WO2002066659A1 - Verfahren zur erhöhung des ölgehalts in transgenen pflanzen und pflanzensamen - Google Patents

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WO2002066659A1
WO2002066659A1 PCT/EP2002/001286 EP0201286W WO02066659A1 WO 2002066659 A1 WO2002066659 A1 WO 2002066659A1 EP 0201286 W EP0201286 W EP 0201286W WO 02066659 A1 WO02066659 A1 WO 02066659A1
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Michael Leps
Udo Conrad
Ivo Feussner
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Ipk - Institut Für Pflanzengenetik Und Kulturpflanzenforschung
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    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)

Definitions

  • the invention relates to a method for increasing the oil content in transgenic plants and plant seeds by influencing the abscisic acid content.
  • the invention relates to a method for increasing the oil content by influencing the abscisic acid content by seed-specific expression of an antibody directed against abscisic acid.
  • the phytohormone abscisic acid (ABA, abscisic acid, (S) -5- (l-hydroxy-2,6,6-trimethyl-4-oxo-2-cyclohexenyl) -3-methyl-cis / trans-2,4-pentadienoic acid ) is a commonly used sesquiterpene with the Jonone scaffold, which plays an important role in regulating seed maturation, among others (review by Giraudat et al. (1994) Plant Mol. Biol. 26: 1557-1577).
  • ABA is responsible for the development of semen dominance (Koomneef (1986) Genetic aspects of abscisic acid. Plant genetic research, a genetic approach to plant biochemistry.
  • Blonstein AD King PJ (eds.) Wien, Springer-Verlag, 35 - 54
  • controls the reserve globulin synthesis (Finkelstein and Sommerville (1990) Plant Physiol. 94, 1172 - 1179) and the dehydration tolerance (Kermode and Bewley (1987) Regulatory processes involved in the switch from seed development to germination: Possible roles for dessication and ABA. Drought resistance in plants.Physiological and genetic aspects.Monti L., Porceddu E. (eds.) Brussels, EEC, 59-76).
  • fatty acids synthesized and accumulated in plants or in plant seeds can be used for a large number of applications.
  • Fatty acids which are found in all vegetable and animal fats and especially in vegetable oils and fish oils as well as in microorganisms, can be used in many ways. For example, a lack of essential fatty acids, i.e. fatty acids that cannot be synthesized in the organism and therefore have to be supplied with food, can lead to skin changes and growth disorders, which is why fatty acids are used in eczema, psoriasis, burns and the like, as well as in cosmetics be used. Fatty acids and oils are also used in washing and cleaning agents, as detergents, as color additives, lubricants and lubricants, processing aids, emulsification aids, hydraulic oils and xmd as carrier oils in pharmaceutical and cosmetic products.
  • Natural fats and oils of animal (e.g. tallow) and vegetable (e.g. coconut, palm kernel or rapeseed) oil are used as renewable raw materials in the chemical-technical sector.
  • the areas of application of vegetable oils have been significantly expanded in the past twenty years. With increasing environmental awareness, for example, environmentally friendly lubricants and hydraulic oils were developed.
  • Other applications include fatty acids and fats as food or food additives, for example in parenteral nutrition, in baking aids, in baby, senior and sports food, in chocolate masses, cocoa powder and as shortening, for the production of soaps, ointments, candles, paints and paints Textile paints, varnishes, heating and lighting equipment.
  • Plant breeding goals are in particular to increase the content of fatty acids in seed oils.
  • fatty acids which can be used industrially and / or are valuable in terms of food technology, for example as raw materials for plasticizers, lubricants, pesticides, surfactants, cosmetics, etc.
  • One way to provide fatty acids is to extract the fatty acids from plants or microorganisms that have particularly high levels of the desired fatty acids.
  • the increase in the content of, for example, medium-chain fatty acids in plants in the traditional way, i.e. by growing plants which produce these fatty acids to an increased extent, has hitherto been achieved only to a limited extent.
  • One is therefore particularly interested in modern, bio-technological approaches in plant breeding ,
  • a reliable method is to be made available which enables both the production and the identification of desired transgenic plants or transgenic plant seeds with an increased oil content.
  • the determination of the total content of fatty acids which is also referred to as oil content in the context of this patent application, showed no differences between the control plants (which expressed a recombinant antibody against oxazolone at a comparable level in a seed-specific manner under the control of the USP promoter, located in the endoplasmic reticulum) and the wild type plants, although in the area of the hypocotyl the oil bodies apparently dissolved and a decrease in the oil content had to be expected.
  • transgenic lines have now also been investigated, which show relatively little of the state of the art by Phillips et al. (1997, vide supra) described anti-ABA antibody accumulated, namely ⁇ 1% TSP (total soluble protein) in the seeds of transgenic plants. These lines did not show any viviparous symptoms, but instead showed a significantly increased oil content, with the oil content increasing up to 80%.
  • transgenic plant seeds in which relatively little anti-ABA antibody accumulates show a considerable increase in the oil content compared to wild-type seeds.
  • the invention thus relates to a method for increasing the oil content in transgenic plants and plant seeds, the increase in the oil content being brought about by influencing the effect of abscisic acid and in particular the content of abscisic acid in transgenic plants or plant seeds.
  • the influencing of the content of effective abscisic acid in transgenic plants and plant seeds is mediated by expression of a recombinant anti-ABA antibody.
  • Effective abscisic acid here means abscisic acid which is not bound by the anti-ABA antibody and which is not held in the" wrong "compartment where it cannot have the desired effect.
  • the antibody directed against ABA is particularly preferably expressed in a seed-specific manner, i.e. the nucleic acid coding for the anti-ABA antibody is expressed in the seed tissue of transgenic plants under the control of a seed-specific promoter.
  • the seed-specific promoter is particularly preferably the USP promoter, under the control of which the anti-ABA antibody is expressed. This promoter ensures a relatively early and high expression in seed development, which is very advantageous in the context of the present invention.
  • the USP promoter was first developed by Bäumlein et al. (1991, Mol. Gen. Genet. 225: 459-467) and its use as a seed-specific promoter has been described frequently in scientific publications and in patent documents in recent years.
  • the USP promoter and the anti-ABA antibody is hereby expressly referred to the disclosure in the Phillips et al. article mentioned above. (1997, vide supra) because this article describes in detail the synthesis and expression of an antibody suitable in the context of the present invention in transgenic plant seeds and provides the person skilled in the art with a way of putting the invention described here into practice.
  • the explicit reference to the article by Phillips et al. (1997, vide supra) is used to avoid repetitions.
  • Detection of transgenic plant lines that match the desired expression or Having accumulation levels of anti-ABA antibodies in the semen can be carried out by the average person skilled in the art using simple and fast routine methods.
  • a Western blot to quantify the accumulation of the anti-ABA antibody in the plant seed.
  • other detection methods are known to the person skilled in the art in order to be able to determine the antibody accumulation in the seed at a specific point in time.
  • the transgenic plant seeds preferably show a relatively low accumulation of anti-ABA antibodies in the seed, with a relatively low accumulation within the scope of this invention an accumulation of the
  • Antibody of preferably ⁇ 1.0% TSP in the seed and particularly preferably ⁇ 0.7% TSP in the seed should be at least 0.01% TSP.
  • TSP stands for "total soluble protein", ie total soluble protein (see, for example, Conrad and Fiedler (1998) Plant Mol. Biol. 38: 101-109 and the literature mentioned therein).
