CN102978229A

CN102978229A - 蓝藻整合表达载体及其应用

Info

Publication number: CN102978229A
Application number: CN2012104809285A
Authority: CN
Inventors: 周杰; 张海峰; 张延平; 李寅
Original assignee: Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: Institute of Microbiology of CAS
Priority date: 2012-11-23
Filing date: 2012-11-23
Publication date: 2013-03-20
Anticipated expiration: 2032-11-23
Also published as: CN102978229B

Abstract

本发明公开了一种蓝藻整合表达载体及其应用。本发明所提供的载体为环状载体，包含如序列1所示的启动子Pcpc，以及位于所述启动子Pcpc下游如序列2所示的终止子TrbcL；所述环状载体还包含如下1）或2）：1）位于所述启动子Pcpc上游如序列3所示的DNA片段1，以及位于所述终止子TrbcL下游如序列4所示的DNA片段2；2）位于所述启动子Pcpc上游如序列5所示的DNA片段3，以及位于所述终止子TrbcL下游如序列6所示的DNA片段4。本发明所提供的载体可在蓝藻体内利用太阳能将CO₂高效合成化学品，把内源基因敲除和外源基因稳定、高效表达与改变蓝藻内源碳流相偶联，使外源基因在蓝藻中的表达量可达总可溶蛋白的15%，本发明为推动蓝藻产化学品工业化提供有力工具。

Description

蓝藻整合表达载体及其应用

技术领域

本发明涉及蓝藻整合表达载体及其应用。

背景技术

蓝藻（blue-green algae），又称蓝细菌（cyanobacteria），是可以进行放氧光合作用的原核生物。蓝藻广泛分布在淡水、海水甚至是污水中，能够利用CO₂和太阳能快速繁殖，是利用CO₂生物合成化学品的理想宿主。作为原核生物，蓝藻细胞结构简单、遗传背景与大肠杆菌相似，与植物细胞相比更易于基因操作。除培养成本低廉、可以光合自养外，有些蓝藻本身营养价值丰富、不含内毒素，具有大肠杆菌作为外源基因表达宿主无法比拟的优点。因此，从上个世纪九十年代开始，科研人员开始了在蓝藻中表达外源基因的种种尝试。已有在蓝藻中合成人过氧化物岐化酶、肿瘤坏死因子、乙醇及丁醇等化学品的成功案例。太阳能是地球上取之不尽的能源，而CO₂是导致全球变暖的温室气体，全球每年投入数以亿计资金用于CO₂减排。因此，通过对蓝藻进行遗传改造，使蓝藻利用太阳能把CO₂直接转化为化学品，将是解决全球原料短缺问题和CO2过渡排放环境问题的理想途径之一。

虽然蓝藻作为外源基因表达宿主及通过创建生物合成途径利用CO₂产大宗化学品的研究已引起国内外科研人员的极大热情，但由于蓝藻遗传操作工具匮乏限制了这一领域的发展，使本领域的研究尚处探索阶段。目前外源基因在蓝藻中表达最好的是人过氧化物岐化酶，表达量为总可溶蛋白的3%。该表达量虽然目前是蓝藻中最高的，但和商业用的大肠杆菌表达系统表达量（10-20%）相比还相差甚远。此外，该表达系统在蓝藻中是以质粒形式存在的，使菌株不稳定容易丢失。而在蓝藻中创建合成途径产大宗化学品的产量都很低，多为mg/L。提高CO₂生物合成化学品的转化效率、提高目标化学品产量是目前蓝藻利用CO₂生物合成化学品领域首要解决的问题。

不管是在蓝藻中简单表达一个外源基因产高附加值蛋白，还是创建新的合成途径产大宗化学品，都离不开对蓝藻遗传系统的改造。此外，对于创建合成途径产化学品，不仅需要高效表达系统还需要对蓝藻内源碳流进行有效控制，通过对内源碳流进行重新分配，使更多碳流向目标化学品合成，进而提高目标化学品产量。总之，目前蓝藻利用CO₂生物合成化学品领域遇到的瓶颈问题之一是缺乏强大的蓝藻遗传改造系统。

发明内容

本发明的目的是提供一种蓝藻整合表达载体及其应用。

本发明所提供的载体，包含启动子Pcpc，以及位于所述启动子Pcpc下游的终止子TrbcL；

所述启动子Pcpc和所述终止子TrbcL均来源于蓝藻；

所述启动子Pcpc的核苷酸序列如序列表中序列1所示；所述终止子TrbcL的核苷酸序列如序列表中序列2所示。

其中，序列1由560个核苷酸组成；序列2由179个核苷酸组成。

在本发明的一个实施例中，所述环状载体除包含所述启动子Pcpc，以及位于所述启动子Pcpc下游的终止子TrbcL外，还包含DNA片段1和DNA片段2；所述DNA片段1位于所述启动子Pcpc的上游，所述DNA片段2位于所述终止子TrbcL的下游；

所述DNA片段1和所述DNA片段2分别为来源于蓝藻基因组中聚羟基丁酸（PHB）合酶编码基因phaC&E的上下游600bp的片段，合称为同源臂1，命名为pha同源臂；

所述DNA片段1的核苷酸序列如序列表中序列3所示；所述DNA片段2的核苷酸序列如序列表中序列4所示。

其中，序列3由600个核苷酸组成；序列4由595个核苷酸组成。

在本发明的另一个实施例中，所述环状载体除包含所述启动子Pcpc，以及位于所述启动子Pcpc下游的终止子TrbcL外，还包含DNA片段3和DNA片段4；所述DNA片段3位于所述启动子Pcpc的上游，所述DNA片段4位于所述终止子TrbcL的下游；

