CN105325289A - 使用高分子吸水树脂克服香石竹茎尖培养玻璃化的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物再生领域，提供一种使用高分子吸水树脂克服香石竹茎尖培养玻璃化的方法，包括步骤：1)选择生长健壮的香石竹植株，切留带顶的2cm茎段；2)无菌水冲洗3-5次，备用；3)剥取香石竹茎尖0.5mm接入到培养基中，所述培养基为：铁盐加倍MS+蔗糖30g/L+琼脂6g/L+TDZ1g/L+NAA1g/L+8g/L高分子吸水性树脂，之后在20-30℃下培养。本发明经过试验确定了培养基添加物品种的选择，经过试验比较，选择了添加物的浓度。由试验结果得知，适合浓度的高分子吸水性树脂可以对香石竹红色品种茎尖脱毒后的玻璃化发生率降低至17％左右，后续未玻璃化的植株再发生玻璃化的情况也大大降低。

Description

使用高分子吸水树脂克服香石竹茎尖培养玻璃化的方法

技术领域

本发明属于植物再生领域，具体涉及一种克服茎尖培养玻璃化的组织培养方法。

背景技术

玻璃化是组织培养中另一个常见问题，是组培苗的一种生理失调症状。当植物材料不断地进行离体繁殖时，有些培养物的嫩茎、叶片往往会呈半透明状，呈水浸状，这种现象通常称为玻璃化。它会使组培苗生长缓慢或出现畸形，繁殖系数下降，不能移栽成活，形成的苗长势弱小；玻璃化植株叶片缺乏叶绿素a和叶绿素b，叶片肥厚，海绵组织中细胞间隙大。在草本和木本植物中均有发生，已报道出现玻璃苗的植物己达70多种。玻璃苗的叶片呈水晶透明或半透明，水浸状，植株矮小肿胀，颜色失绿，叶片皱缩呈纵向卷曲、脆弱易碎，叶表皮缺少角质层蜡质，没有功能性气孔，不具有栅栏组织，仅有海绵组织，体内含水量增加，干鲜重比例下降，叶绿素、蛋白质、纤维素含量降低。由于其组织畸形，吸收养料与光合器官功能不全，分化能力大大降低，因而很难继续用作继代培养和扩大繁殖的材料；加上生根困难，很难移栽成活。目前玻璃化已成为茎尖脱毒、名贵花木工厂化育苗和材料种质保存等方面的严重障碍，造成人、财、物的极大浪费。

不同植物种类在培养过程中玻璃化发生与否及发生的轻重有很大的差异，有些植物易玻璃化且较严重，而有些则发生较轻或不易发生。如康乃馨组培过程中较其它鲜切花易玻璃化，其品种间也有较大差别。

目前很多科学工作者在研究控制植物玻璃化现象中做了大量试验，但由于目前对“玻璃化”的发病机制尚未完全阐明，在香石竹茎尖培养上一般是采用去除细胞分裂素、增加琼脂浓度、降低培养基中大量元素、降低温度、增加光照等手段来克服植物的玻璃化现象。目前这些克服香石竹玻璃化的方法可以在一定程度上降低香石竹组培苗的玻璃化发生率。但对香石竹红色品种作用不大，对其他色系品种作用也不明显，而对香石竹茎尖脱毒苗的玻璃化现象无作用。

发明内容

针对本领域存在的不足之处，本发明的目的是提出一种使用高分子吸水树脂克服香石竹茎尖培养玻璃化的方法。

实现本发明目的的技术方案为：

一种使用高分子吸水树脂克服香石竹茎尖培养玻璃化的方法，包括步骤：

1)选择生长健壮，品质优良，无病虫害的香石竹红色品种，选取基部健壮侧芽，剥除展开的叶片，留未展开的2-3对叶，切留带顶的2cm茎段，置于干净的烧杯中备用；

2)在超净工作台上操作灭菌后，用无菌水冲洗3-5次，备用；

3)在解剖镜下剥取香石竹茎尖0.3mm-0.5mm接入到培养基中，所述培养基为：铁盐加倍MS+蔗糖30g/L+琼脂6g/L+TDZ1g/L+NAA1g/L+8-16g/L高分子吸水性树脂，之后在20-28℃下培养；

