CN116724112B - HMG-CoA还原酶突变体及其在生产萜类化合物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了HMG‑CoA还原酶突变体及其在生产萜类化合物中的应用,属于基因工程和酶工程技术领域。利用pMG21环形人工染色体来构建HMG‑CoA还原酶突变体库,步骤简单。筛选得到的HMG‑CoA还原酶突变体可用于加强甲羟戊酸途径的代谢流量,提高了下游萜类化合物的产量。
Description
技术领域
本发明涉及HMG-CoA还原酶突变体及其在生产萜类化合物中的应用,属于基因工程和酶工程技术领域。
背景技术
萜类化合物,也称为类异戊二烯类,是一类高度多样化的天然产物,被广泛应用于工业、食品、化妆品、医药健康等领域。目前,工业上生产萜类化合物的主要方法是化学合成和植物提取,这些方法存在产率低、成本高和污染大等难以避免的问题。近年来,利用酵母等微生物合成萜类化合物的方法备受关注。酵母的遗传背景清晰、分子操作简单、发酵工艺成熟、生物安全性高,是理想的合成生物学细胞工厂,有望实现工业化大规模生产具有高附加值的萜类化合物。酵母中本身含有合成萜类化合物的上游通路:甲羟戊酸途径(如附图1所示),但利用酵母本身的甲羟戊酸途径合成萜类化合物时产量较低,难以满足工业化需求。因此,强化甲羟戊酸通路是提高萜类化合物产量的有效途径。
HMG-CoA还原酶(即3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶,3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase,EC: 1.1.1.34,HMGR),催化依赖于NADPH的从3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A到甲羟戊酸(MVA)的合成反应,由于甲羟戊酸的生成是一个不可逆过程,因此,HMGR被认为是MVA途径中的第一个限速酶。通常,过表达截短的HMG-CoA还原酶tHMGR能起到强化甲羟戊酸通路的效果。但随着该还原酶在酵母中表达次数的增加,代谢流的提升效果和酵母的生长均受到限制,主要原因是HMGR的催化效率受到酶活的限制。目前没有相关研究报道如何进一步提高tHMGR的酶活。
发明内容
本发明披露了HMG-CoA还原酶突变体,可用于提高合成通路的代谢流,增加萜类化合物的产量。
所述HMG-CoA还原酶突变体具有:
(1)在SEQ ID NO:1所示序列的位置F151、G206、L386、P425、V158、A457、I64、S423、G378、G374、Q441发生至少一个位置的取代;
(2)在SEQ ID NO:1所示序列的基础上发生F151L、G206E/L386T/P425R、V158L/A457S、I64A、S423D/G378N、G374V、Q441E中的至少一种取代;
(3)与SEQ ID NO:1中的序列具有至少85%但小于100%的相似度,并在相应的氨基酸位点上具有(1)或(2)所示的取代,相应的氨基酸位点是指同源序列通过MAFFT(Multiple Alignment using Fast Fourier Transform)软件与SEQ ID NO:1中的序列进行比对,同源序列中与SEQ ID NO:1序列中的F151、G206、L386、P425、V158、A457、I64、S423、G378、G374、Q441对应的保守氨基酸位点;
(4)与SEQ ID NO:1所示序列具有至少85%但小于100%的相似度,并在与SEQ IDNO:1的F151、G206、L386、P425、V158、A457、I64、S423、G378、G374、Q441相应的至少一个位置上发生F151L、G206E/L386T/P425R、V158L/A457S、I64A、S423D/G378N、G374V、Q441E中的至少一种取代。
表1
本发明披露了多核苷酸,所述多核苷酸编码所述HMG-CoA还原酶突变体。