所述DNA片段3和所述DNA片段4分别为来源于蓝藻基因组中磷酸转乙酰酶编码基因pta的上下游约600bp的片段，合称为同源臂2，命名为pta同源臂。

所述DNA片段3的核苷酸序列如序列表中序列5所示；所述DNA片段4的核苷酸序列如序列表中序列6所示。

其中，序列5由601个核苷酸组成；序列6由587个核苷酸组成。

在本发明中，在所述环状载体的所述启动子Pcpc和所述终止子TrbcL之间存在用于插入待表达基因的酶切位点，如酶切位点Kpn I和BamH I。

为了能够有效的筛选到阳性克隆，所述表达载体中还包含抗性基因。

在本发明中，所述抗性基因具体为卡那霉素抗性基因或氯霉素抗性基因。

所述卡那霉素抗性基因的序列具体如序列表中序列7所示；所述氯霉素抗性基因的序列具体如序列表中序列8所示。

其中，序列7由932个核苷酸组成；序列8由1050个核苷酸组成。

更加具体的，在本发明的一个实施例中，所述环状载体为将序列表中序列9所示的DNA片段（结构组成如下：UP-1（XhoI）Pcpc（KpnI）-（BamHI）TrbcL（XhoI）Km Down-1）与T-载体连接后得到的重组载体（pMD-Δpta::X）；在本发明的另一个实施例中，所述环状载体为将序列表中序列10所示的DNA片段（结构组成如下：UP-2（BamHI）Pcpc（KpnI）-（PstI）TrbcL（BamHI）Cm Down-2）与T-载体连接后得到的重组载体（pMD-Δpha::X）。

其中，序列9由2889个核苷酸组成；序列10由3014个核苷酸组成。所述T-载体具体可为pMD-18T-simple载体。

本发明还提供了所述环状载体的一个用途。

所述环状载体的用途具体为所述环状载体在蓝藻中表达目的蛋白的应用。

所述应用中，将所述目的蛋白的编码基因插入到所述环状载体pMD-Δpta::X或pMD-Δpha::X的所述启动子Pcpc和所述终止子TrbcL之间，得到整合表达载体，再将整合表达载体导入目的蓝藻中，所述整合载体与所述目的蓝藻通过所述pta同源臂或所述pha同源臂发生重组，获得重组蓝藻，培养所述重组蓝藻，获得所述目的蛋白。

在本发明中，所述目的蛋白具体为D-乳酸脱氢酶（Dldh）或反式烯酰辅酶A还原酶（Ter）。

更加具体的所述应用为：

其一，将D-乳酸脱氢酶的编码序列（如序列11）插入到载体pMD-Δpta::X的所述启动子Pcpc和所述终止子TrbcL之间，得到整合表达载体（pMD-Δpta::Dldh），将所述整合表达载体pMD-Δpta::Dldh导入蓝藻中，所述整合表达载体pMD-Δpta::Dldh与所述蓝藻通过所述pta同源臂发生同源重组，得到重组蓝藻（S.Δpta::Dldh），通过培养重组蓝藻获得大量D-乳酸脱氢酶；从所述重组蓝藻S.Δpta::Dldh的代谢产物中还可获得D-乳酸。

其二，将反式烯酰辅酶A还原酶的编码序列（如序列12）插入到载体pMD-Δpha::X的所述启动子Pcpc和所述终止子TrbcL之间，得到整合表达载体（pMD-Δpha::Ter），将所述整合表达载体pMD-Δpha::Ter导入蓝藻中，所述整合表达载体pMD-Δpha::Ter与所述蓝藻通过所述pha同源臂发生同源重组，得到重组蓝藻（S.Δpha::Ter），通过培养重组蓝藻获得大量反式烯酰辅酶A还原酶；从所述重组蓝藻S.Δpha::Ter的代谢产物中还可获得丁醇。

其中，序列11由1002个核苷酸组成；序列12由1194个核苷酸组成。

本发明的另一个目的是提供另一种整合表达载体。

所述整合表达载体具体为将待表达蛋白的编码基因插入到所述载体的所述启动子Pcpc和所述终止子TrbcL之间得到的重组载体。

在本发明中，所述整合表达载体具体为如下（a1）或（a2）：

（a1）在所述表达载体的所述启动子Pcpc和所述终止子TrbcL之间插入序列表中序列11所示DNA片段所形成的重组载体，即所述pMD-Δpta::Dldh；

（a2）在所述环状载体的所述启动子Pcpc和所述终止子TrbcL之间插入序列表中序列12所示DNA片段所形成的重组载体，即所述pMD-Δpha::Ter。

本发明还有一个目的是提供如下（1）或（2）的DNA片段：

（1）核苷酸序列为序列表中序列9所示的DNA片段；

（2）核苷酸序列为序列表中序列10所示的DNA片段。

本发明的再一个目的是提供一种重组蓝藻。

本发明所提供的重组蓝藻可为将所述整合表达载体导入到目的蓝藻中，所述整合表达载体与所述目的蓝藻通过同源臂发生同源重组后得到的重组蓝藻（如重组蓝藻S.Δpta::Dldh，或重组蓝藻S.Δpha::Ter）。

所述重组蓝藻S.Δpta::Dldh在制备D-乳酸中的应用也属于本发明的保护范围。

在所述应用中，发酵培养所述重组蓝藻S.Δpta::Dldh，收集发酵液获得D-乳酸。

所述发酵培养的方式为先光照振荡培养，再黑暗静止培养；所述发酵培养的温度为30℃；所述发酵所述重组蓝藻S.Δpta::Dldh培养的培养基为BG-11培养基；

所述光照振荡培养的光强为100μm/m²·s，振荡频率为130r/min，培养时间为培养至所述重组蓝藻S.Δpta::Dldh细胞密度达到OD₇₃₀=1.5；

所述黑暗静止培养的培养时间为72小时。

所述重组蓝藻S.Δpha::Ter在制备丁醇中的应用也属于本发明的保护范围。

在所述应用中，发酵培养所述重组蓝藻S.Δpha::Ter，收集发酵液获得丁醇。

所述发酵培养的方式为先光照振荡培养，再黑暗静止培养；所述发酵培养的温度为30℃；所述发酵所述重组蓝藻S.Δpha::Ter培养的培养基为BG-11培养基；

所述光照振荡培养的光强为100μm/m²·s，振荡频率为130r/min，培养时间为培养至所述重组蓝藻S.Δpha::Ter细胞密度达到OD₇₃₀=1.5；

所述黑暗静止培养的培养时间为72小时。

在本发明中，所述蓝藻具体为淡水蓝藻集胞藻6803。

本发明所提供的蓝藻高效表达系统，使蓝藻可以利用太阳能将CO₂高效合成化学品（包括在蓝藻中表达单个基因直接生产蛋白质和创建合成途径生产大宗化学品）；把内源基因敲除和外源基因的稳定、高效表达与改变蓝藻内源碳流相偶联；使外源基因在蓝藻中的表达量可以达到总可溶蛋白的15%，可与大肠杆菌高效表达系统的表达量相比；使依赖乙酰辅酶A的大宗化学品产量显著提高，为提高蓝藻利用CO₂生物合成化学品产量、推动蓝藻产化学品工业化提供有力工具。