其中，TDZ为苯基噻二唑基脲，NAA为α-萘乙酸。

其中，所述步骤2)中灭菌的方法为在0.1％升汞溶液中灭菌6-9min。

优选地，所述步骤3)的培养基为：铁盐加倍MS+蔗糖30g/L+琼脂6g/L+TDZ1g/L+NAA1g/L+8g/L高分子吸水性树脂。

其中，所述步骤3)培养的条件为26℃±0.5℃，光强度1000lx-4000lx下培养。

优选地，所述步骤3)培养的时间为18-25天。

经过步骤3)的培养，香石竹茎尖可以继续放在步骤3)的培养基中培养，或为了降低成本，可以转移到不加高分子吸水树脂的培养基中继续培养。具体为：步骤3)培养之后，将香石竹茎尖转移至组成为铁盐加倍MS+蔗糖30g/L+琼脂6g/L+TDZ1g/L+NAA1g/L的培养基中继续培养。

其中，所述高分子吸水性树脂为淀粉接枝丙烯酸盐、接枝丙烯酰胺、交联羧甲基纤维素、丙烯酰胺-丙烯酸钾交聚物、交联羧甲基纤维素接枝丙烯酰胺、交联型羟乙基纤维素接枝丙烯酰胺聚合物中的一种。

本发明针对茎尖脱毒苗玻璃化问题提出解决方案。茎尖脱毒苗不同于组培苗，组培苗是根据植物细胞具有全能性的理论，利用外殖体，在无菌和适宜的人工条件下，培育的完整植株。

一般认为茎尖分生组织中(包括原套、原体等)，维管系统尚未发育完善，病毒仅能通过刚形成的少量的胞间连丝进行细胞间转移，且多数病毒还需借助运动蛋白(MP)对胞间连丝进行修饰方能容病毒核酸通过。因此茎尖分生区的病毒传播速度很慢，组培后获得无毒苗的几率也较大，通过此方法获得的组培苗称之为茎尖脱毒苗。

茎尖脱毒苗的原材料要求在0.3mm-0.5mm，越小脱毒效果越好，玻璃化情况也会越严重，本申请做实验时取了最大的0.5mm，这个大小肯定能脱去大部分病毒。

本发明的有益效果在于：

本发明提出的方法，在培养基中添加高分子吸水性树脂，其为一种亲水物质，加入到培养基中不仅可以起到支撑作用，还可以改变培养基内的水分微环境，从而可以降低瓶内湿度；

本发明经过试验确定了培养基添加物品种的选择；另一方面经过试验比较，选择了添加物的浓度。由试验结果得知，适合浓度的高分子吸水性树脂(8g/L)可以对香石竹红色品种茎尖脱毒后的玻璃化发生率降低至17％左右，后续未玻璃化的植株再发生玻璃化的情况也大大降低。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。

实施例中，香石竹红色品种‘马斯特’购自宁夏银川天地缘锦绣园林花卉有限公司塔桥香石竹日光温室基地。‘马斯特’是目前市场主栽品种，同时也是组培苗玻璃化发生率最高的品种。

高分子吸水树脂为亲水智多能交聚物BJ2101，购自北京汉力淼新技术有限公司。其化学名称为CLP(Cross-LinkedCo-polymeracrylamideandAcrylatePotassium)，具体成分为丙烯酰胺-丙烯酸钾交聚物。

实施例1：

1)选择生长健壮，品质优良，无病虫害的“马斯特”香石竹植株，选取基部健壮侧芽，剥除展开的叶片，留未展开的2-3对叶，切留带顶的2cm茎段，置于干净的烧杯中备用；

2)在超净工作台上操作灭菌，倒入0.1％升汞溶液,轻轻摇动,使植物材料与灭菌液体接触均匀，灭菌8min后，用无菌水冲洗3-5次，备用；

3)在解剖镜下剥取香石竹茎尖0.5mm接入到100ml容积的瓶中，培养基40ml/瓶，所述培养基为：铁盐加倍MS+蔗糖30g/L+琼脂6g/L+TDZ1g/L+NAA1g/L+0-24g/L高分子吸水性树脂，每瓶接4株之后在26℃±0.5℃,光强度1000lx-4000lx下培养，从2013年8月10日培养至8月30日，统计结果；

