ES2891377T3 - Polipéptidos de valenceno sintasa, moléculas de ácido nucleico codificantes y usos de los mismos - Google Patents

Abstract

Una célula recombinante que produce valenceno y aristoloqueno, donde a) la célula recombinante comprende un ácido nucleico heterólogo que codifica un polipéptido de valenceno sintasa que tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia con la secuencia establecida en la SEC. N.º ID.:1, o un fragmento con actividad catalítica del mismo; o b) la célula recombinante comprende un polipéptido de valenceno sintasa heterólogo que tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia con la secuencia establecida en la SEC. N.º ID.:1, o un fragmento con actividad catalítica del mismo.

Description

DESCRIPCIÓN

Polipéptidos de valenceno sintasa, moléculas de ácido nucleico codificantes y usos de los mismos

CAMPO DE LA INVENCIÓN

Se proporcionan células hospedadoras que contienen los ácidos nucleicos y métodos para producir productos cuya producción está catalizada por polipéptidos. También se proporcionan métodos para producir valenceno.

ANTECEDENTES

El valenceno y la nootkatona son sesquiterpenos que se encuentran en los aceites esenciales, como los aceites de cítricos, incluidos la naranja y el pomelo. El valenceno se produce por ciclación del farnesil difosfato (FPP), un pirofosfato acíclico precursor de terpenos, y la oxidación del valenceno da lugar a la formación de nootkatona. Tanto el valenceno como la nootkatona se utilizan en la industria de la perfumería y los aromas.

El valenceno originalmente se extraía de la piel de naranja de Valencia y la nootkatona se extrae de la piel de pomelo o se produce por oxidación del valenceno extraído. Aunque se han intentado enfoques químicos para generar valenceno y nootkatona, las estructuras sumamente complejas de estos compuestos han hecho que los procesos de síntesis económicamente viables para su producción en grandes cantidades sean inalcanzables. El valenceno se ha producido en células hospedadoras mediante catálisis por un ácido nucleico que codifica una valenceno sintasa de cítricos (véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 7.442.785). Se buscan mejoras en la producción y medios alternativos de producción de valenceno y otros terpenos.

Así, entre los objetos detallados en la presente memoria, está la provisión y polipéptidos de valenceno sintasa y métodos para la producción de productos terpénicos cuya producción está catalizada por los polipéptidos.

En la patente de EE.UU. n.° 2012/246767 A1 se dan a conocer polipéptidos de valenceno sintasa modificados y métodos para utilizar polipéptidos de valenceno sintasa modificados y producir sintasas modificadas de terpenos. En DATABASE EMBL [Online] 1 de abril de 2012, «ARNm de la alfa copaeno sintasa (Cop) de Eleutherococcus trifoliatus, secuencia de codificación (cds) completa» (Eleutherococcus trifoliatus alpha copaene synthase (Cop) mRNA, complete cds) se da a conocer un código genético para el ARNm de la alfa copaeno sintasa (Cop) de Eleutherococcus trifoliatus.

En «De Novo Synthesis of High-Value Plant Sesquiterpenoids in Yeast», Methods in Enzymology, Academic Press, EE. UU., vol. 517 (2012), 261-278 de Nguyen et al., se da a conocer la producción in vivo de, y métodos para producir, 5-epi-aristoloqueno, 5-epi-aristoloqueno fusionado con tiorredoxina y sesquiterpeno hidroxilado utilizando una levadura genomanipulada.

RESUMEN

En un primer aspecto, la invención comprende una célula recombinante que produce valenceno y aristoloqueno, en donde la célula recombinante comprende un ácido nucleico heterólogo que codifica un polipéptido de valenceno sintasa que tiene una identidad de secuencia de al menos un 85 % con la secuencia establecida en la SEC. N.° ID.: 1, o un fragmento con actividad catalítica del mismo; o la célula recombinante comprende un polipéptido de valenceno sintasa heterólogo que tiene una identidad de secuencia de al menos un 85 % con la secuencia establecida en la SEC. N.° ID.: 1, o un fragmento con actividad catalítica del mismo.

En un segundo aspecto, la invención comprende un método de producción de valenceno y aristoloqueno en una célula recombinante, que comprende el cultivo de la célula recombinante en condiciones adecuadas para la expresión del polipéptido de valenceno sintasa, donde la célula produce valenceno y aristoloqueno de este modo, donde la célula recombinante comprende un ácido nucleico heterólogo que codifica un polipéptido de valenceno sintasa que tiene una identidad de secuencia de al menos un 85 % con la secuencia establecida en la SEC. N.° ID.: 1, o un fragmento con actividad catalítica del mismo; o la célula recombinante comprende un polipéptido de valenceno sintasa heterólogo que tiene una identidad de secuencia de al menos un 85 % con la secuencia establecida en la SEC. N.° ID.: 1, o un fragmento con actividad catalítica del mismo.

Se dan a conocer valenceno sintasas de Eryngium (EgVS). Se dan a conocer polipéptidos de valenceno sintasa aislados que tienen una secuencia aminoacídica que tiene una identidad de secuencia de al menos un 55 %, como al menos un 58 % o al menos un 85 %, con el polipéptido de valenceno sintasa cuya secuencia está establecida en la SEC. N.° ID.:1. La sintasa de Eryngium glaciale ejemplificada tiene la secuencia aminoacídica establecida en la SEC. N.° ID.:1. Las valenceno sintasas dadas a conocer en la presente memoria catalizan la producción de valenceno y otros productos a partir de un pirofosfato acíclico precursor de terpenos, como, entre otros, el farnesil difosfato. La producción se puede efectuar in vitro poniendo en contacto la sintasa aislada con un pirofosfato acíclico precursor de terpenos, o in vivo en una célula hospedadora adecuada que codifique la sintasa. Las células hospedadoras adecuadas producen o están modificadas para producir un pirofosfato acíclico precursor. Si las células son de origen humano, se trata de células aisladas o cultivadas en un cultivo celular. Las células, como las de levadura, en particular las que expresan un pirofosfato acíclico precursor de terpenos, que expresan EgVS, producen cantidades muy elevadas de valenceno en comparación con las mismas células que expresan la valenceno sintasa de cítricos (CVS) (Citrus sinensis) y sus variantes optimizadas y/o modificadas para expresar concentraciones elevadas de valenceno.

También se dan a conocer moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de las valenceno sintasas dadas a conocer en la presente memoria. Las moléculas de ácido nucleico incluyen moléculas de ácido nucleico aisladas y también ADNc. Por ejemplo, las moléculas de ácido nucleico dadas a conocer en la presente memoria son las que codifican la secuencia aminoacídica establecida en la SEC. N.° ID.: 1, y también cualquiera que codifica una secuencia aminoacídica que tenga una identidad de secuencia de al menos un 58 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 % 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con un polipéptido de valenceno sintasa cuya secuencia está establecida en la SEC. ID NO: 1 o un fragmento con actividad catalítica del mismo, donde el polipéptido codificado cataliza la producción de valenceno a partir de un pirofosfato acíclico precursor de terpenos. Por ejemplo, la molécula de ácido nucleico aislada se selecciona de entre las moléculas de ácido nucleico que contienen: (a) la secuencia de ácidos nucleicos establecida en la SEC. N.° ID.:2; (b) una secuencia de ácidos nucleicos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 85 % con una secuencia de ácidos nucleicos establecida en la SEC. N.° ID.:2; y (c) degeneraciones de (a) y (b). También se dan a conocer los polipéptidos aislados y los fragmentos con actividad catalítica codificados por las moléculas de ácido nucleico proporcionadas en la presente memoria. Los polipéptidos codificados se pueden producir por expresión en cualquier célula hospedadora, incluidas células eucariotas y procariotas, como células de mamífero, células de levadura y células bacterianas. En ejemplos en los que la célula hospedadora es una célula de mamífero que es una célula humana, la célula es una célula aislada o una célula en cultivo, como en un cultivo celular.

También se dan a conocer vectores que contienen las moléculas de ácido nucleico proporcionadas en la presente memoria. Entre los vectores se incluyen vectores procariotas y eucariotas, incluidos vectores víricos y vectores de levadura, como vectores de Saccharomyces.

También se dan a conocer células que contienen los vectores y las moléculas de ácido nucleico que codifican una EgVS. Las células incluyen células procariotas y eucariotas, incluidas, entre otras, células de bacterias, de levadura, de insectos, de plantas y de mamíferos. En ejemplos en los que la célula hospedadora es una célula de mamífero que es una célula humana, la célula es una célula aislada o una célula cultivada. En algunos ejemplos, el ácido nucleico es heterólogo para la célula. Entre las células de levadura dadas a conocer en la presente memoria se incluyen, entre otras, células del género Saccharomyces y células del género Pichia. Entre las células bacterianas descritas en la presente memoria se incluyen células de Escherichia coli. Entre las células vegetales descritas en la presente memoria se incluyen los protoplastos. Las células pueden producir el precursor acíclico, como el farnesil difosfato, de forma nativa, o se pueden modificar para que lo produzcan o para producir más que una célula que no está modificada. Entre las células proporcionadas en la presente memoria se encuentran las que codifican un polipéptido de valenceno sintasa, donde: la célula hospedadora produce un pirofosfato acíclico precursor de terpenos; el polipéptido de valenceno sintasa es heterólogo para el hospedador; y la valenceno sintasa cataliza la producción de valenceno a partir del pirofosfato acíclico precursor de terpenos, como el farnesil difosfato. También se dan a conocer plantas transgénicas que codifican los polipéptidos de valenceno sintasa dados a conocer en la presente memoria. Pueden incluir un ácido nucleico que codifica el polipéptido de valenceno sintasa o un vector adecuado que lo codifica. Entre las plantas transgénicas dadas a conocer se incluyen plantas de tabaco.

En la presente memoria se dan a conocer métodos para producir un polipéptido de valenceno sintasa. Los métodos incluyen los pasos de introducir una molécula de ácido nucleico que codifica los polipéptidos de valenceno sintasa, o fragmentos con actividad catalítica de los mismos, dados a conocer en la presente memoria o un vector que codifica el polipéptido de valenceno sintasa, o fragmentos con actividad catalítica del mismo, en una célula, por ejemplo, mediante transfección o transformación; cultivar la célula in vitro o in vivo en condiciones adecuadas para la expresión del polipéptido de valenceno sintasa o de un fragmento con actividad catalítica del mismo; y, opcionalmente, aislar el polipéptido de valenceno sintasa. Las células para su uso en los métodos incluyen células hospedadoras eucariotas y procariotas, incluidas, entre otras, células de bacterias, de levadura, de insectos, de plantas y de mamíferos. Las células de levadura para su uso en los métodos incluyen, entre otras, células del género Saccharomyces y células del género Pichia.

También se dan a conocer métodos para producir valenceno. Los métodos suponen poner en contacto un pirofosfato acíclico precursor de terpenos con un polipéptido de valenceno sintasa o un fragmento con actividad catalítica del mismo, dados a conocer en la presente memoria, in vitro o in vivo, en condiciones adecuadas para la formación de valenceno a partir del pirofosfato acíclico precursor de terpenos, como el farnesil difosfato. En algunos ejemplos, el valenceno se aísla o se purifica. En los métodos proporcionados, el paso de poner en contacto el pirofosfato acíclico precursor de terpenos con el polipéptido de valenceno sintasa o el fragmento con actividad catalítica del mismo se puede efectuar in vitro o in vivo en una célula hospedadora adecuada dada a conocer en la presente memoria. Cuando se efectúa in vivo, los ácidos nucleicos o vectores se pueden introducir en las células según se describe en la presente memoria, de manera que el polipéptido de valenceno sintasa codificado o el fragmento catalítico del mismo es heterólogo para las células, y las células se cultivan en condiciones en las que se expresa la valenceno sintasa codificada. Las células para su uso en dichos métodos se pueden modificar para producir el precursor acíclico o para producir más del precursor acíclico que las células que no están modificadas. Entre las células y los métodos para seleccionar dichas células dados a conocer se encuentran los descritos en las patentes de EE. UU. n.° 8.609.371 (publicación de EE.UU. n.° 2010-0151555) y 8.481.286 (publicación de EE.UU. n.° 2010-0151519). El valenceno se puede transformar en nootkatona, por ejemplo, mediante oxidación, lo que se puede llevar a cabo por métodos conocidos, incluidos métodos biosintéticos y químicos.

Por lo tanto, en la presente memoria también se dan a conocer métodos para producir nootkatona. Dichos métodos conllevan la producción de valenceno mediante los pasos establecidos en cualquiera de los métodos proporcionados en la presente memoria para la producción de valenceno; el aislamiento del valenceno producido; la oxidación del valenceno para producir nootkatona; y el aislamiento de la nootkatona. El valenceno se puede oxidar química o biosintéticamente.

En cualquiera de los métodos proporcionados, se puede utilizar cualquier método conocido por el experto en la técnica para aislar el valenceno y/o la nootkatona, así como cualesquiera otros productos de la reacción o reacciones, incluido el aristoloqueno, que es el compuesto del pico 2 en la Figura 3A. Dichos métodos de aislamiento incluyen, entre otros, la extracción con un disolvente orgánico y/o la cromatografía en columna.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

La FIGURA 1 es el esquema de reacción para la producción de valenceno y nootkatona. Las valenceno sintasas son terpeno ciclasas vegetales de clase 1 o sintasas que transforman el farnesil difosfato (FPP) en el sesquiterpeno valenceno. El valenceno se puede a continuación oxidar para formar nootkatona.

FIGURAS 2A-B. En la Figura 2A se muestra el cromatograma de gases del extracto de aceite de la planta Eryngium glaciale. El valenceno (pico 1) se detecta a los 10,18 minutos. En la Figura 2B se muestra el espectro de masas del pico que aparece a los 10,18 minutos, correspondiente al valenceno.

FIGURAS 3A-B. La Figura 3A representa el cromatograma de gases de un ejemplo de cepa de levadura designada cepa ALX7-95 transformada con un gen que codifica la valenceno sintasa de Eryngium glaciale. El valenceno (pico 1) se observa a los 12,46 minutos. Un compuesto adicional (designado pico 2) se observa a los 12,37 minutos. En la Figura 3B se representa el espectro de masas del pico que aparece a los 12,46 minutos, correspondiente al valenceno.

En las FIGURAS 4A-G se muestran ejemplos de alineamiento de la valenceno sintasa de Eryngium glaciale (EGVS) con otras valenceno sintasas. Un "*" significa que los restos o nucleótidos en esa columna son idénticos en todas las secuencias en el alineamiento, un ":" significa que se han observado sustituciones conservadas, y un "." significa que se observan sustituciones semiconservadas. Por ejemplo, la Figura 4A representa el alineamiento de la valenceno sintasa de Eryngium glaciale establecida en la SEC. N.° ID.:1 con la valenceno sintasa de Citrus sinensis (CVS) establecida en la SEC. N.° ID.:14. En la Figura 4B se muestra el alineamiento de la valenceno sintasa de Eryngium glaciale establecida en la SEC. N.° ID.:1 con la valenceno sintasa de Citrus x paradisi (CVS) establecida en la SEC. N.° ID.:15. En la Figura 4C se muestra el alineamiento de la valenceno sintasa de Eryngium glaciale establecida en la SEC. N.° ID.:1 con la valenceno sintasa de Vitis vinifera (VVS) establecida en la SEC. N.° ID.:16. En la Figura 4D se muestra el alineamiento de la valenceno sintasa de Eryngium glaciale establecida en la SEC. N.° ID.:1 con la valenceno sintasa de Chamaecyparis nootkatensis (CNVS) establecida en la SEC. N.° ID.:17. En la Figura 4E se representa el alineamiento de la valenceno sintasa de Eryngium glaciale establecida en la SEC. N.° ID.:1 con una valenceno sintasa CVS modificada designada V277 (descrita en la publicación de EE. UU. en trámite n.° 2012-0246767), cuya secuencia está establecida en la SEC. N.° ID.:31. En la Figura 4F se muestra el alineamiento de la valenceno sintasa de Eryngium glaciale establecida en la SEC. N.° ID.:1 con la valenceno sintasa de Chamaecyparis nootkatensis (CNVS) establecida en la SEC. N.° ID.:29. En la Figura 4G se muestra el alineamiento de la valenceno sintasa de Eryngium glaciale establecida en la SEC. N.° ID.:1 con la valenceno sintasa de Perilla frutescens (PFVS) establecida en la SEC. N.° ID.:38.

En las FIGURAS 5A-J se muestran ejemplos de alineamiento de la valenceno sintasa de Eryngium glaciale (EGVS) con otras valenceno sintasas. Un "*" significa que los restos o nucleótidos en esa columna son idénticos en todas las secuencias en el alineamiento, un ":" significa que se han observado sustituciones conservadas, y un "." significa que se observan sustituciones semiconservadas. Por ejemplo, la Figura 5A representa el alineamiento de la valenceno sintasa de Eryngium glaciale establecida en la SEC. N.° ID.:1 con la alfa-copaeno sintasa de Eleutherococcus trifoliatus (ETACS) establecida en la SEC. N.° ID.:18. En la Figura 5B se muestra el alineamiento de la valenceno sintasa de Eryngium glaciale establecida en la SEC. N.° ID.:1 con la germacreno-D sintasa de Actinidia deliciosa (ADGDS) establecida en la SEC. N.° ID.:19. En la Figura 5C se muestra el alineamiento de la valenceno sintasa de Eryngium glaciale establecida en la SEC. N.° ID.:1 con la (-)-germacreno-D sintasa de Vitis vinifera (VDGS) establecida en la SEC. N.° ID.:20. En la Figura 5D se muestra el alineamiento de la valenceno sintasa de Eryngium glaciale establecida en la SEC. N.° ID.:1 con la sesquiterpeno sintasa de Santalum murrayanum (SMSS) establecida en la SEC. N.° ID.:21. En la Figura 5E se muestra el alineamiento de la valenceno sintasa de Eryngium glaciale establecida en la SEC. N.° ID.:1 con la (+)-delta-cadineno sintasa de Ricinus communis (RCDCS) establecida en la SEC. N.° ID.:22. En la Figura 5F se muestra el alineamiento de la valenceno sintasa de Eryngium glaciale establecida en la SEC. N.° ID.:1 con la delta-cadineno sintasa de Citrus x paradisi (DCSC) establecida en la SEC. N.° ID.:23. En la Figura 5G se muestra el alineamiento de la valenceno sintasa de Eryngium glaciale establecida en la SEC. N.° ID.:1 con la 5-epi-aristoloqueno sintasa de Nicotiana tabacum (TEAS) establecida en la SEC. N.° ID.:24. En la Figura 5H se muestra el alineamiento de la valenceno sintasa de Eryngium glaciale establecida en la SEC. N.° ID.:1 con la premnaspirodieno sintasa de Hyoscyamus muticus (HPS) establecida en la SEC. N.° ID.:25. En la Figura 5I se muestra un alineamiento de la valenceno sintasa de Eryngium glaciale establecida en la SEC. N.° ID.:1 con la germacreno D sintasa de Citrus hystrix establecida en la SEC. N.° ID.:45. En la Figura 5J se muestra un alineamiento de V277 establecida en la SEC. N.° ID.:31 y la valenceno sintasa de cítricos establecida en la SEC. N.° ID.:14.

La Figura 6 representa los parámetros cinéticos de la enzima en estado estacionario para la valenceno sintasa de E. glaciale (EgVS), cuya secuencia está establecida en la SEC. N.° ID.:1 (izquierda) y la valenceno sintasa V277 (CVS con marcaje), cuya secuencia está establecida en la SEC. N.° ID.:31 (derecha); FPP = farnesil difosfato.

La Figura 7 demuestra que la cantidad de valenceno producida en la levadura catalizada por la VSE es significativamente mayor que la producida en la levadura catalizada por la CVS.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

Índice

A. Definiciones

B. Perspectiva general

1. Estructura y usos del valenceno

2. Nootkatona

3. Valenceno sintasas

a. Estructura

b. Actividades

4. Ensayos para detectar la actividad enzimática de polipéptidos de valenceno sintasa

C. Moléculas de ácido nucleico que codifican la valenceno sintasa de Eryngium glaciale y polipéptidos codificados

1. Aislamiento del ácido nucleico que codifica las valenceno sintasas a. Generación de ácido nucleico modificado

2. Vectores y células para la expresión de polipéptidos de valenceno sintasa

3. Sistemas de expresión

a. Células procariotas

b. Células de levadura

c. Plantas y células vegetales

d. Insectos y células de insectos

e. Células de mamífero

4. Purificación

D. Polipéptidos de valenceno sintasa

1. Polipéptidos de valenceno sintasa de Eryngium glaciale

2. Modificaciones de los polipéptidos de valenceno sintasa de Eryngium glaciale

a. Polipéptidos truncados

b. Polipéptidos con actividades o propiedades alteradas

c. Intercambio de dominios

d. Variantes adicionales

e. Proteínas de fusión

E. Métodos para la producción de terpenos y métodos para la detección de dichos productos y de la actividad de los polipéptidos de valenceno sintasa

1. Producción de terpenos catalizada por la valenceno sintasa de Eryngium glaciale

a. Ejemplos de células

b. Cultivo de células

c. Aislamiento y evaluación de los productos

2. Producción de nootkatona

F. Ejemplos

A. DEFINICIONES

A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente memoria tienen el mismo significado que un experto en la técnica a la que pertenecen las invenciones entiende comúnmente.

En el caso de que exista una pluralidad de definiciones para los términos utilizados en la presente memoria, las definiciones que se aporten en esta sección prevalecerán. Cuando se hace referencia a una URL u otro identificador o dirección, se entiende que dichos identificadores pueden cambiar y que la información concreta en Internet puede aparecer y desaparecer, pero que se puede encontrar información equivalente buscando en Internet. La referencia a la misma es una prueba de la disponibilidad y la difusión al público de dicha información.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, un pirofosfato acíclico precursor de terpenos es cualquier compuesto de pirofosfato acíclico que es un precursor en la producción de al menos un terpeno, incluidos, entre otros, el farnesil pirofosfato (FPP), el geranil pirofosfato (GPP) y el geranilgeranil pirofosfato (GGPP). Los pirofosfatos acíclicos precursores de terpenos son, por lo tanto, sustratos para las terpeno sintasas.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, un terpeno es un hidrocarburo insaturado formado por unidades de isopreno (C5H8), y que tiene la fórmula general C5xH8x, como C10H16. La referencia a un terpeno incluye terpenos acíclicos, monocíclicos y policíclicos. Los terpenos incluyen, entre otros, los monoterpenos, que contienen 10 átomos de carbono; los sesquiterpenos, que contienen 15 átomos de carbono; los diterpenos, que contienen 20 átomos de carbono, y los triterpenos, que contienen 30 átomos de carbono. La referencia a un terpeno también incluye los estereoisómeros del terpeno.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, una terpeno sintasa es un polipéptido con la capacidad de catalizar la formación de uno o más terpenos a partir de un pirofosfato acíclico precursor de terpenos, como, por ejemplo, FPP, GPP o GGPP.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, el valenceno es un sesquiterpeno que tiene la siguiente estructura:

La referencia al valenceno incluye la referencia a cualquier isómero del mismo, incluido, entre otros, el (+)-valenceno.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, la nootkatona es un sesquiterpenoide que tiene la siguiente estructura:

La referencia a la nootkatona incluye la referencia a cualquier isómero de la misma.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, una «valenceno sintasa» o un «polipéptido de valenceno sintasa» es un polipéptido con la capacidad de catalizar la formación de valenceno a partir de un pirofosfato acíclico precursor de terpenos, como el farnesil difosfato (FPP). Entre los polipéptidos de valenceno sintasa de la presente memoria se incluyen cualesquiera que tengan una identidad de secuencia superior o aproximadamente superior a un 63 %, 65 %, 70 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % con la valenceno sintasa establecida en la SEC. N.° ID.: 1, cuando se alinea a lo largo de toda su longitud, o un fragmento con actividad catalítica del mismo. Estos polipéptidos catalizan la producción de valenceno como el único producto o un producto entre una mezcla de productos formados a partir de la reacción de un pirofosfato acíclico precursor de terpenos con una valenceno sintasa. Normalmente, el valenceno es el producto más prevalente o se encuentra entre varios productos prevalentes. Por ejemplo, la cantidad de valenceno producida a partir de la reacción de una valenceno sintasa con un pirofosfato acíclico precursor de terpenos suele ser al menos o aproximadamente de un 1 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o más de la cantidad total de terpeno producida en la reacción. En algunos casos, el valenceno es el terpeno predominante producido (es decir, presente en mayores cantidades que cualquier otro terpeno individual producido a partir de la reacción de un pirofosfato acíclico precursor de terpenos con una valenceno sintasa).

