CN116144694A - 一种创制高花色素苷含量材料的方法、应用及制备的材料 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种创制高花色素苷含量材料的方法、应用及制备的材料，属于生物技术领域，目的在于解决单独过量表达MYB、bHLH或WD40基因并不能有效地提高番茄果实花色素苷的含量，目前缺乏能够用于创制高花色素苷全紫果材料的方法的问题，其通过SlTT8和SlANT1的共同超量表达，成功制备出高花色素苷含量的材料。本发明利用番茄的MYB和bHLH两种重要转录因子的编码基因SlANT1和SlTT8，改良了番茄果实中花色素苷积累特性，创制了一种花色素苷含量高、营养品质好的全紫果番茄新材料。本发明能够快速将一个仅在果肩表皮含有极少量花色素苷的材料和一个浅紫点状果番茄材料通过杂交，转变为高花色素苷紫黑果材料，具有重要的育种应用前景和经济价值。

Description

一种创制高花色素苷含量材料的方法、应用及制备的材料
技术领域
本申请涉及生物技术领域，尤其是高花色素苷材料制备领域，具体为一种创制高花色素苷含量材料的方法、应用及制备的材料。
背景技术
花色素苷(又称花青素)是一类广泛存在于植物体内的、安全天然的食用色素，具有抗氧化、抗突变、改善肝机能等多种生理功能，其在防治心血管疾病和乳腺癌方面疗效显著，在食品、化妆品及医药等行业中具有非常广泛的应用前景。此外，花色素苷还是一种减轻植物逆境伤害的生理保护剂和压力调节器。因此，深入研究花色素苷的代谢途径、分子调控机制及生物功能，具有重要的意义和应用价值。
番茄作为一种重要的果蔬类蔬菜作物，含有丰富的营养成分，其果实富含类胡萝卜素(如番茄红素)，并含有少量的黄酮类化合物，但绝大多数栽培番茄果实中通常不合成花色素苷。随着健康理念不断深入人心，人们期待具有更高营养价值的番茄新品种的出现。实践证明，通过基因工程的方法来改良花色素苷的生物合成特性，是提高花色素苷含量、培育高营养品质番茄的有效途径。而目前番茄花色素苷生物合成的调控机制还不是十分清楚，可供操作的、用于提高番茄花色素苷含量的基因资源还十分有限。研究表明：在植物中MYB、bHLH和WD40转录因子可以通过单独或共同作用的方式(形成MBW三聚复合体)激活花色素苷合成途径中多个结构基因的协同表达，从而能够更有效地启动或调控次生代谢途径(Ramsay et al.,2005)。然而，到目前为止，在番茄中仅有少数的几个调控花色素苷的转录因子被分离和鉴定。研究显示，过量表达编码R2R3-MYB转录因子的番茄基因SlANT1(Anthocyanin1)和SlAN2(Anthocyanin2)，能够提高番茄营养组织中花色素苷的含量，但是在果实中仅能诱导局部浅紫点状花色素苷分布，且大多只局限于果实表皮(Mathews etal.,2003；Schreiber et al.,2011)；而编码bHLH转录因子的SlGL3和AH基因中，SlGL3被证明分别是番茄植株花色素苷生物合成中关键的正调控因子(Wada et al.,2014)，但并不影响番茄果实花色素苷的积累；野生型AH基因的过量表达能够提高番茄植株中花色素苷的积累，但仅在果实的果肩部位有少量斑点状的花色素苷积累(Qiu et al.,2016)。发明人前期已从番茄中分离出一个编码WD40转录因子的基因SlAN11，并证明其过量表达能够显著提高番茄营养组织中花色素苷的含量，但不影响果实中花色素苷的积累(Gao et al.,2018)。上述研究表明，单独过量表达MYB、bHLH或WD40基因并不能有效地提高番茄果实花色素苷的含量，利用多基因的聚合的技术来创制高花色素苷全紫果番茄或许是一种可行的途径。
为此，迫切需要一种新的方法，以解决上述问题。
参考文献：
1.Ramsay N A,Glover B J.2005.MYB–bHLH–WD40 protein complex and theevolution of cellular diversity.Trends in plant science,10(2):63-70.
