KR101174410B1

KR101174410B1 - α-토코페롤 고 함유 형질전환 콩 및 그의 제조방법

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Publication number: KR101174410B1
Application number: KR1020080110858A
Authority: KR
Inventors: 이기종; 권순종; 김동헌; 김명식; 이경렬; 박용환; 김정봉; 김경환; 이부영
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2008-11-10
Filing date: 2008-11-10
Publication date: 2012-08-22
Also published as: KR20100052011A

Abstract

본 발명은 α-토코페롤 고 함유 형질전환 콩 및 그의 제조방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는 콩 종자 내부에 다량으로 함유되어 있는 γ-토코페롤을 들깨에서 유래한 γ-토코페롤 메틸트랜스퍼라제(γ-tmt)에 의하여 비타민 E 활성이 월등히 높은 α-토코페롤로 전환하여 콩 종자 내에 α-토코페롤 함량이 증가하도록 아그로박테리움 투메파시엔스를 이용한 콩의 형질전환 방법 및 이 방법에 의하여 생산된 콩에 관한 것이다.

Description

α-토코페롤 고 함유 형질전환 콩 및 그의 제조방법{High α-tocopherol transgenic soybean and the method for preparing thereof}

본 발명은 알파(α)-토코페롤 고 함유 형질전환 콩 및 그의 제조방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는 콩 종자 내부에 다량으로 함유되어 있는 감마(γ)-토코페롤을 들깨에서 유래한 γ-토코페롤 메틸트랜스퍼라제(γ-tocopherol methyltransferase, 이하 'γ-tmt'라 함)에 의하여 비타민 E 활성이 월등히 높은 α-토코페롤로 전환하여 콩 종자 내에 α-토코페롤 함량이 증가하도록 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)를 이용한 콩의 형질전환 방법 및 이 방법에 의하여 생산된 콩에 관한 것이다.

콩(Glycine max (L.) Merr.)의 원산지는 우리나라를 포함한 동북아시아이며, 우리나라는 삼국시대 초기부터 오곡중의 하나로 재배되었으며 최근까지 국민영양상 주요한 단백질 급원으로 이용되어왔다. 서양에는 18세기 이후 콩이 전파되어 재배되었으며, 2007년 전 세계에서 생산된 219.8백만톤의 콩 재배지를 살펴보면, 남미지역이 52%, 미국이 32%를 차지하였다(www.soystat.com/2008).

콩은 주요한 단백질 및 지방의 급원일 뿐만 아니라 비타민 A, B, D, E도 풍 부하여, 우리나라를 비롯한 동양에서는 주로 식용으로 이용되어 왔지만 서양에서는 가공식용 및 사료용 등으로 많이 이용되어 왔다(조재영 외, 2007 四訂田作 향문사 서울: ISBN 89-7187-003-6 93520, 270-329쪽). 최근에는 웰빙(well-being) 식품과 자연적인 먹을거리를 찾으면서 콩의 소비가 증가하고 있다. 특히 콩에 풍부한 토코페롤이 심혈관 질환 및 암을 예방하며 면역기능을 보조하고 항산화작용으로 노화와 관련된 퇴행성 질환을 예방 및 완화할 수 있다(Pryor WA., 2000 Vitamin E and heart disease: Basic science to clinical intervention trials. Free Radic. Biol. Med. 28: 141-164)고 알려지면서 그 수요가 점차 증가하고 있다.

토코페롤은 지용성 항산화물질로 비타민 E로 잘 알려져 있다. 토코페롤은 광합성을 하는 녹색식물과 세균에서만 합성할 수 있기 때문에 인간은 이들을 섭취하여 보충할 수밖에 없다. 토코페롤은 방향족 고리의 메틸기(-CH₃) 수와 위치에 따라 알파(α-), 베타(β-), 감마(γ-), 델타(δ-) 등 4개의 동족체가 존재하며, 이들 중 활성이 가장 높고 인체 내 혈관에서 바로 이용될 수 있어 효과가 뛰어난 α-토코페롤은 γ-토코페롤보다 비타민 E 활성이 약 10배 이상 높다. 하지만 콩을 비롯한 대부분의 유지작물에 존재하는 토코페롤은 γ-토코페롤이 60~65%이며, δ-토코페롤이 20~26%를 차지한다. 따라서 다양한 작물에서 생물 활성을 증가시키려는 연구가 절실히 요구되어 왔다.

