WO2022260455A1 - 제라닐제라닐 피로포스페이트 신타아제 변이체 및 이를 이용한 테트라테르펜, 이의 전구체, 및 테트라테르펜을 전구체로 하는 물질의 생산방법 - Google Patents

제라닐제라닐 피로포스페이트 신타아제 변이체 및 이를 이용한 테트라테르펜, 이의 전구체, 및 테트라테르펜을 전구체로 하는 물질의 생산방법 Download PDF

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WO2022260455A1
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WO
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amino acid
seq
tetraterpene
precursor
microorganism
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이베드로
박혜민
하철웅
이동필
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씨제이제일제당 (주)
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    • C12Y205/01029—Geranylgeranyl diphosphate synthase (2.5.1.29)

Definitions

  • the present application relates to geranylgeranyl pyrophosphate synthase (Geranylgeranyl pyrophosphate synthase) variants; a polynucleotide encoding the variant; a vector containing the polynucleotide; a microorganism comprising any one or more of the above mutants, polynucleotides, and vectors; a method for producing a tetraterpene using the same, a precursor thereof, and a material using the tetraterpene as a precursor; tetraterpenes, precursors thereof, and compositions for producing substances containing tetraterpenes as precursors; and a tetraterpene of a microorganism including at least one of the variant, polynucleotide, and vector, a precursor thereof, and a use for producing a material using the tetraterpene as a precursor.
  • Terpenoid is a concept including carotenoid, and as it exerts various functions in plants and animals, it is used in various industrial fields such as food and feed.
  • Terpenoids are known as representative substances that produce medicinal effects of plants, and are terpenes like carotenoids.
  • carotenoids such as beta-carotene are reported to have functions such as removing free radicals, being the mother of vitamin A in animals, enhancing the immune system of vertebrates, and reducing the risk of lung cancer.
  • carotenoids such as beta-carotene
  • beta-carotene are not synthesized or synthesized in insufficient amounts in the body of animals.
  • mutated microorganisms US Patent Registration No. 7745170
  • geranylgeranyl pyrophosphate (GGPP, C20), a key precursor for the production of carotenoids or terpenoids, activates geranylgeranyl pyrophosphate synthase (isoprenoid) in the biosynthetic pathway. It is produced by combining farnesyl pyrophosphate (FPP, C15) and isopentenyl pyrophosphate (IPP, C5) by the enzyme geranylgeranyl pyrophosphate synthase.
  • squalene (C30) may be produced as a by-product from farnesyl pyrophosphate (FPP, C15) by squalene synthase (ERG9). Accordingly, there is a need to develop a method for increasing the production of GGPP, a key precursor for carotenoid or terpenoid biosynthesis, and reducing the production of squalene, which is a competitive pathway.
  • An object to be solved by the present application is to provide a geranylgeranyl pyrophosphate synthase variant, a tetraterpene using the same, a precursor thereof, and a method for producing a material using the tetraterpene as a precursor.
  • One object of the present application is to convert any one or more of the amino acids corresponding to positions 29, 43, 90, 103, 122, and 141 from the N-terminus of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 to another amino acid. It is to provide a substituted, geranylgeranyl pyrophosphate synthase (Geranylgeranyl pyrophosphate synthase) mutant.
  • Another object of the present application is to provide a polynucleotide encoding the variant.
  • Another object of the present application is to provide a vector containing the polynucleotide.
  • Another object of the present application is to provide a microorganism comprising any one or more of the above mutants, polynucleotides, and vectors.
  • Another object of the present application is to provide a tetraterpene (tetraterpene), a precursor thereof, and a method for producing a material using the tetraterpene as a precursor, including the step of culturing the microorganism in a medium.
  • tetraterpene tetraterpene
  • a method for producing a material using the tetraterpene as a precursor including the step of culturing the microorganism in a medium.
  • Another object of the present application is to provide a tetraterpene, a precursor thereof, and a composition for producing a material containing the tetraterpene as a precursor, including the mutant, the vector, the microorganism, or the culture of the microorganism.
  • Another object of the present application is to provide a tetraterpene of any one or more of the above mutants, polynucleotides, vectors, and microorganisms, a precursor thereof, and a use for producing a material using the tetraterpene as a precursor.
  • Microorganisms expressing the geranylgeranyl pyrophosphate synthase variant of the present application can effectively produce tetraterpenes, precursors of tetraterpenes, or materials containing tetraterpenes as precursors, compared to strains that do not express them.
  • any one or more of the amino acids corresponding to positions 29, 43, 90, 103, 122, and 141 from the N-terminus of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is substituted with another amino acid
  • a variant of geranylgeranyl pyrophosphate synthase is substituted with another amino acid.
  • the geranylgeranyl pyrophosphate synthase variant is a polypeptide having geranylgeranyl pyrophosphate synthase activity or geranylgeranyl pyrophosphate synthase at positions 29, 43, and 90 from the N-terminus of SEQ ID NO: 1.
  • 103, 122, and 141 means any one or more of the amino acids corresponding to the amino acid is substituted with another amino acid variant.
  • Geranylgeranyl pyrophosphate synthase (GGS1) can catalyze the synthesis of geranylgeranyl pyrophosphate synthase (GGPP) from farnesylpyrophosphate (FPP). is an enzyme in
  • the geranylgeranyl pyrophosphate synthase of the present application is a geranylgeranyl pyrophosphate synthase or geranylgeranyl pyrophosphate synthase modified to prepare a geranylgeranyl pyrophosphate synthase variant provided in the present application. It may be a polypeptide having an ase activity. Specifically, it may be a naturally occurring polypeptide or wild-type polypeptide, may be a mature polypeptide thereof, may include a variant or functional fragment thereof, but the parent of the geranylgeranyl pyrophosphate synthase variant of the present application Included without limitation where possible.
  • the geranylgeranyl pyrophosphate synthase is not limited thereto, but may be a polypeptide of SEQ ID NO: 1. Also, about 80% with the polypeptide of SEQ ID NO: 1. It may be a polypeptide having a sequence identity of 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% or more, and may have the same or equivalent activity as the polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. included in the scope of geranylgeranyl pyrophosphate synthase.
  • the sequence of the geranylgeranyl pyrophosphate synthase of the present application can be obtained from a known database such as NCBI's GenBank. Specifically, it may be a polypeptide encoded by the ggs1 gene, but is not limited thereto.
  • a “variant” is a polypeptide that differs from the amino acid sequence prior to the mutation by conservative substitution and/or modification of one or more amino acids, but retains functions or properties. refers to Such variants can generally be identified by modifying one or more amino acids in the amino acid sequence of the polypeptide and evaluating the properties of the modified polypeptide. That is, the ability of the variant may be increased, unchanged, or reduced compared to the polypeptide before the mutation.
  • some variants may include modifications in which one or more portions are removed, such as an N-terminal leader sequence or a transmembrane domain.
  • Other variants may include modifications in which portions are removed from the N- and/or C-terminus of the mature protein.
  • variant may be used interchangeably with terms such as variant, variant, variant polypeptide, mutated protein, mutation and variant (in English, modification, modified polypeptide, modified protein, mutant, mutein, divergent, etc.) And, if the term is used in a mutated sense, it is not limited thereto.
  • Variants may also include deletions or additions of amino acids that have minimal impact on the secondary structure and properties of the polypeptide.
  • a signal (or leader) sequence involved in protein translocation may be conjugated to the N-terminus of the variant, either co-translationally or post-translationally.
  • the variant may be conjugated with other sequences or linkers to enable identification, purification, or synthesis.
  • the variant of the present application is a substitution of any one or more amino acids among amino acids corresponding to positions 29, 43, 90, 103, 122, and 141 from the N-terminus of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 with another amino acid. , geranylgeranyl pyrophosphate synthase variants. Specifically, among the positions 29, 43, 90, 103, 122, and 141, one or more, two or more, three or more, four or more, five or more, or six or more amino acids may be substituted. However, it is not limited thereto.
  • the amino acid corresponding to position 29 from the N-terminus of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is asparagine. ;
  • the amino acid corresponding to position 43 is phenylalanine;
  • the amino acid corresponding to position 90 is leucine;
  • the amino acid corresponding to position 103 is methionine;
  • the amino acid corresponding to position 122 is isoleucine;
  • the amino acid corresponding to position 141 may be arginine, but is not limited thereto.
  • the amino acid corresponding to position 29 from the N-terminus of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is substituted with an amino acid other than asparagine; the amino acid corresponding to amino acid 43 is substituted with an amino acid other than phenylalanine; an amino acid corresponding to amino acid 90 is substituted with an amino acid other than leucine; an amino acid corresponding to amino acid number 103 is substituted with an amino acid other than methionine; an amino acid corresponding to amino acid 122 is substituted with an amino acid other than isoleucine; and substitution of an amino acid other than arginine for the amino acid corresponding to amino acid 141, but is not limited thereto.
  • the "other amino acid” is not limited as long as it is an amino acid different from the amino acid before substitution and the amino acid before substitution.
  • it is expressed as 'a specific amino acid is substituted' in the present application, it is obvious that it is substituted with an amino acid different from the amino acid before substitution, even if it is not separately indicated that the amino acid is substituted with another amino acid.
  • the substitution with another amino acid may be a substitution with a nonpolar amino acid, a polar amino acid, or a positively charged (basic) amino acid.
  • the nonpolar amino acid may be selected from the group consisting of glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, methionine, and proline, but is not limited thereto.
  • the polar amino acid may be mixed with a hydrophilic amino acid and may be selected from the group consisting of serine, threonine, cysteine, tyrosine, asparagine and glutamine, and the positively charged (basic) amino acid is arginine , lysine, and may be selected from the group consisting of histidine, but is not limited thereto.
  • the variant of the present application has any one or more amino acids among amino acids corresponding to positions 29, 43, 90, 103, 122, and 141 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, which is a reference protein.
  • non-polar amino acids polar amino acids, or positively charged (basic) amino acids
  • it may be a variant substituted with an amino acid different from the amino acid before substitution, but is not limited thereto.
  • the non-polar amino acid may be isoleucine (Ile) or valine (Val)
  • the polar amino acid may be threonine (Thr)
  • the positively charged amino acid may be arginine (Arg) or lysine (Lys). Not limited.
  • the other amino acid may be any one selected from the group consisting of threonine, isoleucine, arginine, valine, and lysine, but is not limited thereto.
  • the variant of the present application is any one or more of the amino acids corresponding to positions 29, 43, 90, 103, 122, and 141 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is threonine, isoleucine, It may be substituted with any one selected from the group consisting of arginine, valine, and lysine, but is not limited thereto.
  • the amino acid corresponding to position 29 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is substituted with threonine; the amino acid corresponding to position 43 is substituted with isoleucine; the amino acid corresponding to position 90 is substituted with arginine; the amino acid corresponding to position 103 is substituted with isoleucine; the amino acid corresponding to position 122 is substituted with valine; the amino acid corresponding to position 141 is substituted with lysine; And it may be selected and substituted from the group consisting of combinations thereof, but is not limited thereto.
  • corresponding to refers to an amino acid residue at a recited position in a polypeptide, or an amino acid residue that is similar, identical, or homologous to a recited residue in a polypeptide. Identification of the amino acid at the corresponding position may be determining the specific amino acid in the sequence that references the specific sequence.
  • corresponding region generally refers to a similar or corresponding position in a related or reference protein.
  • any amino acid sequence can be aligned with SEQ ID NO: 1, and based on this, each amino acid residue of the amino acid sequence can be numbered with reference to the numerical position of the amino acid residue corresponding to the amino acid residue of SEQ ID NO: 1.
  • sequence alignment algorithms such as those described herein, can identify the location of amino acids, or locations where modifications such as substitutions, insertions, or deletions occur, compared to a query sequence (also referred to as a “reference sequence”).
  • Such alignments include, for example, the Needleman-Wunsch algorithm (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453), the Needle program in the EMBOSS package (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al. , 2000), Trends Genet. 16: 276-277) may be used, but it is not limited thereto, and a sequence alignment program known in the art, a pairwise sequence comparison algorithm, and the like may be appropriately used.
  • the variant of the present application is about 80% of the polypeptide of SEQ ID NO: 1. Positions 29, 43, 90, 103, 122, and 141 of SEQ ID NO: 1, having at least 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% sequence identity Any one or more of the amino acids corresponding to may be substituted with other amino acids.
  • the variant of the present application is at least 80% identical to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15 or SEQ ID NO: 17, It may comprise amino acid sequences having at least 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.7% or 99.9% homology or identity.
  • the variant of the present application has the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15 or SEQ ID NO: 17, It may comprise, consist of, or consist essentially of the amino acid sequence.
  • the variant of the present application differs in any one or more of the amino acids corresponding to positions 29, 43, 90, 103, 122, and 141 based on the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. substituted with, and at least 80%, 85%, 90% of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, or SEQ ID NO: 17 %, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.7% or 99.9% homology or identity.
  • the variant of the present application is a polypeptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, in which methionine, an amino acid corresponding to position 103 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, is substituted with isoleucine; a polypeptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5, in which phenylalanine, an amino acid corresponding to position 43 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, is substituted with isoleucine; A polypeptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7 in which asparagine, an amino acid corresponding to position 29 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, is substituted with threonine, and leucine, an amino acid corresponding to position 90, is substituted with arginine; a polypeptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9, in which asparagine, which is an amino acid corresponding to position 29 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, is substituted
  • sequence additions or deletions naturally occurring mutations, silent mutations or conservations to the amino acid sequence N-terminus, C-terminus and/or within that do not alter the function of the variants of the present application. This is the case with redundant substitution.
  • the "conservative substitution” refers to the substitution of one amino acid with another amino acid having similar structural and/or chemical properties. Such amino acid substitutions can generally occur based on similarities in polarity, charge, solubility, hydrophobicity, hydrophilicity and/or amphipathic nature of the residues. Typically, conservative substitutions may have little or no effect on the activity of the protein or polypeptide.
  • the term 'homology' or 'identity' refers to the degree of similarity between two given amino acid sequences or base sequences and can be expressed as a percentage.
  • the terms homology and identity are often used interchangeably.
  • Sequence homology or identity of conserved polynucleotides or polypeptides can be determined by standard alignment algorithms, together with default gap penalties established by the program used. Substantially homologous or identical sequences are generally capable of hybridizing with all or part of the sequence under moderate or high stringent conditions. It is obvious that hybridization also includes hybridization with polynucleotides containing common codons or codons in consideration of codon degeneracy in polynucleotides.
  • GAP program can define the total number of symbols in the shorter of the two sequences divided by the number of similarly arranged symbols (i.e., nucleotides or amino acids).
  • the default parameters for the GAP program are (1) a binary comparison matrix (containing values of 1 for identity and 0 for non-identity) and Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation , pp. 353-358 (1979), Gribskov et al (1986) Nucl. Acids Res. 14: weighted comparison matrix of 6745 (or EDNAFULL (EMBOSS version of NCBI NUC4.4) substitution matrix); (2) a penalty of 3.0 for each gap and an additional penalty of 0.10 for each symbol in each gap (or 10 gap opening penalty, 0.5 gap extension penalty); and (3) no penalty for end gaps.
  • the variant of the present application may have geranylgeranyl pyrophosphate synthase activity. In one embodiment, the variant of the present application may have an activity that increases the ability to produce a tetraterpene, a precursor of a tetraterpene, or a material using a tetraterpene as a precursor, compared to wild-type or non-mutated geranylgeranyl pyrophosphate synthase. .
  • the variant of the present application has an activity to reduce the production level of a by-product of a tetraterpene, a precursor of a tetraterpene, or a material production pathway using a tetraterpene as a precursor, compared to wild-type or geranylgeranyl pyrophosphate synthase.
  • the variant of the present application may have an activity that reduces the level of squalene production compared to wild-type or geranylgeranyl pyrophosphate synthase.
  • the variant of the present application may have enhanced activity compared to wild-type or non-mutated geranylgeranyl pyrophosphate synthase, but is not limited thereto.
  • Another aspect of the present application provides a polynucleotide encoding a variant of the present application.
  • polynucleotide is a polymer of nucleotides in which nucleotide monomers are connected in a long chain shape by covalent bonds, and is a DNA or RNA strand of a certain length or more, more specifically, geranylgeranylpyramidal. It refers to a polynucleotide fragment encoding the variant having phosphate activity.
  • the polynucleotide encoding the variant of the present application is a base encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, or SEQ ID NO: 17 sequence may be included.
  • the polynucleotide of the present application may have or include the sequence of SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16 or SEQ ID NO: 18 have.
  • polynucleotide of the present application may consist of or consist essentially of the sequence of SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16 or SEQ ID NO: 18 have.
  • polynucleotides of the present application are various in the coding region within the range that does not change the amino acid sequence of the variants of the present application in consideration of codon degeneracy or preferred codons in organisms intended to express the variants of the present application. Transformations can be made.
  • the polynucleotide of the present application has 80% homology or identity with the sequence of SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16 or SEQ ID NO: 18 has or comprises at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, and less than 100% of the sequence of SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, or SEQ ID NO: 8 , SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16 or SEQ ID NO: 18 homology or identity to the sequence of 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, 96% or more, 97% Or more, 98% or more, and may consist of or essentially consist of a nucleotide sequence of less than 100%, but is not limited thereto.
  • the polynucleotide of the present application is not limited as long as it is a probe that can be prepared from a known gene sequence, for example, a sequence that can hybridize under stringent conditions with a sequence complementary to all or part of the polynucleotide sequence of the present application.
  • the "stringent condition” means a condition that allows specific hybridization between polynucleotides. These conditions are described in J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York, 9.50-9.51, 11.7-11.8).
  • polynucleotides with high homology or identity 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, Or a condition in which polynucleotides having 99% or more homology or identity hybridize and polynucleotides having lower homology or identity do not hybridize, or 60 ° C., which is a washing condition for normal southern hybridization, 1 ⁇ SSC, 0.1% SDS, specifically at 60°C, 0.1 ⁇ SSC, 0.1% SDS, more specifically at a salt concentration and temperature equivalent to 68°C, 0.1 ⁇ SSC, 0.1% SDS, washed once, specifically 2 to 3 times conditions can be enumerated.
  • Hybridization requires that two nucleic acids have complementary sequences, although mismatches between bases are possible depending on the stringency of hybridization.