本发明披露了含有所述多核苷酸的表达盒。所述表达盒还含有启动子区、终止子区。构建表达盒的方法可以是融合PCR、Golden Gate组装、Gibson组装、体内同源重组等。
本发明披露了含有所述多核苷酸的重组质粒(或称重组载体),所述重组质粒是将所述多核苷酸插入出发质粒(或称出发载体)得到的重组质粒,或者,所述重组质粒含有所述表达盒。所述出发质粒可是常用于酵母,优选用于酿酒酵母的质粒,例如:YEp、YIp、YAC。所述重组质粒上还可包含用于筛选已转化有重组质粒的选择性标记基因,例如编码抗生素抗性的基因。
本发明披露了含有所述多核苷酸的重组微生物,所述重组微生物是将所述重组质粒转化进入出发微生物(或称底盘微生物)得到的,或者将所述表达盒插入到出发微生物的基因组上得到的。优选的,所述出发微生物是酵母,更优选的是酿酒酵母种(Saccharomyces cerevisiae)的微生物,包括酿酒酵母种的所有小种和变种的菌株,例如CEN.PK2-1C、BY4741等。
所述HMG-CoA还原酶突变体、所述多核苷酸、所述表达盒、所述重组质粒、所述重组微生物在生产萜类化合物中的用途。所述萜类化合物包括所有通过甲羟戊酸途径来合成的化合物,例如虾青素、胡萝卜素、角鲨烯等。所述用途是指在含有甲羟戊酸途径的酵母中表达所述HMG-CoA还原酶突变体,以提高萜类化合物的产量。所述甲羟戊酸途径是指以乙酰辅酶A为前体合成异戊二烯焦磷酸和二甲烯丙基焦磷酸的一条代谢途径,存在于所有高等真核生物中,该途径的产生的异戊二烯焦磷酸和二甲烯丙基焦磷酸是类固醇、类萜等生物分子的合成前体。
本发明披露应用所述HMG-CoA还原酶突变体、所述多核苷酸、所述表达盒、所述重组质粒或所述重组微生物生产萜类化合物的方法,包括下述步骤:以HMG-CoA还原酶突变体催化3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A得到甲羟戊酸,其它至少一种催化剂进一步催化甲羟戊酸得到萜类化合物;或者,将所述表达盒或所述重组质粒转化进入底盘微生物,所述底盘微生物优选的是酵母,更优选的是酿酒酵母种(Saccharomyces cerevisiae)的微生物,在含有有益于所述HMG-CoA还原酶突变体产生的条件下培养所述重组微生物,使得重组微生物合成更多的萜类化合物。
本发明披露含有所述HMG-CoA还原酶突变体的配制物。所述配制物可以是酶制剂,可以是液体酶制剂或者固体酶制剂。
本发明披露制备所述HMG-CoA还原酶突变体的方法,包括下述步骤:在含有有益于所述HMG-CoA还原酶突变体产生的条件下培养所述重组微生物,回收所述HMG-CoA还原酶突变体。
本发明披露获得所述HMG-CoA还原酶突变体的方法,包括下述步骤:
步骤1:以酿酒酵母CEN.PK2-1C为底盘微生物,表达了CrtE、CrtB、CrtI基因,得到了能够产番茄红素的重组酿酒酵母,命名为ySC162,用于筛选HMG-CoA还原酶突变体;
步骤2:构建HMG-CoA还原酶突变体库
以含有编码HMG-CoA还原酶亲本的tHMGR基因DNA序列的质粒为模板,通过易错PCR获得具有随机突变的DNA片段混合物,将这些DNA片段与线性化的pMG21载体共同转入步骤1所获得的所述重组酿酒酵母ySC162中;
在所述重组酿酒酵母ySC162细胞中,DNA片段与线性化的pMG21载体通过同源重组连接成一个可自我复制的环状人工染色体(如附图2所示);所述环状人工染色体上含有Gal1p启动子和CYC1t终止子,还含有CEN6/ARS4自我复制起点和URA营养缺陷型筛选标签;
步骤3:高通量筛选并鉴定HMG-CoA还原酶突变体
将步骤得到的HMG-CoA还原酶突变体库在平板培养基上培养,根据酵母转化平板上菌落所呈现的红色的深浅,初筛到了与对照组的菌落颜色相比红色加深的菌落,说明产生了更多的番茄红素,是潜在的含有酶活提高的HMG-CoA还原酶突变体的酵母转化子;
