CN103404518A

CN103404518A - 一种防除杂草—紫茎泽兰的靶标及其应用

Info

Publication number: CN103404518A
Application number: CN2013101586006A
Authority: CN
Inventors: 侯玉霞; 张晟瑞; 周思泓; 王平
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2013-05-02
Filing date: 2013-05-02
Publication date: 2013-11-27
Anticipated expiration: 2033-05-02
Also published as: CN103404518B

Abstract

本发明公开了以2-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸生物合成途径的关键酶（2-甲基-D-赤藓糖醇-2,4-环焦磷酸环化酶，EaispF1）作为防除杂草-紫茎泽兰的靶标及其应用。该靶标是如下a)或b)的蛋白：a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)在序列表中序列2的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且与靶标相关的由a）衍生的蛋白。本发明还涉及基于紫茎泽兰EaispF1酶结构设计的活性化合A和B，以及上述化合物的合成方法。

Description

一种防除杂草—紫茎泽兰的靶标及其应用

技术领域

本发明涉及紫茎泽兰的2-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸（MEP）生物合成途径的关键酶（2-甲基-D-赤藓糖醇-2,4-环焦磷酸环化酶）作为防除杂草-紫茎泽兰的靶标及其应用。

背景技术

紫茎泽兰（Eupatorium adenophorum Spreng）为属菊科泽兰属，利用种子有性繁殖，还利用根或茎无性繁殖，依靠强大的根状茎快速扩展蔓延。紫茎泽兰环境适应能力强、具有强的抗逆性和极强的光适应能力。据调查，紫茎泽兰是我国目前危害最为严重的恶性入侵物种之一，名列有国家环保局和国家科学院发布的《中国第一批外来入侵物种名单》之首。紫茎泽兰已在西南地区的云南、贵州、四川、广西等省区定植，侵占农田和林地，与农作物和林木争水、争肥、争阳光、争空间，严重危害了农林业生产。紫茎泽兰严重破坏了生物多样性和生态平衡，抑制了其他植物的生长，泛滥成灾。牲畜误食导致腹泻、脱毛，甚至死亡，仅贵州省草场侵害面积达900万亩，年牧草减产12亿公斤以上，直接经济损失4.8亿元。紫茎泽兰的防治迫在眉睫，急需开发高效、无残留、具有高选择性的化学除草剂。本发明涉及紫茎泽兰的2-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸（MEP）合成途径的关键酶（2-甲基-D-赤藓糖醇-2,4-环焦磷酸环化酶，ispF）作为化学防除紫茎泽兰的靶标,应用于除草剂的研发。

目前，防除杂草-紫茎泽兰的方法主要有化学药剂防治、人工挖除和机械铲除、生物防治、种群替代控制，其中化学防除是防治紫茎泽兰的重要手段。防除紫茎泽兰的除草剂有：草甘膦、嘧磺隆、2,4-D等。草甘膦是通过抑制芳香氨基酸的合成来抑制这些氨基酸所组成蛋白质的合成以及抑制细胞壁多聚体木质素的合成。嘧磺隆是抑制乙酰乳酸合成酶（ALS），该酶是支链氨基酸缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸生物合成的关键酶，抑制ALS，就阻断了含侧链氨基酸的合成。2,4-D干扰了植物体内激素平衡，破坏核酸与蛋白质代谢，促进或抑制某些器官生长，使杂草茎叶扭曲、茎基变粗、肿裂。由于这些除草剂反复使用，使紫茎泽兰将产生抗药性，导致用药量增加，防除成本增大。本发明力图解决化学防除紫茎泽兰中存在的问题，将紫茎泽兰MEP生物合成途径的关键酶（ispF）作为防除紫茎泽兰的靶标，增加除草剂防除的选择性和特异性。

异戊二烯类化合物是植物生长发育必需的化合物，植物中异戊二烯焦磷酸和二甲丙烯焦磷酸是合成异戊二烯类化合物的基本结构单元。植物体内异戊二烯焦磷酸通过甲羟戊酸（MVA）途径和MEP途径合成，二甲丙烯焦磷酸只在MEP途径合成，如图1。MEP途径产生的异戊二烯焦磷酸和二甲丙烯焦磷酸用于生成多种具有重要生理功能的化合物，如单萜、双萜、叶绿素、类胡萝卜素、细胞分裂素、质体醌等。若阻断MEP途径，植物无法进行正常的生理活动，最终死亡。另外，由于动物体内不存在MEP途径，所以MEP途径是作为开发高选择性、低毒除草剂的靶标。

