KR20070036770A

KR20070036770A - 형질전환 식물체의 모상근으로부터 유용 재조합단백질을대량 생산하는 방법

Info

Publication number: KR20070036770A
Application number: KR1020070026786A
Authority: KR
Inventors: 이선교
Original assignee: (주)넥스젠
Priority date: 2007-03-19
Filing date: 2007-03-19
Publication date: 2007-04-03

Abstract

본 발명은 생물반응기를 이용한 식물체의 부정근 대량 생산 방법, 형질전환 식물체의 부정근 및 모상근으로부터 유용 재조합단백질을 대량 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법에 따르면, 적절한 유도 배지 및 적절한 농도의 식물 생장조절물질을 사용함으로써 식물체로부터 부정근 또는 모상근을 유도하고, 이를 생물반응기에서 액체배양함으로써 부정근 또는 모상근을 대량으로 생산할 수 있으며, 이로부터 유용 재조합단백질을 안정적으로 다량 생산할 수 있다.

부정근, 모상근, 식물 발현용 벡터, 형질전환, 생물반응기

Description

형질전환 식물체의 모상근으로부터 유용 재조합단백질을 대량 생산하는 방법{Method for Producing Available Recombinant Protein by Culturing Hairy Root of Transformed Plants}

본 발명은 생물반응기를 이용한 식물체의 부정근 대량 생산 방법, 형질전환 식물체의 부정근 및 모상근으로부터 유용 재조합단백질을 대량 생산하는 방법에 관한 것이다.

최근 들어 식물은 의료용 및 산업용 단백질의 대량생산 시스템으로 주목을 받고 있다. 이는 기존에 확립되어 있는 전통적인 농업기반을 이용하여 쉽게 수확하고 가공할 수 있어 원하는 생물자원 (biomass)의 대량 확보가 가능하기 때문이다. 또한 단백질 발현 시스템으로 주로 이용되었던 세균과 달리 식물체는 포유동물 단백질의 활성에 필수적인 후-해독 수식 과정이 수행되는 진핵생물 단백질 합성 경로를 갖고 있기 때문에 (Cabanes-Macheteau et al., Glycobiolgy 9:365-372(1999)), 식물체에서 발현된 단백질은 세균에서 발현된 단백질과 달리 포유동물에서 발현된 단백질과 거의 동일하다고 할 수 있다.

일반적으로 동물에서 유래한 외래 단백질은 주로 동물 세포주를 이용하여 생산이 되었지만 유지비용이 많이 들고 대량발현과 분리 정제의 어려움이 있었다. 이러한 단점을 보완하기 위해서 대장균을 이용한 대량발현 및 생물학적인 활성을 가지는 당단백질을 분리 정제하는 기술이 도입되었으나, 전사효율이 낮거나 해독 효율이 낮은 등의 이유로 유전자의 발현 수율 자체가 낮아서 폴리펩타이드가 적게 생기거나 생성된 폴리펩타이드가 안정한 3차 구조를 이루지 못해 분해되기 쉽고, 또한 활성이 없는 형태로 응집되어 세포 내에서 봉입체 (inclusion body) 상태로 존재하는 문제가 있었다.

따라서, 식물의 장점을 이용하여 식물에 유용 재조합단백질 생산에 관여하는 유전자를 도입시켜 확보한 형질전환 식물체를 목적 단백질의 생산시스템으로 활용하는 방법이 현재 많이 활용되고 있다.

식물체를 이용한 유용 재조합단백질의 생산 시스템은 크게 4 종류로 구분할 수 있다. 첫째는 잎에서 발현된 단백질을 이용하는 법, 둘째는 곡물과 콩의 종자를 이용하는 법, 셋째는 과실과 열매를 이용하는 법 그리고 마지막으로 면사와 기름종자를 이용하는 법 등이 있다. 이들 모두는 각각의 장점을 가지고 있지만 현재 대두하고 있는 환경 영향적 면에서 모두 문제점을 가지고 있다. 식물유전공학 분야에서 현재 대두되고 있는 첫 번째 문제는 식물의 생육 시 주변 환경에 의해 식물의 성장이 안정적이지 못하고 저해되어 산출량이 낮아질 수 있다는 문제점이며, 다른 문제는 형질 전환된 식물에 의해 주변의 식물들이 오염될 수 있다는 것이다. 물론 아직까지는 과학적인 분석을 통해 심각한 문제를 일으킨다는 것을 밝혀낸 보고는 없으나, 유전자 조작 콩이나 옥수수의 경우를 보건대 식물유전공학에 의해 생산되는 외래 단백질 발현 식물체의 생산 시 앞으로 환경적인 면에 대한 문제가 제기될 소지가 크다.

벼는 아시아 인구의 거의 95%가 식량으로 이용하고 있으며, 전 세계적으로는 전체 인구의 50% 이상의 주식으로서 영양가가 가장 균형 잡힌 식량이다. 벼는 유전자 조작을 하기에 매우 힘든 작물 중의 하나였으나 최근 들어 식물체 게놈 연구 및 식물병리, 유전자 조작과 발현 등의 연구를 위한 모델로 부상하고 있다 (Christou, Plant Mol . Biol., 35:197-203, (1997); Tang et al., Planta., 208:552-63, (1999)). 단자엽 식물인 벼는 유전체 크기가 작고, 조직배양이 용이하여 단자엽 식물의 모델이 되고 있으며, Hiei 등의 문헌이 발표된 이후 아그로박테리움 튜머페이션스에 의한 형질전환 시스템이 개발되었다 (Hiei et al., Plant J., 6:271-82, (1994); Aldemita and Hodges, Planta, 199:612-7, (1996)).