2.Mathews H,Clendennen SK,Caldwell CG,Liu XL,Connors K,Matheis N,Schuster DK,Menasco DJ,Wagoner W,Lightner J,Wagner DR.2003.Activation taggingin tomato identifies a transcriptional regulator of anthocyanin biosynthesis,modification,and transport.The Plant Cell,15:1689-1703.
3.Schreiber G,Reuveni M,Evenor D,Oren-Shamir M,Ovadia R,Sapir-Mir R,et al.2011.Anthocyanin 1from Solanumchilense is more efficient inaccumulating anthocyanin metabolites than its Solanumlycopersicum counterpartin association with the anthocyanin fruit phenotype of tomato.TheoreticalApplied Genetics,124:295-308.
4.Wada T,Kunihiro A,Tominaga-Wada R.2014.Arabidopsis CAPRICE(MYB)andGLABRA3(bHLH)Control Tomato(Solanumlycopersicum)Anthocyanin Biosynthesis.PLoSONE,9:e109093.
5.Qiu Z,Wang X,Gao J,Guo Y,Huang Z,Du Y.2016.The Tomato Hoffman’sAnthocyaninless Gene Encodes a bHLH Transcription Factor Involved inAnthocyanin Biosynthesis That Is Developmentally Regulated and Induced by LowTemperatures.PLoS ONE,11:e0151067.
6.Gao Y,Liu J,Chen Y,et al.2018.Tomato SlAN11 regulates flavonoidbiosynthesis and seed dormancy by interaction with bHLH proteins but not withMYB proteins.Horticulture Research,2018,5.
发明内容
本申请的发明目的在于：针对上述存在的问题，提供一种创制高花色素苷含量材料的方法、应用及制备的材料。本发明利用番茄的MYB和bHLH两种重要转录因子的编码基因SlANT1和SlTT8，改良了番茄果实中花色素苷积累特性，创制了一种花色素苷含量高、营养品质好的全紫果番茄新材料，并提供了一种高营养品质番茄种质的创制方法，具有重要的应用价值和育种前景。
为了实现上述目的，本申请采用如下技术方案：
一种创制高花色素苷含量材料的方法，通过SlTT8和SlANT1的共同超量表达，制备出高花色素苷含量的材料。
通过SlTT8和SlANT1在植物体内的共同超量表达，制备出高花色素苷含量的植物；
或通过SlTT8和SlANT1在植物果实中的共同超量特异表达，制备出高花色素苷含量果实的植物。
包括如下步骤：
(1)以待处理植物为对象；获得SlANT1超量表达的T2代纯合子转基因植株或株系，记为SlANT1-OE；获得SlTT8超量表达的T2代纯合子转基因植株或株系，记为SlTT8-OE；
(2)将步骤(1)制备的SlANT1-OE与SlTT8-OE通过杂交的方法导入到同一个植株中，产生的双过表达的杂交F1代，即得高花色素苷含量的材料。
