JP7157237B2 - ステロール生産能を有する組換え酵母菌株、その製造方法および用途 - Google Patents

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Description

KCTC KCTC13882BP KCTC KCTC13883BP KCTC KCTC13884BP KCTC KCTC13885BP KCTC KCTC13886BP KCTC KCTC13887BP KCTC KCTC13888BP KCTC KCTC13889BP
本出願は、２０１８年７月２６日に出願された韓国特許出願第１０－２０１８－００８７３７２号を優先権として主張し、前記明細書全体は本出願の参考文献である。
本発明は、ステロール生産能を有する組換え酵母菌株、その製造方法および用途に関し、より詳細には、ＥＲＧ５およびＥＲＧ６遺伝子を欠失させ、ＤＨＣＲ２４およびＤＨＣＲ７遺伝子を多重でまたはコドンコンテクスト方式でコドン最適化して導入することによって、コレステロールおよびコレステロール前駆体を高い収率で生産できる組換え酵母菌株とその製造方法および用途に関する。ひいては、前記製作された組換え酵母菌株にｔＨＭＧ１、ＥＲＧ２、ＥＲＧ３、ＥＲＧ２７、またはＵＰＣ２－１遺伝子などを追加で導入させることによって、コレステロールおよびコレステロール前駆体の生産収率が増加した組換え酵母菌株の製造方法および用途に関するものを含む。
酵母は、多様な二次代謝産物の生合成経路を導入して発現させることができる宿主として関心を集めている。多様な生命体が生産する二次代謝産物は、高付加価値化学化合物の主な供給処であって、多くの場合、重要な医薬的な性質を持っている。特に植物の代謝産物は、抗酸化剤または抗生剤機能を通じてバクテリア、ウイルス、かび等の感染を防ぎ、また、人体健康に有益な機能性物質であって、治療剤としての活用度が高くて、微生物を活用した大量生産技術に対する需要が高い。二次代謝生合成経路が自体的に制限的な酵母は、遺伝工学を通じて導入された外来代謝経路を妨害したり、競争したりせず、何よりも多様なオミックス解析システムが十分に構築されていて、転写体とメタボローム解析を通じて酵母宿主の生理状態に対する総体的な情報を確保することができる長所がある。また、代謝過程に対する詳細なモデルが開発されて、変形された代謝ネットワークの行動を予測できるインシリコ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）酵母が構築されていて、これを活用した人工細胞のデザインおよび製作がさらに容易な点が大きな長所である。ひいては、単細胞真核微生物として酵母は、小胞体およびミトコンドリアのような小器官で発現する場合にのみ活性を有することになるシトクロム（ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ）Ｐ４５０のような外来酵素発現に適合した宿主であり、植物および動物由来の酵素活性に必須的なタンパク質翻訳後に変形能がある点も、原核微生物宿主に比べて有する長所である。一方、コレステロールは、哺乳動物において非常に重要な生体構成物質であって、細胞の分裂、成長、発育および分化の調節に関与し、各種必須的な代謝物質（例えば、ホルモン、胆汁酸等）の前駆体として知られており、その前駆体が発生初期および老化過程に重要な役割をするものと知られている。これより、本発明では、コレステロールおよびその前駆体を高い収率で生産できる組換え酵母菌株を提供しようとする。
韓国登録特許第１０－０４１８１８７号公報
本発明は、ステロール（コレステロールおよびコレステロール前駆体）生産能を有する組換え酵母菌株を提供する。
また、本発明は、前記ステロール（コレステロールおよびコレステロール前駆体）生産能を有する組換え酵母菌株の製造方法とその用途を提供する。
本発明は、ＥＲＧ５およびＥＲＧ６遺伝子が欠失され、ＤＨＣＲ２４およびＤＨＣＲ７遺伝子が導入されたステロール生産能を有する組換え酵母菌株を提供する。
前記ＤＨＣＲ２４とＤＨＣＲ７遺伝子の２つのうちの１つ以上の遺伝子のコピー数（ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒ）が多重で導入されたりまたはコドン最適化されたＤＨＣＲ２４とＤＨＣＲ７合成遺伝子が１コピー以上で導入され得る。ここで、前記ＤＨＣＲ２４とＤＨＣＲ７遺伝子の２つのうちの１つ以上の遺伝子のコピー数（ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒ）が多重で導入される場合、ＤＨＣＲ２４とＤＨＣＲ７遺伝子の２つのうちの１つ以上の遺伝子コピー数（ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒ）は、２～１０でありうる。より好ましくは、４～７でありうる。遺伝子コピー数が２未満の場合には、所望の効果を具現しにくく、１０超過時には、効果の変化が極めて小さい。
前記組換え酵母菌株には、ｔＨＭＧ１、ＥＲＧ３、ＥＲＧ２、ＥＲＧ２７およびＵＰＣ２－１遺伝子よりなる群から選ばれる1つ以上の遺伝子が追加で導入され得る。
前記組換え酵母菌株には、ＥＲＧ２７－ＥＲＧ２融合タンパク質をコードする合成遺伝子が追加で導入され得る。
前記ＤＨＣＲ２４遺伝子は、ＥＲＧ６遺伝子座に導入され、前記ＤＨＣＲ７遺伝子は、ＥＲＧ５遺伝子座に導入され得る。上記のように遺伝子導入位置を構成する場合、コレステロールとコレステロール前駆体をより高い収率で生産することができ、エタノール（ｅｔｈａｎｏｌ）とアセテート（ａｃｅｔａｔｅ）のような副産物が蓄積されない効果がある。
前記ステロールは、コレステロール前駆体またはコレステロールの２つのうちの１つ以上を含むことができる。
前記コレステロール前駆体は、ジモステロール、デヒドロコレステロール、ラトステロール、デヒドロデスモステロールおよびデスモステロールよりなる群から選ばれる１つ以上を含むことができる。
前記組換え菌株は、サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）リボソームＤＮＡ非転写領域（ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＤＮＡ ｎｏｎｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ ｓｐａｃｅｒ；ｒＤＮＡ ＮＴＳ）のＮ末端断片遺伝子、挿入目的遺伝子、プロモーター領域を含む栄養要求性選択標識マーカー遺伝子およびサッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ｒＤＮＡ ＮＴＳのＣ末端断片遺伝子を順に含む遺伝子多重挿入カセットを用いて製造され得る。
前記遺伝子多重挿入カセットのｒＤＮＡ ＮＴＳのＮ末端断片遺伝子は、配列番号１（ｃａｃａａｇａｇｇｔ ａｇｇｔｃｇａａａｃ ａｇａａｃａｔｇａａ ａｇｔｔｇｇｔｃｇｇ ｔａｇｇｔｇｃ）で表され、前記ｒＤＮＡ ＮＴＳのＣ末端断片遺伝子は、配列番号２（ｇｇｔｔｔｔｇｃａｃ ｃａｔａｔｃｔｔｃａ ｔａａｃｃｔｇｔｃａ ｃｃｔｔｇａａａｃｔ ａｃｃｔｃｔｇｇｃ）で表され得る。
前記栄養要求性選択標識マーカー遺伝子は、配列番号３（ｇａａａｃｇａａｇａ ｔａａａｔｃ）で表されるプロモーター領域を含むＵＲＡ３遺伝子、配列番号４（ｔｔａｃｃｔｔｔｔａ ｃａｔｔｔｃａｇｃａ ａ）で表されるプロモーター領域を含むＬＥＵ２遺伝子、配列番号５（ｃｔｔｃｇａａｇａａ ｔａｔａｃｔａａａａ ａａｔｇａｇｃａｇｇ ｃａａｇａｔａａａｃ ｇａａｇｇｃａａａｇ）で表されるプロモーター領域を含むＨＩＳ３遺伝子または配列番号６（ｔａｔｔｇａｇｃａｃ ｇｔｇａｇｔａｔａｃ ｇｔｇａｔｔａａｇｃ ａｃａｃａａａｇｇｃ ａｇｃｔｔｇｇａｇｔ）で表されるプロモーター領域を含むＴＲＰ１遺伝子でありうる。
前記ＤＨＣＲ２４遺伝子およびＤＨＣＲ７遺伝子は、コドン適応指数（Ｃｏｄｏｎ Ａｄａｐｔａｔｉｏｎ Ｉｎｄｅｘ）方式またはコドンコンテクスト（ｃｏｄｏｎ ｃｏｎｔｅｘｔ）方式でコドン最適化され得る。
前記コドン適応指数（Ｃｏｄｏｎ Ａｄａｐｔａｔｉｏｎ Ｉｎｄｅｘ）方式で最適化されたＤＨＣＲ７遺伝子は、配列番号９で構成され、ＤＨＣＲ２４遺伝子は、配列番号１０で構成され得る。
コドンコンテクスト（ｃｏｄｏｎ ｃｏｎｔｅｘｔ）方式でコドン最適化されたＤＨＣＲ２４遺伝子は、配列番号１７で構成され、ＤＨＣＲ７遺伝子は、配列番号１８で構成され得る。
前記組換え酵母菌株は、ｔＨＭＧ１遺伝子が追加で導入されたものでありうる。
また、本発明は、酵母菌株のＥＲＧ５およびＥＲＧ６遺伝子を欠失させた後、ＤＨＣＲ２４およびＤＨＣＲ７遺伝子を導入する段階を含み、前記ＤＨＣＲ２４とＤＨＣＲ７遺伝子の２つのうちの１つ以上の遺伝子のコピー数（ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒ）を多重で導入することを特徴とする、ステロール生産能を有する組換え酵母菌株の製造方法を提供する。
前記酵母菌株は、サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）でありうる。
前記ＤＨＣＲ２４およびＤＨＣＲ７遺伝子導入は、サッカロマイセスセレビシエリボソームＤＮＡ非転写領域（ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＤＮＡ ｎｏｎｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ ｓｐａｃｅｒ；ｒＤＮＡ ＮＴＳ）のＮ末端断片遺伝子、挿入目的遺伝子、プロモーター領域を含む栄養要求性選択標識マーカー遺伝子およびサッカロマイセスセレビシエｒＤＮＡ ＮＴＳのＣ末端断片遺伝子を順に含む遺伝子多重挿入カセットを用いて行うことができる。具体的な内容は、上記で説明したことと同じである。
また、本発明は、前記組換え酵母菌株を培地に培養してステロールを生産する方法を提供する。