따라서, 형질전환된 식물체의 부정근 또는 모상근을 생물반응기에서 다량 증식하여 위에 언급한 문제점을 해결하면서 외래 재조합단백질을 안정적으로 다량 생산할 수 있는 시스템을 개발할 필요가 있다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 인용문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발 명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 외부 환경으로 인한 생육의 저해를 방지하면서 또한 외부환경을 오염시키지 않기 위해 예의 노력한 결과, 유용 재조합단백질 생산의 호스트로 이용될 수 있는 식물체의 부정근 및 모상근을 대량 생산할 수 있는 방법을 개발하고, 아그로박테리움 튜머페이션스 또는 아그로박테리움 리조게네스에 의해 제조한 형질전환 식물체의 부정근 및 모상근을 생물반응기에서 증식시킴으로써 유용 재조합단백질을 안정적으로 대량 생산할 수 있는 시스템을 개발하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 생물반응기를 이용한 단자엽 또는 쌍자엽 식물체의 부정근 대량 생산 방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 생물반응기를 이용하여 형질전환 식물체의 부정근으로부터 유용 재조합단백질을 대량 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 생물반응기를 이용하여 형질전환 식물체의 모상근으로부터 유용 재조합단백질을 대량 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은

(i) 단자엽 또는 쌍자엽 식물체의 종자를 발아시키는 단계;

(ⅱ) 상기 발아된 종자의 자엽 절편 또는 배축을 식물 생장조절물질이 첨가된 캘러스 유도 배지에 접종하여 캘러스를 유도하는 단계;

(ⅲ) 액체 현탁배양 배지를 이용하여 상기 캘러스를 액체배양함으로써 현탁배양 세포를 증식하는 단계;

(ⅳ) 단계 (ⅱ)의 캘러스 또는 단계 (ⅲ)의 현탁배양 세포를 부정근 유도 배지에 접종하여 부정근 (adventitious root)을 유도하는 단계; 및

(ⅴ) 생물반응기 (bioreactor)를 이용하여 상기 부정근을 대량으로 배양하는 단계를 포함하는 생물반응기를 이용한 단자엽 또는 쌍자엽 식물체의 부정근 대량 생산 방법을 제공한다.

이하 본 발명의 방법을 단계별로 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

I. 단자엽 또는 쌍자엽 식물체의 종자를 발아시키는 단계

식물체의 조직배양 재료로서 이용될 수 있는 것은 종자, 잎, 줄기 또는 엽병이 있다. 이러한 재료는 식물의 다양한 부분에서 얻을 수 있으나, 가장 바람직한 재료는 종자를 이용하는 것이다. 종자는 사용하기 전에 미리 염소 (특히, 소듐 하이포클로라이드) 등과 같은 소독제를 이용하여 멸균하는 것이 바람직하다.

본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 종자의 발아에 이용되는 배지는 MS (Murashige and Skoog), B5 (Gamberg), LS, N6 (Gupfa and Durzan) 및 White 등과 같은 영양 기본 배지, 에너지원 그리고 비타민을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 에너지원은 보다 바람직하게는 당류이고, 가장 바람직하게는 수크로스이다. 또한, 상기 비타민은 바람직하게는 니코틴산, 티아민 및 피리독신 등을 포함한다. 한편, 본 발명의 발아 배지는 pH 변화를 완충시키는 역할을 하는 MES(2-(N-Morpholino) ethanesulfonic acid Monohydrate)를 추가적으로 포함할 수 있고, 고체 지지체로서 아가를 추가적으로 포함할 수 있다. 본 발명의 발아 배지에는 식물 성장 조절제는 첨가하지 않는다. 종자의 발아는 적합한 배지를 이용하여 적합한 암/광조건 하에서 실시된다.

II. 발아된 종자의 자엽 절편 또는 배축을 식물 생장조절물질이 첨가된 캘러스 유도 배지에 접종하여 캘러스를 유도하는 단계

발아된 무균 재료로부터 캘러스를 유도하기 위한 배지는 MS 또는 N6 배지를 이용하며, 이때 식물 생장조절물질로서 IAA (Indoleacetic acid), IBA (Indolebutyric acid), NAA (Naphthalene acetic acid) 및 2,4-D (2,4-dichlorophenoxyacetic acid)로 구성된 군으로부터 선택되는 오옥신류를 첨가하며, 0.01-5 ppm, 바람직하게는 0.1-5 ppm의 오옥신류를 처리하여 캘러스를 유도한다. 본 발명의 바람직한 실시예에 따르면 2,4-D를 0.5-5 ppm 처리할 경우 캘러스 유도효과가 가장 우수하다.

III. 액체 현탁배양 배지를 이용하여 상기 캘러스를 액체배양함으로써 현탁배양 세 포를 증식하는 단계

캘러스의 액체배양에 의한 현탁배양 세포 증식 단계는 액체 현탁배양 배지로 MS, WPM (Lloyd and McCown) 또는 SH (Schenk and Hilderandt) 배지를 사용하여 세포 접종량을 배지 총량의 8-12%, 바람직하게는 10%로 맞추어 주는 것이 효과적이다. 대수생장기에 있는 세포를 지속적으로 다량 얻기 위해서 2주 간격으로 계대배양하면 4 주 배양 후 생체중량이 2배 이상 증가하게 된다.

IV. 캘러스 또는 현탁배양 세포를 부정근 유도 배지에 접종하여 부정근 (adventitious root)을 유도하는 단계

부정근의 유도는 캘러스로부터 직접 유도하거나, 액체 현탁배양 세포로부터 유도할 수 있는데, 첫째로 캘러스에서 부정근 유도는 지름 1-1.5 cm 정도의 캘러스 덩어리를 생장조절 물질인 2,4-D 또는 NAA를 0.01-5 ppm 첨가한 mB5 (modified Gamberg), MS (Murashige and Skoog); 1/2 MS, B5 (Gamberg), SH (Schenk and Hild ebrandt), LS (Linsmair-Skoog) 또는 N6 (Gupfa and Durzan)배지에 배양하여 부정근을 유도한다. 이때 배양배지는 1/2 MS 배지 또는 N6 배지에 2,4-D를 0.01-1 ppm, NAA를 0.01-1 ppm 넣어주거나 MS 배지 또는 N6 배지에 NAA를 0.01-1 ppm 첨가하여 주는 것이 가장 효과적이다.