La referencia a una valenceno sintasa incluye cualquier polipéptido que catalice la producción de valenceno, incluido, entre otros, un polipéptido producido mediante recombinación, un polipéptido producido mediante síntesis y un polipéptido de valenceno sintasa extraído o aislado de células y materia vegetal a partir de la que se ha aislado valenceno, incluidas, entre otras, las especies de cardo, según se proporciona en la presente memoria. Otros ejemplos de polipéptidos de valenceno sintasa incluyen los aislados de cítricos, flores de vid (por ejemplo, Vitis vinifera L. cv. Gewürztraminer y Vitis vinifera L. cv. Cabernet Sauvignon (véase Lucker et al., (2004) Phytochemistry 65(19):2649-2659 y Martin et al., (2009) Proc. Natl. Acad. Sci, EE. UU. 106:7245-7250) y perilla (shiso verde). Entre las valenceno sintasas de cítricos (CVS) se incluyen, entre otras, la valenceno sintasa de Citrus sinensis (naranja dulce) (SEC. N.° ID.:14 y 34) y Citrus x paradisi (pomelo) (SEC. N.° ID.:15, 26 y 27). Otros ejemplos de polipéptidos de valenceno sintasa incluyen la valenceno sintasa aislada de flores de vid, incluida Vitis vinifera L. cv. Gewürztraminer y Vitis vinifera L. cv. Cabernet Sauvignon (SEC. N.° ID.:16 y 28), valenceno sintasas aisladas de Chamaecyparis nootkatensis pendula (SEC. N.° ID.:17 y 29) y valenceno sintasa de Perilla frutescens (SEC. N.° ID.:38). La referencia a la valenceno sintasa incluye la valenceno sintasa de cualquier género o especie, e incluye variantes alélicas o de especies, variantes codificadas por variantes de empalme y otras variantes de las mismas, incluidos polipéptidos que tienen una identidad de secuencia de al menos o aproximadamente un 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más con la valenceno sintasa establecida en la SEC. N.° ID.:1. La valenceno sintasa también incluye fragmentos de la misma que conservan la actividad de valenceno sintasa.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, los fragmentos con actividad catalítica de los polipéptidos de valenceno sintasa son polipéptidos de sintasa truncados que conservan la capacidad de catalizar la formación de valenceno a partir de un pirofosfato acíclico precursor de terpenos. Un experto en la técnica puede identificar fácilmente un fragmento de una sintasa que conserva la actividad catalítica mediante su evaluación en cualquier ensayo adecuado, como los descritos en la presente memoria, y la detección de la formación de valenceno a partir del precursor.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, la «actividad de valenceno sintasa» (también denominada en la presente memoria actividad catalítica) hace referencia a la capacidad de catalizar la formación de valenceno a partir de un pirofosfato acíclico precursor de terpenos, como el farnesil difosfato (FPP). Los métodos para evaluar la formación de valenceno a partir de la reacción de una sintasa con un pirofosfato acíclico precursor de terpenos, como el FPP, son bien conocidos en la técnica y se describen en la presente memoria. Por ejemplo, la sintasa se puede expresar en una célula hospedadora, como una célula de levadura, que también produce FPP. La producción de valenceno se puede entonces evaluar y cuantificar mediante, por ejemplo, cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS) (véanse los ejemplos a continuación). Se considera que una sintasa presenta actividad de valenceno sintasa o la capacidad de catalizar la formación de valenceno a partir de un pirofosfato acíclico precursor de terpenos, como el FPP, si la cantidad de valenceno producida a partir de la reacción es de al menos o aproximadamente un 1 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o más de la cantidad total de terpenos producidos en la reacción.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, «actividad catalítica aumentada» con referencia a la actividad de una valenceno sintasa significa que la capacidad de catalizar la formación de valenceno a partir de un pirofosfato acíclico precursor de terpenos, como el farnesil difosfato (FPP), aumenta, lo que da lugar a una mayor formación de valenceno. A efectos de la presente memoria, una valenceno sintasa presenta una actividad catalítica aumentada si la cantidad de valenceno producida a partir de FPP por la valenceno sintasa modificada es de un 10 % a un 500 %, de un 10 % a un 250 %, de un 50 % a un 250 %, de un 100 % a un 500 % o es de un 100 % a un 250 % superior a la cantidad de valenceno producida a partir de FPP por la valenceno sintasa establecida en la SEC. N.° ID.: 1, como un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 110 %, 120 %, 130 %, 140 %, 150 %, 160 %, 170 %, 180 %, 190 %, 200 %, 250 %, 300 %, 350 %, 400 %, 500 %, o más, superior a la cantidad de valenceno producida a partir de FPP por la valenceno sintasa establecida en la SEC. N.° ID.:1. Por ejemplo, una valenceno sintasa presenta una actividad catalítica aumentada si la cantidad de valenceno producida a partir de FPP por la valenceno sintasa modificada es al menos o aproximadamente al menos un 110 %, 115 %, 120 %, 125 %, 130 %, 135 %, 140 %, 145 %, 150 %, 160 %, 170 %, 180 %, 200 %, 250 %, 300 %, 350 %, 400 %, 500 %, 1500 %, 2000 %, 3000 %, 4000 %, 5000 % de la cantidad de valenceno producida a partir de FPP por la valenceno sintasa nativa establecida en la SEC. N.° ID.: 1 en las mismas condiciones.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, «sin mutaciones» o «nativo/a» con referencia a la valenceno sintasa hace referencia a un polipéptido de valenceno sintasa codificado por un gen de valenceno sintasa de origen natural o nativo, incluidas variantes alélicas, que está presente en un organismo, incluida una planta, en la naturaleza. La referencia a la valenceno sintasa nativa sin referencia a una especie pretende abarcar cualquier especie de valenceno sintasa nativa. La secuencia aminoacídica de los ejemplos de valenceno sintasas está establecida en la SEC. N.° ID.:1 (aislada de Eryngium glaciale), SEC. N.° ID.: 14 (aislada de Citrus sinensis cv. Valencia, Citrus sinensis cv. Cara Cara y Citrus x paradisi), SEC. N.° ID.:34 (aislada de Citrus sinensis cv. Valencia), SEC. N.° ID.:27 (aislada de Citrus x paradisi), SEC. N.° ID.:26 (aislada de Citrus x paradisi), SEC. N.° ID.:16 y 28 (aislada de Vitis vinifera), SEC. N.° ID.:29 (aislada de Chamaecyparis nootkatensis pendula) y SEC. N.° ID.:38 (aislada de Perilla frutescens).

Tal y como se utiliza en la presente memoria, variantes de especies hace referencia a variantes en polipéptidos entre diferentes especies.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, variantes alélicas hace referencia a variaciones en las proteínas codificadas entre miembros de la misma especie.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, una variante de empalme hace referencia a una variante producida por el procesamiento diferencial de un transcrito primario de ADN genómico que da lugar a más de un tipo de ARNm.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, «polipéptido de valenceno sintasa modificado» hace referencia a un polipéptido de valenceno sintasa que tiene una o más diferencias de aminoácidos en comparación con un polipéptido de valenceno sintasa nativa o sin modificar. Las diferencias de uno o más aminoácidos pueden ser mutaciones de aminoácidos, como uno o más reemplazos (sustituciones), inserciones o deleciones de aminoácidos, o pueden ser inserciones o deleciones de dominios enteros, y cualquier combinación de los mismos. Normalmente, un polipéptido de valenceno sintasa modificado tiene una o más modificaciones en la secuencia principal en comparación con un polipéptido de valenceno sintasa nativa o sin modificar. Por ejemplo, un polipéptido de valenceno sintasa modificado proporcionado en la presente memoria puede tener al menos 1, 5, 10, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135 o más diferencias de aminoácidos en comparación con un polipéptido de valenceno sintasa no modificada. Se contempla cualquier modificación siempre que el polipéptido resultante presente al menos una actividad de valenceno sintasa asociada a un polipéptido de valenceno sintasa nativa, como, por ejemplo, actividad catalítica, la capacidad de unirse a FPP y/o la capacidad de catalizar la formación de valenceno a partir de FPP.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, la referencia a un polipéptido de valenceno sintasa modificado que produce valenceno a partir de FPP en una cantidad que es mayor que la cantidad de valenceno producida a partir de FPP por una valenceno sintasa de referencia, como una valenceno sintasa nativa, indica que la valenceno sintasa modificada produce al menos o aproximadamente un 10 % más de valenceno a partir de FPP que la valenceno sintasa de referencia. Por ejemplo, dicho polipéptido de valenceno sintasa modificado puede producir al menos o aproximadamente un 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 110%, 120 %, 130 %, 140 %, 150 %, 160 %, 170 %, 180 %, 190 %, 200 %, 250 %, 300 %, 350 %, 400 %, 500 %, 600 %, 700 %, 800 %, 900 %, 1000 %, 2000 %, 5000 % o más valenceno a partir de FPP en comparación con la cantidad de valenceno producida a partir de FPP por una valenceno sintasa de referencia. La cantidad de valenceno producida a partir de FPP por una valenceno sintasa se puede evaluar mediante cualquier método conocido en la técnica. Cuando se compara la cantidad de valenceno producida a partir de FPP por dos valenceno sintasas, como una valenceno sintasa modificada y una valenceno sintasa de referencia, como una valenceno sintasa nativa, se entiende que el ensayo se realiza en las mismas condiciones para cada sintasa. En un ejemplo, la cantidad de valenceno producida a partir de FPP por dos valenceno sintasas, como una valenceno sintasa modificada y una valenceno sintasa de referencia, se evalúa expresando la valenceno sintasa modificada y la valenceno sintasa de referencia por separado en una célula de levadura de la misma cepa (donde la expresión es a partir del mismo vector de expresión) que también produce FPP, y las células se cultivan en las mismas condiciones de manera que se produce valenceno. La cantidad de valenceno producida en el cultivo celular que expresa la valenceno sintasa modificada se compara con la cantidad de valenceno producida en el cultivo celular que expresa la valenceno sintasa de referencia, utilizando métodos de cuantificación bien conocidos en la técnica, como GC-MS.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, restos correspondientes hace referencia a restos que están presentes en los loci alineados. Los polipéptidos relacionados o variantes se alinean mediante cualquier método conocido por los expertos en la técnica. Dichos métodos suelen maximizar los emparejamientos, e incluyen métodos como el uso de alineaciones manuales y el uso de los numerosos programas de alineamiento disponibles (por ejemplo, BLASTP) y otros conocidos por los expertos en la técnica. Al alinear las secuencias de polipéptidos, un experto en la técnica puede identificar los restos correspondientes, utilizando como guía restos aminoacídicos conservados e idénticos. Las posiciones correspondientes también se pueden basar en alineaciones estructurales, por ejemplo, utilizando alineaciones simuladas por ordenador de la estructura de la proteína. Por ejemplo, como se muestra en la Figura 4A, el Asp315 de la valenceno sintasa de E. glaciale establecida en la SEC. N.° ID.:1 corresponde al Asp301 de la valenceno sintasa de C. sinensis establecida en la SEC. N.° ID.:14.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, dominio o región (normalmente una secuencia de tres o más, generalmente 5 o 7 o más aminoácidos) hace referencia a una porción de una molécula, como una proteína o los ácidos nucleicos que la codifican, que es estructural y/o funcionalmente distinta de otras porciones de la molécula y es identificable. Una proteína puede tener uno o más dominios distintos. Por ejemplo, un dominio se puede identificar, definir o distinguir por la homología de su secuencia con miembros análogos de la familia, como otras terpeno sintasas. Un dominio puede ser una secuencia aminoacídica lineal o una secuencia aminoacídica no lineal. Muchos polipéptidos contienen una pluralidad de dominios. Dichos dominios son conocidos y los expertos en la técnica los pueden identificar. A modo de ejemplo, se proporcionan definiciones, pero se entiende que está sobradamente dentro de las habilidades del experto en la técnica reconocer dominios particulares por su nombre. Si es necesario, se puede emplear un software adecuado para identificar los dominios. Por ejemplo, como se ha comentado más arriba, los dominios correspondientes en diferentes terpeno sintasas se pueden identificar mediante alineaciones de secuencias, como, por ejemplo, utilizando herramientas y algoritmos bien conocidos en la técnica (por ejemplo, BLASTP).

Tal y como se utiliza en la presente memoria, un dominio funcional hace referencia a aquellas porciones de un polipéptido que se reconocen en virtud de una actividad funcional, como la actividad catalítica. Un dominio funcional se puede distinguir por su función, como su actividad catalítica, o su capacidad de interactuar con una biomolécula, como la unión a un sustrato o la unión a un metal. En algunos ejemplos, un dominio puede presentar de forma independiente una función o propiedad biológica tal que el dominio, de manera independiente o fusionado con otra molécula, puede realizar una actividad, como, por ejemplo, actividad catalítica o unión a un sustrato.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, un dominio estructural hace referencia a aquellas porciones de una cadena polipeptídica que pueden formar una estructura plegada independientemente dentro de una proteína compuesta por uno o más motivos estructurales.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, «heterólogo» con respecto a una secuencia aminoacídica o una secuencia de un ácido nucleico hace referencia a porciones de una secuencia que no están presentes en el polipéptido nativo ni codificadas por el polinucleótido nativo. Por ejemplo, una porción de aminoácidos de un polipéptido, como un dominio o región o porción del mismo, para una valenceno sintasa es heteróloga en esta si dichos aminoácidos no están presentes en una valenceno sintasa nativa o sin modificar (por ejemplo, como se establece en la SEC. N.° ID.:1), o codificada por el polinucleótido que codifica una valenceno sintasa nativa o no modificar. Los polipéptidos que contienen dichos aminoácidos heterólogos o los polinucleótidos que los codifican se denominan «polipéptidos quiméricos» o «polinucleótidos quiméricos», respectivamente.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, la frase «una propiedad de la terpeno sintasa modificada es mejorada en comparación con la primera terpeno sintasa» hace referencia a un cambio deseable en una propiedad de una terpeno sintasa modificada en comparación con una terpeno sintasa que no contiene la modificación o modificaciones. Normalmente, la propiedad o propiedades se mejoran de tal manera que la cantidad de un terpeno deseado producido a partir de la reacción de un sustrato con la terpeno sintasa modificada se incrementa en comparación con la cantidad del terpeno deseado producido a partir de la reacción de un sustrato con una terpeno sintasa que no está modificada de esta manera. Entre los ejemplos de propiedades que se pueden mejorar en una terpeno sintasa modificada se incluyen, por ejemplo, la producción de terpenos, la actividad catalítica, la distribución del producto; la especificidad del sustrato; la regioselectividad y la estereoselectividad. Una o más de las propiedades se pueden evaluar mediante métodos bien conocidos en la técnica para determinar si la propiedad ha sido mejorada (es decir, ha sido alterada para ser más deseable para la producción de un terpeno o terpenos deseados).

Tal y como se utiliza en la presente memoria, la producción de terpenos (también denominada rendimiento de terpenos) hace referencia a la cantidad (en peso o peso/volumen) de terpeno producido a partir de la reacción de un pirofosfato acíclico precursor de terpenos con una terpeno sintasa. La referencia a la producción total de terpenos hace referencia a la cantidad total de todos los terpenos producidos a partir de la reacción, mientras que la referencia a la producción de terpenos específicos hace referencia a la cantidad de un terpeno específico (por ejemplo, valenceno), producido a partir de la reacción.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, una producción mejorada de terpenos hace referencia a un aumento en la cantidad total de terpenos (es decir, una producción mejorada de terpenos totales) o a un aumento en la cantidad de terpenos específicos (es decir, una producción mejorada de terpenos específicos) producidos a partir de la reacción de un pirofosfato acíclico precursor de terpenos con una terpeno sintasa modificada, en comparación con la cantidad producida a partir de la reacción del mismo pirofosfato acíclico precursor de terpenos con una terpeno sintasa no modificada. La cantidad de terpeno (total o específico) producida a partir de la reacción de un pirofosfato acíclico precursor de terpenos con una terpeno sintasa modificada puede aumentar al menos o aproximadamente en un 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 30 %, 40 %, 5o %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 % o más en comparación con la cantidad de terpeno producida a partir de la reacción del mismo pirofosfato acíclico precursor de terpenos en las mismas condiciones con una terpeno sintasa que no está modificada de esta manera.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, especificidad del sustrato hace referencia a la preferencia de una valenceno sintasa por un sustrato de interés con respecto a otro, como un pirofosfato acíclico precursor de terpenos (por ejemplo, farnesil pirofosfato (FPP), geranil pirofosfato (GPP) o geranilgeranil pirofosfato (GGPP)) con respecto a otro. La especificidad del sustrato se puede evaluar mediante métodos bien conocidos en la técnica, como los que calculan Kcat/Km. Por ejemplo, la especificidad del sustrato se puede evaluar comparando la Kcat/Km relativa, que es una medida de la eficiencia catalítica, de la enzima frente a varios sustratos (por ejemplo, GPP, FPP, GGPP).

Tal y como se utiliza en la presente memoria, especificidad alterada hace referencia a un cambio en la especificidad del sustrato de un polipéptido de terpeno sintasa modificada (como un polipéptido de valenceno sintasa modificado) en comparación con una terpeno sintasa que no está modificada de esta manera (como, por ejemplo, una valenceno sintasa nativa). La especificidad (por ejemplo, Kcat /Km) de un polipéptido de terpeno sintasa modificada frente a un sustrato, como el FPP, el GPP o el GGPP, se puede alterar en al menos o aproximadamente un 10 %, 15 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 % o más en comparación con la especificidad de una valenceno sintasa de partida para el mismo sustrato.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, especificidad del sustrato mejorada hace referencia a un cambio o una alteración en la especificidad del sustrato a una especificidad más deseada. Por ejemplo, la especificidad del sustrato mejorada puede incluir un aumento en la especificidad del sustrato de un polipéptido de terpeno sintasa modificada frente a un sustrato deseado, como el FPP, el GPP o el GGPP. La especificidad (por ejemplo, kcat/Km) de un polipéptido de terpeno sintasa modificada frente a un sustrato, como el FPP, el GPP o el GGPP, se puede aumentar en al menos o aproximadamente un 10 %, 15 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 % o más en comparación con la especificidad de una terpeno sintasa que no está modificada de esta manera.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, «distribución del producto» hace referencia a las cantidades relativas de diferentes terpenos producidos a partir de la reacción entre un pirofosfato acíclico precursor de terpenos, como el FPP, y una terpeno sintasa, incluidos los polipéptidos de valenceno sintasa modificados proporcionados en la presente memoria. La cantidad de un terpeno producido se puede representar como un porcentaje de los productos totales producidos por la terpeno sintasa. Por ejemplo, la distribución del producto obtenido a partir de la reacción del FPP con una valenceno sintasa puede ser de un 90 % (peso/volumen) de valenceno y un 10 % (peso/volumen) de pelemeno. Los métodos para evaluar el tipo y la cantidad de un terpeno en una solución son bien conocidos en la técnica y se describen en la presente memoria, e incluyen, por ejemplo, la cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS) (véanse ejemplos a continuación).

Tal y como se utiliza en la presente memoria, una distribución alterada del producto hace referencia a un cambio en la cantidad relativa de terpenos individuales producidos a partir de la reacción entre un pirofosfato acíclico precursor de terpenos, como el FPP, y una terpeno sintasa, como la valenceno sintasa. Normalmente, el cambio se evalúa determinando la cantidad relativa de terpenos individuales producidos a partir del pirofosfato acíclico precursor de terpenos utilizando una primera sintasa (por ejemplo, la sintasa nativa) y a continuación comparándola con la cantidad relativa de terpenos individuales producidos utilizando una segunda sintasa (por ejemplo, una sintasa modificada). Se considera que tiene lugar una distribución alterada del producto si la cantidad relativa de uno o más terpenos aumenta o disminuye al menos en un 0,5 %, 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o más.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, una distribución mejorada del producto hace referencia a un cambio en la distribución del producto que es más deseable, es decir, que contiene cantidades relativas más deseables de terpenos. Por ejemplo, una distribución mejorada del producto puede contener una mayor cantidad de un terpeno deseado y una menor cantidad de un terpeno no tan deseado. La cantidad de terpeno deseado en una distribución mejorada de la producción puede aumentar al menos en un 0,5 %, 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o más. La cantidad de un terpeno que no se desea en una distribución mejorada de la producción puede disminuir al menos en un 0,5 %, 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o más.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, los ácidos nucleicos o las moléculas de ácido nucleico incluyen el ADN, el ARN y sus análogos, incluidos los ácidos nucleicos peptídicos (ANP) y mezclas de los mismos. Los ácidos nucleicos pueden ser monocatenarios o bicatenarios. Al referirse a las sondas o cebadores, que están opcionalmente marcados, como con un marcaje detectable, como un marcaje fluorescente o radioactivo, se contemplan moléculas monocatenarias. Dichas moléculas suelen tener una longitud tal que su blanco es estadísticamente único o tiene un bajo número de copias (normalmente menos de 5, por lo general menos de 3) para sondear o cebar una biblioteca. Por lo general, una sonda o cebador contiene al menos 14, 16 o 30 nucleótidos contiguos de secuencia complementaria o idéntica a un gen de interés. Las sondas y los cebadores pueden tener una longitud de 10, 20, 30, 50, 100 o más ácidos nucleicos.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, el término polinucleótido significa un polímero monocatenario o bicatenario de bases desoxirribonucleotídicas o ribonucleotídicas leído desde el extremo 5' al 3'. Los polinucleótidos incluyen el ARN y el ADN, y se pueden aislar de fuentes naturales, sintetizar in vitro o producir a partir de una combinación de moléculas naturales y sintéticas. La longitud de una molécula polinucleotídica se indica en la presente memoria en términos de nucleótidos (abreviado como «nt») o pares de bases (abreviado como «pb»). El término nucleótido se utiliza para moléculas monocatenarias y bicatenarias cuando el contexto lo permite. Cuando el término se aplica a moléculas bicatenarias se utiliza para denotar la longitud total y se entenderá que equivale al término «pares de bases». Los expertos en la técnica reconocerán que las dos hebras de un polinucleótido bicatenario pueden diferir ligeramente en longitud y que sus extremos pueden ser escalonados; por lo tanto, no todos los nucleótidos de una molécula polinucleotídica bicatenaria pueden estar emparejados. Dichos extremos no emparejados no superarán, por lo general, los 20 nucleótidos.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, el ácido nucleico heterólogo es un ácido nucleico que normalmente no es producido in vivo por la célula en la que se expresa o que es producido por la célula, pero está en un locus diferente o se expresa de forma distinta o que media o codifica mediadores que alteran la expresión del ácido nucleico endógeno, como el ADN, afectando a la transcripción, la traducción u otros procesos bioquímicos regulables. El ácido nucleico heterólogo por lo general no es endógeno para la célula en la que se introduce, sino que se ha obtenido a partir de otra célula o se ha producido mediante síntesis. El ácido nucleico heterólogo puede ser endógeno, pero es un ácido nucleico que se expresa a partir de un locus diferente o que está alterado en su expresión. Por lo general, aunque no necesariamente, dicho ácido nucleico codifica ARN y proteínas que normalmente no son producidas por la célula o de la misma manera en la célula en la que se expresa. El ácido nucleico heterólogo, como el ADN, también se puede denominar ácido nucleico foráneo, como el ADN. Así, el ácido nucleico heterólogo o ácido nucleico foráneo incluye una molécula de ácido nucleico que no está presente en la orientación o posición exactas de la molécula de ácido nucleico homóloga, como el ADN, en un genoma. También puede hacer referencia a una molécula de ácido nucleico de otro organismo o especie (es decir, exógena).

Cualquier ácido nucleico, como el ADN, que un experto en la técnica reconocería o consideraría como heterólogo o foráneo a la célula en la que se expresa el ácido nucleico se abarca en la presente memoria mediante ácido nucleico heterólogo; ácido nucleico heterólogo incluye ácido nucleico añadido de forma exógena que también se expresa de forma endógena. Entre los ejemplos de ácido nucleico heterólogo se incluyen, entre otros, ácido nucleico que codifica proteínas marcadoras rastreables, como una proteína que confiere resistencia a los fármacos, ácido nucleico que codifica sustancias con eficacia terapéutica, como agentes anticancerígenos, enzimas y hormonas, y ácido nucleico, como el ADN, que codifica otros tipos de proteínas, como anticuerpos. Los anticuerpos que están codificados por el ácido nucleico heterólogo pueden ser secretados o expresados en la superficie de la célula en la que se ha introducido el ácido nucleico heterólogo.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, un péptido hace referencia a un polipéptido de una longitud de 2 a 40 aminoácidos.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, los aminoácidos que están presentes en las diversas secuencias aminoacídicas proporcionadas en la presente memoria se identifican según sus abreviaturas conocidas, de tres letras o de una letra (Tabla 1). Los nucleótidos que están presentes en los diversos fragmentos de ácidos nucleicos se designan con las denominaciones estándar de una sola letra utilizadas habitualmente en la técnica.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, un «aminoácido» es un compuesto orgánico que contiene un grupo amino y un grupo ácido carboxílico. Un polipéptido contiene dos o más aminoácidos. A efectos de la presente memoria, los aminoácidos incluyen los veinte aminoácidos de origen natural, aminoácidos no naturales y aminoácidos análogos (es decir, aminoácidos en los que el carbono en a tiene una cadena lateral).