具体地，培养基中高分子吸水性树脂量分别为0、8g/L、16g/L、24g/L的梯度共做4个处理，标记为处理号1(对照)、2、3、4。

将未发生玻璃化的茎尖脱毒苗转移到未加高分子吸水性树脂的MS(铁盐加倍)+蔗糖30g/L+琼脂6g/L+6-BA0.3g/L+NAA0.3g/L培养基中，培养10天，于9月9日观察苗后续发生玻璃化的情况，统计结果表明从高分子吸水性树脂中转出的茎尖组培苗并未出现玻璃化的现象。

表1不同浓度CLP对香石竹玻璃化影响

表2不同浓度CLP对香石竹成苗生长影响

试验结果显示，对照组全部玻璃化，而加入不同浓度CLP的处理组较没加入的玻璃化发生率显著降低，苗态正常率由33.3％到83.3％，其中处理2和处理3，苗态正常率最高，达83.33％，但是处理3中植株出现死亡现象，根据统计结果得到，随着CLP浓度的增加，植株死亡率与CLP增加量成正相关，死亡植株苗态小，还未展叶，成黄褐色，随着CLP浓度的增加，植株受伤害比率越大，其中处理4中最高可达58.3％。CLP一般在苗很小时产生毒害，成苗后不会受到影响，外观形态正常。结果表明当CLP浓度为8g/L，茎尖大小为0.5mm左右时，可以有效地控制玻璃化现象。

当CLP浓度为0、8g/L、16g/L、24g/L时，香石竹茎尖均是由愈伤组织阶段发育成植株，愈伤组织形成的大小与CLP浓度增加量成负相关与茎尖大小成正相关，处理2、3中愈伤组织长到一定程度便长出正常植株，其中处理2中，均出现分株，出苗率为208％，处理4中未出现分株现象；不同CLP浓度下，植株生长状况不同，随着CLP浓度增加，香石竹茎尖均未出现玻璃化现象，处理3、4中，部分植株出现死亡，表现为植株成黄褐色，成活的植株生长缓慢。结果表明：低浓度的CLP可以增加出苗率，当CLP浓度为8g/L时，效果最好，同时在该浓度下，不仅可以有效的控制香石竹的玻璃化现象还可以提高繁殖系数，植株受毒害作用最小。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及实例，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对本方法的判别模型作出一定的补充和优化。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (7)

1.一种使用高分子吸水树脂克服香石竹茎尖培养玻璃化的方法，包括步骤：

1)选择生长健壮，品质优良，无病虫害的香石竹植株，选取基部健壮侧芽，剥除展开的叶片，留未展开的2-3对叶，切留带顶的2cm茎段；

2)在超净工作台上灭菌后，用无菌水冲洗3-5次，备用；

3)在解剖镜下剥取香石竹茎尖0.3mm-0.5mm接入到培养基中，所述培养基为：铁盐加倍MS+蔗糖30g/L+琼脂6g/L+TDZ1g/L+NAA1g/L+8-16g/L高分子吸水性树脂，之后在20-28℃下培养。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中灭菌的方法为在0.1％升汞溶液中灭菌6-9min。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3)的培养基为：铁盐加倍MS+蔗糖30g/L+琼脂6g/L+TDZ1g/L+NAA1g/L+8g/L高分子吸水性树脂。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3)培养的条件为26℃±0.5℃，光强度1000lx-4000lx下培养。

5.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于，所述步骤3)培养的时间为18-25天。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤3)培养之后，将香石竹茎尖转移至组成为：铁盐加倍MS+蔗糖30g/L+琼脂6g/L+TDZ1g/L+NAA1g/L的培养基中继续培养。

7.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于，所述高分子吸水性树脂为淀粉接枝丙烯酸盐、接枝丙烯酰胺、交联羧甲基纤维素、丙烯酰胺-丙烯酸钾交聚物、交联羧甲基纤维素接枝丙烯酰胺、交联型羟乙基纤维素接枝丙烯酰胺聚合物中的一种。