V. 생물반응기 (bioreactor)를 이용하여 부정근을 대량으로 배양하는 단계

현탁배양 세포를 생물반응기에서 배양을 할 경우 부정근을 대량으로 생산할 수 있다. 본 발명의 방법에서 현탁배양 세포를 배양할 수 있는 생물반응기는 당업계에 공지된 어떠한 반응기를 사용하여도 무방하다. 바람직하게는, 현탁세포 배양용 플레이트 (plate), 플라스크 또는 공기 부양식 생물반응기 (Air lift bioreactor)가 있으며, 더욱 바람직하게는 공기 부양식 생물반응기가 있다. 현탁배양 세포의 배양 방식도 특정 배양 방식에 영향을 받지 않으며, 폐쇄 시스템 (closed system)인 배치 배양 (batch culture) 또는 개방 시스템 (open system)인 공기 부양식 배양 (air lift culture)을 사용한다.

이때 부정근 배양용 배지는 N6 또는 1/2 MS 배지가 가장 효과적인데, 배양세포에서 부정근을 유도하기 위해서는 약 0.1-5 ppm의 NAA를 첨가하는 것이 필수적이다. 또한, 접종 시 세포의 밀도는 배지 총량의 0.1-0.5% 정도로 조절시킨 다음, 배양 3-5주 정도 동일배지에 유지시키면 부정근의 분화가 가능하다.

생물반응기를 이용한 벼 부정근의 배양은 5 ℓ 용량의 공기부양식 생물 반응기에 벼 부정근을 배양 시 초기 접종량은 0.5% 정도가 적당하며, 배지의 공급은 배양 부정근이 엉키기 시작하는 시점인 7일 단위로 첨가해주는 방식이 회분식 배양 (one batch culture) 방식보다 훨씬 효과적인데, 이때 길이가 0.5-2.0 cm 길이의 부정근을 접종할 경우 수확 시 생중량이 크게 증가하게 된다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은

(ⅰ) 식물세포의 게놈 DNA에 삽입될 수 있고, 유용 재조합단백질을 코딩하는 유전자 서열을 갖는 벡터가 내재되어 있는 아그로박테리움 튜머페이션스 (Agrobacterium tumefaciens)를 단자엽 또는 쌍자엽 식물체의 자엽 또는 배축에 감염시키는 단계;

(ⅱ) 감염된 식물체의 자엽 또는 배축을 식물 생장조절물질이 함유된 재분화 배지에서 재분화시켜 신초를 형성시키는 단계;

(ⅲ) 재분화된 신초를 식물 생장조절물질 NAA가 함유된 발근 배지에서 발근시켜 형질전환 식물체를 형성시키는 단계;

(ⅳ) 형질전환 식물체의 종자를 발아시키는 단계;

(ⅴ) 캘러스 유도 배지 및 식물 생장조절물질을 첨가하여 발아된 형질전환 식물체의 종자로부터 캘러스를 유도하는 단계;

(ⅵ) 캘러스를 액체배양함으로써 현탁배양 세포를 증식하는 단계;

(ⅶ) 단계 (ⅴ)의 캘러스 또는 단계 (ⅵ)의 현탁배양 세포로부터 부정근을 유도하는 단계; 및

(ⅷ) 생물반응기를 이용하여 형질전환 식물체의 부정근을 대량으로 배양하는 단계를 포함하는 형질전환 식물체의 부정근으로부터 유용 재조합단백질을 대량 생산하는 방법을 제공한다.

I. 식물세포의 게놈 DNA에 삽입될 수 있고, 유용 재조합단백질을 코딩하는 유전자 서열을 갖는 벡터가 내재되어 있는 아그로박테리움 튜머페이션스 (Agrobacterium tumefaciens)를 단자엽 또는 쌍자엽 식물체의 자엽 또는 배축에 감염시키는 단계

본 발명에서는 종자의 발아에서 생성된 모든 조직이 이용될 수 있으나, 바람직하게는 자엽 및 배축을 이용할 수 있고, 가장 바람직하게는 자엽을 이용한다. 발아된 종자에서 자엽을 얻는 경우에는 생장점을 완전히 제거하고 채취하는 것이 바람직하다. 또한, 자엽은 절단되지 않은 자엽 전체를 이용하는 것이 바람직하다.

식물세포, 특히 벼 세포의 형질전환은 Ti 플라스미드가 내재되어 있는 아그로박테리움 튜머페이션스로 실시한다 (Depicker et al., Plant cell transformation by Agrobacterium plasmids. In Genetic Engineering of Plants, Plenum Press, New York, 1983).

아그로박테리움 튜머페이션스는 Ti 플라스미드 (Ti plasmid)라고 불리는 거대한 (약 200,000 염기쌍) 플라스미드를 가지고 있다. 이 세균이 식물세포와 접촉하면, T DNA (약 23,000 염기쌍)라고 불리는 단편이 Ti 플라스미드로부터 식물세포의 핵으로 옮겨지고, 형질전환을 하는 동안에 식물의 염색체 중 1개의 랜덤위치에 짜여져 들어가게 (integrate) 된다. 이 현상은 DNA가 무핵생물로부터 유핵생물로 옮겨지는 드문 예가 되고, 자연적으로 일어난 유전공학이라고 말할 수 있다.

*T DNA는 식물의 대사 산물을, 세균에 있어서 중요한 2가지 부류의 화합물로 변환하는 효소를 코드하고 있다. 첫 번째 부류는, 식물 호르몬인 오옥신 (auxin)과 사이토키닌 (cytokinin)이 된다. 이들은, 형질전환된 세포의 증식을 촉진시켜서, 크라운 골 종양을 만들게 된다. 두 번째 부류는, 오핀 (opines)이라는 것으로, 보통은 볼 수 없는 아미노산의 1군이고, 세균의 먹이 (food source)가 된 다. 오핀은 종양내에서 고농도로 생산되고, 주위로 분비된다. 오핀은 아그로박테리움에 의해서만 대사되며, 효소도 Ti 플라스미드 상의 어딘가에 코드된 것을 사용한다. 이와 같이, 이 세균은 유용한 영양소를 다른 어떤 생물에서는 무익한 형으로 바꾸어서 독점하고 있다.