附图说明

图1为整合表达载体pMD-Δpta::X和pMD-Δpha::X的构建流程图。其中，A为pMD-Δpta::X；B为pMD-Δpha::X。A中，pta up即表示UP-1片段（pta同源臂中的上游同源臂），pta down即表示DOWN-1片段（pta同源臂中的下游同源臂）。B中，phaE up即表示UP-2片段（pha同源臂中的上游同源臂），phaC down即表示DOWN-2片段（pha同源臂中的下游同源臂）。

图2为重组蓝藻S.Δpta::Dldh基因水平鉴定图。

图3为重组蓝藻S.Δpta::Dldh蛋白水平鉴定图。

图4为HPLC检测重组蓝藻S.Δpta::Dldh发酵液中产物D-乳酸及乙酸含量。

图5为重组蓝藻S.Δpha::Ter基因水平鉴定图。

图6为重组蓝藻S.Δpha::Ter蛋白水平鉴定图。

图7为GC-MS检测重组蓝藻S.Δpha::Ter发酵液中产物丁醇及聚羟基丁酸（PHB）。A为丁醇检测结果；B为聚羟基丁酸（PHB）检测结果。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

大肠杆菌（E.coli）DH5α购自北京全式金生物技术有限公司。

载体pMD-18T-simple：购自北京全式金生物技术有限公司。

淡水蓝藻集胞藻6803（Synechocystis sp.PCC 6803）属于色球藻科、集胞藻属；参考文献：Zhang S,Spann K W，et al.Identification of two genes,sll0804 and slr1306,as putative componentsof the CO₂-concentrating mechanism in the cyanobacterium Synechocystis sp.strain PCC 6803.JBacteriol.2008,190:8234-8237，公众可从中国科学院微生物研究所获得。

质粒pRL271：参考文献：Wei TF,Ramasubramanian TS,et al.Anabaena sp.strain PCC 7120ntcA gene required for growth on nitrate and heterocyst development.J Bacteriol.1994,176:4473-4482。

蓝藻表达载体pAM2770：参考文献：Wu X,Li DW，et al.The Anabaena sp.strain PCC 7120asr1734 gene encodes a negative regulator of heterocystis Development.MoleculMicrobiol.2007,64:782-794，公众可从中国科学院微生物研究所获得。

BG-11培养基组成见表1。

Trace metal mix A5组成见表2。

表1BG-11培养基组成

组分	含量（/L）
		NaNO₃	1.5g
K₂HPO₄	0.04g
		MgSO₄·7H₂O	0.075g
CaCl₂·2H₂O	0.036g
		柠檬酸（Citric acid）	0.006g
柠檬酸铁铵（Ferric ammonium citrate）	0.006g
		EDTA(disodium salt)	0.001g
Na₂CO₃	0.02g
		Trace metal mix A5（组成见表2）	1.0ml
琼脂Agar	10.0g

蒸馏水	1.0L
		pH	8.0

注：其中组分琼脂Agar在相应的液体培养基中则不含。

表2Trace metal mix A5组成

组分	含量（/L）
		H₃BO₃	2.86g
MnCl₂·4H₂O	1.81g
		ZnSO₄·7H₂O	0.222g
NaMoO₄·2H₂O	0.39g
		CuSO₄·5H₂O	0.079g
Co(NO₃)₂·6H₂O	49.4mg
		蒸馏水	1.0L

实施例1、蓝藻高效稳定遗传操作系统pMD-Δpta::X的构建及其应用

本实施例构建取代淡水蓝藻集胞藻6803（Synechocystis sp.PCC 6803）基因组上磷酸转乙酰酶编码基因pta的高效、整合表达载体。磷酸转乙酰酶是从乙酰辅酶A到乙酸合成途径的关键酶，因此，用外源基因表达盒取代pta基因，可以阻断乙酸合成。使用该表达载体可以实现把蓝藻内源基因pta敲除和外源基因在蓝藻中的高效表达与改变内源碳流相结合。

一、蓝藻整合表达载体pMD-Δpta::X的构建

1、构建带有蓝藻高效表达元件的中间载体pMD-PcpcTrbcL1

（1）克隆蓝藻内源强启动子Pcpc

以淡水蓝藻集胞藻6803的基因组DNA为模板，通过PCR扩增藻蓝蛋白β亚基编码基因cpcB上游560bp序列作为启动子Pcpc。

PCR扩增Pcpc的引物对如下：

PcpcF1：5’-CTCGAGacctgtagagaagagtccctgaa-3’（大写部分为Xho I的识别位点，其后的序列为序列1的第1-23位）

PcpcR1：5’-GGTACCtgaattaatctcctacttgactttatg-3’（大写部分为Kpn I的识别位点，其后的序列为序列1的第534-560位的反向互补序列）

将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果显示，PCR扩增得到了大小约为560bp的目的条带，进一步测序表明PCR产物为两端带有相应酶切位点的启动子Pcpc序列，启动子Pcpc的核苷酸序列如序列表中序列1所示，具体由560个核苷酸组成。

（2）克隆蓝藻内源强终止子TrbcL

以淡水蓝藻集胞藻6803的基因组DNA为模板，通过PCR扩增1.5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶大亚基编码基因下游179bp序列作为终止子TrbcL。

PCR扩增TrbcL的引物对如下：

TrbcLF1：5’-agtcagGGATCCaccggtgtttggattgtcgg-3’（大写部分为BamH I的识别位点，其后的序列为序列2的第1-20位）

TrbcLR1：5’-CTCGAGgctgtcgaagttgaacatcag-3’（大写部分为Xho I的识别位点，其后的序列为序列2的第159-179位的反向互补序列）