  • the influencing of the abscisic acid content is brought about by direct modulation of the ABA biosynthesis, here also a seed-specific modulation is preferred.
  • ABA-deficient mutants are already known and relate primarily to plant genes for aldehyde oxidase, which catalyzes the oxidation of abscisinaldehyde to ABA and whose inactivation results in a reduced AB A content (see, for example, Seo et al. (2000) Proc. Natl Acad Sci. USA 97: 12908-12913).
  • aldehyde oxidase In addition to aldehyde oxidase, other enzymes can be inactivated or inhibited in their activity by mutation, which are involved in the ABA synthesis and whose influence results in a reduction in the ABA content in plant cells.
  • zeaxanthin epoxidase Another gene or gene product which can be used in the context of the invention and which is involved in ABA biosynthesis is zeaxanthin epoxidase (Audran et al. (1999) Plant Mol. Biol. 39: 1267-1274; Audran et al. ( 1998) Plant Physiol. 118: 1021-1028; Marin et al. (1996) EMBO J. 15: 2331-2342).
  • the modulation of the ABA biosynthesis is not effected by mutating the genes involved in the biosynthesis, but by means of cosuppression or antisense approaches, in which suitable sense or antisense constructs are expressed in transgenic plants and preferably in the seed tissue become.
  • cosuppression or antisense approaches in which suitable sense or antisense constructs are expressed in transgenic plants and preferably in the seed tissue become.
  • RNA interference technique for the suppression of genes or enzyme activities which play a role in ABA biosynthesis, is also evident here.
  • the plant's own enzyme aldehyde oxidase in particular aldehyde oxidase 3, is suitable for this approach.
  • seed-specific suppression is preferred, e.g. by expression of suppression constructs under the control of a seed-specific promoter, e.g. the USP promoter.
  • the modulation of the AB A effect can be accomplished by inhibiting enzymes that are involved in the ABA biosynthesis using specific antibodies.
  • the antibody would not be directed against ABA, but e.g. against the above
  • the ABA biosynthesis is inhibited by the application of an inhibitor and the desired increase in the oil content causes.
  • a suitable inhibitor is, for example, fluridone, which has already proven itself as an ABA biosynthesis inhibitor in embryos of alfalfa and mustard (Xu et al. (1995) J. Exp. Botany 46: 687-694; Fischer et al. (1983) In. Krueger and La Bege (eds.) II: Int. Symp. On pre-harvested sprouting in cereals, Boulder, Col. Westview Press, pp. 188-196).
  • the modulation of the ABA effect limited to the seeds is preferred in contrast to the systemic influence on the ABA content in the entire plant.
  • a major reason for this is that the modulation of ABA effects in all cells would change the plant physiologically so that practically only growth at 95% humidity would be possible.
  • nucleic acid constructs according to the invention are possible for the person skilled in the art using standard methods, as described, for example, by Sambrook et al. (1989) Molecular cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Coldspring Harbor, Laboratory Press, Coldspring Harbor, New York. The same applies to the introduction of mutations, the production of sense and antisense constructs, the production of antibody constructs, etc.
  • seed-specific promoter regions are also known to the person skilled in the art; in addition to the USP promoter already mentioned, the LeB4 promoter (Nagj I. (1990) study on expression and regulation of seed-specific genes by Viciafaba, thesis, University of Halle) should be mentioned here, for example. and the DC3 promoter (Steffens et al. (1990) Dev. Genet. 11:65 - 76).
  • the Napin promoter (Eilerstrom et al. (1996) Plant Mol. Biol. 32: 1019-1027) and the FatB4 promoter are also suitable.
  • These seed-specific promoters can be used for both anti-sense and sense constructs to achieve changes in the abscisic acid biosynthetic pathway with the aim of reducing the abscisic acid content in the seeds.
  • cloning vectors which contain a replication signal for E. coli and a marker gene for the selection of transformed bacterial cells.
  • examples of such vectors are pBR322, pUC series, M13mp series, pACYC184 etc.
  • the desired sequence can be introduced into the vector at a suitable restriction site.
  • the plasmid obtained is then used for the transformation of E. coli cells.
  • Transformed E. coli cells are grown in a suitable medium and then harvested and lysed, and the plasmid is recovered. Restriction analyzes, gel electrophoresis and other biochemical-molecular biological methods are generally used as the analysis method for characterizing the plasmid DNA obtained. After each manipulation, the plasmid DNA can be cleaved and DNA fragments obtained can be linked to other DNA sequences.
  • a large number of techniques are available for introducing DNA into a plant host cell, and the person skilled in the art can determine the appropriate method in each case without difficulty. These techniques include transformation plant cells with T-DNA using Agrobacterium tumefaciens or Agrobacterium rhizogenes as the transformation medium, the fusion of protoplasts, injection, electroporation, the direct gene transfer of isolated DNA into protoplasts, the introduction of DNA using the biolistic method and other possibilities that have been around since are well established for several years and belong to the usual repertoire of the specialist in plant molecular biology or plant biotechnology.
  • plasmids When injecting and electroporation of DNA into plant cells, there are no special requirements per se for the plasmids used. The same applies to direct gene transfer. Simple plasmids, e.g. pUC derivatives can be used. However, if whole cells are to be regenerated from such transformed cells, the presence of a selectable marker gene is recommended.
  • the usual selection markers are known to the person skilled in the art and it is not a problem for him to select a suitable marker.
  • the Ti or Ri plasmid is used for the transformation of the plant cell, at least the right boundary, but often the right and left boundary of the T-DNA contained in the Ti or Ri plasmid, must be connected as a flank region to the genes to be introduced become.
  • Agrobacteria are used for the transformation, the DNA to be introduced must be cloned into special plasmids, either in an intermediate or in a binary vector.
  • the intermediate vectors can be integrated into the Ti or Ri plasmid of the agrobacteria on the basis of sequences which are homologous to sequences in the T-DNA by homologous recombination.
  • Intermediate vectors cannot replicate in agrobacteria. Using a helper plasmid, the intermediate vector can be transferred to Agrobacterium tumefaciens (conjugation).
  • Binary vectors can replicate in both E. coli and Agrobacteria. They contain a selection marker gene and a linker or polylinker, which are framed by the right and left T-DNA border region. They can be transformed directly into the agrobacteria.
  • the agrobacterium serving as the host cell is said to contain a plasmid which carries a vir region. The vir region is necessary for the transfer of the T-DNA into the plant cell. Additional T-DNA may be present.
  • plant explants can expediently be cultivated with Agrobacterium tumefaciens or Agrobacterium rhizogenes. Whole plants can then be regenerated from the infected plant material (for example leaf pieces, stem segments, roots, but also protoplasts or suspension-cultivated plant cells) in a suitable medium, which may contain antibiotics or biocides for the selection of transformed cells.
  • Agrobacterium tumefaciens or Agrobacterium rhizogenes.
  • Whole plants can then be regenerated from the infected plant material (for example leaf pieces, stem segments, roots, but also protoplasts or suspension-cultivated plant cells) in a suitable medium, which may contain antibiotics or biocides for the selection of transformed cells.
  • the introduced DNA is integrated in the genome of the plant cell, it is generally stable there and is also retained in the progeny of the originally transformed cell. It normally contains a selection marker which gives the transformed plant cells resistance to a biocide or an antibiotic such as kanamycin, G 418, bleomycin, hygromycin, methotrexate, glyphosate, streptomycin, sulfonylurea, gentamycin or phosphinotricin and others.