유용 재조합단백질을 코딩하는 유전자 서열을 갖는 벡터로는 보다 바람직하게는 바이너리 (binary) 벡터 시스템을 이용하는 것이다 (An et al., Binary vectors. In Plant Gene Res. Manual, Martinus Nijhoff Publisher, New York, 1986). 상기한 바이너리 벡터는 예컨대, pBin19, pRD400 또는 pRD320 등이 있으며, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 pRD400을 사용하였다.

본 발명에 이용되는 바이너리 벡터는 기본적으로 (a) 식물 세포 내에서 작용하는 복제 원점; (b) 식물 세포 내에서 전사를 촉진할 수 있는 프로모터; (c) 상기 프로모터에 기능적으로 연결된 외래 단백질을 코딩하는 구조 유전자 서열; 및 (d) 식물 세포 내에서 작동하여 RNA의 3’ 말단에 폴리아데닐을 형성시키는 폴리아데닐 시그널 서열을 포함한다. 또한, 바람직하게는 상기 벡터에는 선택 표지로서 항생제 (카베니실린, 카나마이신, 스펙티노마이신 및 하이그로마이신 등) 내성 유전자를 추가로 포함할 수 있다. 한편, 상기 벡터는 추가적으로 리포터 물질 (루시퍼라아제, β-글루쿠로니다아제 등)을 인코딩하는 유전자를 포함할 수 있다.

상기 바이너리 벡터 내에 이용될 수 있는 프로모터는 예컨대, 콜리플라우어 모자이크 바이러스 35S 프로모터, 1’ 프로모터, 2’ 프로모터 또는 노팔린 합성효소 (nos) 프로모터 또는 숙주 식물로부터 유래하는 뿌리 특이 프로모터, 를 포함한 다. 한편, 상기 외래 단백질을 인코딩하는 구조 유전자 서열은 얻고자 하는 바람직한 형질에 따라 결정된다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에 적합한 프로모터는, 식물체의 유전자 도입을 위해 당업계에서 통상적으로 이용되는 어떠한 것도 이용될 수 있으며, 예를 들어, 콜리플라우어 모자이크 바이러스 (CaMV) 35S 프로모터, 노팔린 합성효소 (nos) 프로모터, 피그워트 모자이크 바이러스 35S 프로모터, 수가크레인 바실리폼 바이러스 프로모터, 콤멜리나 엘로우 모틀 바이러스 프로모터, 리불로오스-1,5-비스-포스페이트 카르복실라아제 스몰 서브유닛 (ssRUBISCO)의 광유도성 프로모터, 벼의 사이토졸 트리오스포스페이트 이소머라아제 (TPI) 프로모터, 포스페이트 유도 프로모터 또는 뿌리 특이 프로모터 또는 당 유도 프로모터, 아라비돕시스의 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라아제 (APRT) 프로모터 및 옥토파인 씬타아제 프로모터를 포함한다.

선택적으로, 상기 벡터는 리포터 분자 (예: 루시퍼라아제 및 β-글루쿠로니다아제)를 코딩하는 유전자를 추가적으로 포함한다. 또한, 본 발명의 벡터는 선택 표지로서 항생제 (예: 네오마이신, 카베니실린, 카나마이신, 스펙티노마이신 및 하이그로마이신 등) 내성 유전자 (예: 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제 (npt Ⅱ), 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라아제 (hpt) 등)를 포함한다.

상기한 벡터를 내재하고 있는 아그로박테리움에 의한 식물 세포의 감염은 당 업계에 공지된 통상적인 방법을 이용할 수 있다. 예컨대, 생장점이 배제되도록 채취한 자엽을 아그로박테리움의 배양액에 침지시켜 공동 배양함으로써 아그로박테리 움이 자엽에 감염되도록 하는 것이다. 공동배양액에는 바람직하게는 아세토시링곤이 포함되는데, 이는 아그로박테리움의 식물로의 형질전환을 돕기 위한 것이다.

본 발명의 방법에 의해 제조된 형질전환체의 확인은 당 업계에 공지된 방법에 의해 실시할 수 있다. 예컨대, 형질전환 벼의 조직에서 분리한 DNA 시료를 이용하여 PCR을 실시함으로서 형질전환에 의해 벼의 게놈에 삽입된 외래 유전자를 용이하게 확인할 수 있다. 또한, 서던 블롯팅 방법과 노던 블롯팅 방법 (Maniatis et al., Molecular Cloning, L Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. 1989)에 의해서도 형질전환체를 확인할 수 있다. 한편, 유전자 도입 시 이용되는 벡터에 β-글루쿠로니다아제 유전자가 있는 경우에는 유전자가 도입된 잎 조직의 일부를 X-gluc (5-Bromo-4-Chloro-3-Indole-β-D-Glucuronic Acid) 등의 기질 용액에 침지시켜 발색되는 양상을 육안으로 관찰함으로써 유전자 도입 여부를 용이하게 확인할 수 있다 (Jefferson, Plant Mol . Biol . Rep ., 5:387(1987)).

Ⅱ. 감염된 식물체의 자엽 또는 배축을 식물 생장조절물질이 함유된 재분화 배지에서 재분화시켜 신초를 형성시키는 단계

감염된 식물체의 자엽 또는 배축을 재분화시켜 신초를 형성시키기 위한 재분화 배지는 BA, 키네틴 (Kinetin), 제아틴 (Zeatin) 및 GA3로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하며, BA인 것이 더욱 바람직하다. 재분화 배지에 첨가하는 식물 생장조절물질은 BA, NAA 및 IAA로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하며, BA를 사용하는 것이 더욱 바람직하다. BA는 0.1-5 ppm으로 첨가하는 것이 바람직하며, 0.5-2 ppm으로 첨가하는 것이 더욱 바람직하다.