前記培養は、２５～３５℃で２～１０日間行うことができる。
本発明によれば、ＥＲＧ５およびＥＲＧ６遺伝子が欠失され、ＤＨＣＲ２４およびＤＨＣＲ７遺伝子が多重で導入された組換え菌株、またはＥＲＧ５およびＥＲＧ６遺伝子が欠失され、コドンコンテクスト方式によりコドン最適化されたＤＨＣＲ２４およびＤＨＣＲ７遺伝子が導入された組換え菌株により高い収率でコレステロールとその前駆体を生産することができる。ひいては、前記製作された組換え酵母菌株にｔＨＭＧ１、ＥＲＧ２、ＥＲＧ３、ＥＲＧ２７、またはＵＰＣ２－１遺伝子を追加で導入させることによって、コレステロールおよびコレステロール前駆体の生産収率が増加した組換え酵母菌株の製造方法および用途に関するものを含む。
本発明の一実施例による組換え酵母菌株のコレステロール生合成経路を示すものである。 本発明の一実施例による組換え酵母菌株の製造過程を示すものである。（ａ）組換え酵母菌株＃１９（ｅｒｇ５：：Ｄ２４／ｅｒｇ６：：Ｄ７）と＃Ｓ１（ｅｒｇ６：：Ｄ２４／ｅｒｇ５：：Ｄ７）製作および追加的にＤＨＣＲ２４が多重挿入された組換え酵母菌株製作の模式図である。（ｂ）組換え酵母菌株＃１９（ｅｒｇ５：：Ｄ２４／ｅｒｇ６：：Ｄ７）と＃Ｓ１（ｅｒｇ６：：Ｄ２４／ｅｒｇ５：：Ｄ７）に追加的にＤＨＣＲ２４、ＤＨＣＲ７の多重挿入あるいは過発現およびＥＲＧ３、ＥＲＧ２、ＥＲＧ２７－２ ｆｕｓｉｏｎ、ＵＰＣ２－１の追加導入の組換え酵母菌株製作の模式図である。 本発明の一実施例による組換え酵母菌株の製造過程を示すものである。（ａ）サッカロマイセスセレビシエ野生型菌株にＤＨＣＲ２４、ＤＨＣＲ７多重挿入導入した組換え酵母菌株製作および追加的なＥＲＧ３、ＥＲＧ２、ＥＲＧ２７－２ ｆｕｓｉｏｎ、ＵＰＣ２－１導入した組換え酵母菌株の製作およびｅｒｇ６欠失と同時にＤＨＣＲ２４、多重挿入導入した組換え酵母菌株製作の模式図である。（ｂ）コドンコンテクスト（ｃｏｄｏｎ ｃｏｎｔｅｘｔ）方式でコドン最適化されたＤＨＣＲ２４（ｃｃ）、ＤＨＣＲ７（ｃｃ）を用いた組換え酵母菌株＃ｃｃ１９（ｅｒｇ５：：ｃｃＤ２４／ｅｒｇ６：：ｃｃＤ７）と＃ｃｃＳ１（ｅｒｇ６：：ｃｃＤ２４／ｅｒｇ５：：ｃｃＤ７）製作および追加的にＮ－末端が一部除去されたｔＨＭＧ１が多重挿入された組換え酵母菌株製作の模式図である。 本発明の一実施例による組換え酵母菌株の製作時に使用されたベクターを示すものである。 本発明の一実施例による組換え酵母菌株＃１９（ｅｒｇ５：：Ｄ２４／ｅｒｇ６：：Ｄ７）と＃Ｓ１（ｅｒｇ６：：Ｄ２４／ｅｒｇ５：：Ｄ７）のコレステロールおよびその前駆体の生産量をＨＰＬＣ－ＵＶ／Ｖｉｓ分析クロマトグラムで分析した結果である。（＊：未知ピーク（ｕｎｋｎｏｗｎ ｐｅａｋ）、ＤＤ：デヒドロデスモステロール（ｄｅｈｙｄｒｏｄｅｓｍｏｓｔｅｒｏｌ）、Ｄ：デスモステロール（ｄｅｓｍｏｓｔｅｒｏｌ）、Ｚ：ジモステロール（ｚｙｍｏｓｔｅｒｏｌ）、Ｃ：コレステロール（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ）） 本発明の一実施例による組換え酵母菌株ＮＴＳＤ２４／＃１９（ＮＴＳＤ２４／ｅｒｇ５：：Ｄ２４／ｅｒｇ６：：Ｄ７）およびＮＴＳＤ２４／＃Ｓ１（ＮＴＳＤ２４／ｅｒｇ６：：Ｄ２４／ｅｒｇ５：：Ｄ７）のコレステロールおよびその前駆体の生産量をＨＰＬＣ－ＵＶ／Ｖｉｓ分析クロマトグラムで分析した結果である（ＤＤ：デヒドロデスモステロール、Ｄ：デスモステロール、Ｚ：ジモステロール、Ｃ：コレステロール）。 本発明の一実施例による組換え酵母菌株の特性を比較分析したものである：（ａ）組換え菌株ＮＴＳＤ２４Ｄ７／＃１９（ＮＴＳＤ２４Ｄ７／ｅｒｇ５：：Ｄ２４／ｅｒｇ６：：Ｄ７）の挿入カセット数による結果分析（ｑＰＣＲ分析）。（ｂ）組換え菌株＃１９とＮＴＳＤ２４Ｄ７／＃１９のコレステロールおよびその前駆体生産量の分析結果（ＨＰＬＣ－ＵＶ／Ｖｉｓ分析クロマトグラム）。（ｃ）組換え菌株２ｕＤ２４Ｄ７／＃Ｓ１菌株のコレステロールおよびその前駆体生産量の分析結果（ＨＰＬＣ－ＵＶ／Ｖｉｓ分析クロマトグラム）、（ＤＤ：デヒドロデスモステロール、Ｄ：デスモステロール、Ｚ：ジモステロール、Ｃ：コレステロール）。 本発明の一実施例による組換え酵母菌株Ｅ３Ｅ２／ＮＴＳＤ２４Ｄ７／＃１９、Ｅ３Ｅ２７－２／ＮＴＳＤ２４Ｄ７／＃１９、ＵＰＣ２－１／ＮＴＳＤ２４Ｄ７／＃１９のコレステロールおよびその前駆体生産量をＨＰＬＣ－ＵＶ／Ｖｉｓ分析クロマトグラムで分析した結果である（ＤＤ：デヒドロデスモステロール、Ｄ：デスモステロール、Ｚ：ジモステロール、Ｃ：コレステロール）。 新規構築したＨＰＬＣ－ＣＡＤ基盤ＬＣクロマトグラム分析結果であって、本発明の一実施例による組換え酵母菌株のコレステロールおよびその前駆体の生産量を分析したものである。（Ａ）標準品３種（１：ジモステロール、２：エルゴステロール、３：コレステロール）に対するＬＣクロマトグラム、（Ｂ）標準品４種（４：７－デヒドロデスモステロール、５：デスモステロール、６：７－デヒドロコレステロール、７：ラトステロール）に対するＬＣクロマトグラム（Ｃ）野生型菌株（ＣＥＮ．ＰＫ）、（Ｄ）組換え菌株＃１９（ｅｒｇ５：：Ｄ２４／ｅｒｇ６：：Ｄ７）。 本発明の一実施例によって製造されたＡＲＥ２欠失菌株のステロールプロファイルを分析した結果である。（ａ）相同組換え技法基盤のＡＲＥ２欠失菌株製作の模式図（ｂ）ＨＰＬＣ－ＵＶ／Ｖｉｓ分析基盤の他のステロール抽出方法で確保された総ステロール（ｔｏｔａｌ ｓｔｅｒｏｌ）（ＫＯＨ／ＥｔＯＨ）と遊離ステロール（ｆｒｅｅ ｓｔｅｒｏｌ）（Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ／ＭｅＯＨ）クロマトグラム、（ｃ）ＨＰＬＣ－ＵＶ／Ｖｉｓ分析基盤ａｒｅ２／ＮＴＳＤ２４Ｄ７／＃１９組換え菌株の総ステロール（ｔｏｔａｌ ｓｔｅｒｏｌ）クロマトグラム（ＤＤ：デヒドロデスモステロール、Ｄ：デスモステロール、Ｚ：ジモステロール、Ｃ：コレステロール）。 本発明の一実施例によって製造された組換え酵母菌株のコピー数とステロール生産量の関係を分析したものである。図１１ｄは、ｅｒｇ６：：Ｄ７／ＵＰＣ２－１／ＮＴＳＤ２４Ｄ７菌株のステロールプロファイルをＨＰＬＣ－ＵＶ／Ｖｉｓで分析した結果である。＊：未知ピーク（ｕｎｋｎｏｗｎ ｐｅａｋ）、ＤＤ：デヒドロデスモステロール、Ｄ：デスモステロール、Ｚ：ジモステロール、Ｃ：コレステロール。 本発明の一実施例による組換え酵母菌株の特性を比較分析したものである：（ａ）組換え菌株ＮＴＳＤ７／ＮＴＳＤ２４／＃Ｓ１の製作に使用されたカセットを含むベクター。（ｂ）組換え菌株ＮＴＳＤ７／ＮＴＳＤ２４／＃Ｓ１の挿入カセット数による結果分析（ｑＰＣＲ分析）。（ｃ）組換え菌株ＮＴＳＤ７／ＮＴＳＤ２４／＃Ｓ１のコレステロールおよびその前駆体生産量の分析結果（ＨＰＬＣ－ＵＶ／Ｖｉｓ分析クロマトグラム）。 本発明の一実施例による組換え酵母菌株の特性を比較分析したものである：（ａ）～（ｄ）組換え菌株＃ｃｃ１９、＃ｃｃＳ１の製作に使用されたカセットを含むベクター。（ｅ）組換え菌株＃ｃｃ１９、＃ｃｃＳ１のコレステロールおよびその前駆体生産量の分析結果（ＨＰＬＣ－ＵＶ／Ｖｉｓ分析クロマトグラム）。 本発明の一実施例による組換え酵母菌株の特性を比較分析したものである：（ａ）組換え菌株ｔＨＭＧ１／＃ｃｃ１９、ｔＨＭＧ１／＃ｃｃＳ１の製作に使用されたｔＨＭＧ１多重挿入カセットを含むベクター。（ｂ）組換え菌株ｔＨＭＧ１／＃ｃｃ１９、ｔＨＭＧ１／＃ｃｃＳ１の多重挿入されたｔＨＭＧ１カセット数による結果分析（ｑＰＣＲ分析）。（Ｃ）組換え菌株ｔＨＭＧ１／＃ｃｃ１９、ｔＨＭＧ１／＃ｃｃＳ１のコレステロールおよびその前駆体生産量の分析結果（ＨＰＬＣ－ＵＶ／Ｖｉｓ分析クロマトグラム）。
以下、実施例を通じて本発明をより詳細に説明する。本発明の目的、特徴、長所は、以下の実施例を通じて容易に理解され得る。本発明は、ここで説明する実施例に限定されず、他の形態で具体化されることもできる。ここで紹介される実施例は、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者に本発明の思想が十分に伝達され得るようにするために提供されるものである。したがって、以下の実施例によって本発明が制限されるべきものではない。
本実施例は、酵母特異的ステロール（ｓｔｅｒｏｌ）であるエルゴステロール（ｅｒｇｏｓｔｅｒｏｌ）の代わりに、動物細胞のコレステロール（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ）と、コレステロールの前駆体を生産する組換え酵母菌株の製作を目的に行われた。このために伝統製パン酵母サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を対象にエルゴステロール最終生合成段階を遮断し、コレステロール生合成関連外来遺伝子を導入して、コレステロール生合成経路を有する組換え酵母菌株を製作した（図１）。本実施例の具体的な戦略としては、エルゴステロール特異的構造２２－カーボンダブルボンド（２２－ｃａｒｂｏｎｅ ｄｏｕｂｌｅ ｂｏｎｄ）の形成に関与するＣ－２２ステロールデサチュラーゼ（Ｃ－２２ ｓｔｅｒｏｌ ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ）遺伝子ＥＲＧ５と２４－カーボンメチレーション（２４－ｃａｒｂｏｎｅ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）に関与するデルタ（２４）－ステロールＣ－メチルトランスフェラーゼ（Ｄｅｌｔａ（２４）－ｓｔｅｒｏｌ Ｃ－ｍｅｔｈｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）遺伝子ＥＲＧ６を破砕させ、コレステロール（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ）の生成に必要な動物細胞由来の７－デヒドロコレステロールレダクターゼ（７－ｄｅｈｙｄｒｏｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）遺伝子ＤＨＣＲ７と２４－デヒドロコレステロールレダクターゼ（２４－ｄｅｈｙｄｒｏｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）遺伝子ＤＨＣＲ２４を酵母宿主に導入して、多様な形態で導入された組換えサッカロマイセスセレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）菌株を製作した（図２ａ）。