  • complementary is used to describe the relationship between nucleotide bases that are capable of hybridizing to each other. For example, with respect to DNA, adenine is complementary to thymine and cytosine is complementary to guanine.
  • the polynucleotides of the present application may also include substantially similar nucleic acid sequences as well as isolated nucleic acid fragments complementary to the entire sequence.
  • a polynucleotide having homology or identity to the polynucleotide of the present application can be detected using hybridization conditions including a hybridization step at a Tm value of 55° C. and using the above-described conditions.
  • the Tm value may be 60 °C, 63 °C, or 65 °C, but is not limited thereto and may be appropriately adjusted by those skilled in the art according to the purpose.
  • Appropriate stringency for hybridizing the polynucleotides depends on the length of the polynucleotides and the degree of complementarity, parameters well known in the art (e.g., J. Sambrook et al., supra).
  • the vector may be an expression vector for expressing the polynucleotide in a host cell, but is not limited thereto.
  • the vector of the present application may include a DNA product containing the nucleotide sequence of a polynucleotide encoding the target polypeptide operably linked to a suitable expression control region (or expression control sequence) so as to express the target polypeptide in a suitable host.
  • the expression control region may include a promoter capable of initiating transcription, an arbitrary operator sequence for regulating such transcription, a sequence encoding a suitable mRNA ribosome binding site, and a sequence regulating termination of transcription and translation.
  • the vector After transformation into a suitable host cell, the vector can replicate or function independently of the host genome and can integrate into the genome itself.
  • Vectors used in the present application are not particularly limited, and any vectors known in the art may be used.
  • Examples of commonly used vectors include natural or recombinant plasmids, cosmids, viruses and bacteriophages.
  • pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, and Charon21A may be used as phage vectors or cosmid vectors
  • pDC-based, pBR-based, and pUC-based plasmid vectors may be used.
  • pBluescriptII-based, pGEM-based, pTZ-based, pCL-based, pET-based, etc. can be used.
  • pDC pDC
  • pDCM2 Public of Korea Patent Publication No. 10-2020-0136813
  • pACYC177 pACYC184
  • pCL pECCG117
  • pUC19 pUC19
  • pBR322 pMW118
  • pCC1BAC pIMR53 vectors and the like
  • a polynucleotide encoding a target polypeptide may be inserted into a chromosome through a vector for chromosomal insertion into a cell. Insertion of the polynucleotide into the chromosome may be performed by any method known in the art, for example, homologous recombination, but is not limited thereto.
  • a selection marker for determining whether the chromosome is inserted may be further included.
  • the selectable marker is used to select cells transformed with a vector, that is, to determine whether a target nucleic acid molecule has been inserted, and can exhibit selectable phenotypes such as drug resistance, auxotrophy, resistance to cytotoxic agents, or surface polypeptide expression. markers may be used. In an environment treated with a selective agent, only cells expressing the selectable marker survive or exhibit other expression traits, so transformed cells can be selected.
  • the term "transformation” means introducing a vector containing a polynucleotide encoding a target polypeptide into a host cell or microorganism so that the polypeptide encoded by the polynucleotide can be expressed in the host cell.
  • the transformed polynucleotide can be expressed in the host cell, it may be inserted into and located in the chromosome of the host cell or located outside the chromosome.
  • the polynucleotide includes DNA and/or RNA encoding a polypeptide of interest.
  • the polynucleotide may be introduced in any form as long as it can be introduced and expressed into a host cell.
  • the polynucleotide may be introduced into a host cell in the form of an expression cassette, which is a genetic construct containing all elements required for self-expression.
  • the expression cassette may include a promoter operably linked to the polynucleotide, a transcription termination signal, a ribosome binding site, and a translation termination signal.
  • the expression cassette may be in the form of an expression vector capable of self-replication.
  • the polynucleotide may be introduced into a host cell in its own form and operably linked to a sequence necessary for expression in the host cell, but is not limited thereto.
  • operably linked means that the polynucleotide sequence is functionally linked to a promoter sequence that initiates and mediates the transcription of the polynucleotide encoding the target variant of the present application.
  • Another aspect of the present application is a variant of the present application; a polynucleotide encoding the variant; And it provides a microorganism comprising any one or more of the vectors containing the polynucleotide.
  • microorganism or “strain” includes both wild-type microorganisms and naturally or artificially genetically modified microorganisms, and is caused by insertion of foreign genes or enhancement or inactivation of endogenous gene activity.
  • a microorganism whose specific mechanism is attenuated or enhanced due to this, it may be a microorganism including genetic modification for the production of a desired polypeptide, protein or product.
  • the microorganism of the present application includes a microorganism comprising any one or more of a vector comprising a variant of the present application, a polynucleotide of the present application, and a polynucleotide of the present application; microorganisms modified to express a variant of the present application or a polynucleotide of the present application; microorganisms expressing the variants of the present application, or the polynucleotides of the present application; Or it may be a microorganism (eg, recombinant microorganism) having the mutant activity of the present application, but is not limited thereto.
  • a microorganism comprising any one or more of a vector comprising a variant of the present application, a polynucleotide of the present application, and a polynucleotide of the present application
  • microorganisms modified to express a variant of the present application or a polynucleotide of the present application microorganis
  • the microorganism is modified to further include polynucleotides encoding lycopene cyclase / phytoene synthase (crtYB) and phytoene desaturase (crtI) proteins, and these protein activities It may be a microorganism that expresses or a microorganism for which these protein activities are enhanced.
  • the lycopene cyclase/phytoene synthase or phytoene desaturase may be a protein derived from Xanthophyllomyces dendrohous , but is not limited thereto.
  • the polynucleotide encoding the lycopene cyclase/phytoene synthase or phytoene desaturase may have or include the sequence of SEQ ID NO: 27 or SEQ ID NO: 28, respectively.
  • various modifications may be made to the coding region within a range that does not change the amino acid sequence in consideration of codon degeneracy or codons preferred in microorganisms to express the variant of the present application.
  • the polynucleotide has 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, and at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97% homology or identity to the sequence of SEQ ID NO: 27 or SEQ ID NO: 28, having or comprising a nucleotide sequence of less than 100%; Or more, 98% or more, and may consist of or essentially consist of a nucleotide sequence of less than 100%, but is not limited thereto.
  • the microorganism of the present application may be one that produces tetraterpene, a precursor of tetraterpene, or a material using tetraterpene as a precursor, and the production of by-products generated in the tetraterpene production pathway may be reduced, and the production of squalene may be reduced.
  • tetraterpene a precursor of tetraterpene
  • a material using tetraterpene as a precursor a material using tetraterpene as a precursor
  • the production of by-products generated in the tetraterpene production pathway may be reduced, and the production of squalene may be reduced.
  • tetraterpene means a polymer (C40) in which 8 isoprene is polymerized among terpenes, and may include a tetraterpene-based material.
  • the terpene is a polymer of isoprene units, a terpene obtained by polymerizing two isoprene (C5) units is a monoterpene (C10), and a terpene obtained by polymerizing three isoprene units is a sesquiterpene (C15).
  • terpenes can be classified according to the number of polymerized isoprene units.
  • the tetraterpene may be a carotenoid, but is not limited thereto.
  • the tetraterpene precursor may be geranylgeranyl pyrophosphate (GGPP), but is not limited thereto.
  • GGPP geranylgeranyl pyrophosphate
  • the material using tetraterpene as a precursor may be at least one selected from the group consisting of retinal and retinol, but is not limited thereto.
  • a "tetraterpenoid" in this application is a modified tetraterpene.
  • the tetraterpenoid may be a functional group-linked tetraterpene.
  • carotenoid is a tetraterpene or a derivative thereof that gives colors such as yellow in fruits and vegetables, and may be used interchangeably with the tetraterpene and tetraterpenoid.
  • the carotenoids are xanthophyll, carotene, alpha-carotene, beta-carotene, gamma-carotene, lutein, and lycopene. ), zeaxanthin, capsanthin, canthaxanthin, and astaxanthin, but may be any one or more selected from the group consisting of, but is not limited thereto.
  • the precursor of carotenoid may be geranylgeranyl pyrophosphate (GGPP), but is not limited thereto.
  • GGPP geranylgeranyl pyrophosphate
  • the material using carotenoid as a precursor may be at least one selected from the group consisting of retinal and retinol, but is not limited thereto.
  • beta-carotene is one of carotenoid-based substances, and has beta rings at both ends of the molecule in carotene.
  • the beta-carotene precursor may be at least one selected from the group consisting of phytoene, phytofluene, lycopene, and gamma-carotene, but is not limited thereto. don't
  • the material containing beta-carotene as a precursor may be any one or more selected from the group consisting of retinal, retinol, and vitamin A, but is not limited thereto.
  • the tetraterpene, a precursor of tetraterpene, or a material using tetraterpene as a precursor may be a carotenoid, a precursor of carotenoid, or a material using a carotenoid as a precursor, and may be beta-carotene, a precursor of beta-carotene, or a material using beta-carotene as a precursor. It may, but is not limited thereto.
  • any one or more of the variant, polynucleotide, vector, and microorganism may be for producing tetraterpene, and the microorganism may be for producing tetraterpene, and may produce a precursor of tetraterpene or a precursor of tetraterpene. It may be to produce a substance to be.
  • any one or more of the variants, polynucleotides, vectors, and microorganisms may be for producing carotenoids, and the microorganisms may be for producing carotenoids, and may produce precursors of carotenoids or materials containing carotenoids as precursors. may be producing
  • any one or more of the variant, polynucleotide, vector, and microorganism may be for beta-carotene production, and the microorganism may be to produce beta-carotene, produce a beta-carotene precursor or beta-carotene as a precursor It may be to produce a substance to be.
  • GGPP geranylgeranyl pyrophosphate
  • the microorganism can also produce geranylgeranyl pyrophosphate. may be producing
  • by-products produced in the tetraterpene production pathway refer to tetraterpenes, precursors of tetraterpenes, and materials other than materials using tetraterpenes as precursors, and may specifically be squalene, but are not limited thereto.
  • don't Beta-carotene can be produced in the carotenoid or isoprenoid production pathway, and in the process, squalene synthase (ERG9) consumes 2 molecules of farnesyl pyrophosphate (FPP, C15), C30) can be produced together as a by-product.
  • squalene is an unsaturated hydrocarbon (C 30 H 50 ), which is also used for biosynthesis of steroid hormones and vitamin D.
  • the microorganism of the present application may be one in which by-products produced in the tetraterpene production pathway are reduced, and may specifically be one in which squalene production is reduced, but is not limited thereto.
  • the microorganism or strain of the present application is a microorganism naturally having the ability to produce geranylgeranyl pyrophosphate synthase or tetraterpene, or a variant or A polynucleotide encoding it (or a vector containing the polynucleotide) may be introduced and/or a microorganism endowed with the ability to produce a tetraterpene, a precursor of a tetraterpene, or a material using a tetraterpene as a precursor, but is not limited thereto.
  • the microorganism or strain of the present application is a cell or microorganism that is transformed with a vector containing a polynucleotide of the present application or a polynucleotide encoding a variant of the present application and expresses the variant of the present application.
  • the microorganisms or strains of the present application may include all microorganisms capable of producing tetraterpenes, precursors of tetraterpenes, or substances containing tetraterpenes as precursors, including the variants of the present application.
  • a polynucleotide encoding the variant of the present application is introduced into a natural wild-type microorganism or a microorganism that produces a tetraterpene, so that a geranylgeranyl pyrophosphate synthase variant is expressed, and the tetraterpene , It may be a recombinant strain with increased production ability of a precursor of tetraterpene or a material using tetraterpene as a precursor.
  • the recombinant strain is a tetraterpene, a precursor of tetraterpene, or a tetraterpene compared to a natural wild-type microorganism or a non-modified geranylgeranyl pyrophosphate synthase microorganism (ie, a microorganism expressing wild-type geranylgeranyl pyrophosphate synthase). It may be a microorganism with increased production ability of a material using a precursor, but is not limited thereto.
  • the recombinant strain is about 1% or more, specifically, about 3%, about 5%, compared to the production ability of the parent strain or the unmodified microorganism before the mutation, the tetraterpene, the precursor of the tetraterpene, or the material using the tetraterpene as a precursor. It may be higher than or higher, but is not limited thereto as long as it has an increase of + value compared to the production capacity of the parent strain or unmodified microorganism before mutation.
  • the recombinant strain has about 85% or less, about 80% or less, about 75% or less, about 70% or less, about 65% or less, about 85% or less, about 80% or less, about 65% or less, % or less, about 60% or less, about 55% or less, about 50% or less, about 30% or less, or about 10% or less, or by-products may not be produced, but is not limited thereto.
  • the term "unmodified microorganism” does not exclude strains containing mutations that may occur naturally in microorganisms, and are wild-type strains or wild-type strains themselves, or are genetically modified by natural or artificial factors. It may mean a strain before change.
  • the unmodified microorganism may mean a strain before or without introduction of the geranylgeranyl pyrophosphate synthase variant of the present application.
  • the "unmodified microorganism” may be used interchangeably with "strain before transformation", “microorganism before transformation”, “non-mutated strain”, “unmodified strain”, "non-mutated microorganism” or "reference microorganism".
  • the microorganism of the present application may be a microorganism of the genus Yarrowia sp ., specifically Yarrowia lipolytica , but may be, but is not limited thereto.
  • the term "enhancement" of polypeptide activity means that the activity of the polypeptide is increased relative to the intrinsic activity.
  • the enhancement may be used interchangeably with terms such as activation, up-regulation, overexpression, and increase.
  • activation, enhancement, upregulation, overexpression, and increase may include those that exhibit an activity that was not originally possessed, or those that exhibit enhanced activity compared to intrinsic activity or activity before modification.
  • intrinsic activity refers to the activity of a specific polypeptide originally possessed by the parent strain or non-transformed microorganism before transformation when the character changes due to genetic mutation caused by natural or artificial factors.
  • activity before transformation and “Enhancement”, “upregulation”, “overexpression” or “increase” of the activity of a polypeptide compared to its intrinsic activity means the activity of a specific polypeptide originally possessed by the parent strain or non-transformed microorganism before transformation. And / or improved compared to the concentration (expression amount).
  • the enhancement can be achieved by introducing a foreign polypeptide or by enhancing the activity and/or concentration (expression level) of an endogenous polypeptide. Whether or not the activity of the polypeptide is enhanced can be confirmed from an increase in the activity level, expression level, or amount of a product released from the corresponding polypeptide.
  • Enhancement of the activity of the polypeptide can be applied by various methods well known in the art, and is not limited as long as the activity of the target polypeptide can be enhanced compared to the microorganism before transformation. Specifically, it may be using genetic engineering and / or protein engineering, which is well known to those skilled in the art, which is a routine method of molecular biology, but is not limited thereto (e.g., Sitnicka et al. Functional Analysis of Genes. Advances in Cell Biology. 2010, Vol. 2. 1-16, Sambrook et al. Molecular Cloning 2012, etc.).
  • modification of the polynucleotide sequence encoding the polypeptide to enhance the activity of the polypeptide eg, modification of the polynucleotide sequence of the polypeptide gene to encode the modified polypeptide to enhance the activity of the polypeptide
  • It may be a combination of two or more selected from 1) to 8), but is not particularly limited thereto.
  • the increase in intracellular copy number of the polynucleotide encoding the polypeptide is achieved by introducing into the host cell a vector capable of replicating and functioning independently of the host, to which the polynucleotide encoding the corresponding polypeptide is operably linked. it may be Alternatively, it may be achieved by introducing one copy or two or more copies of a polynucleotide encoding the corresponding polypeptide into a chromosome of a host cell.
  • the introduction into the chromosome may be performed by introducing a vector capable of inserting the polynucleotide into the chromosome of the host cell into the host cell, but is not limited thereto.
  • the vector is as described above.
  • the expression control region may include a promoter, an operator sequence, a sequence encoding a ribosome binding site, and a sequence regulating termination of transcription and translation.
  • the original promoter may be replaced with a strong promoter, but is not limited thereto.
  • Examples of known strong promoters include cj1 to cj7 promoter (US Patent US 7662943 B2), lac promoter, trp promoter, trc promoter, tac promoter, lambda phage PR promoter, PL promoter, tet promoter, gapA promoter, SPL7 promoter, SPL13 (sm3) promoter (US Patent US 10584338 B2), O2 promoter (US Patent US 10273491 B2), tkt promoter, yccA promoter, etc., but are not limited thereto.
  • Modification of the nucleotide sequence encoding the initiation codon or 5'-UTR region of the gene transcript encoding the polypeptide is, for example, a nucleotide sequence encoding another initiation codon with a higher polypeptide expression rate than the endogenous initiation codon. It may be substituted, but is not limited thereto.
  • Modification of the amino acid sequence or polynucleotide sequence of 4) and 5) above may include deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution of the amino acid sequence of the polypeptide or the polynucleotide sequence encoding the polypeptide to enhance the activity of the polypeptide.
  • the combination thereof may be a sequence mutation, or replacement with an amino acid sequence or polynucleotide sequence improved to have stronger activity, or an amino acid sequence or polynucleotide sequence improved to increase activity, but is not limited thereto.
  • the replacement may be specifically performed by inserting the polynucleotide into a chromosome by homologous recombination, but is not limited thereto.
  • the vector used at this time may further include a selection marker for checking whether the chromosome is inserted.
  • the selectable marker is as described above.
  • Introduction of a foreign polynucleotide exhibiting the activity of the polypeptide may be introduction of a foreign polynucleotide encoding a polypeptide exhibiting the same/similar activity as the polypeptide into a host cell.
  • the foreign polynucleotide is not limited in origin or sequence as long as it exhibits the same/similar activity as the polypeptide.
  • the method used for the introduction can be performed by appropriately selecting a known transformation method by a person skilled in the art, and expression of the introduced polynucleotide in a host cell can generate a polypeptide and increase its activity.
  • the codon optimization of the polynucleotide encoding the polypeptide is codon optimization of the endogenous polynucleotide to increase transcription or translation in the host cell, or optimization of the transcription or translation of the foreign polynucleotide in the host cell. It may be that the codons of this have been optimized.