Ⅲ. 재분화된 신초를 식물 생장조절물질 NAA가 함유된 발근 배지에서 발근시켜 형질전환 식물체를 형성시키는 단계

재분화된 신초를 발근시켜 형질전환 식물체를 제조할 수 있는 발근 배지는 NAA, IAA, IBA 및 2,4-D로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하고, NAA인 것이 더욱 바람직하다. NAA는 발근 배지 총량에 대해 0.01-5 mg/ℓ로 첨가하는 것이 바람직하고 0.01-1 mg/ℓ로 첨가하는 것이 더욱 바람직하다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 상기 발근 배지에 식물 생장조절물질인 NAA, 항생제인 카나마이신 및 일정량의 아가를 포함시켰으며, 상기 NAA는 0.01-1 mg/ℓ의 용량으로 첨가하여 25 ±1℃ 및 8,000 룩스, 16/8 시간 (day/night)의 조건으로 배양함으로써 형질전환 식물체를 형성시켰다.

Ⅳ-Ⅷ. 형질전환 식물체의 종자로부터 생물반응기를 이용하여 부정근을 대량 배양하는 단계

형질전환 식물체의 종자를 발아시키고, 발아된 종자로부터 캘러스를 유도하며, 캘러스를 액체배양함으로써 현탁배양 세포를 증식하고, 캘러스 또는 현탁배양 세포로부터 부정근을 유도한 뒤 생물반응기를 이용하여 부정근을 대량으로 배양하는 단계는 상기에서 설명한 식물체로부터 부정근을 대량 생산하는 방법에서 설명한 바와 동일하게 수행한다.

이렇게 대량생산된 형질전환 식물체의 부정근은 유용 재조합단백질을 발현하므로, 본 발명의 방법을 이용함으로써 유용 재조합단백질을 대량으로 생산할 수 있다. 부정근으로부터 유용 재조합단백질을 분리하는 방법은 당업계에 공지된 통상의 방법을 통해 수행할 수 있다.

또한, 본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은

(ⅰ) 유용 재조합단백질을 코딩하는 유전자가 삽입된 Ri 플라스미드를 포함하는 아그로박테리움 리조게네스 (Agrobacterium rhizogenes)를 식물체의 뿌리 절편에 감염시키는 단계;

(ⅱ) 감염된 뿌리 절편으로부터 모상근 (hairy root)을 유도하는 단계;

(ⅲ) 캘러스 유도 배지 및 식물 생장조절물질을 이용하여 모상근으로부터 캘러스를 유도하는 단계;

(ⅳ) 캘러스를 기내 배유도배지에 옮겨 배양함으로써 체세포배를 유도하는 단계;

(ⅴ) 체세포배를 발아배지 및 재분화 배지에서 배양함으로써 형질전환 식물체를 유도하는 단계; 및

(ⅵ) 형질전환 식물체의 모상근을 생물반응기에서 액체배양하는 단계를 포함하는 형질전환 식물체의 모상근으로부터 유용 재조합단백질을 대량 생산하는 방법을 제공한다.

Ⅰ. 유용 재조합단백질을 코딩하는 유전자가 삽입된 Ri 플라스미드를 포함하는 아그로박테리움 리조게네스 (Agrobacterium rhizogenes)를 식물체의 뿌리 절편에 감염시키는 단계

아그로박테리움 리조게네스는 쌍자엽 식물에서 모근병을 일으키며, Ri 플라스미드라는 큰 플라스미드를 가지며 Ri 플라스미드의 T-DNA 부분은 Ti 플라스미드의 T-DNA와 같은 양상으로 식물핵으로 전이된다. 아그로박테리움 리조게네스가 감염된 부위에서는 비정상적인 종양인 모상근이 생성된다.

아그로박테리움 리조게네스를 감염시키기 위한 식물체의 뿌리 절편은 무균 처리된 것이 바람직하며, 감염이 용이하게 하기 위해 약 20 mm 크기로 절단한다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 Ri 플라스미드를 포함하는 아그로박테리움 리조게네스로서 아그로박테리움 리조게네스 ATCC 15834를 사용하였으며, 1×10⁸ 세포/㎖ 농도로 접종시켰다.

아그로박테리움 리조게네스를 식물체의 뿌리 절편에 감염시키기 위한 방법으로는 통상적으로 사용되는 전기충격요법 (electroporation), 폴리에틸렌 글리콜 (polyethylene glycol)을 이용하는 방법 또는 현미경하에서 미세한 주사기를 이용하여 주사하는 방법이 사용될 수 있다.

Ⅱ. 감염된 뿌리 절편으로부터 모상근 (hairy root)을 유도하는 단계

감염된 뿌리 절편으로부터 모상근을 유도하기 위한 배지로는 MS 배지가 가장 바람직하며, 본 발명의 바람직한 실시예에 따르면 MS 배지에서 유도된 모상근을 절취해 카베니실린, 가나마이신이 첨가된 배지에 옮겨 박테리아를 제거한 뒤, 상기 항생제를 첨가하지 않은 모상근 생장 배지에 옮겨 2개월간 배양함으로써 모상근을 유도한다.

Ⅲ. 캘러스 유도 배지 및 식물 생장조절물질을 이용하여 모상근으로부터 캘러스를 유도하는 단계

모상근으로부터 캘러스를 유도하기 위한 캘러스 유도 배지로는 MS 또는 N6 배지를 이용하며, 이때 식물 생장조절물질은 IAA, IBA, NAA 및 2,4-D로 구성된 군으로부터 선택되며, 상기 식물 생장조절물질을 0.1-10 ppm, 바람직하게는 0.1-5 ppm 처리하여 캘러스를 유도한다. 본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 모상근으로부터 배를 형성한 캘러스를 유도한 결과 배 형성율은 4주 후에 13.2%이고 12주 후에 39.5%로 나타나 본 발명의 방법에 따르면 모상근으로부터 유도한 캘러스의 배 형성율이 매우 높음을 알 수 있었다.

Ⅳ. 캘러스를 기내 배유도배지에 옮겨 배양함으로써 체세포배를 유도하는 단계

*캘러스로부터 체세포배를 유도하기 위한 배지로는 BA, 키네틴, 제아틴 및 GA3로 구성된 군으로부터 선택되며, 제아틴 또는 GA3이 바람직하다. 본 발명의 방법에 따르면, 캘러스로부터 체세포배의 유도율은 캘러스당 26개의 배가 발생된 것으로 나타났다.