发酵并检测初筛得到的酵母转化子中的番茄红素的产量,选出产量排名前20的酵母转化子,利用引物扩增出这20个转化子中的HMG-CoA还原酶突变体表达盒,再将扩增得到的HMG-CoA还原酶突变体表达盒插入到步骤1所得到的重组酿酒酵母ySC162的基因组ARS911b位点,将所获得的酿酒酵母菌株进行发酵,通过与对照菌株(表达的tHMGR基因没有突变)比较番茄红素的产量来确认是HMG-CoA还原酶突变体的酶活变化使得番茄红素产量提高。
本发明利用pMG21环形人工染色体来构建HMG-CoA还原酶突变体库,无需先通过大肠杆菌构建质粒突变体库,步骤简单、所需时间短、转化效率更高。
本发明得到HMG-CoA还原酶突变体,在酵母中表达时,可用于加强甲羟戊酸途径的代谢流量,提高了下游萜类化合物的产量。在一种实施例中,通过过表达其中一个HMGR突变体,使角鲨烯的产量提高了27倍。
附图说明
图1 甲羟戊酸途径及其下游萜类化合物。
图2 pMG21载体示意图。
图3 酵母菌株MU1-MU20的番茄红素产量。
图4 酵母菌株ySC172和ySC173的角鲨烯产量。
具体实施方式
本发明所述突变体,是指具有HMG-CoA还原酶活性的、在一个或多个氨基酸位置包含了取代的多肽。所述取代是指,是用不同的氨基酸替代占据某一位置的氨基酸。本发明中突变体的命名方法是:原始氨基酸、位置、被取代的氨基酸,氨基酸采用氨基酸的单字母缩写来表示。例如,将在位置151处的苯丙氨酸被亮氨酸取代表示为“F151L”。多个突变通过“/”分开,例如,“V158L/A457S”代表在位置158和位置457处的缬氨酸和丙氨酸分别被亮氨酸和丝氨酸取代。
在一些实施方式中,所述突变体是HMG-CoA还原酶突变体,是在SEQ ID NO:1所示序列的位置F151、G206、L386、P425、V158、A457、I64、S423、G378、G374、Q441发生至少一个位置的取代。在一些实施方式中,所述HMG-CoA还原酶突变体是在SEQ ID NO:1所示序列的基础上发生了F151L、G206E/L386T/P425R、V158L/A457S、I64A、S423D/G378N、G374V、Q441E中的至少一种突变。在一些实施方式中,所述HMG-CoA还原酶突变体与SEQ ID NO:1中的序列具有至少85%但小于100%的相似度,优选86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%的相似度,并在相应的氨基酸位点上具有(1)或(2)所示的取代。所述相似度是指两种多肽的氨基酸序列之间的相似程度。
本发明所述编码是直接规定突变体的氨基酸序列。编码序列,是指直接规定突变体的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界通常由可读框确定,所述可读框以起始密码子(例如ATG、GTG或TTG)开始并且以终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可为基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。
本发明所述重组质粒(或重组载体),是指直链或环状DNA分子,包含了编码突变体的多核苷酸并且多核苷酸可操作地连接至用于控制多核苷酸表达的序列。所述用于控制多核苷酸表达的序列,是指对于表达编码本发明的突变体的多核苷酸所必需的核酸序列,可以是原生(native)的(即,来自相同基因)或外源的(即,来自不同基因),包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、以及转录终止子;最少,包括启动子、以及转录和翻译终止信号。所述表达包括涉及变体产生的任何步骤,包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。
本发明所述出发细胞(或称宿主细胞、底盘微生物),是指易于用包含本发明的多核苷酸的重组质粒或表达盒进行转化、转染、转导等的任何细胞类型。
下述实施例中用到的初始菌株为购自于美国菌种保藏中心(ATCC)的酿酒酵母菌株 CEN.PK2-1C。初始菌株及实施例中改造获得的菌株基因型信息如下表2所示。