  • Analyzing the tertiary structure of the polypeptide to select and modify or chemically modify the exposed site for example, by comparing the sequence information of the polypeptide to be analyzed with a database in which sequence information of known proteins is stored, depending on the degree of sequence similarity. It may be to determine a template protein candidate according to the method, confirm the structure based on this, and modify or modify an exposed portion to be chemically modified to be modified or modified.
  • the enhancement of such a polypeptide activity is an increase in the activity or concentration of the corresponding polypeptide based on the activity or concentration of the polypeptide expressed in the wild-type or pre-modified microbial strain, or an increase in the amount of the product produced from the corresponding polypeptide. It may be, but is not limited thereto.
  • Modification of some or all of the polynucleotides in the microorganism of the present application is (a) genome editing using homologous recombination or genetic scissors (engineered nuclease, e.g., CRISPR-Cas9) using a vector for chromosomal insertion into the microorganism and / or (b) It may be induced by light and/or chemical treatment, such as ultraviolet light and radiation, but is not limited thereto.
  • a method of modifying part or all of the gene may include a method using DNA recombination technology.
  • a part or all of a gene may be deleted by injecting a nucleotide sequence or vector containing a nucleotide sequence homologous to a target gene into the microorganism to cause homologous recombination.
  • the injected nucleotide sequence or vector may include a dominant selection marker, but is not limited thereto.
  • Another aspect of the present application is a variant of the present application; a polynucleotide encoding the variant; and culturing a microorganism comprising any one or more of the vectors containing the polynucleotide in a medium, and a method for producing a tetraterpene, a precursor of the tetraterpene, or a material using the tetraterpene as a precursor.
  • the method for producing the tetraterpene, the precursor of the tetraterpene, or a material using the tetraterpene as a precursor may be a method for reducing squalene production, but is not limited thereto.
  • the term "culture” means growing the microorganism of the present application under appropriately controlled environmental conditions.
  • the culture process of the present application may be performed according to suitable media and culture conditions known in the art. This culturing process can be easily adjusted and used by those skilled in the art according to the selected strain.
  • the culture may be batch, continuous and/or fed-batch, but is not limited thereto.
  • the term "medium” refers to a material in which nutrients necessary for culturing the microorganisms of the present application are mixed as main components, and supplies nutrients and growth factors, including water essential for survival and growth.
  • the medium and other culture conditions used for culturing the microorganisms of the present application can be any medium without particular limitation as long as it is a medium used for culturing ordinary microorganisms, but the microorganisms of the present application are suitable as carbon sources, nitrogen sources, personnel, and inorganic materials. It can be cultured while controlling temperature, pH, etc. under aerobic conditions in a conventional medium containing compounds, amino acids, and/or vitamins.
  • Examples of the carbon source in the present application include carbohydrates such as glucose, saccharose, lactose, fructose, sucrose, and maltose; sugar alcohols such as mannitol and sorbitol; organic acids such as pyruvic acid, lactic acid, citric acid and the like; Amino acids such as glutamic acid, methionine, lysine, and the like may be included.
  • natural organic nutrients such as starch hydrolysate, molasses, blackstrap molasses, rice winter, cassava, sugarcane pomace and corn steep liquor can be used, specifically glucose and sterilized pretreated molasses (i.e. converted to reducing sugar).
  • Carbohydrates such as molasses
  • various other carbon sources in appropriate amounts may be used without limitation. These carbon sources may be used alone or in combination of two or more, but are not limited thereto.
  • nitrogen source examples include inorganic nitrogen sources such as ammonia, ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium acetate, ammonium phosphate, ammonium carbonate, and ammonium nitrate; Amino acids such as glutamic acid, methionine, glutamine, etc., organic nitrogen sources such as peptone, NZ-amine, meat extract, yeast extract, malt extract, corn steep liquor, casein hydrolysate, fish or degradation products thereof, defatted soybean cake or degradation products thereof, etc. can be used These nitrogen sources may be used alone or in combination of two or more, but are not limited thereto.
  • inorganic nitrogen sources such as ammonia, ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium acetate, ammonium phosphate, ammonium carbonate, and ammonium nitrate
  • Amino acids such as glutamic acid, methionine, glutamine, etc.
  • organic nitrogen sources such as peptone, NZ-amine,
  • the number of persons may include monopotassium phosphate, dipotassium phosphate, or a sodium-containing salt corresponding thereto.
  • the inorganic compound sodium chloride, calcium chloride, iron chloride, magnesium sulfate, iron sulfate, manganese sulfate, calcium carbonate, etc. may be used, and amino acids, vitamins, and/or appropriate precursors may be included. These components or precursors may be added to the medium either batchwise or continuously. However, it is not limited thereto.
  • the pH of the medium can be adjusted by adding compounds such as ammonium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia, phosphoric acid, sulfuric acid and the like to the medium in an appropriate manner during the cultivation of the microorganism of the present application.
  • an antifoaming agent such as a fatty acid polyglycol ester.
  • oxygen or oxygen-containing gas may be injected into the medium, or nitrogen, hydrogen or carbon dioxide gas may be injected without gas injection or nitrogen, hydrogen or carbon dioxide gas may be injected to maintain the anaerobic and non-aerobic state. It is not.
  • the culture temperature may be maintained at 20 to 45 ° C, specifically 25 to 40 ° C, 20 to 35 ° C, or 25 to 35 ° C, and may be cultured for about 10 to 160 hours, but is not limited thereto not.
  • Tetraterpenes produced by the culture of the present application may be secreted into the medium or remain in cells.
  • the method for producing a tetraterpene, a precursor of tetraterpene, or a material using tetraterpene as a precursor of the present application includes preparing a microorganism of the present application, preparing a medium for culturing the strain, or a combination thereof (in the order Regardless, in any order), for example, prior to the culturing step, may be further included.
  • the tetraterpene of the present application is a tetraterpene, a precursor of tetraterpene, or a tetraterpene from the culture medium (culture medium) or the microorganism of the present application.
  • a step of recovering a material using as a precursor may be further included.
  • the recovering step may be further included after the culturing step.
  • the recovery is carried out using a suitable method known in the art according to the culture method of the microorganism of the present application, for example, batch, continuous or fed-batch culture method, etc. It may be to collect a substance to be. For example, centrifugation, filtration, treatment with a precipitating agent for crystallized proteins (salting out), extraction, cell disruption, sonication, ultrafiltration, dialysis, molecular sieve chromatography (gel filtration), adsorption chromatography, ion exchange chromatography It may be used in combination with various chromatography such as chromatography, affinity chromatography, HPLC, or these methods, and the desired tetraterpene, precursor of tetraterpene, or tetraterpene is obtained from a medium or microorganism using a suitable method known in the art. A material using as a precursor can be recovered.
  • a suitable method known in the art can be recovered.
  • the method for producing a tetraterpene, a precursor of tetraterpene, or a material using tetraterpene as a precursor of the present application may additionally include a purification step.
  • the purification may be performed using suitable methods known in the art.
  • the recovery step and the purification step are temporary regardless of the order ( or continuously), or may be performed simultaneously or integrated into one step, but is not limited thereto.
  • the method for producing a material using tetraterpene as a precursor of the present application may further include converting the tetraterpene into a material using tetraterpene as a precursor.
  • the converting step may be further included after the culturing step or the recovering step.
  • the conversion step may be performed using a suitable method known in the art. For example, the conversion may be performed using beta-carotene 15,15'-oxygenase or retinol dehydrogenase, but is not limited thereto.
  • mutants, polynucleotides, vectors, microorganisms, tetraterpenes, precursors of tetraterpenes, and materials containing tetraterpenes as precursors are as described above.
  • Another aspect of the present application is a variant of the present application; vectors of the present application; The variant of the present application, the polynucleotide encoding the variant, the vector comprising the polynucleotide, or the microorganism comprising the polynucleotide of the present application; medium in which it was cultured; Or to provide a tetraterpene containing a combination of two or more of them, a precursor of the tetraterpene, and a composition for producing a material using the tetraterpene as a precursor.
  • composition of the present application may further include any suitable excipient commonly used in compositions for producing tetraterpenes, precursors of tetraterpenes, and substances containing tetraterpenes as precursors, and these excipients include, for example, preservatives, wetting agents, It may be a dispersing agent, a suspending agent, a buffering agent, a stabilizing agent or an isotonic agent, etc., but is not limited thereto.
  • mutants, polynucleotides, vectors, microorganisms, media, tetraterpenes, precursors of tetraterpenes, materials containing tetraterpenes as precursors, and the like are as described above.
  • Another aspect of the present application provides a use for producing a tetraterpene of any one or more of the variant, polynucleotide, vector, and microorganism of the present application, a precursor of the tetraterpene, and a material using the tetraterpene as a precursor.
  • mutants, polynucleotides, vectors, microorganisms, tetraterpenes, precursors of tetraterpenes, and materials containing tetraterpenes as precursors are as described above.
  • GGS1 In order to amplify the GGS1 gene encoding geranylgeranyl pyrophosphate synthase on the Yarrowia lioplytica chromosome, GGS1 (YALI0D17050 ) The amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 were obtained.
  • a diversify PCR random mutagenesis kit (Takara Co.) was used to induce random mutations through error-prone PCR (ep-PCR). PCR conditions and methods were optimized through buffer condition 1 and buffer condition 2 of the user manual, respectively. Specific Error-prone PCR conditions are shown in Table 1 below.
  • Buffer condition 1 Buffer condition 2 PCR grade water 40 ⁇ l 39 ⁇ l 10X Titanium Taq buffer 5 ⁇ l 5 ⁇ l MnSO4 0 ⁇ l 1 ⁇ l dGTP 1 ⁇ l 1 ⁇ l 50X Diversify dNTP Mix 1 ⁇ l 1 ⁇ l Primer mix 1 ⁇ l 1 ⁇ l Template DNA 1 ⁇ l 1 ⁇ l Titanium Taq polymerase 1 ⁇ l 1 ⁇ l
  • PCR was performed using Yarrowia lipolytica PO1f genomic DNA as a template and primers of SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20. PCR conditions, denaturation 95 °C, 1 min; Anneal 55°C, 1 min; And the polymerization reaction was repeated 32 times at 68°C for 1 minute.
  • a GGS1 mutant expression vector library based on the pIMR53-EXP1p-CYC1t vector was constructed by mixing the GGS1 PCR products of the two conditions amplified by PCR.
  • the pIMR53-EXP1p-CYC1t vector was constructed as follows. To amplify EXP1p, PCR was performed using Yarrowia lipolytica PO1f genomic DNA as a template and primers of SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 22, and Saccharomyces cerevisiae to amplify the CYC1t terminator. PCR was performed using Saccharomyce cerevisiae genomic DNA as a template and primers of SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO: 24. PCR conditions, denaturation 95 °C, 1 min; Anneal 55°C, 1 min; And the polymerization reaction was repeated 32 times at 68°C for 1 minute.
  • PCR was performed using the pIMR53 vector as a template and using the primers of SEQ ID NO: 25 and SEQ ID NO: 26. PCR conditions, denaturation 95 °C, 1 min; Anneal 55°C, 1 min; And the polymerization reaction was repeated 32 times at 68 ° C for 5 minutes.
  • Colonies transformed with the plasmid into which the desired EXP1p promoter and CYC1t terminator were inserted were selected by PCR, and then the plasmid was obtained using a commonly known plasmid extraction method, and this plasmid was named pIMR53-EXP1p-CYC1t.
  • Example 2-1 X. dendrorhous Production of derived crtYB-crtI insert strain
  • crtYB lycopene cyclase/phytoene synthase
  • crtI phytoene desaturase
  • crtYB secured the polynucleotide of SEQ ID NO: 27 based on the base sequence registered in NCBI (National Center for Biotechnology Information Search database) (GenBank: AY177204.1), and crtI obtained the base sequence registered in NCBI (GenBank: Based on AY177424.1), the polynucleotide of SEQ ID NO: 28 was obtained.
  • the polynucleotide sequences of crtYB and crtI were synthesized by Macrogen in the form of TEFINtp-crtYB-CYC1t (SEQ ID NO: 29) and TEFINtp-crtI-CYC1t (SEQ ID NO: 30), and URA3 of Y. lipolytica was used as a selection marker.
  • a cassette inserted into the MHY1 (YALI0B21582g) gene locus was designed using the gene (SEQ ID NO: 31).
  • Each PCR was performed using the primers of SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, and SEQ ID NO: 43.
  • PCR conditions were denaturing 95 °C for 1 min; Anneal 55°C, 1 min; And the polymerization reaction was repeated 35 times at 72°C for 3 minutes and 30 seconds. Five DNA fragments obtained as a result were produced as one cassette through overlap extension PCR.
  • the prepared cassette was introduced into KCCM12972P strain by heat shock method ( D.-C. Chen et al., Appl Microbiol Biotechnol, 1997 ), and then colonies formed on uracil-free solid medium (YLMM1) were obtained.
  • YLMM1 uracil-free solid medium
  • SEQ ID NO: 44 and SEQ ID NO: 45 colonies in which cassette insertion was confirmed in the genome were spotted on 5-FOA solid medium, cultured at 30 ° C for 3 days, and colonies grown on 5-FOA solid medium were obtained to obtain URA3 Markers were recovered.
  • Example 2-2 HMGR fortified wine production
  • a cassette was designed to replace the site with the TEFINt promoter, using KCCM12972P genomic DNA as a template and SEQ ID NO: 47 and SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49 and SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 and SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53 and SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, and SEQ ID NO: 56, respectively, PCR was performed.
  • PCR conditions were denaturing 95 °C for 1 min; Anneal 55°C, 1 min; And the polymerization reaction was repeated 35 times at 72°C for 1 minute and 30 seconds. Five DNA fragments obtained as a result were produced as one cassette through overlap extension PCR.
  • Glucose 20 g/L Yeast nitrogen base without amino acids 6.7 g/L, Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements without uracil 2 g/L, agar 15 g/L
  • the first color-based selection was performed.
  • YLMM2 Yarrowia lipolytica minimal media 2
  • YLMM1 Yarrowia lipolytica minimal media 2
  • the positive control CC08-1023/pIMR53-EXP1p-GGS1-CYC1t
  • 36 strains of dark orange color compared to strains were first screened.
  • the preparation method and composition of the above-described YLMM2 are as follows.
  • Glucose 40 g/L Yeast nitrogen base without amino acids and ammonium sulfate 1.7 g/L, Uracil 0.5 g/L, Ammonium sulfate 2.5 g/L in 0.1 M phosphate buffer (sodium phosphate buffer) (pH 7.2).
  • a reference value was set based on the value calculated from PC (positive control), strains corresponding to both conditions were selected, and a total of four candidate groups corresponding to conditions 1 and 2 were selected at the same time.
  • the secondary selection criteria values and four secondary selection candidates are shown in Table 3 below.
  • Transformed plasmids were extracted from the selected four strains, and sequence analysis was performed to identify random mutations located in the GGS1 ORF.
  • the transformed GGS1 plasmid was extracted from the selected strain using Zymoprep yeast plasmid miniprep kit 2 (Zymo research), and sequencing was performed in both directions using primers of SEQ ID NO: 59 and SEQ ID NO: 60 to increase the reliability of sequencing. proceeded.
  • Amino acid mutations identified as a result of the GGS1 ORF sequence analysis are shown in Table 4 below, and four candidate groups were confirmed to contain one or two mutations in Table 4 below.
  • NC (negative control) and PC (positive control) vectors and 4 variants selected in Example 4 (M103I variant, F43I variant, N29T and L90R variant, and I122V and R141K variant), and 4 related single variants (N29T mutant, L90R mutant, I122V mutant, and R141K mutant) flask evaluation of a total of 10 strains constructed by transforming expression vectors was performed.
  • Expression vectors for each of the four single variants are prepared as follows. To secure the DNA fragments of four single variants (N29T variant, L90R variant, I122V variant, and R141K variant), the pIMR53-EXP1p-GGS1-CYC1t vector containing the wild-type GGS1 sequence was used as a template with SEQ ID NO: 61 and SEQ ID NO: 62; PCR was performed using primers of SEQ ID NO: 63 and SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65 and SEQ ID NO: 66, and SEQ ID NO: 67 and SEQ ID NO: 68, respectively.
  • Expression vectors of the double mutants, N29T and L90R variants, or I122V and R141K variants, respectively, use the above-constructed N29T expression vector or I122V expression vector as a template, and primers of SEQ ID NO: 63 and SEQ ID NO: 64 or SEQ ID NO: 67 and SEQ ID NO: 68 It was prepared by performing PCR in the same way using the primers of.
  • the PCR-amplified DNA into which the variant was introduced was transformed into E. coli DH5 ⁇ using an Infusion cloning kit (Invitrogen), and plated on LB solid medium containing 30 mg/L ampicillin. After screening colonies transformed with the plasmid into which the 4 transformed GGS1 variant vectors were inserted, plasmids were obtained using a commonly known plasmid extraction method, and the variant sequences were identified using SEQ ID NO: 59 and SEQ ID NO: 60. .
  • Genotype OD ⁇ -carotene (mg/L) Squalene (mg/L) ⁇ -carotene (%) Squalene (%) NC 62 5 208 0.03 1.34 PC 56 30 133 0.21 0.95 M103I 62 59 91 0.38 0.59 F43I 63 69 71 0.44 0.45 N29T/L90R 64 67 89 0.42 0.56 N29T 61 55 88 0.36 0.58 L90R 64 58 90 0.36 0.56 I122V/R141K 62 62 65 0.40 0.42 I122V 57 43 118 0.30 0.83 R141K 59 44 111 0.30 0.75
  • the beta-carotene concentration increased by 143 to 230% in all of the GGS1 variants to which M103I, F43I, N29T, L90R, I122V, and/or R141K mutations were selected compared to PC (positive control), and the squalene concentration was A decrease of 11 to 51% was confirmed.
  • the strain introduced with the F43I variant had the best effect, and in the case of the I122V and R141K variants, beta-carotene concentration increased and squalene increased when applied simultaneously compared to the application of the two variants alone. It was confirmed that the production reduction effect was further increased.
  • the N29T and L90R variants it was confirmed that the effect of reducing squalene production was further increased when applied simultaneously compared to the application of the two variants alone.
  • a strain (CC08-1214) in which the promoter of the GGS1 gene was replaced (CC08-1214) and a strain expressing a mutant in which the 43rd phenylalanine of GGS1 was substituted with isoleucine (CC08-1215) were sequentially prepared.
