CN103773729A - 高效合成萜类化合物的重组大肠杆菌底盘细胞及其制法和应用 - Google Patents
高效合成萜类化合物的重组大肠杆菌底盘细胞及其制法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种高效合成萜类化合物的重组大肠杆菌底盘细胞及其制法和应用。具体地，本发明对大肠杆菌内源2-C-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸(MEP)前体途径进行改造，利用改造后的大肠杆菌底盘细胞进行萜类化合物的高效生物合成，前体途径的改造主要是充分挖掘自然界中其他微生物来源的MEP前体途径基因模块，筛选特性优良的基因模块在大肠杆菌中进行表达，同时在改造后的底盘细胞中集成组装萜类化合物的下游合成途径，包括倍半萜类化合物如紫槐二烯，二萜类化合物如贝壳烯，四萜类化合物如番茄红素，多萜类化合物及其他萜类生物碱化合物等。本发明的大肠杆菌底盘细胞能够显著提高萜类化合物的合成。
Description
技术领域
本发明属于合成生物学及工业生物学技术领域，具体地，本发明涉及一种高效合成萜类化合物的重组大肠杆菌底盘细胞及其制法和应用。
背景技术
合成生物学是基于理性的设计，将标准化的生物元件进行集成与装配，从而构建性能优良的人造生命系统。合成生物学一经诞生，它的思想和设计就深刻地影响着工业微生物技术的发展，使微生物技术在药物，生物燃料，精细化学品的开发与生产过程中发挥出更加巨大的作用。
美国加州大学伯克利分校的Keasling实验室，将黄花蒿来源的紫槐二烯合成酶基因(ads)，紫槐二烯氧化酶基因(cyp71av1)以及细胞色素P450还原蛋白基因(cpr)置于酵母细胞调控元件下，最终在酵母工程菌中组装了一条青蒿酸的异源合成途径并成功地合成了青蒿酸。随后，麻省理工学院和塔夫茨大学的合作者在大肠杆菌中重建了紫杉醇前体-紫杉二烯的合成途径，结合对工程菌株的一系列改造，最终使得紫杉二烯的产量超过了1g/L。这些研究表明结合合成生物学的设计以及成熟的微生物基因工程技术，可以打破了种属的界限，实现各种来源珍稀化合物在通用微生物底盘细胞中的高效合成。
萜类化合物是种类最多，结构最丰富，功能最多样的天然产物，是药物，芳香物质，食品添加剂，橡胶以及生物燃料的重要来源。目前已被发现的萜类化合物超过40,000种，它们广泛地存在于植物中，同时真菌和细菌中也有越来越多的萜类化合物被报道。萜类化合物由通用的异戊酰焦磷酸(IPP)和二甲烯丙基焦磷酸(DMAPP)前体单元(C5)通过次序叠加合成。根据叠加的前体单元数量不同，分为半萜(C5)，单萜(C10)，倍半萜(C15)，二萜(C20)，三萜(C20)，四萜(C40)，多萜类化合物及其他萜类生物碱化合物等。越来越多的萜类化合物被发现具有治疗和防控多种疾病的功能，比如抗癌，抗微生物，抗真菌，抗寄生虫，抗病毒，抗炎，免疫调节等。但这些化合物在原产植株或微生物中的合成往往受到严格的调控，含量低，且具有明显的季节性，严重地制约了进一步的开发利用。以太平洋红豆杉来源的紫杉醇为例，作为有效的抗药药物，该化合物非常微量地分布在太平洋红豆杉的树皮中，1200kg的树皮只能提取10g纯的紫杉醇。
在传统的模式微生物中，大肠杆菌是一种常用的异源合成底盘细胞。它具有清晰的遗传背景、成熟的基因操作技术与工具、丰富的基因表达元件，可靠经济的大规模发酵技术。大肠杆菌采用2-C-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸(MEP)前体途径合成IPP/DMAPP前体单元，但原始大肠杆菌细胞的MEP途径只有极低的表达水平，仅能维持很低的前体供应，无法满足萜类化合物的高效合成。Yuan等人用染色体工程的方法，采用T5启动子替换MEP途径相关基因的原始启动子，以逐个强化MEP途径基因，并鉴定了途径中的1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因(dxs)，4-二磷酸胞苷2-C-甲基-D赤藓糖醇合成酶基因(ispD)，2-甲基赤藓糖醇-2，4-环焦磷酸合成酶基因(ispF)，异戊烯焦磷酸异构酶基因(idi)是限速步骤，共同强化这四个基因的表达，能够有效改善番茄红素的合成。基于Yuan等研究结果，MIT的研究人员将大肠杆菌内源dxs，ispD，ispF，idi基因串联成一个操纵子，并结合启动子工程，基因拷贝数调节等手段，最终获得工程菌经补料分批发酵后获得了>1g/L的紫杉二烯。这一系列对MEP途径的改造，虽取得了很大的成功，但是获得的底盘细胞仍无法满足萜类化合物大规模生产的要求。而且针对大肠杆菌内源MEP途径调控机制及酶学特性仍缺乏足够的了解，仅仅依赖某些限速步骤基因表达的强化无法彻底地解除途径中可能存在的未知调控，因此也就无法完全打开MEP途径的代谢通量并实现更高产萜类化合物底盘细胞的构建。
因此，本领域目前还没有一种有效的可靠的合成生物学与工业微生物技术，大规模生产萜类化合物。因此迫切需要构建能够异源合成萜类化合物的重组微生物工程菌，从而实现廉价，全天候，大规模生产萜类化合物。
发明内容
本发明的目的就是提供一种高效合成萜类化合物的重组大肠杆菌底盘细胞及其制法和应用。
在本发明的第一方面，提供了一种底盘细胞，所述的底盘细胞含有提高所述底盘细胞生产萜类化合物能力的基因。
在另一优选例中，所述的底盘细胞是用于生产萜类化合物的底盘细胞，并且所述的基因是选自下述的至少一个基因或其组合：
来源于阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)的dxs2、idi、dxr、或ispD基因；
来源于红霉糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea)的dxr、ispD、idi1、或idi2基因；
来源于欧文氏菌ATCC55669(Erwinia taxi ATCC55669)的ispD基因；
来源于金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的idi基因；
来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的idi基因。
在另一优选例中，所述的底盘细胞为真核细胞(如酵母细胞)或原核细胞(如枯草芽孢杆菌细胞、大肠杆菌细胞)；较佳地为大肠杆菌细胞。
在另一优选例中，所述的真核细胞为酵母细胞。
在另一优选例中，所述的原核细胞为大肠杆菌(Escherichia coli)细胞。
在另一优选例中，所述的底盘细胞为大肠杆菌(Escherichia coli)细胞。
在另一优选例中，所述的萜类化合物选自下组：半萜(C5)类化合物、单萜(C10)类化合物、倍半萜(C15)类化合物、二萜(C20)类化合物、三萜(C20)类化合物、四萜(C40)类化合物、多萜类化合物、其他萜类生物碱化合物或其组合。
在另一优选例中，所述的基因选自下组：