表2 酵母菌株信息
菌株名称 | 基因型 |
CEN.PK2-1C | MATa; his3Δ1; leu2-3_112; ura3-52; trp1-289; MAL2-8c; SUC2 |
ySC162 | CEN.PK2-1C {511b::TEF1p-CrtE-CYC1t/PGK1p-CrtB-ENO1t/TDH3p-CrtI-TDH1t} |
ySC163 | ySC162; pMG21-tHMGR |
ySC172 | CEN.PK2-1C; pMG21-tHMGR |
ySC173 | CEN.PK2-1C; pMG21-tHMGRG206E, L386T, P425R |
下述实施例中使用的培养基包括:
YPG培养基:蛋白胨 20g/L,酵母粉 10g/L,半乳糖 20g/L。
YPD培养基:蛋白胨 20g/L,酵母粉 10g/L,葡萄糖 20g/L。
SD-Ura-营养缺陷型培养基:酵母氮源基础(YNB) 6.7g/L,葡萄糖 20g/L,DOSupplement-Ura 1.29g/L。
下述实施例中pMG23载体的构建方法:利用Golden Gate分级组装的方法构建pMG23载体,将启动子(TEF1p、PGK1p、TDH3p)、终止子(CYC1t、ENO1t、TDH1t)、基因(CrtE、CrtB、CrtI)和插入位点的上下游同源臂(ARS511b-up、ARS511b-down)组装到载体pLM-1上。pLM-1载体信息及具体组装方法参照文献1《Sylvestre Marillonnet, Ramona Grützner.Synthetic DNA Assembly Using Golden Gate Cloning and the Hierarchical ModularCloning Pipeline,Curr Protoc Mol Biol. 2020 Mar;130(1):e115.》。
下述实施例中pMG21载体(即pMG21环形人工染色体)的构建方法:pMG21载体的结构示意图如图2所示。环形人工染色体pMG21由酵母表达载体pYES2(Invitrogen,USA)改造而来,将pYES2载体中的2μ复制起点替换为CEN6/ARS4复制起点,使质粒pMG21能够像染色体一样在酵母细胞中单拷贝复制并在有丝分裂中均匀的分配到两个细胞中。为了构建pMG21载体,分别利用引物BO009和BO010扩增质粒pYES2上的载体片段,利用引物BO011和BO012扩增质粒pRS415(Addgene)上的CEN6/ARS4片段,然后利用Gibson组装方法将两个片段组装成pMG21载体。pMG21环形人工染色体上含有Gal1p启动子和CYC1t终止子,与连接上的tHMGR随机突变序列组成完整的表达元件;还含有CEN6/ARS4自我复制起点和URA营养缺陷型筛选标签。本发明构建了包含约10万个酵母转化子的HMG-CoA还原酶随机突变体库。所述pMG21环形人工染色体中的启动子、终止子等元件还可以替换为其它类似元件,例如把Gal1p启动子换成其它启动子,把CYC1t终止子换成其它终止子,把URA营养缺陷型筛选标记换成其它营养缺陷型筛选标记或抗性筛选标记。
下述实施例中的酵母转化方法:利用碱阳离子酵母转化试剂盒进行酵母转化,具体方法参照”Alkali-Cation™ Yeast Transformation Kit”的产品说明书。
下述实施例中酵母的孔板发酵方法:挑取单菌落接种在加入2ml YPD培养基的24孔板中,30℃ 550rpm摇床中过夜培养(16h),然后将菌液稀释10倍,采用紫外分光光度计检测菌液浓度OD600,再转接至3ml YPG培养液中,使起始OD600为0.2,置于30℃ 550rpm摇床中进行培养。每24h补加400μl 20%(w/v,即g/100mL)半乳糖水溶液。共发酵72h,取菌液200μl进行产物检测。