Ⅴ. 체세포배를 발아배지 및 재분화 배지에서 배양함으로써 형질전환 식물체를 유도하는 단계

생성된 체세포배로부터 형질전환 식물체를 유도하는 단계에서는 식물 생장조절물질인 BA 및 NAA의 농도가 매우 중요하여 0.01-2 ppm 정도로 낮추어야 견실하게 재분화가 이뤄진다. 이와 같이 생성된 유식물체는 뿌리가 왕성하게 발달하여 생물반응기를 이용한 모상근 배양에 적합하게 된다.

Ⅵ. 형질전환 식물체의 모상근을 생물반응기에서 액체배양하는 단계

본 발명의 방법에 따르면, 형질전환 식물체의 모상근을 액체 배양하는데 있어서, 첨가되는 식물 생장조절물질은 IAA를 0.5 ppm으로 사용할 때 모상근의 번식률이 가장 높다.

이렇게 대량 번식된 모상근은 유용 재조합단백질을 다량 함유하고 있으므로, 본 발명의 방법을 통해 형질전환 식물체의 모상근으로부터 유용 재조합단백질을 대량 생산할 수 있다. 식물체의 모상근으로부터 유용 재조합단백질을 분리하는 방법은 당업계에 공지된 통상적인 방법을 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 방법은 다양한 단자엽 또는 쌍자엽 식물체에 적용되며, 바람직하게는 벼 (Oryza sativa), 보리 (Hordum sativum), 밀 (Triticum aestivum 또는 Triticum vulgare), 감자 (Solanum tuberosum), 고구마 (Ipomoea batatas), 오이 (Cucumis sativus) 및 참외 (Cucumis melo)로 구성된 군으로부터 선택되며, 벼에 적용되는 것이 가장 바람직하다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 시료의 소독 및 발아

벼는 국내에서 재배되고 있는 단립종의 벼로써 자포니카 (Japonica)인 일미벼 (동진벼)를 실험에 이용하였다. 먼저 종자를 5% NaOCl 용액에서 15분 동안 소독한 후 멸균 증류수로 15분씩 3회 수세하였다. 이어, 1/2 MS (Murashige & Skoog medium including Minimal Salts), 2% 수크로스 및 0.6% 아가를 함유한 발아배지에 치상하여 암상태 조건에서 25 ±1℃ 조건으로 4일 동안 배양하여 발아시켰다. 그런 다음, 본엽이 생기지 않은 유묘만을 선택하고, 자엽 절편과 배축을 채취하여 하기의 실험에 이용하였다.

실시예 2: 캘러스 유도

상기 실시예에서 생성된 자엽 절편을 선별하여 식물 생장조절물질이 함유되어 있는 배지에 접종하여 캘러스 증식상태를 관찰하였다. 이때 사용된 배양배지는 MS 배지를 이용하였으며, 식물 생장조절물질은 옥신류 중에서 IAA (Indoleacetic acid), IBA (Indolebutyric acid), NAA (Naphthalene acetic acid) 또는 2,4-D (2,4-dichlorophenoxyacetic acid)를 0.1 ppm에서 10 ppm 까지 단계별로 처리하였다.

그 결과, 2,4-D와 NAA를 처리하였을 때 캘러스를 증식하는 효과가 우수하였으며, 그 중에서도 2,4-D를 0.5-5.0 ppm으로 처리하였을 때 캘러스 증식 효과가 가장 뛰어난 것으로 확인되었다. 캘러스는 조직이 비후된 다음 배양체 위쪽에서 주로 발생하였으나, 이를 분리하여 계대배양을 4주 간격으로 3회 이상 배양하였을 때 생장이 빠른 캘러스를 얻을 수 있었다. 처리한 식물 생장조절물질 및 그의 농도에 따른 캘러스 증식 결과를 표 1에 나타내었다.

생장조절물질의 농도에 따른 캘러스 형성에 대한 효과

구분	농 도 (ppm)
구분	0.1	0.5	1	2	3	4	5	10
IAA	1	2	6	6	5	5	5	1
IBA	4	5	6	6	4	6	6	2
NAA	7	13	10	9	7	6	6	5
2,4-D	10	14	13	12	12	11	11	8

실시예 3: 캘러스에서 현탁배양 세포 증식

생장속도가 비교적 빠르고 흰색 또는 옅은 노란색을 띄는 캘러스를 메스로 잘게 부순 다음 이를 액체배양 배지에 현탁시킨 후 약 1달 간격으로 계대배양하였다. 이때 연속적인 계대배양을 위하여 계대시 거즈로 세포덩어리를 제거시켜 주었다. 액체 현탁배양시 초기 세포 접종량은 배지 총량의 10%로 맞추어 주는 것이 효과적이었으며, 4주 배양 후 3배 이상의 생체중량이 증가하는 것을 관찰할 수 있었다.

액체 현탁배양시 N6 배지를 사용한 결과, 세포 생장량 증가에 있어서 배지간의 차이는 거의 보이지 않았으나, MS 배지가 다소 좋은 것으로 관찰되었다. 대수생장기에 있는 세포를 지속적으로 다량 얻기 위해서는 계대배양 시기를 2주 간격으로 실시하는 것이 바람직하였다.

실시예 4: 부정근의 유도

생장속도가 비교적 빠르고 흰색 또는 옅은 노란색을 띄는 캘러스를 선발하여 고체배지에서 2주간 생장시킨 다음 부정근을 유도하였다. 부정근의 유도는 일반적인 식물 조직배양 방법으로 실시하였다.

배양배지는 MS, 1/2 MS, B5 (Gamberg), SH (Schenk and Hildebrandt), LS, White, N6 또는 GD (Gresshoff and Doy medium)배지에 생장조절 물질인 2,4-D 및 NAA를 0.5-5 ppm 첨가한 배지를 사용하였다.