De acuerdo con la nomenclatura estándar para polipéptidos descrita en J. Biol. Chem. 243: 3557-3559 (1968), y adoptada conforme a la norma 37 C.F.R. §§ 1.821-1.822, las abreviaturas de los restos aminoacídicos se muestran en la Tabla 1:

Tabla 1 - Tabla de correspondencia

Todas las secuencias de restos aminoacídicos representadas en la presente memoria mediante fórmulas tienen una orientación de izquierda a derecha en la dirección convencional del extremo aminoterminal al extremo carboxiterminal. Además, la frase «resto aminoacídico» se define ampliamente para incluir los aminoácidos enumerados en la Tabla de Correspondencia (Tabla 1) y los aminoácidos modificados e inusuales, como los mencionados en 37 C.F.R. §§ 1.821-1.822.

Además, un guion al principio o al final de una secuencia de restos aminoacídicos indica un enlace peptídico a otra secuencia de uno o más restos aminoacídicos, a un grupo aminoterminal, como NH2, o a un grupo carboxiterminal, como COOH.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, los «aminoácidos naturales» se refieren a los 20 ^-aminoácidos que están presentes en los polipéptidos.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, «aminoácido no natural» hace referencia a un compuesto orgánico que contiene un grupo amino y un grupo ácido carboxílico, y que no es uno de los aminoácidos naturales enumerados en la Tabla 1. Entre los aminoácidos que no son de origen natural se incluyen, por ejemplo, aminoácidos o análogos de aminoácidos distintos de los 20 aminoácidos naturales e incluyen, entre otros, estereoisómeros D de los aminoácidos. Los ejemplos de aminoácidos no naturales son conocidos por los expertos en la técnica y se pueden incluir en cualquiera de los polipéptidos de valenceno sintasa modificados proporcionados en la presente memoria.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, la modificación hace referencia a la modificación de una secuencia de aminoácidos de un polipéptido o una secuencia de nucleótidos en una molécula de ácido nucleico e incluye deleciones, inserciones y reemplazos de aminoácidos y nucleótidos, respectivamente. Para los fines de la presente memoria, los reemplazos (o sustituciones), las deleciones y/o las inserciones de aminoácidos, se pueden realizar en cualquiera de las valenceno sintasas proporcionadas en la presente memoria. Las modificaciones se pueden realizar haciendo reemplazos de aminoácidos conservadores y también sustituciones de aminoácidos no conservadoras. Por ejemplo, se pueden realizar reemplazos de aminoácidos que alteren de forma deseable o ventajosa las propiedades de la valenceno sintasa. Por ejemplo, se pueden realizar reemplazos de aminoácidos en la valenceno sintasa de manera que la valenceno sintasa modificada resultante pueda producir más valenceno a partir de FPP en comparación con una valenceno sintasa que no está modificada.

Entre los reemplazos o sustituciones de aminoácidos contemplados se incluyen sustituciones conservadoras, incluidas, entre otras, las establecidas en la Tabla 2. Las sustituciones conservadoras de aminoácidos adecuadas son conocidas por los expertos en la técnica y se pueden realizar por lo general sin alterar la conformación ni la actividad del polipéptido. Los expertos en la técnica reconocen que, en general, las sustituciones de aminoácidos individuales en regiones no esenciales de un polipéptido no alteran sustancialmente la actividad biológica (véase, por ejemplo, Watson et al. Molecular Biology of the Gene, 4a edición, 1987, The Benjamin/Cummings Pub. co., pág. 224). Las sustituciones conservadoras de aminoácidos se realizan, por ejemplo, de acuerdo con las establecidas en la Tabla 2 a continuación:

TABLA 2

También se permiten otras sustituciones conservadoras, que se pueden determinar empíricamente o de acuerdo con sustituciones conservadoras conocidas. Los efectos de estas sustituciones se pueden calcular utilizando matrices de puntuación de sustitución, como PAM120, PAM-200 y PAM-250, tal y como se explica en Altschul (J. Mol. Biol.

219:555-565 (1991)).

Tal y como se utiliza en la presente memoria, «secuencia primaria» hace referencia a la secuencia de restos aminoacídicos en un polipéptido.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, la «similitud» entre dos proteínas o ácidos nucleicos hace referencia a la analogía entre la secuencia aminoacídica de las proteínas o las secuencias nucleotídicas de los ácidos nucleicos. La similitud puede basarse en el grado de identidad y/u homología de las secuencias de restos y de los restos que contienen. Los métodos para evaluar el grado de similitud entre proteínas o ácidos nucleicos son conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, en un método de evaluación de la similitud de secuencias, dos secuencias aminoacídicas o nucleotídicas se alinean de manera que se obtiene un grado máximo de identidad entre las secuencias. La «identidad» se refiere al grado de invariabilidad de las secuencias aminoacídicas o nucleotídicas. El alineamiento de las secuencias aminoacídicas, y en cierta medida de las secuencias nucleotídicas, también puede tener en cuenta las diferencias conservadoras y/o las sustituciones frecuentes en los aminoácidos (o nucleótidos). Las diferencias conservadoras son las que preservan las propiedades fisicoquímicas de los restos implicados. Los alineamientos pueden ser globales (alineamiento de las secuencias comparadas a lo largo de toda la longitud de las secuencias e incluyendo todos los restos) o locales (alineamiento de una porción de las secuencias que incluye solo la región o las regiones más similares).

Tal y como se utiliza en la presente memoria, los términos «homología» e «identidad» se utilizan para describir la analogía entre polipéptidos (o moléculas de ácido nucleico que los codifican). La identidad hace referencia a secuencias idénticas; la homología puede incluir cambios conservadores de aminoácidos. En general, para identificar las posiciones correspondientes las secuencias aminoacídicas se alinean de forma que se obtenga el emparejamiento de mayor orden (véase, por ejemplo Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, Nueva York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M. y Griffin, H.G., eds, Humana Press, Nueva Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; y Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M Stockton Press, Nueva York, 1991; Carrillo et al. (1988) SIAM J Applied Math 48:1073).

Tal y como se utiliza en la presente memoria, la «identidad de secuencia» hace referencia al número de aminoácidos o bases nucleotídicas similares o idénticos en una comparación entre un polipéptido o polinucleótido experimental y uno de referencia. La identidad de secuencia se puede determinar mediante alineamiento de las secuencias de un ácido nucleico o una proteína para identificar regiones de similitud o identidad. A los efectos de la presente memoria, la identidad de secuencia por lo general se determina mediante alineamiento para identificar restos idénticos. El alineamiento puede ser local o global, pero a efectos de la presente memoria, por lo general, se trata de un alineamiento global en la que se compara la totalidad de cada secuencia. Entre las secuencias comparadas se pueden identificar emparejamientos, discrepancias y brechas. Las brechas son aminoácidos o nucleótidos nulos que se introducen entre los restos de las secuencias alineadas de manera que caracteres idénticos o similares están alineados. Por lo general, puede haber brechas internas y terminales. La identidad de secuencia se puede determinar teniendo en cuenta las brechas como el número de restos idénticos/longitud de la secuencia más corta * 100. Cuando se utilizan penalizaciones para las brechas, la identidad de secuencia se puede determinar sin penalizar las brechas en los extremos (por ejemplo, las brechas terminales no se penalizan). Como otra posibilidad, la identidad de secuencia se puede determinar sin tener en cuenta las brechas como el número de posiciones idénticas/longitud de la secuencia total alineada * 100.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, un «alineamiento global» es un alineamiento que alinea dos secuencias de principio a fin, alineando cada letra de cada secuencia una sola vez. Se produce un alineamiento, independientemente de si existe o no similitud o identidad entre las secuencias. Por ejemplo, una identidad de secuencia del 50 % basada en un «alineamiento global» significa que en un alineamiento de la secuencia completa de dos secuencias comparadas, cada una de ellas de una longitud de 100 nucleótidos, el 50 % de los restos son iguales. Se entiende que el alineamiento global también se puede utilizar para determinar la identidad de secuencia incluso cuando la longitud de las secuencias alineadas no es la misma. Las diferencias en los extremos terminales de las secuencias se tendrán en cuenta a la hora de determinar la identidad de secuencia, a menos que se seleccione la opción «sin penalización para las brechas en los extremos». Por lo general, un alineamiento global se utiliza en secuencias que comparten una similitud significativa en la mayor parte de su longitud. Algunos ejemplos de algoritmos para realizar un alineamiento global incluyen el algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman et al. J. Mol. Biol. 48: 443 (1970)). Algunos ejemplos de programas para realizar alineamientos globales son de acceso público e incluyen la Herramienta de Alineamiento Global de Secuencias disponible en el sitio web del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) (ncbi.nlm.nih.gov/), y el programa disponible en deepc2.psi.iastate.edu/aat/align/align.html.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, un «alineamiento local» es un alineamiento que alinea dos secuencias, pero solo alinea aquellas porciones de las secuencias que comparten similitud o identidad. Por lo tanto, un alineamiento local determina si los subsegmentos de una secuencia están presentes en otra secuencia. Si no hay similitud, no se obtendrá ningún alineamiento. Entre los algoritmos de alineamiento local se encuentran BLAST o el algoritmo de Smith-Waterman (Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981)). Por ejemplo, una identidad de secuencia del 50 % basada en un «alineamiento local» significa que en un alineamiento de la secuencia completa de dos secuencias comparadas de cualquier longitud, una región de similitud o identidad de una longitud de 100 nucleótidos tiene el 50 % de los restos que son los mismos en la región de similitud o identidad.

A los efectos de la presente memoria, la identidad de secuencia se puede determinar mediante programas de algoritmos de alineamiento estándar utilizados con penalizaciones por defecto para las brechas establecidas por cada proveedor. Los parámetros por defecto del programa GAP pueden incluir (1) una matriz de comparación unaria (que contiene un valor de 1 para identidades y de 0 para no identidades) y la matriz de comparación ponderada de Gribskov et al. Nucl. Acids Res. 14: 6745 (1986), según lo descrito por Schwartz y Dayhoff, eds., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, págs. 353-358 (1979); (2) una penalización de 3,0 por cada brecha y una penalización adicional de 0,10 por cada símbolo en cada brecha; y (3) ninguna penalización por las brechas de los extremos. El hecho de que dos moléculas de ácido nucleico tengan secuencias nucleotídicas o que cualesquiera dos polipéptidos tengan secuencias aminoacídicas que sean «idénticas» en al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 %, u otras variaciones similares que reciten un porcentaje de identidad, se puede determinar utilizando algoritmos informáticos conocidos basados en el alineamiento local o global (véase, por ejemplo, wikipedia.org/wiki/Sequence_alignment_software, que proporciona enlaces a docenas de bases de datos y programas de alineamiento conocidos y de acceso público). Por lo general, a efectos de la presente memoria, la identidad de secuencia se determina mediante algoritmos informáticos basados en el alineamiento global, como la herramienta Needleman-Wunsch Global Sequence Alignment, disponible en NCBI/BLAST (blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD=Web&Page_TYPE=BlastHome); LAlign (William Pearson implementa el algoritmo de Huang y Miller (Adv. Appl. Math. (1991) 12:337-357)); y el programa de Xiaoqui Huang disponible en deepc2.psi.iastate.edu/aat/align/align.html. Por lo general, al comparar las secuencias nucleotídicas en la presente memoria, se utiliza un alineamiento con penalización para las brechas de los extremos. El alineamiento local también se puede utilizar cuando las secuencias que se comparan tienen sustancialmente la misma longitud.

Por lo tanto, tal y como se utiliza en la presente memoria, el término «identidad» representa una comparación o alineamiento entre un polipéptido o polinucleótido experimental y uno de referencia. En un ejemplo no limitativo, «al menos un 90 % idéntico a» hace referencia a identidades porcentuales del 90 al 100 % en relación con el polipéptido o polinucleótido de referencia. La identidad a un nivel del 90 % o más es indicativa del hecho de que, suponiendo a efectos de ejemplificación que se comparan un polipéptido o polinucleótido experimental y uno de referencia de una longitud de 100 aminoácidos o nucleótidos, no más de un 10 % (es decir, 10 de 100) de los aminoácidos o nucleótidos en el polipéptido o polinucleótido experimental son distintos a los de los polipéptidos de referencia. Se pueden hacer comparaciones similares entre un polinucleótido experimental y uno de referencia. Dichas diferencias se pueden representar como mutaciones puntuales distribuidas aleatoriamente a lo largo de toda la longitud de una secuencia aminoacídica o se pueden agrupar en una o más ubicaciones de longitud variable hasta el máximo permitido, por ejemplo, diferencia de 10/100 aminoácidos (una identidad de aproximadamente un 90 %). Las diferencias también se pueden deber a deleciones o truncamientos de restos aminoacídicos. Las diferencias se definen como sustituciones, inserciones o deleciones de ácidos nucleicos o aminoácidos. Dependiendo de la longitud de las secuencias comparadas, a nivel de homologías o identidades por encima de aproximadamente un 85-90 %, el resultado puede ser independiente del programa y de los parámetros de brecha establecidos; dichos niveles elevados de identidad se pueden evaluar fácilmente, a menudo sin necesitar un software.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, también se entiende que los términos «sustancialmente idéntico» o «similar» varían según el contexto, tal y como lo entienden los expertos en la técnica, pero que los expertos pueden evaluarlo.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, una secuencia alineada hace referencia al uso de homología (similitud y/o identidad) para alinear posiciones correspondientes en una secuencia de nucleótidos o de aminoácidos. Normalmente, se alinean dos o más secuencias que presentan un 50 % o más de identidad entre ellas. Un conjunto alineado de secuencias hace referencia a 2 o más secuencias que están alineadas en posiciones correspondientes y puede incluir el alineamiento de secuencias derivadas a partir de ARN, como marcadores de secuencias expresadas (EST) y otros ADNc, alineadas con la secuencia de ADN genómico.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, el polipéptido o la proteína aislados o purificados, o la porción con actividad biológica de los mismos, sustancialmente no contienen material celular ni otras proteínas contaminantes procedentes de la célula o del tejido del que se deriva la proteína, o sustancialmente no contienen precursores químicos ni otros compuestos químicos cuando se sintetizan por medios químicos. Se puede determinar que los preparados sustancialmente no contienen ningún residuo si parecen no contener impurezas que se detecten con facilidad según lo determinado por métodos analíticos estándar, como la cromatografía en capa fina (TLC), la electroforesis en gel y la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), utilizados por los expertos en la técnica para evaluar dicha pureza, o están lo suficientemente puros como para que una purificación adicional no altere de forma detectable las propiedades físicas y químicas, como las actividades proteolíticas y biológicas, de la sustancia. Los expertos en la técnica conocen los métodos de purificación de los compuestos para producir compuestos que sustancialmente son químicamente puros. Sin embargo, un compuesto que sustancialmente es químicamente puro puede ser una mezcla de estereoisómeros. En dichos casos, una purificación adicional podría aumentar la actividad específica del compuesto.

El término sustancialmente sin material celular incluye preparados de valenceno sintasa y productos terpénicos en los que la valenceno sintasa o el producto terpénico se separan de los componentes celulares de las células a partir de las que se aíslan o se producen. En una realización, el término «sustancialmente sin material celular» incluye preparados de valenceno sintasa o productos terpénicos que tienen menos de aproximadamente un 30 %, 20 %, 10 %, 5 % o menos (en peso seco) de sintasas distintas a la valenceno sintasa o proteínas o productos terpénicos, incluido el medio de cultivo celular.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, la producción por métodos recombinantes mediante el uso de métodos de ADN recombinante hace referencia al uso de métodos bien conocidos de biología molecular para expresar proteínas codificadas por ADN clonado.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, vector (o plásmido) hace referencia a elementos discretos de ADN que se utilizan para introducir un ácido nucleico heterólogo en las células para su expresión o su replicación. Los vectores se suelen mantener episómicos, pero se pueden diseñar para efectuar la integración de un gen o una porción del mismo en un cromosoma del genoma. También se contemplan vectores que son cromosomas artificiales, como cromosomas artificiales bacterianos, cromosomas artificiales de levadura y cromosomas artificiales de mamíferos. La selección y el uso de dichos vehículos son bien conocidos por los expertos en la técnica.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, la expresión hace referencia al proceso por el cual el ácido nucleico se transcribe a ARNm y se traduce a péptidos, polipéptidos o proteínas. Si el ácido nucleico se deriva de ADN genómico, la expresión puede, si se selecciona un organismo o célula hospedadora eucariota adecuados, incluir el procesamiento, como el empalme del ARNm.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, un vector de expresión incluye vectores con la capacidad de expresar ADN que está operativamente conectado a secuencias reguladoras, como regiones promotoras, que tienen la capacidad de efectuar la expresión de dichos fragmentos de ADN. Dichos segmentos adicionales pueden incluir secuencias promotoras y terminadoras, y opcionalmente pueden incluir uno o más orígenes de replicación, uno o más marcadores seleccionables, un potenciador, una señal de poliadenilación y similares. Los vectores de expresión por lo general se derivan de ADN plasmídico o vírico, o pueden contener elementos de ambos. Por lo tanto, un vector de expresión hace referencia a un constructo de ADN o ARN recombinante, como un plásmido, un fago, un virus recombinante u otro vector que, al introducirlo en una célula hospedadora adecuada, da lugar a la expresión del ADN clonado. Los vectores de expresión adecuados son bien conocidos por los expertos en la técnica e incluyen los que son replicables en células eucariotas y/o procariotas y los que se mantienen episómicos o los que se integran en el genoma de la célula hospedadora.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, el término «vector» también incluye «vectores de virus» o «vectores víricos». Los vectores víricos son virus genomanipulados que están operativamente conectados a genes exógenos para transferir (como vehículos o lanzaderas) los genes exógenos al interior de las células.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, un adenovirus hace referencia a cualquiera de un grupo de virus que contienen ADN y que causan conjuntivitis e infecciones de las vías respiratorias superiores en los seres humanos.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, el ADN desnudo hace referencia al ADN sin histonas que se puede utilizar para vacunas y terapia génica. El ADN desnudo es el material genético que se pasa de célula a célula durante un proceso de transferencia de genes denominado transformación o transfección. En la transformación o transfección, el ADN purificado o desnudo que es captado por la célula receptora conferirá a ésta una nueva característica o fenotipo.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, operable u operativamente conectado cuando se hace referencia a segmentos de ADN significa que los segmentos están dispuestos de modo que funcionan de manera concertada para sus fines previstos, por ejemplo, la transcripción se inicia en el promotor y prosigue a través del segmento codificador hasta el terminador.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, una «proteína quimérica» o «proteína de fusión» hace referencia a un polipéptido operativamente conectado a un polipéptido diferente. Una proteína quimérica o de fusión proporcionada en la presente memoria puede incluir uno o más polipéptidos de valenceno sintasa, o una porción de los mismos, y uno o más polipéptidos distintos para cualquiera o cualesquiera de las señales de control transcripcional/traduccional, secuencias señal, un marcaje para la localización, un marcaje para la purificación, parte de un dominio de una inmunoglobulina G y/o un agente de orientación. Un polipéptido quimérico de valenceno sintasa también incluye aquellos que tienen sus dominios endógenos o regiones del polipéptido intercambiados con otro polipéptido. Estas proteínas quiméricas o de fusión incluyen las producidas por medios recombinantes como proteínas de fusión, las producidas por medios químicos, como por acoplamiento químico, por ejemplo, mediante el acoplamiento a grupos sulfhidrilo, y las producidas mediante cualquier otro método por el que al menos un polipéptido (es decir, valenceno sintasa), o una porción del mismo, está conectado, directa o indirectamente a través de un conector o conectores a otro polipéptido.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, la mención de que un polipéptido «consiste esencialmente» en una secuencia aminoacídica mencionada significa que solo está presente la porción mencionada, o un fragmento de la misma, del polipéptido de secuencia completa. El polipéptido opcionalmente, y por lo general, incluirá aminoácidos adicionales de otra fuente o se puede introducir en otro polipéptido.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, las formas en singular «un», «uno», «una», «el» y «la» incluyen las referencias al plural a menos que el contenido claramente indique lo contrario. Así, por ejemplo, la referencia a un polipéptido que comprende «un reemplazo de aminoácidos» incluye a polipéptidos con un reemplazo de aminoácidos o con una pluralidad de reemplazos de aminoácidos.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, los intervalos y las cantidades se pueden expresar como «aproximadamente» un valor particular o como intervalo. El término «aproximadamente» también incluye la cantidad exacta. Por lo tanto, «aproximadamente del 5 %» significa «aproximadamente del 5 %» y también «5 %».

Tal y como se utiliza en la presente memoria, «opcional» u «opcionalmente» significan que el suceso o circunstancia descritos posteriormente ocurren o no, y que la descripción incluye casos en los que dicho suceso o circunstancia ocurren y casos en los que no. Por ejemplo, un paso opcional de aislamiento del valenceno significa que el valenceno se aísla o no se aísla.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, las abreviaturas para cualquier grupo protector, aminoácidos y otros compuestos, son, a menos que se indique lo contrario, acordes con su uso común, abreviaturas reconocidas, o la Comisión de Nomenclatura Bioquímica de la IUPAC-IUB (véase, (1972) Biochem. 11:1726).

B. RESUMEN

En la presente memoria se proporcionan valenceno sintasas de Eryngium glaciale, y variantes y fragmentos con actividad catalítica de las mismas, que catalizan la producción de terpenos a partir de un pirofosfato acíclico precursor de terpenos. Los terpenos incluyen el valenceno y opcionalmente otros sesquiterpenos. Dichas valenceno sintasas catalizan la producción biosintética de valenceno a partir de un pirofosfato acíclico precursor, como el farnesil pirofosfato. En la presente memoria también se proporcionan métodos para producir valenceno y otros sesquiterpenos a partir de dicho precursor, como, entre otros, el farnesil pirofosfato. En la presente memoria también se proporcionan métodos para sintetizar nootkatona a partir del valenceno resultante y del precursor acíclico, como el farnesil pirofosfato. Las valenceno sintasas de Eryngium glaciale (EgVS) proporcionan la producción de productos terpénicos valiosos, incluido el valenceno, en cantidades útiles desde un punto de vista comercial y de una manera rentable y energéticamente eficiente. En particular, las EgVS catalizan la producción de concentraciones muy elevadas de valenceno en comparación con otras valenceno sintasas, incluida la CVS.

1. Estructura y usos del valenceno

El valenceno (1,2,3,5,6,7,8,8a-octahidro-7-isopropenil-1,8a-dimetilnaftaleno; (1) es un sesquiterpeno que se encuentra en los aceites de cítricos, como la naranja y el pomelo. Hasta la fecha, el valenceno se ha identificado en varias plantas, incluidos los cítricos (Citrus sp.), las flores de la vid (Vitis vinifera), el apio (Apium graveolens), el mango (Mangifera indica), las aceitunas (Olea europea) y el coral. El valenceno se utiliza como sabor/fragancia de naranja en perfumes, bebidas y gomas de mascar, y se emplea como material de partida en la producción de nootkatona.

El valenceno se genera en plantas mediante una terpeno sintasa denominada valenceno sintasa, que cataliza la reacción del pirofosfato acíclico precursor de terpenos, el farnesil pirofosfato (FPP), para dar valenceno (véase la Figura 1).

2. Nootkatona

La nootkatona (4,4a,5,6,7,8-hexahidro-6-isopropenil-4,4-a-dimetil-2(3H)-naftalenona; (2), es un sesquiterpenoide que se encuentra en el aceite de pomelo y que proporciona el aroma dominante del pomelo. Normalmente, la nootkatona se aísla mediante extracción a partir del pomelo. La nootkatona también se ha identificado en otras plantas, como, por ejemplo, el cedro amarillo de Alaska (Cupressus nootkatensis), la hierba vetiver (Chrysopogon zizanioides) y la Alpinia oxyphylla Miquel.

La nootkatona es un producto oxidado del valenceno. El valenceno puede sufrir una hidroxilación regioselectiva para formar 2-hidroxivalenceno, que se oxida adicionalmente para formar nootkatona (como se describe con más detalle en el apartado E más abajo). La nootkatona se aprecia por su sabor y aroma a pomelo y se utiliza ampliamente en las industrias de perfumería y aromas. Además, la nootkatona ha demostrado ser un eficaz repelente e insecticida contra garrapatas y mosquitos.

