KR20070012605A - 카네이션 형질전환체의 제조방법 및 신기능 형질전환카네이션의 조기개발 - Google Patents

카네이션 형질전환체의 제조방법 및 신기능 형질전환카네이션의 조기개발 Download PDF

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안병준
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단국대학교 산학협력단
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Abstract

본 발명은 아그로박테리움 튜머페이션스 ( Agrobacterium tumefaciens )를 이용한 카네이션 형질전환체의 제조방법 및 이로부터 제조되는 카네이션 형질전환체에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 (i) 카네이션 세포의 지놈 DNA에 삽입될 수 있고 다음과 같은 서열을 갖는 벡터가 내재되어 있는 아그로박테리움 튜머페이션스 (Agrobacterium tumefaciens )로 카네이션의 경정을 감염시키는 단계: (a) 카네이션 경정 내에서 작동하는 복제 원점; (b) 카네이션 세포 내에서 전사를 촉진할 수 있는 프로모터; (c) 상기 프로모터에 기능적으로 연결된 외래 단백질을 코딩하는 구조 유전자 서열; (ii) 상기 감염된 카네이션 경정을 BAP(6-Benzylaminopurine)가 함유된 배지에 치상하여 재분화시켜 다신초를 형성시키는 단계; 및 (iii) 상기 재분화된 신초를 발근 배지에서 발근시켜 형질전환 카네이션을 형성시키는 단계를 포함하는 카네이션 형질전환체의 제조방법 및 이로부터 제조되는 카네이션 형질전환체에 관한 것이다.
카네이션, 형질전환체, 아그로박테리움

Description

카네이션 형질전환체의 제조방법 및 신기능 형질전환 카네이션의 조기개발{Transformation methods based on in vitro shoot tip culture of carnations and produced transgenic plants}
도 1은 본 발명에 따른 카네이션 경정의 형질전환 직후의 상태를 나타내는 사진;
도 2는 본 발명에 이용된 바이너리 벡터 pGA748의 유전자 지도;
도 3은 본 발명에 따른 형질전환체의 아그로박테리움 튜머페이션스와의 공동배양기간동안의 경정의 사진;
도 4는 발근배지로 옮긴 후 형질전환 카네이션의 사진;
도 5는 카나마이신 농도 및 피토아가와 겔라이트의 조합에 따른 카네이션 경정에 미치는 영향에 대한 사진;
도 6은 본 발명에 따라 제조된 형질전환체를 확인하는 PCR 결과를 나타내는 겔 사진;
도 7은 본 발명에 따라 제조된 형질전환체와 비형질전환체의 온실 재배후 표현형을 비교하는 사진.
본 발명은 카네이션 형질전환체의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 아그로박테리움 튜머페이션스 ( Agrobacteruim tumefaciens )를 이용한 카네이션 형질전환체의 제조방법 및 이로부터 제조되는 카네이션 형질전환체에 관한 것이다.
카네이션은 석죽과( Caryophyllaceae ) Dianthus속의 다년생 식물로서, 남유럽, 북아프리카의 원종( Dianthus caryophyllus )과 일부 아시아에서 자생하는 D. chinensis의 교잡종에서부터 출발하여 초기의 일계성을 사계성 품종으로 육성이 지속되면서 오늘날 여러 품종의 절화용 카네이션들이 개량되었다. 카네이션은 주로 삽목 번식을 하며, 7~13절의 측지를 삽수로 이용한다. 삽목 번식은 생육이 빠른 장점이 있으나, 모두가 바이러스에 감염된 경우 번식된 묘로의 이병이 확실하며, 삽목시 청고병(wiltdisease)에 걸릴 확률도 매우 높다. 국내의 카네이션 재배는 마산과 부산 등의 남해안 일대에서 많이 이루어지고 있으며, 약 80ha의 재배면적에서 36백만 본의 절화가 생산되고 있다. 정식기 묘 공급 부족 현상이 나타나며, 연간 4억원 이상의 발근묘를 네덜란드, 일본 등에서 수입하여 재배하고 있는 실정이다. 또한 최근 카네이션의 소비는 정체되는 경향이며, 또한 수입 절화류가 계속 증가되어 경영여건이 어려운 실정이다. 따라서 앞으로는 소비를 촉진시키기 위해 새로운 형태나 색채, 방향성 등의 다양한 특성의 카네이션을 육성하여 새로운 소비를 개척하고, 고품질화 ? 생산성 향상에 기여할 수 있는 새로운 상품 개발에 주력해야 한다. 내병성과 노화억제를 위한 품종 육성을 휘해 기존의 교배를 통한 육종 노력 외에 병저항성, 노화 및 화색 관련 유전자를 카네이션에 도입하여 새로운 품종을 육성하는 유전공학적 연구가 세계적으로 진행되고 있다.