或包括如下步骤：以待处理植物为对象，通过转基因方法，将SlTT8和SlANT1在植物体内共同超量表达，再通过筛选、分离得到花色素苷含量的材料。
前述方法在制备全紫植物中的应用。
所述植物包括单子叶植物、双子叶植物中的一种或多种。
采用前述方法制备的材料。
通过在植物体内同时超量表达SlANT1和SlTT8基因，能够显著提高植物花青素的合成与积累，所制备材料的高花色素苷含量显著提升。
针对前述问题，本申请提供一种创制高花色素苷含量材料的方法、应用及制备的材料。更具体地，其是提供一种利用两种转录因子基因创制高花色素苷全紫果番茄材料的方法及应用。这两种番茄转录因子基因分别是一种R2R3MYB基因SlANT1和一种bHLH基因SlTT8。SlANT1和SlTT8能够调控番茄花色素苷的生物合成，这为利用这两种基因改良番茄果实花色素苷积累特性，从而培育出具有高花色素苷含量、营养品质好的全紫黑果番茄材料提供了新方法。
在制备全紫番茄的实验中，本发明所述控制番茄花色素苷合成的两种转录因子基因SlANT1和SlTT8的核苷酸序列可从番茄基因组数据库下载获得(https://solgenomics.net/organism/Solanumlycopersicum/genome)。通过分离和克隆上述两个基因的编码序列(CDS)，分别在番茄中超表达上述两个基因，并经过后代的筛选和纯化，分别获得SlANT1和SlTT8超量表达(SlANT1-OE和SlTT8-OE)的T2代纯合子转基因植株或株系。
将上述两种超表达的基因(SlANT1-OE和SlTT8-OE)通过杂交的方法导入到同一个番茄植株中，所产生的双过表达的杂交F1代(SlANT1-OE×SlTT8-OE)番茄的果实呈现全紫黑色、花色素苷含量高、最终获得具有极高营养品质的番茄材料。
进一步，同时在植物体内超量或果实特异表达SlANT1和SlTT8基因的生物体也能达到本发明的目的，也属于本发明的保护范围。
本发明通过在植物体内同时超量表达SlANT1和SlTT8基因可以显著提高植物花青素的合成与积累，其在该方面的应用均属于本发明的保护范围。
本发明分别获得了SlANT1和SlTT8基因的超量表达的重组载体，分别将上述两个载体转化野生型番茄，通过后代的筛选鉴定分别获得上述两个基因超量表达的纯合子植株或株系，并通过杂交获得了高花色素苷紫黑果番茄材料。
通过实验证明：本发明的方法有效，能够快速将一个仅在果肩表皮含有极少量花色素苷的材料和一个浅紫点状果番茄材料通过杂交，转变为高花色素苷紫黑果材料，具有重要的育种应用前景和经济价值。
附图说明
图1为将SlANT1基因构建于pBI121载体质粒中的示意图；其中，图1中的A为pBI121示意图；图1中的B为pBI121-SlANT1示意图，其中示出了利用35启动子驱动位于其下游的目的基因SlANT1的表达。
图2为将SlTT8基因构建于pBI121S载体质粒中的示意图；其中，图2中的A为pBI121S示意图；图2中的B为pBI121S-SlTT8示意图，其中示出了利用35启动子驱动位于其下游的目的基因SlTT8的表达。
图3为野生型、转基因和杂交F1番茄材料果实花色素苷积累的表型示意图；其中，图3的A为野生型(AC+)番茄的果实的表型图；图3的B为SlTT8基因超量表达(SlANT1-OE)转基因植株(T2纯合植株)果实的表型图；图3的C为SlANT1基因超量表达(SlTT8-OE)转基因植株(T2纯合植株)果实的表型图；图3的D为SlTT8基因超量表达转基因植株与SlANT1基因超量表达转基因植株杂交F1植株(SlANT1-OE×SlTT8-OE)果实的表型图。
图4为野生型、转基因和杂交F1番茄材料成熟绿果花色素苷积累的表型示意图；其中，图4中AC+为野生型番茄成熟绿果花色素苷积累的情况；图4中SlANT1-OE为SlANT1基因超量表达转基因植株成熟绿果表型图；图4中SlTT8-OE为SlTT8基因超量表达转基因成熟绿果表型图；图4中SlANT1-OE×SlTT8-OE为SlTT8基因超量表达转基因植株与SlANT1基因超量表达转基因植株杂交F1植株成熟绿果表型图。图4中，左边为完整的成熟绿果图，右边为成熟绿果横切剖面图。