(1)阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)来源的dxs2基因；(2)阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)来源的idi基因；(3)枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)来源的idi基因；(4)上述(1)-(3)基因的任意组合。
在另一优选例中，所述的底盘细胞含有多拷贝的提高所述底盘细胞生产萜类化合物能力的基因。
在另一优选例中，所述的基因为：
(1)阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)来源的dxs2基因和阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)来源的idi基因的组合；(2)阿维链霉菌(Streptomycesavermitilis)来源的dxs2基因和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)来源的idi基因的组合；(3)阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)来源的idi基因和枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)来源的idi基因的组合；(4)阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)来源的dxs2基因的叠加。
在另一优选例中，所述的底盘细胞还包括任选自下组的基因或其组合：
来源于阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)的dxr、或ispD基因；
来源于红霉糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea)的dxr、ispD、idi1、或idi2基因；
来源于欧文氏菌的ispD基因；
来源于金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的idi基因；和/或
所述的底盘细胞还含有其它甲羟戊酸途径(MVA途径)和/或非甲羟戊酸途径(MEP途径)中的酶。
在另一优选例中，所述的基因为外源基因。
在另一优选例中，所述的萜类化合物选自下组：半萜(C5)类化合物、单萜(C10)类化合物、倍半萜(C15)类化合物、二萜(C20)类化合物、三萜(C20)类化合物、四萜(C40)类化合物、多萜类化合物及其他萜类生物碱化合物或其组合。
在另一优选例中，所述的倍半萜(C15)类化合物为紫槐二烯。
在另一优选例中，所述的四萜(C40)类化合物为番茄红素。
在另一优选例中，所述的二萜(C20)类化合物为贝壳烯。
在另一优选例中，所述的萜类化合物选自下组：紫槐二烯、番茄红素、贝壳烯、或其组合。
在本发明的第二方面，提供了一种生产萜类化合物的方法，所述方法包括步骤：
(a)在适合表达的条件下，培养本发明第一方面所述的底盘细胞，获得含有萜类化合物的培养物；
(b)从步骤(a)的培养物中分离出所述的萜类化合物；
其中，在步骤(a)中所述的底盘细胞含有或不含有外源的萜类化合物合成基因模块。
在另一优选例中，所述的萜类化合物选自下组：紫槐二烯、番茄红素、贝壳烯、或其组合。
在本发明的第三方面，提供了一种基因的用途，所述基因选自下组：
来源于阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)的dxs2、idi、dxr、或ispD基因；来源于红霉糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea)的dxr、ispD、idi1、或idi2基因；来源于欧文氏菌ATCC55669(Erwinia taxi ATCC55669)的ispD基因；来源于金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的idi基因；来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的idi基因；和/或上述基因的任意组合，所述的基因用于提高底盘细胞生产萜类化合物的能力。
在另一优选例中，所述基因用于制备生产萜类化合物能力被提高的底盘细胞。
在另一优选例中，所述的基因选自下组：(1)阿维链霉菌(Streptomycesavermitilis)来源的dxs2基因；(2)阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)来源的idi基因；(3)枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)来源的idi基因；(4)上述(1)-(3)基因的任意组合；在另一优选例中，所述的底盘细胞为真核细胞(如酵母细胞)或原核细胞(如大肠杆菌(Escherichia coli)细胞)。
在另一优选例中，所述的底盘细胞为大肠杆菌(Escherichia coli)细胞。
在另一优选例中，所述的基因任选自下组：
(1)阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)来源的dxs2基因和阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)来源的idi基因的组合；
(2)阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)来源的dxs2基因和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)来源的idi基因的组合；
(3)阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)来源的idi基因和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)来源的idi基因的组合；
(4)阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)来源的dxs2基因的叠加。
在另一优选例中，所述的基因还包括任选自下组的基因或其组合：
来源于大肠杆菌(Escherichia coli)的dxs、dxr、ispD、ispF、或idi基因；
来源于阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)的dxs1、dxr、ispD、或ispF基因；
来源于红霉糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea)的dxs、dxr、ispD、ispF、idi1、或idi2基因；
来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的dxs、dxr、ispD、或ispF基因；
来源于欧文氏菌的dxs、dxr、或ispD基因；