IspF是MEP途径上的关键酶。IspF酶催化2-磷酸-4-(胞苷-5-焦磷酸)-2-甲基-D-赤藓糖醇脱去胞苷-5-单磷酸，环化成2-甲基-D-赤藓糖醇-2,4-环焦磷酸。如果抑制IspF酶的催化活性，这步反应无法进行，从而阻断MEP途径合成异戊二烯焦磷酸和二甲丙烯焦磷酸，植物无法合成以MEP途径合成的异戊二烯焦磷酸和二甲丙烯焦磷酸为原料的重要的生理功能的物质，无法进行正常生理活动，如光合作用等，最终导致植物死亡。因此，本发明将紫茎泽兰MEP途径的关键酶（ispF）作为防除紫茎泽兰药物的靶标，为开发出高选择性、低毒的除草剂提供了新的靶标，具有重大的理论和实践意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种防除杂草—紫茎泽兰的靶标及其应用。

本发明所提供防除杂草—紫茎泽兰的靶标为EaispF1酶，，是如下a)或b)的蛋白：

a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

b)在序列表中序列2的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且与靶标相关的由a）衍生的ispF酶。

上述b)中的ispF酶可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

本发明还涉及基于紫茎泽兰EaispF1酶的结构设计的活性化合A和B：

A类化合物，取代基R=H、OH、CH₃和OCH₃

B类化合物，取代基R₁=F，Br和CCl₃,R₂=OH，CH₃和OCH₃

上述化合物在紫茎泽兰防除的过程中起到了有益的效果。

附图说明

图1为MEP途径。

图2为紫茎泽兰总RNA图示

图3为EaispF1基因的3’Race-PCR产物图示

图4为EaispF1基因的5’Race-PCR产物图示

图5为转EaispF1拟南芥转阳性转化植株PCR验证结果

图6为转EaispF1拟南芥T2代幼苗叶肉细胞中的绿色荧光信号图

图7为EaispF1蛋白三维结构图

具体实施方式

实施例1、紫茎泽兰EaispF1基因的克隆

紫茎泽兰种子采自云南省。将花卉土：蛭石按2:1比例混合均匀，装入直径为25cm盆中，将紫茎泽兰的种子撒到已经润湿的培养土上，再在种子上面铺一层厚度为2mm细土面，最后用纸将花盆盖住防止水分过度蒸发，5-7d后待紫茎泽兰幼苗长出来后，移去花盆上的纸，在温室中培养8周。提取幼苗的总RNA，如图2所示。

采用原位杂交技术筛选出紫茎泽兰EaispF1基因的cDNA序列，经酶切鉴定，获得个阳性克隆，经鉴定为IspF基因的部分序列。为获得EaispF1基因序列全长，采用RACE-PCR技术分别对EaispF1的5’端和3’端进行扩增。

3’Race-PCR对EaispF1基因的3’端序列的扩增。根据原位杂交所得的部分EaispF1基因的序列，设计3’Race特异性引物。采用TaKaRa公司3’-Full RACE Core Set Ver.2.0试剂盒，以紫茎泽兰RNA为模板，使用Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H-）将Poly(A)+RNA反转录成cDNA，以反转录cDNA为模板,3ISPFO：

5’-GACATTGGGCAGATCTTTCCAG-3’和3ISPFN：

5’-GAAAGGGGCAGCATCATCCGTG-3’为正向引物，试剂盒中的通用引物为反向引物，依照试剂盒的使用指南，获得了大小为550bp的EaispF1基因的3’端DNA片段，如图3。通过氯化钙介导法转化到大肠杆菌GM109菌株，进行测序。

5’RACE-PCR对EaispF1基因的5’端序列的扩增。根据原位杂交获得的部分EaispF1基因的序列，设计特异性反向引物为RIGSP1：

5’-CTCCACCTTGAGTTCTTTCCTC-3’用于cDNA的合成，另外两个特异性反向引物分别为SIGSP2：5'-CAGCTACTAAAGTTCCATCTGCCA-3’和PIGSP3：