3. Valenceno sintasas

Las valenceno sintasas son terpeno ciclasas vegetales de clase 1, o terpeno sintasas, isoprenoide sintasas o terpenoide ciclasas, que transforman el farnesil difosfato en el sesquiterpeno valenceno. Hasta la fecha, se han aislado valenceno sintasas de cítricos, flores de vid y perilla (shiso verde). La valenceno sintasa de cítricos (CVS) se ha identificado en el flavedo (cáscara exterior) de Citrus sinensis (naranja dulce; naranja de Valencia) (SEC. N.° ID.:14 y 34) y Citrus x paradisi (pomelo) (SEC. N.° ID.:15, 26 y 27) (véase, Chappell (2004) Trends Plant Sci, 9:266; Sharon-Asa et al., (2003) The Plant Journal 36:664-674; AF411120 y las patentes de EE. UU. n.° 7.273.735; 7.442.785; 7.790.426; y las solicitudes de patente internacional vía PCT n.° WO2005021705 y WO2003025193). Se ha descrito una variante de la valenceno sintasa que contiene reemplazos de aminoácidos A517I/I518V (tesina de Eyal, E., Departamento de Ciencias Vegetales, Instituto de Ciencias Weizmann, Rehovot, Israel; enero de 2001; establecida en la SEC. N.° ID.:37). Una variedad de valenceno sintasas modificadas de cítricos se ha descrito en la solicitud de patente de EE. UU. n^ 2012-0246767. También se han identificado y aislado valenceno sintasas de flores de vid, incluida Vitis vinifera L. cv. Gewürztraminer y Vitis vinifera L. cv. Cabernet Sauvignon (véase, Lucker et al., (2004) Phytochemistry 65(19):2649-2659 y Martin et al., (2009) Proc. Natl. Acad. Sci, EE. UU. 106:7245-7250) (SEC. N.° ID.:16 y 28). También se han aislado valenceno sintasas de pendula Chamaecyparis nootkatensis (véase, por ejemplo, las solicitudes de patente internacional vía PCT n^ WO2011074954 y WO2012177129; SEC. N.° ID.: 17 y 29). La sintasa EgVS proporcionada en la presente memoria se muestra en la presente memoria para catalizar la producción de concentraciones elevadas de valenceno en comparación con otras valenceno sintasas, incluidas otras cuyas secuencias se han modificado para producir mayores concentraciones de valenceno.

a. Estructura

Las terpeno ciclasas vegetales de clase 1 incluyen un grupo diverso de terpeno sintasas monoméricas que comparten una arquitectura alfa helicoidal común denominada pliegue de terpenoide ciclasas de clase 1 (véase, por ejemplo, Christianson, D.W., (2008) Curr. Opin. Chem. Biol. 12(2):141-150 y Bohlmann et al., (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:4126-4133). Aunque existe relativamente poca similitud en la secuencia general, las terpeno ciclasas vegetales de clase 1 poseen estructuras homólogas y algunos motivos y/o restos sumamente conservados. En su sitio catalítico, cada terpeno ciclasa proporciona una plantilla que se une al sustrato isoprenoídico flexible con una orientación y conformación tales que, al ciclar, se forma un enlace carbono-carbono intramolecular específico. Así, la estructura del sitio catalítico de cada enzima determina los monoterpenos, diterpenos y sesquiterpenos cíclicos resultantes.

Las estructuras cristalinas por rayos X de la 5-epi-aristoloqueno sintasa y la pentaleneno sintasa del tabaco revelaron que las terpeno ciclasas vegetales de clase 1 están compuestas por hélices a interconectadas por giros y bucles conectores cortos (véase, por ejemplo, Starks et al., (1997) Science 277:1815-1820 y Lesburg et al., (1997) Science 277:1820-1824). Estas enzimas contienen dos dominios estructurales distintos, un dominio aminoterminal, cuya estructura se asemeja a los núcleos catalíticos de las glicosil hidrolasas, pero cuya función sigue estando en gran medida por conocer, y un dominio catalítico carboxiterminal. El dominio catalítico contiene dos motivos conservados de unión a metales, es decir, regiones ricas en aspartato, que son responsables de la actividad catalítica de la enzima. El sitio catalítico contiene una gran cavidad central formada mayoritariamente por hélices alfa antiparalelas con las dos regiones ricas en aspartato situadas en paredes opuestas. Las regiones ricas en aspartato median la unión de los difosfatos del sustrato a través de iones Mg2+ de puente. La posterior unión del sustrato induce cambios conformacionales de tal manera que la región aminoterminal forma una tapa sobre el núcleo catalítico que cierra el sitio activo al disolvente, estabilizando de esta manera los intermedios carbocatiónicos reactivos.

Las hélices alfa conservadas C, D, F, G y H componen el sitio catalítico o activo de las terpeno sintasas vegetales de clase 1. El sitio activo es un bolsillo hidrofóbico revestido de restos aromáticos para acomodar la cadena olefínica del sustrato. Los restos aromáticos estabilizan los intermedios carbocatiónicos a través de interacciones catión-n. Una región 1 rica en aspartato se localiza en la Hélice D y se caracteriza por la secuencia conservada DDxxD (SEC. N.° ID.:35), que también funciona para unirse a Mg2+ (véase, por ejemplo, Starks et al., (1997), Science 277:1815-1820). Una segunda región conservada que se une a metales está ubicada en la Hélice H y se caracteriza por la secuencia conservada [N/D]xxx[S/T]xxxE (SEC. N.° ID.:36), también denominada «motivo NSE/DTE». Estos dos motivos conservados de unión a metales coordinan la unión de tres iones Mg2+ al difosfato isoprenoídico.

La valenceno sintasa de Eryngium glaciale, proporcionada en la presente memoria, contiene un dominio aminoterminal (aa 1-280 de la SEC. N.° ID.:1) y un dominio catalítico carboxiterminal (aa 281-565 de la SEC. N.° ID.:1). Dentro del dominio catalítico carboxiterminal se encuentra el sitio de unión a metales conservado que contiene las regiones 1 y 2 ricas en aspartato. Basándose en el alineamiento con valenceno sintasas conocidas, como la valenceno sintasa de cítricos, la región 1 rica en aspartato, que contiene el motivo conservado DDxxD, corresponde a los aminoácidos D315, D316, T317, Y318 y D319 de la SEC. N.° ID.:1. Asp315 y Asp319 se unen a los restos de difosfato del FPP a través de la coordinación con Mg2+. La región 2 rica en aspartato, que contiene el motivo NSE/DTE, corresponde a los aminoácidos D461, D462, 1463, G464, G465, H466, E467, F468 y E469 de la SEC. N.° ID.:1. Esta región se une a un ion Mg2+ adicional a través de los aminoácidos Asp461, Gly465 y Glu469.

. c v a es

La valenceno sintasa cataliza la formación de valenceno a partir de pirofosfatos acíclicos precursores, como el farnesil difosfato (FPP), un intermedio ubicuo de pirofosfato que se produce en la ruta biosintética de isoprenoides dependiente de mevalonato en hongos y animales y la ruta biosintética de isoprenoides no dependiente de mevalonato en bacterias y plantas superiores. Entre los productos terpénicos adicionales que se pueden producir por la valenceno sintasa a partir de pirofosfatos acíclicos precursores de terpenos, como el FPP, se incluyen, entre otros, el germacreno A, el pelemeno (el p-elemeno se forma por descomposición espontánea del germacreno A), el p-selineno, el T-selineno, el 7-epi-a-selineno y un compuesto adicional, el aristoloqueno (véase, por ejemplo, el pico 2 en la Figura 3).

En general, las terpeno ciclasas vegetales de clase 1, como la valenceno sintasa, son ciclasas dependientes de metales que transforman los difosfatos lineales isoprenoídicos con todos los enlaces en trans, como el geranil difosfato, el farnesil difosfato y el geranil-geranil difosfato, en monoterpenos, diterpenos y sesquiterpenos cíclicos. Las reacciones de ciclación tienen lugar mediante alquilación electrófila en la que se forman nuevos enlaces sencillos carbono-carbono mediante reacción de un carbocatión alílico sumamente reactivo y deficiente en electrones con un doble enlace carbono-carbono rico en electrones.

Las terpeno sintasas contienen iones metálicos divalentes, normalmente iones Mg2+ o a veces Mn2+, en el centro activo de la enzima, que son necesarios para la catálisis enzimática. Más concretamente, son necesarios para la salida del pirofosfato. Por lo general, las enzimas contienen dos motivos conservados de unión a metales que recubren el sitio catalítico, incluido el motivo DDxxD rico en aspartato (SEC. N.° ID.:35) que coordina la unión de dos iones Mg2+ y el motivo NSE/DTE (SEC. N.° ID.:36) que coordina un tercer ion Mg2+ (véase, Starks et al., (1997), Science 277:1815-1820 y Lesburg et al., (1997), Science 277:1820-1824). Las regiones ricas en aspartato del sitio activo catalítico median la unión de los difosfatos de prenilo a través de iones Mg2+ de puente. La unión de (Mg2+)3-PPi induce cambios conformacionales de manera que la región aminoterminal forma una tapa sobre el núcleo catalítico y, por lo tanto, estabiliza el sitio activo en una conformación cerrada que no contiene disolvente del medio. La pérdida de pirofosfato (PPi) a partir del sustrato unido a la enzima da lugar a un carbocatión alílico sumamente reactivo que ataca electrófilamente a un doble enlace intramolecular más abajo en la cadena terpénica para efectuar el cierre de anillo. El anión PPi acepta puentes de hidrógeno de los restos básicos conservados cuando está unido en la conformación cerrada de la sintasa y un bolsillo hidrofóbico recubierto por restos aromáticos acoge la cadena lateral de prenilo y probablemente proporciona una plantilla en la reacción de ciclación al forzar conformaciones particulares del sustrato y estabilizar los carbocationes a través de interacciones por apilamiento n -n (Noel et al., (2010) ACS Chemical Biology 5(4):377-392).

4. Ensayos para detectar la actividad enzimática de polipéptidos de valenceno sintasa

Un experto en la técnica está familiarizado con los métodos y ensayos para detectar la actividad enzimática de los polipéptidos de valenceno sintasa. Los polipéptidos de valenceno sintasa se pueden sobreexpresar y purificar según se describe en el apartado C más abajo. Normalmente, la actividad de una valenceno sintasa se determina mediante incubación de una valenceno sintasa con un pirofosfato acíclico precursor de terpenos, como el farnesil pirofosfato (FPP), y la identificación, determinación y/o cuantificación del valenceno y otros productos de reacción.

Por ejemplo, la actividad de la valenceno sintasa se puede determinar in vitro incubando una valenceno sintasa con un pirofosfato acíclico precursor de terpenos, como el FPP, e identificando los productos de reacción. Los productos de reacción, incluidos los cocientes de los productos, se pueden analizar mediante cualquier método conocido por un experto en la técnica, incluida la cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS), GC-FID, la cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS), la comparación con patrones conocidos y la resonancia magnética nuclear (RMN) de protón y de carbono.

Como otra posibilidad, la actividad de valenceno sintasa se puede determinar in vivo mediante expresión de una valenceno sintasa en una cepa de levadura que produce un pirofosfato acíclico precursor de terpenos, como el FPP, de manera que la expresión de la valenceno sintasa da lugar a la producción de valenceno y subproductos o compuestos/productos de reacción adicionales. El valenceno y los compuestos adicionales se pueden purificar a partir del medio de cultivo celular, por ejemplo, mediante extracción con un disolvente orgánico, de manera que se produce el reparto del valenceno y otros productos hacia la fase acuosa, como se describe en el Ejemplo 4, y los productos de reacción se pueden identificar y cuantificar según se ha descrito anteriormente. Los ejemplos de células de levadura para la expresión de valenceno sintasas y los métodos para generar células de levadura modificadas que produzcan un pirofosfato acíclico precursor de terpenos se describen con más detalle en el apartado E más abajo.

La cinética de la producción de valenceno se puede determinar mediante métodos estándar, como, por ejemplo, mediante ensayos con sintasas en los que se emplean sustratos isoprenoídicos radiactivos, como 3H FPP o 14C FPP, con concentraciones variables de sintasa. Los productos de la reacción se extraen en una fase orgánica y la radiactividad se mide mediante un contador de centelleo líquido. Las constantes cinéticas se determinan a partir de ajustes directos de la ecuación de Michaelis-Menton a los datos.

C. MOLÉCULAS DE ÁCIDO NUCLEICO QUE CODIFICAN LA VALENCENO SINTASA DE ERYNGIUM GLACIALE (EGVS) Y POLIPÉPTIDOS CODIFICADOS

En la presente memoria se proporcionan moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido de valenceno sintasa, incluidas moléculas de ADNc. En la presente memoria también se proporcionan polipéptidos de valenceno sintasa, y fragmentos con actividad catalítica de los mismos, codificados por las moléculas de ácido nucleico proporcionadas en la presente memoria. Las valenceno sintasas codificadas por las moléculas de ácido nucleico proporcionadas en la presente memoria catalizan la formación de valenceno a partir de cualquier pirofosfato acíclico adecuado precursor de terpenos, incluido el farnesil pirofosfato (FPP), el geranil pirofosfato (GPP) y el geranil-geranil pirofosfato (GGPP). En la presente memoria es de interés la producción de valenceno a partir de FPP. En algunos ejemplos, las moléculas de ácido nucleico proporcionadas en la presente memoria que codifican los polipéptidos de valenceno sintasa son las mismas que las aisladas a partir del cardo Eryngium glaciale. En otros ejemplos, las moléculas de ácido nucleico y los polipéptidos de valenceno sintasa codificados proporcionados en la presente memoria son variantes de los aislados a partir del cardo Eryngium glaciale.

Por ejemplo, en la presente memoria se proporciona una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos establecida en la SEC. N.° ID.:2, y degeneraciones de la misma, que codifican un polipéptido de valenceno sintasa que tiene una secuencia aminoacídica establecida en la SEC. N.° ID.:1. En la presente memoria también se proporcionan moléculas de ácido nucleico que tienen una identidad de secuencia de al menos un 85 % con una secuencia de nucleótidos establecida en la SEC. N.° ID.:2 que codifica un polipéptido de valenceno sintasa. Por ejemplo, las moléculas de ácido nucleico proporcionadas en la presente memoria pueden presentar una identidad de secuencia de al menos o aproximadamente un 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 95 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % o más con una secuencia de nucleótidos establecida en la SEC. N.° ID.:2, siempre que los polipéptidos de valenceno sintasa codificados presenten actividad de valenceno sintasa (es decir, la capacidad de catalizar la formación de valenceno). El porcentaje de identidad lo puede determinar un experto en la técnica utilizando programas de alineamiento estándar. En la presente memoria también se proporcionan secuencias degeneradas de la secuencia nucleotídica establecida en la SEC. N.° ID.:2, que codifican una valenceno sintasa que tiene una secuencia aminoacídica establecida en la SEC. N.° ID.:1. En algunos ejemplos, las moléculas de ácido nucleico que codifican los polipéptidos de valenceno sintasa se aíslan a partir del cardo Eryngium glaciale. En otros ejemplos, las moléculas de ácido nucleico y los polipéptidos de valenceno sintasa codificados son variantes de los aislados a partir del cardo Eryngium glaciale.

En la presente memoria también se proporcionan moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido de valenceno sintasa modificado proporcionado en la presente memoria. Las modificaciones se pueden realizar en cualquier región de un gen que codifica la valenceno sintasa siempre que el polipéptido de valenceno sintasa modificado codificado resultante conserve al menos la actividad de valenceno sintasa (es decir, la capacidad de catalizar la formación de valenceno a partir de un pirofosfato acíclico precursor de terpenos, normalmente FPP). Las modificaciones pueden incluir la optimización de codones de los ácidos nucleicos y/o cambios que dan lugar a una única modificación de aminoácidos en el polipéptido de valenceno sintasa codificado, como reemplazos (sustituciones), inserciones o deleciones de un solo aminoácido, o modificaciones de múltiples aminoácidos, como reemplazos, inserciones o deleciones de múltiples aminoácidos, incluidos intercambios de regiones o dominios del polipéptido.

La expresión de las moléculas de ácido nucleico proporcionadas en la presente memoria en un hospedador adecuado, por ejemplo, una célula bacteriana o de levadura, da lugar a la expresión de valenceno sintasa. Dichas células se pueden utilizar para producir la valenceno sintasa y/o para llevar a cabo reacciones in vivo para producir valenceno. Por ejemplo, el valenceno se puede generar en una célula de levadura a partir de FPP, en particular una célula de levadura que sobreproduce FPP, un pirofosfato acíclico precursor de terpenos.

En ejemplos particulares, en las moléculas de ácido nucleico proporcionadas en la presente memoria se pueden optimizar los codones, por ejemplo, para aumentar los niveles de expresión de la secuencia codificada. El uso particular de los codones depende del organismo hospedador en el que se expresa el polipéptido modificado. Un experto en la técnica está familiarizado con los codones óptimos para la expresión en bacterias o levaduras, incluidas, por ejemplo, E. coli o Saccharomyces cerevisiae. Por ejemplo, la información sobre el uso de los codones está disponible en la base de datos de uso de codones en kazusa.or.jp.codon (véase una descripción de la base de datos en Richmond (2000) Genome Biology, 1:241). Véase también, Forsburg (2004) Yeast, 10:1045-1047; Brown et al. (1991) Nucleic Acids Research, 19:4298; Sharp et al. (1988) Nucleic Acids Research, 12:8207-8211; Sharp et al. (1991) Yeast, 657-678. En algunos ejemplos, en las moléculas de ácido nucleico proporcionadas en la presente memoria que codifican un polipéptido de valenceno sintasa se han optimizado los codones para la expresión en bacterias o levaduras. En ejemplos particulares, en las moléculas de ácido nucleico proporcionadas en la presente memoria que codifican una valenceno sintasa se han optimizado los codones para la expresión basada en el uso de codones en Saccharomyces cerevisiae.

En la presente memoria también se proporcionan polipéptidos de valenceno sintasa codificados por cualquiera de las moléculas de ácido nucleico proporcionadas en la presente memoria. Los polipéptidos de valenceno sintasa y los fragmentos activos de los mismos codificados por las moléculas de ácido nucleico proporcionadas en la presente memoria se pueden obtener por métodos bien conocidos en la técnica para la generación y la expresión de proteínas recombinantes. Dichos polipéptidos de valenceno sintasa se pueden utilizar para producir valenceno a partir de un pirofosfato acíclico adecuado precursor de terpenos, como el FPP, en la célula hospedadora en la que se expresa la sintasa, o in vitro tras la purificación de la sintasa. Para obtener el ácido nucleico que codifica una terpeno sintasa, como una valenceno sintasa, se puede utilizar cualquier método conocido por los expertos en la técnica para la identificación de ácidos nucleicos que codifican los genes deseados. Por ejemplo, el ácido nucleico que codifica polipéptidos de valenceno sintasa se puede obtener mediante métodos bien conocidos a partir de una fuente vegetal, como el cardo. Los polipéptidos de valenceno sintasa modificados se pueden a continuación genomanipular mediante cualquier método conocido en la técnica para introducir mutaciones en polipéptidos de valenceno sintasa nativos o sin modificaciones, incluido cualquier método descrito en la presente memoria, como mutagénesis aleatoria del ácido nucleico codificante mediante PCR propensa a errores, mutagénesis dirigida al sitio, PCR con superposición u otros métodos recombinantes. Los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos se pueden a continuación introducir en una célula hospedadora para ser expresados heterólogamente.

1. Aislamiento del ácido nucleico que codifica valenceno sintasas

Los ácidos nucleicos que codifican valenceno sintasas se pueden clonar o aislar mediante cualquier método disponible conocido en la técnica para clonar y aislar moléculas de ácido nucleico. Entre dichos métodos se incluye la amplificación por PCR de ácidos nucleicos y el cribado de bibliotecas, incluido el cribado por hibridación de ácidos nucleicos. En algunos ejemplos, se pueden utilizar métodos de amplificación de ácidos nucleicos para aislar moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido de valenceno sintasa, incluidos, por ejemplo, métodos de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Se puede utilizar un material que contenga ácidos nucleicos como material de partida a partir del cual se puede aislar una molécula de ácido nucleico que codifique valenceno sintasa. Las bibliotecas de ácidos nucleicos se pueden utilizar como fuente de material de partida. Los cebadores están diseñados para amplificar una molécula que codifica valenceno sintasa. Las moléculas proporcionadas en la presente memoria se pueden utilizar como plantillas para los cebadores o la hibridación o la comparación.

Para aislar el ácido nucleico proporcionado en la presente memoria, se prepararon preparados de ADN y ARNm a partir de cardo (Eryngium sp.), en este caso Eryngium glaciale, y se cribaron con cebadores basados en otras valenceno sintasas se emplearon para el cribado. Por ejemplo, se diseñaron cebadores basándose en secuencias de los ácidos nucleicos conocidos que codifican una terpeno sintasa, como una valenceno sintasa, germacreno D sintasa y vetispiradieno (premnaspirodieno) sintasa, incluidas aquellas cuyas secuencias se exponen en la SEC. N.° ID.:39-44. Las moléculas de ácido nucleico generadas mediante amplificación se pueden secuenciar y las que codifican un polipéptido de valenceno sintasa se pueden identificar.

Se pueden juntar secuencias nucleotídicas adicionales a una molécula de ácido nucleico que codifica valenceno sintasa, incluidas secuencias conectoras que contengan sitios para endonucleasas de restricción con el fin de clonar el gen sintético en un vector, por ejemplo, un vector de expresión de proteínas o un vector diseñado para la amplificación de las secuencias de ADN que codifican la proteína principal. Además, las secuencias nucleotídicas adicionales que especifican elementos de ADN funcionales se pueden conectar operativamente a una molécula de ácido nucleico que codifica valenceno sintasa. Además, el ácido nucleico que codifica otras porciones o dominios también se puede incluir de manera que la sintasa resultante sea una proteína de fusión. Por ejemplo, ácidos nucleicos que codifican otras enzimas, como la FPP sintasa, o marcajes para la purificación de proteínas, como los marcajes de His o Flag.

a. Preparación del ácido nucleico modificado

El ácido nucleico que codifica una valenceno sintasa modificada (descrita con más detalle en el Apartado D más abajo) se puede preparar o generar mediante cualquier método conocido en la técnica para efectuar modificaciones, en particular, inserciones, deleciones y reemplazos de aminoácidos. Entre los métodos para la modificación de las moléculas de ácido nucleico se incluyen la mutagénesis racional y/o aleatoria estándar de moléculas de ácido nucleico codificantes (utilizando, por ejemplo, la PCR propensa a errores, la mutagénesis por saturación aleatoria dirigida al sitio, el barajado de ADN o la mutagénesis racional dirigida al sitio, como, por ejemplo, kits de mutagénesis (por ejemplo, QuikChange disponible en Stratagene), o métodos de síntesis en fase sólida). Además, para generar ácidos nucleicos que codifican polipéptidos que contienen aminoácidos heterólogos se pueden utilizar técnicas de rutina de ADN recombinante. Por ejemplo, el ácido nucleico que codifica polipéptidos quiméricos o polipéptidos que contienen una secuencia aminoacídica heteróloga se puede generar mediante un método de PCR de dos pasos, y/o mediante enzimas de restricción y métodos de clonación para el subclonado de rutina de los componentes que son polipéptidos quiméricos deseados.

Una vez generadas, las moléculas de ácido nucleico se pueden expresar en células para generar polipéptidos de valenceno sintasa modificados mediante cualquier método conocido en la técnica. Los polipéptidos de valenceno sintasa modificados se pueden evaluar a continuación mediante cribado para encontrar una propiedad o actividad deseada, por ejemplo, la capacidad de producir un valenceno a partir de un sustrato adecuado, por ejemplo, FPP, como se describe en el Apartado E. En ejemplos particulares, las valenceno sintasas modificadas con propiedades deseadas se generan por mutación y se criban para encontrar una propiedad de acuerdo con los ejemplos aportados en la presente memoria. Normalmente, los polipéptidos de valenceno sintasa modificados producen valenceno a partir de FPP.

2. Vectores y células para la expresión de polipéptidos de valenceno sintasa

Para la expresión recombinante de uno o más de los polipéptidos de valenceno sintasa codificados por los ácidos nucleicos proporcionados en la presente memoria, el ácido nucleico que contiene toda o una porción de la secuencia nucleotídica que codifica la sintasa se puede introducir en un vector de expresión adecuado, es decir, un vector que contiene los elementos necesarios para la transcripción y la traducción de la secuencia codificadora de la proteína introducida. Dependiendo del sistema de expresión utilizado, las señales de transcripción y traducción necesarias también las puede suministrar el promotor nativo para un gen de la valenceno sintasa, y/o sus regiones flanqueantes. Por lo tanto, en la presente memoria también se proporcionan vectores que contienen ácido nucleico que codifica cualquier polipéptido de valenceno sintasa proporcionado en la presente memoria. Entre los ejemplos de vectores se incluye el pALX.63-71 establecido en la SEC. N.° ID.:33 y descrito en el Ejemplo 4 más adelante.