来源于金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的idi基因。
在本发明的第四方面，提供了一种分离的基因组合，所述的基因组合为：
阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)来源的dxs2基因、阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)来源的idi基因、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)来源的idi基因的任意组合。
在另一优选例中，所述的组合为2个或多个基因的组合。
在另一优选例中，所述的基因组合任选自下组：
(1)阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)来源的dxs2基因和阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)来源的idi基因的组合；
(2)阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)来源的dxs2基因和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)来源的idi基因的组合；
(3)阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)来源的idi基因和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)来源的idi基因的组合；
(4)阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)来源的dxs2基因的叠加；
(5)阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)来源的idi基因的叠加；
(6)枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)来源的idi基因的叠加。
在另一优选例中，所述的基因组合还包括任选自下组的基因或其组合：
来源于大肠杆菌(Escherichia coli)的dxs、dxr、ispD、ispF、或idi基因；
来源于阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)的dxs1、dxr、ispD、或ispF基因；
来源于红霉糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea)的dxs、dxr、ispD、ispF、idi1、或idi2基因；
来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的dxs、dxr、ispD、或ispF基因；
来源于欧文氏菌的dxs、dxr、或ispD基因；
来源于金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的idi基因。
在本发明的第五方面，提供了一种载体或载体混合物，所述的载体或载体混合物含有第四方面所述的基因组合。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。
图1为MEP前体途径及下游萜类合成途径示意图。
图2为MEP前体途径不同种属来源的dxs模块基因的表达结果，泳道M：protein marker；泳道1：Control；泳道2：Escherichia coli dxs；泳道3：Bacillussubtilis dxs；泳道4：Erwinia taxi ATCC55669dxs；泳道5：Streptomycesavermitilis dxs1；泳道6：Streptomyces avermitilis dxs2；泳道7：Saccharopolyspora erythraea dxs。
图3为MEP前体途径不同种属来源的dxr模块基因的表达结果，泳道M：protein marker；泳道1：Control；泳道2：Escherichia coli dxr；泳道3：Bacillussubtilis dxr；泳道4：Erwinia taxi ATCC55669strain dxs；泳道5：Streptomycesavermitilis dxr；泳道6：Saccharopolyspora erythraea dxr。
图4为MEP前体途径不同种属来源的ispD模块基因的表达结果，泳道M：protein marker；泳道1：Control；泳道2：Escherichia coli ispD；泳道3：Bacillussubtilis ispD；泳道4：Erwinia taxi ATCC55669strain ispD；泳道5：Streptomyces avermitilis ispD；泳道6：Saccharopolyspora erythraea ispD。
图5为MEP前体途径不同种属来源的ispF模块基因的表达结果，泳道M：protein marker；泳道1：Control；泳道2：Escherichia coli ispF；泳道3：Bacillussubtilis ispF；泳道4：Streptomyces avermitilis ispF；泳道6：Saccharopolysporaerythraea ispF。
图6为MEP前体途径不同种属来源的idi模块基因的表达结果；泳道M：protein marker；泳道1：Control；泳道2：Escherichia coli idi；泳道3：Bacillussubtilis idi；泳道4：Streptomyces avermitilis idi；泳道5：Saccharopolysporaerythraea idi1；泳道6：Saccharopolyspora erythraea idi2；泳道7：Staphylococcus aureus idi。
图7为不同dxs基因模块对番茄红素合成的影响。
图8为不同dxr基因模块对番茄红素合成的影响。
图9为不同ispD基因模块对番茄红素合成的影响。
图10为不同ispF基因模块对番茄红素合成的影响。
图11为不同idi基因模块对番茄红素合成的影响。
图12为不同基因模块共表达对番茄红素合成的影响。
图13为不同重要基因模块对紫槐二烯合成的影响。
图14为不同重要基因模块共表达对紫槐二烯合成的影响。
图15为不同重要模块基因对贝壳烯合成的影响。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次对大肠杆菌内源2-C-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸(MEP)前体途径进行改造，利用改造后的大肠杆菌底盘细胞进行萜类化合物的高效生物合成；前体途径的改造主要是充分挖掘自然界中其他微生物来源的MEP前体途径基因模块，筛选特性优良的基因模块在大肠杆菌中进行表达，同时在改造后的底盘细胞中集成组装萜类化合物的下游合成途径，包括倍半萜类化合物紫槐二烯，二萜类化合物贝壳烯，四萜类化合物番茄红素。本发明的大肠杆菌底盘细胞能够显著提高萜类化合物的合成。在此基础上完成了本发明。