  • the individually selected marker should therefore allow the selection of transformed cells from cells that lack the inserted DNA.
  • Alternative markers are also suitable for this, such as nutritive markers and screening markers (such as GFP, green fluorescent protein).
  • selection markers can also be dispensed with entirely, but this is accompanied by a fairly high need for screening. If marker-free transgenic plants are desired, please Those skilled in the art also have strategies available which permit subsequent removal of the marker gene, for example cotransformation, sequence-specific recombinases.
  • the regeneration of the transgenic plants from transgenic plant cells is carried out according to customary regeneration methods using known nutrient media.
  • the plants obtained in this way can then be examined for the presence of the nucleic acid introduced or of the protein encoded by the nucleic acid using customary methods, including molecular biological methods, such as PCR, blot analyzes.
  • the transgenic plant or the transgenic plant cells can be any monocot or dicot plant or plant cell for which an increase in the oil content in the seed tissue is desired. They are preferably useful plants or cells of useful plants. It is particularly preferred to use oilseeds, in particular plants whose seeds are rich in vegetable oil and which are suitable for the extraction of vegetable oil, and most preferably linseed, rapeseed, turnip, sunflower and soybean.
  • the invention also relates to the oil obtained from the plants, preferably the plant seeds and fruits.
  • the oil is obtained from the transgenic plants according to the invention by conventional methods, for example by pressing.
  • the invention relates to the use of antibodies against abscisic acid or against enzymes involved in abscisic acid biosynthesis are directed to increasing the oil and fatty acid content in transgenic plant seeds.
  • Helium was used as the carrier gas (30 cm xs "1 ).
  • the samples were measured with a split ratio of 60: 1 and with an injector temperature of 220 ° C.
  • the temperature gradient was 150 ° C for 1 min., 150 ° C - 200 ° C at 15 ° C / min., 200 ° C - 250 ° C at 2 ° C / min. And 250 ° C for 10 min. All fatty acids were identified by co-injection with authentic standards and the oil content by adding the amounts of the individual fatty acids certainly.
  • the present invention is based on that of Phillips et al. (1997, vide supra) described transgenic plants which show viviparous appearances in the developing seeds.
  • Phillips et al. (1997, vide supra) described transgenic plants which show viviparous appearances in the developing seeds.
  • only highly expressive plants which contain neither protein bodies nor oil bodies in the cotelydones were investigated in the prior art.
  • Recent electron microscopic examinations of embryos using sections from different areas of the embryo showed that although the "protein bodies” were missing everywhere, the oil bodies were no longer present only in the central area of the embryo, namely in the hypocotyl. From this observation, it was presumed that the oil body formation and the "protein body” formation during seed development both did
  • Abscisic acid can be regulated, but are not strictly linked.
  • a series of 60 independent transgenic plants (TGO plants, ie TG1 seeds, designation: BU1 to BU60) was therefore examined and a high variability in the oil content of 400-800 ⁇ g / mg ( ⁇ g fatty acids / mg seed tissue) was found here.
  • Non-transgenic plants had a content of 400 ⁇ g mg. Since TGI seeds are not genetically uniform, the seeds of TG2 plants, ie TG3 seeds of different primary lines, were examined. All seeds included in this experiment were grown and harvested in parallel in the greenhouse at the same time, including both high-expression lines and lower antibody-accumulating lines in the experiment.
  • SNN stands for the wild type Nicotiana tabacum cv.
  • Samsun NN TSP stands for totally soluble protein scFv stands for single-chain variable fragment
  • a sense or antisense construct in which the nucleic acid coding for ABA aldehyde oxidase, preferably for ABA aldehyde oxidase 3 (see Seo et al. (2000), vide supra) acid sequence in sense or antisense orientation under the control of a seed-specific promoter, preferably under the control of the USP promoter.
  • AAO ABA aldehyde oxidase gene, preferably ABA aldehyde oxidase 3
  • transgenic plants with an increased ABA oil content can be selected.
  • Figure 1 shows the oil content of transgenic tobacco seeds of various transgenic lines.

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erhöhung des Ölgehalts in transgenen Pflanzen und Pflanzensamen durch Beeinflussung des Abscisinsäuregehalts. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Erhöhung des Ölgehalts durch Beeinflussung des Abscisinsäuregehalts durch samenspezifische Expression eines gegen Abscisinsäure gerichteten Antikörpers.

Description

Verfahren zur Erhöhung des Olgehalts in transgenen Pflanzen und Pflanzensamen
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erhöhung des Olgehalts in transgenen Pflanzen und Pflanzensamen durch Beeinflussung des Abscisinsauregehalts.
Insbesondere betrifft die-Erfindung ein Verfahren zur Erhöhung des Olgehalts durch Beeinflussung des Abscisinsauregehalts durch samenspezifische Expression eines gegen Abscisinsäure gerichteten Antikörpers.
Das Phytohormon Abscisinsäure (ABA, abscisic acid, (S)-5-(l-Hydroxy-2,6,6- trimethyl-4-oxo-2-cyclohexenyl)-3-methyl-cis/trans-2,4-pentadiensäure) ist ein allgemein verbreitetes Sesquiterpen mit dem Gerüst der Jonone, das u.a. bei der Regulation der Samenreifung eine wichtige Rolle spielt (Übersicht bei Giraudat et al. (1994) Plant Mol. Biol. 26: 1557 - 1577). ABA ist verantwortlich für die Ausprägung der Samendormanz (Koomneef (1986) Genetic aspects of abscisic acid. Plant genetic research, a genetic approach to plant biochemistry. Blonstein AD, King PJ (eds.) Wien, Springer- Verlag, 35 - 54), kontrolliert die Reserveglobulinsynthese (Finkelstein and Sommerville (1990) Plant Physiol. 94, 1172 - 1179) und die Austrocknungstoleranz (Kermode and Bewley (1987) Regulatory processes involved in the switch from seed development to germination: Possible roles for dessication and ABA. Drought resistance in plants. Physiological and genetic aspects. Monti L., Porceddu E. (eds.) Brüssel, EEC, 59 - 76). Im Stand der Technik wurden zum Studium dieser Phänomene bereits neben Mutanten auch transgene Pflanzen eingesetzt, die einen rekombinanten Antikörper gegen ABA im endoplasmatischen Retikulum sich entwickelnder Embryonen zu hohen Konzentrationen akkumulierten. Bei hoher Konzentration des Antikörpers im Embryo zeigten diese Samen vivipare Erscheinungen, die Reserveglobuline waren im Embryo nicht mehr nachweisbar und die Ölkörper kaum vorhanden (Phillips et al. (1997) EMBO J. 16: 4489 - 4496). Die Expression ABA-spezifischer Antikörper im Samen wurde auch beschrieben von A. Marion-Poll in Trends in Plant Science (1997) 2: 447 - 448. Ein Zusammenhang zwischen Abscisinsäure und dem Ölgehalt in Pflanzensamen wurde im Stand der Technik bisher nicht erwähnt. Es wurde jetzt überraschenderweise gefunden, daß der Ölgehalt in Pflanzensamen durch Beeinflussung des Abscisinsauregehalts erhöht werden kann. Die Erhöhung des Olgehalts in Pflanzen und insbesondere in Pflanzensamen ist für die klassische wie für die moderne Pflanzenzüchtung und insbesondere die pflanzliche Biotechnologie von großem Interesse.