将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果显示，PCR扩增得到了大小约为179bp的目的条带，进一步测序表明PCR产物为两端带有相应酶切位点的终止子TrbcL序列。终止子TrbcL的核苷酸序列如序列表中序列2所示，具体由179个核苷酸组成。

（3）构建中间载体pMD-PcpcTrbcL1

将步骤（1）和（2）获得的启动子Pcpc和终止子TrbcL同时作为模板，用PcpcF1、PcpcTrbcLRF1、TrbcLF1和TrbcLR1组成的引物组合进行融合PCR。

融合PCR所用引物为：

PcpcTrbcLRF1：

5’-ccgacaatccaaacaccggtGGATCCctgact-GGTACCtgaattaatctcctacttgactttatg-3’（大写部分依次分别为BamH I和Kpn I的识别位点，BamH I之前的序列为序列2的第1-10位的反向互补序列，“-”后的序列为序列1的第534-560位的反向互补序列）

将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果显示，PCR扩增得到了大小约为750bp的目的条带，进一步测序表明PCR产物的核苷酸序列如序列表中序列9的第602-1370位所示。该PCR产物是步骤（1）和（2）获得的启动子Pcpc和终止子TrbcL的融合片段，其结构组成为(XhoI)Pcpc(KpnI)-(BamHI)TrbcL(XhoI)，将该融合片段命名为DNA片段PcpcTrbcL 1。将DNA片段PcpcTrbcL1连接到载体pMD-18T-simple上，测序表明序列信息正确，且插入方向正确的重组载体为阳性载体，将其命名为pMD-PcpcTrbcL1。

2、构建蓝藻整合载体pMD-Δpta

（1）克隆上游同源臂和下游同源臂

以淡水蓝藻集胞藻6803的基因组DNA为模板，分别PCR扩增得到Up-1片段和Down-1片段。Up-1片段为蓝藻基因组DNA中乙酸合成途径第一个酶的编码基因——乙酰磷酸转移酶基因（pta）上游DNA片段，Down-1片段为蓝藻基因组DNA中pta基因下游DNA片段。

PCR扩增Up-1片段的引物对如下：

Up1F：5’-ATCGAGCCATGTTGCATCTA-3’（序列5的第1-20位）；

Up1R：5’-CTCGAGCTAAACTCACCGCTTCATGG-3’（下划线处为Xho Ⅰ识别位点，其后的序列为序列5的第582-601位的反向互补序列）

PCR扩增Down-1片段的引物对如下：

Down1F：5’-CCGGTAACAATACTTACAAGGC-3’（序列6的第1-22位）；

Down1R：5’-GCTGTGGTGGGACTGTTTCA-3’（序列6的第568-587位的反向互补序列）。

将利用上述扩增Up-1片段的引物对进行PCR扩增所得的产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果显示，PCR扩增得到了大小约为600bp的目的条带，进一步测序表明PCR产物为两端带有相应酶切位点的Up-1片段序列。Up-1片段的核苷酸序列如序列表中序列5所示，具体由601个核苷酸组成。

将利用上述扩增Down-1片段的引物对进行PCR扩增所得的产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果显示，PCR扩增得到了大小约为600bp的目的条带，进一步测序表明PCR产物为两端带有相应酶切位点的Down-1片段序列。Down-1片段的核苷酸序列如序列表中序列6所示，具体由587个核苷酸组成。

将Up-1片段（上游同源臂）和Down-1片段（下游同源臂）合称为pta同源臂。

（2）卡那霉素抗性基因的制备

以蓝藻表达载体pAM2770为模板，PCR扩增卡那霉素抗性基因（Km基因）。

PCR扩增卡那霉素抗性基因的引物对如下：

KmF：5’-GATCAAGAGA CAGGATGAGG-3’（序列7的第1-20位）；

KmR：5’-AACGATTCCGAAGCCCAACC-3’（序列7的第913-932位的反向互补序列）

将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果显示，PCR扩增得到了大小约为1000bp的目的条带，进一步测序表明PCR产物为卡那霉素抗性基因的核苷酸序列如序列表中序列7所示，具体由932个核苷酸组成。

（3）构建蓝藻整合载体pMD-Δpta

将步骤（1）和（2）获得的Up-1片段、Km基因和Down-1片段同时作为模板，用Up1F、Up1KmRF、KmF-Xho、Kmdown1RF、Down1F和Down1R组成的引物组合进行融合PCR。

融合PCR所用引物为：

Up1F：5’-ATCGAGCCATGTTGCATCTA-3’（序列5的第1-20位）；

Up1KmRF：

5’-CTCGAGCCTCATCCTGTCTCTTGATC-CTAAACTCACCGCTTCATGG-3’（下划线处为Xho Ⅰ识别位点，其后至“-”前的序列为序列7的第1-20位的反向互补序列，“-”后的序列为序列5的第582-601位的反向互补序列）

KmF-Xho：5’-CTCGAGGATCAAGAGACAGGATGAGG-3’（下划线处为Xho Ⅰ的识别位点，其后的序列为序列7的第1-20位）；

Kmdown1RF：

5’-GCCTTGTAAGTATTGTTACCGG-AACGATTCCGAAGCCCAACC-3’（“-”前的序列为序列6的第1-22位的反向互补序列，“-”后的序列为序列7的第913-932位的反向互补序列）；

Down1F：5’-CCGGTAACAATACTTACAAGGC-3’（序列6的第1-22位）；

将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果显示，PCR扩增得到了大小约为2000bp的目的条带，进一步测序表明PCR产物的核苷酸序列为“序列5+CTCGAG+序列7+序列6”。该PCR产物是步骤（1）和（2）获得的Up-1片段、Km基因和Down-1片段的融合片段，其结构组成为UP-1(XhoI)KmDown-1，将该融合片段命名为DNA片段Up1Kmdown1。将DNA片段Up1Kmdown1连接到载体pMD-18T-simple上，测序表明序列信息正确，且插入方向正确的重组载体为阳性载体，将其命名为pMD-Δpta。