현재까지 카네이션의 재분화 및 형질전환에 관련하여 계속적인 연구가 있었으며 그 예는 다음과 같다: 잎과 줄기(Lu et. al., Agrobacterium-mediated transformation of carnation(Dianthus caryophyllus L.). Bio/Technology Vol.9 :864-868(1991)) , 잎(Yu- sn., Plant trasnformation and genetic analysis of CarMV CP gene for the development of virus resistant carnation. Department of horticulture the graduate school, Catholic university of Daegu :1-90(2002)) , (Song Zhang et. al., Infection by Agrobacterium tumefaciens increased the resistance of leaf explants to selective agents in carnation(Dianthus caryophyllus L. and D. chinensis). Plant science 168 :137-144(2005)) , 줄기(Alexander Vainstein et. al., Transformation of carnation by microprojectile bombardment. Scientia Horticulturae 64 :177-185(1995)) , 미숙화뢰( Ahn-bj., Rapid multiplication carnation through somatic embryogenesis from flower bud-induced callus. J. Kor. Soc. Hort. Sci 38(6) :771-775(1998)) , O. Karami et. al., Effect of sucrose concentrations on somatic embryogenesis in carnation(Dianthus caryophyllus L.). Scientia Horticulturae xxx :xxx-xxx(2006)) 등을 시료로 재분화된 식물체를 얻었다는 보고가 있다.
그러나, 현재까지 개발된 방법에 따르는 경우에는, 재분화율이 낮고, 한 시료에서 하나의 재분화 식물체가 생산되는 비효율성등의 문제점이 있다.
따라서 카네이션 식물체의 재분화 및 형질전환에 관하여는, 아직까지 많은 개선점이 잔존해 있다. 본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문이 참조되고 그 인용은 괄호내에 표시된다. 인용된 논문의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 요지가 보다 명확하게 설명된다.
따라서 , 본 발명의 목적은 아그로박테리움 튜머페이션스( Agrobacterium tumefaciens )에 의한 카네이션 형질전환체의 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 제조방법에 의해 제조된 카네이션 형질전환체를 제공하는데 있다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 (i) 카네이션 세포의 지놈 DNA에 삽입될 수 있고 다음과 같은 서열을 갖는 벡터가 내재되어 있는 아그로박테리움 튜머페이션스( Agrobacterium tumefaciens )로 카네이션의 경정을 감염시키는 단계: (a)카네이션 세포 내에서 작동하는 복제 원점; (b)카네이션 세포내에서 전사를 촉진할 수 있는 프로모터; (c)상기 프로모터에 기능적으로 연결된 외래 단백질을 코딩하는 구조 유전자 서열; (ii) 상기 감염된 카네이션 경정을 BAP(6-benzylaminopurine)이 함유된 배지에 치상하여 재분화 시켜 다신초를 형성시키는 단계; 및 (iii) 상기 재분화된 신초를 발근 배지에서 발근시켜 형질전환 카네이션을 형성시키는 단계를 포함하는 카네이션 형질전환체의 제조방법을 제공한다.
본 연구에서는 5종의 카네이션 품종을 대상으로 경정부위에서 신초를 유도하고 높 은 빈도로 다신초 재분화 개체를 얻을 수 있는 재분화 방법 및 아그로박테리움 튜머페이션스를 이용한 효율적인 카네이션 형질전환에 대한 결과를 얻었다.