5'-CGCCCGAGAATGTGTCGGTTAC-3’，所用的正向引物为试剂盒中的通用引物。根据试剂盒说明书的步骤进行巢式PCR反应，获得了两条特异性条带，分别为490bp和856bp，如图4。将DNA片段回收后，连接到pMD18-T载体上，再转入GM109大肠杆菌，进行测序。测序结果显示，这两个PCR产物都含有EaispF1基因的5’序列。最后将EaispF1基因的cDNA片段、3’Race-PCR片段和5’RACE-PCR片段拼接起来，通过PCR获得EaispF1全长cDNA序列。

实施例2转EaispF1基因超表达拟南芥株系的获得

将实施例1中克隆的EaispF1基因cDNA构建到启动子为CaMV35S植物表达载体pCAMBIA1300。通过农杆菌介导的花粉管转化法，将EaispF1基因转入拟南芥植株细胞，筛选获得4个转基因超表达拟南芥株系，其PCR鉴定结果如图5所示。

实施例3EaispF1亚细胞定位

EaispF1的信号肽预示其蛋白表达后的位置为叶绿体。EaispF1在转基因拟南芥的的亚细胞定位通过EaispF1-GFP在植物中的表达来确定。用激光共聚焦扫描显微镜观察生长5天的T2代转基因幼苗，发现EaispF1-GFP的荧光信号在植物细胞的叶绿体中，和叶绿素的红色荧光信号相重叠。如图6，说明EaispF1定位于细胞内的叶绿体中。

实施例4转EaispF1基因拟南芥叶绿素和类胡萝卜素的含量显著增加

通过液相色谱分别测定生长4周野生型和转EaispF1基因拟南芥叶片叶绿素和类胡萝卜素含量，测定方法如下：

取生长4周野生型和转EaispF1基因拟南芥的叶片进行叶绿素和多种类胡萝卜素含量的测定。在绿灯下，取1g叶片在液氮中研磨，加入5mL丙酮:水:NH₄OH为80:20:0.01的提取液，-20℃避光提取，过夜。再在绿光下10000g离心5min，取上清，过0.45nm过滤膜，到新管，待测。样品通过高效液相色谱分离，荧光检测器检查。色谱柱为Adsorbsphere C18反相色谱柱（Alltech，4.6×15mm,3μm）。梯度洗脱程序：0min，乙酸乙酯（A）：0.01%乙酸铵（B）=0:100；15min，A:B=20:80；25min，A:B=80:20。在445nm吸收值下测定叶绿素和类胡萝卜素。通过外标法，对样品中的这些色素的保留时间和含量进行定量定性分析。如表1所示，所检测色素的保留时间和标准曲线方程以及相关系数。

表1叶绿素和类胡萝卜素的保留时间、标准曲线和相关系数

研究发现，EaispF1基因在拟南芥超表达，提高了转EaispF1基因拟南芥植株叶片的叶绿素含量和类胡萝卜素的含量（表1）。转EaispF1基因拟南芥比野生型拟南芥植株叶片叶绿素含量增加12.3%～15.2%、叶绿素b含量增加9.2%-13.6%、类胡萝卜素的含量也显著提高：紫黄质含量增加53.3%～102.4%；叶黄素含量增加16.5%～38.5%；β-胡萝卜素含量增加25.5%～50.8%；总类胡萝卜素含量增加20.3%～41.7%。花药黄质、玉米黄质和新黄质的含量没有明显变化。

表2转EaispF1基因型拟南芥与野生型叶绿素和类或萝卜素的含量

实施例5紫茎泽兰EaispF1酶三维结构

通过计算机同源建模的方法预测出EaispF1的三维结构，如图7。选用序列一致性为87%的拟南芥的IspF的晶体结构（PDB ID：2PMP）的链A为模板，用Swiss-modeling系统模拟出EaispF1蛋白的三维结构。EaispF1蛋白是由三个EaispF1亚基形成的一个不对称的同源三聚体，每个亚基有7个β片层、5个α螺旋以及2个η螺旋结构组成。EaispF1蛋白有三个活性槽，位于相邻的亚基之间的缝隙中。Zn²⁺和碱基ASP82、HIS84和HIS116相互作用，这三个碱基在植物和细菌的IspF蛋白中都非常的保守。碱基ASP79、GLY81、LEU123、PRO126、LYS127、LUE128和SER129在EaispF1蛋白的催化中心周围，形成了一个催化槽，和底物结合，催化MECDP的环化反应。