콩 형질전환에 있어서 필수적인 재분화 체계 확립과 조직배양기술은 이미 많은 연구자들로부터 시도되었다. 콩의 조직배양 연구는 상배축(epicotyl)(Wright MS. et al., 1987 Initiation and propagation of Glycine max L. Merr.: Plants from tissue-cultured epicotyls. Plant cell tissue and Organ culture 8: 83-90), 초생엽(primary leaf)(Wright MS. et al., 1987 Regeneration of soybean (Glycine max L. Merr.) from cultured primary leaf tissue. Plant cell Rep. 6: 83-89), 미숙배(immature embryo)(Christianson ML. et al., 1983 A morphogenetically competent soybean suspension culture. Science 222: 632-634), 자엽(Lippmann L et al., 1984 Induction of somatic embryos in cotyledonary tissue of soybean, Glycine max L. Merr. Plant Cell Reports 3: 215-218), 원형질체(Myers JR et al., 1989 Plant regeneration of wildGlycine species from suspension culture-derived protoplasts. Plant Cell Reports 8: 112-115) 등을 이용한 재분화 체계가 확립되었다. 식물 형질전환시 목적하는 유전자를 도입하기 위해서는 일반적으로 아그로박테리움을 이용하거나 입자충격법(particle bombardment)을 이용하는데, 콩 형질전환도 아그로박테리움(Hinchee MAW. et al., 1988 Production of transgenic soybean plants using Agrobacterium-mediated DNA transfer. Bio/technology 6: 915-922; Chee PP. et al., 1989 Transformation of soybean(Glycine max) by infecting germinating seeds with Agrobacterium tumefaciens. Plant physiol. 91: 1212-1218)을 이용하거나 입자충격법 등이 사용되어 왔다(McCabe DE. et al., 1988 Stable transformation of soybean (Glycine max) by particle acceleration. Bio/Technology 6: 923~926; Christou P. et al., 1988 Stable transformation of soybean callus by DNA-coated gold particles. Plant Physiol. 87: 671-674). 형질전환 효율을 높이고 재현성을 향상시키기 위하여 다양한 연구가 시도되었으며 시스테인(L-cysteine), 글루타치온(glutathione)과 같은 황화합물을 첨가하거나(Olhoft P. and Sommer D. 2001 L-Cysteine increases Agrobacterium-mediated T-DNA delivery into soybean cotyledonary-node cells. Plant cell Rep. 20:706-711), 초음파(Trick HN et al., 1997 SAAT: sonication-assisted Agrobacterium-mediated transformation. Transgenic Research 6: 329-336) 및 미숙배를 이용하여 식물체로 발달시키기도 하지만 재료를 구하기가 어려운 문제점이 있다. 따라서, 아직까지 형질전환 효율이 낮고 재현성이 낮은 문제점을 안고 있으므로 보다 효율적이고 안정적인 재분화 시스템 및 형질전환 기술 개발이 절실히 요구되고 있다.

콩의 재배에는 잡초 방제가 큰 문제이기 때문에 식물 생명공학 기술을 이용하여 제초제저항성 작물을 개발하려는 연구가 가장 먼저 시도되었으며 1996년에 글리포세이트(glyphosate) 제초제저항성을 나타내는 라운드업레디(Roundup Ready) 콩이 상업화된 이후 제초제저항성 콩은 2007년 전체 생산면적 91백만 헥타르중 64%에서 재배되고 있다(James C. 2008 Global Status of Commercialized Biotech/GM Crops: 2007 www.ISAAA.org). 포스피노트리신(phosphinothricin, PPT)은 바스타(basta, 바이엘크롭사이언스)의 주성분으로서 식물의 글루타민 합성을 저해시키고 그 결과 암모니아 축적으로 인한 식물체의 광합성 저해작용으로 식물체를 고사시키는 비선택성 제초제이다. 이러한 PPT 제초제 성분에 대한 저항성 유전자인 bar 유전자(bialaphos resistance gene)는 PPT를 아세틸화하여 무독화 시키는 효소인 포스피노트리신 아세틸전이효소(phosphinothricin acetyltransferase, PAT)의 유전자로서 스트렙토마이세스 하이그로스코피커스(Streptomyces hygroscopicus)로부터 클로닝 되어(Thompson CJ. et al., 1987 Characterization of the herbicide-resistance gene bar from Streptomyces hygroscopicus. EMBO 6: 2519-2523) 제초제저항성 식물체 개발에 많이 이용되고 있다. 제초제저항성, 병해충저항성 및 기능성물질을 생산하는 새로운 품종들을 개발하기에는 기존의 교잡육종만으로는 한계가 있었다. 하지만 최근 발달한 생명공학 기술은 유용유전자를 식물체에 도입하여 발현시킴으로서 목적하는 새로운 형질을 얻을 수 있으며, 전통적인 교잡육종과는 달리 식물이 본래 가지고 있던 형질은 그대로 유지하면서, 빠른 시간 내에 품종 육성이 가능하다는 장점이 있다.