图5为野生型、转基因和杂交F1番茄材料绿果果皮花青素含量测定结果；其中，图5中AC+为野生型番茄；图5中SlANT1-OE为SlANT1基因超量表达转基因番茄；图5中SlTT8-OE为SlTT8基因超量表达转基因番茄；图5中SlANT1-OE×SlTT8-OE为SlTT8基因超量表达转基因植株与SlANT1基因超量表达转基因植株杂交F1番茄。
图6为野生型、转基因和杂交F1番茄绿果果皮中目的基因和花色素苷合成基因的mRNA表达水平比较图；其中，图6A-图6F分别为目的基因SlTT8、SlANT1和花色素苷合成基因Sl3’5’H、SlDFR、SlACC和SlGST的mRNA表达水平。
具体实施方式
本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。
本说明书中公开的任一特征，除非特别叙述，均可被其他等效或具有类似目的的替代特征加以替换。即，除非特别叙述，每个特征只是一系列等效或类似特征中的一个例子而已。
以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发现，其不以任何方式限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1重组表达载体pBI121-SlANT1和pBI121S-SlTT8的构建
1、植物材料
番茄野生型种子为AC+，由西南科技大学植物生物学实验室保存。
2、菌株及载体
克隆载体pEASY-Blunt购自北京全式金生物科技公司，大肠杆菌DH5ɑ、根癌农杆菌EHA105、表达载体pBI121K均由西南科技大学植物生物学实验室保存。
3、试剂与药品
高保真酶PrimeSTAR HS购自TAKARA公司，限制性内切酶购自Thermo公司，Taq酶购自Tiangen公司，T4 DNA连接酶购自Promega公司，琼脂糖凝胶回收试剂盒及小批量质粒提取试剂盒购自Omega Bio-Tek公司。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，测序由华大基因科技股份有限公司完成。
缓冲液、试剂、细菌培养基配方参见《分子克隆实验指南》(第三版，作者：著[美]J.莎姆布鲁克、黄培堂译，出版社：科学出版社，ISBN：7030103386)。
4、番茄SlWRKY8P启动子的克隆
根据SGN(http://solgenomics.wur.nl/)提供的番茄全基因组序列，依据番茄SlANT1(Solyc10g086260)和SlTT8(Solyc09g065100)基因的编码序列分别设计扩增引物，并添加合适的酶切位点，具体的引物如下。
OE-SlANT1-F1:GGATCCATGAACAGTACATCTATGTCTTCA(BamHI)
OE-SlANT1-R1:GAGCTCTTAATCAAGTAGATTCCATAAGTC(SacI)
OE-TT8-F1:TCTAGAATGGAGATTATACAGCCTAATAGC(XbaI)
OE-TT8-R1:ACTAGTGAAAGAGCTGAGCAAATTATAG(SpeI)
分别用OE-SlANT1-F1/OE-SlANT1-R1和OE-TT8-F1/OE-TT8-R1引物以番茄AC+的cDNA为模板，利用高保真酶PrimeSTARMax，分别扩增SlANT1和SlTT8基因的全长编码序列。扩增总体积50μL，其中正向引物(F1)1μL，反向引物(F2)1μL，DNA模板1μL，PrimeSTARMax 25μL，ddH2O 22μL。扩增程序为：98℃10秒，55℃5秒，72℃5秒，30个循环。琼脂糖凝胶电泳后分别胶回收与目的基因大小相近的片段。分别连接克隆载体pEASY-Blunt。将连接产物转化大肠杆菌，37℃恒温培养16-18小时。挑取大肠杆菌单克隆，接种含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，置于37℃，150转/每分钟的摇床中扩大培养16-18小时。将扩大培养的大肠杆菌菌液经PCR鉴定为阳性的克隆送华大基因科技股份有限公司进行测序分析，测序正确的克隆用以构建表达载体。