また、ひいては、エルゴステロール生合成経路がコレステロール前駆体の生合成経路にさらに効率的に転換され得るようにＥＲＧ３（Ｄｅｌｔａ（７）－ｓｔｅｒｏｌ ５（６）－ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ）、ＥＲＧ２（Ｃ－８ ｓｔｅｒｏｌ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）、ＥＲＧ２７（３－ｋｅｔｏ－ｓｔｅｒｏｉｄ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）とエルゴステロール生合成経路調節転写因子であるＵＰＣ２－１（Ｕｐｔａｋｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ ２－１）を追加で導入された組換え菌株を製作しようとした（図２ｂ）。さらに他の方法としては、野生型菌株背景にＤＨＣＲ７とＤＨＣＲ２４遺伝子を多重で先に挿入させた後、ＥＲＧ３、ＥＲＧ２、ＥＲＧ２７とエルゴステロール生合成経路調節転写因子であるＵＰＣ２－１を追加で導入させた後、ＥＲＧ６を破砕させて、コレステロール生産菌株を製作した（図３ａ）。ひいては、エルゴステロール生合成経路の前駆体生合成経路であるメバロネート生合成経路（Ｍｅｖａｌｏｎａｔｅ ｐａｔｈｗａｙ）を増幅させるために、ｔＨＭＧ１遺伝子を宿主染色体に多重に追加導入した（図３ｂ）。
前記ＥＲＧ５、ＥＲＧ６、ＤＨＣＲ７、ＤＨＣＲ２４、ＥＲＧ３、ＥＲＧ２、ＥＲＧ２７，ＡＲＥ２、ＥＲＧ２７－ＥＲＧ２、ＵＰＣ２－１、ｔＨＭＧ１は、それぞれ配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１９で表される配列で構成され得る。
ＥＲＧ２７－ＥＲＧ２融合遺伝子配列（配列番号１５、カッコ内：ＥＲＧ２部分）
ｔｔｇａａａｃｔａｇａａｃｃｃｃｃａｔｔ［ｃｃａａｃｃａａｔｔａｃａｔｇｔｔｃｇａｔｃｃａａａａａｃｔｔｔｇａａｃｇａａａｔａｔｇｔａａｃｔｃｇｇｔｇａｔｔａｇｃａａａｃａｃａａｃｇｃａｇｃａｇａａｇｇｔｔｔａｔｃｃａｃｔｇａａｇａｃｃｔｇｔｔａｃａｇｇａｔｇｔｃａｇａｇａｃｇｃａｃｔｔｇｃｃｔｃｔｃａｔｔａｃｇｇｇｇａｃｇａａｔａｃａｔｃａａｃａｇｇｔａｃｇｔｃａａａｇａａｇａａｔｇｇｇｔｃｔｔｃａａｃａａｔｇｃｔｇｇｔｇｇｔｇｃｇａｔｇｇｇｃｃａａａｔｇａｔｃａｔｃｃｔａｃａｃｇｃｔｔｃｃｇｔａｔｃｃｇａｇｔａｃｔｔａａｔｔｃｔａｔｔｃｇｇａａｃｃｇｃｔｇｔｔｇｇｔａｃｔｇａａｇｇｇｃａｃａｃａｇｇｔｇｔｔｃａｃｔｔｔｇｃｔｇａｃｇａｃｔａｔｔｔｔａｃｃａｔｃｔｔａｃａｔｇｇｔａｃｇｃａａａｔｃｇｃａｇｃａｔｔｇｃｃａｔａｔｇｃｃａｃｔｇａａｇｃｃｇａａｇｔｔｔａｃａｃｔｃｃｔｇｇｔａｔｇａｃｔｃａｔｃａｃｔｔｇａａｇａａｇｇｇａｔａｃｇｃｃａａｇｃａａｔａｃａｇｃａｔｇｃｃａｇｇｔｇｇｔｔｃｃｔｔｔｇｃｃｃｔｔｇａａｔｔｇｇｃｔｃａａｇｇｃｔｇｇａｔｔｃｃａｔｇｔａｔｇｔｔｇｃｃａｔｔｃｇｇｇｔｔｔｔｔｇｇａｃａｃｔｔｔｃｔｃｃａｇｔａｃｔｃｔｔｇａｔｔｔａｔａｃａｃｔｃｔａｔａｔａｇａａｃｔｇｔｃｔａｃｃｔｇａｃｔｇｃｃａｇｇｇａｃａｔｇｇｇｔａａｇａａｃｔｔｇｔｔｇｃａａａａｃａａａａａｇｔｔｃｔａａ］
ＵＰＣ２－１配列（配列番号１６、大文字部分：Ｇ８８８Ｄ 点突然変異領域（ＧＧＴからＧＡＴ）
ａｔｔａｔｔａａｇａｇａａｇｃｔｇｔｔｔｔａｇａａａｔａｔｃｔｇａｇａａｔａａｃａｃｃｇａｔｇｃｇｃｔａｇｔｔｇｃｃａｇｃｇｃｃｃｔｇａｔａｃｔａａｔｃａｔｇｇａｃｔｃｇｔｔａｇｃａａａｔｇｃｔａｇｔｇｇｔａａｃｇｇｃａｃｔｇｔａｇｇａａａｃｃａａａｇｔｔｔｇａａｔａｇｃａｔｇｔｃａｃｃａａｇｃｇｃｔｔｇｇａｔｃｔｔｔｃａｔｇｔｃａａａｇｇｔｇｃｔｇｃａａｃａａｔｔｔｔａａｃｃｇｃｔｇｔｇｔｇｇｃｃｔｔｔｇａｇｔｇａａａｇａｔｃｔａａａｔｔｔｃａｔａａｃａｔｔａｔａｔｃｔｇｔｔｇａｔｃｔｔａｇｃｇａｔｔｔａｇｇｃｇａｔｇｔｃａｔｔａａｃｃｃｔｇａｔｇｔｔｇｇａａｃａａｔｔａｃｔｇａａｔｔｇｇｔａｔｇｔｔｔｔｇａｔｇａａａｇｔａｔｔｇｃｃｇａｔｔｔｇｔａｔｃｃｔｇｔｃｇｇｃｔｔａｇａｔｔｃｇｃｃａｔａｔｔｔｇａｔａａｃａｃｔａｇｃｔｔａｔｔｔａｇａｔａａａｔｔｇｃａｃｃｇｔｇａａａａａａａｃｃａｇｇｇｔｇａｔｔｔｔａｔｔｃｔｇｃｇｇｇｔａｔｔｔａｃａｔ ｔｔｃｃａｇｃａｔｔｇｃｔａｇａｃａａｇａｃａｔｔｃｃｔｇｇｃａｔｔａｃｔｇａｔｇａｃａｇｇｔｇａｔｔｔａｇｇｔｇｃａａｔｇａｇａａｔｔａｔｇａｇａｔｃａｔａｔｔａｔａａａｃｔａｃｔｔｃｇａｇｇａｔｔｔｇｃｃａｃａｇａｇｇｔｃａａｇｇａｔａａａｇｔｃｔｇｇｔｔｔｃｔｃｇａａｇｇａｇｔｃａｃｇｃａｇｇｔｇｃｔｇｃｃｔｃａａｇａｔｇｔｔｇａｃｇａａｔａｃａｇｔｇｇａｇｇｔｇｇｔＧＡＴａｔｇｃａｔａｔｇａｔｇｃｔａｇａｔｔｔｃｃｔｃｇｇｔｇｇｃｇｇａｔｔａｃｃａｔｃｇａｔｇａｃａａｃａａｃａａａｔｔｔｃｔｃｔｇａｔｔｔｔｔｃｇｔｔａ
以下、さらに具体的な実施例を通じて本発明をより詳細に説明する。
材料
本実施例に使用されたプライマー、発現ベクター、酵母菌株は、表１、表２、表３に整理されている。本実施例で製作された発現ベクターは、図４に図式で整理されており、使用した培地および試薬は、下記の通りである。
－ＳＣ培地（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｍｅｄｉｕｍ；）：０．６７％アミノ酸がない酵母窒素塩基（ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ ｗｉｔｈｏｕｔ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ）（ＢＤ、２９１９４０）、２％グルコース（ｇｌｕｃｏｓｅ）（ＪＵＮＳＥＩ、６４２２０Ｓ０６５０）、０．７７ｇ／Ｌすべての必須アミノ酸が補充されたドロップ－アウトアミノ酸混合物（ｄｒｏｐ－ｏｕｔ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｍｉｘｔｕｒｅ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ ｗｉｔｈ ａｌｌ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ）（ＣＬＯＮＴＥＣＨ、６３０４２５）
－インフュージョンクローニングキット（Ｉｎ ｆｕｓｉｏｎ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ）（ＴＡＫＡＲＡ １２１４１６）
－ＫＯＨ（ＪＵＮＳＥＩ、３９０４０－０３５０／Ｓｉｇｍａ、Ｐ１７６７）
－エタノール（Ｅｔｈａｎｏｌ）（ＭＥＲＣＫ、１．００９８３．１０１１）
－メタノール（Ｍｅｔｈａｎｏｌ）（Ｂ＆Ｊ、ＡＨ２３０－４）
－ヘプタン（Ｈｅｐｔａｎｅ）（ＳＩＧＭＡ、２４６６５４）
－石油エタノール（Ｐｅｔｒｏｌｅｕｍ ｅｔｈｅｒ）（Ｂ＆Ｊ、３１７－４）
－ピロガロール（Ｐｙｒｏｇａｌｌｏｌ）（ＴＣＩ、Ｐ０５７０）
－アセトン（Ａｃｅｔｏｎｅ）（ＳＩＧＭＡ、６５０５０１）
－Ｃｏｓｍｏｓｉｌ Ｃ１８－ＰＡＱ（４．６ｍｍ＊２５０ｍｍ）ｃｏｌｕｍｎ
－ＨＰＬＣアセトニトリル（ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ）（ＦＩＳＨＥＲ、Ａ９９８－４）
－ＨＰＬＣウォーター（ｗａｔｅｒ）（ＦＩＳＨＥＲ、Ｗ５－４）
－ＨＰＬＣ分析用標準コレステロール前駆体
：ラノステロール （Ｌａｎｏｓｔｅｒｏｌ）（ＳＩＧＭＡ、Ｌ５７６８）
：エルゴステロール（Ｅｒｇｏｓｔｅｒｏｌ）（ＳＩＧＭＡ、４５４８０－１０ｇ－ｆ）
：ジモステロール（Ｚｙｍｏｓｔｅｒｏｌ）（ＡＶＡＮＴＩ、７０００６８Ｐ）
：デスモステロール（Ｄｅｓｍｏｓｔｅｒｏｌ）（ＳＩＧＭＡ、Ｄ６５１３）
：コレステロール（Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ）（ＳＩＧＭＡ、Ｃ８６６７）
：ラトステロール（Ｌａｔｈｏｓｔｅｒｏｌ）（ＳＩＧＭＡ、Ｃ３６５２）
：７－デヒドロデスモステロール（７－Ｄｅｈｙｄｒｏｄｅｓｍｏｓｔｅｒｏｌ）（ＡＶＡＮＴＩ、７００１３８Ｐ）
：７－デヒドロコレステロール（７－Ｄｅｈｙｄｒｏｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ）（ＳＩＧＭＡ、３０８００）
：グルコースバイオ（Ｇｌｕｃｏｓｅ Ｂｉｏ）（Ｒｏｃｈｅ、０６３４３７３２００１）
：アセテートＶ２バイオ（Ａｃｅｔａｔｅ Ｖ２ Ｂｉｏ）（ＣＯＷＩＥ、７３９５４４２００１）
：エタノールバイオ（Ｅｔｈａｎｏｌ ｂｉｏ）（Ｒｏｃｈｅ、８０５５６４５００１）
機器
－ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ Ｍｏｄｕｌｅ ２６９５、Ｗａｔｅｒｓ Ｄｕａｌ λ Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ ２４８７）
－ＰＣＲ ｃｙｃｌｅｒ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、ＡＧ ２２３３１）
－ビーズビーター（Ｂｅａｄｂｅａｔｏｒ）（ＢＥＲＴＩＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ、ＰｒｅｃｅｌｌｙｓＲ２４）