지금까지 다양한 방법들이 연구되어 왔음에도 불구하고 콩 형질전환은 효율성과 재현성이 낮고 일부 품종만을 형질전환에 이용할 수 있는 문제점이 있다.

본 발명은 상기 문제점을 해결하기 위해 이루어진 것으로, 효율적인 콩 형질전환을 위하여, 본 발명은 형질전환에 사용되는 콩이 최대한 분화되지 않은 상태를 유지하여 재분화의 효율을 높여 형질전환 효율을 높이는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한, 아그로박테리움(Agrobacterium)을 이용하여 형질전환시킨 콩에서 γ-토코페롤을α-토코페롤로 전환하여 그 양이 증가되는 형질전환 콩의 제조방법을 제공하고자 한다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 들깨에서 유래한 γ-tmt 유전자를 이용하여 콩에 형질전환시킴으로서 식물체내에서 α-토코페롤의 생산을 증가시키고 이를 위해 형질전환 효율을 향상하는 방법을 제공한다.

본 발명의 한 측면은 서열번호 1의 들깨 유래의 γ-tmt 유전자를 포함하는 발현벡터를 아그로박테리움에 도입하여 형질전환하는 단계; 상기 형질전환된 아그로박테리움을 콩의 자엽와 함께 공동배양하는 단계; 상기 공동배양된 콩의 자엽를 신초유도배지에 치상하여 신초를 유도한 후 상기 유도된 신초를 신초신장배지에 치상하여 신장시키고 발근배지에서 뿌리를 유도하는 단계; 및 뿌리가 발달한 콩을 자연환경에 이식하여 순화시키는 단계; 를 포함하며, 상기 콩의 자엽는 시토키닌이 첨가된 배지 및 차광 상태에서 발아된 α-토코페롤 고 함유 콩의 제조방법을 제공한다.

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또한, 바람직하게, 상기 신초유도배지는 비5(B5) 기본배지에 3%의 수크로오스(sucrose), 3mM의 엠이에스(MES), 1.67㎎/ℓ의 벤질아데닌(BA), 250㎎/ℓ의 세포탁심(cefotaxime), 50㎎/ℓ의 반코마이신(vancomycin), 0.8%의 식물 아가(plant agar), 8㎎/ℓ의 포스피노트리신(PPT)이 첨가된 것으로, pH 5.7인 α-토코페롤 고 함유 콩의 제조방법을 제공한다.

또한, 바람직하게 상기 신초신장배지는 엠에스(MS) 기본배지에 3%의 수크로오스(sucrose), 3mM의 엠이에스(MES), 0.5㎎/ℓ의 지베렐린(GA), 50㎎/ℓ의 아스파라긴(asparagine), 1㎎/ℓ의 지아틴 리보사이드(zeatin riboside), 0.1㎎/ℓ의 아이에이에이(IAA), 250㎎/ℓ의 세포탁심(cefotaxime), 50㎎/ℓ의 반코마이신(vancomycin), 0.8%의 식물 아가(plant agar), 5㎎/ℓ의 포스피노트리신(PPT)이 첨가된 것으로, pH 5.7인 α-토코페롤 고 함유 콩의 제조방법을 제공한다.

또한, 바람직하게 상기 발근배지는 엠에스(MS)기본배지에 3%의 수크로오스(sucrose), 1㎎/ℓ의 엔에이에이(NAA), 0.8% 식물 아가(plant agar)가 첨가된 것으로, pH 5.7인 α-토코페롤 고 함유 콩의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 다른 측면은 상기 α-토코페롤 고 함유 콩의 제조방법에 의해 제조된 들깨 유래의 γ-tmt 유전자가 형질전환된 α-토코페롤 고 함유 콩을 제공한다.