  • Promoter of TEF1 (YALI0C09141p) based on the nucleotide sequence registered in KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) for the production of a cassette capable of replacing the promoter of GGS1 with the TEFINt promoter on the Yarrowia lipolytica chromosome And a polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 69 including a splicing point was obtained.
  • the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 of GGS1 (YALI0D17050g) was secured for promoter substitution of GGS1.
  • PCR was performed using Yarrowia lipolytica PO1f genomic DNA as a template and primers of SEQ ID NO: 70 and SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72 and SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74 and SEQ ID NO: 75, and SEQ ID NO: 76 and SEQ ID NO: 77, respectively. did Then, PCR was performed using the primers of SEQ ID NO: 78 and SEQ ID NO: 79 using the URA3 auxotrophic marker as a template. PCR conditions were denaturing 95° C. for 1 min; Annealing 55° C., 1 min; And the polymerization reaction was repeated 35 times at 72° C. for 1 minute and 30 seconds.
  • the GGS1 promoter replacement cassette was transformed into CC08-1023 by heat-shock and selected on YLMM1 solid medium without uracil. The selected primary strains were subjected to secondary crossover, and finally, strains in which the promoter of the GGS1 gene was replaced with the TEFINt promoter were produced. The strain thus produced was named "CC08-1214".
  • PCR was performed using the primers of SEQ ID NO: 90 and SEQ ID NO: 91, respectively.
  • PCR was performed using the primers of SEQ ID NO: 88 and SEQ ID NO: 89 using the URA3 auxotrophic marker as a template. PCR conditions were denaturing 95 °C for 1 min; Anneal 55°C, 1 min; And the polymerization reaction was repeated 35 times at 72°C for 1 minute and 30 seconds.
  • the GGS1 (F43I) mutant replacement cassette was transformed into CC08-1214 by heat-shock, and selected on YLMM1 solid medium without uracil. The selected primary strain was again subjected to secondary crossover, and finally a strain expressing the F43I mutant in which the 43rd amino acid residue of GGS1 was replaced with isoleucine was prepared. The strain thus produced was named "CC08-1215".
  • Flask evaluation was performed with CC08-1023 as negative control and CC08-1214 as positive control along with CC08-1215.
  • CC08-1215, CC08-1023 (negative control), and CC08-1214 (positive control) were added to a 250 ml corner-baffle flask containing 50 ml of YLMM2 (Yarrowia lipolytica minimal media 2) containing uracil. Inoculated to an initial OD of 1, and cultured at 30° C. for 48 hours with shaking at 250 rpm.
  • Genotype OD ⁇ -carotene (mg/L) Squalene (mg/L) ⁇ -carotene (%) Squalene (%) CC08-1023(NC) 46 5 41 0.04 0.36 CC08-1214 (PC) 50 32 17 0.26 0.14 CC08-1215 48 49 2 0.41 0.02
  • beta-carotene production can be increased when introducing the GGS1 variant of the present application.
  • the beta-carotene production efficiency can be further increased by introducing the GGS1 variant to reduce beta-carotene production and squalene synthesis, which is a competitive pathway.

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Abstract

본 출원은 제라닐제라닐 피로포스페이트 신타아제(Geranylgeranyl pyrophosphate synthase) 변이체; 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터; 상기 변이체, 폴리뉴클레오티드, 및 벡터 중 어느 하나 이상을 포함하는 미생물; 이를 이용한 테트라테르펜, 테트라테르펜의 전구체, 또는 테트라테르펜을 전구체로 하는 물질 생산방법; 테트라테르펜, 테트라테르펜의 전구체, 또는 테트라테르펜을 전구체로 하는 물질 생산용 조성물; 및 상기 변이체, 폴리뉴클레오티드, 및 벡터 중 어느 하나 이상을 포함하는 미생물의 테트라테르펜, 이의 전구체, 및 테트라테르펜을 전구체로 하는 물질 생산 용도에 관한 것이다.

Description

제라닐제라닐 피로포스페이트 신타아제 변이체 및 이를 이용한 테트라테르펜, 이의 전구체, 및 테트라테르펜을 전구체로 하는 물질의 생산방법
본 출원은 제라닐제라닐 피로포스페이트 신타아제(Geranylgeranyl pyrophosphate synthase) 변이체; 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터; 상기 변이체, 폴리뉴클레오티드, 및 벡터 중 어느 하나 이상을 포함하는 미생물; 이를 이용한 테트라테르펜, 이의 전구체, 및 테트라테르펜을 전구체로 하는 물질의 생산방법; 테트라테르펜, 이의 전구체, 및 테트라테르펜을 전구체로 하는 물질 생산용 조성물; 및 상기 변이체, 폴리뉴클레오티드, 및 벡터 중 어느 하나 이상을 포함하는 미생물의 테트라테르펜, 이의 전구체, 및 테트라테르펜을 전구체로 하는 물질 생산 용도에 관한 것이다.
테르페노이드(terpenoid)는 카로티노이드(carotenoid)를 포함하는 개념으로서, 식물 및 동물에서 다양한 기능을 발휘함에 따라, 식품, 사료 등 다방면의 산업 분야에서 이용되고 있다. 테르페노이드는 식물의 약효를 내는 대표적인 물질로 알려져 있으며, 카로티노이드(carotenoid)와 같이 테르펜(terpene)류이다. 그 중에서도 베타카로틴과 같은 카로티노이드는 자유라디칼 제거, 동물에서 비타민 A의 모체, 척추동물의 면역시스템 증강, 및 폐암 위험성 감소와 같은 기능이 보고된 물질이다.
그러나, 이러한 장점에도 불구하고, 카로티노이드, 예를 들어, 베타카로틴은 동물의 체내에서 합성되지 않거나 합성량이 부족하다. 또한, 변이된 미생물을 이용하여 산업적 생산을 도모하더라도(미국등록특허 제7745170호), 여전히 부산물로 인해 베타카로틴을 고순도로 생산하는 것이 어려운 실정이다.
부산물과 관련하여, 카로티노이드 또는 테르페노이드 생산을 위한 핵심 전구물질인 제라닐제라닐 피로포스페이트(geranylgeranyl pyrophosphate; GGPP, C20)는 아이소프레노이드(isoprenoid) 생합성 경로에서 제라닐제라닐 피로포스페이트 신타아제(geranylgeranyl pyrophosphate synthase) 효소에 의해 파네실 피로포스페이트(farnesyl pyrophosphate; FPP, C15)와 이소펜테닐 피로포스페이트(isopentenyl pyrophosphate; IPP, C5)가 결합되어 생산된다. 다만, 스쿠알렌 신타아제(squalene synthase; ERG9)에 의해 파네실 피로포스페이트(FPP, C15)로부터 스쿠알렌(C30)이 부산물로 함께 생산될 수 있다. 이에, 카로티노이드 또는 테르페노이드 생합성을 위한 핵심 전구물질인 GGPP 생성량 증대 및 경쟁경로인 스쿠알렌 생산 감소를 위한 방법의 개발할 필요성이 대두되고 있다.
본 출원의 해결하고자 하는 과제는 제라닐제라닐 피로포스페이트 신타아제 변이체 및 이를 이용한 테트라테르펜, 이의 전구체, 및 테트라테르펜을 전구체로 하는 물질 생산 방법을 제공하는 것이다.
본 출원의 하나의 목적은 서열번호 1의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 29번, 43번, 90번, 103번, 122번, 및 141번 위치에 상응하는 아미노산 중 어느 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 제라닐제라닐 피로포스페이트 신타아제(Geranylgeranyl pyrophosphate synthase) 변이체를 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 하나의 목적은 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 하나의 목적은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 목적은 상기 변이체, 폴리뉴클레오티드, 및 벡터 중 어느 하나 이상을 포함하는 미생물을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 하나의 목적은 상기 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 테트라테르펜(tetraterpene), 이의 전구체, 및 테트라테르펜을 전구체로 하는 물질 생산 방법을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 하나의 목적은 상기 변이체, 벡터, 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 포함하는, 테트라테르펜, 이의 전구체, 및 테트라테르펜을 전구체로 하는 물질 생산용 조성물을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 하나의 목적은 상기 변이체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 및 미생물 중 어느 하나 이상의 테트라테르펜, 이의 전구체, 및 테트라테르펜을 전구체로 하는 물질 생산 용도를 제공하는 것이다.
본 출원의 제라닐제라닐 피로포스페이트 신타아제 변이체를 발현하는 미생물은 이를 발현하지 않는 균주에 비해 테트라테르펜, 테트라테르펜의 전구체, 또는 테트라테르펜을 전구체로 하는 물질을 효과적으로 생산할 수 있다.
이하, 본 출원 내용에 대하여 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시한 일 양태의 설명 및 실시형태는 공통된 사항에 대하여 다른 양태의 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 또한, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 더불어, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
본 출원의 일 양태는 서열번호 1의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 29번, 43번, 90번, 103번, 122번, 및 141번 위치에 상응하는 아미노산 중 어느 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 제라닐제라닐 피로포스페이트 신타아제(Geranylgeranyl pyrophosphate synthase) 변이체를 제공한다.
상기 제라닐제라닐 피로포스페이트 신타아제 변이체는, 제라닐제라닐 피로포스페이트 신타아제 활성을 갖는 폴리펩티드 또는 제라닐제라닐 피로포스페이트 신타아제에서 서열번호 1의 N-말단으로부터 29번, 43번, 90번, 103번, 122번, 및 141번 위치에 상응하는 아미노산 중 어느 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 변이체를 의미한다.
본 출원에서 "제라닐제라닐 피로포스페이트 신타아제(Geranylgeranyl pyrophosphate synthase; GGS1)"는 파네실피로인산(Farneylpyrophosphate; FPP)로부터 제라닐제라닐 피로포스페이트(Geranylgeranyl pyrophosphate synthase; GGPP)의 합성을 촉매할 수 있는 효소이다.
본 출원의 제라닐제라닐 피로포스페이트 신타아제는 본 출원에서 제공하는 제라닐제라닐 피로포스페이트 신타아제 변이체를 제조하기 위해 변형이 가해지는 제라닐제라닐 피로포스페이트 신타아제 또는 제라닐제라닐 피로포스페이트 신타아제 활성을 갖는 폴리펩티드일 수 있다. 구체적으로, 자연적으로 발생하는 폴리펩티드 또는 야생형 폴리펩티드일 수 있고, 이의 성숙 폴리펩티드일 수 있으며, 이의 변이체 또는 기능적 단편을 포함할 수 있으나 본 출원의 제라닐제라닐 피로포스페이트 신타아제 변이체의 모체(parent)가 될 수 있는 한 제한 없이 포함된다.
본 출원에서 상기 제라닐제라닐 피로포스페이트 신타아제는 이에 제한되지는 않으나, 서열번호 1의 폴리펩티드일 수 있다. 또한, 서열번호 1의 폴리펩티드와 약 80%. 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드일 수 있으며, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드와 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면 제한 없이 제라닐제라닐 피로포스페이트 신타아제 범위에 포함된다.
본 출원의 제라닐제라닐 피로포스페이트 신타아제는 공지의 데이터 베이스인 NCBI의 GenBank 등에서 그 서열을 얻을 수 있다. 구체적으로 ggs1 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서, "변이체"는 하나 이상의 아미노산이 보존적 치환(conservative substitution) 및/또는 변형(modification)되어 상기 변이체의 변이 전 아미노산 서열과 상이하나 기능(functions) 또는 특성(properties)이 유지되는 폴리펩티드를 지칭한다. 이러한 변이체는 일반적으로 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열 중 하나 이상의 아미노산을 변형하고, 상기 변형된 폴리펩티드의 특성을 평가하여 동정(identify)될 수 있다. 즉, 변이체의 능력은 변이 전 폴리펩티드에 비하여 증가되거나, 변하지 않거나, 또는 감소될 수 있다. 또한, 일부 변이체는 N-말단 리더 서열 또는 막전이 도메인(transmembrane domain)과 같은 하나 이상의 부분이 제거된 변형을 포함할 수 있다. 다른 변이체는 성숙 단백질(mature protein)의 N- 및/또는 C-말단으로부터 일부분이 제거된 변형을 포함할 수 있다. 상기 용어 "변이체"는 변이형, 변형, 변이형 폴리펩티드, 변이된 단백질, 변이 및 변이체 등의 용어(영문 표현으로는 modification, modified polypeptide, modified protein, mutant, mutein, divergent 등)가 혼용되어 사용될 수 있으며, 변이된 의미로 사용되는 용어라면 이에 제한되지 않는다.
또한, 변이체는 폴리펩티드의 특성과 2차 구조에 최소한의 영향을 갖는 아미노산들의 결실 또는 부가를 포함할 수 있다. 예를 들면 변이체의 N-말단에는 번역-동시에(co-translationally) 또는 번역-후에(post-translationally) 단백질의 이동(translocation)에 관여하는 시그널(또는 리더) 서열이 컨쥬게이트 될 수 있다. 또한 상기 변이체는 확인, 정제, 또는 합성할 수 있도록 다른 서열 또는 링커와 컨쥬게이트 될 수 있다.
본 출원의 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 29번, 43번, 90번, 103번, 122번, 및 141번 위치에 상응하는 아미노산 중 어느 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 제라닐제라닐 피로포스페이트 신타아제 변이체일 수 있다. 구체적으로, 상기 29번, 43번, 90번, 103번, 122번, 및 141번 위치 중 1 이상, 2 이상, 3 이상, 4이상, 5 이상, 또는 6 이상의 위치의 아미노산이 치환된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 변이체의 모체가 되는 제라닐제라닐 피로포스페이트 신타아제 활성을 갖는 폴리펩티드 또는 제라닐제라닐 피로포스페이트 신타아제에 있어서, 서열번호 1의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 29번 위치에 상응하는 아미노산은 아스파라긴; 43번 위치에 상응하는 아미노산은 페닐알라닌; 90번 위치에 상응하는 아미노산은 류신; 103번 위치에 상응하는 아미노산은 메티오닌; 122번 위치에 상응하는 아미노산은 이소류신; 및/또는 141번 위치에 상응하는 아미노산은 아르기닌일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 구현예로 상기 변이체는, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 29번 위치에 상응하는 아미노산이 아스파라긴 외의 아미노산으로 치환; 43번 아미노산에 상응하는 아미노산이 페닐알라닌 외의 아미노산으로 치환; 90번 아미노산에 상응하는 아미노산이 류신 외의 아미노산으로 치환; 103번 아미노산에 상응하는 아미노산이 메티오닌 외의 아미노산으로 치환; 122번 아미노산에 상응하는 아미노산이 이소류신 외의 아미노산으로 치환; 및 141번 아미노산에 상응하는 아미노산이 아르기닌 외의 아미노산으로 치환 중 하나 이상의 치환을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 "다른 아미노산"은 치환 전 아미노산과 치환 전의 아미노산과 다른 아미노산이면 제한되지 않는다. 한편, 본 출원에서 '특정 아미노산이 치환되었다'고 표현하는 경우, 다른 아미노산으로 치환되었다고 별도로 표기하지 않더라도 치환 전의 아미노산과 다른 아미노산으로 치환되는 것임은 자명하다.
상기 다른 아미노산으로의 치환은 비극성(nonpolar) 아미노산, 극성(polar) 아미노산, 또는 양으로 하전된(염기성) 아미노산으로의 치환일 수 있다. 구체적으로, 상기 비극성(nonpolar) 아미노산은 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 메티오닌, 및 프롤린으로 이루어지는 군에서 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 극성(polar) 아미노산은 친수성(hydrophilic) 아미노산과 혼용될 수 있으며, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있고, 상기 양으로 하전된(염기성) 아미노산은 아르기닌, 라이신, 및 히스티딘으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 본 출원의 변이체는 참조(reference) 단백질인 서열번호 1의 아미노산 서열의 29번, 43번, 90번, 103번, 122번, 및 141번 위치에 상응하는 아미노산 중 어느 하나 이상의 아미노산이 비극성 아미노산, 극성 아미노산, 또는 양으로 하전된(염기성) 아미노산 중 치환 전 아미노산과 다른 아미노산으로 치환된 변이체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 비극성 아미노산은 이소류신(Ile) 또는 발린(Val)일 수 있고, 상기 극성 아미노산은 트레오닌(Thr)일 수 있으며, 상기 양으로 하전된 아미노산은 아르기닌(Arg) 또는 라이신(Lys)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 다른 아미노산은 트레오닌, 이소류신, 아르기닌, 발린, 및 라이신으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 구현예로, 본 출원의 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열의 29번, 43번, 90번, 103번, 122번, 및 141번 위치에 상응하는 아미노산 중 어느 하나 이상의 아미노산이 트레오닌, 이소류신, 아르기닌, 발린, 및 라이신으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나로 치환된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 구현 예로, 본 출원의 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열의 29번 위치에 상응하는 아미노산이 트레오닌으로 치환; 43번 위치에 상응하는 아미노산이 이소류신으로 치환; 90번 위치에 상응하는 아미노산이 아르기닌으로 치환; 103번 위치에 상응하는 아미노산이 이소류신으로 치환; 122번 위치에 상응하는 아미노산이 발린으로 치환; 141번 위치에 상응하는 아미노산이 라이신으로 치환; 및 이들의 조합으로 구성되는 군에서 선택되어 치환된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서, 용어 "상응하는(corresponding to)"은, 폴리펩티드에서 열거되는 위치의 아미노산 잔기이거나, 또는 폴리펩티드에서 열거되는 잔기와 유사하거나 동일하거나 상동한 아미노산 잔기를 지칭한다. 상응하는 위치의 아미노산을 확인하는 것은 특정 서열을 참조하는 서열의 특정 아미노산을 결정하는 것일 수 있다. 본 출원에 사용된 "상응 영역"은 일반적으로 관련 단백질 또는 참조 (reference) 단백질에서의 유사하거나 대응되는 위치를 지칭한다.