－ウォーターバス（Ｗａｔｅｒ ｂａｔｈ）（ＴＡＩＴＥＣ、ＳＤＮ－Ｂ）
－遠心分離機（Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、５４２４Ｒ）
－回転真空濃縮機（Ｒｏｔａｔｉｏｎａｌ ｖａｃｕｕｍ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ）（ＣＨＲＩＳＴ、ＲＶＣ ２－２５ ＣＤ ｐｌｕｓ）
－ＨＰＬＣ－ＣＡＤシステム（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｄｉｏｎｅｘ Ｕｌｔｉｍａｔｅ ３０００－Ｃｏｒｏｎａ Ｖｅｏ ＲＳ）
－バイオプロセスアナライザー（Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ ａｎａｌｙｚｅｒ）（Ｒｏｃｈｅ、Ｃｅｄｅｘ Ｂｉｏ）
Figure 0007157237000001
Figure 0007157237000002
Figure 0007157237000003
Figure 0007157237000004
Figure 0007157237000005
Figure 0007157237000006
Figure 0007157237000007
Figure 0007157237000008
Figure 0007157237000009
Figure 0007157237000010
酵母形質転換（ＬｉＡｃ／ＰＥＧ方式）
前記製造されたベクターあるいはカセットを用いて形質転換を行うために、ＹＰＤ（Ｂａｃｔｏ－ｐｅｐｔｏｎｅ ２％（ｗ／ｖ）、Ｂａｃｔｏ－Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ １％（ｗ／ｖ）、Ｄ－グルコース（Ｇｌｕｃｏｓｅ）２％（ｗ／ｖ）液体培地で前培養した菌株を５００ｍＬバッフルフラスコ（ｂａｆｆｌｅｄ ｆｌａｓｋ）に初期ＯＤ６００値を０．２に合わせて５０ｍＬを３０℃振とう培養器で１８０ｒｐｍで培養した。６～７時間後、ＯＤ６００値が１．０になるまで培養した後、４℃、４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上澄み液を除去し、ＬｉＡｃ／ＴＥ緩衝溶液（０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１Ｍ ＬｉＡｃ、ｐＨ７．５）１ｍＬを入れ、ピペッティング（ｐｉｐｅｔｔｉｎｇ）で懸濁した後、１３，０００ｒｐｍで１分間遠心分離して沈殿物を得た。さらにＬｉＡｃ／ＴＥ緩衝溶液５００μＬに懸濁して、コンピテント細胞（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌ）を製造した。１００μＬずつ５個に分けて分注し、各チューブ（ｔｕｂｅ）に組換えベクターあるいはカセット２μＬ、サケ精子（ｓａｌｍｏｎ ｓｐｅｒｍ）ＤＮＡ １０μＬ、ＰＥＧ／ＬｉＡｃ緩衝溶液（５０％ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）、０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１Ｍ ＬｉＡｃ、ｐＨ７．５）６００μＬを混合した後、約３～４回用心深くピペッティング（ｐｉｐｅｔｔｉｎｇ）した。３０℃で３０分間放置させた後、ＤＭＳＯ ７０μＬを添加してピペッティング（ｐｉｐｅｔｔｉｎｇ）した後、４２℃で１５分間熱処理をした。氷で３分間放置した後、１３，０００ｒｐｍで１分間遠心分離して得られた沈殿物を滅菌された蒸留水で懸濁し、特定アミノ酸（ＬＥＵ ｏｒ ＴＲＰ ｏｒ ＨＩＳ）または塩基（ＵＲＡ）が欠失されたＳＣ合成基盤の選択培地ＳＣ－ＬＥＵ、ＳＣ－ＵＲＡ、ＳＣ－ＬＵＥ－ＵＲＡ－ＴＲＰ、ＳＣ－ＬＵＥ－ＵＲＡ－ＴＲＰ－ＨＩＳ（０．６７％ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ ｗｉｔｈｏｕｔ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ，２％ｇｌｕｃｏｓｅ，０．７７ｇ／Ｌ ｄｒｏｐ－ｏｕｔ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｍｉｘｔｕｒｅ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ ｗｉｔｈｏｕｔ ｌｅｕｃｉｎｅ，ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ，ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ，ｏｒ ｕｒａｃｉｌ ｉｎ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）に塗抹し、３０℃で４８時間培養した後、形質転換体を得た（Ｈｉｌｌ Ｊ ｅｔ．ａｌ．１９９１）。
実施例１：ＥＲＧ５、ＥＲＧ６欠失とＤＨＣＲ２４、ＤＨＣＲ７同時挿入を通したステロール生産菌株の製作
まず、ＥＲＧ５、ＥＲＧ６欠失のために相同組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）が起こるＮ断片とＣ断片を表１に表示されたｅｒｇ５ ｄＮ ｆｗ、ＥＲＧ５ ｄＮ ｒｖ、ＥＲＧ５ ｄＣ ｆｗ、ＥＲＧ５ ｄＣ ｒｖ、ＥＲＧ６ ｄＮ ｆｗ、ＥＲＧ６ ｄＮ ｒｖ、ＥＲＧ６ ｄＣ ｆｗ、ＥＲＧ６ ｄＣ ｒｖプライマーを用いてそれぞれＮ、Ｃの２個のＰＣＲ断片を得た後、その断片をもって融合重合酵素連鎖反応（Ｆｕｓｉｏｎ－ＰＣＲ）を行って、ｐＴ－ＥＲＧ５ｄＮＣ、ｐＴ－ＥＲＧ６ｄＮＣを得た。酵母用コドン適応指数（Ｃｏｄｏｎ Ａｄａｐｔａｔｉｏｎ Ｉｎｄｅｘ）方式でコドン最適化されたゼブラフィッシュ由来のＤＨＣＲ２４とＤＨＣＲ７遺伝子がクローニングされているｐＭＫＲＱ－ＤｒＤＨＣＲ２４、ｐＭＫＲＱ－ＤｒＤＨＣＲ７からＰＣＲを通じてＤＨＣＲ７、ＤＨＣＲ２４ ＤＮＡ切片を回収し、また、ＰＣＲを通じて得られた４１１ｂｐ ＴＥＦ１プロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）と３１４ｂｐ ＧＡＬ７ターミネーター（ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）とともに連結（ｌｉｇａｔｉｏｎ）してｐＴ－ＤＨＣＲ２４、ｐＴ－ＤＨＣＲ７ベクターを製作後、このベクターからＴＥＦ１ｐ－ＤＨＣＲ７－ＧＡＬ７ｔ、ＴＥＦ１ｐ－ＤＨＣＲ２４－ＧＡＬ７ｔ断片を持ってきてｐＴ－ＥＲＧ５ｄＮＣ、ｐＴ－ＥＲＧ６ｄＮＣベクターのＮ、Ｃ断片のうち、ＢａｍＨＩ／ＸｂａＩ位置に挿入し、ＫｌＵＲＡ３、ＫｌＬＥＵ２をｐＵＧ７３、ｐＵＧ７２ベクターから持ってきてＮｏｔＩ位置に挿入することによって、最終ベクターｐＴ－ｅｒｇ５：：ＤＨＣＲ２４－ＬＥＵ２、ｐＴ－ｅｒｇ６：：ＤＨＣＲ７－ＵＲＡ３、ｐＴ－ｅｒｇ６：：ＤＨＣＲ２４－ＬＥＵ２、ｐＴ－ｅｒｇ５：：ＤＨＣＲ７－ＵＲＡ３を得た（図４Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）。最終ベクターをＳｐｈＩ／ＭｌｕＩ処理してｅｒｇ５：：ＤＨＣＲ２４－ＬＥＵ２、ＥＲＧ６：：ＤＨＣＲ７－ＵＲＡ３、ＥＲＧ６：：ＤＨＣＲ２４－ＬＥＵ２、ＥＲＧ５：：ＤＨＣＲ７－ＵＲＡ３カセットを回収した後、ＣＥＮＰＫ菌株にＬｉＡｃ／ＰＥＧ方式で形質転換し、ＳＣ－ＬＥＵ、ＳＣ－ＵＲＡ、ＳＣ－ＬＥＵ－ＵＲＡ培地で選別してｅｒｇ５：：Ｄ２４、ＥＲＧ６：：Ｄ７、ＥＲＧ６：：Ｄ２４、ＥＲＧ５：：Ｄ７、ＥＲＧ５：：２４／ｅｒｇ６：：Ｄ７、ＥＲＧ６：：Ｄ２４／ｅｒｇ５：：Ｄ７組換え菌株を製作した（図２、１段階、表３）。
実施例２：ＤＨＣＲ２４多重挿入カセット製作および組換え酵母選別
コレステロール生合成遺伝子の多重挿入のために、本研究チームで開発されたｒＤＮＡ－ＮＴＳ基盤多重挿入カセットシステム（Ｍｏｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１６）を用いてＮＴＳ－ＤＨＣＲ２４－８６ＴＲＰ１カセットを製作した。ｐＴ－ＮＴＳ－８６ＴＲＰ１ベクターにｐＴ－ｅｒｇ６：：ＤＨＣＲ２４－ＬＥＵ２から持ってきたＴＥＦ１ｐ－ＤＨＣＲ２４－ＧＡＬｔ７断片をＢａｍＨＩ位置に挿入して製作されたｐＴ－ＮＴＳ－ＤＨＣＲ２４－８６ＴＲＰ１（図４Ｅ）をＳｐｈＩ／ＮｓｉＩ処理してＮＴＳ－ＤＨＣＲ２４－８６ＴＲＰ１カセットを回収した後、ｅｒｇ５：：Ｄ２４／ｅｒｇ６：：Ｄ７（＃１９、寄託番号ＫＣＴＣ １３８８９ＢＰ）、ＥＲＧ６：：Ｄ２４／ｅｒｇ５：：Ｄ７（＃Ｓ１、寄託番号ＫＣＴＣ １３８８８ＢＰ）組換え菌株に導入させた後、ＳＣ－ＬＥＵ－ＵＲＡ－ＴＲＰ培地で選別して、ＮＴＳＤ２４／＃１９およびＮＴＳＤ２４／＃Ｓ１組換え菌株を製作した（図２、２段階）。
実施例３：ＤＨＣＲ２４／ＤＨＣＲ７多重挿入製作および組換え酵母選別
ＤＣＨＲ２４とＤＨＣＲ７発現カセットが共に入っているｐＴ－ＮＴＳ－ＤＨＣＲ２４－ＤＨＣＲ７－８６ＴＲＰ１ベクター（図４ｆ）の製作は、ＡＣＴ１ｐ ｆｗとＡＣＴ１ｐ ｒｖプライマーで８３７ｂｐ大きさのＳｃＡＣＴ１プロモーターとＤＨＣＲ７ ｆｗ２とＤＨＣＲ７ ｒｖ２プライマーで１４５８ｂｐ大きさのＤＨＣＲ７遺伝子、ＣＹＣ１ｔ ｆｗとＣＹＣ１ｔ ｒｖプライマーで２５２ｂｐ大きさのＣＹＣ１ターミネーター部位をそれぞれ増幅し、これを融合（ｆｕｓｉｏｎ）ＰＣＲを通じて1つの断片に作った後、既存ｐＴ－ＮＴＳ－ＤＨＣＲ２４－８６ＴＲＰ１ベクターにＫｐｎＩ座に挿入して製作した。このように製作されたｐＴ－ＮＴＳ－ＤＨＣＲ２４－ＤＨＣＲ７－８６ＴＲＰ１をＳｐｈＩ／ＮｓｉＩ処理してＮＴＳ－ＤＨＣＲ２４－ＤＨＣＲ７－８６ＴＲＰ１カセットを回収した後、ｅｒｇ５：：Ｄ２４／ｅｒｇ６：：Ｄ７（＃１９）組換え菌株に形質転換を行った後、ＳＣ－ＬＥＵ－ＵＲＡ－ＴＲＰ培地で選別してＮＴＳＤ２４Ｄ７／＃１９組換え菌株（寄託番号ＫＣＴＣ １３８８４ＢＰ）を製作した（図２、３段階、右側パネル）。