Dabei ist die Erhöhung des Olgehalts zum einen aus ernährungstechnischer Sicht vorteilhaft, zum anderen können in Pflanzen bzw. in Pflanzensamen synthetisierte und akkumulierte Fettsäuren für eine Vielzahl von Anwendungen genutzt werden.
Fettsäuren, die in sämtlichen pflanzlichen und tierischen Fetten und vor allem in pflanzlichen Ölen und Fischölen sowie in Mikroorganismen vorkommen, sind vielseitig einsetzbar. Beispielsweise kann ein Mangel an essentiellen Fettsäuren, also Fettsäuren, die im Organismus nicht synthetisiert werden können und daher mit der Nahrung zugeführt werden müssen, zu Hautveränderungen und Wachstumsstörungen führen, weshalb Fettsäuren u.a. bei Ekzemen, Psoriasis, Verbrennungen und dergleichen, sowie auch in der Kosmetik eingesetzt werden. Weiter finden Fettsäuren und Öle in Wasch- und Reinigungsmitteln, als Detergentien, als Farbzusätze, Schmier- und Gleitstoffe, Verarbeitungshilfen, Emulgationshilfen, Hydrauliköle xmd als Trägeröle in pharmazeutischen und kosmetischen Erzeugnissen Anwendung. Als nachwachsende Rohstoffe im chemisch-technischen Sektor werden natürliche Fette und Öle tierischen (beispielsweise Talg) und pflanzlichen (beispielsweise Kokosnuß- , Palmkern- oder Rapsöl) Ursprungs eingesetzt. Die Einsatzbereiche pflanzlicher Öle wurden in den letzten zwanzig Jahren deutlich erweitert. Mit steigendem Umwelt- bewußtsein entwickelte man beispielsweise umweltverträgliche Schmierstoffe und Hydrauliköle. Weitere Anwendungen finden Fettsäuren und Fette als Nahrungsmittel bzw. Nahrungsmittelzusatz, beispielsweise in der parenteralen Ernährung, bei Backhilfen, in der Baby-, Senioren- und Sportlerkost, in Schokoladenmassen, Kakaopulver und als Backfette, zur Herstellung von Seifen, Salben, Kerzen, Malerfarben und Textilfarben, Firnissen, Heiz- und Beleuchtungsmitteln. Pflanzenzüchterische Ziele sind insbesondere die Erhöhung des Gehalts von Fettsäuren in Samenölen. So besteht in Bezug auf Industrieraps und alternative Produktionsbereiche für die Landwirtschaft ein Zuchtziel in der Gewinnung von Rapsöl mit Fettsäuren mittlerer Kettenlänge, da diese besonders in der Tensidherstellung begehrt sind. Neben dem Gedanken, pflanzliche Öle als Industrierohstoffe zu verwenden, besteht die Möglichkeit, sie als Biotreibstoff einzusetzen.
Es besteht daher allgemein ein Bedarf an der Bereitstellung von Fettsäuren, die beispielsweise als Grundstoffe für Weichmacher, Schmierstoffe, Pestizide, Tenside, Kosmetika usw. industriell einsetzbar und/oder nahrungsmitteltechnologisch wertvoll sind. Eine Möglichkeit zur Bereitstellung von Fettsäuren besteht in der Extraktion der Fettsäuren aus Pflanzen oder Mikroorganismen, die besonders hohe Gehalte an den erwünschten Fettsäuren aufweisen. Die Erhöhung des Gehalts an beispielsweise mittelkettigen Fettsäuren in Pflanzen auf klassischem Wege, also durch Züchtung von Pflanzen, die in erhöhtem Maße diese Fettsäuren produzieren, konnte bisher nur bedingt erreicht werden., Man ist daher besonders an modernen, bio technologischen Ansätzen in der Pflanzenzüchtung interessiert.
Es ist somit eine Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur Erhöhung des Öl- und Fettsäuregehalts in transgenen Pflanzen und insbesondere in transgenen Pflanzensamen bereitzustellen. Insbesondere soll ein zuverlässiges Verfahren zur Verfügung gestellt werden, welches sowohl die Herstellung als auch die Identifizierung gewünschter transgener Pflanzen bzw. transgener Pflanzensamen mit erhöhtem Ölgehalt ermöglicht.
Diese und weitere Aufgaben werden durch die Gegenstände der unabhängigen Patentansprüche gelöst. Bevorzugte Ausführungsformen sind in den jeweiligen Unteransprüchen definiert. Jüngste Untersuchungen zeigten, daß die im Stand der Technik von Phillips et al. (1997, vide supra) beobachtete Schädigung der Olkörper durch Expression eines rekombinanten Antikörpers gegen ABA nur im Hypocotyl deutlich ausgeprägt war, während im Bereich der Cotyledonen die Olkörper bei mehreren transgenen Linien noch vorhanden waren. Die Bestimmung des Gesamtgehaltes an Fettsäuren, der im Rahmen dieser Patentanmeldung auch als Ölgehalt bezeichnet wird, zeigte keine Unterschiede zwischen den Kontrollpflanzen (die einen rekombinanten Antikörper gegen Oxazolon in vergleichbarer Höhe samenspezifisch unter Kontrolle des USP- Promotors, lokalisiert im Endoplasmatischen Retikulum, exprimierten) und den Wildtyppflanzen, obwohl im Bereich des Hypocotyls sich offensichtlich die Olkörper auflösten und mit einer Erniedrigung des Ölgehaltes gerechnet werden mußte.
Des weiteren wurden jetzt auch transgene Linien untersucht, die relativ wenig des im Stand der Technik von Phillips et al. (1997, vide supra) beschriebenen anti-ABA- Antikörpers akkumulierten, nämlich < 1% TSP (total soluble protein) im Samen transgener Pflanzen. Diese Linien zeigten keine viviparen Erscheinungen, dagegen aber einen signifikant erhöhten Ölgehalt, wobei die Erhöhung des Olgehalts bis zu 80% betrug.
Es wurde somit gefunden, daß transgene Pflanzensamen, in denen relativ wenig anti- ABA- Antikörper akkumulierte, eine beträchtliche Steigerung des Olgehalts gegenüber Wildtypsamen zeigen.
Ohne an eine Hypothese gebunden sein zu wollen, wird gegenwärtig angenommen, daß es durch die teilweise Immunmodulation der ABA- Wirkung im Samen bei einem bestimmten Grad der Bindung durch ABA durch den Antikörper zu einer Umlagerung der Speicheraktivitäten kommt, die zu einer bevorzugten Speicherung von Öl führt. Bei einem höheren Grad der Immunmodulation wird, so wird gegenwärtig vermutet, der gesamte Prozeß der Bildung von Speichervakuolen gestört und die erhöhte Ölakkumulation wird durch Ölverluste im Hypocotyl (Ölkörperlyse) ausgeglichen.
Die Erfindung betrifft somit ein Verfahren zur Erhöhung des Olgehalts in transgenen Pflanzen und Pflanzensamen, wobei die Erhöhung des Olgehalts durch Beeinflussung der Abscisinsäurewirkung und insbesondere des Abscisinsauregehalts in transgenen Pflanzen bzw. Pflanzensamen bewirkt wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Beeinflussung des Gehalts wirksamer Abscisinsäure in transgenen Pflanzen und Pflanzensamen durch Expression eines rekombinanten anti-ABA- Antikörpers vermittelt. „Wirksame Abscisinsäure bedeutet hier, Abscisinsäure, die nicht vom anti-ABA- Antikörper gebunden ist und die nicht im „falschen" Kompartiment, wo sie nicht die gewünschte Wirkung entfalten kann, festgehalten wird.