实施例6计算机辅助设计抑制紫茎泽兰EaispF1酶活性的化合物及其合成

（1）A类化合物的合成

化合物3合成：室温下，向含有化合物2（13mmol），乙醇钠（12mmol）的单口瓶中加入甲苯。回流反应1小时，加入化合物1（10mmol），接着回流3小时。旋干溶剂，加入水，调节水溶液到中性。白色固体析出，过滤，得到固体，烘干得到化合物3。

化合物4合成：室温下，向含有化合物3（10mmol）的二氧六环和水的混合溶剂中加入碳酸钠（20mmol），搅拌0.5小时，加入(Boc)₂O（20mmol）。室温下搅拌过夜。加入乙酸乙酯稀释，用饱和食盐水洗。有机相用无水硫酸钠干燥，过滤、旋干得到产品4。

化合物6合成：室温下，向含有化合物4（10mmol）的四氢呋喃溶液中加入碳酸铯（10mmol）。再加入化合物5（11mmol），50°C下，反应过夜。旋干过硅胶柱（PE:EA=1:1）得到化合物6。

化合物8合成：室温下，向含有化合物6（10mmol）的四氢呋喃溶液中加入化合物7（20mmol）。室温下反应12小时，加入乙酸乙酯稀释，饱和食盐水洗。有机相用无水硫酸钠干燥，过滤、旋干，过硅胶柱（PE:MeOH=10:1）得到产物8。

化合物9合成：室温下，向含有三苯基膦（20mmol）的四氢呋喃溶液中加入化合物8（10mmol）。反应过夜，旋干过硅胶柱（PE:EA=1:1）得到化合物9。.

化合物10合成:0°C下，向甲醇溶液中滴加乙酰氯（100mmol），此温度下反应0.5小时。向其中滴加化合物9（10mmol）的甲醇溶液，室温下搅拌3小时。旋干溶剂得到化合物10

化合物11合成:0°C下，向含有化合物10（10mmol）的四氢呋喃溶液中加入DIEA（30mmol），室温搅拌0.5小时。冷到0°C，向其中滴加含有化合物苯甲酰氯（12mmol）的四氢呋喃溶液，室温反应过夜。加入乙酸乙酯稀释，饱和食盐水洗。有机相用无水硫酸钠干燥，过滤、旋干，过硅胶柱（PE:EA=2:1）得到产物11。

（2）B类化合物的合成

化合物3合成：室温及氩气下，向含有化合物1(10mmol)，化合物2(12mmol)，Pd(PPh₃)₄(0.5mmol)和K₂CO₃(20mmol)的单口瓶中加入二氧六环。升至100°C下反应12小时，乙酸乙酯稀释，饱和食盐水洗。有机相用无水硫酸钠干燥，过滤、旋干，过硅胶柱(PE:EA=5:1)得到产物3。

化合物4合成：在0℃下，向甲醇溶液中滴加乙酰氯（100mmol），此温度下反应0.5小时。向其中滴加化合物3(10mmol)甲醇溶液，室温下搅拌3小时。旋干溶剂得到化合物4。

目标化合物6合成：在0°C下，向含有化合物4(10mmol)的四氢呋喃溶液中加入 DIEA（30mmol），室温搅拌0.5小时。冷却到0°C，向其中滴加含有化合物5（12mmol）的四氢呋喃溶液，室温反应过夜。加入乙酸乙酯稀释，饱和食盐水洗。有机相用无水硫酸钠干燥，过滤、旋干，过硅胶柱（PE:EA=1:1）得到产物6。

表3A和B类化合物化合物的产率以及熔点

实施例7A和B类化合物抑制紫茎泽兰和拟南芥EC₅₀的测定

将紫茎泽兰和拟南芥的种子均匀播种在培养土上，在种子上面撒一层2mm毫米厚的细土，置于托盘中，采用漫灌的方式进行浇水，生长4周后，每盆预选15株大小一致的植物。将待测化合物配制成6个浓度梯度，分别是0、10mg/L、100mg/L、400mg/L、800mg/L和1000mg/L，每个浓度设3个重复。利用ASP21098型自动喷雾装置（浙江大学电器设备厂，压力：0.4Mpa，速度：50cm/s），喷施各个浓度的待测药液，每个处理重复2次。药后10、15、20d记载死苗数，计算EC50，表4所示。