이하 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명은 콩에서 α-토코페롤의 생산을 증진시키기 위하여 농촌진흥청 농업생명공학연구원으로부터 분양받은 들깨 유래 γ-tmt 유전자를 이용하였으며, 이의 기작은 γ-토코페롤에 메틸기를 전이하여 α-토코페롤을 생성하는 유전자이다. 비실린 프로모터(Vicillin promoter; Pvic)와 옥토파인 합성효소 터미네이터 (Octopine synthase; Tocs)로 이루어진 재조합 벡터를 이용하였다(도 1).

식물체를 기내에서(in vitro) 배양하기 위해서는 여러 가지 물질이 필요한데, 일반적으로는 유기 및 무기영양소와 이들이 적절히 이용되도록 조절하는 식물호르몬(phytohormone)이 필요하다. 식물호르몬은 유기물로 구성된 일종의 화학적 정보 전달체로 세포, 조직 및 기관의 생장을 촉진시키는 역할을 한다. 대표적인 식물호르몬은 옥신(auxin), 지베렐린(gibberellin), 시토키닌(cytokinin), 아브시스산(abscisic acid, ABA) 및 에틸렌(ethylene)이 있으며 이들의 화학적 구성과 생물적 활성은 식물체내에서 다양한 기능으로 나타난다. 식물조직배양에서 많이 이용되는 식물생장조절제(plant growth regulator)는 이러한 효과를 나타내기 위하여 이와 동일하거나 유사한 합성물질을 말한다(최상진, 1996 식물조직배양학 선진문화사 서울: 91-142쪽). 식물체는 전체형성능(totipotency)을 가지고 있기 때문에 식물체의 일부 조직만으로도 적당한 환경에서 배양하면 온전한 식물체로 재생할 수 있는 능력이 있다. 특히 완전히 분화된 조직보다는 어린 조직을 이용하면 재생능이 강하기 때문에 효율이 높아서 어린 식물체의 조직을 더 많이 선호한다.

빛이 비치는 배양환경에서 콩을 발아시키면 광합성 활동이 시작되어 조직분화가 활발히 이루어지고 이후 체세포가 발달하여 조직이 단단하게 된다. 본 발명에서는 차광을 통해 콩의 어리고 연한 조직인 자엽만을 생장시키는 것이 핵심이다. 그렇지만 차광하에서 콩을 발아시키면 우리가 쉽게 볼 수 있는 콩나물(soybean sprout) 상태가 되며 이 상태의 시료를 형질전환에 이용하면 연한 조직으로 인해 조그만 상처에도 시료가 쉽게 무르고 결국에는 고사하게 된다. 이를 방지하기 위하여 세포분열을 촉진하는 식물생장조절제인 시토키닌을 첨가하여 노란색의 연한 조직 상태를 유지하면서 형질전환시 조직이 쉽게 무르지 않는 시료를 확보하는 것이 본 과제의 목표이다. 이와 같이 형질전환에 용이한 시험재료를 만들고, 형질전환 기술을 이용하여 α-토코페롤의 함량이 기존에 비해 월등히 증가된 형질전환체를 확보할 수 있게 된다.

본 발명에 의하면 콩 형질전환의 효율이 향상된다. 또한, 농촌진흥청 국립농업유전자원센터의 식물유전자원검색시스템에 의하면 α-토코페롤의 함량이 제일 높은 콩의 재배품종은 은하콩이며, 그 양은 8mg/100g이었고, 보유하고 있는 콩 유전자원의 대부분은 5mg/100g이하의 α-토코페롤을 함유하고 있다. 본 발명에 의해 인간의 몸에 이로운 α-토코페롤이 은하콩보다 4~8배 증가한 형질전환 콩은 그 이용성이 크게 증대될 뿐만 아니라 국민건강 증진에 기여할 수 있어 부가가치도 향상될 것이며, 이러한 콩을 이용한 새로운 제품을 개발할 때에도 그 부가가치를 높일 수 있다. 또한, 선진농업기술인 콩 형질전환 기술 확보로 경쟁력 강화와 고품질 콩을 생산하기 위한 육종소재로의 이용이 가능하다. 또한 본 발명에 따른 α-토코페롤 고 함유 콩 식물체는 다른 품종에 이러한 형질을 도입하는데 육종 모본으로도 사용될 수 있을 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더 상세히 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되어서는 안 된다.