Besonders bevorzugt wird der gegen ABA gerichtete Antikörper samenspezifisch exprimiert, d.h. die für den anti-ABA- Antikörper kodierende Nukleinsäure wird unter Kontrolle eines samenspezifischen Promotors im Samengewebe transgener Pflanzen exprimiert.
Besonders bevorzugt handelt es sich bei dem samenspezifischen Promotor um den USP-Promotor, unter dessen Kontrolle der anti-ABA- Antikörper exprimiert wird. Dieser Promotor gewährleistet eine relativ frühe und hohe Expression in der Samenentwicklung, was im Rahmen der vorliegenden Erfindung sehr vorteilhaft ist.
Der USP-Promotor wurde erstmals von Bäumlein et al. (1991, Mol. Gen. Genet. 225: 459 - 467) beschrieben und sein Einsatz als samenspezifischer Promotor ist während der letzten Jahre häufig in wissenschaftlichen Publikationen sowie in Patentdokumenten beschrieben worden. Im Zusammenhang mit dem USP-Promotor sowie dem anti-ABA- Antikörper wird hiermit ausdrücklich auf die Offenbarung in dem bereits oben erwähnten Artikel von Phillips et al. (1997, vide supra) Bezug genommen, da dieser Artikel die Synthese und Expression eines im Rahmen der vorliegenden Erfindung geeigneten Antikörpers in transgenen Pflanzensamen im Detail beschreibt und dem Fachmann einen Weg für die praktische Umsetzung der hier beschriebenen Erfindung liefert. Der ausdrückliche Verweis auf den Artikel von Phillips et al. (1997, vide supra) dient der Vermeidung von Wiederholungen.
Neben dem USP-Promotor eignen sich selbstverständlich auch andere Promotoren, die in pflanzlichem Samengewebe aktiv sind. Samenaktive und samenspezifische Promotoren kann der Fachmann in großer Zahl der Literatur und den Gendatenbanken entnehmen. Der in den beigefügten Ausführungsbeispielen verwendete USP-Promotor ist daher nur als Beispiel anzusehen.
Auch die Detektion transgener Pflanzenlinien, die den gewünschten Expressionsbzw. Akkumulationslevel an anti-ABA-Antikörpern im Samen aufweisen, ist für den Durchschnittsfachmann mittels einfacher und schneller Routinemethoden durchführbar. Hier bietet sich z.B. ein Western-Blot an, um die Akkumulation des anti-ABA- Antikörpers im Pflanzensamen zu quantifizieren. Darüber hinaus sind dem Fachmann weitere Nachweismethoden bekannt, um die Antikörperakkumulation im Samen zu einem bestimmten Zeitpunkt bestimmen zu können.
Wie oben erwähnt zeigen die transgenen Pflanzensamen bevorzugt eine relativ geringe Akkumulation an anti-ABA-Antikörpern im Samen, wobei eine relativ geringe Akkumulation im Rahmen dieser Erfindung eine Akkumulation des
Antikörpers von vorzugsweise < 1,0% TSP im Samen und besonders bevorzugt < 0,7% TSP im Samen bedeutet, wobei die Antikörperkonzentration im Samen mindestens 0,01% TSP betragen sollte. TSP steht für „total soluble protein", also gesamtes lösliches Protein (siehe z.B. Conrad and Fiedler (1998) Plant Mol. Biol. 38:101-109 und darin erwähnte Literatur).
In einer weiteren Ausführungsform wird die Beeinflussung des Abscisinsauregehalts durch direkte Modulation der ABA-Biosynthese bewirkt, wobei auch hier eine samenspezifische Modulation bevorzugt ist.
So kann z.B. durch Erzeugung geeigneter Mutanten, in denen die natürliche ABA- Biosynthese gestört ist und die aufgrund dieser Störung erniedrigte ABA-Gehalte aufweisen, die oben im Zusammenhang mit der Expression von ABA-spezifischen Antikörpern beschriebene Erhöhung des Olgehalts erreicht werden. Beispiele für ABA-defiziente Mutanten sind bereits bekannt und betreffen vor allem pflanzliche Gene für Aldehydoxidase, die die Oxidation von Abscisinaldehyd zu ABA katalysiert und deren Inaktivierung in einem reduzierten AB A-Gehalt resultiert (siehe z.B. Seo et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 97:12908-12913). Neben Aldehydoxidase können andere Enzyme durch Mutation inaktiviert bzw. in ihrer Aktivität gehemmt werden, die an der ABA-Synthese beteiligt sind und deren Beeinflussung in einer Erniedrigung des ABA-Gehalts in Pfanzenzellen resultiert.
Ein weiteres im Rahmen der Erfindung einsetzbares Gen bzw. Genprodukt, das an der ABA-Biosynthese beteiligt ist, ist die Zeaxanthin-Epoxidase (Audran et al. (1999) Plant Mol. Biol. 39:1267-1274; Audran et al. (1998) Plant Physiol. 118:1021- 1028; Marin et al. (1996) EMBO J. 15 :2331-2342).
In einer weiteren Ausführungsform wird die Modulation der ABA-Biosynthese nicht durch Mutation der in die Biosynthese involvierten Gene bewirkt, sondern durch Cosuppressions- bzw. Antisense- Ansätze, bei denen geeignete sense- bzw. antisense- Konstrukte in transgenen Pflanzen und vorzugsweise im Samengewebe exprimiert werden. Neben den konventionellen Cosuppressions- bzw. Antisensetechniken eignet sich hier selbstverständlich auch die RNA interference-Technik zur Suppression von Genen bzw. Enzymaktivitäten, die bei der ABA-Biosynthese eine Rolle spielen. Wie oben bereits erwähnt, eignet sich für diesen Ansatz beispielsweise das pflanzeneigene Enzym Aldehyd-Oxidase, insbesondere Aldehyd-Oxidase 3.
Auch in diesen Fällen wird eine samenspezifische Suppression bevorzugt, z.B. durch Expression von Suppressionskonstrukten unter Kontrolle eines samenspezifischen Promotors, wie z.B. dem USP-Promotor.
Sowohl die Erzeugung von Pflanzen, in denen die ABA-Biosynthese durch
Mutationen in den ABA-Biosynthesegenen gehemmt ist, als auch die Erzeugung von Pflanzen, in denen die ABA-Biosynthese durch Übertragung und Expression von sense- bzw. antisense-Konstrukten für ABA-Biosynthesegene verringert ist, ist dem Fachmann mittels molekularbiologischer Routinemethoden und herkömmlicher Transformationstechniken ohne Probleme möglich.
In einer weiteren Ausführungsforai kann die Modulation der AB A- Wirkung durch Inhibition von Enzymen, die an der ABA-Biosynthese beteiligt sind, mittels spezifischer Antikörper bewerkstelligt werden. In diesem Fall wäre der Antikörper also nicht gegen ABA gerichtet, sondern z.B. gegen die oben erwähnte
Aldehydoxidase, was ebenfalls zu der gewünschten Erniedrigung der ABA- Konzentration in der Pflanzenzelle führen würde. Auch die Möglichkeit der Immunmodulation ist für den Fachmann problemlos umsetzbar, da die Expression spezifischer Antikörper in Pflanzen bereits seit vielen Jahren gut etabliert ist; siehe z.B. Fiedler et al. (1997) Immunotechnology 3:205-216; Comad and Fiedler (1998) Plant Mol. Biol. 38:101-109 (Review); De Jaeger et al. (2000) Plant Mol. Biol. 43:419-428.