表4A和B类化合物抑制紫茎泽兰和拟南芥EC₅₀

<110> 中国农业大学

<120> 一种防除杂草-紫茎泽兰的靶标及其应用

<130>

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 693

<212> DNA

<213> 紫茎泽兰（Eupatorium adenophorum Spreng）

<400> 1

atggctactt cttcatcgtg ttacacctct ccgatctcca ccggaatatt cccaaagcat 60

caaccaacta tacctacgtc gacctctttc ctcacatgct tcaccagacg ctcaccgatc 120

tctctccggt cggtatcacg tccggtggtg gttgcggcag ctgccaacgc cgttgaagtt 180

gagaaacagg cggtgacgaa aactccgtcg aagattctcc cgttccgagt cggacatggc 240

ttcgatcttc atagattgga gcctggatac cctctcatca tcggaggcat taatattcct 300

cacgagagag gctgcgaagc tcactccgat ggtgatgtgc tgttgcattg tgtcgttgat 360

gcgattttgg gtgctttggg tctacccgac attgggcaga tctttccaga caacgatcct 420

aaatggaaag gggcagcatc atccgtgttc atcaaagaag ccgtgagatt gatgcatgag 480

gctggttatg agctaggaaa cttagatgcc actttgattc ttcaaagacc aaagctaagc 540

cctcataaag aggctattcg agacaatttg tctttgcttc taggcgcgga cccttctgtt 600

gtcaacctga aagctaaaac gcatgagaag gtagacagtc ttggagaaaa tagaagtatc 660

gcggctcaca cagttgtgct tttgatgaag aaa 696

<210> 2

<211> 231

<212> PRT

<213> 紫茎泽兰（Eupatorium adenophorum Spreng）

<400> 2

Met Ala Thr Ser Ser Ser Cys Tyr Thr Ser Pro Ile Ser Thr Gly Ile

1 5 10 15

Phe Pro Lys His Gln Pro Thr Ile Pro Thr Ser Thr Ser Phe Leu Thr

20 25 30

Cys Phe Thr Arg Arg Ser Pro Ile Ser Leu Arg Ser Val Ser Arg Pro

35 40 45

Val Val Val Ala Ala Ala Ala Asn Ala Val Glu Val Glu Lys Gln Ala

50 55 60

Val Thr Lys Thr Pro Ser Lys Ile Leu Pro Phe Arg Val Gly His Gly

65 70 75 80

Phe Asp Leu His Arg Leu Glu Pro Gly Tyr Pro Leu Ile Ile Gly Gly

85 90 95

Ile Asn Ile Pro His Glu Arg Gly Cys Glu Ala His Ser Asp Gly Asp

100 105 110

Val Leu Leu His Cys Val Val Asp Ala Ile Leu Gly Ala Leu Gly Leu

115 120 125

Pro Asp Ile Gly Gln Ile Phe Pro Asp Asn Asp Pro Lys Trp Lys Gly

130 135 140

Ala Ala Ser Ser Val Phe Ile Lys Glu Ala Val Arg Leu Met His Glu

145 150 155 160

Ala Gly Tyr Glu Leu Gly Asn Leu Asp Ala Thr Leu Ile Leu Gln Arg

165 170 175

Pro Lys Leu Ser Pro His Lys Glu Ala Ile Arg Asp Asn Leu Ser Leu

180 185 190

Leu Leu Gly Ala Asp Pro Ser Val Val Asn Leu Lys Ala Lys Thr His

195 200 205

Glu Lys Val Asp Ser Leu Gly Glu Asn Arg Ser Ile Ala Ala His Thr

210 215 220

Val Val Leu Leu Met Lys Lys

225 230

Claims

1.紫茎泽兰EaispF1作为防除紫茎泽兰的靶标的用途。

2.A类和B类化合物

A类化合物，取代基R=OH,CH3,OCH3

B类化合物，取代基R1=F，Br，CCl3,R2=OH，CH3，OCH3。

3.如权利要求2所述的化合物的制备方法：

其中A类化合物的制备方法如下：

B类化合物的制备方法如下：

4.权利要求2所述化合物在防除杂草紫茎泽兰中的用途。