また、ｐＴ－ＮＴＳ－８６ＴＲＰ１－ＤＨＣＲ２４－ＤＨＣＲ７ベクターをＢａｍＨＩ処理してＤＨＣＲ２４を除去することによって、ｐＴ－ＮＴＳ－８６ＴＲＰ１－ＤＨＣＲ７ベクターを製作した。その後、ｐＴ－ＮＴＳ－８６ＴＲＰ１－ＤＨＣＲ７ベクターにＳｍａＩ／ＮｏｔＩを処理して８６ＴＲＰ１を除去した後、プライマー１０１ＨＩＳ３ ｆｗ、１０１ＨＩＳ３ ｒｖを用いてＰＣＲで得られた１０１ｂｐ大きさのプロモーターを有するＨＩＳ３断片を挿入してｐＴ－ＮＴＳ－１０１ＨＩＳ３－ＤＨＣＲ７を製作した（図１２ａ）。ＳｐｅＩ／ＸｂａＩを処理してＮＴＳ－１０１ＨＩＳ３－ＤＨＣＲ７カセットを得た後、ＮＴＳＤ２４／＃Ｓ１菌株にＬｉＡｃ／ＰＥＧ方式で形質転換し、ＳＣ－ＨＩＳ培地で選別してＮＴＳＤ７／ＮＴＳＤ２４／＃Ｓ１菌株（寄託番号ＫＣＴＣ １３８８５ＢＰ）を得た。製作された菌株ＮＴＳＤ７／ＮＴＳＤ２４／＃Ｓ１遺伝体内導入されたカセット数を確認するために、当該菌株をｑＰＣＲを通じて導入コピー数を分析した結果、ＤＨＣＲ７の遺伝子は、約４個、ＤＨＣＲ２４の遺伝子は、約２個のカセットが導入されたことを確認することができた（図１２ｂ）。
実施例４：エピソームプラスミド（Ｅｐｉｓｏｍａｌ ｐｌａｓｍｉｄ）基盤ＤＨＣＲ２４／ＤＨＣＲ７発現ベクター製作
２マイクロイーストエピソームプラスミド（ｍｉｃｒｏ ｙｅａｓｔ ｅｐｉｓｏｍａｌ ｐｌａｓｍｉｄｓ）を用いたＹ２ｐＨ－ＤＨＣＲ７－ＤＨＣＲ２４ベクター（図４ｇ）は、Ｙ２ｐＨベクターにｐＴ－ＮＴＳ－ＤＨＣＲ２４－ＤＨＣＲ７－８６ＴＲＰ１から持ってきたＤＨＣＲ２４－ＤＨＣＲ７をＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ位置に挿入して製作し、ｅｒｇ６：：Ｄ２４／ｅｒｇ５：：Ｄ７（＃Ｓ１）組換え菌株にＬｉＡｃ／ＰＥＧ方式で形質転換を行った後、ＳＣ－ＬＥＵ－ＵＲＡ－ＨＩＳ培地で選別して２ｕＤ２４Ｄ７／＃Ｓ１組換え菌株を得た（図２、３段階、左側パネル）。
実施例５：ＥＲＧ２７－ＥＲＧ２融合遺伝子（ｆｕｓｉｏｎ ｇｅｎｅ）、ＥＲＧ３過発現菌株の製作
ＥＲＧ２、ＥＲＧ３発現のためにＹ２ｐＨ－ＥＲＧ３－ＥＲＧ２ベクター（図４ｆ）の製作は、ＴＤＨ３ｐ ｆｗとＴＤＨ３ｐ ｒｖプライマーで７１４ｂｐ大きさのＳｃＴＤＨ３プロモーターとＥＲＧ３ ｆｗとＥＲＧ３ ｒｖプライマーで１０９８ｂｐ大きさのＳｃＥＲＧ３遺伝子、ＴＥＦ１ｔ ｆｗとＴＥＦ１ｔ ｒｖプライマーで３６７ｂｐ大きさのＳｃＴＥＦ１ターミネーター部位をそれぞれ増幅し、これを融合（ｆｕｓｉｏｎ）ＰＣＲを通じて1つの断片に作って、ＴＥＦ２ｐ ｆｗとＴＥＦ２ｐ ｒｖプライマーで８３６ｂｐ大きさのＳｃＴＥＦ２プロモーターとＥＲＧ２ ｆｗとＲＥＦ２ ｒｖプライマーで６６６ｂｐ大きさのＳｃＥＲＧ２遺伝子、ＴＤＨ３ｔ ｆｗとＴＤＨ３ｔ ｒｖプライマーで４８４ｂｐ大きさのＳｃＴＤＨ３ターミネーター部位をそれぞれ増幅し、これを融合ＰＣＲを通じて1つの断片に作った後、既存Ｙ２ｐＨベクターにＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ座に挿入して製作した。Ｙ２ｐＨ－ＥＲＧ３－ＥＲＧ２７－２融合ベクター（図４ｇ）の製作は、ＥＲＧ２７とＥＲＧ２をＥＲＧ２７－２ ｆｗ１とＥＲＧ２７－２ ｒｖ１を用いてＰＣＲ生成物（ｐｒｏｄｕｃｔ）１とＥＲＧ２７－２ ｆｗ２とＥＲＧ２７－２ ｒｖ２を用いて得られたＰＣＲ生成物（ｐｒｏｄｕｃｔ）２を融合ＰＣＲを通じて得た後、Ｙ２ｐＨ－ＥＲＧ３－ＥＲＧ２ベクターにＳｐｈＩサイトを用いてＥＲＧ２の代わりに挿入させて製作した。製作されたＹ２ｐＨ－ＥＲＧ３－ＥＲＧ２、Ｙ２ｐＨ－ＥＲＧ３－ＥＲＧ２７－２融合ベクターをＮＴＳＤ２４Ｄ７／＃１９菌株に形質転換させた後、ＳＣ－ＬＥＵ－ＵＲＡ－ＴＲＰ－ＨＩＳ培地で選別してＥ３Ｅ２／ＮＴＳＤ２４Ｄ７／＃１９、Ｅ３Ｅ２７－２／ＮＴＳＤ２４Ｄ７／＃１９組換え菌株を製作した。
実施例６：ＵＰＣ２－１導入菌株の製作
本研究チームで４８０ｂｐ大きさのＵＰＣ２プロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）とＹＣｐ（ｙｅａｓｔ ｃｅｎｔｒｏｍｅｒｅ ｐｌａｓｍｉｄｓ）を用いて製作したＹＣｐＨ－ｎｐ－ＵＰＣ２を２ｕＤ２４Ｄ７／＃１９菌株に形質転換させた後、ＳＣ－ＬＥＵ－ＵＲＡ－ＴＲＰ－ＨＩＳ培地で選別してＵＰＣ２－１／ＮＴＳＤ２４Ｄ７／＃１９組換え菌株を製作した（図２、４段階左側パネル）。
実施例７：ｅｒｇ６：：Ｄ７／ＵＰＣ２－１／ＮＴＳＤ２４Ｄ７菌株製作
先立って製作されたＮＴＳ－ＤＨＣＲ２４－ＤＨＣＲ７－８６ＴＲＰ１カセットをＣＥＮ．ＰＫ野生型菌株に形質転換させた後、ＳＣ－ＴＲＰ培地で選別して、ＮＴＳＤ２４Ｄ７／ＷＴ組換え菌株を得た。その後、前記製作したＹ２ｐＨ－ＥＲＧ３－ＥＲＧ２、Ｙ２ｐＨ－ＥＲＧ３－ＥＲＧ２７－２、ＹＣｐＨ－ｎｐ－ＵＰＣ２を導入してＥ３Ｅ２／ＮＴＳＤ２４Ｄ７／ＷＴ、Ｅ３Ｅ２７－２／ＮＴＳＤ２４Ｄ７／ＷＴ、ＵＰＣ２－１／ＮＴＳＤ２４Ｄ７／ＷＴ菌株を製作した。これらのうちＵＰＣ２－１／ＮＴＳＤ２４Ｄ７／ＷＴ菌株を選択してｅｒｇ６：：ＤＨＣＲ７－ＵＲＡ３カセットを活用してＥＲＧ６遺伝子を欠失させて、ｅｒｇ６：：Ｄ７／ＵＰＣ２－１／ＮＴＳＤ２４Ｄ７菌株を製作した（図３）。
実施例８：ステロールエステル（Ｓｔｅｒｏｌ ｅｓｔｅｒ）化主要な遺伝子ＡＲＥ２欠失菌株の製作
相同組換えを用いたＡＲＥ２欠失のためにＮ断片とＣ断片をＡＲＥ２ ｄＮ ｆｗ、ＡＲＥ２ ｄＮ ｆｗ、ＡＲＥ２ ｄＣ ｆｗ、ＡＲＥ２ ｄＣ ｆｗプライマーを用いてそれぞれＰＣＲで得た後、その断片をもって融合ＰＣＲを行って、ｐＴ－ＡＲＥ２ｄＮＣを得た。その後、２つの断片の間のＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＶサイトにＳｃＨＩＳ３を挿入して、最終ベクターｐＴ－ＡＲＥ２ｄＮＣ－ＨＩＳを得、ＳｐｈＩ／ＭｌｕＩ処理を通じてＡＲＥ２ｄＮＣ－ＨＩＳカセットを得た後、ＮＴＳＤ２４Ｄ７／＃１９菌株にＬｉＡｃ／ＰＥＧ方式で形質転換を行った後、ＳＣ－ＬＥＵ－ＵＲＡ－ＴＲＰ－ＨＩＳ培地で選別してａｒｅ２Δ／ＮＴＳＤ２４Ｄ７／＃１９組換え菌株を製作した。
実施例９：コドンコンテクスト（Ｃｏｄｏｎ ｃｏｎｔｅｘｔ）方式でコドン最適化したｃｃＤＨＣＲ２４、ｃｃＤＨＣＲ７を用いたＥＲＧ５、ＥＲＧ６欠失とＤＨＣＲ２４／ＤＨＣＲ７同時挿入製作および組換え酵母選別
既存に製作されたｐＴ－ＥＲＧ５ｄＮＣ－ＤｒＤＨＣＲ７、ｐＴ－ＥＲＧ５ｄＮＣ－ＤｒＤＨＣＲ２４、ｐＴ－ＥＲＧ６ｄＮＣ－ＤｒＤＨＣＲ７、ｐＴ－ＥＲＧ６ｄＮＣ－ＤｒＤＨＣＲ７ベクターをＰｓｔＩ／ＳａｌＩ処理してバックボーン（ｂａｃｋｂｏｎｅ）として準備し、コドンコンテクスト（Ｃｏｄｏｎ ｃｏｎｔｅｘｔ）方式でｃｃＤＨＣＲ２４、ｃｃＤＨＣＲ７を遺伝子合成したｐＭＫＲＱ－ｓＤｒＤＨＣＲ７（ｃｃ）、ｐＭＫＲＱ－ｓＤｒＤＨＣＲ２４（ｃｃ）ベクターでプライマーｃｃＤ７ ｆｗ、ｃｃＤ７ ｒｖ、ｃｃＤ２４ ｆｗ、ｃｃＤ２４ ｒｖを用いてＰＣＲで得られたｃｃＤＨＣＲ２４、ｃｃＤＨＣＲ７断片をＫｐｎＩ／ＳａｌＩ処理して得られたインサート（ｉｎｓｅｒｔ）をライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）して、ベクターｐＴ－ＥＲＧ５ｄＮＣ－ｃｃＤＨＣＲ７、ｐＴ－ＥＲＧ５ｄＮＣ－ｃｃＤＨＣＲ２４、ｐＴ－ＥＲＧ６ｄＮＣ－ｃｃＤＨＣＲ７、ｐＴ－ＥＲＧ６ｄＮＣ－ｃｃＤＨＣＲ２４を得た。その後、ＫｌＵＲＡ３、ＫｌＬＥＵ２をｐＵＧ７３、ｐＵＧ７２ベクターから持ってきてＮｏｔＩ位置に挿入することによって、最終ベクターｐＴ－ｅｒｇ５：：ｃｃＤＨＣＲ２４－ＬＥＵ２、ｐＴ－ｅｒｇ６：：ｃｃＤＨＣＲ７－ＵＲＡ３、ｐＴ－ｅｒｇ６：：ｃｃＤＨＣＲ２４－ＬＥＵ２、ｐＴ－ｅｒｇ５：：ｃｃＤＨＣＲ７－ＵＲＡ３を得た（図１３ａ～ｄ）。最終ベクターをＳｐｈＩ／ＭｌｕＩ処理してｅｒｇ５：：ｃｃＤＨＣＲ２４－ＬＥＵ２、ＥＲＧ６：：ｃｃＤＨＣＲ７－ＵＲＡ３、ＥＲＧ６：：ｃｃＤＨＣＲ２４－ＬＥＵ２、ＥＲＧ５：：ｃｃＤＨＣＲ７－ＵＲＡ３カセットを回収した後、ＣＥＮ．ＰＫ菌株にＬｉＡｃ／ＰＥＧ方式で形質転換し、ＳＣ－ＬＥＵ、ＳＣ－ＵＲＡ、ＳＣ－ＬＥＵ－ＵＲＡ培地で選別してｅｒｇ５：：ｃｃＤ２４、ＥＲＧ６：：ｃｃＤ７、ＥＲＧ６：：ｃｃＤ２４、ＥＲＧ５：：ｃｃＤ７、ＥＲＧ５：：ｃｃＤ２４／ｅｒｇ６：：ｃｃＤ７（＝＃ｃｃ１９、寄託番号ＫＣＴＣ １３８８６ＢＰ）、ＥＲＧ６：：ｃｃＤ２４／ｅｒｇ５：：ｃｃＤ７（＝＃ｃｃＳ１、寄託番号ＫＣＴＣ １３８８２ＢＰ）組換え菌株を製作した（表３）。
実施例１０：ｔＨＭＧ１多重挿入による組換え＃ｃｃ１９、＃ｃｃＳ１菌株のコレステロール生産量増大
多重挿入が可能なｐＴ－ＮＴＳ－８６ＴＲＰ１－ｔＨＭＧ１ベクターは、表１に記述されたプライマーｔＨＭＧ１－ｆｗとｔＨＭＧ１－ｒｖを用いて増幅したＮ－末端５５２ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄが除去されたＨＭＧ１遺伝子をｐＴ－ＮＴＳ－８６ＴＲＰ１のＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩに挿入してｐＴ－ＮＴＳ－８６ＴＲＰ１－ｔＨＭＧ１ベクターを製作した（図１４ａ）。製作されたｐＴ－ＮＴＳ－８６ＴＲＰ１－ｔＨＭＧ１ベクターをＳｐｅＩ／ＮｓｉＩ処理してＮＴＳ－８６ＴＲＰ１－ｔＨＭＧ１カセットを得た後、ｅｒｇ５：：ｃｃＤ２４／ｅｒｇ６：：ｃｃＤ７（＝＃ｃｃ１９）、ＥＲＧ６：：ｃｃＤ２４／ｅｒｇ５：：ｃｃＤ７（＝＃ｃｃＳ１）菌株にＬｉＡｃ／ＰＥＧ方式で形質転換し、ＳＣ－ＴＲＰ培地で選別してｔＨＭＧ１／ｅｒｇ５：：ｃｃＤ２４／ｅｒｇ６：：ｃｃＤ７（＝ｔＨＭＧ１／＃ｃｃ１９、寄託番号ＫＣＴＣ １３８８７ＢＰ）、ｔＨＭＧ１／ｅｒｇ６：：ｃｃＤ２４／ｅｒｇ５：：ｃｃＤ７（＝ｔＨＭＧ１／＃ｃｃＳ１、寄託番号ＫＣＴＣ １３８８３ＢＰ）組換え菌株を製作した（表３）。製作された菌株ｔＨＭＧ１／＃ｃｃ１９、ｔＨＭＧ１／＃ｃｃＳ１遺伝体内導入されたカセット数を確認するために、当該菌株をｑＰＣＲを通じて導入コピー数を分析した結果、約３～４個のカセットが導入されたことを確認することができた（図１４ｂ）。