이와 같은 본 발명을 보다 상세하게 설명하면 다음과 같다:
Ⅰ. 형질전환 재료의 준비
카네이션의 형질전환 재료로서 이용될 수 있는 것은 경정이다. 이 재료는 카네이션 식물의 삽수에서 얻을 수 있다.
Ⅱ. 형질전환 조직의 준비
본 발명에서 이용할 수 있는 조직은 카네이션 삽수내의 생장점이다. 생장점만이 드러나도록 잎 전체를 제거한다. 이때 생장점 부위는 무균을 유지해야 한다.
Ⅲ. 아그로박테리움 튜머페이션스에 의한 감염
카네이션 세포의 형질전환은 Ti 플라스미드가 내재되어 있는 아그로박테리움 튜머페이션스로 실시한다. 본 발명에 이용되는 벡터는 기본적으로 (a) 카네이션 세포 내에서 작동하는 복제 원점; (b) 카네이션 세포 내에서 전사를 촉진할 수 있는 프로모터; (c) 상기 프로모터에 기능적으로 연결된 외래 단백질을 코딩하는 구조 유전자 서열; 또한 바람직하게는 상기 벡터에는 선택 표지로서 항생제(예: 카베니실린, 카나마이신, 스펙티노마이신, 하이그로마이신 등)내성 유전자를 포함한다. 상기 벡터내에 이용될 수 있는 프로모터는 예컨대, 콜리플라워 모자이크 바이러스 35S 프로모터, 노팔린 합성효소(nos) 프로모터를 포함한다. 한편, 상기 외래 단백질을 인코딩하는 구조 유전자 서열은 얻고자 하는 바람직한 형질에 따라 결정된다. 예컨대, 제초제 저항성 유전자, 바이러스 저항성 유전자, 해충 저항성 유전자, 악 조건 저항성 유전자, 품질 향상을 위한 유전자, 화색 유전자 등이 있다.
상기한 벡터를 내재하고 있는 아그로박테리움에 의한 식물 세포의 감염은 당업계에 공지된 통상적인 방법을 이용할 수 있다. 예컨대, 잎이 배제되도록 채취한 경정을 아그로박테리움의 배양액에 침지시켜 공동 배양함으로써 아그로박테리움이 경정내에 감염되도록 하는 것이다. 공동배양액에는 바람직하게는 아세토시리곤이 포함되는데, 이는 아그로박테리움의 식물로의 형질전환을 돕기 위한 것이다.
Ⅳ. 재분화
상기 아그로박테리움에 의해 형질전환된 식물 조직의 재분화는 엄격하게 조절된 성분과 성분 양을 포함하는 재분화 배지에서 실시되어야 한다.
본 발명에 따르면, 재분화 배지는 MS, N6, LS등과 같은 영양 기본 배지, 에너지원 그리고 비타민을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 에너지원은 보다 바람직하게는 당류이고, 가장 바람직하게는 수크로스이다. 상기 비타민은 바람직하게는 니코틴산, 티아민 및 피리독신 등을 포함한다. 한편 본 발명의 재분화 배지는 고체 지지체로서 아가를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 재분화 배지에는 식물 생장 조절제가 포함된다. 식물 생장 조절제 중 함유되는 시토키닌은 6-벤질아미노퓨린(BAP), 키네틴, 제아틴, 이소펜틸아테노신 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니며, 가장 바람직하게는 6-벤질아미노퓨린이 이용된다.
재분화 배지에 포함되는 시토키닌의 양, 특히 BAP의 양은 1mg/L가 바람직하다. BAP의 양이 1mg/L일 때, 경정에서 유도되는 신초의 양이 많은 다신초가 원활히 유도가 되는 결과를 관찰할 수 있으며, 한 번 형질전환을 통해 처음 양의 최소 4배이상의 신초를 얻을 수 있어 본 발명의 배지의 우수성을 보여준다.
본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 형질전환된 조직을 선별할 수 있도록 항생제(예: 카베니실린, 카나마이신, 스펙티노마이신, 하이그로마이신 등)을 추가적으로 포함한다. 예컨대, 항생제로서 카나마이신을 이용하는 경우에는 그 양을 300-500mg/L로 조절하는 것이 바람직하며, 그 함량이 300mg/L 미만인 경우에는 재분화율이 크게 높게 나타나기는 하지만 최종적인 형질전환율이 확연히 떨어지는 문제점이 있고, 500mg/L을 초과하는 경우에는 재분화율이 감소되는 문제점이 있다.