예를 들어, 임의의 아미노산 서열을 서열번호 1과 정렬(align)하고, 이를 토대로 상기 아미노산 서열의 각 아미노산 잔기는 서열번호 1의 아미노산 잔기와 상응하는 아미노산 잔기의 숫자 위치를 참조하여 넘버링 할 수 있다. 예를 들어, 본 출원에 기재된 것과 같은 서열 정렬 알고리즘은, 쿼리 시퀀스("참조 서열"이라고도 함)와 비교하여 아미노산의 위치, 또는 치환, 삽입 또는 결실 등의 변형이 발생하는 위치를 확인할 수 있다.
이러한 정렬에는 예를 들어 Needleman-Wunsch 알고리즘 (Needleman 및 Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453), EMBOSS 패키지의 Needle 프로그램 (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000), Trends Genet. 16: 276-277) 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않고 당업계에 알려진 서열 정렬 프로그램, 쌍 서열(pairwise sequence) 비교 알고리즘 등을 적절히 사용할 수 있다.
일 구현예로, 본 출원의 변이체는 서열번호 1의 폴리펩티드와 약 80%. 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 서열 동일성을 가지면서, 서열번호 1의 29번, 43번, 90번, 103번, 122번, 및 141번 위치에 상응하는 아미노산 중 어느 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 것일 수 있다.
일 구현예로, 본 출원의 변이체는 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15 또는 서열번호 17로 기재된 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.7% 또는 99.9% 이상의 상동성 또는 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
구체적으로, 본 출원의 변이체는 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15 또는 서열번호 17로 기재된 아미노산 서열을 가지거나(having), 포함하거나(comprising), 이루어지거나(consisting of), 상기 아미노산 서열로 필수적으로 이루어질(essentially consisting of) 수 있다.
일 구현예로, 본 출원의 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열을 기준으로 29번, 43번, 90번, 103번, 122번, 및 141번 위치에 상응하는 아미노산 중 어느 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되고, 상기 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 또는 서열번호 17로 기재된 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.7% 또는 99.9% 이상의 상동성 또는 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일 구현예로, 본 출원의 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열의 103번째 위치에 상응하는 아미노산인 메티오닌이 이소류신으로 치환된, 서열번호 3으로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드; 서열번호 1의 아미노산 서열의 43번째 위치에 상응하는 아미노산인 페닐알라닌이 이소류신으로 치환된, 서열번호 5로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드; 서열번호 1의 아미노산 서열의 29번째 위치에 상응하는 아미노산인 아스파라긴이 트레오닌으로 치환 및 90번째 위치에 상응하는 아미노산인 류신이 아르기닌으로 치환된, 서열번호 7로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드; 서열번호 1의 아미노산 서열의 29번째 위치에 상응하는 아미노산인 아스파라긴이 트레오닌으로 치환된, 서열번호 9로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드; 서열번호 1의 아미노산 서열의 90번째 위치에 상응하는 아미노산인 류신이 아르기닌으로 치환된, 서열번호 11로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드; 서열번호 1의 아미노산 서열의 122번째 위치에 상응하는 아미노산인 이소류신이 발린으로 치환 및 141번째 위치에 상응하는 아미노산인 아르기닌이 라이신으로 치환된, 서열번호 13으로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드; 서열번호 1의 아미노산 서열의 122번째 위치에 상응하는 아미노산인 이소류신이 발린으로 치환된, 서열번호 15으로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드; 및 서열번호 1의 아미노산 서열의 141번째 위치에 상응하는 아미노산인 아르기닌이 라이신으로 치환된, 서열번호 17로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
*또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 본 출원의 변이체에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환, 보존적 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 변이체도 본 출원의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
예를 들어, 상기 아미노산 서열 N-말단, C-말단 그리고/또는 내부에 본 출원의 변이체의 기능을 변경하지 않는 서열 추가 또는 결실, 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 잠재성 돌연변이 (silent mutation) 또는 보존적 치환을 가지는 경우이다.
상기 "보존적 치환(conservative substitution)"은 한 아미노산을 유사한 구조적 및/또는 화학적 성질을 갖는 또 다른 아미노산으로 치환시키는 것을 의미한다. 이러한 아미노산 치환은 일반적으로 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성(amphipathic nature)에서의 유사성에 근거하여 발생할 수 있다. 통상적으로, 보존적 치환은 단백질 또는 폴리펩티드의 활성에 거의 영향을 미치지 않거나 또는 영향을 미치지 않을 수 있다.
본 출원에서 용어, '상동성 (homology)' 또는 '동일성 (identity)'은 두 개의 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열 상호간 유사한 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 용어 상동성 및 동일성은 종종 상호교환적으로 이용될 수 있다.
보존된(conserved) 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 서열 상동성 또는 동일성은 표준 배열 알고리즘에 의해 결정되며, 사용되는 프로그램에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티가 함께 이용될 수 있다. 실질적으로, 상동성을 갖거나(homologous) 또는 동일한(identical) 서열은 일반적으로 서열 전체 또는 일부분과 중간 또는 높은 엄격한 조건(stringent conditions)에서 하이브리드할 수 있다. 하이브리드화는 폴리뉴클레오티드에서 일반 코돈 또는 코돈 축퇴성을 고려한 코돈을 함유하는 폴리뉴클레오티드와의 하이브리드화 역시 포함됨이 자명하다.
임의의 두 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는, 예를 들어, Pearson et al (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444에서와 같은 디폴트 파라미터를 이용하여 "FASTA" 프로그램과 같은 공지의 컴퓨터 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. 또는, EMBOSS 패키지의 니들만 프로그램(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277)(버전 5.0.0 또는 이후 버전)에서 수행되는 바와 같은, 니들만-운치(Needleman-Wunsch) 알고리즘(Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)이 사용되어 결정될 수 있다(GCG 프로그램 패키지 (Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994, 및 [CARILLO ETA/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073을 포함한다). 예를 들어, 국립 생물공학 정보 데이터베이스 센터의 BLAST, 또는 ClustalW를 이용하여 상동성, 유사성 또는 동일성을 결정할 수 있다.
폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 상동성, 유사성 또는 동일성은, 예를 들어, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482 에 공지된 대로, 예를 들면, Needleman et al. (1970), J Mol Biol. 48:443과 같은 GAP 컴퓨터 프로그램을 이용하여 서열 정보를 비교함으로써 결정될 수 있다. 요약하면, GAP 프로그램은 두 서열 중 더 짧은 것에서의 기호의 전체 수로, 유사한 배열된 기호(즉, 뉴클레오티드 또는 아미노산)의 수를 나눈 값으로 정의할 수 있다. GAP 프로그램을 위한 디폴트 파라미터는 (1) 이진법 비교 매트릭스(동일성을 위해 1 그리고 비-동일성을 위해 0의 값을 함유함) 및 Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)에 의해 개시된 대로, Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745의 가중된 비교 매트릭스 (또는 EDNAFULL (NCBI NUC4.4의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스); (2) 각 갭을 위한 3.0의 페널티 및 각 갭에서 각 기호를 위한 추가의 0.10 페널티 (또는 갭 개방 패널티 10, 갭 연장 패널티 0.5); 및 (3) 말단 갭을 위한 무 페널티를 포함할 수 있다.
일 구현예로, 본 출원의 변이체는 제라닐제라닐 피로포스페이트 신타아제 활성을 가질 수 있다. 일 구현예로, 본 출원의 변이체는 야생형 혹은 비변이 제라닐제라닐 피로포스페이트 신타아제에 비해, 테트라테르펜, 테트라테르펜의 전구체 또는 테트라테르펜을 전구체로 하는 물질 생산능이 증가하도록 하는 활성을 가질 수 있다. 일 구현예로, 본 출원의 변이체는 야생형 혹은 제라닐제라닐 피로포스페이트 신타아제에 비해, 테트라테르펜, 테트라테르펜의 전구체 또는 테트라테르펜을 전구체로 하는 물질 생산경로의 부산물 생산수준이 감소하도록 하는 활성을 가질 수 있다. 일 구현예로, 본 출원의 변이체는 야생형 혹은 제라닐제라닐 피로포스페이트 신타아제에 비해, 스쿠알렌 생산수준이 감소하도록 하는 활성을 가질 수 있다. 일 구현예로, 본 출원의 변이체는 야생형 혹은 비변이 제라닐제라닐 피로포스페이트 신타아제에 비해, 강화된 활성을 가지는 것일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 다른 하나의 양태는 본 출원의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 출원에서 용어, "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드 단위체(monomer)가 공유결합에 의해 길게 사슬모양으로 이어진 뉴클레오티드의 중합체(polymer)로 일정한 길이 이상의 DNA 또는 RNA 가닥으로서, 보다 구체적으로는 제라닐제라닐 피로포스페이트 활성을 갖는 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 단편을 의미한다.
본 출원의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 또는 서열번호 17로 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 포함할 수 있다. 일 구현예로, 본 출원의 폴리뉴클레오티드는 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16 또는 서열번호 18의 서열을 가지거나 포함할 수 있다. 또한, 본 출원의 폴리뉴클레오티드는 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16 또는 서열번호 18의 서열로 이루어지거나, 필수적으로 구성될 수 있다.
본 출원의 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성(degeneracy) 또는 본 출원의 변이체를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 본 출원의 변이체의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 구체적으로, 본 출원의 폴리뉴클레오티드는 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16 또는 서열번호 18의 서열과 상동성 또는 동일성이 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 및 100% 미만인 염기서열을 가지거나 포함하거나, 또는 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16 또는 서열번호 18의 서열과 상동성 또는 동일성이 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 및 100% 미만인 염기서열로 이루어지거나 필수적으로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이때, 상기 상동성 또는 동일성을 갖는 서열의, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16 또는 서열번호 18의 29번, 43번, 90번, 103번, 122번, 및 141번 위치에 상응하는 아미노산을 코딩하는 코돈은, 트레오닌, 이소류신, 아르기닌, 발린, 또는 라이신을 코딩하는 코돈 중 하나일 수 있다.
또한, 본 출원의 폴리뉴클레오티드는 공지의 유전자 서열로부터 제조될 수 있는 프로브, 예를 들면, 본 출원의 폴리뉴클레오티드 서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이드리드화할 수 있는 서열이라면 제한 없이 포함될 수 있다. 상기 "엄격한 조건(stringent condition)"이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 이러한 조건은 문헌(J. Sambrook et al.,Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York, 9.50-9.51, 11.7-11.8 참조)에 구체적으로 기재되어 있다. 예를 들어, 상동성 또는 동일성이 높은 폴리뉴클레오티드끼리, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드끼리 하이브리드화하고, 그보다 상동성 또는 동일성이 낮은 폴리뉴클레오티드끼리 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던 하이브리드화(southern hybridization)의 세척 조건인 60℃, 1ХSSC, 0.1% SDS, 구체적으로 60℃, 0.1ХSSC, 0.1% SDS, 보다 구체적으로 68℃, 0.1ХSSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 구체적으로 2회 내지 3회 세정하는 조건을 열거할 수 있다.
혼성화는 비록 혼성화의 엄격도에 따라 염기 간의 미스매치(mismatch)가 가능할지라도, 두 개의 핵산이 상보적 서열을 가질 것을 요구한다. 용어, "상보적"은 서로 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 염기 간의 관계를 기술하는데 사용된다. 예를 들면, DNA에 관하여, 아데닌은 티민에 상보적이며 시토신은 구아닌에 상보적이다. 따라서, 본 출원의 폴리뉴클레오티드는 또한 실질적으로 유사한 핵산 서열뿐만 아니라 전체 서열에 상보적인 단리된 핵산 단편을 포함할 수 있다.
구체적으로, 본 출원의 폴리뉴클레오티드와 상동성 또는 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드는 55 ℃의 Tm 값에서 혼성화 단계를 포함하는 혼성화 조건을 사용하고 상술한 조건을 사용하여 탐지할 수 있다. 또한, 상기 Tm 값은 60 ℃, 63 ℃, 또는 65 ℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고 그 목적에 따라 당업자에 의해 적절히 조절될 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드를 혼성화하는 적절한 엄격도는 폴리뉴클레오티드의 길이 및 상보성 정도에 의존하고 변수는 해당기술분야에 잘 알려져 있다(예컨대, J. Sambrook et al., 상동).
본 출원의 또 다른 하나의 양태는 본 출원의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다. 상기 벡터는 상기 폴리뉴클레오티드를 숙주세포에서 발현시키기 위한 발현 벡터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 벡터는 적합한 숙주 내에서 목적 폴리펩티드를 발현시킬 수 있도록 적합한 발현조절영역(또는 발현조절서열)에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 포함하는 DNA 제조물을 포함할 수 있다. 상기 발현조절영역은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.
본 출원에서 사용되는 벡터는 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pDC계, pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 구체적으로는 pDC, pDCM2(대한민국 공개특허공보 제10-2020-0136813호), pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC, pIMR53 벡터 등을 사용할 수 있다.
일례로 세포 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 목적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 염색체 내로 삽입할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동재조합(homologous recombination)에 의하여 이루어질 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 상기 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커(selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 선별 마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별, 즉 목적 핵산 분자의 삽입 여부를 확인하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 폴리펩티드의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서는 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하거나 다른 표현 형질을 나타내므로, 형질전환된 세포를 선별할 수 있다.
본 출원에서 용어 "형질전환"은 표적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포 혹은 미생물 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 폴리펩티드가 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함할 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 목적 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 및/또는 RNA를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로도 도입될 수 있다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트(expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터(promoter), 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있으며, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기에서 용어 "작동 가능하게 연결"된 것이란 본 출원의 목적 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열과 상기 폴리뉴클레오티드 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다.
본 출원의 또 다른 하나의 양태는 본 출원의 변이체; 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 중 어느 하나 이상을 포함하는, 미생물을 제공한다.
본 출원에서 용어, "미생물" 또는 "균주"는 야생형 미생물이나 자연적 또는 인위적으로 유전적 변형이 일어난 미생물을 모두 포함하며, 외부 유전자가 삽입되거나 내재적 유전자의 활성이 강화되거나 불활성화되는 등의 원인으로 인해서 특정 기작이 약화되거나 강화된 미생물로서, 목적하는 폴리펩티드, 단백질 또는 산물의 생산을 위하여 유전적 변형(modification)을 포함하는 미생물일 수 있다.
본 출원의 미생물은 본 출원의 변이체, 본 출원의 폴리뉴클레오티드 및 본 출원의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 중 어느 하나 이상을 포함하는 미생물; 본 출원의 변이체 또는 본 출원의 폴리뉴클레오티드를 발현하도록 변형된 미생물; 본 출원의 변이체, 또는 본 출원의 폴리뉴클레오티드를 발현하는 미생물; 또는 본 출원의 변이체 활성을 갖는 미생물 (예컨대, 재조합 미생물)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 미생물은 라이코펜 사이클라제/파이토엔 신타아제(lycopene cyclase/phytoene synthase, crtYB) 및 파이토엔 디새튜라아제(phytoene desaturase, crtI) 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 더 포함하도록 변형되어, 이들 단백질 활성을 나타내는 미생물 또는 이들 단백질 활성이 강화된 미생물일 수 있다. 상기 라이코펜 사이클라제/파이토엔 신타아제 또는 파이토엔 디새튜라아제는 크산토필로마이세스 덴드로하우스(Xanthophyllomyces dendrorhous) 유래의 단백질일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 일 구체예로 상기 라이코펜 사이클라제/파이토엔 신타아제 또는 파이토엔 디새튜라아제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 각각 서열번호 27 또는 서열번호 28의 서열을 가지거나 포함하는 것일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성(degeneracy) 또는 본 출원의 변이체를 발현시키고자 하는 미생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 구체적으로, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 27 또는 서열번호 28의 서열과 상동성 또는 동일성이 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 및 100% 미만인 염기서열을 가지거나 포함하거나, 또는 서열번호 27 또는 서열번호 28의 서열과 상동성 또는 동일성이 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 및 100% 미만인 염기서열로 이루어지거나 필수적으로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 미생물은 테트라테르펜, 테트라테르펜의 전구체 또는 테트라테르펜을 전구체로 하는 물질을 생산하는 것일 수 있으며, 테트라테르펜 생산 경로에서 생성되는 부산물 생산이 감소된 것일 수 있고, 스쿠알렌 생산이 감소된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 "테트라테르펜(tetraterpene)"은 테르펜(terpene) 중에서 이소프렌(isoprene)이 8개가 중합된 폴리머(C40)를 의미하며, 테트라테르펜계 물질을 포함할 수 있다. 상기 테르펜은 이소프렌 단위의 중합체이고, 두 개의 이소프렌(C5) 단위가 중합된 테르펜은 모노테르펜(monoterpene, C10), 및 세 개의 이소프렌 단위가 중합된 테르펜은 세스퀴테르펜(Sesquiterpene, C15)이며, 이와 같이 테르펜은 중합된 이소프렌 단위 개수에 따라 구분될 수 있다.
구체적으로, 상기 테트라테르펜은 카로티노이드(carotenoid)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 테트라테르펜의 전구체는 제라닐제라닐 피로포스페이트(Geranylgeranyl Pyrophosphate; GGPP)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 테트라테르펜을 전구체로 하는 물질은 레티날(retinal) 및 레티놀(retinol)로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 "테트라테르페노이드(tetraterpenoid)"는 변형된 테트라테르펜이다. 상기 테트라테르페노이드는 작용기가 결합된 테트라테르펜일 수 있다.
본 출원에서 "카로티노이드(carotenoid)"는 과일 및 야채에서 노란색 등의 색을 내게 하는 테트라테르펜 또는 이의 유도체로서, 상기 테트라테르펜 및 테트라테르페노이드와 혼용될 수 있다.
구체적으로, 상기 카로티노이드는 크산토필(xanthophyll), 카로틴(carotene), 알파카로틴(alpha-carotene), 베타카로틴(beta-carotene), 감마카로틴(gamma-carotene), 루테인(lutein), 라이코펜(lycopene), 제아잔틴(Zeaxanthin), 캡산틴(Capsanthin), 칸타잔틴(Canthaxanthin), 및 아스타잔틴(Astaxanthin)으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 카로티노이드의 전구체는 제라닐제라닐 피로포스페이트(Geranylgeranyl Pyrophosphate; GGPP)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 카로티노이드를 전구체로 하는 물질은 레티날(retinal) 및 레티놀(retinol)로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 "베타카로틴"은 카로티노이드계 물질 중 하나로서, 카로틴 중에서 분자 양쪽 끝 단에 베타 고리를 갖는다.