3、蓝藻整合表达载体pMD-Δpta::X的构建

用限制性内切酶Xho I酶切步骤1获得的载体pMD-PcpcTrbcL，获得酶切后的DNA片段PcpcTrbcL，将其与经过同样双酶切的步骤2获得的载体pMD-Δpta线性片段相连，获得重组载体。将测序表明含有序列表中序列9所示DNA片段（UP-1(XhoI)Pcpc(KpnI)-(BamHI)TrbcL(XhoI)KmDown-1），且插入方向正确的重组载体命名为pMD-Δpta::X。重组载体pMD-Δpta::X为含有pta同源臂、筛选标记（卡那霉素抗性基因）和高效表达元件（启动子Pcpc和终止子TrbcL）的整合表达载体，其质粒图谱如图1中A所示。

二、用整合表达载体pMD-Δpta::X在蓝藻中表达D-乳酸脱氢酶编码基因Dldh

1、构建Dldh基因整合表达载体pMD-Δpta::Dldh

（1）D-乳酸脱氢酶编码基因Dldh的获得

根据德式乳酸菌（Lactobacillus delbrueckii）基因组数据库所提供的D-乳酸脱氢酶编码基因序列，委托上海生物工程公司优化合成两端带有酶切位点Kpn I的D-乳酸脱氢酶编码基因Dldh，Dldh基因的核苷酸序列如序列表中序列11所示。

（2）整合表达载体pMD-Δpta::Dldh的构建

用限制性内切酶Kpn I酶切步骤（1）获得的Dldh基因，将其与经过同样酶切的步骤一获得的整合表达载体pMD-Δpta::X的线性片段相连，获得重组载体。将测序表明含有序列表中序列11所示DNA片段（Dldh基因），且插入方向正确的重组载体命名为pMD-Δpta::Dldh。

2、重组蓝藻S.Δpta::Dldh的制备和鉴定

（1）重组蓝藻的制备

用步骤1获得的整合表达载体pMD-Δpta::Dldh转化淡水蓝藻集胞藻6803，使用终浓度为10μg/ml的卡那霉素筛选重组菌（转化子）。具体操作如下：

A实验准备：

1）硝酸纤维素膜：ddH₂O清洗3次；再于微波炉中煮沸3次，每煮沸一次，换一次ddH₂O；洗涤完毕后，加入ddH₂O使之没过硝酸纤维素膜，最后高压灭菌。

2）BG-11培养基固体平板：不加抗生素和加抗生素（10μg/ml的卡那霉素）固体平板各若干个，在不加抗生素平板上铺上硝酸纤维素膜。

3）藻株准备：从淡水蓝藻集胞藻PCC6803平板上刮取多个藻落，接种到BG-11液体培养基中；再于30℃、30μE.m^-2.s^-1的条件下培养至对数期(OD₇₃₀为0.5～1.2)，即可用于转化。

B实验步骤：

1）5,000g离心5分钟收集藻细胞；

2）用新鲜BG-11液体培养基洗涤细胞两次后，按1×10⁹细胞·mL^-1（OD₇₃₀=2.5；1×10⁸细胞浓度的藻液OD₇₃₀=0.25）的浓度将细胞重悬于BG-11液体培养基中；

3）温育：取0.4mL浓缩后的藻液到新的无菌EP管，加入质粒DNA—pMD-Δpta::Dldh（终浓度10μg·mL^-1）混匀，30μE.m^-2.s^-1光照30℃温育4～5hr；

4）涂膜：将藻-DNA混合物涂在含有NC膜的BG-11固体平板（不含抗生素）上，光照条件下，30μE.m^-2.s^-1、30℃温育18～24hr；

5）转膜：将NC膜转移到含有抗生素的BG-11固体平板上，于30μE.m^-2.s^-1、30℃培养约一周左右即有转化子长出。

6）用无菌牙签挑取转化子在新的相同抗性的BG-11固体平板上划线，待藻落富集后再接入BG-11液体培养基中进一步分离筛选，获得重组蓝藻。

同时设置转入整合表达载体pMD-Δpta::X的空载体对照。

（2）基因水平鉴定

分别以步骤（1）获得的转入整合表达载体pMD-Δpta::Dldh的重组蓝藻以及转入空载体pMD-Δpta::X的重组蓝藻的基因组DNA为模板，用DldhF和DldhR组成的引物对进行PCR扩增，PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。

DldhF：5’-ctgactGGTACCATGACTAAAATCTTCGCCTACGC-3’（下划线处为Kpn I的识别位点，其后的序列为序列11的第1-23位）

DldhR：5’-ctgactGGTACC TTAACCCACT TTAACCGGCG-3’（下划线处为Kpn I的识别位点，其后的序列为序列11的第983-1002位的反向互补序列）

电泳结果如图2所示，从图中可以看出转入整合表达载体pMD-Δpta::Dldh的重组蓝藻扩增到约1000bp的DNA片段，而转入空载体pMD-Δpta::X的重组蓝藻没有扩增到DNA片段，与预期结果相符。进一步对由转入整合表达载体pMD-Δpta::Dldh的重组蓝藻扩增得到的约1000bp的DNA片段进行测序验证，结果表明该DNA片段为两端带有相应酶切位点的Dldh基因序列。Dldh基因的核苷酸序列如序列表中序列11所示。将经PCR扩增及测序鉴定正确的重组蓝藻命名为S.Δpta::Dldh。在重组蓝藻S.Δpta::Dldh中，Dldh基因的插入位点为乙酸合成途径的第一个酶的编码基因pta基因，即Dldh基因取代了pta。因此，在重组蓝藻S.Δpta::Dldh中，乙酸合成途径已被干扰。同时将转入空载体pMD-Δpta::X的重组蓝藻命名为S.Δpta。

（3）蛋白水平鉴定

取等量的重组蓝藻S.Δpta（空载体对照）及表达Dldh基因的重组蓝藻S.Δpta::Dldh，破碎细胞，取上清，进行12%的SDS-PAGE电泳。

结果如图3所示，在重组蓝藻S.Δpta::Dldh中有36.5kD的蛋白条带，该大小与D-乳酸脱氢酶（Dldh）理论计算的分子量大小相符，而作为空载体对照的重组蓝藻S.Δpta中没有。这一结果说明Dldh已在蓝藻中成功表达，根据已知蛋白条带浓度的Marker进行比较，可知表达量约占细胞总可溶蛋白的15%。