In einer weiteren Ausführungsform wird die ABA-Biosynthese durch Applikation eines Inhibitors gehemmt und dadurch die gewünschte Steigerung des Olgehalts bewirkt. Als Hemmstoff eignet sich z.B. Fluridon, der sich bereits bei Embryonen von Luzerne und Senf als ABA-Biosynthesehemmer bewährt hat (Xu et al. (1995) J. Exp. Botany 46:687-694; Fischer et al. (1983) In. Krueger and La Bege (eds.) II: Int. Symp. On pre-harvested sprouting in cereals, Boulder, Col. Westview Press, Seiten 188-196).
In jedem Fall muß der Fachmann im Anschluß an die Erzeugung der Pflanzen, diejenigen Pflanzen selektieren, die neben einem verringerten ABA-Gehalt auch einen erhöhten Ölgehalt aufweisen. Wie bereits erwähnt, stehen auch hier dem Fachmann diverse Standardmethoden zur Verfügung.
Wie bereits erwähnt, ist die auf den Samen beschränkte Modulation der ABA- Wirkung im Unterschied zur systemischen Beeinflussung des ABA-Gehalts in der gesamten Pflanze bevorzugt. Ein wesentlicher Grund hierfür liegt darin, daß die Modulation von ABA- Wirkungen in allen Zellen die Pflanze physiologisch so verändern würde, daß praktisch nur noch ein Wachstum bei 95% Luftfeuchtigkeit möglich wäre.
Die Herstellung erfindungsgemäßer Nukleinsäurekonstrukte ist dem Fachmann mittels Standardmethoden möglich, wie sie beispielsweise von Sambrook et al. (1989) Molecular cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Coldspring Harbour, Laboratory Press, Coldspring Harbour, New York, beschrieben sind. Gleiches gilt für die Einführung von Mutationen, die Herstellung von sense- und antisense- Konstrukten, die Herstellung von Antikörperkonstrukten etc.
Wie oben erwähnt sind dem Fachmann auch geeignete samenspezifische Promotorregionen bekannt, neben dem bereits erwähnten USP-Promotor sind hier beispielsweise zu nennen der LeB4-Promotor (Nagj I. (1990) Untersuchung zu Expression und Regulation samenspezifischer Gene von Viciafaba, Dissertation, Universität Halle) und der DC3-Promotor (Steffens et al. (1990) Dev. Genet. 11 : 65 - 76). Geeignet sind auch der Napin-Promotor (Eilerstrom et al. (1996) Plant Mol. Biol. 32:1019-1027) und der FatB4-Promotor. Diese samenspezifischen Promotoren können sowohl für anti-sense- als auch sense-Konstrukte eingesetzt werden, um Veränderungen des Abscisinsäure-Biosynthesewegs mit dem Ziel einer Verminderung des Abscisinsauregehalts in den Samen zu erreichen.
Da auch eine Erhöhung des Olgehalts in z.B. Ölpalmenfrüchten und Oliven von großem pflanzenzüchterischen Interesse ist, stellt die fruchtspezifische Expression von anti-ABA-Antikörpern ebenfalls eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung dar. Gleiches gilt selbstverständlich für die anderen oben genannte Wege zur Erniedrigung des ABA-Gehalts.
Zur Vorbereitung der Einführung fremder Gene in höhere Pflanzen bzw. deren Zellen stehen eine große Anzahl von Klonierungsvektoren zur Verfügung, die ein Replikationssignal für E. coli und ein Markergen zur Selektion transformierter Bakterienzellen enthalten. Beispiele für derartige Vektoren sind pBR322, pUC- Serien, M13mp-Serien, pACYC184 usw. Die gewünschte Sequenz kann an einer passenden Restriktionsschnittstelle in den Vektor eingeführt werden. Das erhaltene Plasmid wird dann für die Transformation von E. coli-Zellen verwendet. Transformierte E. coli-Zellen werden in einem geeigneten Medium gezüchtet und anschließend geerntet und lysiert, und das Plasmid wird wiedergewonnen. Als Analysenmethode zur Charakterisierung der gewonnenen Plasmid-DNA werden im allgemeinen Restriktionsanalysen, Gelelektrophoresen und weitere biochemisch- molekularbiologische Methoden eingesetzt. Nach jeder Manipulation kann die Plasmid-DNA gespalten und gewonnene DNA-Fragmente mit anderen DNA- Sequenzen verknüpft werden.
Für die Einführung von DNA in eine pflanzliche Wirtszelle stehen eine Vielzahl von Techniken zur Verfügung, wobei der Fachmann die jeweils geeignete Methode ohne Schwierigkeiten ermitteln kann. Diese Techniken umfassen die Transformation pflanzlicher Zellen mit T-DNA unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes als Transformationsmedium, die Fusion von Protoplasten, die Injektion, die Elektroporation, den direkten Gentransfer isolierter DNA in Protoplasten, die Einbringung von DNA mittels der biolistischen Methode sowie weitere Möglichkeiten die bereits seit mehreren Jahren gut etabliert sind und zum üblichen Repertoire des Fachmanns in der pflanzlichen Molekularbiologie bzw. Pflanzenbiotechnologie gehören.
Bei der Injektion und Elektroporation von DNA in Pflanzenzellen werden per se keine speziellen Anforderungen an die verwendeten Plasmide gestellt. Ähnliches gilt für den direkten Gentransfer. Es können einfache Plasmide, wie z.B. pUC-Derivate, verwendet werden. Sollen aber aus derartig transformierten Zellen ganze Zellen regeneriert werden, ist die Anwesenheit eines selektierbaren Markergens empfehlenswert. Dem Fachmann sind die gängigen Selektionsmarker bekannt, und es stellt für ihn kein Problem dar, einen geeigneten Marker auszuwählen.
Je nach Einführungsmethode gewünschter Gene in die Pflanzenzelle können weitere DNA-Sequenzen erforderlich sein. Werden z.B. für die Transformation der Pflanzenzelle das Ti- oder Ri-Plasmid verwendet, so muss mindestens die rechte Begrenzung, häufig jedoch die rechte und linke Begrenzung der im Ti- bzw. Ri- Plasmid enthaltenen T-DNA als Flankenbereich mit den einzuführenden Genen verbunden werden. Werden für die Transformation Agrobakterien verwendet, muss die einzuführende DNA in spezielle Plasmide kloniert werden, und zwar entweder in einen intermediären oder in einen binären Vektor. Die intermediären Vektoren können aufgrund von Sequenzen, die homolog zu Sequenzen in der T-DNA sind, durch homologe Rekombination in das Ti- oder Ri-Plasmid der Agrobakterien integriert werden. Dieses enthält außerdem die für den Transfer der T-DNA notwendige vir-Region. Intermediäre Vektoren können nicht in Agrobakterien replizieren. Mittels eines Helferplasmids kann der intermediäre Vektor auf Agrobacterium tumefaciens übertragen werden (Konjugation). Binäre Vektoren können sowohl in E. coli als auch in Agrobakterien replizieren. Sie enthalten ein Selektionsmarkergen und einen Linker oder Polylinker, welche von der rechten und linken T-DNA-Grenzregion eingerahmt werden. Sie können direkt in die Agrobakterien transformiert werden. Das als Wirtszelle dienende Agrobakterium soll ein Plasmid, das eine vir-Region trägt, enthalten. Die vir-Region ist für den Transfer der T-DNA in die Pflanzenzelle notwendig. Zusätzliche T-DNA kann vorhanden sein. Das derartig transformierte Agrobakterium wird zur Transformation von Pflanzenzellen verwendet. Die Verwendung von T-DNA für die Transformation von Pflanzenzellen ist intensiv untersucht und ausreichend in allseits bekannten Übersichtsartikeln und Handbüchern zur Pflanzentransformation beschrieben worden. Für den Transfer der DNA in die Pflanzenzelle können Pflanzen-Explantate zweckmäßigerweise mit Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes kultiviert werden. Aus dem infizierten Pflanzenmaterial (z.B. Blattstücke, Stengelsegmente, Wurzeln, aber auch Protoplasten oder Suspensions-kultivierte Pflanzen- zellen) können dann in einem geeigneten Medium, welches Antibiotika oder Biozide zur Selektion transformierter Zellen enthalten kann, wieder ganze Pflanzen regeneriert werden.