本发明采取的技术方案是：
一种挖掘自然界MEP前体途径基因模块的，筛选性能优良的基因模块，进而将这些模块运用于大肠杆菌MEP途径改造的方法，包括选取了阿维链霉菌(dxs1，dxs2，ispD，ispF，idi)，红霉糖多孢菌(dxs，ispD，ispF，idi1，idi2)，欧文氏菌(dxs，dxr，ispD)，枯草芽孢杆菌(dxs，ispD，ispF，idi)以及金黄色葡萄球菌(idi)等基因，同时选取大肠杆菌(dxs，ispD，ispF，idi)基因作为对照。通过克隆以上基因，然后将相关质粒与含有番茄红素合成途径的pAC-LYC质粒共同转化大肠杆菌细胞，筛选出能够明显改善番茄红素产量的基因，然后选取能够明显改善番茄红素基因，用于倍半萜前体紫槐二烯、二萜前体贝壳烯的异源合成，同时将效果特别明显的基因进行共强化进一步提高这些萜类化合物的合成。
MEP途径和MVA途径
如本文所用，术语“MEP途径”是指2-C-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸途径，术语“MVA途径”是指甲羟戊酸途径。MEP途径和MVA途径是自然中的两条萜类化合物通用前体的合成途径，其中MEP途径主要存在于各种真细菌，蓝藻及植物质体中，真核细菌尤其是链霉菌具有比较丰富的萜类次级代谢。相对于本身不产萜类化合物的大肠杆菌来说，这些萜类代谢丰富微生物其MEP途径在表达调控，酶活特性上表现出一定的特性。同时丰富的天然基因资源也为大肠杆菌中MEP途径的改造提供了丰富的元件库。因此有效的挖掘这些资源，并用于大肠杆菌MEP途径的改造，是构建萜类高产底盘细胞的有效途径(图1)。
底盘细胞
本发明提供了一种用于萜类化合物的合成的底盘细胞及其应用，
如本文所用，术语“底盘细胞”“宿主细胞”“工程细胞”可以互换使用，指合成生物学中一种可搭配不同的功能模块从而生产所需产品或实现所需功能的宿主细胞。这种细胞可以是天然来源的生物细胞，也可以是在天然来源的生物细胞基础上经过了一定改良操作得到的细胞，如基因元件的增减和优化。
在本发明中，所述底盘细胞含有提高所述底盘细胞生产萜类化合物能力的基因。
所述的底盘细胞为真核细胞或原核细胞；真核细胞可以为如酵母细胞；原核细胞可以为大肠杆菌(Escherichia coli)细胞。
在本发明的一个优选例中，底盘细胞为大肠杆菌(Escherichia coli)。
在本发明的一个优选例中，所述的基因选自下组：阿维链霉菌(Streptomycesavermitilis)来源的dxs2基因；阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)来源的idi基因；枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)来源的idi基因；上述基因的任意组合。
在本发明的一个优选例中，底盘细胞含有多拷贝的提高所述底盘细胞生产萜类化合物能力的基因。
优选地，所述的基因为：阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)来源的dxs2基因和阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)来源的idi基因的组合；阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)来源的dxs2基因和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)来源的idi基因的组合；阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)来源的idi基因和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)来源的idi基因的组合；阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)来源的dxs2基因的叠加。
更优选地，底盘细胞还包括任选自下组的基因或其组合：来源于阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)的dxr、或ispD基因；来源于红霉糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea)的dxr、ispD、idi1、或idi2基因；来源于欧文氏菌(Erwinia taxi ATCC55669)的ispD基因；来源于金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的idi基因。
更优选地，所述的底盘细胞还含有其它甲羟戊酸途径(MVA途径)和/或非甲羟戊酸途径(MEP途径)中的酶。
在本发明中，所述的萜类化合物优选地选自下组：半萜(C5)类化合物、单萜(C10)类化合物、倍半萜(C15)类化合物、二萜(C20)类化合物、三萜(C30)类化合物、四萜(C40)类化合物、或多萜类化合物及其他萜类生物碱化合物。
优选地，单萜类化合物为异戊二烯、柠檬烯、薄荷醇等；倍半萜(C15)类化合物为紫槐二烯；四萜(C40)类化合物为番茄红素；二萜(C20)类化合物为贝壳烯(甜菊糖前体)、紫杉二烯(紫杉醇前体)、海松二烯等；四萜(C40)类化合物为番茄红素、β-胡萝卜素、虾青素等；多萜类化合物为杜仲胶等，以及萜类生物碱为喜树碱等。
本发明优选的萜类化合物选自下组：紫槐二烯、番茄红素、贝壳烯、或其组合。
基因用途
本发明还提供了一种基因的用途，所述基因选自下组：阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)来源的dxs2基因；阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)来源的idi基因；枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)来源的idi基因；上述基因的任意组合；所述的基因用于提高底盘细胞生产萜类化合物的能力。
在另一优选例中，所述的基因任选自下组：阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)来源的dxs2基因和阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)来源的idi基因的组合；阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)来源的dxs2基因和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)来源的idi基因的组合；阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)来源的idi基因和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)来源的idi基因的组合；阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)来源的dxs2基因的叠加。