5、质粒提取
将测序正确的分别含有目基因的pEASY-Blunt-SlANT1和pEASY-Blunt-SlTT8克隆以及pBI121和pBI121S大肠杆菌扩大培养，提取质粒。所用溶液I、溶液II、溶液III、BufferHB、Wash Buffer和Elution Buffer全部来自于Omega Bio-Tek公司的小批量质粒提取试剂盒。
(1)在10-20mL试管中，将携带有所需质粒的大肠杆菌接种到5mL含有氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃震荡培养12-16小时。
(2)取1.5-5mL菌液室温10000×g离心1分钟。
(3)去上清，加250μL溶液I，涡旋震荡器震荡至菌体完全悬浮。
(4)加入250μL溶液II，温和颠倒离心管4-6次，获得澄清的裂解液，室温孵育2分钟。
(5)加入350μL溶液III，温和颠倒数次混合，至出现白色絮状沉淀。
(6)室温13000×g离心10分钟。
(7)小心吸取上清，移至洁净的装配好容积2mL离心管的吸收柱中。室温10000×g离心1分钟。
(8)弃滤液，加500μL Buffer HB，10000×g离心1分钟。
(9)弃滤液，用700μL Wash Buffer清洗吸收柱，10000×g离心1分钟。
(10)重复第(9)步。
(11)将吸收柱重新置回2mL离心管中，13000×g离心2分钟。
将吸收柱放入干净的1.5mL离心管，在吸附柱的膜中央加30-50μL ElutionBuffer，13000×g离心1分钟。
4、目的基因片段和表达载体的酶切和胶回收
对提取的pEASY-Blunt-SlANT1、pEASY-Blunt-SlTT8、pBI121和pBI121S质粒同时用限制性内切酶进行双酶切，反应体系如下表1所示，反应条件为37℃酶切2小时。
将酶切后的产物经琼脂糖凝胶电泳后，分别回收目的基因片段(SlANT1、SlTT8)和载体片段(pBI121、pBI121S)。
表1反应体系
加入的试剂 pESAY-Blunt-SlANT1 pBI121 pESAY-Blunt-SlTT8 pBI121S
10×Buffer 5 5 5 5
质粒 10 43 10 43
BamH I 1 1 0 0
Sac I 1 1 0 0
Xba I 0 0 1 1
Spe I 0 0 1 1
ddH2O 33 0 33 0
总体积 50 50 50 50
5、目的基因片段和表达载体的连接
用T4 DNA连接酶分别将目的基因片段(SlANT1、SlTT8)和载体片段(pBI121、pBI121S)进行连接，反应体系为：10×T4 ligase buffer 1μL，目基因片段5μL，载体片段3μL，T4 ligase1μL。反应条件为：4℃冰箱过夜连接16-18小时。
6、大肠杆菌转化
将连接产物转化大肠杆菌。
(1)从超低温冰箱中取出大肠杆菌感受态细胞，置于冰上解冻。
(2)将连接产物加入到解冻后的感受态细胞中，小心混匀，冰浴30min。
(3)将含有感受态细胞的离心管置于42℃中，热击90秒。
(4)快速将热击后的离心管转移至冰浴中，冷却2-3分钟。
(5)向冷却后的离心管中加入800μL的SOC，混匀后置于37℃摇床中120转每分钟振摇培养1小时。
(6)将菌液于4000转每分钟离心1分钟，弃掉部分上清，保留100-150μL，轻弹悬浮菌体，取全部菌液涂板，37℃培养过夜。
(7)挑取大肠杆菌单克隆进行菌落PCR，将阳性克隆接种含有硫酸卡那霉素的LB液体培养基中，置于37℃，150转/每分钟的摇床中扩大培养16-18小时。将扩大培养的大肠杆菌送华大基因科技股份有限公司进行测序分析，测序正确的克隆提取质粒后，用以转化根癌农杆菌EHA105。