Ist die eingeführte DNA einmal im Genom der Pflanzenzelle integriert, so ist sie dort in der Regel stabil und bleibt auch in den Nachkommen der ursprünglich transformierten Zelle erhalten. Sie enthält normalerweise einen Selektionsmarker, der den transformierten Pflanzenzellen Resistenz gegenüber einem Biozid oder einem Antibiotikum wie Kanamycin, G 418, Bleomycin, Hygromycin, Methotrexat, Glyphosat, Streptomycin, Sulfonylharnstoff, Gentamycin oder Phosphinotricin u.a. vermittelt. Der individuell gewählte Marker sollte daher die Selektion transformierter Zellen gegenüber Zellen, denen die eingeführte DNA fehlt, gestatten. Hierzu sind auch alternative Marker geeignet, wie nutritive Marker, Screeningmarker (wie GFP, green fluorescent protein). Selbstverständlich kann auch vollkommen auf Selektionsmarker verzichtet werden, was allerdings mit einem ziemlich hohen Screening- bedarf einhergeht. Falls markerfreie transgene Pflanzen erwünscht sind, stehen dem Fachmann auch Strategien zur Verfügung, die eine nachträgliche Entfernung des Markergens erlauben, z.B. Cotransformation, Sequenz-spezifische Rekombinasen.
Die Regeneration der transgenen Pflanzen aus transgenen Pflanzenzellen erfolgt nach üblichen Regenerationsmethoden unter Verwendung bekannter Nährmedien. Die so erhaltenen Pflanzen können dann mittels üblicher Verfahren, einschließlich molekularbiologischer Methoden, wie PCR, Blot- Analysen, auf Anwesenheit der eingeführten Nukleinsäure bzw. des von der Nukleinsäure kodierten Proteins untersucht werden.
Bei der transgenen Pflanze bzw. den transgenen Pflanzenzellen kann es sich um jede beliebige monokotyle oder dikotyle Pflanze bzw. Pflanzenzelle handeln, für die eine Erhöhung des Olgehalts im Samengewebe erwünscht ist. Vorzugsweise handelt es sich um Nutzpflanzen bzw. Zellen von Nutzpflanzen. Besonders bevorzugt handelt es sich um Olsaaten, also insbesondere Pflanzen, deren Samen reich an pflanzlichem Öl sind und die sich für die Gewinnung von Pflanzenöl eignen, und am meisten bevorzugt um Lein, Raps, Rübsen, Sonnenblume und Sojabohne.
Neben den transgenen Pflanzen, Pflanzenzellen und Pflanzensamen sind auch andere Pflanzenteile, Pflanzenprodukte und Vermehrungsmaterial der transgenen, erfindungsgemäßen Pflanzen Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Insbesondere betrifft die Erfindung auch das aus den Pflanzen, bevorzugt den Pflanzensamen und Früchten gewonnene Öl. Die Gewinnung des Öls aus den erfindungsgemäßen transgenen Pflanzen erfolgt nach konventionellen Methoden, beispielsweise durch Pressung.
Schließlich betrifft die Erfindung die Verwendung von Antikörpern, die gegen Abscisinsäure oder gegen an der Abscisinsäure-Biosynthese beteiligte Enzyme gerichtet sind, zur Erhöhung des Öl- und Fettsäuregehalts in transgenen Pflanzensamen.
Die vorliegende Erfindung wird in den nachfolgenden Beispielen, die nur der Veranschaulichung der Erfindung dienen und in keiner Weise als Einschränkung zu verstehen sind, erläutert.
Beispiele
Erhöhung des Olgehalts in transgenen Tabaksamen durch Expression eines rekombinanten anti-ABA-Antikörpers in den Samen
Die Erzeugung transgener Pflanzen, das verwendete Nukleinsäurekonstrukt, das für den anti-ABA- Antikörper unter Kontrolle des USP-Promotors kodiert, die
Bestimmung des ABA-Gehalts durch ELISA, die Durchführung von Western-Blots zur Quantifizierung des anti-ABA-Antikörpers, die gelektrophoretische Analyse der Reserveglobuline im Tabaksamen bzw. Tabakembryo wurden gemäß Phillips et al. (1997, vide supra) durchgeführt. Auf die gesamte Offenbarung dieses Artikels aus dem Jahr 1997 wird hiermit zwecks Vermeidung von Wiederholungen Bezug genommen.
Die Lipidanalyse wurde nach folgendem Protokoll durchgeführt:
Für die Analyse des Gesamtfettsäuregehalts von transgenen Tabaksamen wurden 1 mg der Samen durch Zugabe von 405 μl eines Gemischs von Toluol und Methanol (1 : 1 v/v) und von 105 μl von 0,5 mM Natriummethoxid-Lösimg in Methanol im Mörser homogenisiert. Als internen Standard wurden 100 μg Triheptadecanoat hinzugegeben. Nach Inkubation der Proben für 20 Min. wurden 0,5 ml von 1 mM Natriumchlorid hinzugegeben und die Fettsäuremethylester wurden zweimal mit 0,5 ml Heptan extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden unter einem Stickstoffstrom bis zur Trockenheit verdampft und die entsprechenden Fettsäuremethylester wurden in 10 μl Acetonitril wieder aufgenommen. Anschließend wurde 1 μl einer jeden Probe mittels Gaschromatographie (GC) analysiert. Die GC- Analyse wurde mit einem Agilent GC 6890-System, gekoppelt mit einem FID-Detektor, ausgestattet mit einer HP INNOVAX-Kapillarsäule (30 m x 0,32 mm; 0,5 μm Beschichtungsdicke; Agilent, Deutschland) durchgeführt.
Helium wurde als Trägergas verwendet (30 cm x s"1). Die Proben wurden mit einem Splitverhältnis von 60:1 und mit einer Injektortemperatur von 220°C gemessen. Der Temperaturgradient war 150°C für 1 Min., 150°C - 200°C bei 15°C/Min., 200°C - 250°C bei 2°C/Min. und 250°C für 10 Min. Sämtliche Fettsäuren wurden durch Coinjektion mit authentischen Standards identifiziert und der Ölgehalt durch Addition der Mengen der einzelnen Fettsäuren bestimmt.