También se proporcionan células, incluidas células procariotas y eucariotas, que contienen los vectores. Dichas células incluyen células bacterianas, células de levadura, células fúngicas, Archea, células vegetales, células de insectos y células animales. En ejemplos particulares, las células son de levadura, como Saccharomyces cerevisiae, que expresan un pirofosfato acíclico precursor de terpenos, como el FPP. Las células se utilizan para producir una valenceno sintasa, cultivando las células descritas más arriba en condiciones en las que la valenceno sintasa codificada es expresada por la célula. En algunos casos, la sintasa expresada se purifica. En otros casos, la valenceno sintasa expresada transforma el FPP en uno o más sesquiterpenos (por ejemplo, valenceno) en la célula hospedadora.

Para construir vectores de expresión que contengan un gen quimérico que contenga señales de control transcripcional/traduccional adecuadas y secuencias codificantes de proteínas, se puede utilizar cualquier método conocido por los expertos en la técnica para la introducción de fragmentos de ADN en un vector. Estos métodos pueden incluir técnicas de síntesis y de ADN recombinante in vitro y recombinantes in vivo (recombinación genética). La expresión de las secuencias de los ácidos nucleicos que codifican un polipéptido de valenceno sintasa, o dominios, derivados, fragmentos u homólogos de los mismos, puede estar regulada por una segunda secuencia de un ácido nucleico de manera que los genes o fragmentos del mismo se expresen en un hospedador transformado con la molécula o moléculas de ADN recombinante. Por ejemplo, la expresión de las proteínas se puede controlar mediante cualquier promotor/potenciador conocido en la técnica. En una realización específica, el promotor no es nativo a los genes que codifican una proteína de valenceno sintasa. Entre los promotores que se pueden utilizar se incluyen, entre otros, promotores procariotas, de levadura, de mamíferos y de plantas. El tipo de promotor depende del sistema de expresión utilizado, que se describe con más detalle más abajo.

En una realización específica, se utiliza un vector que contiene un promotor operablemente conectado a ácidos nucleicos que codifican un polipéptido de valenceno sintasa, o un dominio, fragmento, derivado u homólogo del mismo, uno o más orígenes de replicación y, opcionalmente, uno o más marcadores seleccionables (por ejemplo, un gen de resistencia a los antibióticos). Se describen vectores y sistemas para la expresión de polipéptidos de valenceno sintasa.

3. Sistemas de expresión

Los polipéptidos de valenceno sintasa (modificados y sin modificar) se pueden producir mediante cualquier método conocido en la técnica para la producción de proteínas, incluidos métodos in vitro e in vivo como, por ejemplo, la introducción de moléculas de ácido nucleico que codifican la valenceno sintasa en una célula hospedadora o planta hospedadora para la producción o la expresión in vivo a partir de moléculas de ácido nucleico que codifican la valenceno sintasa in vitro. Los polipéptidos de valenceno sintasa se pueden expresar en cualquier organismo adecuado para producir las cantidades y formas requeridas de un polipéptido de sintasa. Entre los hospedadores de expresión se incluyen organismos procariotas y eucariotas, como E. coli, levadura, plantas, células de insectos, células de mamíferos, incluidas líneas celulares humanas y animales transgénicos. Los hospedadores de expresión pueden diferir en sus niveles de producción de proteínas, así como en los tipos de modificaciones postraduccionales que están presentes en las proteínas expresadas. La elección del hospedador de expresión se puede hacer en función de estos y otros factores, como las consideraciones normativas y de seguridad, los costes de producción y la necesidad y los métodos de purificación.

La expresión en hospedadores eucariotas puede incluir la expresión en células de levadura, como las del género Saccharomyces (por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae) y del género Pichia (por ejemplo, Pichia pastoris), células de insectos como células de Drosophila y células de lepidopteran, plantas y células vegetales, como las de cítricos, tabaco, maíz, arroz, algas y lemna. Las células eucariotas para la expresión también incluyen líneas de células de mamíferos, como células de ovario de hámster chino (CHO) o células de riñón de hámster bebé (BHK). Los hospedadores de expresión eucariotas también incluyen la producción en animales transgénicos, por ejemplo, incluida la producción en suero, leche y huevos.

Hay muchos vectores de expresión disponibles y conocidos por los expertos en la técnica para la expresión de una terpeno sintasa, como la valenceno sintasa. Un ejemplo de vector de expresión es pALX31-108.2, establecido en la SEC. N.° ID.:32, y descrito en otra parte de la presente memoria. La elección del vector de expresión está influida por la elección del sistema de expresión del hospedador. Dicha selección se encuentra dentro de las competencias del experto en la técnica. Por lo general, los vectores de expresión pueden incluir promotores transcripcionales y opcionalmente potenciadores, señales de traducción, y señales de terminación transcripcional y traduccional. Los vectores de expresión que se utilizan para la transformación estable suelen tener un marcador seleccionable que permite la selección y el mantenimiento de las células transformadas. En algunos casos, se puede utilizar un origen de replicación para amplificar el número de copias de los vectores en las células.

Los métodos de producción de polipéptidos de terpeno sintasa, incluidos los polipéptidos de valenceno sintasa, pueden incluir la coexpresión de un pirofosfato acíclico precursor de terpenos, como el FPP, en la célula hospedadora. En algunos casos, la célula hospedadora expresa FPP de manera natural. Dicha célula se puede modificar para que exprese mayores cantidades de FPP (véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.° 6.531.303, 6.689.593, 7.838.279 y 7.842.497). En otros casos, una célula hospedadora que no produce FPP de manera natural se modifica genéticamente para que produzca FPP.

a. Células procariotas

Los procariotas, especialmente E. coli, proporcionan un sistema para producir grandes cantidades de los polipéptidos de valenceno sintasa proporcionados en la presente memoria. La transformación de E. coli es una técnica sencilla y rápida bien conocida por los expertos en la técnica. Entre los ejemplos de vectores de expresión para la transformación de células de E. coli se incluyen, por ejemplo, los vectores de expresión pGEM, los vectores de expresión pQE y los vectores de expresión pET (véase la patente de EE. UU. n^ 4.952.496; disponible en Novagen, Madison, Wisconsin, EE. UU.; véase también la bibliografía publicada por Novagen donde se describe el sistema). Dichos plásmidos incluyen pET 11a, que contiene el promotor T7lac, el terminador T7, el operador lac de E. coli inducible y el gen represor lac; pET 12a-c, que contiene el promotor T7, el terminador T7 y la señal de secreción ompT de E. coli; y pET 15b y pET19b (Novagen, Madison, Wisconsin, EE. UU:), que contienen una secuencia líder de His-Tag™ para su uso en la purificación con una columna de Ni y un sitio de escisión por trombina que permite la escisión después de la purificación en la columna, la región promotora T7-lac y el terminador T7.

Los vectores de expresión para E. coli pueden contener promotores inducibles que son útiles para inducir elevados niveles de expresión de proteínas y para expresar proteínas que presentan cierta toxicidad para las células hospedadoras. Entre los ejemplos de promotores procariotas se incluyen, por ejemplo, el promotor de la p-lactamasa (Jay et al., (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 78:5543) y el promotor tac (DeBoer et al., (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 80:21-25); véase también «Useful Proteins from Recombinant Bacteria» en Scientific American 242:74-94 (1980)). Algunos ejemplos de promotores inducibles incluyen el promotor lac, el promotor trp, el promotor tac híbrido, los promotores de ARN T7 y SP6 y el promotor APl regulado por la temperatura.

Los polipéptidos de valenceno sintasa proporcionados en la presente memoria se pueden expresar en el entorno citoplasmático de E. coli. El citoplasma es un entorno reductor y para algunas moléculas, esto puede dar lugar a la formación de cuerpos de inclusión insolubles. Se pueden utilizar agentes reductores, como el ditiotreitol y el pmercaptoetanol, y desnaturalizantes (por ejemplo, la guanidina-HCl y la urea) para volver a solubilizar las proteínas. Un enfoque alternativo es la expresión de valenceno sintasas en el espacio periplásmico de las bacterias, que proporciona un entorno oxidante e isomerasas disulfuro y tipo chaperoninas que dan lugar a la producción de proteínas solubles. Por lo general, se fusiona una secuencia líder con la proteína que se va a expresar que dirige la proteína al periplasma. A continuación, las peptidasas señal dentro del periplasma eliminan la líder. Entre los ejemplos de secuencias líder orientadas al periplasma se incluyen la líder pelB del gen de la pectato liasa y la líder derivada del gen de la fosfatasa alcalina. En algunos casos, la expresión en el periplasma permite la fuga de la proteína expresada al medio de cultivo. La secreción de proteínas permite una purificación rápida y sencilla a partir del sobrenadante del cultivo. Las proteínas que no son secretadas se pueden obtener a partir del periplasma mediante lisis por ósmosis. De forma similar a la expresión en el citoplasma, en algunos casos las proteínas se pueden volver insolubles y se pueden utilizar desnaturalizantes y agentes reductores para facilitar la solubilización y el replegamiento. La temperatura de inducción y crecimiento también puede influir en los niveles de expresión y solubilidad. Normalmente, se utilizan temperaturas de entre 25° C y 37° C. También se pueden utilizar mutaciones para aumentar la solubilidad de las proteínas expresadas. Normalmente, las bacterias producen proteínas aglucosiladas.

b. Células de levadura

Se pueden usar sistemas de levadura, como, entre otros, los del género Saccharomyces (por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae), Schizosaccharomyces pombe, Yarrowia lipolytica, Kluyveromyces lactis y Pichia pastoris para expresar los polipéptidos de valenceno sintasa proporcionados en la presente memoria. Los sistemas de expresión en levaduras también se pueden utilizar para producir terpenos, por ejemplo, valenceno, cuyas reacciones son catalizadas por las sintasas (por ejemplo, valenceno sintasas). La levadura se puede transformar con vectores de replicación episómica o mediante integración cromosómica estable por recombinación homóloga. En algunos ejemplos, se utilizan promotores inducibles para regular la expresión génica. Entre los ejemplos de secuencias promotoras para la expresión de polipéptidos de valenceno sintasa en la levadura se incluyen, entre otros, promotores de metalotioneína, 3-fosfoglicerato cinasa (Hitzeman et al. (1980) J. Biol. Chem. 255:2073), u otras enzimas glicolíticas (Hess et al. (1968) J. Adv. Enzyme Reg. 7:149; y Holland et al. (1978) Biochem. 17:4900), como la enolasa, la gliceraldehído fosfato deshidrogenasa, la hexocinasa, la piruvato descarboxilasa, la fosfofructocinasa, la glucosa fosfato isomerasa, la 3-fosfoglicerato mutasa, la piruvato cinasa, la triosafosfato isomerasa, la fosfoglucosa isomerasa y la glucocinasa.

Otros vectores y promotores adecuados para su uso en la expresión en levaduras se describen con más detalle en Hitzeman, EPA-73.657 o en Fleer et al. (1991) Gene, 107:285-195; y van den Berg et al. (1990) Bio/Technology, 8:135-139. Otra alternativa incluye, entre otras, el promotor ADH2 reprimible por glucosa descrito por Russell et al. (J. Biol.

Chem. 258:2674, 1982) y Beier et al. (Nature 300:724, 1982), o un promotor ADH1 modificado. Los vectores lanzadera replicables en levaduras y E. coli se pueden construir, por ejemplo, introduciendo secuencias de ADN de pBR322 para la selección y la replicación en E. coli (gen Ampr y origen de replicación) en los vectores de levadura descritos más arriba.

Los vectores de expresión en levaduras pueden incluir un marcador seleccionable, como LEU2, TRP1, HIS3 y URA3, para la selección y el mantenimiento del ADN transformado. Entre los ejemplos de vectores se incluyen pALX31-108.2, descrito en otra parte de la presente memoria, que contiene un marcador de URA3. Las proteínas expresadas en levaduras suelen ser solubles y la coexpresión con chaperoninas, como Bip y la proteína disulfuro isomerasa, puede mejorar los niveles de expresión y la solubilidad. Adicionalmente, las proteínas expresadas en levaduras pueden estar dirigidas para la secreción utilizando fusiones de péptidos señal de secreción, como la señal de secreción del factor alfa de tipo apareamiento de la levadura Saccharomyces cerevisiae y fusiones con proteínas de la superficie celular de la levadura, como el receptor de adhesión por apareamiento Aga2p de la glucoamilasa de Arxula adeninivorans. Se puede genomanipular un sitio de escisión en una proteasa (por ejemplo, la proteasa Kex-2) para eliminar las secuencias fusionadas de los polipéptidos cuando salen de la ruta de secreción.

La levadura expresa de forma natural las proteínas necesarias, incluida la FPP sintasa (gen ERG20; que puede producir FPP) para la ruta biosintética de isoprenoides dependiente de mevalonato. Por lo tanto, la expresión de las terpeno sintasas, incluidos los polipéptidos de valenceno sintasa proporcionados en la presente memoria, en células de levadura puede dar lugar a la producción de sesquiterpenos, como el valenceno, a partir de FPP. Entre los ejemplos de células de levadura para la expresión de polipéptidos de valenceno sintasa se incluyen las levaduras modificadas para expresar concentraciones más elevadas de FPP. Por ejemplo, las células de levadura se pueden modificar para producir menos escualeno sintasa o una escualeno sintasa menos activa (p. ej., mutantes erg9; véanse, p. ej., las patentes de EE.UU. n.° 6.531.303 y 6.689.593 y las patentes publicadas de EE.UU. n.° 2010-0151519 y 2010­ 0151555). Esto da lugar a la acumulación de FPP en la célula hospedadora en concentraciones más elevadas en comparación con las células de levadura nativas, lo que a su vez puede dar lugar a una mayor producción de sesquiterpenos (por ejemplo, valenceno).

En otro ejemplo, las células de levadura se pueden modificar para producir más FPP sintasa mediante la introducción de un gen de la FPP sintasa, como la FPPS de A. annua (véase, por ejemplo, Brodelius et al. (2002) Eur. J. Biochem.

269:3570-3579), FPP de N. crassa y FPS1 y FPS2 de A. thaliana. En algunos ejemplos, el gen nativo de la FPP en dicha levadura se puede suprimir. Otras modificaciones que permiten aumentar la producción de FPP en la levadura incluyen, por ejemplo, entre otras, modificaciones que aumentan la producción de acetil-CoA, inactivan los genes que codifican enzimas que utilizan FPP y GPP como sustrato y sobreexpresan HMG-CoA reductasas, tal y como se describe en la patente de EE. UU. n.° 7.842.497. Entre los ejemplos de células de levadura modificadas se incluyen, entre otros, cepas modificadas CALI5-1 (ura3, leu2, his3, trpl, A erg9::HIS3, HMG2cat/TRP1::rDNA, dppl, sue), a Lx 7-95 (ura3, his3, trpl, Aerg9::HIS3, HMG2cat/TRP1::rDNA, dppl sue), ALX11-30 (ura3, trp l, erg9def25, HMG2cat/TRP1::rDNA, dppl, sue) de Saccharomyces cerevisiae, que se conocen y se describen en una o más patentes de EE. UU. con n^ 6.531.303, 6.689.593, 7.838.279, 7.842.497 y las solicitudes de patente publicadas de EE.UU. n^ 2004-0249219 y 2011-0189717.

c. Plantas y células vegetales

Las plantas y células vegetales transgénicas se pueden utilizar para la expresión de los polipéptidos de valenceno sintasa proporcionados en la presente memoria. Los constructos de expresión normalmente se transfieren a plantas mediante transferencia directa de ADN, como el bombardeo con microproyectiles y la transferencia mediada por PEG a protoplastos, y con la transformación mediada por agrobacterias. Los vectores de expresión pueden incluir secuencias promotoras y potenciadoras, elementos de terminación de la transcripción y elementos de control de la traducción. Los vectores de expresión y las técnicas de transformación se suelen dividir entre hospedadores dicotiledóneos, como Arabidopsis y el tabaco, y hospedadores monocotiledóneos, como el maíz y el arroz. Entre los ejemplos de promotores vegetales utilizados para la expresión se incluyen el promotor del virus del mosaico de la coliflor, el promotor de la nopalina sintasa, el promotor de la ribosa bisfosfato carboxilasa y los promotores de la ubiquitina y UBQ3. Para facilitar la selección y el mantenimiento de las células transformadas se suelen utilizar marcadores seleccionables, como la higromicina, la fosfomanosa isomerasa y la neomicina fosfotransferasa. Las células vegetales transformadas se pueden mantener en cultivo como células, agregados (tejido de callo) o se pueden regenerar formando plantas enteras. Las células vegetales transgénicas también pueden incluir algas genomanipuladas para producir proteínas (véase, por ejemplo, Mayfield et al. (2003) Proc Natl Acad Sci EE. UU.

100:438-442). Las plantas transformadas incluyen, por ejemplo, plantas seleccionadas de los géneros Nicotiana, Solanum, Sorghum, Arabidopsis, Medicago (alfalfa), Gossypium (algodón) y Brassica (colza). En algunos ejemplos, la planta pertenece a la especie Nicotiana tabacum, y se transforma con vectores que sobreexpresan valenceno sintasa y farnesil difosfato sintasa, como los descritos en la patente publicada de EE. UU. n^ 2009-0123984 y la patente de EE. UU. n^ 7.906.710.

d. Insectos y células de insectos

Para expresar los polipéptidos de valenceno sintasa proporcionados en la presente memoria se pueden utilizar insectos y células de insectos, en particular un sistema de expresión en baculovirus (véase, por ejemplo, Muneta et al. (2003) J. Vet. Med. Sci. 65(2):219-223). Las células de insectos y larvas de insectos, incluida la expresión en la hemolinfa, expresan elevadas concentraciones de proteína y poseen la capacidad de llevar a cabo la mayoría de las modificaciones postraduccionales utilizadas por las eucariotas superiores. Los baculovirus tienen un espectro de hospedadores restringido, lo que mejora la seguridad y reduce los problemas regulatorios de la expresión eucariota. Por lo general, los vectores de expresión utilizan un promotor como el promotor de la poliedrina de baculovirus para alcanzar un elevado nivel de expresión. Entre los sistemas de baculovirus comúnmente utilizados se incluyen los baculovirus, como el virus de la poliedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV) y el virus de la poliedrosis nuclear de Bombyx mori (BmNPV) y una línea celular de insecto, como Sf9 derivada de Spodoptera frugiperda, Pseudaletia unipuncta (A7S) y Danaus plexippus (DpN1). Para alcanzar un elevado nivel de expresión, la secuencia nucleotídica de la molécula a expresar se fusiona inmediatamente en dirección 3' del codón de inicio de la poliedrina del virus. Las señales de secreción de mamíferos se procesan con exactitud en las células de insectos y se pueden utilizar para secretar la proteína expresada en el medio de cultivo. Además, las líneas celulares Pseudaletia unipuncta (A7S) y Danaus plexippus (DpN1) producen proteínas con perfiles de glucosilación similares a los de los sistemas celulares de mamíferos.

Un sistema alternativo de expresión en células de insectos es el uso de células transformadas de manera estable. Para la expresión se pueden utilizar líneas celulares, como las células Schnieder 2 (S2) y Kc (Drosophila melanogaster) y las células C7 (Aedes albopictus). Para inducir niveles elevados de expresión en presencia de inducción por metales pesados con cadmio o cobre se puede utilizar el promotor de la metalotioneína de Drosophila. Los vectores de expresión se suelen mantener mediante el uso de marcadores seleccionables, como la neomicina y la higromicina.

e. Células de mamífero

Se pueden utilizar sistemas de expresión de mamíferos para expresar los polipéptidos de valenceno sintasa proporcionados en la presente memoria y también se pueden utilizar para producir valenceno y otros terpenos cuya formación está catalizada por valenceno sintasas. Los constructos de expresión se pueden transferir a células de mamífero mediante métodos estándar, incluidos, entre otros, la infección vírica como el adenovirus o por transferencia directa de ADN como liposomas, fosfato de calcio, DEAE-dextran y por medios físicos, como la electroporación y la microinyección. Los vectores de expresión para células de mamíferos suelen incluir un sitio de caperuza en el ARNm, una secuencia TATA, una secuencia de inicio de la traducción (secuencia consenso de Kozak) y elementos de poliadenilación. Dichos vectores suelen incluir potenciadores-promotores de la transcripción para alcanzar un elevado grado de expresión, por ejemplo, el potenciador-promotor del SV40, el promotor del citomegalovirus humano (CMV) o la repetición terminal larga del promotor del virus del sarcoma de Rous (RSV). Estos promotores-potenciadores son activos en muchos tipos de células. Para la expresión también se pueden utilizar regiones de potenciadores y promotores de tejidos y tipos celulares. Entre los ejemplos de regiones de potenciadores/promotores se incluyen, entre otras, las de genes, como los de la elastasa I, insulina, inmunoglobulina, virus del tumor mamario de ratón, albúmina, alfa-fetoproteína, alfa-1-antitripsina, beta-globina, proteína básica de mielina, cadena ligera de la miosina 2 y control del gen de la hormona liberadora de gonadotropina. Se pueden utilizar marcadores seleccionables para seleccionar y mantener las células con el constructo de expresión. Entre los ejemplos de genes marcadores seleccionables se incluyen, entre otros, la higromicina B fosfotransferasa, la adenosina desaminasa, la xantina-guanina fosforribosiltransferasa, la aminoglucósido fosfotransferasa, la dihidrofolato reductasa y la timidina cinasa. La fusión con moléculas de señalización de la superficie celular, como TCR-Z y FceRI-y, puede dirigir la expresión de las proteínas en un estado activo en la superficie celular.

Se dispone de muchas líneas celulares para la expresión en mamíferos, incluidas células de ratón, rata, humano, mono, pollo y hámster. Entre los ejemplos de líneas celulares se incluyen, entre otras, las células de BHK (es decir, BHK-21), 293-F, CHO, CHO Express (CHOX; Excellgene), Balb/3T3, HeLa, MT2, NS0 de ratón (no secretor) y otras líneas celulares de mieloma, líneas celulares de hibridoma y de heterohibridoma, linfocitos, fibroblastos, células Sp2/0, COS, NIH3T3, HEK293, 293S, 293T, 2B8 y HKB. También existen líneas celulares adaptadas a medios sin suero, lo que facilita la purificación de las proteínas secretadas desde el medio de cultivo celular. Un ejemplo de ello es la línea celular EBNA-1 sin suero (Pham et al. (2003) Biotechnol. Bioeng. 84:332-42).

4. Purificación

Los métodos de purificación de polipéptidos de valenceno sintasa a partir de células hospedadoras dependen de las células hospedadoras elegidas y de los sistemas de expresión. En el caso de moléculas secretadas, las proteínas por lo general se purifican a partir de medios de cultivo después de eliminar las células. Para la expresión intracelular, las células se pueden lisar y las proteínas se pueden purificar a partir del extracto. Cuando se utilizan organismos transgénicos, como plantas y animales transgénicos, para la expresión, se pueden utilizar tejidos u órganos como material de partida para preparar un extracto de las células lisadas. Adicionalmente, la producción de animales transgénicos puede incluir la producción de polipéptidos en leche o huevos, que se pueden recoger y, si es necesario, las proteínas se pueden extraer y purificar adicionalmente mediante métodos estándar en la técnica.

Las valenceno sintasas se pueden purificar mediante técnicas estándar de purificación de proteínas conocidas en la técnica, incluidas, entre otras, SDS-PAGE, cromatografía de fraccionamiento por tamaño y por exclusión de tamaño, precipitación con sulfato de amonio, cromatografía de afinidad a quelatos y cromatografía de intercambio iónico. Los constructos de expresión también se pueden genomanipular para añadir un mareaje de afinidad, como un epítopo myc, una fusión de GST o His6, y se pueden purificar por afinidad de una proteína a anticuerpos myc, resina de glutatión y resina de Ni, respectivamente. La pureza se puede evaluar mediante cualquier método conocido en la técnica, incluida la electroforesis en gel y las técnicas de tinción y espectrofotometría.

D. Polipéptidos de valenceno sintasa

En la presente memoria se proporcionan polipéptidos de valenceno sintasa. En algunos ejemplos, los polipéptidos de valenceno sintasa están codificados por ácidos nucleicos aislados a partir del cardo Eryngium glaciale. En otros ejemplos, los polipéptidos de valenceno sintasa son variantes o fragmentos con actividad catalítica de los codificados por ácidos nucleicos aislados a partir del cardo Eryngium glaciale. Los polipéptidos de valenceno sintasa proporcionados en la presente memoria catalizan la formación de valenceno a partir de un precursor adecuado, como un pirofosfato acíclico precursor de terpenos, por ejemplo, farnesil pirofosfato (FPP).

En la presente memoria también se proporcionan polipéptidos de valenceno sintasa modificados. Las modificaciones contempladas en la presente memoria incluyen, por ejemplo, sustituciones o reemplazos, adiciones o deleciones de aminoácidos, truncamientos o combinaciones de los mismos. Las modificaciones se pueden realizar en cualquier región de una valenceno sintasa siempre que el polipéptido de valenceno sintasa modificado resultante conserve al menos la actividad de valenceno sintasa (es decir, la capacidad de catalizar la formación de valenceno sintasa a partir de un pirofosfato acíclico precursor de terpenos, normalmente FPP). Los polipéptidos de valenceno sintasa proporcionados en la presente memoria pueden contener otras modificaciones, por ejemplo, modificaciones que no están en la secuencia primaria del polipéptido, incluidas, por ejemplo, modificaciones postraduccionales.