下述实施例中番茄红素的检测方法:向收集到的菌液中加入约200μl玻璃珠并加入400μl丙酮,在低温研磨仪上以65Hz,60s进行研磨破碎,13000 rpm离心1 min,取150ul上清置于新的1.5ml EP管中待测。使用Agilent 1100 HPLC系统,反向 C18柱(4.6×150mm)进行检测。流动相为甲醇:二氯甲烷(75:25),柱温30℃,流速0.6 mL/min,检测波长472nm。检测样品用0.45μm的有机滤膜过滤,进样量20 μl,以番茄红素标准品作标准曲线进行定量。
下述实施例中角鲨烯的检测方法:向收集到的菌液中加入约200μl玻璃珠,在低温研磨仪上以65Hz,60s进行研磨破碎,之后加入300μl甲醇和300μl正庚烷震荡30min,13000rpm离心1 min,取150μl上清置于新的1.5ml EP管中待测。进样前用0.45μm的有机滤膜过滤。使用Agilent 8860 气相色谱仪,HP-5(MS)(30.0 m×250 μm×0.25 μm)气相色谱柱,采用FID检测器定量检测。进样口温度250 ℃,FID检测器温度300 ℃,分流比20:1,载气流速2mL/min,空气400 mL/min,氢气40 mL/min,尾吹30 mL/min,柱温160 ℃维持1 min,15 ℃/min升温至220 ℃,再以5 ℃/min升温至280 ℃,保持10 min,后运行300 ℃,时间2 min,进样量1μL,根据峰面积,以角鲨烯标准品作标准曲线进行定量。
各实施例中用到的引物名称及对应序列如下表3所示。
表3
实施例1:筛选获得HMG-CoA还原酶突变体
番茄红素是以甲羟戊酸通路产生的法尼烯焦磷酸(FPP)为前体,依次通过GGPP合成酶(CrtE)、八氢番茄红素合成酶(CrtB)和类胡萝卜素脱氢酶(CrtI)催化产生。HMG-CoA还原酶活性的提高将会提高细胞内FPP前体的含量,从而增加番茄红素的产量。番茄红素是一种粉红色的化合物,因此,可以通过菌落所呈现的红色的深浅来判断番茄红素的产量高低,进而筛选到酶活提高的HMG-CoA还原酶突变体。
CrtE基因、CrtB基因均来源于Pantoea agglomerans,核苷酸序列分别如SEQ IDNO:10、SEQ ID NO:11所示。CrtI基因来源于Blakeslea trispora,核苷酸序列如SEQ IDNO:12所示。
(1)构建产番茄红素的酵母菌株
首先,利用上述pMG23载体的构建方法将启动子(TEF1p、PGK1p、TDH3p)、终止子(CYC1t、ENO1t、TDH1t)、基因(CrtE、CrtB、CrtI)和插入位点的上下游同源臂(ARS511b-up、ARS511b-down)在载体pLM-1上组装成完整的片段ARS511b-up/TEF1p-CrtE-CYC1t/PGK1p-CrtB-ENO1t/TDH3p-CrtI-TDH1t/ARS511b-down。然后,利用BsaI限制性内切酶将该片段从载体pMG23上酶切下来,并与pCUT-ARS511b载体(来自以下参考文献2)一起转入酵母CEN.PK2-1C底盘细胞,基因CrtE、CrtB、CrtI及其对应的启动子和终止子将通过CRISPR/Cas9介导的同源重组整合到酵母基因组ARS511b位点并进行表达。pCUT-ARS511b载体信息以及CRISPR/Cas9酵母基因编辑原理和方法参照文献2《Amanda Reider Apel, Leo d'Espaux, Maren Wehrset al.A Cas9-based toolkit to program gene expressioninSaccharomyces cerevisiae,Nucleic Acids Res. 2017 Jan 9;45(1):496-508.》。转化后的酵母通过SD-Ura-营养缺陷型培养基进行平板筛选,可以看到大部分菌落都呈现出粉红色,说明基因CrtE、CrtB、CrtI整合到了基因组上并产生了番茄红素。接下来,进一步利用PCR筛选验证ARS511b位点被正确编辑的酵母转化子,获得产番茄红素的酵母菌株ySC162。
(2)构建HMG-CoA还原酶突变体库