7、重组表达载体转化根癌农杆菌EHA105
(1)从超低温冰箱中取出根癌农杆菌感受态细胞，置于冰上解冻。
(2)将测序正确的重组表达质粒10μL加入到解冻后的感受态细胞中，小心混匀，冰浴30min。
(3)将含有感受态细胞的离心管置于液氮中，速冻1分钟。
(4)快速将速冻后的离心管转移至37℃水浴锅中，放置2-3分钟。
(5)向离心管中加入800μL的SOC，混匀后置于28℃摇床中120转每分钟振摇培养4小时。
(6)将菌液于4000转每分钟离心1分钟，弃掉部分上清，保留100-150μL，轻弹悬浮菌体，取全部菌液涂板，28℃培养2天。
(7)挑取农杆菌单克隆进行菌落PCR。
(8)挑取阳性克隆摇菌，并用甘油保存菌液备用。
实施例2高花色素苷全紫果番茄(SlTT8-OE×SlANT1-OE)材料的创制
1、农杆菌介导的番茄遗传转化
将含有pBI121-SlANT1和pBI121S-SlTT8质粒的重组农杆菌分别转化野生型番茄(AC+)，具体方法如下。
(1)将番茄种子灭菌后播种于含有1/2MS固体培养基的培养瓶中，暗培养4d左右，露白后转置于光照下，培养条件为：25℃，16小时光照，23℃，8小时黑暗，光照强度为80μmolm-2s-1，并在其第一片真叶长出前取下子叶，置于预培养基上培养2d。
(2)将含有pBI121-SlANT1和pBI121S-SlTT8质粒的重组农杆菌分别接种于5mL含有50μg/mL利福平和50μg/mL硫酸卡那霉素的LB培养基中，28℃摇床培养12小时，分别得到各5mL pBI121-SlANT1和pBI121S-SlTT8种子液。分别接种1mL pBI121-SlANT1和pBI121S-SlTT8种子液至50ml含有50μg/mL利福平和50μg/mL硫酸卡那霉素的LB培养基中，28℃摇床培养至OD600为0.8左右，分别得到pBI121-SlANT1和pBI121S-SlTT8培养液。分别将pBI121-SlANT1和pBI121S-SlTT8培养液于室温4000转每分钟，离心4分钟，弃上清收集菌体，分别用约10mL诱导培养液重悬菌体，备用。
(3)在灭菌的培养皿中加入40mL的诱导培养液，用移液器吸取800μL重悬菌体加入到含有诱导培养液的培养皿中，混匀。将预培养2天后的番茄子叶浸入诱导培养液和菌体的混合物中10分钟，期间可用无菌镊子尖部对子叶进行垂直打孔。
将子叶捞出置于无菌滤纸上吸干液体，随后将子叶置于共培养基上，于22±1℃、黑暗条件下培养2天后，转移到分化培养基上；然后，置于光照培养箱中，培养条件为：25℃，16小时光照，23℃，8小时黑暗，光照强度为80μmol m-2s-1。每2周更换一次培养基。当愈伤组织长出2.0cm左右的新芽时，切取嫩芽转移至生根培养基上生根，培育约4周后获得完整的硫酸卡那霉素抗性植株。待根系发育好后，移出，温室盆栽。培养条件为，温度24±1℃、16小时光照，8小时黑暗。各培养基成分见表2。
表2番茄组织所用培养基
Figure SMS_1
注：6-BA：6－苄氨基嘌呤(6-Benzylaminopurine)，IAA：吲哚乙酸(IndoleaceticAcid)，KT：激动素(Kinetin)，2，4-D：2,4－二氯苯氧基乙酸(2,4-DichlorophenoxyaceticAcid)。
2、SlTT8-OE和SlANT1-OE超量表达植株的鉴定和纯合子筛选
(1)利用鉴定转基因阳性植株的方法，根据pBI121和pBI121S载体上的35S启动子序列设计正向扩增引物JD-35S-F；同时，分别根据目的基因SlANT1和SlTT8的编码序列各设计一条反向引物JD-SlANT1-R和JD-SlTT8-R。接下来，分别用35S-F/SlANT1-R和35S-F/SlTT8-R对转化SlANT1和SlTT8基因的再生植株进行PCR阳性鉴定。随后，提取经PCR鉴定为阳性的植株叶片的总RNA并反转录为cDNA后，利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术分别检测目的基因SlANT1和SlTT8的表达水平，其结果相比于野生型番茄(AC+)，SlANT1和SlTT8基因表达量显著升高的植株确定为SlANT1和SlTT8基因过量表达的阳性植株。