En la presente memoria también se proporcionan fragmentos con actividad catalítica de los polipéptidos de valenceno sintasa. Por ejemplo, en la presente memoria se proporcionan fragmentos activos del polipéptido de valenceno sintasa que tienen una secuencia aminoacídica establecida en la SEC. N.° ID.:1. Los fragmentos activos conservan la capacidad de catalizar la formación de valenceno a partir del pirofosfato acíclico precursor de terpenos, como el farnesil pirofosfato (FPP). En ejemplos particulares, los polipéptidos de valenceno sintasa están truncados en el extremo aminoterminal o carboxiterminal, tal y como se describe con más detalle a continuación. En algunos ejemplos, los fragmentos activos de polipéptidos de valenceno sintasa se modifican según se describe en la presente memoria. Dichos fragmentos conservan una o más propiedades de un polipéptido de valenceno sintasa de secuencia completa. Normalmente, los fragmentos activos presentan actividad de valenceno sintasa (es decir, catalizan la formación de valenceno).

Los polipéptidos de valenceno sintasa proporcionados en la presente memoria se pueden generar mediante cualquier método conocido por un experto en la técnica. En algunos ejemplos, los polipéptidos de valenceno sintasa proporcionados en la presente memoria se producen mediante síntesis, como, por ejemplo, mediante síntesis de péptidos en fase sólida o en solución. Normalmente, los polipéptidos de valenceno sintasa proporcionados en la presente memoria se expresan en una célula hospedadora a partir de un ácido nucleico que codifica el polipéptido de valenceno sintasa, según se describe en el Apartado C más arriba. Un ejemplo de célula hospedadora para la expresión de un polipéptido de valenceno sintasa es una célula de levadura, por ejemplo, una célula de S. cerevisiae.

Los polipéptidos de valenceno sintasa proporcionados en la presente memoria se pueden utilizar para catalizar la producción de valenceno. Normalmente, los polipéptidos de valenceno sintasa proporcionados en la presente memoria catalizan la formación de valenceno a partir de f Pp . Las reacciones se pueden realizar in vivo, como en una célula hospedadora en la que se ha introducido un ácido nucleico que codifica el polipéptido de valenceno sintasa (como se describe en el Apartado C más arriba). Al menos uno de los polipéptidos, por ejemplo, el polipéptido de valenceno sintasa, será heterólogo para el hospedador. Las reacciones también se pueden realizar in vitro poniendo en contacto el polipéptido de valenceno sintasa con el sustrato adecuado, por ejemplo, farnesil difosfato, en condiciones adecuadas para la generación de valenceno.

1. Polipéptidos de valenceno sintasa de Eryngium glaciale

En la presente memoria se proporciona un polipéptido de valenceno sintasa que tiene una secuencia aminoacídica establecida en la SEC. N.° lD.:1. En la presente memoria también se proporcionan polipéptidos de valenceno sintasa que presentan al menos un 50 % de identidad de secuencia aminoacídica con un polipéptido de valenceno sintasa establecido en la SEC. N.° ID.:1. Por ejemplo, los polipéptidos de valenceno sintasa proporcionados en la presente memoria pueden presentar identidad de secuencia aminoacídica de al menos o aproximadamente un 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con un polipéptido de valenceno sintasa establecido en la SEC. N.° ID.: 1, siempre que el polipéptido de valenceno sintasa resultante conserve al menos la actividad de valenceno sintasa (es decir, la capacidad de catalizar la formación de valenceno a partir de un pirofosfato acíclico precursor de terpenos, normalmente FPP). El porcentaje de identidad lo puede determinar un experto en la técnica utilizando programas de alineamiento estándar.

2. Modificaciones de los polipéptidos de valenceno sintasa de Eryngium glaciale

En la presente memoria se proporcionan polipéptidos de valenceno sintasa de Eryngium glaciale modificada. En la presente memoria también se proporcionan moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de los polipéptidos de valenceno sintasa modificados proporcionados en la presente memoria. Las modificaciones se pueden realizar en cualquier región de una valenceno sintasa siempre que el polipéptido de valenceno sintasa modificado resultante conserve al menos la actividad de valenceno sintasa (es decir, la capacidad de catalizar la formación de valenceno a partir de un pirofosfato acíclico precursor de terpenos, normalmente FPP).

Las modificaciones pueden ser de un solo aminoácido, como reemplazos (sustituciones), inserciones o deleciones de un solo aminoácido, o modificaciones de múltiples aminoácidos, como reemplazos, inserciones o deleciones de múltiples aminoácidos. En algunos ejemplos, se intercambian regiones o dominios enteros o parciales, como cualquier región o dominio descritos en la presente memoria, con los dominios o regiones correspondientes o porciones de los mismos de otra terpeno sintasa. Los ejemplos de modificaciones son reemplazos de aminoácidos, incluidos reemplazos de aminoácidos únicos o múltiples. Normalmente, la modificación es un reemplazo de aminoácidos, que puede ser una sustitución conservadora, como se establece en la Tabla 2, o una sustitución no conservadora. Por ejemplo, los polipéptidos de valenceno sintasa modificados proporcionados en la presente memoria pueden contener al menos o 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120 o más posiciones modificadas en comparación con el polipéptido de valenceno sintasa que no contiene la modificación.

Las modificaciones descritas en la presente memoria pueden estar en cualquier polipéptido de valenceno sintasa. Normalmente, las modificaciones se realizan en un polipéptido de valenceno sintasa proporcionado en la presente memoria. Por ejemplo, las modificaciones descritas en la presente memoria pueden estar en un polipéptido de valenceno sintasa establecido en la SEC. N.° ID.:1 o cualquier variante del mismo, incluido cualquiera que tenga una identidad de secuencia de al menos un 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con un polipéptido de valenceno sintasa establecido en la SEC. N.° ID.:1.

En particular, los polipéptidos de valenceno sintasa modificados proporcionados en la presente memoria contienen sustituciones o reemplazos, adiciones o deleciones de aminoácidos, truncamientos o combinaciones de los mismos con referencia al polipéptido de valenceno sintasa establecido en la SEC. N.° ID.:1. Está dentro de las competencias de un experto en la técnica hacer dichas modificaciones en los polipéptidos de valenceno sintasa, como cualquiera de los establecidos en la SEC. N.° ID.:1 o cualquier variante de los mismos. En el Apartado C.1.a más arriba se proporcionan ejemplos de métodos para generar polipéptidos de valenceno sintasa modificados. Está dentro de las competencias de un experto en la técnica generar una valenceno sintasa que contenga una o más de las mutaciones descritas, y evaluar la actividad de valenceno sintasa en cada una de ellas según se describe en la presente memoria.

Además, en algunos ejemplos, en la presente memoria se proporcionan fragmentos activos modificados de polipéptidos de valenceno sintasa que contienen cualquiera de las modificaciones proporcionadas en la presente memoria. Dichos fragmentos conservan una o más propiedades de una valenceno sintasa. Normalmente, los fragmentos activos modificados presentan actividad de valenceno sintasa (es decir, la capacidad de catalizar la formación de valenceno a partir de un pirofosfato acíclico precursor de terpenos, por ejemplo, FPP).

Las modificaciones en un polipéptido de valenceno sintasa también se pueden realizar en un polipéptido de valenceno sintasa que también contenga otras modificaciones, incluidas modificaciones de la secuencia primaria y modificaciones fuera de la secuencia primaria del polipéptido. Por ejemplo, la modificación descrita en la presente memoria se puede realizar en un polipéptido de valenceno sintasa que sea un polipéptido de fusión o un polipéptido quimérico, incluidos los híbridos de diferentes polipéptidos de valenceno sintasa o diferentes polipéptidos de terpeno sintasa (por ejemplo, que contengan uno o más dominios o regiones de otra terpeno sintasa) y también polipéptidos sintéticos de valenceno sintasa preparados por recombinación o sintetizados o construidos mediante otros métodos conocidos en la técnica que están basados en la secuencia de polipéptidos conocidos.

Para retener la actividad de valenceno sintasa, normalmente no se realizan modificaciones en aquellas posiciones que son necesarias para la actividad de valenceno sintasa, es decir, en el motivo DDxxD (SEC. N.° ID.:35) del sitio activo o el motivo NSE/DTE (SEC. N.° ID.:36). Por ejemplo, generalmente no se realizan modificaciones en una posición correspondiente a la posición D315, D316 o D319, o en una posición correspondiente a la posición D461, G465 o E469, con referencia a una secuencia de aminoácidos establecida en la SEC. N.° ID.:1.

Los polipéptidos de valenceno sintasa modificados pueden contener una o más sustituciones de aminoácidos, en cualquier combinación, con o sin modificaciones adicionales. Por lo general, las múltiples modificaciones proporcionadas en la presente memoria pueden ser combinadas por un experto en la técnica siempre que el polipéptido modificado conserve la capacidad de catalizar la formación de valenceno y/u otros terpenos a partir de cualquier pirofosfato acíclico adecuado precursor de terpenos, incluidos, entre otros, FPP, GPP y GGPP. Normalmente, los polipéptidos de valenceno sintasa modificada catalizan la formación de valenceno a partir de FPP. En algunos ejemplos, el polipéptido de valenceno sintasa modificado resultante presenta una producción de valenceno a partir de FPP similar o mayor en comparación con el polipéptido de valenceno sintasa que no está modificado. En algunos casos, el polipéptido de valenceno sintasa modificado resultante presenta una producción de valenceno a partir de FPP menor en comparación con el polipéptido de valenceno sintasa que no está modificado.

En la presente memoria también se proporcionan moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de los polipéptidos de valenceno sintasa modificados proporcionados en la presente memoria. En ejemplos particulares, en la secuencia del ácido nucleico se pueden optimizar los codones, por ejemplo, para aumentar los niveles de expresión de la secuencia codificada. En un ejemplo, en las secuencias de los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos de valenceno sintasa modificados proporcionados en la presente memoria se han optimizado los codones basándose en el uso de codones en S. cerevisiae.

Los polipéptidos modificados y las moléculas de ácido nucleico codificantes que se proporcionan en la presente memoria se pueden producir mediante técnicas estándar de ADN recombinante conocidas por los expertos en la técnica. Se puede emplear cualquier método conocido en la técnica para efectuar la mutación de uno o más aminoácidos en una proteína de interés. En el Apartado C más arriba se proporcionan ejemplos de métodos. En algunos ejemplos, los polipéptidos de valenceno sintasa modificados se producen mediante síntesis, como, por ejemplo, mediante síntesis de péptidos en fase sólida o en solución.

a. Polipéptidos truncados

En la presente memoria también se proporcionan polipéptidos truncados de valenceno sintasa. Los polipéptidos truncados de valenceno sintasa pueden estar truncados en el extremo aminoterminal o en el extremo carboxiterminal, siempre que los polipéptidos truncados de valenceno sintasa conserven la actividad catalítica de una valenceno sintasa. Normalmente, los polipéptidos truncados de valenceno sintasa presentan actividad de valenceno sintasa (es decir, la capacidad de catalizar la formación de valenceno a partir de un pirofosfato acíclico precursor de terpenos, como el FPP). En algunos ejemplos, los polipéptidos de valenceno sintasa proporcionados en la presente memoria están truncados en el extremo aminoterminal. En otros ejemplos, los polipéptidos de valenceno sintasa proporcionados en la presente memoria están truncados en el extremo carboxiterminal. En otros ejemplos, los polipéptidos de valenceno sintasa proporcionados en la presente memoria están truncados en el extremo aminoterminal y en el extremo carboxiterminal.

En algunos ejemplos, los polipéptidos de valenceno sintasa están truncados en el extremo aminoterminal, en el extremo carboxiterminal o en ambos extremos de un polipéptido de valenceno sintasa proporcionado en la presente memoria, como el truncamiento de una secuencia de aminoácidos establecida en la SEC. N.° ID.:1. En otros ejemplos, cualquiera de las valenceno sintasas modificadas proporcionadas en la presente memoria están truncadas. En algunos ejemplos, los polipéptidos de valenceno sintasa están truncados en su extremo aminoterminal. Por ejemplo, cualquier polipéptido de valenceno sintasa proporcionado en la presente memoria puede estar truncado en o alrededor de o al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 1920, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75 o más restos aminoacídicos en el extremo aminoterminal, siempre que el polipéptido de valenceno sintasa conserve la actividad de valenceno sintasa.

En otros ejemplos, cualquier polipéptido de valenceno sintasa proporcionado en la presente memoria puede estar truncado en o alrededor de o al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 1920, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75 o más restos aminoacídicos en el extremo carboxiterminal, siempre que el polipéptido de valenceno sintasa conserve la actividad de valenceno sintasa.

b. Polipéptidos con actividades o propiedades alteradas

Los polipéptidos de valenceno sintasa modificados proporcionados en la presente memoria también pueden presentar cambios en las actividades y/o propiedades. La valenceno sintasa modificada puede presentar, por ejemplo, una mayor actividad catalítica, una mayor unión al sustrato (por ejemplo, FPP), una mayor estabilidad, una mayor expresión en una célula hospedadora y/o una distribución alterada del producto (es decir, cantidades relativas alteradas y/o tipos de terpenos) en comparación con un polipéptido de valenceno sintasa nativa. Dichas actividades y propiedades alteradas pueden dar lugar a una mayor producción de valenceno a partir de farnesil pirofosfato. Normalmente, la distribución de productos terpénicos producidos por una valenceno sintasa nativa incluye valenceno, así como una serie de otros productos terpénicos (por ejemplo, subproductos de terpenos o productos derivados de los mismos) incluidos, por ejemplo, p-selineno, T-selineno, eremofilona, 7-epi-a-selineno, germacreno A, p-elemeno y aristoloqueno (pico 2 en la Figura 3A).

En algunos ejemplos, los polipéptidos de valenceno sintasa modificados pueden catalizar la formación de otros terpenos distintos del valenceno a partir de cualquier sustrato adecuado, como, por ejemplo, FPP, GPP o GGPP. Por ejemplo, las valenceno sintasas modificadas pueden producir uno o más monoterpenos, sesquiterpenos o diterpenos distintos del valenceno. Normalmente, los polipéptidos de valenceno sintasa modificados producen más valenceno que cualquier otro terpeno. Esto puede dar lugar a una mayor producción de nootkatona. Las modificaciones que dan lugar a una mayor producción de valenceno a partir de FPP se pueden identificar utilizando los ensayos descritos en la presente memoria y son bien conocidas en la técnica, permitiendo así la identificación de polipéptidos de valenceno sintasa modificados con una capacidad mejorada para producir valenceno a partir de FPP.

c. Intercambio de dominios

En la presente memoria se proporcionan polipéptidos de valenceno sintasa modificados que son polipéptidos quiméricos que contienen un intercambio (deleción e inserción) por deleción de restos aminoacídicos de uno o más dominios o regiones en los mismos o porciones de los mismos e inserción de una secuencia heteróloga de aminoácidos. En algunos ejemplos, la secuencia heteróloga es una secuencia aleatoria de aminoácidos. En otros ejemplos, la secuencia heteróloga es una secuencia contigua de aminoácidos para el dominio o región o porción correspondientes de la misma de otro polipéptido de terpeno sintasa. La secuencia heteróloga que se reemplaza o se introduce por lo general incluye al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 o más aminoácidos. En ejemplos en los que la secuencia heteróloga es de un dominio o porción correspondiente de la misma de otra terpeno sintasa, la secuencia heteróloga por lo general incluye al menos un 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o más aminoácidos contiguos del dominio o región o porción correspondientes. En dicho ejemplo, los restos adyacentes al dominio o región o porción correspondientes heterólogos de la misma también se pueden incluir en un polipéptido de valenceno sintasa modificado proporcionado en la presente memoria.

En un ejemplo de mutantes por intercambio proporcionadas en la presente memoria, al menos un dominio o región o porción de las mismas de un polipéptido de valenceno sintasa está reemplazado por una secuencia contigua de aminoácidos para el dominio o región o porciones correspondientes de la misma de otro polipéptido de terpeno sintasa. En algunos ejemplos, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más dominios o regiones o porciones de la misma se reemplazan con una secuencia contigua de aminoácidos para el dominio o región o porciones correspondientes de la misma de otro polipéptido de terpeno sintasa.

Cualquier dominio o región o porción de la misma de un polipéptido de valenceno sintasa se puede reemplazar con una secuencia heteróloga de aminoácidos, como una secuencia heteróloga del dominio o región correspondientes de otra terpeno sintasa. Un dominio o región puede ser un dominio estructural o un dominio funcional. Un experto en la técnica está familiarizado con los dominios o regiones en las terpeno sintasas. Los dominios funcionales incluyen, por ejemplo, el dominio aminoterminal y el dominio catalítico carboxiterminal o una parte del mismo. Un dominio estructural puede incluir un bucle completo o una porción de este, un bucle no estructurado o un dominio alfa helicoidal.

Un experto en la técnica está familiarizado con varias terpeno sintasas y puede identificar los dominios o regiones o porciones correspondientes de aminoácidos de las mismas. Por ejemplo, los ejemplos de dominios y regiones de la valenceno sintasa de cítricos se describen en la solicitud de patente de EE. UU. n.° 2012-0246767. Entre los ejemplos de terpeno sintasas se incluyen, por ejemplo, las sesquiterpeno sintasas. En ejemplos particulares de la presente memoria, las mutantes por intercambio de dominios de polipéptidos de valenceno sintasa modificados proporcionados en la presente memoria contienen secuencias heterólogas de un dominio o región o porción correspondientes de las mismas de un polipéptido de terpeno sintasa que es una valenceno sintasa de Citrus sp. (SEC. N.° ID.:14-15, 26-27, 34 o 37), una valenceno sintasa de V. Vinifera (SEC. N.° ID.:16 o 28), una valenceno sintasa de P. Frutescens (SEC. N.° ID.:38) o una valenceno sintasa de C. Nootkatensis (SEC. N.° ID.:17 o 29).

Normalmente, la valenceno sintasa modificada resultante presenta actividad de valenceno sintasa y la capacidad de producir valenceno a partir de FPP. Por ejemplo, los polipéptidos de valenceno sintasa modificados presentan del 50 % al 5000 %, como del 50 % al 120 %, del 100 % al 500 % o del 110 % al 250 %, de la producción de valenceno a partir de FPP en comparación con el polipéptido de valenceno sintasa que no contiene la modificación (por ejemplo, el reemplazo de aminoácidos o el intercambio de restos aminoacídicos de un dominio o región) y/o en comparación con el polipéptido de valenceno sintasa nativa establecido en la SEC. N.° ID.:1. Normalmente, los polipéptidos de valenceno sintasa modificados presentan una mayor producción de valenceno a partir de FPP en comparación con el polipéptido de valenceno sintasa que no contiene la modificación, como, por ejemplo, en comparación con la valenceno sintasa nativa establecida en la SEC. N.° ID.:1.

Por ejemplo, los polipéptidos de valenceno sintasa modificados pueden producir valenceno a partir de FPP en una cantidad que es al menos o aproximadamente un 101 %, 102 %, 103 %, 104 %, 105 %, 106 %, 107 %, 108 %, 109 %, 110 %, 115%, 120 %, 125 %, 130 %, 135 %, 140 %, 145 %, 150 %, 160 %, 170 %, 180 %, 200 %, 250 %, 300 %, 350 %, 400 %, 500 %, 1500 %, 2000 %, 3000 %, 4000 %, 5000 % de la cantidad de valenceno producida a partir de FPP por la valenceno sintasa nativa que no contiene la modificación en las mismas condiciones. Por ejemplo, la producción de valenceno aumenta en al menos 1,2 veces, 1,5 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces, 10 veces, 11 veces, 12 veces, 13 veces, 14 veces, 15 veces, 16 veces, 17 veces, 18 veces, 19 veces, 20 veces o más.

En otros ejemplos, los polipéptidos de valenceno sintasa modificados presentan una menor producción de valenceno a partir de FPP en comparación con el polipéptido de valenceno sintasa que no contiene la modificación, como en comparación con la valenceno sintasa nativa establecida en la SEC. N.° ID.:1. Por ejemplo, los polipéptidos de valenceno sintasa modificados pueden producir valenceno a partir de FPP en una cantidad que es como máximo o alrededor del 99 %, 98 %, 97 %, 96 %, 95 %, 94 %, 93 %, 92 %, 91 %, 90 %, 85 %, 80 %, 75 %, 70 %, 65 %, 60 %, 55 %, 50 %, 45 %, 40 %, 35 %, 30 %, 25 %, 20 %, 15 %, 10 %, o menos de la cantidad de valenceno producida a partir de FPP por la valenceno sintasa nativa que no contiene la modificación en las mismas condiciones. Por ejemplo, la producción de valenceno disminuye de manera que la producción de FPP por una valenceno sintasa nativa que no contiene la modificación en las mismas condiciones es al menos 1,2 veces, 1,5 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces, 10 veces, 11 veces, 12 veces, 13 veces, 14 veces, 15 veces, 16 veces, 17 veces, 18 veces, 19 veces, 20 veces o más veces, mayor que la cantidad de valenceno producida a partir de FPP por el polipéptido de valenceno sintasa modificado.

Cualquier método conocido en la técnica para generar polipéptidos quiméricos se puede utilizar para reemplazar la totalidad o una porción contigua de un dominio o una primera terpeno sintasa con la totalidad o una porción contigua del dominio correspondiente de una segunda sintasa (véanse, las patentes de EE. UU. n.° 5.824.774, 6.072.045, 7.186.891 y 8.106.260, y la patente publicada de EE. UU. n^ 2011-0081703). Además, se pueden emplear métodos de barajado de genes para generar polipéptidos quiméricos y/o polipéptidos con intercambios de dominios o regiones.

Por ejemplo, los dominios o regiones correspondientes de dos terpeno sintasas cualesquiera se pueden intercambiar mediante cualquier método recombinante adecuado conocido en la técnica, o mediante síntesis in vitro. Un ejemplo de método recombinante es un método de PCR de superposición de dos etapas, como el descrito en la presente memoria. En dichos métodos, se pueden emplear cebadores que introducen mutaciones en una pluralidad de posiciones de codones en los ácidos nucleicos que codifican el dominio de interés o una porción del mismo en la primera terpeno sintasa, en donde las mutaciones forman conjuntamente la región heteróloga (es decir, la región correspondiente de la segunda terpeno sintasa). Como otra posibilidad, por ejemplo, se pueden utilizar aminoácidos aleatorios para reemplazar dominios o regiones específicas. Se entiende que los errores en el cebador, los errores de PCR y/u otros errores en los métodos de clonación o recombinación pueden dar lugar a errores tales que la región o el dominio intercambiados o reemplazados resultantes no presenten una secuencia aminoacídica que sea idéntica a la región correspondiente de la segunda terpeno sintasa.

En un ejemplo de método con PCR, en la primera etapa de la PCR se utiliza (i) un cebador en dirección 3' que se hibrida en dirección 3' de la región que se está reemplazando con un cebador mutágeno que incluye aproximadamente 15 nucleótidos (o un número efectivo para efectuar la hibridación, como 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 20, 25 nucleótidos o más) de secuencia homóloga a cada lado del dominio o región a intercambiar o aleatorizar que flanquean la región a importar al gen de interés, y (ii) un cebador en dirección 5' que se hibrida en dirección 5' de la región que se está reemplazando junto con un cebador mutágeno de la hebra opuesta que también incluye aproximadamente 15 nucleótidos (o un número efectivo para efectuar la hibridación, como 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 20, 25 nucleótidos o más) de secuencia homóloga a cada lado del dominio o región a intercambiar o aleatorizar que flanquean la región a importar al gen de interés. Si se realiza un reemplazo en el que un dominio o región de un primer gen de terpeno sintasa se reemplaza con el correspondiente dominio o región de una segunda terpeno sintasa, los nucleótidos en los cebadores mutágenos entre las regiones flanqueantes de la primera terpeno sintasa contienen codones para la región correspondiente de la segunda terpeno sintasa. En los casos en que los aminoácidos de un dominio o región deben ser aleatorizados, los nucleótidos de los cebadores mutágenos entre las regiones flanqueantes de la primera terpeno sintasa contienen nucleótidos aleatorios. A continuación, se realiza una PCR de superposición para unir los dos fragmentos, utilizando los oligos en dirección 5' y dirección 3'. El producto resultante de la PCR se puede a continuación clonar en cualquier vector adecuado para la expresión de la terpeno sintasa modificada.