캘러스의 경우 지름 1-1.5 cm 정도의 덩어리를 배양하는 것이 효과적이었으며, 이때 배양배지는 1/2 MS 배지 또는 N6 배지에 2,4-D를 0.5-5 ppm, NAA를 0.5-1 ppm 넣어주거나 MS 배지 또는 N6 배지에 NAA를 0.5-1 ppm 첨가하는 것이 가장 효과적이었다 . 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다

캘러스에서 부정근 유도 수 (단위:개)

배지	2,4-D 농도 (ppm)			NAA 농도 (ppm)
배지	0.5	1	5	0.5	1	5
MS	5	7	2	8	7	1
1/2 MS	8	8	3	15	14	3
B5	-	-	-	-	-	-
SH	-	-	-	-	-	-
LS	-	-	-	2	2	-
White	1	1	-	3	3	-
N6	8	8	2	12	11	1
GD	-	-	-	2	2	-

실시예 5: 현탁배양 세포에서 부정근의 유도

상기 실시예 4와 동일한 배지들 및 식물 생장조절인자를 이용하여 현탁배양세포로부터 부정근을 유도하였다. 그 결과, 1/2 MS 배지에 0.5-5 ppm 정도의 NAA를 넣어주는 것이 필수적이었으며, 접종시 세포의 밀도는 배지 총량의 0.1%에서 0.5% 정도로 조절시킨 다음 배양 4-6주 정도 동일배지에 유지시켜야 부정근의 분화가 가능하였다.

실시예 6: 소규모 생물반응기를 이용한 벼 부정근 배양

배양세포 및 캘러스로부터 유도된 부정근은 대체로 길이가 2-7 cm 정도이며, 부정근 수는 약 40개에서 60개 정도이었다. 이 시료를 사용하여 소규모 생물반응기에서 연속 생산할 수 있는 최적조건을 찾기 위하여 부정근의 규격이 생장에 미치는 영향을 조사한 결과, 0.5-2.0 cm 길이의 부정근을 접종할 때 수확 시 생중량 증가가 크게 일어남을 관찰할 수 있었다. 5 ℓ 용량의 공기 부양식 생물반응기에 벼 부정근을 배양 시 초기 접종량은 0.5% 정도가 적당하였으며, 배지의 공급은 배양 부정근이 엉키기 시작하는 시점인 7일 단위로 첨가해주는 방식이 회분식 배양 (one batch culture)방식보다 훨씬 효과적임을 알 수 있었다. 5 ℓ 용량의 공기 부양식 생물반응기 (air lift bioreactor)에서 생장시킨 벼 부정근을 배양 4주 후에 다시 20 ℓ 용량의 공기 부양식 생물반응기에 계대배양하였다.

실시예 7: 식물체에 외래 단백질 발현용 벡터의 도입

벼의 종자를 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 발아시키고 이로부터 자엽 절편을 얻었다. 식물 바이너리 (binary) 벡터인 pRD400을 접합 (conjugation)또는 형질전환에 의하여 Ti 플라스미드가 내재되어 있는 아그로박테리움 튜머페이션스 GV3101 (Mp90)에 도입하였다 (Plant - cell - rep ., 15(11):799-803(1996)). 아그로박테리움 튜머페이션스 GV3101(Mp90) (Hamid et al., Plant Cell Reports 15(11):799-803, 1996)을 수퍼 브로스(super broth: 37 g/ℓ Brain heart infusion broth(Difco), 0.2% 수크로스, pH 5.6)에서 18시간 동안 배양한 다음, 이 배양액에 상기 자엽 절편을 침지시켜 10분간 혼합하였다. 그런 다음, 2일 동안 25℃에서 암배양 조건으로 공동배양 배지 [BAP (6-benzylaminopurine) 2 mg/ℓ가 함유된 MSB5 (Murashige & Skoog medium including Gamborg B5 vitamins)]에서 3일 동안 아그로박테리움 튜머페이션스 및 자엽을 공동배양하였다. 그리고 나서, 세균을 제거하는 클린업 단계를 거쳐 자엽을 MSB5, MES 0.5 g/ℓ, 3% 수크로스 및 0.4% 피타겔을 기본으로 하는 배지에 BA 2 mg/ℓ와 카르베니실린 500 mg/ℓ, 그리고 카나마이신을 농도별로 추가하여 4 주 동안 25 ±1℃ 및 8,000 룩스, 16시간/8시간 (day/night)의 조건에서 배양하였다.

이어, 재분화된 신초를 일정량의 NAA (0, 0.01 및 0.1 mg/ℓ), 카나마이신 100 mg/ℓ 및 일정량의 아가 (0.4%, 0.6% 및 0.8%)를 포함하는 발근 배지에 옮겨 25 ±1℃ 및 8,000 룩스, 16시간/8시간 (day/night)의 조건으로 배양하여 발근한 개체를 형질전환체로 추정하여 하기 실시예 8의 방법을 이용하여 분석하였다.

실시예 8: 형질전환 식물체의 확인

상기 실시예 7에서 형질전환체의 확인은 다음과 같이 실시하였다:

실시예 8-1: GUS 분석

상기 실시예 7에서 확보한 식물체의 유전자 발현 확인은 다음과 같이 실시하였다: 베타-글루쿠로니다아제 (β- glucuronidase, GUS) 리포터 유전자의 발현을 확인하기 위해 잎을 채취한 다음, GUS 분석 용액 (X-gluc (5-Bromo-4-Chloro- 3-Indole-β-D-Glucuronic Acid), 1 mg/㎖) 200 ㎕를 잎이 들어있는 용기에 넣고 진공기 (vacuum)를 이용하여 완전히 젖을 때까지 진공을 유지하였다. 그 후 발색되는 양상을 육안으로 관찰하여 유전자의 도입 및 발현을 확인하였다.