[실시예 1] 형질전환 재료의 준비

형질전환에 사용할 콩(잭(Jack))을 페트리디쉬(petri-dish, 100x20㎜)에 적당량을 넣고 100㎖ 차아염소산나트늄(sodium hypochlorite)과 5㎖의 HCl을 혼합하여 하루 동안 염소가스 소독을 실시하였다. 24웰 세포 배양 플레이트(24well cell culture plate)에 2㎖의 MS(Murashige T. and Skoog F., 1962 A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum 15: 473-497) 액체배지와 1㎎/ℓ의 BAP를 첨가하여 차광상태에서 콩을 발아시킨 후 MS 고체배지에서 배양하여 형질전환 재료로 이용하였다.

도 2에는 종래대로 광을 조사하여 재배한 콩과 시토키닌이 첨가된 배지에서 빛을 차단한 채 재배한 콩의 사진이 나타나 있다. 도 2의 B에서 보는 것처럼, 차광 및 시토키닌 처리 하에 재배한 콩은 노란색의 연한 조직을 가진다.

광 유무와 시토키닌 처리 여부에 따른 형질전환 효율을 비교한 결과를 표 1 에 나타내었다.

[표 1] 차광과 시토키닌(BAP)처리에 따른 형질전환 효율 비교

	광조사	차광+시토키닌 처리
절편체수	147	141
형질전환체	2	4
형질전환율	1.4%	2.8%

상기 표 1 및 도 2에서 보는 바와 같이, 조직 분화는 미숙하지만 형질전환에 적당한 조직을 이용하기 위하여 시토키닌의 일종인 식물생장조절제인 BAP를 1㎎/ℓ 첨가하여 차광상태에서 배양한 재료를 이용하면 형질전환 효율이 증가하였다.

[실시예 2] 식물형질전환

(1) 발현 벡터의 제작

들깨 γ-tmt유전자 카셋트를 농촌진흥청 농업생명공학연구원으로부터 분양받은 식물 형질전환용 재조합 벡터인 pCAMBIA3301(KACC70016)에 삽입하여 사용하였다. 상기 재조합 벡터를 pCAMBIA3301-tmt라 명명하였다(도 1 참조).

(2) 아그로박테리움(Agrobacterium)로의 형질전환

상기 재조합벡터를 안 등(An G et al., 1988 Binary vectors. In:Gelvin SB, Schilperoort RA, Verma DPS (eds) Plant Molecular Biology Manual A3/l-A3/19. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht)의 방법에 따라 아그로박테리 움(Agrobacterium) EHA105에 도입한 후 카나마이신(kanamycin) 50㎎/ℓ와 리팜피신(rifampicin) 50㎎/ℓ가 첨가된 YEP(1% yeast extract, 1% peptone, 0.5% NaCl) 고체배지에서 pCAMBIA3301-tmt가 도입된 균주를 선발하였다. 이후 선발된 균주를 50㎎/ℓ 카나마이신이 포함된 YEP 액체배지에서 28℃, 200rpm의 조건에서 배양하고 OD₆₀₀=0.6으로 현탁하여 형질전환에 이용하였다.

(3) 콩으로의 형질전환

(3-1) 공동배양

상기 형질전환된 아그로박테리움(Agrobacterium)을 깨끗이 정리한 콩의 자엽와 함께 50㎖ 튜브에서 30분간 접종한 후 24℃, 암상태로 5일간 배양하였다(도 3의 A 참조).

(3-2) 신초 유도

아그로박테리움(Agrobacterium)과 공동배양한 콩 자엽를 B₅배지(Gamborg OL. et al., 1968 Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells. Exp Cell Res. 50: 151-158), 3%의 수크로오스(sucrose), 3mM의 MES, 1.67㎎/ℓ의 벤질아데닌(BA), 250㎎/ℓ의 세포탁심(cefotaxime), 50㎎/ℓ의 반코마이신(vancomycin), 0.8%의 식물 아가(plant agar), 8㎎/ℓ의 포스피노트리신(PPT)이 첨가된 신초유도배지(SI, pH 5.7)에 옮겨 신초를 유도하였다(도 3의 B 참조).

(3-3) 신초신장

신초가 유도된 콩 자엽를 2주마다 한번씩 2번의 계대배양을 한 후 MS 기본배지, 3%의 수크로오스(sucrose), 3mM의 MES, 0.5㎎/ℓ의 지베렐린(GA), 50㎎/ℓ의 아스파라긴(asparagine), 1㎎/ℓ의 지아틴 리보사이드(zeatin riboside), 0.1㎎/ℓ의 IAA, 250㎎/ℓ의 세포탁심(cefotaxime), 50㎎/ℓ의 반코마이신(vancomycin), 0.8%의 식물 아가(plant agar), 5㎎/ℓ의 포스피노트리신(PPT)이 첨가된 신초신장배지(SE, pH 5.7)에서 신초를 신장시켰다(도 3의 C 참조).