Además, cualquiera de los polipéptidos de valenceno sintasa modificados que contengan mutaciones por intercambio en la presente memoria pueden contener uno o más reemplazos de aminoácidos adicionales.

d. Variantes adicionales

Los polipéptidos de valenceno sintasa proporcionados en la presente memoria se pueden modificar mediante cualquier método conocido por un experto en la técnica para generar variantes de proteínas, incluidos, entre otros, el barajado de ADN o genes, la PCR propensa a errores, la PCR de superposición u otros métodos de recombinación. En un ejemplo, las moléculas de ácido nucleico que codifican cualquier polipéptido de valenceno sintasa o polipéptido de valenceno sintasa variante proporcionado en la presente memoria se pueden modificar mediante barajado de genes. El barajado de genes conlleva uno o más ciclos de fragmentación aleatoria y reensamblaje de al menos dos secuencias nucleotídicas, seguido de un cribado para seleccionar las secuencias nucleotídicas que codifican polipéptidos con las propiedades deseadas. La recombinación se puede realizar in vitro (véase Stemmer et al. (1994) Proc Natl Acad Sci USA 91:10747-10751; Stemmer et al. (1994) Nature 370:389-391; Cramieri et al. (1998) Nature 391:288-291; patente de EE. UU. n^ 5.605.793, 5.811.238, 5.830.721, 5.834.252 y 5.837.458) o in vivo (véase, la publicación de patente internacional n^ WO199707205). Las moléculas de ácido nucleico que codifican los polipéptidos se pueden a continuación introducir en una célula hospedadora para ser expresadas heterólogamente y evaluar su actividad de valenceno sintasa mediante cualquier método descrito en el apartado E más abajo.

e. Proteínas de fusión

Los polipéptidos de valenceno sintasa también se pueden utilizar o expresar como fusiones de proteínas. Por ejemplo, se puede generar una fusión para añadir grupos funcionales adicionales a un polipéptido. Entre los ejemplos de proteínas de fusión se incluyen, entre otros, fusiones de una secuencia señal, un marcaje para la localización, por ejemplo, un marcaje de His6 o un marcaje de myc, o un marcaje para la purificación, por ejemplo, una fusión de g St , una fusión de GFP o una fusión de CBP, y una secuencia para dirigir la secreción de proteínas y/o la asociación con la membrana. En otros ejemplos, una sesquiterpeno sintasa, como un polipéptido de valenceno sintasa proporcionado en la presente memoria, se puede fusionar con la FPP sintasa (véase, por ejemplo, Brodelius et al. (2002) Eur. J. Biochem. 269:3570-3579).

También se proporcionan proteínas de fusión que contienen un polipéptido de valenceno sintasa y uno o más polipéptidos. La conexión de un polipéptido de valenceno sintasa a otro polipéptido se puede efectuar directa o indirectamente a través de un conector. En un ejemplo, la conexión puede ser por conexión química, como, por ejemplo, a través de agentes heterobifuncionales o conexiones entre grupos tiol u otras conexiones de este tipo. La fusión también se puede realizar por medios recombinantes. La fusión de una terpeno sintasa, como un polipéptido de valenceno sintasa, con otro polipéptido se puede realizar en el extremo aminoterminal o carboxiterminal del polipéptido de valenceno sintasa.

Una proteína de fusión se puede producir mediante técnicas recombinantes estándar. Por ejemplo, los fragmentos de ADN que codifican las diferentes secuencias polipeptídicas se pueden ligar juntos en fase de acuerdo con técnicas convencionales, por ejemplo, empleando terminaciones romas o escalonadas para el ligamiento, digestión con enzimas de restricción para proporcionar terminaciones adecuadas, relleno de extremos cohesivos según sea adecuado, tratamiento con fosfatasa alcalina para evitar uniones indeseables y ligamiento enzimático. En otra realización, el gen de fusión se puede sintetizar mediante técnicas convencionales, incluidos sintetizadores de ADN automatizados. Como otra posibilidad, la amplificación por PCR de fragmentos del gen se puede llevar a cabo utilizando cebadores de anclaje que dan lugar a salientes complementarios entre dos fragmentos consecutivos del gen que posteriormente se pueden hibridar y reamplificar para generar una secuencia génica quimérica (véase, por ejemplo, Ausubel et al. (eds.) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1992). Además, hay muchos vectores de expresión disponibles en el mercado que ya codifican una porción de fusión (por ejemplo, un polipéptido de GST). Por ejemplo, un ácido nucleico que codifica un polipéptido de valenceno sintasa se puede clonar en un vector de expresión de este tipo, de manera que la porción de fusión está conectada en fase a la proteína de valenceno sintasa. La valenceno sintasa y la porción de fusión se pueden conectar directamente, sin un conector, o como otra posibilidad, se pueden conectar indirectamente en fase con un conector.

E. MÉTODOS PARA PRODUCIR TERPENOS Y MÉTODOS PARA DETECTAR DICHOS PRODUCTOS Y LA ACTIVIDAD DE LOS POLIPÉPTIDOS DE VALENCENO SINTASA

Las valenceno sintasas proporcionadas en la presente memoria se pueden utilizar y evaluar en términos de su capacidad de producir terpenos, como monoterpenos, sesquiterpenos y diterpenos, a partir de cualquier pirofosfato acíclico adecuado precursor de terpenos, incluidos, entre otros, el geranil difosfato (GPP), el farnesil difosfato (FPP) o el geranil-geranil difosfato (GGPP). Normalmente, los polipéptidos de valenceno sintasa proporcionados en la presente memoria catalizan la formación del sesquiterpeno valenceno a partir de FPP. Los polipéptidos de valenceno sintasa proporcionados en la presente memoria también catalizan la formación de un compuesto adicional, el aristoloqueno, (designado como el pico 2; véase la Figura 3A) a partir de FPP.

Los terpenos se pueden producir mediante cualquier método conocido por un experto en la técnica para producir terpenos, incluido el valenceno, con las valenceno sintasas proporcionadas en la presente memoria. La capacidad de las valenceno sintasas proporcionadas en la presente memoria para catalizar la formación de valenceno u otros terpenos a partir de FPP se puede evaluar mediante estos métodos. En algunos ejemplos, la cantidad de terpeno, como valenceno, producida a partir de FPP utilizando las valenceno sintasas proporcionadas en la presente memoria se compara con la cantidad de terpeno, como valenceno, producida a partir del mismo sustrato utilizando una valenceno sintasa diferente, como una valenceno sintasa de una especie diferente, por ejemplo, una valenceno sintasa de cítricos, o cualquier otra valenceno sintasa conocida por un experto en la técnica.

Otras actividades y propiedades de las valenceno sintasas, como los polipéptidos de valenceno sintasa proporcionados en la presente memoria, también se pueden evaluar mediante métodos y ensayos bien conocidos en la técnica. Además de evaluar la actividad de las valenceno sintasas y su capacidad para catalizar la formación de terpenos, la cinética de la reacción, la regioquímica o estereoquímica modificadas, la utilización alterada del sustrato y/o la distribución alterada del producto (es decir, la cantidad alterada de los diferentes terpenos producidos a partir de FPP u otro sustrato) en comparación con las valenceno sintasas se puede evaluar mediante métodos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, el tipo y la cantidad de diversos terpenos producidos a partir de FPP, GPP o GGPP por los polipéptidos de valenceno sintasa proporcionados en la presente memoria se puede evaluar mediante métodos de cromatografía de gases (por ejemplo, GC-MS), como los descritos más abajo y en el Ejemplo 4. En algunos ejemplos, el perfil de los terpenos producidos por los polipéptidos de valenceno sintasa a partir de FPP incluye, entre otros, valenceno, p-elemeno y aristoloqueno (pico 2). Las células hospedadoras también producen los alcoholes terpénicos acíclicos nerolidol y farnesol.

Más abajo se proporcionan métodos para la producción de terpenos, incluidos el valenceno y la nootkatona, a partir de FPP utilizando las valenceno sintasas proporcionadas en la presente memoria.

1. Producción de terpenos catalizada por la valenceno sintasa de Eryngium glaciale

Los polipéptidos de valenceno sintasa modificados se pueden utilizar para catalizar la formación de valenceno y otros terpenos a partir de un pirofosfato acíclico precursor de terpenos, como el FPP. En algunos ejemplos, las valenceno sintasas proporcionadas en la presente memoria se expresan en células que producen o sobreproducen FPP, de manera que el valenceno se produce por la vía descrita más arriba. En otros ejemplos, las valenceno sintasas proporcionadas en la presente memoria se expresan y purifican a partir de cualquier célula hospedadora adecuada, como se describe en el apartado C. Las sintasas purificadas a continuación se combinan in vitro con FPP para producir valenceno.

En algunos ejemplos, la valenceno sintasa proporcionada en la presente memoria se encuentra sobreexpresada y se purifica según se detalla en el apartado C más arriba. La valenceno sintasa se incuba entonces con el sustrato farnesil difosfato y se produce valenceno. El pH de la solución que contiene FPP y valenceno sintasa puede influir en la cantidad de valenceno producida (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. Pub. N.° 2010-0216186). Se añade un disolvente orgánico para que se produzca el reparto del valenceno hacia la fase orgánica para su análisis. La producción de valenceno y la cuantificación de la cantidad de producto a continuación se determinan mediante cualquier método proporcionado en la presente memoria, como cromatografía de gases (por ejemplo, GC-MS) utilizando un patrón interno. Como otra posibilidad, la valenceno sintasa se expresa en células hospedadoras que también producen FPP, dando lugar a la producción de valenceno. A continuación, el valenceno se puede extraer del medio de cultivo celular con un disolvente orgánico y, posteriormente, aislar y purificar mediante cualquier método conocido, como cromatografía en columna o HPLC, y se evalúa la cantidad y la pureza del valenceno recuperado. En algunos ejemplos, el valenceno se transforma mediante oxidación en nootkatona antes o después de la purificación.

a. Ejemplos de células

El valenceno se puede producir expresando un polipéptido de valenceno sintasa proporcionado en la presente memoria en una línea celular que produce FPP en la ruta biosintética de isoprenoides dependiente de mevalonato (por ejemplo, hongos, incluidas células de levadura y células animales) o la ruta biosintética de isoprenoides independiente de mevalonato (por ejemplo, bacterias y plantas superiores). En ejemplos particulares, el valenceno se produce mediante expresión de un polipéptido de valenceno sintasa proporcionado en la presente memoria en una línea celular que ha sido modificada para sobreproducir FPP. Algunos ejemplos de dichas células son las células de levadura modificadas. Por ejemplo, las células de levadura que se han modificado para producir menos escualeno sintasa o una escualeno sintasa menos activa (p. ej., mutantes erg9; véanse, p. ej., las patentes de EE.UU. n.° 6.531.303 y 6.689.593 y la publicación de patente de EE. UU. n.° 2010-0151519 y 2010-0151555) son útiles en los métodos proporcionados en la presente memoria para producir valenceno. La reducción de la actividad de la escualeno sintasa da lugar a la acumulación de FPP en la célula hospedadora a concentraciones más elevadas en comparación con las células de levadura nativas, lo que a su vez puede dar lugar a mayores rendimientos en la producción de valenceno. Entre los ejemplos de células de levadura modificadas se incluyen, entre otras, cepas modificadas CALI5-1 (ura3, leu2, his3, trpl, Aerg9:.HIS3, HMG2cat/TRP1::rDNA, dpp1), ALX7-95 (ura3, his3, trpl, Aerg9::HIS3, HMG2cat/TRP1::rDNA, dppl, sue), ALX11-30 (ura3, trp l, erg9def25, HMG2cat/TRP1::rDNA, dppl, sue) de Saccharomyces cerevisiae y las descritas en las patentes de EE. UU. n^ 6.531.303 y 6.689.593 y las solicitudes de patente publicada de EE. UU. n.° 2004-0249219, 2010-0151519 y 2010-0151555.

La cepa CALI5-1 de Saccharomyces cerevisiae es un derivado de SW23B#74 (descrito en las patentes de EE. UU. n.° 6.531.303 y 6.689.593, y en Takahashi et al. (2007) (Biotechnol Bioeng. 97(1): 170-181), que se derivó de la cepa nativa de la ATCC 28383 (MATa). CALI5-1 se generó para tener una menor actividad de la DPP1 fosfatasa (véase, por ejemplo, la solicitud de patente publicada de EE. Uu . n^ 2004-0249219). La cepa CALI5-1 de Saccharomyces cerevisiae contiene, entre otras mutaciones, una mutación erg9 (el alelo Aerg9::HIS3), así como una mutación que aumenta la captación aeróbica de esteroles (sue). También contiene aproximadamente 8 copias del gen HMG2 truncado. La forma truncada de HMG2 se activa por el promotor GPD y, por lo tanto, ya no está sometida a una regulación estricta, lo que permite un aumento del flujo de carbono al FPP. También contiene una deleción en el gen que codifica la enzima diacilglicerol pirofosfato (DGPP) fosfatasa (dpp1), que limita la desfosforilación del FPP.

ALX7-95 y ALX11-30.1 son derivados de CALI5-1. ALX7-95 se derivó de CALI5-1 corrigiendo la deficiencia de Aleu2 en CALI5-1 con un gen LEU2 funcional, de modo que no es necesario suplementar el medio con leucina (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. 2010/0151519). ALX11-30 se construyó a partir de CAL5-1 en varios pasos, descritos más abajo en el Ejemplo 4.

b. Cultivo de células

En ejemplos de métodos, una valenceno sintasa proporcionada en la presente memoria se expresa en una línea celular hospedadora que ha sido modificada para sobreproducir farnesil difosfato, de manera que tras la expresión de la valenceno sintasa, el farnesil difosfato se transforma en valenceno. La célula hospedadora se cultiva mediante cualquier método adecuado conocido en la técnica. En algunos ejemplos, como para el cribado de alto rendimiento de células que expresan diversas valenceno sintasas, las células que expresan la valenceno sintasa se cultivan en pocillos individuales de una placa de 96 pocillos (véase, por ejemplo, el Ejemplo 4 más abajo). En otros ejemplos en los que la célula hospedadora es una levadura, la célula que expresa los polipéptidos de valenceno sintasa y FPP se cultiva mediante métodos de fermentación como los descritos en los ejemplos más abajo (véase, por ejemplo, el Ejemplo 5).

Para la producción de valenceno a partir de células de levadura que expresan los polipéptidos de valenceno sintasa proporcionados en la presente memoria se pueden utilizar diversos métodos de fermentación. Por ejemplo, la producción a gran escala se puede realizar mediante fermentación en discontinuo o en continuo. Una fermentación en discontinuo clásica consiste en un sistema cerrado en el que la composición del medio se fija al inicio de la fermentación y no se somete a alteraciones artificiales durante la fermentación. Por lo tanto, al inicio de la fermentación, el medio se inocula con el microorganismo o microorganismos deseados, y se deja que la fermentación transcurra sin añadir más nutrientes. Normalmente, la concentración de la fuente de carbono en una fermentación en discontinuo es limitada y se controlan factores como el pH y la concentración de oxígeno. En los sistemas en discontinuo, la composición en metabolitos y biomasa del sistema cambia constantemente hasta el momento en que la fermentación se para. En los cultivos en discontinuo, normalmente las células pasan de una fase de latencia estática a una fase de elevado crecimiento logarítmico y, finalmente, a una fase estacionaria en la que la tasa de crecimiento es inferior o nula. Si no se tratan, las células en fase estacionaria con el tiempo mueren.

Una variación del sistema estándar en discontinuo es el sistema en semicontinuo, que es similar a un sistema convencional en discontinuo, con la excepción de que los nutrientes se añaden a medida que la fermentación progresa. Los sistemas en régimen discontinuo son útiles cuando la represión por catabolito tiende a inhibir el metabolismo de las células y cuando se desea tener cantidades limitadas de sustrato en el medio. Además, la posibilidad de alimentar con nutrientes suele dar lugar a mayores densidades celulares en los procesos de fermentación en semicontinuo en comparación con los procesos de fermentación en discontinuo. Factores como el pH, el oxígeno disuelto, las concentraciones de nutrientes y la presión parcial de los gases residuales, como el CO2, suelen medirse y controlarse en las fermentaciones en semicontinuo.

La producción de valenceno también se puede llevar a cabo mediante fermentación en continuo. La fermentación en continuo consiste en un sistema abierto donde un medio de fermentación definido se añade continuamente a un biorreactor y la misma cantidad de medio acondicionado se extrae simultáneamente para su tratamiento. Este sistema por lo general mantiene los cultivos a una densidad elevada y constante, y las células se encuentran principalmente en su fase de crecimiento logarítmico. La fermentación en continuo permite la modulación de cualquier número de factores que afecten al crecimiento celular o a la concentración de producto final. Por ejemplo, un método mantendrá un nutriente limitante, como la fuente de carbono o de nitrógeno, a una velocidad fija y permitirá que se moderen todos los otros parámetros. En otros sistemas, varios factores que afectan al crecimiento se pueden alterar de manera continua, mientras que la concentración celular, determinada a partir de la turbidez del medio, se mantiene constante. Los sistemas en continuo tienen por objeto mantener condiciones de crecimiento en equilibrio y, por lo tanto, la pérdida de células debida a la eliminación del medio se debe compensar con la tasa de crecimiento celular en la fermentación. Los métodos para modular los nutrientes y los factores de crecimiento en los procesos de fermentación en continuo, así como las técnicas para aumentar al máximo la velocidad de formación del producto, son bien conocidos en la técnica. Tras el cultivo celular, el medio de cultivo celular se puede recolectar para obtener el valenceno producido.

En un ejemplo de método, las células hospedadoras que expresan los polipéptidos de valenceno sintasa (por ejemplo, cepa CALI5-1, ALX7-95 o ALX11-30 de Saccharomyces cerevisiae) se cultivan en un depósito de fermentación de 3 l a 28 °C y a un pH de 4,5 durante aproximadamente 132 horas, manteniendo la concentración de glucosa entre 0 y 1 g/l. Tras la fermentación, se añade sulfato de sodio hasta una concentración final del 10-15 %. También se añade y agita aceite de soja, y el aceite que contiene el valenceno (y otros terpenos) se recupera por centrifugación.

c. Aislamiento y evaluación de los productos

El valenceno producido mediante los métodos anteriores con los polipéptidos de valenceno sintasa proporcionados en la presente memoria se puede aislar y evaluar mediante cualquier método conocido en la técnica. En un ejemplo, el medio de cultivo celular se extrae con un disolvente orgánico para que se produzca el reparto del valenceno, y de cualquier otro terpeno producido, hacia la fase orgánica. La producción de valenceno se puede evaluar y/o el valenceno se puede aislar a partir de otros productos mediante cualquier método conocido en la técnica, como, por ejemplo, cromatografía de gases. Por ejemplo, la fase orgánica se puede analizar mediante cromatografía de gases utilizando cedreno y hexadecano como patrones internos. Este método se ejemplifica en los Ejemplos 3 y 4 más abajo.

La cantidad de valenceno producida se puede determinar mediante cualquier técnica cromatográfica estándar conocida, útil para separar y analizar compuestos orgánicos. Por ejemplo, la producción de valenceno se puede analizar mediante cualquier técnica cromatográfica conocida útil para la detección y la cuantificación de hidrocarburos, como el valenceno y otros terpenos, incluidas, entre otras, la cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (GC-MS), la cromatografía de gases acoplada a un detector de ionización de llama (GC-FID), la GC-MS capilar, la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) y la cromatografía en columna. Normalmente, estas técnicas se llevan a cabo en presencia de patrones internos conocidos, por ejemplo, cedreno o hexadecano, que se utilizan para cuantificar la cantidad del terpeno producido.

Por ejemplo, los terpenos, incluidos los sesquiterpenos, como el valenceno, se pueden identificar mediante la comparación de los tiempos de retención y los espectros de masas con los de los patrones auténticos en cromatografía de gases con detección por espectrometría de masas. Los patrones habituales incluyen, entre otros, el cedreno y el hexadecano. En otros ejemplos, la cuantificación se puede lograr mediante cromatografía de gases con detección por ionización de llama a partir de curvas/rectas de calibración con cantidades conocidas de patrones auténticos y normalización al área de pico de un patrón interno. Estas técnicas cromatográficas permiten la identificación de cualquier terpeno presente en la fase orgánica, incluidos, por ejemplo, otros terpenos producidos por la valenceno sintasa modificada, incluidos, por ejemplo, el p-elemeno y el aristoloqueno (pico 2) y otros compuestos producidos por las células, incluido el nerolidol y el farnesol (véase, por ejemplo, el Ejemplo 4).

En algunos ejemplos, la cinética de la producción de valenceno se puede determinar mediante ensayos con sintasas en los que se utilizan sustratos isoprenoídicos radiactivos, como 3H FPP o 14C FPP, con concentraciones variables de sintasa. Los productos se extraen en una fase orgánica y la radiactividad se mide con un contador de centelleo líquido. Las constantes cinéticas se determinan a partir de ajustes directos de la ecuación de Michaelis-Menton a los datos.

2. Producción de nootkatona

La nootkatona, que es el aroma dominante del pomelo, es un producto de oxidación del valenceno. Las valenceno sintasas proporcionadas en la presente memoria catalizan la producción de valenceno, que luego se puede oxidar a nootkatona. El valenceno puede sufrir una hidroxilación regioselectiva para formar 2-hidroxivalenceno, que se oxida adicionalmente para formar nootkatona. La oxidación del valenceno se puede llevar a cabo por medios químicos o biosintéticos (véanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. n.° 5.847.226, la patente europea n.° 1083233; Girhard et al., (2009) Microb. Cell. Fact. 8:36; Fraatz et al., (2009) Appl. Microbiol. Biotechnol. 83(1):35-41; Furusawa et al. (2005) Chem. Pharm. Bull. 53:1513-1514; Salvador et al., (2002) Green Chemistry, 4, 352-356). La oxidación bioquímica puede ser efectuada por una lacasa, una hidroxilasa u otra enzima oxidativa. En algunos ejemplos, el valenceno se transforma en nootkatona utilizando trióxido de cromo o un catalizador de cromo (III) inmovilizado en fosfonato de sílice (como se describe, por ejemplo, en la patente publicada de EE. UU. n.° 2012-0246767). La formación de nootkatona se puede confirmar y/o cuantificar mediante cualquiera de las técnicas cromatográficas descritas en la presente memoria.

F. EJEMPLOS

Los siguientes ejemplos se incluyen únicamente a título ilustrativo y no tienen por objeto limitar el alcance de la invención.

Ejemplo 1

Extracción e identificación de valenceno a partir de Eryngium glaciale

Para confirmar que Eryngium glaciale produce valenceno, se analizaron extractos de hojas de Eryngium glaciale para detectar la presencia de valenceno. Se compraron hojas y ramas de Eryngium glaciale en el vivero alpino Wrightman (Ontario, Canadá). Se diseccionaron varias hojas y se sumergieron en acetato de etilo durante varios días. El aceite vegetal en acetato de etilo posteriormente se analizó por cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS). El análisis por GC-MS se realizó con el PerkinElmer AutoSystem XL equipado con un espectrómetro de masas TurboMass™. El cromatógrafo de gases del extracto de aceite de la planta se muestra en la Figura 2A. El valenceno se detectó alrededor de los 10,18 minutos (pico 1) y fue el pico principal. El espectro de masas del pico que aparece a los 10,18 minutos (valenceno) se muestra en la Figura 2B.

Ejemplo 2

Identificación del ácido nucleico que codifica la valenceno sintasa de Eryngium glaciale

La valenceno sintasa de Eryngium glaciale se identificó mediante secuenciación del transcriptoma total de Eryngium glaciale utilizando pirosecuenciación 454 de alto rendimiento (Roche Diagnostics, Branford, Connecticut, EE. UU.) y la búsqueda de homología con terpeno sintasas conocidas.

Purificación del ARN

El ARN se aisló de un gramo de material vegetal, se congeló instantáneamente en nitrógeno líquido y posteriormente se molió con un mortero hasta obtener un polvo. La muestra en polvo se descongeló en 10 ml del reactivo TRIzol® (Invitrogen Corp., Carlsbad, California, e E. UU.) para extraer el ARN del tejido, siguiendo las instrucciones del fabricante con pequeñas modificaciones. La mezcla de muestra pulverizada y TRIzol® se centrifugó a 13.000 rpm durante 10 minutos a 4 °C para eliminar los residuos celulares. El sobrenadante se transfirió a tubos nuevos, se añadió cloroformo: alcohol isoamílico (24:1) y la muestra se agitó en un vórtex. Tras otra centrifugación, se añadieron dos volúmenes de isopropanol y la mezcla se incubó durante 10 minutos a temperatura ambiente. El ARN se precipitó por centrifugación a 13.000 rpm durante 10 minutos a 4 °C. El ARN precipitado se lavó una vez con etanol al 75 % y se resuspendió en 20 pl de agua sin ribonucleasa. El ARN se trató además con desoxirribonucleasa I (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts, EE. UU.) para eliminar el ADN, y posteriormente se purificó y concentró utilizando el kit Qiagen MinElute de limpieza de ARN (Qiagen, Hilden, Alemania).