재분화 배지에 경정을 치상하는 방법은 배지면에 삽입하는 방법이 가장 바람직하다. 경정은 잎 절편과는 달리 생장점 끝부분에 상처를 유기한 후 신초를 유도하기 때문에 배지면에 삽입하여 치상하게 되면 재분화 다신초를 얻을 수 있다.
Ⅴ. 발근
재분화된 조직은 본 발명의 발근 배지에서 발근시켜 형질전환 카네이션을 얻는다. 본 발명의 발근배지는 MS, N6, LS등과 같은 영양 기본배지, 에너지원 그리고 비타민을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 에너지원은 보다 바람직하게는 당류이고, 가장 바람직하게는 수크로스이다. 상기 비타민은 바람직하게는 니코틴산, 티아민 및 피리독신 등을 포함한다. 한편, 본 발명의 재분화 배지는 고체 지지체로서 아가를 추가적으로 포함할 수 있다.
Ⅵ. 형질전환체의 확인
본 발명에 의해 제조된 카네이션 형질전환체는 당업계에 공지된 방법에 의해 실시 할 수 있다. 예컨대, 형질전환 카네이션의 조직으로부터 분리한 DNA 시료를 이용하여 PCR을 실시함으로써 형질전환에 의해 카네이션의 지놈에 삽입된 외래 유전자를 용이하게 확인할 수 있다. 또한, Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001)에 개시된 서던 블롯팅 및 노던 블롯팅에 의해서도 형질전환체를 확인 할 수 있다.
본 발명의 가장 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명은 (i) 카네이션 세포의 지놈 DNA에 삽입될 수 있고 다음과 같은 서열을 갖는 벡터가 내재되어 있는 아그로박테리움 튜머페이션스( Agrobacterium tumefaciens )로 카네이션의 경정부위 전체를 감염시키는 단계: (a) 카네이션 세포 내에서 작동하는 복제 원점; (b) 카네이션 세포 내에서 전사를 촉진할 수 있는 프로모터; (c) 상기 프로모터에 기능적으로 연결 된 외래 단백질을 코딩하는 구조 유전자 서열; (ii) 상기 감염된 카네이션 경정을 BAP(6-Benzylaminopurine) 1mg/L가 함유된 배지에 삽입 방법으로 치상하여 재분화시켜 다신초를 형성시키는 단계; 및 (iii) 상기 재분화된 다신초를 발근 배지에서 발근시켜 형질전환 카네이션을 형성시키는 단계를 포함하는 카네이션 형질전환체의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 방법에 의해 제조된 카네이션 형질전환체를 제공한다.
상술한 본 발명의 카네이션 형질전환체의 제조방법은 하기의 실시예에서 확인할 수 있듯이, 형질전환 효율 및 재분화 효율이 매우 높으며, 카네이션 형질전환체 제조 의 재현성이 매우 우수하다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 식물조직의 준비
카네이션 2품종( Desio, Garnet )을 실험에 이용하였다. 7~13절로 자란 측지를 삽수로 이용하여 경정을 채취하였다.
실시예 2: 형질전환 조건의 확립
가장 적합한 형질전환 조건을 확립하기 위하여, 2품종의 카네이션을 대상으로 하여, BAP 1mg/L를 포함하는 배지를 이용하여 형질전환을 실시하였다.
우선, 카네이션 2품종의 삽수를 채취하여 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 경정을 채취하였다. 도 2에 도시된 npt Ⅱ와 DFR-antisense 유전자를 가진 pGA748 벡터(Overexpression of Acyl Carrier Protein-1 Alters Fatty Acid Composition of Leaf Tissue in Arabidopsis. Plant Physiology. Vol127:222-229)로 형질전환된 아그로박테리움 튜머페이션스( Agrobacterium tumefaciens )LBA4404를 인덕션 브로스(induction broth: 트립톤10g/L, Yeast extract 10g/L, NaCl 5g/L, 2.5mM Sodium phosphate, 3% 수크로스, 20mM MES, pH5.5 )에서 24시간 동안 배양한 다음, 이 배양액에 상기 경정을 침지시켜 1시간 동안 혼합하였다.