引物序列如下：
JD-35S-F:CTTCGCAAGACCCTTCCTC
JD-SlTT8-R:GCTTTTGAGCAGCCATTGAG
JD-SlANT1-R:CCAATAGTTTTTCACATCGTTAGC
(2)选取筛选到的转基因阳性植株培养至番茄果实成熟，收获成熟的番茄种子(即T1代转基因种子)。将T1代番茄种子灭菌后，播种于含有50mg/L硫酸卡那霉素的1/2MS固体选择培养上，置于光照培养箱中。经筛选培养，得到含有硫酸卡那霉素抗性基因的转基因番茄幼苗。将筛选得到的转基因番茄阳性幼苗转移至盆中，在温室内培养至番茄果实成熟，并收获成熟的番茄种子(即T2代转基因种子)。每株阳性苗(T2代幼苗)单独收种，按照T1代种子的筛选方法进行再次筛选，如果播撒的种子全部成活，则相应的种子为单基因纯合(根据孟德尔分离定律筛选纯合子)，为实验所需材料。通过本实验的筛选，最终分别获得SlTT8-OE和SlANT1-OE超量表达的纯合子番茄植株。
3、SlTT8-OESlANT1-OE双超量表达植株的创制和鉴定
(1)以SlTT8-OE转基因纯合子番茄植株与SlTT8-OE转基因纯合子番茄植为亲本，进行杂交，获得杂交F1种子。
(2)种植步骤(1)获得的杂交F1种子，并观察F1植株果实花色素苷积累的表型。如图3所示，野生型植株果实基本上没有花色素苷的积累(图3A)，SlTT8-OE超量表达转基因植株的果实仅在果肩部位有部分的花色素苷积累(图3B)，SlANT1-OE超量表达转基因植株果实呈较浅的斑点紫色(图3C)，而SlTT8-OE×SlANT1-OE杂交F1植株的果实呈全紫黑色(图3D)，表明杂交F1植株果实中的花色素苷高度积累。
(3)为了进一步观察野生型、转基因和杂交F1番茄果实内部花色素苷积累的情况，分别对AC+、SlTT8-OE、SlANT1-OE和SlTT8-OE×SlANT1-OE杂交F1植株同一时期的成熟绿果进行横切和剖面观察。如图4所示，野生型植株果实的果皮和心室腔等均没有观察到花色素苷的积累(图4第一行)；SlTT8-OE转基因植株仅在果实的表皮靠近果肩部为有少量的花色素苷积累，而在果皮内部和心室腔等没有观察到花色素苷的积累(图4第二行)；SlANT1-OE转基因植株果实的表皮观察到了浅紫斑点状的花色素苷积累，其次在中果皮、中轴、胎座和种皮上观察到呈少量的点状或辐射状的花色素苷积累(图4第三行)；
SlTT8-OE×SlANT1-OE杂交F1植株的果实表皮呈完全的紫黑色，整个果皮呈全紫色，并且胎座，心室腔和种皮也呈现紫色(图4第四行)。
(4)野生型、SlTT8-OE和SlANT1-OE转基因以及杂交F1番茄果实花青素含量的测定。
用常规酸化甲醇法提取色素，配制提取液：1％盐酸甲醇(v/v)，采取适量转基因番茄植株成熟绿果的果皮组织进行液氮研磨，称取0.1g鲜样组织于1.5ml离心管中，并记录重量；加入1ml提取液，震荡混匀，4℃避光提取24h，期间晃动，充分提取。12000rpm离心15min，取200μl上清液用酶标仪在波长530nm(花青素吸收峰)，根据petunidin3-(p-coumaroylrutinoside)-5-glucoside(矮牵牛色素-3-O-[6”-O-(Z)对香豆酰芸香糖苷]-5-O-葡萄糖苷)的标准曲线计算花青素苷含量。
如图5所示，野生型植株果实的花青素含量为0.009mg/g，SlTT8-OE转基因植株果实的花青素含量为0.014mg/g，SlANT1-OE转基因植株果实的花青素含量为0.050，而SlTT8-OE×SlANT1-OE杂交F1植株的果实花青素含量高达0.979mg/g，其分别是野生型(AC+)、SlTT8-OE和SlANT1-OE转基因果实花青素含量的109、70和20倍，表明SlTT8和SlANT1的共同超量表达能够显著提高番茄果实花青素的积累，是一种创制高花色素苷全紫番茄的新途径。