본 출원에서 베타카로틴의 전구체는 피토엔(phytoene), 피토플루엔(phytofluene), 라이코펜(lycopene), 및 감마카로틴(gamma-carotene)으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 베타카로틴을 전구체로 하는 물질은 레티날(retinal), 레티놀(retinol), 및 비타민 A으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다,
상기 테트라테르펜, 테트라테르펜의 전구체 또는 테트라테르펜을 전구체로 하는 물질은 카로티노이드, 카로티노이드의 전구체 또는 카로티노이드를 전구체로 하는 물질일 수 있고, 베타카로틴, 베타카로틴의 전구체, 또는 베타카로틴을 전구체로 하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 상기 변이체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 및 미생물 중 어느 하나 이상은 테트라테르펜 생산을 위한 것일 수 있으며, 상기 미생물은 테트라테르펜을 생산하는 것일 수 있고, 테트라테르펜의 전구체를 생산하거나 테트라테르펜을 전구체로 하는 물질을 생산하는 것일 수 있다.
본 출원에서 상기 변이체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 및 미생물 중 어느 하나 이상은 카로티노이드 생산을 위한 것일 수 있으며, 상기 미생물은 카로티노이드를 생산하는 것일 수 있고, 카로티노이드의 전구체를 생산하거나 카로티노이드를 전구체로 하는 물질을 생산하는 것일 수 있다.
본 출원에서 상기 변이체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 및 미생물 중 어느 하나 이상은 베타카로틴 생산을 위한 것일 수 있으며, 상기 미생물은 베타카로틴을 생산하는 것일 수 있고, 베타카로틴의 전구체를 생산하거나 베타카로틴을 전구체로 하는 물질을 생산하는 것일 수 있다.
일 구현예로, 제라닐제라닐 피로포스페이트(geranylgeranyl pyrophosphate; GGPP)는 이소프레노이드(isoprenoid) 생합성 경로에서 제라닐제라닐 피로포스페이트 신타아제에 의해 생산되므로, 상기 미생물은 제라닐제라닐 피로포스페이트도 생산하는 것일 수 있다.
*본 출원에서 테트라테르펜 생산 경로에서 생성되는 부산물은, 테트라테르펜, 테트라테르펜의 전구체, 및 테트라테르펜을 전구체로 하는 물질 이외의 물질을 의미하며, 구체적으로는 스쿠알렌(squalene)일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 베타카로틴은 카로티노이드(Carotenoid) 또는 이소프레노이드 생산 경로에서 생산될 수 있는 것으로서, 그 과정에서 스쿠알렌 신타아제(squalene synthase; ERG9)에 의해 파네실 피로포스페이트(FPP, C15) 2분자를 소모하여 스쿠알렌(C30)이 부산물로 함께 생산될 수 있다.
본 출원에서 "스쿠알렌"은 불포화 탄화수소(C30H50)로서, 스테로이드 호르몬, 비타민 D 등의 생합성에도 이용되는 물질이다. 본 출원의 미생물은 테트라테르펜 생산 경로에서 생성되는 부산물을 감소시킨 것일 수 있으며, 구체적으로 스쿠알렌 생산을 감소시킨 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 미생물 또는 균주는 자연적으로 제라닐제라닐 피로포스페이트 신타아제 또는 테트라테르펜 생산능을 가지고 있는 미생물, 또는 제라닐제라닐 피로포스페이트 신타아제 또는 테트라테르펜 생산능이 없는 모균주에 본 출원의 변이체 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터)가 도입되거나 및/또는 테트라테르펜, 테트라테르펜의 전구체 또는 테트라테르펜을 전구체로 하는 물질의 생산능이 부여된 미생물일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
일 예로, 본 출원의 미생물 또는 균주는 본 출원의 폴리뉴클레오티드 또는 본 출원의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로 형질 전환되어, 본 출원의 변이체를 발현하는 세포 또는 미생물로서, 본 출원의 목적상 본 출원의 미생물 또는 균주는 본 출원의 변이체를 포함하여 테트라테르펜, 테트라테르펜의 전구체 또는 테트라테르펜을 전구체로 하는 물질을 생산할 수 있는 미생물을 모두 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 출원의 미생물 또는 균주는 천연의 야생형 미생물 또는 테트라테르펜을 생산하는 미생물에 본 출원의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 도입됨으로써 제라닐제라닐 피로포스페이트 신타아제 변이체가 발현되어, 테트라테르펜, 테트라테르펜의 전구체 또는 테트라테르펜을 전구체로 하는 물질의 생산능이 증가된 재조합 균주일 수 있다. 상기 재조합 균주는, 천연의 야생형 미생물 또는 제라닐제라닐 피로포스페이트 신타아제 비변형 미생물 (즉, 야생형 제라닐제라닐 피로포스페이트 신타아제를 발현하는 미생물)에 비하여 테트라테르펜, 테트라테르펜의 전구체 또는 테트라테르펜을 전구체로 하는 물질의 생산능이 증가된 미생물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 예로, 상기 재조합 균주는 변이 전 모균주 또는 비변형 미생물의 테트라테르펜, 테트라테르펜의 전구체 또는 테트라테르펜을 전구체로 하는 물질의 생산능에 비하여 약 1% 이상, 구체적으로는 약 3%, 약 5% 이상 높아진 것일 수 있으나, 변이 전 모균주 또는 비변형 미생물의 생산능에 비해 +값의 증가량을 갖는 한, 이에 제한되지 않는다.
다른 예로, 상기 재조합 균주는 변이 전 모균주 또는 비변형 미생물에 비하여 테트라테르펜 생산 경로에서 생성되는 부산물의 생산량이 약 85% 이하, 약 80% 이하, 약 75% 이하, 약 70% 이하, 약 65% 이하, 약 60% 이하, 약 55% 이하, 약 50% 이하, 약 30% 이하, 또는 약 10% 이하로 낮아진 것일 수 있고, 또는 부산물이 생산되지 않는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 용어 "약(about)"은 ±0.5, ±0.4, ±0.3, ±0.2, ±0.1 등을 모두 포함하는 범위로, 약 이란 용어 뒤에 나오는 수치와 동등하거나 유사한 범위의 수치를 모두 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어, "비변형 미생물"은 미생물에 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이를 포함하는 균주를 제외하는 것이 아니며, 야생형 균주 또는 천연형 균주 자체이거나, 자연적 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 형질이 변화되기 전 균주를 의미할 수 있다. 예를 들어, 상기 비변형 미생물은 본 출원의 제라닐제라닐 피로포스페이트 신타아제 변이체가 도입되지 않거나 도입되기 전의 균주를 의미할 수 있다. 상기 "비변형 미생물"은 "변형 전 균주", "변형 전 미생물", "비변이 균주", "비변형 균주", "비변이 미생물" 또는 "기준 미생물"과 혼용될 수 있다.
일 구현예로, 본 출원의 미생물은 야로위아(Yarrowia sp.) 속 미생물일 수 있고, 구체적으로 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어, 폴리펩티드 활성의 "강화"는, 폴리펩티드의 활성이 내재적 활성에 비하여 증가되는 것을 의미한다. 상기 강화는 활성화(activation), 상향조절(up-regulation), 과발현(overexpression), 증가(increase) 등의 용어와 혼용될 수 있다. 여기서 활성화, 강화, 상향조절, 과발현, 증가는 본래 가지고 있지 않았던 활성을 나타내게 되는 것, 또는 내재적 활성 또는 변형 전 활성에 비하여 향상된 활성을 나타내게 되는 것을 모두 포함할 수 있다. 상기 “내재적 활성"은 자연적 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 형질이 변화하는 경우, 형질 변화 전 모균주 또는 비변형 미생물이 본래 가지고 있던 특정 폴리펩티드의 활성을 의미한다. 이는 "변형 전 활성"과 혼용되어 사용될 수 있다. 폴리펩티드의 활성이 내재적 활성에 비하여 "강화", "상향조절", "과발현" 또는 "증가"한다는 것은, 형질 변화 전 모균주 또는 비변형 미생물이 본래 가지고 있던 특정 폴리펩티드의 활성 및/또는 농도(발현량)에 비하여 향상된 것을 의미한다.
상기 강화는 외래의 폴리펩티드를 도입하거나, 내재적인 폴리펩티드의 활성 강화 및/또는 농도(발현량)를 통해 달성할 수 있다. 상기 폴리펩티드의 활성의 강화 여부는 해당 폴리펩티드의 활성 정도, 발현량 또는 해당 폴리펩티드로부터 배출되는 산물의 양의 증가로부터 확인할 수 있다.
상기 폴리펩티드의 활성의 강화는 당해 분야에 잘 알려진 다양한 방법의 적용이 가능하며, 목적 폴리펩티드의 활성을 변형전 미생물보다 강화시킬 수 있는 한, 제한되지 않는다. 구체적으로, 분자생물학의 일상적 방법인 당업계의 통상의 기술자에게 잘 알려진 유전자 공학 및/또는 단백질 공학을 이용한 것일 수 있으나, 이로 제한되지 않는다(예컨대, Sitnicka et al. Functional Analysis of Genes. Advances in Cell Biology. 2010, Vol. 2. 1-16, Sambrook et al. Molecular Cloning 2012 등).
구체적으로, 본 출원의 폴리펩티드의 강화는
1) 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 세포 내 카피수 증가;
2) 폴리펩티드를 코딩하는 염색체상의 유전자 발현조절영역을 활성이 강력한 서열로 교체;
3) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 전사체의 개시코돈 또는 5'-UTR 지역을 코딩하는 염기서열의 변형;
4) 폴리펩티드 활성이 강화되도록 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열의 변형;
5) 폴리펩티드 활성이 강화도록 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 변형 (예를 들어, 폴리펩티드의 활성이 강화되도록 변형된 폴리펩티드를 코딩하도록 상기 폴리펩티드 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열의 변형);
6) 폴리펩티드의 활성을 나타내는 외래 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 외래 폴리뉴클레오티드의 도입;
7) 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 코돈 최적화;
8) 폴리펩티드의 삼차구조를 분석하여 노출 부위를 선택하여 변형하거나 화학적으로 수식; 또는
9) 상기 1) 내지 8) 중 선택된 2 이상의 조합일 수 있으나, 이에, 특별히 제한되는 것은 아니다.
보다 구체적으로,
상기 1) 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 세포 내 카피수 증가는, 해당 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 작동가능하게 연결된, 숙주와 무관하게 복제되고 기능할 수 있는 벡터의 숙주세포 내로의 도입에 의해 달성되는 것일 수 있다. 또는, 해당 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 숙주세포 내의 염색체 내에 1 카피 또는 2 카피 이상 도입에 의해 달성되는 것일 수 있다. 상기 염색체 내에 도입은 숙주세포 내의 염색체 내로 상기 폴리뉴클레오티드를 삽입시킬 수 있는 벡터가 숙주세포 내에 도입됨으로써 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 벡터는 전술한 바와 같다.
상기 2) 폴리펩티드를 코딩하는 염색체상의 유전자 발현조절영역(또는 발현조절서열)을 활성이 강력한 서열로 교체는, 예를 들면, 상기 발현조절영역의 활성을 더욱 강화하도록 결실, 삽입, 비보존적 또는 보존적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이 발생, 또는 더욱 강한 활성을 가지는 서열로의 교체일 수 있다. 상기 발현조절영역은, 특별히 이에 제한되지 않으나 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 그리고 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열 등을 포함할 수 있다. 일 예로, 본래의 프로모터를 강력한 프로모터로 교체시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
공지된 강력한 프로모터의 예에는 cj1 내지 cj7 프로모터(미국등록특허 US 7662943 B2), lac 프로모터, trp 프로모터, trc 프로모터, tac 프로모터, 람다 파아지 PR 프로모터, PL 프로모터, tet 프로모터, gapA 프로모터, SPL7 프로모터, SPL13(sm3) 프로모터(미국등록특허 US 10584338 B2), O2 프로모터(미국등록특허 US 10273491 B2), tkt 프로모터, yccA 프로모터 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 3) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 전사체의 개시코돈 또는 5'-UTR 지역을 코딩하는 염기서열 변형은, 예를 들면, 내재적 개시코돈에 비해 폴리펩티드 발현율이 더 높은 다른 개시코돈을 코딩하는 염기 서열로 치환하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 4) 및 5)의 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열의 변형은, 폴리펩티드의 활성을 강화하도록 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열 또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 결실, 삽입, 비보존적 또는 보존적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이 발생, 또는 더욱 강한 활성을 갖도록 개량된 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 활성이 증가하도록 개량된 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열로의 교체일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 교체는 구체적으로 상동재조합에 의하여 폴리뉴클레오티드를 염색체내로 삽입함으로써 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이때 사용되는 벡터는 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커 (selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 선별 마커는 전술한 바와 같다.
상기 6) 폴리펩티드의 활성을 나타내는 외래 폴리뉴클레오티드의 도입은, 상기 폴리펩티드와 동일/유사한 활성을 나타내는 폴리펩티드를 코딩하는 외래 폴리뉴클레오티드의 숙주세포 내 도입일 수 있다. 상기 외래 폴리뉴클레오티드는 상기 폴리펩티드와 동일/유사한 활성을 나타내는 한 그 유래나 서열에 제한이 없다. 상기 도입에 이용되는 방법은 공지된 형질전환 방법을 당업자가 적절히 선택하여 수행될 수 있으며, 숙주 세포 내에서 상기 도입된 폴리뉴클레오티드가 발현됨으로써 폴리펩티드가 생성되어 그 활성이 증가될 수 있다.
상기 7) 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 코돈 최적화는, 내재 폴리뉴클레오티드가 숙주세포 내에서 전사 또는 번역이 증가하도록 코돈 최적화한 것이거나, 또는 외래 폴리뉴클레오티드가 숙주세포 내에서 최적화된 전사, 번역이 이루어지도록 이의 코돈을 최적화한 것일 수 있다.
상기 8) 폴리펩티드의 삼차구조를 분석하여 노출 부위를 선택하여 변형하거나 화학적으로 수식하는 것은, 예를 들어 분석하고자 하는 폴리펩티드의 서열정보를 기지 단백질들의 서열정보가 저장된 데이터베이스와 비교함으로써 서열의 유사성 정도에 따라 주형 단백질 후보를 결정하고 이를 토대로 구조를 확인하여, 변형하거나 화학적으로 수식할 노출 부위를 선택하여 변형 또는 수식하는 것일 수 있다.
이와 같은 폴리펩티드 활성의 강화는, 상응하는 폴리펩티드의 활성 또는 농도 발현량가 야생형이나 변형 전 미생물 균주에서 발현된 폴리펩티드의 활성 또는 농도를 기준으로 하여 증가되거나, 해당 폴리펩티드로부터 생산되는 산물의 양의 증가되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원의 미생물에서 폴리뉴클레오티드의 일부 또는 전체의 변형은 (a) 미생물 내 염색체 삽입용 벡터를 이용한 상동 재조합 또는 유전자가위 (engineered nuclease, e.g., CRISPR-Cas9)을 이용한 유전체 교정 및/또는 (b) 자외선 및 방사선 등과 같은 빛 및/또는 화학물질 처리에 의해 유도될 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 상기 유전자 일부 또는 전체의 변형 방법에는 DNA 재조합 기술에 의한 방법이 포함될 수 있다. 예를 들면, 목적 유전자와 상동성이 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열 또는 벡터를 상기 미생물에 주입하여 상동 재조합(homologous recombination)이 일어나게 함으로써 유전자 일부 또는 전체의 결손이 이루어질 수 있다. 상기 주입되는 뉴클레오티드 서열 또는 벡터는 우성 선별 마커를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원의 또 다른 하나의 양태는 본 출원의 변이체; 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 중 어느 하나 이상을 포함하는, 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 테트라테르펜, 테트라테르펜의 전구체, 또는 테트라테르펜을 전구체로 하는 물질 생산 방법을 제공한다. 상기 테트라테르펜, 테트라테르펜의 전구체, 또는 테트라테르펜을 전구체로 하는 물질 생산 방법은 스쿠알렌 생산을 감소시키는 방법일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서, 용어 "배양"은 본 출원의 미생물을 적당히 조절된 환경 조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 출원의 배양과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 선택되는 균주에 따라 당업자가 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 구체적으로 상기 배양은 회분식, 연속식 및/또는 유가식일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원에서 용어, "배지"는 본 출원의 미생물을 배양하기 위해 필요로 하는 영양물질을 주성분으로 혼합한 물질을 의미하며, 생존 및 발육에 불가결한 물을 비롯하여 영양물질 및 발육인자 등을 공급한다. 구체적으로, 본 출원의 미생물의 배양에 사용되는 배지 및 기타 배양 조건은 통상의 미생물의 배양에 사용되는 배지라면 특별한 제한 없이 어느 것이나 사용할 수 있으나, 본 출원의 미생물을 적당한 탄소원, 질소원, 인원, 무기화합물, 아미노산 및/또는 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 배양할 수 있다.
본 출원에서 상기 탄소원으로는 글루코오스, 사카로오스, 락토오스, 프룩토오스, 수크로오스, 말토오스 등과 같은 탄수화물; 만니톨, 소르비톨 등과 같은 당 알코올, 피루브산, 락트산, 시트르산 등과 같은 유기산; 글루탐산, 메티오닌, 리신 등과 같은 아미노산 등이 포함될 수 있다. 또한, 전분 가수분해물, 당밀, 블랙스트랩 당밀, 쌀겨울, 카사버, 사탕수수 찌꺼기 및 옥수수 침지액 같은 천연의 유기 영양원을 사용할 수 있으며, 구체적으로는 글루코오스 및 살균된 전처리 당밀(즉, 환원당으로 전환된 당밀) 등과 같은 탄수화물이 사용될 수 있으며, 그 외의 적정량의 탄소원을 제한 없이 다양하게 이용할 수 있다. 이들 탄소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 질산암모늄 등과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민 등과 같은 아미노산, 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해 생성물 등과 같은 유기 질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 인원으로는 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨, 또는 이에 대응되는 소디움-함유 염 등이 포함될 수 있다. 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간, 탄산칼슘 등이 사용될 수 있으며, 그 외에 아미노산, 비타민 및/또는 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다. 이들 구성성분 또는 전구체는 배지에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다. 그러나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 출원의 미생물의 배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산, 황산 등과 같은 화합물을 배지에 적절한 방식으로 첨가하여, 배지의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한, 배지의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배지 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입 없이 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 출원의 배양에서 배양온도는 20 내지 45℃ 구체적으로는 25 내지 40℃, 20 내지 35℃, 또는 25 내지 35℃를 유지할 수 있고, 약 10 내지 160 시간 동안 배양할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 출원의 배양에 의하여 생산된 테트라테르펜, 테트라테르펜의 전구체 또는 테트라테르펜을 전구체로 하는 물질은 배지 중으로 분비되거나 세포 내에 잔류할 수 있다.