在另一优选例中，所述的基因还包括任选自下组的基因或其组合：来源于大肠杆菌(Escherichia coli)的dxs、dxr、ispD、ispF、或idi基因；来源于阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)的dxs1、dxr、ispD、或ispF基因；来源于红霉糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea)的dxs、dxr、ispD、ispF、idi1、或idi2基因；来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的dxs、dxr、ispD、或ispF基因；来源于欧文氏菌(Erwinia taxi ATCC55669)的dxs、dxr、或ispD基因；来源于金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的idi基因。
基因组合
本发明还提供了一种分离的基因组合，所述的基因组合为：阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)来源的dxs2基因、阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)来源的idi基因、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)来源的idi基因的任意组合。
优选地，所述的组合为2个或多个基因的组合。
较佳地，所述的基因组合任选自下组：阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)来源的dxs2基因和阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)来源的idi基因的组合；阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)来源的dxs2基因和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)来源的idi基因的组合；阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)来源的idi基因和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)来源的idi基因的组合；阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)来源的dxs2基因的叠加；阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)来源的idi基因的叠加；枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)来源的idi基因的叠加。
如本文所用，术语“叠加”指将某一基因A与一种或多种其他基因进行组合(combine)，从而构成一组合形式(combination)。较佳地，进行叠加的基因是与生产萜类化合物相关的基因，包括本发明中提及的任一基因。此外，该术语还包括基因A与基因A进行叠加的情况。
所述的基因组合还可以包括任选自下组的基因或其组合：来源于大肠杆菌(Escherichia coli)的dxs、dxr、ispD、ispF、或idi基因；来源于阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)的dxs1、dxr、ispD、或ispF基因；来源于红霉糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea)的dxs、dxr、ispD、ispF、idi1、或idi2基因；来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的dxs、dxr、ispD、或ispF基因；来源于欧文氏菌ATCC55669(Erwinia taxi ATCC55669)的dxs、dxr、或ispD基因；来源于金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的idi基因。
本发明还提供了一种载体或载体混合物，所述的载体或载体混合物含有本发明所述的基因组合。
根据本文所述的各种基因或基因组合，本技术领域人员可方便地用各种已知方法制得其编码核酸。这些方法例如但不限于：PCR，DNA人工合成等，具体的方法可参见J.萨姆布鲁克，《分子克隆实验指南》。
作为本发明的一种实施方式，可通过PCR的方法来构建本发明的基因序列。
载体及宿主细胞
本发明还提供了一种载体或载体混合物，所述的载体或载体混合物含有本发明所述的基因组合，还优选地包含与基因序列操作性相连的表达调控序列。
所述的“操作性相连”或“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够调节或控制同一线性DNA序列其它部分的活性。例如，如果启动子控制序列的转录，那么它就是可操作地连于编码序列。本领域技术人员可以根据宿主细胞来选择合适的表达载体。根据已知空载表达载体的酶切图谱，本领域技术人员可按照常规方法通过限制性酶剪切与拼接，将本发明的基因序列插入合适的限制性位点，制得重组表达载体。
本发明还提供了一种遗传工程化的宿主细胞，它含有本发明上述的载体；或其染色体上整合有本发明所述的基因或基因组合。
本发明的宿主细胞可以原核细胞或真核细胞(例如但不限于CHO，COS细胞，293细胞，RSF细胞等)。本发明优选原核细胞，更优选大肠杆菌细胞。
将所述编码序列导入宿主细胞可采用本领域的多种已知技术，例如但不限于：磷酸钙沉淀，原生质体融合，脂质体转染，电穿孔，微注射，反转录法，噬菌体转导法，碱金属离子法。
有关宿主细胞的培养和表达可参见J.萨姆布鲁克，《分子克隆实验指南》。可通过离心去除悬浮液中的细胞和残渣，收集清液，可通过凝胶电泳技术进行鉴定。
应用
本发明提供了一种生产萜类化合物的方法，所述方法包括步骤：
(a)在适合表达的条件下，培养本发明第一方面所述的底盘细胞，获得含有萜类化合物的培养物；
(b)从步骤(a)的培养物中分离出所述的萜类化合物；
其中，在步骤(a)中所述的底盘细胞含有或不含有外源的萜类化合物合成基因模块。
所述的“萜类化合物合成基因模块”指利用萜类前体(如异戊烯焦磷酸(IPP)、二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP))合成萜类化合物、衍生物所需要的基因、基因蔟、操纵子。