(5)野生型、SlTT8-OE和SlANT1-OE转基因以及杂交F1番茄果实中目的基因和花青素合成基因的表达水平检测。
分别提取野生型、SlTT8-OE和SlANT1-OE转基因以及杂交F1番茄成熟绿果果皮的总RNA，反转录为cDNA后，利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术分别检测目的基因SlANT1和SlTT8花色素苷关键合成基因(SlF3’5’H、SlDFR、SlACC和SlGST)的表达水平。
如图6所示，SlTT8基因在SlTT8-OE和SlTT8-OE×SlANT1-OE杂交F1植株果实中的表达量分别是野生型(AC+)的2427和4617倍(图6A)，证明SlTT8在SlTT8-OE和SlTT8-OE×SlANT1-OE杂交F1植株中是超量表达的；同样SlANT1在SlANT1-OE和SlTT8-OE×SlANT1-OE杂交F1植株中也是超量表达的，分别是野生型的(AC+)的23036倍和5841倍(图6B)。花色素苷关键合成基因(SlF3’5’H、SlDFR、SlACC和SlGST)的表达水平在SlTT8-OE×SlANT1-OE杂交F1植株果实中均是最高的，分别是SlANT1-OE转基因植株的3-6倍、SlTT8-OE转基因植株的30-90倍和野生型(AC+)的200-600倍(图6C-E)。
以上结果表明，单独过超量表达SlTT8或SlANT1基因仅能微弱或中度激活番茄花色素苷关键合成基因(SlF3’5’H、SlDFR、SlACC和SlGST)的表达，而共同超表达SlTT8和SlANT1基因却可以显著地增强对下游基因的激活水平，最终实现了番茄果实花色素苷大量积累，大大提高了番茄果实的营养品质。
本发明并不局限于前述的具体实施方式。本发明扩展到任何在本说明书中披露的新特征或任何新的组合，以及披露的任一新的方法或过程的步骤或任何新的组合。

Claims (8)

1.一种创制高花色素苷含量材料的方法，其特征在于，通过SlTT8和SlANT1的共同超量表达，制备出高花色素苷含量的材料。
2.根据权利要求1所述创制高花色素苷含量材料的方法，其特征在于，通过SlTT8和SlANT1在植物体内的共同超量表达，制备出高花色素苷含量的植物；
或通过SlTT8和SlANT1在植物果实中的共同超量特异表达，制备出高花色素苷含量果实的植物。
3.根据权利要求1或2所述创制高花色素苷含量材料的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）以待处理植物为对象；获得SlANT1超量表达的T2代纯合子转基因植株或株系，记为SlANT1-OE；获得SlTT8超量表达的T2代纯合子转基因植株或株系，记为SlTT8-OE；
（2）将步骤（1）制备的SlANT1-OE与SlTT8-OE通过杂交的方法导入到同一个植株中，产生的双过表达的杂交F1代，即得高花色素苷含量的材料。
4.根据权利要求1~3任一项所述创制高花色素苷含量材料的方法，其特征在于，包括如下步骤：以待处理植物为对象，通过转基因方法，将SlTT8和SlANT1在植物体内共同超量表达，再通过筛选、分离得到花色素苷含量的材料。
5.权利要求1~4任一项所述方法在制备全紫植物中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，植物包括单子叶植物、双子叶植物中的一种或多种。
7.权利要求1~4任一项所述方法制备的材料。
8.根据权利要求7所述的材料，其特征在于，通过在植物体内同时超量表达SlANT1和SlTT8基因，能够显著提高植物花青素的合成与积累，所制备材料的高花色素苷含量显著提升。
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