Secuenciación del transcriptoma total

El transcriptoma total de Eryngium glaciale se secuenció mediante pirosecuenciación 454. El ARN total extraído se envió al Centro de Tecnología Genética Avanzada (AGTC) de la Universidad de Kentucky (Reino Unido) para análisis de secuenciación del transcriptoma. El ensamblaje de un total de 5512221 lecturas generó 15717 cóntigos, con un tamaño promedio de cóntigo de 847 pares de bases. Se hizo una búsqueda en la base de datos resultante mediante BLAST frente a las secuencias de varias terpeno sintasas conocidas. Estas sintasas incluían: valenceno sintasa de Perilla frutescens var. frutescens (SEC. N.° ID.:39; número de acceso a GenBank AY917195.1); valenceno sintasa de Citrus sinensis (SEC. N.° ID.:40; número de acceso a GenBank AF441124.1); vetispiradieno (o premnaspirodieno) sintasa de Hyoscyamus muticus (SEC. N.° ID.:41; número de acceso a GenBank U20188.1); germacreno D sintasa de Citrus hystrix (ácido nucleico establecido en la SEC. N.° ID.:42; número de acceso a GenBank HQ652871.1; proteína establecida en la SEC. N.° ID.:45); y valenceno sintasa de Chamaecyparis nootkatensis (SEC. N.° ID.:44). La homología entre ellas iba del 35 al 50 % de identidad a nivel de nucleótidos. Se buscó en la base de datos generada por BLAST utilizando las cinco secuencias. A partir de la base de datos generada para las búsquedas con BLAST se identificaron cinco secuencias parciales diferentes que codificaban terpeno sintasas candidatas. Tras la amplificación (descrita en el Ejemplo 3 para el gen que codifica la sintasa activa), se produjeron moléculas de ADN que codificaban cada uno de los cinco posibles genes. Un gen, descrito en el Ejemplo 3, codificaba una sintasa activa que catalizaba la producción de valenceno.

Ejemplo 3

Aislamiento de un gen que codifica valenceno sintasa a partir de Eryngium glaciale

Basándose en la secuencia del cóntigo seleccionado (SEC. N.° ID.:4), se diseñaron cebadores para la amplificación de los fragmentos de RACE 3' y 5' de tal modo que hubiera aproximadamente un solapamiento de 150 pb entre los fragmentos de RACE 5' y 3' La síntesis de ADN complementario (ADNc) y la PCR se llevaron a cabo según se describe en los protocolos del kit SMARTer™ RACE de amplificación de ADNc (Clontech, Mountain View, California, EE.UU.) con algunas modificaciones en las condiciones de la PCR. Los fragmentos de PCR por RACE 5' y 3' se clonaron en el vector TOPO-TA (Invitrogen, San Diego, EE. UU.) y se secuenció cada producto de amplificación.

Se aplicaron las siguientes condiciones de PCR para amplificar los fragmentos de RACE 3' y 5': Desnaturalización inicial a 94 °C durante 2 minutos, 10 ciclos de 94 °C durante 30 segundos, hibridación a 61 °C durante 45 segundos, extensión a 72 °C durante 1 minuto y 20 segundos, seguidos de 25 ciclos a 94 °C durante 30 segundos, hibridación a 55 °C durante 40 segundos, extensión a 72 °C durante 1 minuto y 20 segundos. Los cebadores utilizados para amplificar el gen que codifica la valenceno sintasa activa se muestran en la Tabla 3 más abajo e incluyen el cebador directo 63-1-2-Fwd2 (SEC. N.° ID.:5) y el cebador inverso 63-1-2-Rev2 (SEC. N.° ID.:6). El cebador directo anidado 63-1-2-NestFwd2 (SEC. N.° ID.:7) y el cebador inverso anidado 63-1-2-NestRev2 (SEC. N.° ID.:8) se utilizaron para aumentar la especificidad de los productos de amplificación en la PCR.

La secuencia nucleotídica completa del gen, designado como EGVS y que posteriormente se confirmó que codifica una valenceno sintasa (véase el Ejemplo 3 a continuación), está establecida en la SEC. N.° ID.:2 y la secuencia aminoacídica codificada está establecida en la SEC. N.° ID.:1.

Ejemplo 4

Clonación de EGVS en el vector de expresión pAlx31-108.2

El gen EGVS aislado de secuencia completa se clonó en el vector de expresión pAlx31-108.2 (SEC. N.° ID.:32). El gen EGVS se amplificó utilizando dos conjuntos de cebadores (véase la Tabla 4 más abajo) para eliminar el sitio de restricción Kpnl en la posición 964 de la secuencia codificante, incluido el cebador directo 63-52-EG2FwdPart1 (SEC. N.° ID.:9) y el cebador inverso 63-52-EG2RevPart1 (SEC. N.° ID.: 10); y el cebador directo 63-52-EG2FwdPart2 (SEC. N.° ID.:11) y el cebador inverso 63-52- EG2RevPart2 (SEC. N.° ID.:12).

Se eliminó el sitio de restricción Kpnl que comienza en la posición 964 de la secuencia codificante, ya que los sitios Kpnl y Xbal se utilizan frecuentemente para clonar genes en el vector de expresión pAlx31-108.2. El sitio KpnI se alteró sin afectar a la secuencia aminoacídica de la EGVS, reemplazando la C en la posición 969 del gen EGVS nativo con una A, de este modo cambiando el codón ACC (que codifica para la treonina) por ACA (que codifica para la treonina) (secuencia nucleotídica establecida en la SEC. N.° ID.:3). El vector de expresión final de la EGVS, designado pAlx63-71 (SEC. N.° ID.:33) se construyó utilizando la mezcla maestra Gibson Assembly™ (New England Biolabs) con productos de PCR amplificados utilizando los cebadores 63-52-EG2FwdPart1, 63-52-EG2RevPart1, 63-52-EG2FwdPart2 y 63-52-EG2RevPart2 (véase la Tabla 4 más arriba).

Ejemplo 5

Expresión de la EGVS en levaduras y cribado de alto rendimiento de células que expresan valenceno sintasa

El vector de expresión pAlx63-71 que codifica la EGVS se transformó en las cepas modificadas ALX7-95 (ura3, his3, trp l, Aerg9::HIS3, HMG2cat/TRP1::rDNA, dppl, sue) y ALX11-30 (ura3, trpl, erg9def25, HMG2cat/TRP1::rDNA, dppl, sue) de Saccharomyces cerevisiae para la expresión de valenceno sintasa y la producción de valenceno utilizando un ensayo de cribado de alto rendimiento.

A. Generación de cepas ALX7-95 y ALX7-95 modificadas de Saccharomyces cerevisiae

Como se señala más arriba, las cepas ALX7-95 y ALX11-30 se derivaron de la cepa CALI5-1 de Saccharomyces cerevisiae, que es una cepa bien conocida y difundida. (véase, por ejemplo, la solicitud de patente publicada de EE. UU. n.° 2012-0246767). La cepa CALI5-1 es un derivado de la cepa designada SW23B#74 (descrita, por ejemplo, en las patentes de EE. u U. n.° 6.531.303 y 6.689.593; véase, también, Takahashi et al. (2007) Biotechnol Bioeng.

97(1):170-181), que se deriva de la cepa MATa nativa, depositada con el número 28383 de acceso a la ATCC. CALI5-1 se generó para que tuviera una actividad disminuida de la fosfatasa DPP1 (véase, por ejemplo, la patente publicada de EE. UU. n^ 2004-0249219). La cepa CALI5-1 de Saccharomyces cerevisiae contiene, entre otras mutaciones, una mutación erg9 (el alelo Aerg9::HIS3), así como una mutación que aumenta la captación aeróbica de esteroles (sue). También contiene aproximadamente 8 copias del gen HMG2 truncado. La forma truncada de HMG2 se activa por el promotor GPD y, por lo tanto, ya no está sometida a una regulación estricta, lo que permite un aumento del flujo de carbono al FPP. También contiene una deleción en el gen que codifica la enzima diacilglicerol pirofosfato (DGPP) fosfatasa (dpp1), que limita la desfosforilación del FPP.

ALX7-95 se generó a partir de CALI5-1 corrigiendo la deficiencia de Aleu2 en CALI5-1 con un gen de LEU2 funcional de manera que no se requiera la suplementación con leucina (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n^ 2010/0151519). ALX11-30 se construyó a partir de CALI5-1 en varios pasos a partir de una cepa designada ALX7-175.1 que, como se describe en la patente publicada de EE. UU. n^ 2010-0151519.

De manera resumida, ALX7-175.1 se produjo según se indica a continuación. La HPS de ALX7-95 se obtuvo transformando un plásmido que contenía la premnaspirodieno sintasa de Hyoscyamus muticus (HPS) en la cepa ALX7-95. El plásmido YEp-HpS se obtuvo clonando el gen de la HPS en Yep-GW-URA, obteniéndose YEp-HPS-ura (YEp-HPS). A continuación, se llevó a cabo una reacción de PCR propensa a errores del gen ERG9, y el ADN resultante se transformó en ALX7-95 que contenía YEpHPS. Las transformantes se sembraron en una placa en medio YP que carecía de ergosterol y se cribaron según la producción de premnaspirodieno. Las que produjeron concentraciones elevadas de premnaspirodieno se guardaron. Una cepa, ALX7-168.25 [ura3, trpl, his3, erg9def25, HMG2cat/TRP1::rDNA, dpp1, sue, YEpHPS] se transformó con un fragmento de PCR del gen HIS3 completo para crear un gen HIS3 funcional. Se aislaron las transformantes con capacidad de crecer en ausencia de histidina en el medio. De esta transformación, se aisló ALX7-175.1 [ura3, trpl, erg9def25, HMG2cat/TRP1::rDNA, dpp1, sue YEpHPS], Por último, se retiró el plásmido YEpHPS haciendo crecer ALX7-175.1 varias generaciones en YPD (extracto de levadura 10 g/l, peptona 20 g/l, glucosa 20 g/l) y sembrando células en placas de YPD. Se identificaron colonias sin la capacidad de crecer en medio SD sin uracilo (0,67 % de base nitrogenada de levadura Bacto sin aminoácidos, 2 % de glucosa, 0,14 % de medio defectivo sintético de levadura sin uracilo). Esta cepa se designó como ALX11-30.

B. Cribado de alto rendimiento para la producción de valenceno

Se analizaron ocho colonias de cada transformación del vector pALx63-71 en ALX7-95 y ALX11-30 para la producción de sesquiterpenos en placas de microtitulación con pocillos profundos. Las transformantes se cribaron según la producción de valenceno mediante análisis de microcultivo en placas de 96 pocillos profundos. Las transformantes individuales se inocularon en pocillos individuales de placas de microvaloración de 96 pocillos llenos con 200 pl de medio definido sintético (SD: 0,67 % de base nitrogenada de levadura Bacto sin aminoácidos, 2 % de glucosa, 0,14 % de medio defectivo sintético de levadura sin histidina, leucina, triptófano ni uracilo) para las cepas ALX11-30 y medios definidos sintéticos con ergosterol (SDE: 0,67 % de base nitrogenada de levadura Bacto sin aminoácidos, 2 % de glucosa, 0,14 % de medio defectivo sintético de levadura sin histidina, leucina, triptófano ni uracilo, y ergosterol 40 mg/l) para las cepas ALX7-95 deficientes en erg9. Las placas se incubaron durante dos o tres días a 28 °C. Tras el crecimiento hasta la saturación, se utilizaron 10 pl del cultivo saturado de cada pocillo para inocular una placa de 96 pocillos profundos que contenían 300 pl de medio adecuado para el crecimiento y la producción de valenceno. La placa se selló con cinta Airpore (Qiagen) y se incubó con agitación durante 3 días.

Los productos de biosíntesis se extrajeron primero mediante la adición de 250 pl de acetona que contenía cedreno en cada pocillo, sellando con un sellador de goma para placas, agitando en vórtex, seguido de la adición de 500 pl de nhexano que contenía hexadecano y agitación adicional en vórtex. Tras la separación de fases, la placa se selló con una película de aluminio y se colocó en la bandeja de muestras de un automuestreador de un cromatógrafo de gases, que retiró un microlitro de la fase orgánica de cada pocillo para el análisis de sesquiterpenos. A la acetona y al hexano utilizados para la extracción se añadieron patrones internos de cedreno y hexadecano, respectivamente, para facilitar la cuantificación de las muestras. Las muestras extraídas se analizaron por cromatografía de gases y la cantidad de valenceno se calculó a partir del área bajo el pico correspondiente al valenceno.

C. Resultados

En la Tabla 5 se presentan los perfiles de distribución de productos y la cantidad de valenceno producida por la valenceno sintasa de Eryngium glaciale, determinada por cromatografía de gases, para los tres mayores productores de valenceno de ALX7-95 y los cuatro mayores productores de valenceno de ALX11-30, así como las designaciones de los nombres de las cepas. Tal y como se indica en la Tabla 5, se observaron varios compuestos adicionales además del valenceno, incluidos el nerolidol, el farnesol y el compuesto, aristoloqueno, del pico 2, que es aristoloqueno. El resultado demuestra que esta valenceno sintasa cataliza la producción de un perfil de productos diferente al de la valenceno sintasa de cítricos. El cedreno y el hexadecano representan patrones internos utilizados para cuantificar la cantidad de valenceno producida. Las siete cepas también se analizaron en el ensayo del matraz agitado que se detalla en el Ejemplo 4.

Tabla 5. Distribución de los productos en el ensayo de microcultivo

Ejemplo 6

Ensayo en matraz agitado de células que expresan valenceno

Se iniciaron cultivos de siembra en matraces de 250 ml inoculando 15 ml de medio SD o SDE (para las cepas ALX11-30 y ALX7-95, respectivamente) con colonias recién crecidas de las 7 cepas que se muestran en la Tabla 5 más arriba. Los cultivos crecieron durante 24 horas, y se utilizaron 2,5 ml de cada cultivo para inocular 50 ml de medio de fermentación (sulfato de amonio al 2 %, fosfato de potasio al 2 %, NaCl al 0,1 %, MgSOWH2O al 0,6 %, extracto de levadura al 0.4 %, 1 ml de solución mineral [FeSOWH2O al 0,028 %, ZnSOWH2O al 0,029 %, CuSO^5H2O al 0,008 %, Na2MoO4^2H2O al 0,024 %, C O C h ^ O al 0,024 %, M n S O ^ O al 0,017 %, 1 ml de HCl], 0,5 ml de glucosa al 50 %, 1,5 ml de solución de vitaminas [biotina al 0,001 %, pantotenato de calcio al 0,012 %, inositol al 0,06 %, piridoxinaHCl al 0,012 %, tiaminaHCl al 0,012 %] y 0,5 ml de CaCl2 al 10 %) en un matraz cónico de 250 ml. Los cultivos se realizaron a 28 °C. Tras 16 horas de incubación, los cultivos se alimentaron con 3,6 ml de glucosa al 50 % y 0,667 ml de extracto de levadura al 12,5 %. Los cultivos se alimentaron cada 24 tras la alimentación inicial. El pH de los cultivos se ajustó a 4,5 cada 24 horas con la adición de NaOH al 30 %. Después de aproximadamente 88 horas de incubación, se añadieron 0,1 ml de IGEPAL CA-630 y el cultivo se incubó con agitación para dispersar completamente el aceite vegetal. Después de 30 minutos, se tomó una muestra de cultivo de 2 mL para su análisis. La muestra se extrajo con 2 mL de solución de acetona/cedreno y a continuación se extrajo con 4 ml de solución de hexano/hexadecano. Se analizó una alícuota de la fase orgánica por cromatografía de gases y se cuantificó la cantidad de valenceno producida calculando el área bajo el pico correspondiente al valenceno. Los perfiles de distribución del producto y la producción de valenceno para cada una de las 2 cepas que contenían EGVS se compararon con una valenceno sintasa de cítricos (CVS) como control y con la valenceno sintasa V277 (descrita en la publicación en trámite de EE.UU. con n.° de serie 2012-0246767) que tiene una secuencia de nucleótidos establecida en la SEC. N.° ID.:30 y una secuencia de aminoácidos establecida en la SEC. N.°ID.:31. V277 tiene una identidad de secuencia de aproximadamente un 83 % con la CVS nativa. Las células que expresan V277 producen más valenceno que las células que expresan CVS nativa (secuencia aminoacídica establecida en la SEC. N.° ID.:14).

En la Tabla 6a más abajo se proporcionan los perfiles de distribución del producto, incluida la cantidad de valenceno producida en el ensayo del matraz agitado, según se determina por cromatografía de gases, de la CVS 277 en comparación con dos cepas que producen EGVS en la cepa ALX11-30 (según se describe en el Ejemplo 3). Como se muestra en la Tabla 6, las cepas de valenceno sintasa de Eryngium glaciale produjeron más valenceno por ml en comparación con la CVS V277 mutada, que a su vez produce más valenceno que la CVS nativa.

El cedreno y el hexadecano representan los patrones internos utilizados para cuantificar la cantidad de valenceno producida. En la Figura 3A se muestra un ejemplo de cromatograma de gases de un ejemplo de cepa ALX7-95, Alx-64.70.3, donde el valenceno tiene un tiempo de retención de 12,46 min, y en la Figura 3B se muestra el espectro de masas del valenceno (pico a 12,46 min). En la Figura 7 se representan los resultados gráficamente.

En la Figura 7 se representan los datos de la Tabla 6b y se muestra una comparación entre la producción de valenceno en células que expresan la valenceno sintasa de cítricos con células que expresan la sintasa de Eryngium glaciale. Las células que expresan sintasa de EG producen más del doble de valenceno en comparación con las que expresan la sintasa CVS.

Ejemplo 7

Aislamiento del valenceno

Los caldos de dos fermentaciones de ALX63-70.7 (2 l cada una) se filtraron al vacío a través de un embudo de filtración. La torta de filtración (aceite de soja, células y residuos celulares) se transfirió a un matraz de 4 litros y se añadió acetona (2 l cada uno) a la torta de filtración y al filtrado (aceite de soja y células), respectivamente, y las soluciones se agitaron durante 1 h. Las mezclas heterogéneas resultantes se filtraron y el disolvente se eliminó a presión reducida. A continuación, el extracto orgánico en crudo se sometió a cromatografía en gel de sílice utilizando hexanos como el único disolvente. Tras eliminar el disolvente a presión reducida, el material aceitoso de color amarillo claro se disolvió en acetona y los fosfolípidos se precipitaron a -20 °C. Los fosfolípidos se filtraron y la acetona en el filtrado se eliminó a presión reducida, obteniéndose un aceite límpido (25 g). El aceite límpido se purificó adicionalmente por destilación de película descendente (0,1 torr, 125 °C), obteniéndose una fracción enriquecida en valenceno (3,13 g). El valenceno se purificó a continuación a partir de la fracción enriquecida mediante HPLC en fase inversa (C18) utilizando acetonitrilo isocrático como disolvente y un detector de índice de refracción.

La resonancia magnética nuclear (RMN) de protón (1H) y carbono-13 (13C) de la muestra purificada mostró que ésta tenía desplazamientos químicos idénticos a los de un patrón auténtico de valenceno (véanse los datos de RMN más abajo). Además, los experimentos de 1D-NOESY, en los que se irradió el grupo metilo cuaternario (C11), mostraron correlaciones con el metino del C9 y el grupo metilo del C12, lo que indica que los grupos metilo del C11 y el C12 y el metino del C9 están todos en la misma cara de la molécula. A continuación, se muestra la estructura del valenceno con la numeración asignada de los carbonos:

Finalmente, la cromatografía de gases (GC-FID), la cromatografía de gases quiral y la cromatografía de gasesespectrometría de masas de la muestra purificada mostraron que el supuesto pico de valenceno tenía tiempos de retención y espectros de masas idénticos a los de un patrón auténtico de valenceno. En su conjunto, estos datos demuestran que la estructura del pico aislado es la del (+)-valenceno.

1H-NMR (BENCENO-d6) 8: 5,36 (dt, J = 4,8, 2,6 Hz, 1H), 4,83 (s, 1H), 4,80 (s, 1H), 2,23 - 2,31 (m, 1H), 2,21 (s, 1H), 2,06 (ddd, J = 13,9, 4,1,2,6 Hz, 2H), 1,90 - 1,96 (m, 2H), 1,69 (d, J = 0,9 Hz, 1H), 1.66 (s, 3H), 1.31 - 1,46 (m, 2H), 1,26 (d, J = 4,4 Hz, 2H), 1,05 (t, J = 12,7 Hz, 1H), 0,91 (s, 3H), 0,83 (d, J = 6,6 Hz, 3H); 13C-NMR (BENCENO-d6) 8: 150,8, 143,3, 120,9, 109,3, 45,7, 41,6, 41,7, 38,5, 33,8, 33,5, 27,9, 26,7, 21,3, 18,9, 16,2. GC-MS (EI+, 70 eV); ( %): 55(44), 67(38), 79(82), 91(80), 93(77), 105(75), 107(73), 119(66), 133(56), 147(33), 161(100), 175(17), 189(34), 204(29).

Ejemplo 8

Comparación de los parámetros cinéticos de la valenceno sintasa de E. glaciale (EgVS) y la valenceno sintasa V277

En este ejemplo, se evaluó la actividad de la valenceno sintasa de E. glaciale (EgVS; SEC. N.° ID.:1) y de la valenceno sintasa de cítricos, designada V277, (SEC. N.° ID.:31) mediante análisis cinético en estado estacionario. Para comparar las actividades de estas enzimas in vitro, las valenceno sintasas se marcaron con histidina en el extremo carboxiterminal, se expresaron en E. coli, se purificaron mediante cromatografía por formación de quelatos de níquel y se evaluó su actividad mediante análisis cinético en estado estacionario. Las condiciones de reacción fueron las siguientes: EgVS 50 nM o valenceno sintasa V277250 nM, bis-tris propano 50 mM (pH 7,5), MgCh 20 mM, KCl 50 mM. T = 30 °C. Detección: GC/MS-SIM.

Como se muestra en la Figura 6 y en la Tabla 7, la EgVS presenta una actividad total y específica mucho mayor cuando se compara de manera directa con la valenceno sintasa de cítricos, denominada V277. Además de una mayor actividad, la EgVS también se renueva significativamente más veces que la valenceno sintasa V277.

Tabla 7. Parámetros cinéticos de la CVS la E VS en estado estacionario

La sintasa EgVS proporcionada en la presente memoria, por lo tanto, no solo produce un perfil de terpenos diferente en comparación con otras sintasas, como la CVS, sino que también muestra una mayor actividad, incluso en comparación con una sintasa CVS que ha sido modificada y optimizada para mostrar una mayor actividad.

Dado que las modificaciones serán evidentes para los expertos en la técnica, se pretende que esta invención esté limitada únicamente por el alcance de las reivindicaciones anexas.

Claims (11)

REIVINDICACIONES

1. Una célula recombinante que produce valenceno y aristoloqueno, donde

a) la célula recombinante comprende un ácido nucleico heterólogo que codifica un polipéptido de valenceno sintasa que tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia con la secuencia establecida en la SEC. N.° ID.:1, o un fragmento con actividad catalítica del mismo; o

b) la célula recombinante comprende un polipéptido de valenceno sintasa heterólogo que tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia con la secuencia establecida en la SEC. N.° ID.:1, o un fragmento con actividad catalítica del mismo.

2. La célula recombinante de la reivindicación 1, parte a), donde el ácido nucleico heterólogo codifica un polipéptido de valenceno sintasa que tiene una secuencia aminoacídica identificada por la SEC. N.° ID.:1, o un fragmento con actividad catalítica del mismo.

3. La célula recombinante de la reivindicación 1, donde el ácido nucleico heterólogo comprende una secuencia que tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia con la secuencia establecida en la SEC. N.° ID.:2.

4. La célula recombinante de la reivindicación 1, parte b), donde el polipéptido de valenceno sintasa comprende una secuencia aminoacídica identificada por la SEC. N.° ID.:1, o un fragmento con actividad catalítica del mismo.

5. La célula recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde la célula recombinante es una célula de levadura o una célula bacteriana.

6. La célula recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde la célula recombinante es una célula de levadura.

7. La célula recombinante de la reivindicación 6, donde la célula de levadura es una Saccharomyces cerevisiae.

8. Un método para producir valenceno y aristoloqueno en una célula recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, que comprende cultivar la célula recombinante en condiciones adecuadas para la expresión del polipéptido de valenceno sintasa donde la célula produce valenceno y aristoloqueno de este modo.

9. El método de la reivindicación 8, que además comprende aislar el valenceno:

10. El método de la reivindicación 8, que además comprende: (a) aislar el valenceno producido por la célula; (b) oxidar el valenceno para producir nootkatona; y (c) aislar la nootkatona.

11. El método de la reivindicación 8, que además comprende: (a) oxidar el valenceno para producir nootkatona; y (b) aislar la nootkatona.