在本发明的一个优选例中，所述的萜类化合物选自下组：紫槐二烯、番茄红素、贝壳烯、或其组合。
本发明的主要优点：
(1)本发明通过对自然界MEP途径基因的大量挖掘，提供了大肠杆菌MEP途径改造中具有重要价值的多种基因，这些基因为大肠杆菌MEP途径的改造提供了丰富的资源；
(2)本发明提供了基因能明显改善萜类合成的能力，可以用于大肠杆菌的精细改造，比如结合启动子工程，染色体工程等；
(3)本发明提供的高效转化的大肠杆菌底盘细胞，能够有效的表达番茄红素、紫槐二烯以及贝壳烯的合成，从而用于萜类化合物的大规模工业化生产。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:ColdSpring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
不同菌株来源MEP途径基因的克隆
表1
本实施例以表1举例，选取上述基因，进行克隆。
分别对大肠杆菌的dxs，dxr，ispD，ispF，idi基因，阿维链霉菌的dxs1，dxs2，dxr，ispD，ispF，idi基因，红霉糖多孢菌dxs，dxr，ispD，ispF，idi1，idi2基因，枯草芽孢杆菌dxs，dxr，ispD，ispF，idi基因，欧文氏菌(Erwinia taxi ATCC55669，简称ATCC)菌的dxs，dxr，ispD基因，以及金黄色葡萄球菌的idi基因设计引物，引物的设计使用常规方法设计和合成。
利用基因组抽提试剂盒(Axygen公司)，提取阿维链霉菌，红霉糖多孢菌，枯草芽孢杆菌，ATCC欧文氏菌以及金黄色葡萄球菌的基因组DNA。以相应的基因组DNA为模版，使用PCR法扩增以上26个基因。
利用常规的Axygen DNA纯化试剂盒，对PCR产物进行纯化，然后将纯化DNA和pET21c/d质粒(购自Novagen)用限制性内切酶进行双酶切。纯化酶切后的PCR产物与质粒载体进行连接。所有重组克隆菌经过双酶切验证，表明本实施例成功构建了不同种属菌株来源MEP途径26个基因模块的克隆载体。
表2为所有克隆基因、相关质粒、克隆引物及其SEQ ID NO的信息。
表2
注：EC表示Escherichia coli,AV表示Streptomyces avermitilis,SE表示Saccharopolyspora erythraea,BS表示Bacillus subtilis,ATCC表示欧文氏菌,SA表示Staphylococcus aureus，单下划线表示克隆酶切位点，双下划线表示SpeI酶切位点。
实施例2
各基因模块的表达
将各含有各模块基因的质粒转化市售的大肠杆菌BL21(DE3),然后挑取单菌落培养过夜。按1%的接种量接种到含有2mlLB培养基(100ml/L氨苄青霉素)的试管中，37℃培养2h后，加入0.1mM IPTG，置于28℃，200rpm诱导培养6h。收集培养液中的菌体，用ddH2O悬浮后，制备SDS-PAGE的样品，然后进行蛋白电泳。
表达结果见图2-图6。图2-图6分别为MEP前体途径不同种属来源的dxs模块、dxr模块基因、ispD模块基因、ispF模块基因和idi模块基因的表达结果，dxs2AV，dxs1AV，dxs SE，dxr SE，dxr ATCC，dxr BS以及ispD SE，由上海博尚生物技术有限公司进行测序确认。
实施例3
番茄红素的异源合成
番茄红素的合成途径位于质粒pAC-LYC中(该质粒pAC-LYC见Cunningham,F.X.,et al.,Molecular structure and enzymatic function of lycopene cyclase fromthe cyanobacterium Synechococcus sp strain PCC7942.The Plant Cell Online,1994.6(8):p.1107-1121，其中含有草生欧文氏菌(Pantoea agglomerans)来源的crtE，crtB，crtI基因簇。
将实施例1制备的含有MEP途径各模块基因的质粒与pAC-LYC共转化BL21(DE3)。挑取单菌落，过夜培养作为发酵种子。按2%的接种量将种子接种到含有10ml加有相应抗生素的TB培养基，用0.1mMIPTG初始诱导。250rpm，28℃培养三天，用比色法测定番茄红素的产量。
绘制番茄红素定量的标准曲线，将番茄红素的标准品进行一定梯度稀释，测定OD475值。番茄红素的标准曲线为y(OD475)=0.3192x(mg/L)-0.014(R2=0.9974)。根据番茄红素发酵液的颜色深浅，吸取100ul或者500ul的发酵液，12000rpm离心2min，弃上清，用1ml ddH2O进行洗涤，然后再次离心弃上清，加入1ml丙酮，漩涡振荡后，在55℃温浴15min。期间边振荡边温浴。浸取结束后12000rpm，离心2min，取上清测定OD475值，根据标准曲线计算番茄红素产量。
结果见图7、8、9、10、11，不同来源MEP途径模块表达对番茄红素合成的影响。结果表明，阿维链霉菌来源的dxs2，枯草芽孢杆菌来源的idi基因均能够显著的提高番茄红素的产量，其他如ATCC来源的ispD基因，大肠杆菌来源的ispF基因，阿维来源的idi基因也能够有效的提高番茄红素的产量。
由于dxs基因为MEP途径的第一个关键酶，因此将dxs2AV分别与各个效果较好的模块，包括dxr SE，ispD ATCC，ispF EC，idi BS，idi AV共同强化表达，检测番茄红素的产量。首先将dxs2AV构建到pET28a载体上(购自Novagen)，替换为卡那霉素抗性，用XbaI/HindIII双酶切质粒pET28a和pET21c-dxs2AV，回收pET28a载体及dxs2AV基因片段后，将用T4DNA连接酶将两者连接，构建pET28a-dxs2AV，即质粒pJF592，见表2。将含有dxr SE，ispD ATCC，ispF EC，idi BS，idi AV模块基因的质粒pJF585，pJF556，pJF43，pJF579，pJF580与pAC-LYC及pJF592共转化BL21(DE3)，用以上的方法进行发酵和产物检测后，测定番茄红素的产量。
结果见图12，图12为dxr SE，ispD ATCC，ispF EC，idi BS，idi AV模块基因与dxs2AV模块进行共同强化表达对番茄红素合成的影响。共同表达dxs2AV，idi BS或idi AV，均能够显著提高番茄红素的产量。在菌株BL21(DE3)pAC-LYC/pJF579/pJF592中，经过三天的摇瓶发酵后，番茄红素的产量达到20.57mg/L。
实施例4
紫槐二烯的异源合成
选取黄花蒿中的紫槐二烯合成酶基因(NCBI登录号AAF98444，ads)，并使用常规密码子优化的方法进行序列优化，使其在大肠杆菌中能够高效表达。将优化后的ads基因进行人工合成，克隆到质粒pET21d(购自Novagen)的NcoI/EcoRI中，构建为pET21d-ads。
利用以大肠杆菌MG1655的基因组作为模版，PCR扩增法尼基焦磷酸合成酶基因(ispA)。利用Axygen DNA纯化试剂盒将PCR产物纯化后，用NcoI/EcoRI酶切PCR产物和载体pET28a质粒。将酶切产物纯化，然后用T4DNA连接酶进行连接，构建质粒pET28a-ispA。