실시예 8-2: PCR 분석

PCR 분석을 위한 식물 게놈 DNA의 분리는 Edwards 방법 (Edward et al., Nucleic Acids Research 19(6):1349, 1991)에 의하여 추출하였다. PCR 분석에서 사용된 프라이머는 아그로박테리움 튜머페이션스에 있는 벡터의 Kan 유전자의 염기 서열에 대응하는 것으로서, 정방향 프라이머는 서열번호 1로 기재되는 서열 (5’-AGA CCA GTT GAG ATT AGG CCA G-3')이고, 역방향 프라이머는 서열번호 2로 기재되는 서열 (5’-GCC TCA TGC AAC CTA ACA GA-3')이다. PCR 반응은 Taq 중합효소를 이용하여, 96℃에서 2분간 전변성한 후, 94℃에서 1분간 변성, 55℃에서 1분간 연결반응, 72℃에서 2분간의 중합반응을 35회 반복하였고, 추가로 72℃에서 10분간 연장 반응을 한 후 반응산물은 1.0% 아가로스 겔에서 분석하였다.

그 결과, 본 발명의 형질전환체에서 Kan 유전자에 해당하는 0.5 kb DNA 밴드가 관찰되어 형질전환되었음을 확인할 수 있었다.

실시예 9: 모상근 유도

벼 뿌리를 채취하여 뿌리의 표면을 70% 에탄올로 10분, 7% 차이염소산나트륨액으로 15분간 살균하고, 무균수로 3회 세척한 다음 20 mm 크기로 절단하였다. 벼 뿌리 절편의 표면에 멸균된 증류수로 1×10⁸ 세포/㎖이 되게 희석한 아그로박테리움 리조게네스 (ATCC 15834)를 접종시키고, 300 ㎎/ℓ의 세포탁심이 첨가된 MS 배지에 치상하고, 27℃의 암소에서 배양하였다. 유도된 모상근을 절취하여 카베니실린 500 ㎎/ℓ, 가나마이신 25 ㎎/ℓ가 첨가된 배지에 옮겨 박테리아를 제거한 다음, 항생제를 첨가하지 않은 모상근 생장배지 (MSB5, 3% 수크로즈, MES, IAA)에 옮겨 2개월간 배양하여 모상근을 유도하였다.

실시예 10: 모상근에서 캘러스 유도

붉은 색을 띄는 모상근을 10 mm 크기의 절편으로 만들고, 캘러스 유도 배지에 20개씩 분주한 다음, 24℃에서 12주간 배양하여 배를 유도하였다. 배를 형성한 캘러스의 수를 해부현미경으로 측정한 결과, 배 형성율은 4주후 13.2%, 12주후 39.5%이었다.

유도된 캘러스를 체세포배 유도 배지에 10개씩 옮겨 60일간 배양하여 체세포배를 유도하였다. 체세포배 유도율은 캘러스당 26개의 배가 발생된 것으로 나타났다.

유식물체 유도자엽을 갖는 체세포배를 발아배지에서 두 달간 배양하여 발아시키고, 유식물체를 얻은 다음, 재분화 배지(1/2 MS 배지)에 옮겨 줄기와 뿌리를 유도하였다. 한 달 후 줄기와 뿌리를 정상적으로 갖는 식물체는 33%, 뿌리는 있으나 줄기가 부실한 식물체는 67%이었다.

실시예 11: 모상근의 액체 배양

상기 실시예에서 생성된 모상근을 실시예 6에서 제시한 소규모 생물반응기에서 연속 생산 단계를 반복하되 모상근 배양 배지의 IAA 농도를 0, 0.1, 0.5, 1 ppm으로 조정한 배지에서 배양한 결과 모상근의 번식률은 IAA 0.5 ppm에서 가장 높은 것으로 나타났다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명은 공기 부양식 생물반응기를 이용한 식물체의 부정근 대량 생산 방법, 형질전환 식물체의 부정근으로부터 유용 재조합단백질의 대량 생산 방법 및 형질전환 식물체의 모상근으로부터 유용 재조합단백질의 대량 생산 방법을 제공한다.

본 발명의 방법에 따르면 외부 환경으로 인한 생육의 저해를 방지하면서 또한 외부환경을 오염시키지 않으면서 생물반응기에서 식물체의 뿌리를 대량으로 증식하여 외래 단백질을 안정적으로 대량 생산할 수 있다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> NEXGEN BIOTECHNOLOGIES, INC. <120> Method for Producing Available Recombinant Protein by Culturing Hairy Root of Transformed Plants <130> dp-2007-0067 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for Kan <400> 1 agaccagttg agattaggcc ag 22 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for Kan <400> 2 gcctcatgca acctaacaga 20

Claims

(ⅰ) 유용 재조합단백질을 코딩하는 유전자가 삽입된 Ri 플라스미드를 포함하는 아그로박테리움 리조게네스 (Agrobacterium rhizogenes)를 식물체의 뿌리 절편에 감염시키는 단계;

(ⅱ) 감염된 뿌리 절편으로부터 모상근 (hairy root)을 유도하는 단계;

(ⅲ) 캘러스 유도 배지 및 식물 생장조절물질을 이용하여 모상근으로부터 캘러스를 유도하는 단계;

(ⅳ) 캘러스를 기내 배유도배지에 옮겨 배양함으로써 체세포배를 유도하는 단계;

(ⅴ) 체세포배를 발아배지 및 재분화 배지에서 배양함으로써 형질전환 식물체를 유도하는 단계; 및

(ⅵ) 형질전환 식물체의 모상근을 생물반응기에서 액체배양하는 단계를 포함하는 형질전환 식물체의 모상근으로부터 유용 재조합단백질을 대량 생산하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 (ⅲ)의 캘러스 유도 배지는 MS 또는 N6 배지이고, 식물 생장조절물질은 IAA, IBA, NAA 및 2,4-D로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 형질전환 식물체의 모상근으로부터 유용 재조합단백질을 대량 생산하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (ⅴ)는 BA 또는 NAA를 0.01-2 ppm 첨가하여 배양함으로써 형질전환 식물체로 유도시키는 것을 특징으로 하는 형질전환 식물체의 모상근으로부터 유용 재조합단백질을 대량 생산하는 방법.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 식물체는 벼 (Oryza sativa), 보리 (Hordum sativum), 밀 (Triticum aestivum 또는 Triticum vulgare), 감자 (Solanum tuberosum), 고구마 (Ipomoea batatas), 오이 (Cucumis sativus) 및 참외 (Cucumis melo)로 구성된 군으로부터 선택되는 식물체인 것을 특징으로 하는 방법.