그런 다음, 10일 동안 21℃에서 광배양 조건으로 공동배양 배지( BAP 1mg/L가 함유 된 MS( Murashige and Skoog medium ) 배지)에서 배양 하였다. 그리고 나서, 경정을 1/2 MS, 3% 수크로스 및 겔라이트와 피타겔을 1:1로하는 배지에서 BAP 1mg/L, 카베니실린 250mg/L, 세포탁심 250mg/L 및 카나마이신 300mg/L을 추가하여 2주동안 21℃에서 광배양 조건으로 배양하였다. 이어서 3-4차례에 걸친 선발 계대배양 과정을 마치고, 선발 재분화 된 신초를 1/2 MS, 3% 수크로스 및 겔라이트와 피타겔을 1:1로하는 배지로 옮겨 21℃의 광배양 조건으로 형질전환한 개체의 발근을 유도하였다.
상기 도 5에서 확인할 수 있듯이, 선택배지의 카나마이신 농도가 300mg/L이하의 경우에는 재분화율은 높게 나타났으나, 형질전환율은 현저히 감소하는 경향을 나타냈으며, 카나마이신 농도가 300mg/L의 경우에는 재분화율이 100%에 가깝고 형질전환율도 높게 나타내었다. 따라서, 선택배지에서의 카나마이신 농도는 약 300mg/L가 적합하다는 것을 알 수 있다.
또한 상기 표에서 확인되듯이, 고체배지의 아가 구성에 따라서도 카나마이신 선발농도가 달라지고 재분화 식물체의 투명화 정도도 달라진다.
피토 아가 0.7%와 겔라이트 0.3%의 고체 배지에서는 선발중에 재분화 식물체의 투명화가 심하게 일어났지만, 피토 아가와 겔라이트를 1:1비율로 섞어 고체배지를 만들었을때는 투명화가 일어나지 않았다.
실시예 3: 형질전환체의 확인
상기 실시예 2에서의 형질전환체의 확인은 다음과 같이 실시하였다.
실시예 3-1. PCR 분석
PCR 분석을 위한 식물 지놈 DNA의 분리는 Dellaporta 방법(Plant Molecular Biology Reporter, 1:19-22(1983)에 의하여 추출하였다. PCR 분석에서 사용된 프라이머는 아그로박테리움 튜머페이션스에 있는 벡터의 DFR-antisense 유전자의 염기서열에 대응하는 것으로서, 전방향 프라이머는 5‘-TGC GAT GTC GTA AAT GGT AGC-3'이고, 역방향 프라이머는 5’-TCC AAG GAT CCC GAG AAT G-3'이다. PCR반응은 Taq 중합효소를 이용하여, 95℃에서 5분간 전변성한 후, 94℃에서 1분간 변성, 60℃에서 1분간 어닐링, 72℃에서 1분간의 중합반응을 40회 반복하였고, 추가로 72℃에서 10분간 연장반응을 하여, 반응 산물은 1.0%아가로스 겔에서 분석하였다(참조: 도 6 ). 도 6에서 M 레인은 100bp 레더, 1레인은 DFR-antisense 유전자를 포함하는 양성 표준 플라스미드의 PCR 산물, 2레인은 비형질전환·체 카네이션의 DNA를 주형으로한 PCR 산물, 3-4레인은 선발된 카네이션 형질전환체의 DNA를 주형으로 한 PCR 산물들을 로딩한 것이다. 도 6에서 볼 수 있듯이, 본 발명의 형질전환체에 대한 레인에서 DFR-antisense 유전자에 해당하는 0.5kb DNA 밴드가 관찰되어, 형질전환 되었음을 확인할 수 있다.