（4）检测重组蓝藻S.Δpta::Dldh发酵液中目标产物D-乳酸

由于通常在发酵时才会产乳酸，因此，本发明的发明人在正常培养条件下培养细胞，当生物量积累到一定程度，采用暗发酵培养进行诱导。

1）重组蓝藻S.Δpta::Dldh、重组蓝藻S.Δpta（空载体对照），以及未经转化的蓝藻集胞藻6803（野生型对照）置于光照培养箱中振荡培养至对数生长后期（使其细胞密度达到OD₇₃₀=1.5）；温度为30℃，光强为100μm/m2·s，振荡频率为130r/min，培养基为BG-11液体培养基。

2）然后将重组蓝藻S.Δpta::Dldh、重组蓝藻S.Δpta（空载体对照），以及未经转化的蓝藻集胞藻6803（野生型对照，WT）黑暗静止培养72小时，使其进行自发酵。温度为30℃；培养基为BG-11液体培养基。

3）离心，取上清，用液相色谱检测D-乳酸的产生。

色谱条件：Agilent 1200液相色谱仪，示差检测器；BioRad Aminex HPX-87 H有机酸柱（300×7.8mm），柱温15℃；上样量10μl；流动相为0.05mM H₂SO₄溶液，流速0.5ml/min。D-乳酸标准品为和光纯莱工业株式会社公司产品。

D-乳酸检测结果见图4及表3，D-乳酸出峰时间在15分钟左右。根据标准曲线（y=86400x+4000，R²=0.999；其中x表示峰面积，y表示D-乳酸产量）计算出S.Δpta和S.Δpta::Dldh的乳酸产量分别约为0.08g/L和1.1g/L。S.Δpta::Dldh中乳酸产量明显高于作为空载体对照组的S.Δpta，证明重组蓝藻S.Δpta::Dldh表达的Dldh有活性。而野生型对照（WT）基本上检测不到D-乳酸的产生。

表3发酵液中D-乳酸含量检测三次重复结果（单位：g/L）

	重复1	重复2	重复3	平均值
					S.Δpta::Dldh	0.9	1.2	1.2	1.1
S.Δpta	0.07	0.08	0.09	0.08

另外，采用上述的培养方式及色谱条件，以北京现代东方精细化学品有限公司的乙酸（货号为20110402）作为标准品，对重组蓝藻S.Δpta::Dldh、重组蓝藻S.Δpta（空载体对照），以及未经转化的蓝藻集胞藻6803（野生型对照）发酵产乙酸量进行测定。结果显示，与野生型对照相比，S.Δpta和S.Δpta::Dldh发酵液中乙酸产量明显降低（图4），究其原因在于：由于外源基因Dldh在重组蓝藻S.Δpta::Dldh中的插入位点pta基因是乙酸合成途径第一个酶的编码基因，外源基因Dldh的插入抑制了乙酸合成途径。这说明使用遗传操作系统pMD-Δpta::X同时实现了内源基因敲除、外源基因稳定高效表达及重新分配内源碳流。

实施例2、构建蓝藻高效稳定遗传操作系统pMD-Δpha::X及其应用

本实施例构建取代淡水蓝藻集胞藻6803（Synechocystis sp.PCC 6803）基因组上聚羟基丁酸（PHB）合酶的编码基因phaC&E的高效、整合表达载体。聚羟基丁酸（PHB）合酶是PHB合成途径中关键酶，因此，用外源基因表达盒取代phaC&E基因，可以阻断聚羟基丁酸（PHB）的合成。使用该表达载体可以实现把蓝藻内源基因phaC&E敲除和外源基因在蓝藻中的高效表达与改变内源碳流相结合。

一、蓝藻整合表达载体pMD-Δpha::X的构建

1、构建带有蓝藻高效表达元件的中间载体pMD-PcpcTrbcL2

（1）克隆蓝藻内源强启动子Pcpc

PCR扩增Pcpc的引物对如下：

PcpcF2：5’-GGATCCacctgtagagaagagtccctgaa-3’（大写部分为BamH I的识别位点，其后的序列为序列1的第1-23位）

PcpcR2：5’-ctgactGGTACCtgaattaatctcctacttgactttatg-3’（大写部分为Kpn I的识别位点，其后的序列为序列1的第534-560位的反向互补序列）

将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果显示，PCR扩增得到了大小约560bp的目的条带，进一步测序表明PCR产物为两端带有相应酶切位点的启动子Pcpc序列。启动子Pcpc序列的核苷酸序列如序列表中序列1所示。

（2）克隆蓝藻内源强终止子TrbcL

PCR扩增TrbcL的引物对如下：

TrbcLF2：5’-CTGCAGaccggtgtttggattgtcgg-3’（大写部分为Pst I的识别位点，其后的序列为序列2的第1-20位）

TrbcLR2：5’-GGATCCgctgtcgaagttgaacatcag-3’（大写部分为BamH I的识别位点，其后的序列为序列2的第159-179位的反向互补序列）

（3）构建中间载体pMD-PcpcTrbcL2

将步骤（1）和（2）获得的启动子Pcpc和终止子TrbcL同时作为模板，用PcpcF2、PcpcTrbcLRF2、TrbcLF2和TrbcLR2组成的引物组合进行融合PCR。

融合PCR所用引物为：

PcpcTrbcLRF2：

5’-ccgacaatccaaacaccggtCTGCAG-ctgactGGTACCtgaattaatctcctacttgactttatg-3’（大写部分依次分别为Pst I和Kpn I的识别位点，Pst I前的序列为序列2的第1-20位的反向互补序列，Kpn I后的序列为序列1的第534-560位的反向互补序列）