＜実験例＞
ｑＰＣＲを用いた挿入コピー数分析
製作された組換え菌株の挿入されたターゲット遺伝子発現カセットコピー数を確認するために、染色体（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）ＤＮＡを回収した後、この染色体ＤＮＡをテンプレート（ｔｅｍｐｌａｔｅ）としてｑＰＣＲを行った。
代謝副産物および残存炭素源分析
最終培養後、上澄み液内に蓄積された代謝副産物（例：Ｅｔｈａｎｏｌ，ａｃｅｔａｔｅ）と培養時に添加した炭素源であるグルコース（ｇｌｕｃｏｓｅ）残存量を測定した。分析に使用した試料は、本培養の最終培養液を用い、これを遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、１０分）して上澄み液を分析した。分析は、バイオプロセスアナライザー（Ｂｉｏ ｐｒｏｃｅｓｓ ａｎａｌｙｚｅｒ）を用い、当該装備のエタノール（ｅｔｈａｎｏｌ）、アセテート（ａｃｅｔａｔｅ）、グルコース（ｇｌｕｃｏｓｅ）測定専用キット（Ｒｏｃｈｅ／ＣＯＷＩＥ）を用いて分析した。
ＨＰＬＣ－ＵＶ／ＶＩｓ基盤コレステロールおよび前駆体分析
ＨＰＬＣ分析は、ＳＣ培地［Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｍｅｄｉｕｍ（０．６７％ ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ ｗｉｔｈｏｕｔ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ、２％ ｇｌｕｃｏｓｅ、０．７７ｇ／Ｌ ｄｒｏｐ－ｏｕｔ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｍｉｘｔｕｒｅ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ ｗｉｔｈ ａｌｌ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ）］に菌株１～２コロニー（ｃｏｌｏｎｙ）接種して種培養を行った後、ＯＤ６００＝０．３～０．５になるように初期接種後、ＳＣ培地またはＹＰＤ培地で培養した。総ステロール（Ｔｏｔａｌ ｓｔｅｒｏｌ）抽出のためには、３日～６日培養（２８℃、２２０ｒｐｍ）サンプル１０ｍＬ回収後、０．０５ｇ／ｗｅｔ ｗｅｉｇｈｔ ｐｅｌｌｅｔに１ｍＬ ＫＯＨ／ＥｔＯＨ（３：２）（ＫＯＨ ｆｉｎａｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ４．５Ｍ）混合液に懸濁後、８５℃で１時間培養後、０．５ｍＬヘプタン（ｈｅｐｔａｎｅ）（ｓｉｇｍａ）を添加した後、ビーズビーター（ｂｅａｄｂｅａｔｏｒ）（６，０００ｒｐｍ、１５秒、３回反復）を用いて混合した。混合されたサンプルを遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、１０分、２５℃）で上澄み液０．５ｍＬヘプタン（ｈｅｐｔａｎｅ）層を回収した（１２，０００ｒｐｍ、１０分、２５℃）後、乾燥して、アセトン（ａｃｅｔｏｎｅ）２００μＬを添加して溶かされたサンプルに対してＨＰＬＣ分析を行った。遊離ステロール（Ｆｒｅｅ ｓｔｅｒｏｌ）抽出のためには、０．５ｍＬクロロホルム（ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ）：ＭｅＯＨ（２：１）混合物（ｍｉｘｔｕｒｅ）をペレット（ｐｅｌｌｅｔ）と添加後、ビーズビーター（６，０００ｒｐｍ、１５秒、３回反復）を用いて混合した。混合されたサンプルを遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、１０分、２５℃）で有機溶媒層を回収した後、乾燥し、乾燥ペレット（ｐｅｌｌｅｔ）に２５０μＬヘキサン（ｈｅｘａｎｅ）を添加して溶かした後、さらに乾燥した。完全に乾燥後、アセトン（ａｃｅｔｏｎｅ）２００μＬを添加して溶かされたサンプルに対してＨＰＬＣ分析を行った。ＨＰＬＣ分析時にカラムは、Ｃｏｓｍｏｓｉｌ Ｃ１８－ＰＡＱ（４．６ｍｍ＊２５０ｍｍ）を使用し、流量（ｆｌｏｗ ｒａｔｅ）は、１ｍＬ／ｍｉｎ、分析溶媒は、９０％アセトニトリル（Ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ）、分析時間５０分（ｍｉｎ）てあった。コレステロールおよび前駆体に該当するピーク（ｐｅａｋ）は、ＵＶ／Ｖｉｓ感知器を使用して波長２０３ｎｍで分析した。
ＨＰＬＣ－ＣＡＤ基盤コレステロールおよび前駆体生産性分析
製作した菌株でコレステロールおよび前駆体生産性確認のためのＨＰＬＣ－ＣＡＤ分析のための細胞培養は、前記ＨＰＬＣ基盤分析内容と同一である。コレステロールおよび前駆体抽出のためには、３日～６日培養（２８℃、２２０ｒｐｍ）したサンプル５０ｍＬを回収した後、２０ｍＬの再懸濁（ｒｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）溶液（１５％ＫＯＨ（ｗ／ｖ）、０．１２５％ピロガロール（ｐｙｒｏｇａｌｌｏｌ、ｗ／ｖ）、７１％ＭｅＯＨ（ｖ／ｖ））に再懸濁した。これを８５℃で２時間反応した後、常温で冷まし、石油エーテル（ｐｅｔｒｏｌｅｕｍ ｅｔｈｅｒ）５ｍＬを添加した後、５分間ボルテックス（ｖｏｒｔｅｘｉｎｇ）して混合した。混合されたサンプルを遠心分離（３，０００ｇ、５分）し、上澄み液を回収した。石油エーテルを添加して抽出する過程は、以後２回反復し、３ｍＬで進めて、上澄み液を全部回収した。回収した上澄み液は、回転真空濃縮機（ｒｏｔａｔｉｏｎａｌ ｖａｃｕｕｍ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ）を用いて乾燥し、乾燥した試料に１ｍＬのメタノール（ｍｅｔｈａｎｏｌ）を添加して溶かしたサンプルに対してＨＰＬＣ－ＣＡＤ分析を行った。ＨＰＬＣ－ＣＡＤ分析時にカラムは、カプセルパック（Ｃａｐｃｅｌｌｐａｋ）（Ｃ１８、４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、５μｍ）を使用し、移動相としてはメタノールを使用し、流量および条件は、下記の表と同じである。分析時間は、４５分（ｍｉｎ）であった。
Figure 0007157237000011
前記分析法を通じて標準品７種（Ｚｙｍｏｓｔｅｒｏｌ、ＥＲＧｏｓｔｅｒｏｌ、Ｌａｔｈｏｓｔｅｒｏｌ、７－ｄｅｈｙｄｒｏｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ、７－ｄｅｈｙｄｒｏｄｅｓｍｏｓｔｅｒｏｌ、Ｄｅｓｍｏｓｔｅｒｏｌ、Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ）を分析した結果（図９参照）、エルゴステロールおよびデスモステロールのＨＰＬＣ ｐｅａｋ滞留時間がそれぞれ３０．７分および３０．４分であって、重なっているが、野生型酵母菌株では、エルゴステロールのみが生産され、コレステロールおよび前駆体を生産できるように製作した組換え酵母菌株の場合には、デスモステロールのみが生産されるので、当該分析法を通じて最終生産性分析を行った。
実験例１：ｅｒｇ５、ｅｒｇ６欠失およびＤＨＣＲ２４、ＤＨＣＲ７発現を通じて製作したステロール生産菌株に対するＨＰＬＣ分析
ＨＰＬＣ－ＵＶ／Ｖｉｓ分析結果、ｅｒｇ５：：Ｄ２４／ｅｒｇ６：：Ｄ７、ＥＲＧ６：：Ｄ２４／ｅｒｇ５：：Ｄ７菌株でコレステロールピーク（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ｐｅａｋ）を確認することができ、ｅｒｇ５：：Ｄ２４／ｅｒｇ６：：Ｄ７（＃１９）菌株が３．１ｐｐｍ、ＥＲＧ６：：Ｄ２４／ｅｒｇ５：：Ｄ７（＃Ｓ１）菌株が７．５ｐｐｍコレステロール生産量を示した（表５）。しかしながら、コレステロール前駆体であるジモステロール（ｚｙｍｏｓｔｅｒｏｌ）、デヒドロデスモステロール（ｄｅｈｙｄｒｏｄｅｓｍｏｓｔｅｒｏｌ）、デスモステロール（ｄｅｓｍｏｓｔｅｒｏｌ）の含量が非常に高かった（図５）。
実験例２：ＤＨＣＲ２４多重挿入を通じて製造したステロール生産菌株に対するＨＬＰＣ分析
生産されたコレステロール生産量増加のために、本研究チームで開発されたｒＤＮＡ－ＮＴＳ基盤多重挿入カセットシステムを用いてＮＴＳ－ＤＨＣＲ２４－８６ＴＲＰ１カセットを追加導入させた菌株のＨＰＬＣ分析結果、＃１９菌株に比べてＮＴＳＤ２４／＃１９組換え菌株において約２．４倍高い７．４ｐｐｍのコレステロール（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ）生成ピークを確認することができた（図６、表５）。また、＃Ｓ１菌株に比べてＮＴＳＤ２４／＃Ｓ１組換え菌株において約１．５倍高い１１．５ｐｐｍのコレステロール（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ）生成ピークを確認することができた（図６、表５）。
実験例３：ＤＨＣＲ２４、ＤＨＣＲ７多重挿入を通した製造した組換え菌株に対するｑＰＣＲおよびＨＰＬＣ分析
ＤＨＣＲ２４、ＤＨＣＲ７の２つの遺伝子発現カセットが共に入っているＮＴＳ－ＤＨＣＲ２４－ＤＨＣＲ７－８６ＴＲＰ１カセットを多重挿入して得られたＮＴＳＤ２４Ｄ７／＃１９組換え菌株の挿入されたカセット数をｑＰＣＲで分析した結果、３～４個まで挿入された菌株を得ることができた（図７ａ）。ＨＰＬＣ分析結果、ｅｒｇ５：：Ｄ２４／ｅｒｇ６：：Ｄ７（＃１９）菌株に比べてＮＴＳＤ２４Ｄ７／ｅｒｇ５：：Ｄ２４／ｅｒｇ６：：Ｄ７（ＮＴＳＤ２４Ｄ７／＃１９）組換え菌株において約２．９倍高い９．０ｐｐｍのコレステロール（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ）生成ピークを確認することができた（図７ｂ）。また、ＨＰＬＣ分析結果、２ｕＤ２４Ｄ７／＃Ｓ１組換え菌株も、＃Ｓ１菌株に比べて約１．５倍高い１１．１ｐｐｍのコレステロール（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ）生成ピークを確認することができた（図７ｃ、表５）。