(3-4) 뿌리 유도 및 순화

상기 신장된 신초를 MS 기본배지, 3%의 수크로오스(sucrose), 1㎎/ℓ의 NAA, 0.8%의 식물 아가(plant agar)가 첨가된 발근배지(RM, pH 5.7)에서 배양하면서 뿌리를 유도하였고 발근된 소식물체(plantlet)를 버미큘라이트(vermiculite)로 채워진 화분에서 순화하여 온실에서 생육시켰다(도 3의 D 참조).

(3-5) 형질전환체 선발

재조합 벡터내 선발마커인 gus 유전자를 이용하여 β-글루쿠로니다아제(β-glucuronidase)(GUS) 반응을 수행하였다. 식물체의 일부분을 1mM의 5-브로모-4-클로로-3-인돌-글루쿠로니다아제(5-bromo-4-chloro-3-indole-glucuronidase; X-gluc) 용액에 침지하여 37℃에서 16시간 이상 반응시킨 후 70% 알코올로 탈색시켜 GUS의 발색여부를 관찰하였다(도 4의 E 참조).

(3-5) 형질전환된 콩의 확인

형질전환 콩에서 γ-tmt 유전자의 도입여부를 확인하기 위하여 분자생물학적 검정을 실시하였다. 형질전환 콩의 잎조직으로부터 당업계에서 알려져 있는 통상의 방법에 따라 제노믹 DNA(genomic DNA)를 추출한 후 이를 주형으로 하여 PCR을 수행하였다. 선발마커인 제초제저항성(bar; 400bp) 유전자와 β-글루쿠로니다아제(β-glucuronidase)(gus; 500bp)유전자의 프라이머(primer)를 이용하였으며 이때 사용된 정방향 프라이머와 역방향 프라이머는 아래와 같다.

bar-F: 5'-TCTCGGTGACGGGCAGG-3

bar-R: 5'-CTCGTCCGTCTGCGGGA-3'

gus-F: 5'-GTGCACGACCACGCATTAATGGACT-3'

gus-R: 5'-AAATCGCCGCTTTGGACATACCATC-3'

PCR반응은 제조회사의 매뉴얼을 따라 수행하였으며 반응조건은 95℃에서 5분간 변성화 반응을 한 후 증폭반응(94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 30초간 반응)을 30회 진행하였고, 최종 신장반응을 72℃에서 10분간 실시하였다. 이후 PCR 결과를 아가로스 겔 전기영동으로 확인하였다. 그 결과를 도 5a에 나타냈다.

도 5a에서 보는 바와 같이, 형질전환 콩 내에 선발마커로 사용한 제초제저항성(bar; 400bp) 유전자와 β-글루쿠로니다아제(gus; 500bp)유전자가 도입되었다.

추출한 DNA(20㎍)를 EcoRI 제한효소로 절단하여 0.8% 아가로오스 겔에 전기영동하고, 아가로오스 겔상의 DNA를 Zeta-Probe® Blotting Membrane(BIO-RAD)에 전이시켰다. 형질전환에 이용한 벡터를 XbaI으로 절단하여 4.2kb의 삽입유전자를 [α-32P] dCTP로 표지하고 이를 프로브(probe)로 하여 써던 블럿(Southern blot)을 실시하여 형질전환체에 유전자의 도입을 확인하였다(도 5b 참조).

형질전환체의 종자로부터 총 RNA(total RNA)를 분리하여 역전사효소 이용 핵산중합효소반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction, RT-PCR) 분석을 수행하였다. 전체 RNA 5㎍을 주형으로 제조회사(바이오니아 Accupower RT/PCR PreMix K-2055)의 매뉴얼에 따라 상보성 DNA(complementary DNA, cDNA)를 합성하고 이것을 주형으로 γ-tmt 유전자에 하기의 특이적인 프라이머를 이용하여 PCR을 실시하였다(도 5c 참조).

tmt-F: 5'-ATGATTGAGGAGTCCCTCCG-3'

tmt-R: 5'-TATAACTGCCGGCCAAAATG-3'

온실에서 채종한 형질전환체 후대를 육묘상(plug tray)에서 발아시킨후 0.3% 바스타를 살포하고 일주일 뒤 제초제저항성 여부를 조사하였다(도 4의 F 참조). 제초제저항성을 보이는 개체의 잎을 수확하여 lateral flow test strip(SDI 7000043)을 이용하여 PAT 단백질이 발현되었음을 확인하였다(도 4의 G 참조). 도 4의 G에서 보는 바와 같이, 제초제저항성은 2개의 밴드로 나타나고 비형질전환체는 하나의 밴드만이 나타났다.