以含有tHMGR基因DNA序列(SEQ ID NO:13)的质粒为模版,利用引物BO474和BO475进行易错PCR扩增,扩增方法参照《Diversify® PCR Random Mutagenesis Kit UserManual》。回收易错PCR扩增后的DNA片段,并以此为模板,利用引物BO474和BO475进行高保真PCR扩增5个循环,回收含有随机突变的DNA片段。
利用EcoRI限制性内切酶将pMG21载体线性化并进行胶回收。
将回收的DNA片段和线性化的pMG21载体共同转入酵母ySC162中,通过在酵母细胞中进行同源重组,含有随机突变的DNA片段与线性化的pMG21载体连接成可单拷贝自我复制的环形DNA,即pMG21-tHMGRmu环形人工染色体。
通过在SD-Ura-营养缺陷型平板培养基上进行筛选,可获得含有pMG21-tHMGRmu环形人工染色体的酵母转化子。我们一共进行了40个酵母转化及平板筛选,每个平板大约有2000-3000个转化子,共获得了约10万个转化子,作为HMG-CoA还原酶突变体库。
(3)通过高通量筛选鉴定酶活提高的HMG-CoA还原酶突变体
以含有tHMGR基因DNA序列(SEQ ID NO:13)的质粒为模版,利用引物BO474和BO475进行高保真PCR,并回收得到tHMGR基因的DNA片段。将回收后的DNA片段与线性化的pMG21载体共同转入酵母ySC162中,通过在酵母细胞中进行同源重组,DNA片段与线性化的pMG21载体连接成可单拷贝自我复制的环形DNA。
通过在SD-Ura-营养缺陷型培养基上进行平板筛选,可获得酵母菌株ySC163。ySC163含有的tHMGR基因没有突变位点,作为对照菌株。
通过将步骤(2)得到的约10万个转化子与对照菌株菌落的颜色比较,挑出了198个有明显的红色加深的菌落,说明这些菌落产生了更多的番茄红素。我们将这198个菌落分别进行孔板发酵,并检测番茄红素的产量,从中挑选出产量最高的20个菌株。
接下来,为了进一步验证这20个菌株中番茄红素产量的提高是否是由tHMGR突变后酶活增强所引起的,我们利用引物BO476和BO477通过酵母菌落PCR分别将上述20个菌落中pMG21-tHMGRmu环形人工染色体的包含HMG-CoA还原酶突变体编码序列及其启动子和终止子的DNA片段扩增出来,并用相同的方法扩增酵母菌株ySC163,以作为对照DNA片段。由于引物BO476和BO477两端带有ARS911b插入位点两端的同源序列,因此以上带有启动子、终止子和HMG-CoA还原酶突变体编码序列的DNA片段可用于整合到基因组ARS911b位点并进行表达。遂将从20个菌落中扩增出的20个DNA片段以及对照DNA片段(tHMGR没有突变)分别与pCUT-ARS911b载体共同转化入酵母ySC162菌株中,所获得的菌株通过PCR验证后分别进行孔板发酵。pCUT-ARS911b载体信息以及CRISPR/Cas9酵母基因编辑原理和方法参照文献2《Amanda Reider Apel, Leo d'Espaux, Maren Wehrset al.A Cas9-based toolkit toprogram gene expression inSaccharomyces cerevisiae,Nucleic Acids Res. 2017Jan 9;45(1):496-508.》。
大部分的含有HMG-CoA还原酶突变体的菌株中番茄红素的产量与对照菌株(tHMGR没有突变)相比都有提高(见附图3),其中,含有HMG-CoA还原酶突变体的菌株MU5、MU7、MU8、MU12、MU15、MU19和MU20比对照菌株番茄红素的产量提高了15-32倍,见附表4。通过测序,能够确定上述这七个菌株中的HMG-CoA还原酶发生了下表4所示的突变。
表4 使酶活提高的HMG-CoA还原酶突变位点
实施例2:利用HMG-CoA还原酶突变体提高角鲨烯产量