본 출원의 테트라테르펜, 테트라테르펜의 전구체 또는 테트라테르펜을 전구체로 하는 물질 생산방법은, 본 출원의 미생물을 준비하는 단계, 상기 균주를 배양하기 위한 배지를 준비하는 단계, 또는 이들의 조합(순서에 무관, in any order)을, 예를 들어, 상기 배양하는 단계 이전에, 추가로 포함할 수 있다.
본 출원의 테트라테르펜, 테트라테르펜의 전구체 또는 테트라테르펜을 전구체로 하는 물질 생산방법은, 상기 배양에 따른 배지(배양이 수행된 배지) 또는 본 출원의 미생물로부터 테트라테르펜, 테트라테르펜의 전구체 또는 테트라테르펜을 전구체로 하는 물질을 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 회수하는 단계는 상기 배양하는 단계 이후에 추가로 포함될 수 있다.
상기 회수는 본 출원의 미생물의 배양 방법, 예를 들어 회분식, 연속식 또는 유가식 배양 방법 등에 따라 당해 기술 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 목적하는 테트라테르펜, 테트라테르펜의 전구체 또는 테트라테르펜을 전구체로 하는 물질을 수집(collect)하는 것일 수 있다. 예를 들어, 원심분리, 여과, 결정화 단백질 침전제에 의한 처리(염석법), 추출, 세포 파쇄, 초음파 파쇄, 한외여과, 투석법, 분자체 크로마토그래피(겔여과), 흡착크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피 등의 각종 크로마토그래피, HPLC 또는 이들의 방법을 조합하여 사용될 수 있으며, 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배지 또는 미생물로부터 목적하는 테트라테르펜, 테트라테르펜의 전구체 또는 테트라테르펜을 전구체로 하는 물질을 회수할 수 있다.
또한, 본 출원의 테트라테르펜, 테트라테르펜의 전구체 또는 테트라테르펜을 전구체로 하는 물질 생산방법은, 추가적으로 정제 단계를 포함할 수 있다. 상기 정제는 당해 기술분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여, 수행할 수 있다. 일 예에서, 본 출원의 테트라테르펜, 테트라테르펜의 전구체 또는 테트라테르펜을 전구체로 하는 물질 생산방법이 회수 단계와 정제 단계를 모두 포함하는 경우, 상기 회수 단계와 정제 단계는 순서에 상관없이 이시적(또는 연속적)으로 수행되거나, 동시에 또는 하나의 단계로 통합되어 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원의 테트라테르펜을 전구체로 하는 물질의 생산방법은 테트라테르펜을 테트라테르펜을 전구체로 하는 물질로 전환하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 본 출원의 테트라테르펜을 전구체로 하는 물질의 생산방법에 있어서, 상기 전환하는 단계는 상기 배양하는 단계 또는 상기 회수하는 단계 이후에 추가로 포함될 수 있다. 상기 전환하는 단게는 당해 기술분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 예컨대, 상기 전환은 베타-카로틴 15,15'-옥시게네이즈 또는 레티놀 탈수소효소(retinol dehydrogenase)를 이용하여 수행할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 변이체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 미생물, 테트라테르펜, 테트라테르펜의 전구체 및 테트라테르펜을 전구체로 하는 물질 등은 전술한 바와 같다.
본 출원의 또 다른 하나의 양태는 본 출원의 변이체; 본 출원의 벡터; 본 출원의 변이체, 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터 또는 본 출원의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 미생물; 이를 배양한 배지; 또는 이들 중 2 이상의 조합을 포함하는 테트라테르펜, 테트라테르펜의 전구체 및 테트라테르펜을 전구체로 하는 물질 생산용 조성물을 제공하는 것이다.
본 출원의 조성물은 테트라테르펜, 테트라테르펜의 전구체 및 테트라테르펜을 전구체로 하는 물질 생산용 조성물에 통상 사용되는 임의의 적합한 부형제를 추가로 포함할 수 있으며, 이러한 부형제는, 예를 들어 보존제, 습윤제, 분산제, 현탁화제, 완충제, 안정화제 또는 등장화제 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 변이체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 미생물, 배지, 테트라테르펜, 테트라테르펜의 전구체, 및 테트라테르펜을 전구체로 하는 물질 등은 전술한 바와 같다.
본 출원의 또 다른 하나의 양태는 본 출원의 변이체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 및 미생물 중 어느 하나 이상의 테트라테르펜, 테트라테르펜의 전구체 및 테트라테르펜을 전구체로 하는 물질 생산 용도를 제공한다.
상기 변이체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 미생물, 테트라테르펜, 테트라테르펜의 전구체 및 테트라테르펜을 전구체로 하는 물질 등은 전술한 바와 같다.
이하 본 출원을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예 및 실험예는 본 출원을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 출원의 범위가 이들 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. GGS1 변이 벡터 라이브러리 구축
야로위아 리폴리티카(Yarrowia lioplytica) 염색체 상에서 제라닐제라닐 피로포스페이트 신타아제를 코딩하는 GGS1 유전자를 증폭하기 위해, KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)에 등록되어 있는 염기서열에 근거하여 GGS1(YALI0D17050)의 서열번호 1의 아미노산 및 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드 서열을 확보하였다. Error-prone PCR(ep-PCR)을 통해 임의의(random) 변이를 유도하기 위해서 diversify PCR random mutagenesis kit(Takara 社)를 사용하였다. PCR 조건 및 방법은 최적화를 통해 사용자 메뉴얼(user manual)의 buffer 조건 1 및 buffer 조건 2로 각각 진행하였다. 구체적인 Error-prone PCR 조건은 하기 표 1에 나타내었다.
Buffer 조건 1 Buffer 조건 2
PCR grade water 40 ㎕ 39 ㎕
10X Titanium Taq buffer 5 ㎕ 5 ㎕
MnSO4 0 ㎕ 1 ㎕
dGTP 1 ㎕ 1 ㎕
50X Diversify dNTP Mix 1 ㎕ 1 ㎕
Primer mix 1 ㎕ 1 ㎕
Template DNA 1 ㎕ 1 ㎕
Titanium Taq polymerase 1 ㎕ 1 ㎕
야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) PO1f 게놈 DNA를 주형으로 하고 서열번호 19와 서열번호 20의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 조건으로, 변성 95°C, 1분; 어닐링 55°C, 1분; 및 중합반응 68°C, 1분을 32회 반복 수행하였다. PCR로 증폭된 2 가지 조건의 GGS1 PCR 산물을 혼합하여 pIMR53-EXP1p-CYC1t 벡터 기반 GGS1 변이체 발현 벡터 라이브러리를 제작하였다.
pIMR53-EXP1p-CYC1t 벡터는 하기와 같은 방법으로 제작되었다. EXP1p를 증폭하기 위해 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) PO1f 게놈 DNA를 주형으로 하고 서열번호 21와 서열번호 22의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였고, CYC1t 터미네이터를 증폭하기 위해 사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyce cerevisiae) 게놈 DNA를 주형으로 하고 서열번호 23과 서열번호 24 의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 조건으로, 변성 95°C, 1분; 어닐링 55°C, 1분; 및 중합반응 68°C, 1분을 32회 반복 수행하였다. 추가적으로 pIMR53 벡터를 주형으로 하고 서열번호 25와 서열번호 26의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 조건으로, 변성 95°C, 1분; 어닐링 55°C, 1분; 및 중합반응 68°C, 5분을 32회 반복 수행하였다.
그 결과 6,774bp의 linearized pIMR53, 1,050bp의 EXP1p, 그리고 289bp의 CYC1t을 얻었다. PCR로 증폭된 상기 EXP1p 및 CYC1t DNA 단편은 Infusion 클로닝 키트(Invitrogen)를 사용하여 pIMR53 벡터에 접합한 후 대장균 DH5α에 형질전환하고, 30 mg/L의 앰피실린이 포함된 LB 고체배지에 도말하였다. PCR을 통해 목적한 EXP1p 프로모터와 CYC1t 터미네이터가 삽입된 플라스미드로 형질 전환된 콜로니를 선별한 후, 통상적으로 알려진 플라스미드 추출법을 이용하여 플라스미드를 획득하였고, 이 플라스미드를 pIMR53-EXP1p-CYC1t이라 명명하였다.
실시예 2. 베타카로틴 생산용 Yarrowia lipolytica 플랫폼 균주 제작
실시예 2-1. X. dendrorhous 유래 crtYB-crtI 삽입주 제작
베타카로틴 생산을 위한 플랫폼 균주 제작을 위해 고지방 효모인 Yarrowia lipolytica CC08-0125(기탁번호 KCCM12972P) 균주의 게놈에 Xanthophyllomyces dendrorhous 유래 lycopene cyclase/phytoene synthase (crtYB)와 phytoene desaturase(crtI) 유전자를 삽입하였다. crtYB는 NCBI(National Center for Biotechnology Information Search database)에 등록되어 있는 염기서열(GenBank: AY177204.1)에 근거하여 서열번호 27의 폴리뉴클레오티드를 확보하였고, crtI는 NCBI에 등록되어 있는 염기서열(GenBank: AY177424.1)에 근거하여 서열번호 28의 폴리뉴클레오티드를 확보하였다. crtYB와 crtI의 폴리뉴클레오티드 서열은 마크로젠社를 통해 TEFINtp-crtYB-CYC1t(서열번호 29), TEFINtp-crtI-CYC1t(서열번호 30)의 형태로 유전자를 합성하였으며, 선별 마커로는 Y. lipolytica 의 URA3 유전자(서열번호 31)를 이용하여 MHY1(YALI0B21582g) 유전자 위치에 삽입되는 카세트를 디자인 하였다. 합성된 crtYB, crtI 유전자 및 KCCM12972P 게놈 DNA를 주형으로 하고 서열번호 32 및 서열번호 33, 서열번호 34 및 서열번호 35, 서열번호 36 및 서열번호 37, 서열번호 38 및 서열번호 39, 서열번호 40 및 서열번호 41, 서열번호 42 및 서열번호 43의 프라이머를 이용하여 각각의 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 변성 95°C, 1분; 어닐링 55°C, 1분; 및 중합반응 72°C, 3분 30초를 35회 반복 수행하였다. 그 결과로 얻어진 5개의 DNA 단편은 overlap extension PCR을 통해 하나의 카세트로 제작되었다.
이렇게 제작된 카세트를 열충격법 (D.-C. Chen et al., Appl Microbiol Biotechnol, 1997) 으로 KCCM12972P 균주에 도입한 후, uracil이 포함되지 않은 고체배지(YLMM1)에서 형성된 콜로니를 획득하였다. 서열번호 44 및 서열번호 45의 프라이머를 이용하여 게놈 내에 카세트 삽입이 확인된 콜로니들을 5-FOA 고체배지에 spotting하여 30°C에서 3일간 배양하였고, 5-FOA 고체 배지에서 자란 콜로니를 획득함으로써 URA3 마커를 회수하였다.
실시예 2-2. HMGR 강화주 제작
앞서 실시예 2-1에서 제작된 crtYB, crtI 유전자가 삽입된 균주의 하이드록시메틸글루타릴 리덕테이즈(3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase, HMGR)유전자의 native 프로모터(서열번호 46) 부위를 TEFINt 프로모터로 교체하기 위한 카세트를 디자인하였고, KCCM12972P 게놈 DNA를 주형으로 하고 서열번호 47 및 서열번호 48, 서열번호 49 및 서열번호 50, 서열번호 51 및 서열번호 52, 서열번호 53 및 서열번호 54, 서열번호 55 및 서열번호 56의 프라이머를 이용하여 각각의 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 변성 95°C, 1분; 어닐링 55°C, 1분; 및 중합반응 72°C, 1분 30초를 35회 반복 수행하였다. 그 결과로 얻어진 5개의 DNA 단편은 overlap extension PCR을 통해 하나의 카세트로 제작되었다.
이렇게 제작된 카세트를 열충격법으로 실시예 2-1에서 제작한 균주에 도입한 후, uracil이 포함되지 않은 고체배지(YLMM1)에서 형성된 콜로니를 획득하였다. 서열번호 57 및 서열번호 58의 프라이머를 이용하여 카세트 삽입이 확인된 콜로니들을 5-FOA 고체배지에 spotting하여 30°C에서 3일간 배양하였고, 5-FOA 고체 배지에서 자란 콜로니를 획득함으로써 URA3 마커를 회수하였다. 최종적으로 제작된 베타카로틴 생산 플랫폼 균주를 CC08-1023으로 명명하였다.
< Yarrowia lipolytica minimal media1 (YLMM1)>
포도당 20 g/L, 아미노산을 포함하지 않는 효모 질소 염기(Yeast nitrogen base without amino acids) 6.7 g/L, 우라실을 포함하지 않는 효모 합성 드롭 아웃 배지 보충물 (Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements without uracil) 2 g/L, 한천(agar) 15 g/L
<5-Fluoroorotic Acid (5-FOA)>
포도당 20 g/L, 아미노산을 포함하지 않는 효모 질소 염기(Yeast nitrogen base without amino acids) 6.7 g/L, 우라실을 포함하지 않는 효모 합성 드롭 아웃 배지 보충물 (Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements without uracil) 2 g/L, 우라실(Uracil) 50 μg/mL, 5-플루오로 오로틴산(5-Fluoroorotic acid; 5-FOA) 1 g/L, 한천(agar) 15 g/L
실시예 3. GGS1 활성 강화주 1차 선별
GGS1 활성 강화주의 1차 선별을 위해, 색깔 기반 1차 선별을 진행하였다.
우선, 베타카로틴을 소량 생산하는 Yarrowia lipolytica CC08-1023 균주에, pIMR53(negative control; NC), pIMR53-EXP1p-GGS1(야생형, 서열번호 2)-CYC1t 벡터(positive control; PC), 및 실시예 1에서 구축된 GGS1 random 변이체 발현 벡터 라이브러리를 열 충격법(heat-shock)으로 형질 전환하였다. 이후, 우라실(uracil)이 포함되지 않은 고체배지에서 형성된 콜로니를 획득하였다.
96 deep-well plate 25 판에 우라실이 포함되지 않은 YLMM2 (Yarrowia lipolytica minimal media 2) 액체배지를 350 ㎕씩 분주하고, 획득한 콜로니들을 접종하여 30℃에서 48시간 동안 배양하였다. 이후, 우라실이 포함되지 않은 YLMM1 고체배지에 접종하여 30℃에서 3일간 배양하였으며, 배양 종료 후에 총 2,400 종의 균주 중에서 positive control (CC08-1023/pIMR53-EXP1p-GGS1-CYC1t)벡터로 형질전환된 균주 대비 색깔이 짙은 주황색 균주 36 종을 1차 선별하였다. 전술한 YLMM2의 제조방법 및 조성은 하기와 같다.
<YLMM2 (pH 7.2)>
포도당 40 g/L, 아미노산 및 암모늄 설페이트가 없는 효모 질소 염기(Yeast nitrogen base without amino acids and ammonium sulfate) 1.7 g/L, 우라실(Uracil) 0.5 g/L, 암모늄 설페이트(Ammonium sulfate) 2.5 g/L를 0.1 M 포스페이트 완충액(sodium phosphate buffer)(pH 7.2)에 용해.
실시예 4. GGS1 활성 강화주 2차 선별
GGS1 활성 강화주의 2차 선별을 위해, 실시예 3에서 1차로 선별된 36종에 대한 플라스크 평가를 진행하였다.
우라실이 포함되지 않은 YLMM2(Yarrowia lipolytica minimal media 2) 50 ㎖를 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에, 상기 36종의 균주 및 PC(positive control) 벡터로 형질 전환된 균주를 초기 OD가 1이 되도록 각각 접종하고, 30℃에서 48시간 동안 250 rpm에서 진탕 배양하였다.
배양 종료 후, 배양액 1 ㎖을 원심 분리하여 상등액을 제거하였다. 다음으로, DMSO(Dimethyl sulfoxide, sigma 社) 0.5 ㎖을 첨가하고, 55℃에서 10분동안 2000rpm에서 진탕하여 셀을 파쇄하였다. 추가적으로, 아세톤(sigma 社) 0.5 ㎖를 첨가하고 45℃에서 15분동안 2000rpm에서 진탕하여 베타카로틴과 스쿠알렌을 추출하였다. 추출된 물질은 HPLC 설비로 농도를 분석하였다. 선별주의 플라스크 평가 결과, OD, 베타카로틴 및 스쿠알렌의 농도 및 함량 측정 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
Numb. OD β-carotene(mg/L) Squalene(mg/L) β-carotene(%) Squalene(%)
PC 60 38 248 0.25 1.66
1 59 54 154 0.36 1.04
2 61 35 214 0.23 1.41
3 65 62 212 0.38 1.32
4 50 30 102 0.24 0.82
5 62 61 194 0.39 1.24
6 62 55 282 0.36 1.83
7 55 46 173 0.33 1.27
8 48 40 180 0.34 1.52
9 56 34 132 0.25 0.95
10 50 46 185 0.36 1.48
11 51 41 120 0.33 0.94
12 62 52 218 0.34 1.42
13 63 57 210 0.37 1.34
14 59 53 230 0.36 1.57
15 58 57 185 0.39 1.29
16 53 40 219 0.31 1.66
17 60 60 121 0.40 0.81
18 59 53 206 0.36 1.40
19 62 50 207 0.32 1.33
20 62 59 189 0.38 1.22
21 60 69 108 0.46 0.72
22 59 60 148 0.41 1.00
23 62 58 134 0.37 0.86
24 60 57 198 0.38 1.33
25 64 48 214 0.30 1.33
26 67 56 228 0.34 1.37
27 59 47 214 0.32 1.45
28 61 35 183 0.23 1.20
29 60 51 219 0.34 1.45
30 59 48 201 0.33 1.38
31 64 61 198 0.38 1.23
32 65 66 169 0.40 1.04
33 59 47 206 0.32 1.40
34 62 51 238 0.32 1.53
35 53 37 189 0.28 1.42
36 61 53 225 0.35 1.47
이후, 평가 시료로부터 추출된 베타카로틴과 스쿠알렌 농도를 DCW(g/L)로 나눈 값을 2차 선별을 위한 기준으로 이용하였다. No. 2, No. 4, No. 9, 및 No. 28 균주를 제외한 33종 평가 균주에서, 베타카로틴 농도를 DCW(g/L)로 나눈 값(β-carotene (%))이 PC(positive control) 대비 증가함을 확인되었다. 스쿠알렌 농도를 DCW(g/L)로 나눈 값은 모든 평가 균주에서 PC(positive control) 대비 감소함을 확인되었다.