[실시예 3] 형질전환 콩의 분석

들깨 γ-tmt 유전자의 도입이 확인된 콩의 T2 종자로부터 토코페롤의 함량과 조성을 HPLC로 분석하였다. 그 결과를 표 2 및 도 6에 나타냈다.

도 6에서 보는 바와 같이, 들깨 γ-tmt 유전자가 도입된 형질전환 콩 T2 종자에서 α-토코페롤 함량이 대조구에 비해 크게 증가하였다. 대조구인 비형질전환 콩의 경우 γ-토코페롤과 δ-토코페롤이 주를 이루는 반면 들깨 유래 γ-tmt 유전자가 도입된 형질전환 콩에서는 α-토코페롤과 β-토코페롤이 크게 증가함을 확인하였다.

특히 표 2에서 α/γ-토코페롤의 비율을 살펴보면 12.7~650.5로 시료에 따라 다양한 비율로 토코페롤이 존재하며, 결과적으로 γ-tmt 유전자를 형질전환함으로서 식물체내에서 α-토코페롤의 함량을 증가시킬 수 있음을 확인하였다.

[표 2] 형질전환체 종자로부터의 토코페롤 분석 결과

시료	토코페롤 농도(㎍·g-1)
시료	α	β	γ	δ	α/γ
잭(jack)	-*	-	668.8	267.9	0
St2-7	597.4	164.2	6.5	-	91.9
St2-15	669.2	186.3	10.5	-	63.7
St2-17	650.5	229.6	-	-	650.5
St2-28	601.8	173.9	9.5	-	63.3
St2-38	502.5	223.5	12.5	-	40.2
St2-50	373.7	184.6	6.6	-	56.6
St2-55	371.0	188.9	29.2	-	12.7

* 극미량

도 1은 들깨 유랭의 γ-tmt 유전자를 콩에 형질전환하기 위한 발현 벡터의 개열지도이다.

도 2는 본 발명에 따른 형질전환에 사용하기 위해 발아시킨 콩을 나타내는 사진으로, A는 광조사 하에서 재배한 콩이며, B는 차광 상태 하에서, 시토키닌이 첨가된 배지에서 재배한 콩의 사진이다.

도 3은 본 발명에 따른 α-토코페롤 고 함유 콩의 제조방법의 각각의 단계를 나타내는 사진으로, A는 공동배양단계, B는 신초발생단계, C는 신초신장단계, D는 순화 후 결실단계를 나타낸다.

도 4는 본 발명에 따라 제조된 α-토코페롤 고 함유 콩을 분석하는 것으로, E는 gus분석 결과, F는 제초제(바스타 0.3%) 검정 결과, G는 Lateral flow strip 검정 결과를 나타낸다.

도 5는 본 발명에 따른 형질전환 콩의 PCR증폭 결과를 나타내는 사진으로, 도 5a의 A는 bar 프라이머를 이용한 PCR 결과, B는 gus 프라이머를 이용한 PCR 결과를 나타내며, 도 5b는 써던 블럿(southern blot)을 수행한 결과, 도 5c는 RT-PCR로 증폭한 결과를 나타낸다. 또한, 1~13은 형질전환체를, J는 비형질전환체(control)를, +는 양성 대조군을 나타낸다.

도 6은 본 발명의 형질전환 콩의 종자와 비형질전환 콩 종자의 토코페롤 함량의 HPLC 분석 결과이다.