実験例４：ＥＲＧ２７－ＥＲＧ２融合遺伝子（ｆｕｓｉｏｎ ｇｅｎｅ）、ＥＲＧ３およびＵＰＣ２－１過発現を通じて製造した組換え菌株に対するＨＰＬＣ分析
製作されたＮＴＳＤ２４Ｄ７／＃１９組換え菌株のより良いコレステロール生産効率増加のために、ジモステロールでコレステロール生産に関与するＥＲＧ２７、ＥＲＧ２、ＥＲＧ３遺伝子の追加発現した菌株のＨＰＬＣ分析結果、ＮＴＳＤ２４Ｄ７／＃１９と比較してＥ３Ｅ２／ＮＴＳＤ２４Ｄ７／＃１９、Ｅ３Ｅ２７－２／ＮＴＳＤ２４Ｄ７／＃１９、ＵＰＣ２－１／ＮＴＳＤ２４Ｄ７／＃１９組換え菌株においてコレステロール生産量の差異が大きくなかった（表５．図８）。しかしながら、ＥＲＧ３、ＥＲＧ２７－２またはＵＰＣ２－１が導入された組換え菌株の場合、コレステロール前駆体の生産量は、顕著に増加した傾向を示した。
実験例５：ＨＰＬＣ－ＣＡＤ基盤組換え菌株のコレステロールおよび前駆体生産量分析
ＨＰＬＣ－ＣＡＤ基盤分析法を通じてコレステロールおよび前駆体生産性を分析し、その結果を図９に示した。野生型菌株に比べて組換え菌株＃１９（ｅｒｇ５：：Ｄ２４／ｅｒｇ６：：Ｄ７）は、７－デヒドロデスモステロール、ジモステロール、デスモステロール、７－デヒドロコレステロールおよびコレステロールを高い収率で生産することが確認された。
上記のような方法で製造した組換え菌株のコレステロール（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ）およびコレステロール前駆体の生産量を表５に整理した。
Figure 0007157237000012
実験例６：ステロールエステル（Ｓｔｅｒｏｌ ｅｓｔｅｒ）化主要な遺伝子ＡＲＥ２欠失組換え菌株に対するＨＰＬＣ－ＵＶ／Ｖｉｓ分析
酵母で細胞内過剰のステロール（ｓｔｅｒｏｌ）の貯蔵のために、エステル（ｅｓｔｅｒ）化および脂質液滴（ｌｉｐｉｄ ｄｒｏｐｌｅｔ）保管に関与するＡＲＥ１、ＡＲＥ２遺伝子（Ｈｏｈｍａｎｎ Ｈ－Ｐ ｅｔ．ａｌ．２０１７）のうち好気性成長で主要な機能を担当するＡＲＥ２の欠失を相同組換えによる遺伝子破砕技法でＮＴＳＤ２４Ｄ７／＃１９菌株に試みた（図１０ａ）。遊離コレステロール（Ｆｒｅｅ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ）形態が維持される抽出法で準備したサンプルの場合、野生型菌株背景でコレステロールの量は大きな変化がない反面、前駆体のうちデヒドロデスモステロールの量が大きく減少することが観察された（図１０ｂ）。これは、デヒドロデスモステロールの場合、大部分エステル（ｅｓｔｅｒ）化した状態で存在するが、コレステロールは、大部分遊離した（ｆｒｅｅ）形態で存在することを示唆する。製作されたａｒｅ２Δ／ＮＴＳＤ２４Ｄ７／＃１９菌株のＨＰＬＣ分析結果、コレステロール量は大きな差異がなく、多量蓄積されていたデヒドロデスモステロールの量が多少減少した。このような結果は、ＮＴＳＤ２４Ｄ７／＃１９菌株で生産されるコレステロールは、大部分遊離ステロール（ｆｒｅｅ ｓｔｅｒｏｌ）状態と推定される。
実験例７：野生型菌株対象ステロール生産組換え酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ分析
上記で試みられた戦略のうち多重挿入カセットシステムを用いた染色体（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）内のＮＴＳ－ＤＨＣＲ２４－ＤＨＣＲ７－８６ＴＲＰ１カセットの挿入数増加のための方法で野生型菌株に先にＮＴＳ－ＤＨＣＲ２４－ＤＨＣＲ７－８６ＴＲＰ１カセットを多重挿入させた後、ＥＲＧ６欠失を試みる戦略をもって最初の段階で製作されたＮＴＳＤ２４Ｄ７／ＷＴ組換え菌株の挿入されたカセット数をｑＰＣＲで分析した結果、４～１０個まで挿入された様々な候補菌株を得ることができた（図１１ａ）。その後、ＨＰＬＣ－ＵＶ／Ｖｉｓ分析で７個挿入された候補群（ＮＴＳＤ２４Ｄ７／ＷＴ ＃８）においてエルゴステロール（ｅｒｇｏｓｔｅｒｏｌ）ピーク（ｐｅａｋ）が大きく減少した反面、カンペステロール（ｃａｍｐｅｓｔｅｒｏｌ）と推定されるピーク（ｐｅａｋ）の最も増加した値を示した（図１１ｂ）。したがって、後続実験では、７個挿入された候補群（ＮＴＳＤ２４Ｄ７／ＷＴ ＃８）を使用してＥ３Ｅ２／ＮＴＳＤ２４Ｄ７／ＷＴ、Ｅ３Ｅ２７－２／ＮＴＳＤ２４Ｄ７／ＷＴ菌株を製作したが、ＨＰＬＣ－ＵＶ／Ｖｉｓ分析結果、ＮＴＳＤ２４Ｄ７／ＷＴ菌株と大きな差異が認められなかった。一方、ＵＰＣ２－１／ＮＴＳＤ２４Ｄ７／ＷＴ組換え菌株の場合、全体的なエルゴステロール生合成経路（ｅｒｇｏｓｔｅｒｏｌ ｐａｔｈｗａｙ）活性化のためなのか、かえってエルゴステロール生産が増加した（図１１ｃ）。次に製作されたｅｒｇ６：：Ｄ７／ＵＰＣ２－１／ＮＴＳＤ２４Ｄ７菌株に対してＨＰＬＣ－ＵＶ／Ｖｉｓ分析結果、コレステロール生産量が既存製作した最も高いコレステロール生産量を示すＮＴＳＤ２４Ｄ７／ｅｒｇ５：：Ｄ２４／ｅｒｇ６：：Ｄ７（ＮＴＳＤ２４Ｄ７／＃１９）組換え菌株に比べてさらに優秀ではなかった（図１１ｄ）。
実験例８：ステロール生産組換え菌株＃Ｓ１および＃１９の生長量および副産物蓄積量分析
製作した菌株の代謝副産物蓄積量の確認結果、＃１９（ｅｒｇ５：：Ｄ２４／ｅｒｇ６：：Ｄ７）菌株では、最終培養後にエタノールとアセテートのような副産物が蓄積される反面、＃Ｓ１（ｅｒｇ６：：Ｄ２４／ｅｒｇ５：：Ｄ７）菌株の場合は、アセテートの蓄積は少量あるが、主要な代謝副産物であるエタノールの蓄積は確認されなかったので、野生型と同じ様相を確認することができた。また、細胞生長量の分析結果、＃１９（ｅｒｇ５：：Ｄ２４／ｅｒｇ６：：Ｄ７）菌株のＯＤ６００値の場合、約１４．８と確認されたところ、野生型菌株（ＷＴ）および＃Ｓ１（ｅｒｇ６：：Ｄ２４／ｅｒｇ５：：Ｄ７）菌株それぞれのＯＤ６００値である約４６．５および約５７．３に比べて生長が阻害されることを確認することができた（表６）。
Figure 0007157237000013
実験例９：ＳＣまたはＹＰＤ培地で＃Ｓ１由来菌株とＤＨＣＲ遺伝子コドン最適化菌株のコレステロールおよびコレステロール前駆体生産量分析
細胞生長量および副産物蓄積量の分析結果は、＃１９（ｅｒｇ５：：Ｄ２４／ｅｒｇ６：：Ｄ７）菌株に比べて成長が良好であり、副産物蓄積が殆どない＃Ｓ１（ｅｒｇ６：：Ｄ２４／ｅｒｇ５：：Ｄ７）菌株が、産業的菌株としてさらに適合することを提示している。これにより、＃Ｓ１由来の組換え菌株のコレステロールおよび前駆体生産量をＳＣ培地とＹＰＤ培地で培養してＨＰＬＣ－ＣＡＤ基盤ＬＣクロマトグラムを用いて詳細比較分析を行った（表７）。ＹＰＤ培地で培養時には、ＳＣ培地を用いるときより細胞成長が高くて、総コレステロール生産量は高い反面、ＳＣ培地で培養された場合が、菌体当たり生産されたコレステロール量が高いことを確認することができた。
Figure 0007157237000014
また、ＮＴＳＤ７／ＮＴＳＤ２４／＃Ｓ１組換え菌株に対するＨＰＬＣ分析結果、＃Ｓ１菌株に比べて約１．７倍高い９．３ｐｐｍのコレステロール（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ）生成ピークを確認することができた（図１２ｃ、表８）。また、ｅｒｇ５：：ｃｃＤ２４／ｅｒｇ６：：ｃｃＤ７（＝＃ｃｃ１９）、ＥＲＧ６：：ｃｃＤ２４／ｅｒｇ５：：ｃｃＤ７（＝＃ｃｃＳ１）に対してＨＰＬＣ分析結果、３０．１、２９．４ｐｐｍのコレステロールと６．１、６．０ｐｐｍのジモステロールを生産することが確認され、これは、＃Ｓ１菌株に比べてコレステロール生産量が約５倍以上増大した結果である（図１３ｅ、表８）。
Figure 0007157237000015
また、ＨＰＬＣ分析結果、ｔＨＭＧ１／＃ｃｃ１９、ｔＨＭＧ１／＃ｃｃＳ１菌株が、＃ｃｃ１９、＃ｃｃＳ１菌株に比べて、スクアレン（ｓｑｕａｌｅｎｅ）、オキシドスクアレン（ｏｘｉｄｏｓｑｕａｌｅｎｅ）、ラノステロール （ｌａｎｏｓｔｅｒｏｌ）、ジモステロール（ｚｙｍｏｓｔｅｒｏｌ）が全部蓄積されるパターンを示し、コレステロールの場合、＃ｃｃ１９、＃ｃｃＳ１菌株に比べてＨＰＬＣクロマトグラムピーク面積（ｐｅａｋ ａｒｅａ）の比較時に約１．３～１．５倍程度生産量が増加する傾向を示した（図１４ｃ）。

Claims (13)

  1. ＥＲＧ５およびＥＲＧ６遺伝子が欠失され、ＤＨＣＲ２４およびＤＨＣＲ７遺伝子が導入されたステロール生産能を有する組換え酵母菌株であって、
    前記ＤＨＣＲ２４とＤＨＣＲ７遺伝子の２つのうちの１つ以上の遺伝子のコピー数（ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒ）が多重で導入されるか、またはコドン最適化されたＤＨＣＲ２４とＤＨＣＲ７合成遺伝子が１コピー以上で導入され、
    前記ＤＨＣＲ２４とＤＨＣＲ７遺伝子の２つのうちの１つ以上の遺伝子コピー数（ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒ）は、４～１０であり、
    前記ＤＨＣＲ２４遺伝子はＥＲＧ６遺伝子座に導入され且つ前記ＤＨＣＲ７遺伝子はＥＲＧ５遺伝子座に導入され、又は前記ＤＨＣＲ２４遺伝子はＥＲＧ５遺伝子座に導入され且つ前記ＤＨＣＲ７遺伝子はＥＲＧ６遺伝子座に導入され、追加で導入された前記ＤＨＣＲ２４遺伝子又は前記ＤＨＣＲ７遺伝子は、前記酵母菌株のリボソームＤＮＡ非転写領域（ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＤＮＡ ｎｏｎｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ ｓｐａｃｅｒ；ｒＤＮＡ ＮＴＳ）内に導入され、