将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果显示，PCR扩增得到了大小约750bp的目的条带，进一步测序表明PCR产物的核苷酸序列如序列表中序列10的第601-1369位所示。该PCR产物是步骤（1）和（2）获得的启动子Pcpc和终止子TrbcL的融合片段，其结构组成为(BamHI)Pcpc(KpnI)-(PstI)TrbcL(BamHI)，将该融合片段命名为DNA片段PcpcTrbcL2。将DNA片段PcpcTrbcL2连接到载体pMD-18T-simple上，测序表明序列信息正确，且插入方向正确的重组载体为阳性载体，将其命名为pMD-PcpcTrbcL2。

2、构建蓝藻整合载体pMD-Δpha

（1）克隆上游同源臂和下游同源臂

以淡水蓝藻集胞藻6803的基因组DNA为模板，分别PCR扩增得到Up-2片段和Down-2片段。Up-2片段为蓝藻基因组DNA中PHB合成途径中关键酶——PHB合酶的编码基因（phaC&E）上游DNA片段，Down-2片段为蓝藻基因组DNA中基因phaC&E下游DNA片段。

PCR扩增Up-2片段的引物对如下：

Up2F：5’-TCTTCCCCCAGGCGATCGCC-3’（序列3的第1-20位）；

Up2R：5’-GGATCCGGTCAAAATCCACCTTACTACTGGC-3’（下划线处为BamH Ⅰ的识别位点，其后的序列为序列3的第576-600位的反向互补序列）

PCR扩增Down-2片段的引物对如下：

Down2F：5’-TTGCTGGAATACATTAGGGCAAC-3’（序列4的第1-23位）；

Down2R：5’-GATATCGAAGCGGACAACGGCAT-3’（第2-23位为序列4的第574-595位的反向互补序列）。

将利用上述扩增Up-2片段的引物对进行PCR扩增所得的产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果显示，PCR扩增得到了大小约为600bp的目的条带，进一步测序表明PCR产物为两端带有相应酶切位点的Up-2片段序列。Up-2片段的核苷酸序列如序列表中序列3所示，具体由600个核苷酸组成。

将利用上述扩增Down-2片段的引物对进行PCR扩增所得的产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果显示，PCR扩增得到了大小约为600bp的目的条带，进一步测序表明PCR产物为两端带有相应酶切位点的Down-2片段序列。Down-2片段核苷酸序列如序列表中序列4所示，具体由595个核苷酸组成。

将Up-2片段（上游同源臂）和Down-2片段（下游同源臂）合称为pha同源臂。

（2）氯霉素抗性基因的制备

以质粒pRL271为模板，PCR扩增氯霉素抗性基因（Cm基因）。

PCR扩增氯霉素抗性基因的引物对如下：

CmF：5’-GGATCCGTTGATAATGAACTGTGCTGAT-3’（下划线处为BamH Ⅰ的识别位点，其后的序列为序列8的第1-22位）；

CmR：5’-ATCGAATTTCTGCCATTCATCCG-3’（序列8的第1028-1050位的反向互补序列）。

（3）构建蓝藻整合载体pMD-Δpha

将步骤（1）和（2）获得的Up-2片段、Cm基因和Down-2片段同时作为模板，用Up2F、Up2CmRF、CmF、Cmdown2RF、Down2F和Down2R组成的引物组合进行融合PCR。

融合PCR所用引物为：

Up2F：5’-TCTTCCCCCAGGCGATCGCC-3’（序列3的第1-20位）

Up2CmRF：

5’-ATCAGCACAGTTCATTATCAAC-GGATCCGGTCAAAATCCACCTTACTACTGGC-3’（第1-22位为序列8的第1-22位的反向互补序列，下划线处为BamH Ⅰ的识别位点，其后的序列为序列3的第576-600位的反向互补序列）

Cmdown2RF：

5’-GTTGCCCTAATGTATTCCAGCAA-ATCGAATTTCTGCCATTCATCCG-3’（“-”前的序列为序列4的第1-23位的反向互补序列，“-”后的序列为序列8的第1028-1050位的反向互补序列）。

Down2F：5’-TTGCTGGAATACATTAGGGCAAC-3’（序列4的第1-23位）；

将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果显示，PCR扩增得到了大小约为2200bp的目的条带，进一步测序表明PCR产物的核苷酸序列为“序列3+GGATCC+序列8+序列4”。该PCR产物是步骤（1）和（2）获得的Up-2片段、Cm基因和Down-2片段的融合片段，其结构组成为UP-2(BamHI)CmDown-2，将该融合片段命名为DNA片段Up2Cmdown2。将DNA片段Up2Cmdown2连接到载体pMD-18T-simple上，测序表明序列信息正确，且插入方向正确的重组载体为阳性载体，将其命名为pMD-Δpha。

3、蓝藻整合表达载体pMD-Δpha::X的构建

用限制性内切酶BamH I酶切步骤1获得的载体pMD-PcpcTrbcL2，获得酶切后的DNA片段PcpcTrbcL2，将其与经过同样双酶切的步骤2获得的载体pMD-Δpha线性片段相连，获得重组载体。将测序表明含有序列表中序列10所示DNA片段（UP-2(BamHI)Pcpc(KpnI)-(PstI)TrbcL(BamHI)CmDown-2），且插入方向正确的重组载体命名为pMD-Δpha::X。重组载体pMD-Δpha::X为含有pha同源臂、筛选标记（氯霉素抗性基因）和高效表达元件（启动子Pcpc和终止子TrbcL）的整合表达载体，其质粒图谱如图1中B所示。

二、用整合表达载体pMD-Δpha::X在蓝藻中表达反式烯酰辅酶A还原酶编码基因Ter

1、构建Ter基因整合表达载体pMD-Δpha::Ter

（1）反构建式烯酰辅酶A还原酶编码基因Ter的获得

根据齿垢密螺旋体（Treponema denticola）基因组数据库所提供的反式烯酰辅酶A还原酶基因的编码序列，委托上海生物工程公司优化合成两端带有酶切位点Kpn I的反式烯酰辅酶A还原酶编码基因Ter，其核苷酸序列如序列表中序列12所示。

（2）整合表达载体pMD-Δpha::Ter的构建

用限制性内切酶Kpn I酶切步骤（1）获得的Ter基因，将其与经过同样酶切的步骤一获得的整合表达载体pMD-Δpha::X的线性片段相连，获得重组载体。将测序表明含有序列表中序列12所示DNA片段（Ter基因），且插入方向正确的重组载体命名为pMD-Δpha::Ter。