따라서, PC(positive control)로부터 계산된 값을 기반으로 기준값을 설정하고 두 조건 모두에 해당되는 균주를 선별하였으며, 조건 1과 조건 2를 동시에 해당되는 후보군 총 4종을 선별하였다. 상기 2차 선별 기준 값과 2차 선별 후보 4종은 하기 표 3에 나타내었다.
조건 기준 선별 결과(플라스크 번호) 비고
#1 베타카로틴 함량(%) ≥ 0.38 3, 5, 15, 17, 20, 21, 22, 24, 31, 32 GGS1(PC)=0.25
#2 스쿠알렌 함량(%) < 1.05 2, 4, 9, 11, 17, 21, 22, 23, 32 GGS1(PC)=1.66
조건 1 + 조건 2 17, 21, 22, 32 　
선별된 4종의 균주에서 형질 전환된 플라스미드를 추출하여 GGS1 ORF에 위치한 random 변이를 확인하기 위한 서열분석을 진행하였다. Zymoprep yeast plasmid miniprep kit 2(Zymo research 社)를 사용하여 선별된 균주로부터 형질 전환된 GGS1 플라스미드를 추출하고 서열분석의 신뢰도를 높이기 위해 서열번호 59와 서열번호 60의 프라이머를 사용하여 양방향으로 서열분석을 진행하였다. GGS1 ORF 서열 분석 결과 확인된 아미노산 변이는 하기 표 4에 나타내었으며, 4종 후보군은 하기 표 4 중 1개 또는 2개의 돌연변이를 포함하는 것으로 확인되었다.
변이주 플라스크 번호. Genotype
17 GGS1(I122V, R141K)
21 GGS1(N29T, L90R)
22 GGS1(M103I)
32 GGS1(F43I)
실시예 5. GGS1 선별 변이체 활성 검증
실시예 3 및 실시예 4에서 선별된 GGS1 변이체의 활성 검증 실험을 진행하였다.
이를 위하여, NC(negative control) 및 PC(positive control) 벡터 및 실시예 4에서 선별된 변이체 4종(M103I 변이체, F43I 변이체, N29T 및 L90R 변이체, 및 I122V 및 R141K 변이체), 및 관련 단독 변이체 4종(N29T 변이체, L90R 변이체, I122V 변이체, 및 R141K 변이체) 발현 벡터를 형질 전환하여 제작한 총 10종 균주의 플라스크 평가를 진행하였다.
단독 변이체 4종(N29T 변이체, L90R 변이체, I122V 변이체, 및 R141K 변이체) 각각의 발현 벡터 제작방법은 하기와 같다. 단독 변이체 4종(N29T 변이체, L90R 변이체, I122V 변이체, 및 R141K 변이체) DNA 절편을 확보하기 위해 야생형 GGS1 서열을 포함하는 pIMR53-EXP1p-GGS1-CYC1t 벡터를 주형으로 서열번호 61와 서열번호 62, 서열번호 63과 서열번호 64, 서열번호 65와 서열번호 66, 서열번호 67과 서열번호 68의 프라이머를 이용하여 각각 PCR을 수행하였다. PCR 조건으로, 변성 95°C, 1분; 어닐링 55°C, 1분; 및 중합반응 68°C, 5분을 32회 반복 수행하였다. 이중 변이체인 N29T 및 L90R 변이체, 또는 I122V 및 R141K 변이체의 발현 벡터는 각각 상기에서 제작된 N29T 발현 벡터 또는 I122V 발현 벡터를 주형으로 하여 서열번호 63과 서열번호 64의 프라이머 또는 서열번호 67과 서열번호 68의 프라이머를 이용하여 동일하게 PCR을 수행하여 제작하였다.
그 결과, PCR로 증폭된 상기 변이체가 도입된 DNA는 Infusion 클로닝 키트(Invitrogen)를 사용해 대장균 DH5α에 형질전환하고, 30 mg/L의 앰피실린이 포함된 LB 고체배지에 도말하였다. 형질전환된 GGS1 변이체 4종 벡터가 삽입된 플라스미드로 형질전환된 콜로니를 선별한 후, 통상적으로 알려진 플라스미드 추출법을 이용하여 플라스미드를 획득하였고, 서열번호 59와 서열번호 60를 사용하여 변이체 서열을 확인하였다.
구체적으로, 우라실이 포함되지 않은 YLMM2(Yarrowia lipolytica minimal media 2) 50 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에, 상기 10종의 균주를 초기 OD가 1이 되도록 접종하고, 30℃에서 48시간 동안, 250 rpm으로 진탕 배양하였다.
배양 종료 후, 배양액 1 ㎖을 원심 분리하여 상등액을 제거하였다. 그 후, DMSO(Dimethyl sulfoxide, sigma 社) 0.5 ㎖을 첨가하고 55℃에서 10분동안 2000rpm에서 진탕하여 셀을 파쇄하였다. 추가적으로, 아세톤 (sigma社) 0.5 ㎖을 첨가하고 45℃에서 15분동안 2000rpm에서 진탕하여 베타카로틴 및 스쿠알렌을 추출하였고, HPLC 설비로 농도를 분석하였다. 분석된 OD, 베타카로틴 및 스쿠알렌의 농도 및 함량을 측정한 결과는 하기 표 5에 나타내었다.
Genotype OD β-carotene
(mg/L)		 Squalene
(mg/L)		 β-carotene
(%)		 Squalene
(%)
NC 62 5 208 0.03 1.34
PC 56 30 133 0.21 0.95
M103I 62 59 91 0.38 0.59
F43I 63 69 71 0.44 0.45
N29T/L90R 64 67 89 0.42 0.56
N29T 61 55 88 0.36 0.58
L90R 64 58 90 0.36 0.56
I122V/R141K 62 62 65 0.40 0.42
I122V 57 43 118 0.30 0.83
R141K 59 44 111 0.30 0.75
상기 표 5에 나타난 바와 같이, PC(positive control) 대비 선별된 M103I, F43I, N29T, L90R, I122V, 및/또는 R141K 변이가 적용된 GGS1 변이체 모두에서 베타카로틴 농도가 143 내지 230% 증가하고 스쿠알렌 농도는 11 내지 51% 감소하는 것을 확인하였다. 결과적으로, 단독 변이체를 도입한 6종의 균주 중에서는 F43I 변이체를 도입한 균주의 효과가 가장 우수하였으며, I122V 및 R141K 변이체의 경우, 두 변이체 단독 적용에 비해 동시 적용할 때 베타카로틴 농도 증가 및 스쿠알렌 생산량감소 효과가 더욱 증가됨을 확인하였다. 또한 N29T 및 L90R 변이체에서는 두 변이체 단독 적용에 비해 동시 적용할 때 스쿠알렌 생산 감소 효과가 더욱 증가됨을 확인하였다.
실시예 6. GGS1 변이체 도입주 제작 및 평가
앞선 실시예를 통해 가장 우수하다고 판단된 GGS1 F43I 변이체가 실제 균주 내 도입되었을 때의 효과를 검증하고자 하였다.
이를 위하여, CC08-1023을 기반으로 GGS1 유전자의 프로모터가 교체된 균주(CC08-1214) 및 GGS1 43번째 페닐알라닌이 이소류신으로 치환된 변이체를 발현하는 균주(CC08-1215)를 순차적으로 제작하였다.
실시예 6-1. GGS1 promoter 치환주("CC08-1214") 제작
야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica) 염색체 상에서 GGS1의 promoter를 TEFINt promoter로 치환할 수 있는 cassette 제작을 위해 KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)에 등록되어 있는 염기서열에 근거하여 TEF1 (YALI0C09141p)의 promoter 및 splicing point를 포함하는 서열번호 69의 폴리뉴클레오티드 서열을 확보하였다. 또한, GGS1의 promoter 치환을 위해 GGS1(YALI0D17050g)의 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드 서열을 확보하였다. Yarrowia lipolytica PO1f 게놈 DNA를 주형으로 하여 서열번호 70과 서열번호 71, 서열번호 72와 서열번호 73, 서열번호 74와 서열번호 75, 및 서열번호 76과 서열번호 77의 프라이머를 이용하여 각각 PCR을 수행하였다. 그리고 URA3 auxotrophic marker를 주형으로 하여 서열번호 78과 서열번호 79의 프라이머를 사용해 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 변성 95℃, 1분; 어닐링 55℃, 1분; 및 중합반응 72℃, 1분 30초를 35회 반복 수행하였다.
그 결과, 1500bp의 5'UTR arm, 531bp의 5'UTR_RP, 1500bp의 GGS1 arm 그리고 1533bp의 URA3를 얻었다. PCR로 증폭된 DNA 단편은 overlap extension PCR을 통해 하나의 GGS1 promoter 교체 cassette로 제작되었으며, cassette design은 5'UTR arm-TEFINt-URA3-TEFINt-GGS1 arm의 순서로 이루어졌다.
GGS1 promoter 교체 cassette를 CC08-1023에 열충격법(heat-shock)으로 형질전환하고, uracil이 포함되지 않은 YLMM1 고체배지에서 선별하였다. 선별된 1차 균주는 다시 2차 교차를 거쳐 최종적으로 GGS1 유전자 의 promoter가 TEFINt promoter로 교체된 균주를 제작하였다. 이렇게 제작된 균주를 "CC08-1214"라 명명하였다.
실시예 6-2. GGS1(F43I) 변이주("CC08-1215") 제작
야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica) 염색체 상에 GGS1 단백질 F43I 변이체 발현 서열을 도입하기 위해 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드 서열 중 127번째 티민을 아데닌으로 치환하는 cassette를 제작하였다.
구체적으로 Yarrowia lipolytica PO1f 게놈 DNA를 주형으로 하여 서열번호 80과 서열번호 81, 서열번호 82와 서열번호 83, 서열번호 84와 서열번호 85, 서열번호 86과 서열번호 83, 서열번호 84와 서열번호 87, 및 서열번호 90과 서열번호 91 프라이머를 이용하여 각각 PCR을 수행하였다. 그리고 URA3 auxotrophic marker를 주형으로 하여 서열번호 88과 서열번호 89의 프라이머를 사용해 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 변성 95°C, 1분; 어닐링 55°C, 1분; 및 중합반응 72°C, 1분 30초를 35회 반복 수행하였다.
그 결과 1500bp의 5'UTR arm, 661bp의 TEFINt-GGS1_1, 1390bp의 GGS1_2, 661bp의 RP_1, 1390bp의 RP_2, 1500bp의 3'UTR arm 그리고 1533bp의 URA3를 얻었다. PCR로 증폭된 DNA 단편은 overlap extension PCR을 통해 하나의 GGS1 promoter 교체 cassette로 제작되었으며, cassette design은 5'UTR arm- TEFINt-GGS1_1- GGS1_2- RP_1- RP_2-3'UTR arm의 순서로 이루어졌다.
GGS1 (F43I) 변이 교체 cassette를 CC08-1214에 열충격법(heat-shock)으로 형질전환하고, uracil이 포함되지 않은 YLMM1 고체배지에서 선별하였다. 선별된 1차 균주는 다시 2차 교차를 거쳐 최종적으로 GGS1의 43번째 아미노산 잔기가 이소류신으로 교체된 F43I 변이체를 발현하는 균주를 제작하였다. 이렇게 제작된 균주를 "CC08-1215"라 명명하였다.
실시예 6-3. GGS1 변이체 도입주 평가
CC08-1023 를 negative control로 CC08-1214를 positive control로 CC08-1215와 함께 플라스크 평가를 진행하였다.
구체적으로, 우라실이 포함된 YLMM2(Yarrowia lipolytica minimal media 2) 50 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에, 상기 CC08-1215, CC08-1023(negative control), 및 CC08-1214(positive control)를 초기 OD가 1이 되도록 접종하고, 30℃에서 48시간 동안, 250 rpm으로 진탕 배양하였다.
배양 종료 후, 배양액 1 ㎖을 원심 분리하여 상등액을 제거하였다. 그 후, DMSO(Dimethyl sulfoxide, sigma 社) 0.5 ㎖을 첨가하고 55℃에서 10분동안 2000rpm에서 진탕하여 셀을 파쇄하였다. 추가적으로, 아세톤 (sigma社) 0.5 ㎖을 첨가하고 45℃에서 15분동안 2000rpm에서 진탕하여 베타카로틴 및 스쿠알렌을 추출하였고, HPLC 설비로 농도를 분석하였다. 분석된 OD, 베타카로틴 및 스쿠알렌의 농도 및 함량을 측정한 결과는 하기 표 6에 나타내었다.
Genotype OD β-carotene
(mg/L)		 Squalene
(mg/L)		 β-carotene
(%)		 Squalene
(%)
CC08-1023(NC) 46 5 41 0.04 0.36
CC08-1214(PC) 50 32 17 0.26 0.14
CC08-1215 48 49 2 0.41 0.02
상기 표 6에 나타난 바와 같이, CC08-1214(PC) 대비 선별된 F43I 변이가 적용된 CC08-1215 균주에서 베타카로틴 농도가 51.3% 증가하고 스쿠알렌 농도는 88.5% 감소하는 것을 확인하였다. 결과적으로, F43I 단독 변이체를 도입한 효과가 실제 균주에 적용되어도 베타카로틴 농도 증가 및 스쿠알렌 생산량 감소 효과가 있음을 확인하였다.
상기 결과들로부터 본 출원의 GGS1 변이체를 도입할 경우 베타카로틴 생산량을 증가시킬 수 있음을 확인하였다. 또한, GGS1 변이체를 도입하여 베타카로틴 생산과 경쟁경로인 스쿠알렌 합성을 감소시킴으로써, 베타카로틴 생산 효율을 더욱 증가시킬 수 있음을 확인하였다.
또한, 상기 결과들로부터, 베타카로틴 생산과 마찬가지로, GGS1이 관여하는 테트라테르펜류 생산 효율을 더욱 증가시킬 수 있음을 확인하였다.
이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
Figure PCTKR2022008156-appb-img-000001

Claims (16)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 29번, 43번, 90번, 103번, 122번, 및 141번 위치에 상응하는 아미노산 중 어느 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 제라닐제라닐 피로포스페이트 신타아제(Geranylgeranyl pyrophosphate synthase) 변이체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 29번 위치에 상응하는 아미노산이 아스파라긴 외의 아미노산으로 치환; 43번 아미노산에 상응하는 아미노산이 페닐알라닌 외의 아미노산으로 치환; 90번 아미노산에 상응하는 아미노산이 류신 외의 아미노산으로 치환; 103번 아미노산에 상응하는 아미노산이 메티오닌 외의 아미노산으로 치환; 122번 아미노산에 상응하는 아미노산이 이소류신 외의 아미노산으로 치환; 및 141번 아미노산에 상응하는 아미노산이 아르기닌 외의 아미노산으로 치환 중 하나 이상의 치환을 포함하는, 제라닐제라닐 피로포스페이트 신타아제 변이체.
  3. 제1항에 있어서, 다른 아미노산으로의 치환은 비극성(nonpolar) 아미노산, 극성(polar) 아미노산, 또는 양으로 하전된(염기성) 아미노산으로의 치환인 것인, 제라닐제라닐 피로포스페이트 신타아제 변이체.
  4. 제1항에 있어서, 상기 다른 아미노산은 트레오닌(Thr), 이소류신(Ile), 아르기닌(Arg), 발린(Val), 및 라이신(Lys)으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나인 것인, 제라닐제라닐 피로포스페이트 신타아제 변이체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 제라닐제라닐 피로포스페이트 신타아제 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 제라닐제라닐 피로포스페이트 신타아제 변이체 및 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나 이상을 포함하는, 미생물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 미생물은 테트라테르펜, 테트라테르펜의 전구체, 또는 테트라테르펜을 전구체로 하는 물질을 생산하는 것인, 미생물.
  8. 제6항에 있어서, 상기 미생물은 야로위아 속(Yarrowia sp.)인, 미생물.
  9. 제6항에 있어서. 상기 미생물은 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) 인, 미생물.
  10. 제6항에 있어서, 상기 미생물은 베타카로틴, 베타카로틴의 전구체, 또는 베타카로틴을 전구체로 하는 물질을 생산하는 것인, 미생물.
  11. 제6항의 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 테트라테르펜, 테트라테르펜의 전구체, 또는 테트라테르펜을 전구체로 하는 물질 생산 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 방법은 상기 배지 또는 미생물로부터 테트라테르펜, 테트라테르펜의 전구체, 또는 테트라테르펜을 전구체로 하는 물질을 회수하는 단계를 추가로 포함하는, 생산 방법.
  13. 제11항에 있어서, 상기 미생물은 야로위아 속(Yarrowia sp.)인, 생산 방법.
  14. 제11항에 있어서, 상기 방법은 스쿠알렌 생산을 감소시키는 것인, 생산 방법.
  15. 제1항의 변이체, 제6항의 미생물, 또는 상기 미생물의 배양물을 포함하는, 테트라테르펜, 테트라테르펜의 전구체, 또는 테트라테르펜을 전구체로 하는 물질 생산용 조성물.
  16. 서열번호 1의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 29번, 43번, 90번, 103번, 122번, 및 141번 위치에 상응하는 아미노산 중 어느 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 제라닐제라닐 피로포스페이트 신타아제 변이체; 및 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나 이상을 포함하는, 미생물의 테트라테르펜, 테트라테르펜의 전구체, 또는 테트라테르펜을 전구체로 하는 물질 생산 용도.
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