用XbaI/XhoI酶切质粒pET21d-ads，回收ads DNA片段，用SpeI/XhoI酶切质粒pET28a-ispA，回收酶切产物后与ads进行连接，构建质粒pET28a-ispA-ads，即pJF23。
为了进行模块叠加，本实施例还构架了pACYC-ispA-ads质粒，即pJF569。将载体pACYC-Duet-1(购自Novagen)与pET28a-ispA-ads分别用NcoI/HindIII进行双酶切，然后胶回收pACYC-Duet-1载体和ispA-ads基因片段，用T4DNA连接酶将两者连接后获得质粒pJF569。
pJF47的构建：提取E.coli MG1655的基因组，然后利用表3的引物，PCR扩增各基因，分别克隆到质粒pET21d的NcoI/EcoRI位点上，然后用SpeI/EcoRI酶切pET21c-ispF，XbaI/EcoRI酶切pET21d-idi，回收pET21c-ispF载体和idi基因片段，将两者连接，构建质粒pET21d-ispF-idi；接着将SpeI/EcoRI酶切pET21c-ispD，用XbaI/EcoRI酶切pET21d-ispF-idi，回收pET21c-ispD载体和ispF-idi基因片段，连接构建pET21d-ispD-ispF-idi；再将SpeI/EcoRI酶切pET21d-dxs，用XbaI/EcoRI酶切pET21d-ispD-ispF-idi，回收pET21d-dxs载体和ispD-ispF-idi基因片段，连接构建质粒pET21d-dxs-ispD-ispF-idi，命名为pJF47。
表3
将pJF23与含有dxs2AV，dxr SE，ispD ATCC，ispF EC，idi BS，idi AV基因模块的质粒pJF575，pJF585，pJF556，pJF43，pJF579，pJF580共同转化BL21(DE3)，同时将pJF23与pET21c，pJF47共转化作为评价的对照。获得单菌落按上述方法制备种子。按2%的接种量将种子接种到含有10ml加有相应抗生素的TB培养基，初始加有20%十二烷，用0.1mMIPTG初始诱导。250rpm，28℃培养三天，对紫槐二烯检测：吸取发酵液的十二烷上清，用乙酸乙酯稀释一定的倍数后，使石竹烯浓度在线性范围内(0.902-18.04mg/L)。加入4.51mg/L的石竹烯内标，GC-MS检测紫槐二烯。
紫槐二烯检测的GC-MS条件：采用Agilent7890-5975GC MS系统。柱子为HP-5MS，载气为氦气，流速1ml/min。进样量5ul，不分流，进样温度250℃。柱子升温程序为：80℃保持4min，以20℃/min升温至180℃，然后30℃/min升温到240℃。扫描方式：选择离子扫描(m/z189，204)。解离电压为70eV。
结果见图13：图13显示分别将dxs2AV，dxr SE，ispD ATCC，ispF EC，idiBS，idi AV基因模块与pJF23质粒共表达对紫槐二烯合成的影响。
再次将dxs2AV与dxr SE，ispD ATCC，ispF EC，idi BS，idi AV基因模块共同强化后检测的紫槐二烯的产量。首先将pJF585，pJF556，pJF43，pJF579，pJF580质粒分别于pJF592和pJF569分别共转化BL21(DE3)。获得单菌落按上述方法制备种子。按2%的接种量将种子接种到含有10ml加有相应抗生素的TB培养基，初始加有20%十二烷，用0.1mMIPTG初始诱导。250rpm，28℃培养三天，按上述方法进行紫槐二烯进行检测。
结果见图14：图14显示了将dxs2AV分别与dxr SE，ispD ATCC，ispF EC，idi BS，idi AV基因模块共强化后，对紫槐二烯合成的影响。
上述结果表明，共同表达dxs2AV，idi BS或idi AV，均能够显著提高紫槐二烯的产量(图11)。在菌株BL21(DE3)pET21d-dxs2AV-idi AV中，经过三天的摇瓶发酵后，紫槐二烯的产量达到250mg/L以上。在菌株BL21(DE3)pET21d-dxs2AV-idi BS中，经过三天的摇瓶发酵后，紫槐二烯的产量达到300mg/L以上。
实施例5
贝壳烯的异源合成
从美国国立生物信息学数据库中选取了来源于加拿大红豆杉(Taxuscanadensis)的牻牛儿牻牛儿焦磷酸合成酶(GGPPS，Genbank号AAD16018)、来源于甜叶菊(Stevia rebaudiana)的古巴焦磷酸合成酶(CDPS，Genbank号AAB87091)，贝壳烯合成酶(KS，Genbank号AAD34294)。
将牻牛儿牻牛儿焦磷酸合成酶、古巴焦磷酸合成酶、贝壳烯合成酶的相关基因克隆到pET21a(购自Novagen)上，进行重组载体的构建。
在ggpps基因的终止密码子TAA后加入SpeI酶切位点，然后将其克隆到质粒pET28a(购自Novagen)的NcoI/HindIII酶切位点上，得到pET28a-ggpps；在cdps，ks，ko的3个基因的终止密码子TAA后面分别加入SpeI位点，然后将这些基因分别克隆到质粒pET21a的NdeI/BamHI位点上，分别得到质粒pET21a-cdps、pET21a-ks。
采用了类似New England Biolab公司的BioBrick Assembly Kit试剂盒的方法，进行异源途径基因的串联组装；即用SpeI/HindIII双酶切质粒pET28a-ggpps，用XbaI/HindIII酶切质粒pET21a-cdps，分别用PCR清洁试剂盒直接回收pET28a-ggpps载体和胶回收cdps DNA片段；用T4DNA连接酶将pET28a-ggpps载体和cdps DNA片段进行连接，构建质粒pET28a-ggpps-cdps；采用相同的方法用再将ks串联，最终获得质粒pZQ3。
将pZQ3分别与pJF47，pJF575，pJF579，pJF580，pET21d-dxs2AV-idi AV共同转化BL21(DE3)。挑取单克隆接种到2ml含工作浓度抗生素的LB中过夜摇(约12h)，以2%接种量接到10ml的TB培养基中(100ml的小摇瓶)加入0.1mM的IPTG与工作浓度的Amp和Kan，2ml的十二烷。培养条件为28℃，250rpm，5天。收集发酵液，离心吸取十二烷层，利用GC-MS进行贝壳烯检测。
贝壳烯的GC-MS检测条件：采用Agilent7890-5975GC MS系统。柱子为HP-5MS，载气为氦气，流速1ml/min。进样量5ul，不分流，进样温度250℃。柱子升温程序为：100℃保持2min，以5℃/min升温至250℃，然后250℃保持15min。溶剂延迟4.50min。扫描方式：选择离子扫描(m/z272)。解离电压为70eV。
结果见图15：为dxs2AV，idi AV，idi BS模块基因强化后，对贝壳烯合成的影响。
上述结果表明，共同表达dxs2AV，idi BS或idi AV，均能够显著提高贝壳烯的产量；在菌株BL21(DE3)pET21d-dxs2AV-idi BS中，经过五天的摇瓶发酵后，贝壳烯的产量达到30.34mg/L以上。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (11)