2、重组蓝藻S.Δpha::Ter的制备和鉴定

（1）重组蓝藻的制备

用步骤1获得的整合表达载体pMD-Δpha::Ter转化淡水蓝藻集胞藻6803，使用终浓度为10μg/ml的氯霉素筛选重组菌（转化子）。具体操作如下：

A实验准备：

2）BG-11培养基固体平板：不加抗生素和加抗生素（10μg/ml的氯霉素）固体平板各若干个，在不加抗生素平板上铺上硝酸纤维素膜。

B实验步骤：

1）5,000g离心5分钟收集藻细胞；

3）温育：取0.4mL浓缩后的藻液到新的无菌EP管，加入质粒DNA—pMD-Δpha::Ter（终浓度10μg·mL^-1）混匀，30μE.m^-2.s^-1光照30℃温育4～5hr；

同时设置转入整合表达载体pMD-Δpha::X的空载体对照。

（2）基因水平鉴定

分别以步骤（1）获得的转入整合表达载体pMD-Δpha::Ter的重组蓝藻、未经转化的蓝藻集胞藻6803，以及转入空载体pMD-Δpha::X的重组蓝藻的基因组DNA为模板，用TerF和TerR组成的引物对进行PCR扩增，PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。

TerF：5’-ctgactGGTACCATGATTGTGAAACCCATGGT-3’（下划线处为Kpn I的识别位点，其后的序列为序列12的第1-20位）

TerR：5’-ctgactGGTACCTTAAATGCGATCAAAGCGTTC-3’（下划线处为Kpn I的识别位点，其后的序列为序列12的第1174-1194位的反向互补序列）

电泳结果如图5所示，从图中可以看出转入整合表达载体pMD-Δpha::Ter的重组蓝藻扩增到约1194bp的DNA片段，而未经转化的蓝藻集胞藻6803，以及转入空载体pMD-Δpha::X的重组蓝藻没有扩增到DNA片段，与预期结果相符。进一步对由转入整合表达载体pMD-Δpha::Ter的重组蓝藻扩增得到的约1194bp的DNA片段进行测序验证，结果表明该DNA片段正为序列表中序列12所示的Ter基因片段。将经PCR扩增及测序鉴定正确的重组蓝藻命名为S.Δpha::Ter。在重组蓝藻S.Δpha::Ter中，Ter基因的插入位点为PHB合成途径关键酶PHB合酶的编码基因phaC&E，即Ter基因取代了phaC&E。因此，在重组蓝藻S.Δpha::Ter中，PHB合成途径已被干扰。同时将转入空载体pMD-Δpha::X的重组蓝藻命名为S.Δpha。

（3）蛋白水平鉴定

取等量的重组蓝藻S.Δpha（空载体对照）、未经转化的蓝藻集胞藻6803（野生型对照）和表达Ter基因的重组蓝藻S.Δpha::Ter，破碎细胞，取上清，进行12%的SDS-PAGE电泳。

结果如图6所示，在重组蓝藻S.Δpha::Ter中有43.7kD的蛋白条带，该大小与PHB合酶（Ter）理论计算的分子量大小相符，而作为空载体对照的重组蓝藻S.Δpha，以及作为野生型对照的未经转化的蓝藻集胞藻6803中没有。这一结果说明Ter已在蓝藻中成功表达，通过与已知浓度的蛋白分子量Marker比较及通过凝聚分析软件分析，表达量约占细胞总可溶蛋白的15%。

（4）检测重组蓝藻S.Δpha::Ter发酵液中目标产物丁醇

在正常培养条件下培养细胞，当生物量积累到一定程度，进行诱导产丁醇。

1）重组蓝藻S.Δpha::Ter、重组蓝藻S.Δpha（空载体对照），以及未经转化的蓝藻集胞藻6803（野生型对照，WT）置于光照培养箱中振荡培养至对数生长后期（使其细胞密度达到OD₇₃₀=1.5）；温度为30℃，光强为100μm/m²·s，振荡频率为130r/min，培养基为BG-11液体培养基。

2）然后将重组蓝藻S.Δpha::Ter、重组蓝藻S.Δpha（空载体对照），以及未经转化的蓝藻集胞藻6803（野生型对照）黑暗静止培养72小时，使其进行自发酵。温度为30℃；培养基为BG-11液体培养基。

3）离心，取上清，用气相色谱-质谱（GC-MS）检测丁醇产量。

GC-MS检测条件：Agilent 5973N MSD气相色谱仪，用DB-WAX检测柱（30m×0.15mm）氦气为载体，注射温度为220℃。质谱的核质比为56。丁醇标准品北京现代东方精细化学品有限公司产品。

丁醇的检测结果见图7中A及表4，丁醇出峰时间在8min左右。根据标准品浓度及峰面积比，计算出S.Δpha和S.Δpha::Ter发酵液中丁醇产量分别约为0和50mg/L，而目前报道的蓝藻丁醇最高产量是28mg/L。该结果证明重组蓝藻S.Δpha::Ter表达的Ter是有活性的，而且高效表达Ter可以提高重组蓝藻丁醇产量。野生型蓝藻集胞藻6803产丁醇的检测结果与空载体对照S.Δpta相比，无显著差异。

表4发酵液中丁醇含量检测三次重复结果（单位：mg/L）

	重复1	重复2	重复3	平均值
					S.Δpha::Ter	46	55	49	50
S.Δpha	0	0	0	0
					WT	0	0	0	0

另外，采用上述的培养方式及色谱条件，以北京现代东方精细化学品有限公司的3-羟基丁酸甲酯作为标准品，对重组蓝藻S.Δpha::Ter、重组蓝藻S.Δpha（空载体对照），以及未经转化的蓝藻集胞藻6803（野生型对照）代谢产物PHB进行分析。结果显示，未经转化的蓝藻集胞藻6803细胞中有明显的PHB积累，而S.Δpha和S.Δpha::Ter细胞中没有PHB积累（图7中B），这说明使用遗传操作系统pMD-Δpha::X可同时实现内源基因敲除、外源基因稳定高效表达及重新分配内源碳流。