<110> Republic of Korea <120> High alpha-tocopherol transgenic soybean and the method for preparing thereof <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1110 <212> DNA <213> Perilla frutescens <400> 1 atggccgagg cggtcacgcc aggtatctgc accaccgggt ggcgccgcgg tggggtccac 60 gctcccactt ataatatttc tataaagcca gcgacagcgt tgctggttgg ctgcaccacc 120 aaaaccaaaa gcattacttc tttttccaca gactccctca ggacacgtgg cagagcacgt 180 cgcccgacga tgagcctgaa cgccgctgcg gcggagatgg agacggagat ggagaccttg 240 cgtaaaggga ttgcggagtt ctacgacgag tcgtcggggg tgtgggagaa catatgggga 300 gaccacatgc accacggctt ttacgagccg gccgccgacg tctccatctc cgaccatcgc 360 gccgcccaga tccgcatgat tgaggagtcc ctccgattcg cttccttctc tccgataact 420 acgacggaga aaccgaagaa tatagttgat gtgggatgtg gtataggagg cagttctagg 480 tatctggcaa gaaaatatgg ggctaaattg tctagggcta ttactctttc cagccctgtg 540 caagcgcaga gagctcaaca gcttgctgat gctcaaggat taaatggcaa ggtttccttt 600 gaagttgctg atgcgttgaa ccaaccattt cctgaaggga agtttgatct ggtttggtcg 660 atggagagtg gagaacacat gcctgataag aaaaagtttg taaatgagct ggtgcgtgtg 720 gctgctcctg gtggaagaat aatcatcgtt acatggtgcc acagggacct atcaccttct 780 gaagaatctc ttcgccaaga ggagaaagat ttgctaaaca aaatatgtag tgcttattat 840 cttccagcat ggtgctctac tgctgactat gtcaaattac tcgactccct ctcaatggag 900 gacattaagt ctgcagactg gtctgaccat gtcgctccat tttggccggc agttataaag 960 tcggcattga catggaaggg cataacctca ctgctaagga gcggatggaa gactataaga 1020 ggagcaatgg tgatgccatt gatgatcgaa ggatataaga agggcgtgat caaatttgcc 1080 atcattacat gccgaaaacc tgcatcttaa 1110

Claims

서열번호 1의 들깨 유래의 γ-tmt 유전자를 포함하는 도 1의 개열지도로 표현된 발현벡터를 아그로박테리움에 도입하여 형질전환하는 단계;

상기 형질전환된 아그로박테리움을 콩의 자엽와 함께 공동배양하는 단계;

상기 공동배양된 콩의 자엽를 신초유도배지에 치상하여 신초를 유도한 후 상기 유도된 신초를 신초신장배지에 치상하여 신장시키고 발근배지에서 뿌리를 유도하는 단계; 및

뿌리가 발달한 콩을 자연환경에 이식하여 순화시키는 단계; 를 포함하며,

상기 콩의 자엽는 시토키닌이 첨가된 배지 및 차광 상태에서 발아된 것을 특징으로 하는 α-토코페롤 고 함유 콩의 제조방법.
삭제
제1항에 있어서,

상기 신초유도배지는 비₅(B₅) 기본배지에 3%의 수크로오스(sucrose), 3mM의 엠이에스(MES), 1.67㎎/ℓ의 벤질아데닌(BA), 250㎎/ℓ의 세포탁심(cefotaxime), 50㎎/ℓ의 반코마이신(vancomycin), 0.8%의 식물 아가(plant agar), 8㎎/ℓ의 포스피노트리신(PPT)이 첨가된 것으로, pH 5.7인 것을 특징으로 하는 α-토코페롤 고 함유 콩의 제조방법.
제1항에 있어서,

상기 신초신장배지는 엠에스(MS) 기본배지에 3%의 수크로오스(sucrose), 3mM의 엠이에스(MES), 0.5㎎/ℓ의 지베렐린(GA), 50㎎/ℓ의 아스파라긴(asparagine), 1㎎/ℓ의 지아틴 리보사이드(zeatin riboside), 0.1㎎/ℓ의 아이에이에이(IAA), 250㎎/ℓ의 세포탁심(cefotaxime), 50㎎/ℓ의 반코마이신(vancomycin), 0.8%의 식물 아가(plant agar), 5㎎/ℓ의 포스피노트리신(PPT)이 첨가된 것으로, pH 5.7인 것을 특징으로 하는 α-토코페롤 고 함유 콩의 제조방법.
제1항에 있어서,

상기 발근배지는 엠에스(MS)기본배지에 3%의 수크로오스(sucrose), 1㎎/ℓ의 엔에이에이(NAA), 0.8% 식물 아가(plant agar)가 첨가된 것으로, pH 5.7인 것을 특징으로 하는 α-토코페롤 고 함유 콩의 제조방법.
제1항 및 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 들깨 유래의 γ-tmt 유전자가 형질전환된 α-토코페롤 고 함유 콩.