为了测试HMG-CoA还原酶突变体的酶活增强是否也有利于其它通过甲羟戊酸途径合成的萜类化合物的产量提高,我们利用引物BO476和BO477,分别将实施例1中对照菌株ySC163含有的没有突变的tHMGR基因连同含启动子和终止子,以及MU7菌株中的HMG-CoA还原酶G206E/L386T/P425R突变体的编码序列连同含启动子和终止子,扩增出来,并转化入酵母菌株CEN.PK2-1C中,通过PCR筛选验证分别获得菌株ySC172(CEN.PK2-1c; pMG21-tHMGR)和ySC173(CEN.PK2-1C; pMG21-tHMGRG206E, L386T, P425R)。将菌株ySC172和ySC173分别进行孔板发酵,发酵后检测角鲨烯的产量。结果如附图4所示,HMG-CoA还原酶突变体使角鲨烯的产量提高了27倍。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上,但其并非用以限定本发明,任何熟悉此技术的人,在不脱离本发明的精神和范围内,都可做各种的改动与修饰,因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (20)
1. HMG-CoA还原酶突变体,其特征在于,相较于SEQ ID NO:1所示序列,区别为发生了G206E、L386T和P425R取代。
2.多核苷酸,其特征在于,编码权利要求1所述HMG-CoA还原酶突变体。
3.表达盒,其特征在于,含有权利要求2所述多核苷酸。
4.根据权利要求3所述的表达盒,其特征在于,还含有启动子区、终止子区。
5.重组质粒,其特征在于,含有权利要求2所述多核苷酸。
6.重组微生物,其特征在于,含有权利要求2所述多核苷酸,或含有权利要求3或4所述表达盒,或含有权利要求5所述重组质粒。
7.根据权利要求6所述的重组微生物,其特征在于,是酵母。
8. 根据权利要求7所述的重组微生物,其特征在于,所述酵母是酿酒酵母种(Saccharomyces cerevisiae)的微生物。
9.根据权利要求7或8所述的重组微生物,其特征在于,所述酵母是CEN.PK2-1C或BY4741。
10.权利要求1所述HMG-CoA还原酶突变体、权利要求2所述多核苷酸、权利要求3或4所述表达盒、权利要求5所述重组质粒或者权利要求6所述重组微生物在通过甲羟戊酸途径合成生产萜类化合物中的用途。
11.根据权利要求10所述的用途,其特征在于,所述萜类化合物为虾青素、胡萝卜素或角鲨烯。
12.根据权利要求10所述的用途,其特征在于,所述用途是在含有甲羟戊酸途径的酵母中表达所述HMG-CoA还原酶突变体,提高萜类化合物的产量。
13.应用权利要求1所述HMG-CoA还原酶突变体生产萜类化合物的方法,其特征在于,包括下述步骤:以所述HMG-CoA还原酶突变体催化3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A得到甲羟戊酸,其它至少一种催化剂进一步催化甲羟戊酸得到萜类化合物。
14.应用权利要求2所述多核苷酸、权利要求3或4所述表达盒、权利要求5所述重组质粒或者权利要求6所述重组微生物生产萜类化合物的方法,其特征在于,包括下述步骤:将所述多核苷酸、表达盒或重组质粒转化进入底盘微生物获得重组微生物,或使用权利要求6所述重组微生物,在有益于所述HMG-CoA还原酶突变体表达的条件下培养所述重组微生物,使得重组微生物合成更多的萜类化合物。
15.根据权利要求14所述的方法,其特征在于,所述底盘微生物是酵母。
16. 根据权利要求15所述的方法,其特征在于,所述酵母是酿酒酵母种(Saccharomyces cerevisiae)的微生物。
17.含有权利要求1所述HMG-CoA还原酶突变体的配制物。
18.根据权利要求17所述的配制物,其特征在于,是酶制剂。
19.根据权利要求17或18所述的配制物,其特征在于,是液体酶制剂或者固体酶制剂。
20.制备权利要求1所述HMG-CoA还原酶突变体的方法,其特征在于,包括下述步骤:在有益于所述HMG-CoA还原酶突变体表达的条件下培养权利要求6所述的重组微生物,回收所述HMG-CoA还原酶突变体。
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