    前記ステロールは、コレステロール前駆体またはコレステロールの２つのうちの１つ以上を含み、
    前記コレステロール前駆体は、ジモステロール、デヒドロコレステロール、ラトステロール、デヒドロデスモステロールおよびデスモステロールよりなる群から選ばれる１つ以上を含むことを特徴とする、ステロール生産能を有する組換え酵母菌株。
  2. 前記組換え酵母菌株には、ＥＲＧ３、ＥＲＧ２、ＥＲＧ２７およびＵＰＣ２－１遺伝子よりなる群から選ばれる１つ以上の遺伝子が追加で導入されることを特徴とする、請求項１に記載のステロール生産能を有する組換え酵母菌株。
  3. 前記組換え酵母菌株には、ＥＲＧ２７－ＥＲＧ２融合タンパク質をコードする合成遺伝子が追加で導入されることを特徴とする、請求項１に記載のステロール生産能を有する組換え酵母菌株。
  4. 前記ＤＨＣＲ２４遺伝子は、ＥＲＧ６遺伝子座に導入され、
    前記ＤＨＣＲ７遺伝子は、ＥＲＧ５遺伝子座に導入されることを特徴とする、請求項１に記載のステロール生産能を有する組換え酵母菌株。
  5. 前記組換え菌株は、サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）リボソームＤＮＡ非転写領域（ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＤＮＡ ｎｏｎｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ ｓｐａｃｅｒ；ｒＤＮＡ ＮＴＳ）のＮ末端断片遺伝子、挿入目的遺伝子、プロモーター領域を含む栄養要求性選択標識マーカー遺伝子およびサッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ｒＤＮＡ ＮＴＳのＣ末端断片遺伝子を順に含む遺伝子多重挿入カセットを用いて製造されたことを特徴とする、請求項１に記載のステロール生産能を有する組換え酵母菌株。
  6. 前記遺伝子多重挿入カセットのｒＤＮＡ ＮＴＳのＮ末端断片遺伝子は、配列番号１で表され、前記ｒＤＮＡ ＮＴＳのＣ末端断片遺伝子は、配列番号２で表されることを特徴とする、請求項５に記載のステロール生産能を有する組換え酵母菌株。
  7. 前記コドン最適化されたＤＨＣＲ２４合成遺伝子は、配列番号１７で構成され、前記ＤＨＣＲ７合成遺伝子は、配列番号１８で構成されることを特徴とする、請求項１に記載のステロール生産能を有する組換え酵母菌株。
  8. 前記組換え酵母菌株は、ｔＨＭＧ１遺伝子が宿主の染色体上に追加導入されたことを特徴とする、請求項１に記載の組換え酵母菌株。
  9. 酵母菌株のＥＲＧ５およびＥＲＧ６遺伝子を欠失させた後、ＤＨＣＲ２４およびＤＨＣＲ７遺伝子を導入する段階を含み、前記ＤＨＣＲ２４とＤＨＣＲ７遺伝子の２つのうちの１つ以上の遺伝子のコピー数（ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒ）を多重で導入し、
    前記ＤＨＣＲ２４とＤＨＣＲ７遺伝子の２つのうちの１つ以上の遺伝子コピー数（ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒ）は、４～１０であり、
    前記ＤＨＣＲ２４遺伝子はＥＲＧ６遺伝子座に導入され且つ前記ＤＨＣＲ７遺伝子はＥＲＧ５遺伝子座に導入され、又は前記ＤＨＣＲ２４遺伝子はＥＲＧ５遺伝子座に導入され且つ前記ＤＨＣＲ７遺伝子はＥＲＧ６遺伝子座に導入され、追加で導入された前記ＤＨＣＲ２４遺伝子又は前記ＤＨＣＲ７遺伝子は、前記酵母菌株のリボソームＤＮＡ非転写領域（ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＤＮＡ ｎｏｎｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ ｓｐａｃｅｒ；ｒＤＮＡ ＮＴＳ）内に導入され、
    前記ステロールは、コレステロール前駆体またはコレステロールの２つのうちの１つ以上を含み、
    前記コレステロール前駆体は、ジモステロール、デヒドロコレステロール、ラトステロール、デヒドロデスモステロールおよびデスモステロールよりなる群から選ばれる１つ以上を含むことを特徴とする、ステロール生産能を有する組換え酵母菌株の製造方法。
  10. 前記酵母菌株は、サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）であることを特徴とする、請求項９に記載のステロール生産能を有する組換え酵母菌株の製造方法。
  11. 前記ＤＨＣＲ２４およびＤＨＣＲ７遺伝子導入は、サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）リボソームＤＮＡ非転写領域（ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＤＮＡ ｎｏｎｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ ｓｐａｃｅｒ；ｒＤＮＡ ＮＴＳ）のＮ末端断片遺伝子、挿入目的遺伝子、プロモーター領域を含む栄養要求性選択標識マーカー遺伝子およびサッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ｒＤＮＡ ＮＴＳのＣ末端断片遺伝子を順に含む遺伝子多重挿入カセットを用いて行うことを特徴とする、請求項９に記載のステロール生産能を有する組換え酵母菌株の製造方法。
  12. 請求項１～請求項８のいずれか１項に記載の組換え酵母菌株を培地に培養してステロールを生産する方法。
  13. 前記培養は、２５～３５℃で２～１０日間行うことを特徴とする、請求項１２に記載のステロールを生産する方法。
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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114606147B (zh) * 2022-03-15 2022-12-16 江南大学 一种同时增强和抑制酿酒酵母7-脱氢胆固醇合成中多个关键基因的方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008507974A (ja) 2004-07-27 2008-03-21 ザ レジェンツ オブ ザ ユニバーシティー オブ カリフォルニア イソプレノイド化合物を生産するための遺伝的に修飾された宿主細胞および同宿主細胞の使用方法
JP2017527306A (ja) 2014-08-21 2017-09-21 チュン−アン ユニヴァーシティ インダストリー−アカデミー コーポレーション ファウンデーションＣｈｕｎｇ−Ａｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ−Ａｃａｄｅｍｙ Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｒＤＮＡ ＮＴＳ基盤の遺伝子多重挿入カセットセット、及びそれを用いたＧＲＡＳ等級の組換え酵母菌株

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040235088A1 (en) * 1997-09-30 2004-11-25 Schering Aktiengesellschaft Process for the production of ergosterol and its intermediate products using recombinant yeasts
KR100418187B1 (ko) 2001-06-22 2004-02-11 (주)케이디알 콜레스테롤을 체내 합성하는 형질전환된 꼬마선충
JP2012024084A (ja) * 2010-06-25 2012-02-09 Mitsubishi Chemicals Corp 新規酵母およびそれを用いたδ５，７−ステロール及びハイドロコルチゾンの製造方法
CN106887444B (zh) 2015-12-15 2020-01-10 昆山工研院新型平板显示技术中心有限公司 有机发光显示器件及显示装置
CN106754993B (zh) * 2017-02-17 2020-06-30 天津大学 一种基因、重组酿酒酵母菌株及其构建方法与应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008507974A (ja) 2004-07-27 2008-03-21 ザ レジェンツ オブ ザ ユニバーシティー オブ カリフォルニア イソプレノイド化合物を生産するための遺伝的に修飾された宿主細胞および同宿主細胞の使用方法
JP2017527306A (ja) 2014-08-21 2017-09-21 チュン−アン ユニヴァーシティ インダストリー−アカデミー コーポレーション ファウンデーションＣｈｕｎｇ−Ａｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ−Ａｃａｄｅｍｙ Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｒＤＮＡ ＮＴＳ基盤の遺伝子多重挿入カセットセット、及びそれを用いたＧＲＡＳ等級の組換え酵母菌株

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Biotechnol. Biofuels, 2018, 11:192
J. Lipid Res., 2011, 52(5), pp.1062-1065

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