1.一种底盘细胞，其特征在于，所述的底盘细胞含有提高所述底盘细胞生产萜类化合物能力的基因。
2.如权利要求1所述的底盘细胞，其特征在于，所述的底盘细胞是用于生产萜类化合物的底盘细胞，并且所述的基因是选自下述的至少一个基因或其组合：
来源于阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)的dxs2、idi、dxr、或ispD基因；
来源于红霉糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea)的dxr、ispD、idi1、或idi2基因；
来源于欧文氏菌ATCC55669(Erwinia taxi ATCC55669)的ispD基因；
来源于金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的idi基因；
来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的idi基因。
3.如权利要求1所述的底盘细胞，其特征在于，所述的底盘细胞为真核细胞(如酵母细胞)或原核细胞(如枯草芽孢杆菌细胞、大肠杆菌细胞)；较佳地为大肠杆菌细胞。
4.如权利要求1所述的底盘细胞，其特征在于，所述的萜类化合物选自下组：半萜(C5)类化合物、单萜(C10)类化合物、倍半萜(C15)类化合物、二萜(C20)类化合物、三萜(C20)类化合物、四萜(C40)类化合物、多萜类化合物、其他萜类生物碱化合物或其组合。
5.如权利要求1所述的底盘细胞，其特征在于，所述的基因选自下组：
(1)阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)来源的dxs2基因；
(2)阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)来源的idi基因；
(3)枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)来源的idi基因；
(4)上述(1)-(3)基因的任意组合；
较佳地，所述的基因是选自下组的基因组合：
(1)阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)来源的dxs2基因和阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)来源的idi基因的组合；
(2)阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)来源的dxs2基因和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)来源的idi基因的组合；
(3)阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)来源的idi基因和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)来源的idi基因的组合；
(4)阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)来源的dxs2基因的叠加。
6.如权利要求1或5所述的底盘细胞，其特征在于，所述的底盘细胞还含有任选自下组的基因或其组合：
来源于阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)的dxr、或ispD基因；
来源于红霉糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea)的dxr、ispD、idi1、或idi2基因；
来源于欧文氏菌ATCC55669(Erwinia taxi ATCC55669)的ispD基因；
来源于金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的idi基因；和/或
所述的底盘细胞还含有其它甲羟戊酸途径(MVA途径)和/或非甲羟戊酸途径(MEP途径)中的酶。
7.一种生产萜类化合物的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
(a)在适合表达的条件下，培养权利要求1-6中任一所述的底盘细胞，获得含有萜类化合物的培养物；
(b)从步骤(a)的培养物中分离出所述的萜类化合物；
其中，在步骤(a)中所述的底盘细胞含有或不含有外源的萜类化合物合成基因模块。
8.一种基因的用途，其特征在于，所述基因选自下组：
来源于阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)的dxs2、idi、dxr、或ispD基因；
来源于红霉糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea)的dxr、ispD、idi1、或idi2基因；
来源于欧文氏菌ATCC55669(Erwinia taxi ATCC55669)的ispD基因；
来源于金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的idi基因；
来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的idi基因；和/或
上述基因的任意组合，
其特征在于，所述的基因用于提高底盘细胞生产萜类化合物的能力。
9.一种基因的用途，其特征在于，所述基因选自下组：
(1)阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)来源的dxs2基因；
(2)阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)来源的idi基因；
(3)枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)来源的idi基因；
(4)上述(1)-(3)基因的任意组合；
所述的基因用于提高底盘细胞生产萜类化合物的能力。
10.一种分离的基因组合，其特征在于，所述的基因组合为：阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)来源的dxs2基因、阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)来源的idi基因、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)来源的idi基因的任意组合。
11.一种载体或载体混合物，其特征在于，所述的载体或载体混合物含有权利要求10所述的基因组合。
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