실시예 3-2. 표현형 분석
형질전환된 카네이션 식물체의 표현형 분석을 위해 온실에서 재배하였다. 이미 선택배지에서 형질전환된 개체들에 대한 선발이 이루어졌으며, 발근단계를 거쳐 온실에 순화하였다. DFR-sense라는 화색관련 유전자를 카네이션에 삽입하였으므로 일반 비형질전환 카네이션과는 다른 화색을 보이리라 예상하였다. 개화 후 형질전환체와 비형질전환체의 화색을 비교하였을때 도 7에서와 같이 확연한 차이를 나타내었다. 표현형 분석으로서 카네이션이 형질전환되었음을 확인할 수 있었다.
본 발명은 아그로박테리움 튜머페이션스에 의한 카네이션 형질전환체의 제조방법 및 그로부터 제조되는 카네이션 형질전환체를 제공한다. 본 발명의 카네이션 형질전환체의 제조방법은 형질전환 효율 및 재분화 효율이 매우 높으며, 카네이션 형질전환체 제조의 재현성이 매우 우수하다.

Claims (9)

  1. 다음의 단계를 포함하는 카네이션 형질전환체의 제조방법:
    (i) 오이 세포의 지놈 DNA에 삽입될 수 있고 다음과 같은 서열을 갖는 벡터가 내재되어 있는 아그로박테리움 튜머페이션스로 카네이션 경정을 감염시키는 단계: (a) 카네이션 세포 내에서 작동하는 복제 원점; (b) 카네이션 세포 내에서 작동하는 프로모터; 및 (c) 상기 프로모터에 연결되어 발현이 조절되는 외래 단백질을 코딩하는 구조 유전자 서열;
    (ii) 상기 감염된 카네이션 경정을 BAP(6-Benzylaminopurine)이 함유된 배지에 치상하여 재분화시켜 다신초를 형성시키는 단계; 및
    (iii) 상기 재분화된 다신초를 호르몬이 없는 발근 배지에서 발근시켜 형질전환 카네이션을 형성시키는 단계.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 단계(i)의 카네이션 경정은 모든 잎을 제거한 순수 생장점 부위인 것을 특징으로 하는 카네이션 형질전환체의 제조방법.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 단계 (ii)에서의 치상은 경정 전체를 배지면에 삽입하여 실시됨을 특징으로 하는 카네이션 형질전환체의 제조방법.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 단계 (ii)의 BAP의 양은 1mg/L 인 것을 특징으로 하 는 카네이션 형질전환체의 제조방법.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 단계 (ii)의 BAP의 양은 1mg/L 인 것을 특징으로 하는 카네이션 형질전환체의 제조방법.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 단계 (iii)의 발근 배지의 호르몬은 배제된 것을 특징으로 하는 카네이션 형질전환체의 제조방법.
  7. 제 1항에 있어서, 상기 단계 (iii)의 발근 배지는 피토 아가와 겔라이트를 1:1로 섞은 것을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 오이 형질전환체의 제조방법.
  8. 다음의 단계를 포함하는 카네이션 형질전환체의 제조방법:
    (i) 카네이션 세포의 지놈 DNA에 삽입될 수 있고 다음과 같은 서열을 갖는 벡터가 내재되어 있는 아그로박테리움 튜머페이션스로 카네이션의 경정부위 전체를 감염시키는 단계: (a) 카네이션 세포내에서 작동하는 복제 원점; (b) 카네이션 세포 내에서 작동하는 프로모터; 및 (c) 상기 프로모터에 연결되어 발현이 조절되는 외래 단백질을 코딩하는 구조 유전자 서열
    (ii) 상기 감염된 카네이션 자엽을 BAP(6-Benzylaminopurine) 1mg/L가 함유된 배지에 삽입 방법으로 치상하여 재분화시켜 다신초를 형성시키는 단계; 및
    (iii) 상기 재분화된 다신초를 피토 아가와 겔라이트가 1:1로 섞인 발근 배지에서 발근시켜 형질전환 카네이션을 형성시키는 단계.
  9. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 항의 방법에 의해 제조된 카네이션 형질전환체.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN104186315A (zh) * 2014-08-06 2014-12-10 云南集创园艺科技有限公司 快速高效香石竹再生体系建立方法
CN105325289A (zh) * 2014-08-11 2016-02-17 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 使用高分子吸水树脂克服香石竹茎尖培养玻璃化的方法

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