Wie oben erwähnt basiert die vorliegende Erfindung auf den von Phillips et al. (1997, vide supra) beschriebenen transgenen Pflanzen, die vivipare Erscheinungen in den sich entwickelnden Samen zeigen. Allerdings wurden im Stand der Technik nur hochexprimierende Pflanzen untersucht, die in den Cotelydonen weder "protein bodies" noch Olkörper enthalten. Jüngste elektronenmikroskopische Untersuchungen von Embryonen anhand von Schnitten aus verschiedenen Bereichen des Embryos zeigten, daß zwar überall die "protein bodies" fehlten, aber die Olkörper nur im mittleren Bereich des Embryos, nämlich im Hypocotyl, nicht mehr vorhanden waren. Aus dieser Beobachtung ergab sich die Vermutung, daß die Ölkörperbildung und die "protein body" -Bildung während der Samenentwicklung zwar beide durch
Abscisinsäure reguliert werden, aber nicht streng aneinander gekoppelt sind. Es wurde daher eine Serie von 60 unabhängigen transgenen Pflanzen (TGO-Pflanzen, also TG1— Samen, Bezeichnung: BU1 bis BU60) untersucht und hier eine hohe Variabilität im Ölgehalt von 400 - 800 μg/mg (μg Fettsäuren / mg Samengewebe) festgestellt. Nicht-transgene Pflanzen wiesen einen Gehalt von 400 μg mg auf. Da TGl-Samen genetisch nicht einheitlich sind, wurden die Samen von TG2- Pflanzen, also TG3-Samen verschiedener Primärlinien untersucht. Alle in diesen Versuch eingeschlossenen Samen wurden parallel im Gewächshaus zum selben Zeitpunkt angezogen und geerntet, wobei sowohl hochexprimierende Linien als auch geringere Antikörpermengen akkumulierende Linien in das Experiment eingeschlossen wurden. Als Kontrollen dienten parallel zum selben Zeitpunkt angezogene Wildtyppflanzen und anti-Oxazolon scFv transgene Linien (20U-18, Phillips et al. (1997, vide supra), Fiedler et al. (1997, vide supra)). Von diesen Linien wurden zunächst die Antikörperkonzentration durch Western-Blot und die ABA- Konzentration durch ELISA bestimmt (siehe unten stehende Tabelle 1).
Darüber hinaus wurde beobachtet, daß in den hoch exprimierenden Linien (BU18, BU22 und BU24 in Tabelle 1 bzw. Bezeichnung ohne BU in Figur 1) die von Phillips et al. (1997, vide supra) beschriebenen moφhologischen Veränderungen auftraten, nämlich Ergrünung, Embryowachstum und teilweise Viviparie. Die Linien BU31 und BU61 hingegen waren nur teilweise etwas ergrünt. Um diese Befunde durch einen weiteren Parameter zu unterstützen, wurde auf Transkriptebene die Expression der kleinen Hitzeschockproteine (hspl7) untersucht (ebenfalls in Tabelle 1). Kleine Hitzeschockproteine werden ebenfalls im Samenreifungsprozeß synthetisiert.
Tabelle 1 : Antikörpergehalt, ABA-Gehalt und Transkriptmenge der kleinen
Hitzeschockproteine von transgenen BU-Samen und Kontrollsamen
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SNN steht für den Wildtyp Nicotiana tabacum cv. Samsun NN TSP steht für total soluble protein scFv steht für single-chain variable fragment
Die in Tabelle 1 dargestellten Ergebnisse zeigen, daß der ABA-Gehalt in Abhängigkeit von der Antikörperkonzentration steigt, daß die Linien BU31 und BU61 relativ wenig ABA- Antikörper produzieren und BU31 im reifen Samen einen leicht erhöhten ABA-Gehalt aufweist, während BU61 dies nicht zeigt. Weiter zeigen die Ergebnisse, daß bei hohem Antiköφergehalt die Hitzeschockprotein (hsp)- Transkripte fast völlig wegfallen, und die hsp-Transkripte bei niedrigem Antiköφergehalt ebenfalls deutlich verringert sind.
Untersuchungen der Reserveproteine zeigten, daß diese nur bei hoch exprimierenden Linien, wie BU18, BU22 und BU24, sehr stark verringert auftreten. Daraus folgt, daß in Folge der samenspezifischen Immunmodulation der AB A-Funktion einzelne Parameter unterschiedlich reguliert werden. Überraschende Einflüsse zeigten sich bei der Analyse des Ölgehaltes (siehe Figur 1). Nur wenig Antiköφer produzierende Linien zeigen einen deutlich erhöhten Ölgehalt. Durch differentielle samenspezifische Immunmodulation der ABA-Funktion wurde eine Situation erzeugt, die erhöhte Ölakkumulation und nicht signifikant verminderte Reserveglobulinsynthese ermöglicht. Diese Situation ist ABA- immunmodulationsspezifisch, wie normale Ölgehalte in SNN- und 20U/18-Samen (anti-Oxazolon- Antiköφer, ist spezifisch für ein anderes Antigen und bindet nicht an ABA) beweisen.
Erhöhung des Olgehalts in transgenen Samen durch Expression eines sense- oder antisense-Konstrukts, in dem die für ABA- Aldehydoxidase, vorzugsweise für ABA- Aldehydoxidase 3 (siehe Seo et al. (2000), vide supra), kodierende Nuklein- säuresequenz in sense- bzw. antisense-Orientierung unter Kontrolle eines Samenspezifischen Promotors, vorzugsweise unter Kontrolle des USP-Promotors steht.
Konstrukte: 5' USP-Promotor sense AAO Terminator 3'
5' USP-Promotor antisense AAO Terminator 3'
AAO: ABA-Aldehydoxidasegen, vorzugsweise ABA-Aldehydoxidase 3
Durch Analyse des Olgehaltes können transgene Pflanzen mit durch ABA-Reduktion erhöhtem Ölgehalt selektiert werden.
Figuren
Figur 1 zeigt den Ölgehalt transgener Tabaksamen verschiedener transgener Linien.

Claims

PATENTANSPRÜCHE
1. Verfahren zur Erhöhung des Öl- und Fettsäuregehalts in transgenen Pflanzen und/oder Pflanzensamen, wobei die Erhöhung des Öl- und Fettsäuregehalts durch Beeinflussung der Abscisinsäurewirkung in der Pflanze und/oder den Pflanzensamen bewirkt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Beeinflussung der Abscisinsäurewirkung eine Beeinflussung des Abscisinsauregehalts ist.
3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Beeinflussung des Abscisinsauregehalts eine Erniedrigung des Abscisinsauregehalts ist.
4. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die
Beeinflussung der Abscisinsäurewirkung durch Expression eines rekombinanten anti-Abscisinsäure-Antiköφers vermittelt wird.
5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei der anti- Abscisinsäure- Antiköφer unter Kontrolle eines samenspezifischen Promotors steht.
6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei der Promotor der USP-Promotor ist.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 6, wobei die Akkumulation des anti-Abscisinsäure-Antiköφers im Samen < 1,0%, vorzugsweise < 0,7%, des gesamten löslichen Proteins ausmacht.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Beeinflussung der Abscisinsäurewirkung durch Übertragung und Expression eines rekombinanten Nukleinsäuremoleküls in transgenen Pflanzen und/oder Pflanzensamen vermittelt wird, wobei in dem Nukleinsäuremolekül eine für ein an der Abscisinsäure- Biosynthese beteiligtes Enzym kodierende Nukleinsäuresequenz in sense- oder antisense-Orientierung unter Kontrolle eines samenspezifischen Promotors steht.
9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei es sich bei dem Enzym um Aldehyd-
Oxidase, vorzugsweise Aldehyd-Oxidase 3 handelt.
10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, wobei der samenspezifische Promotor der USP-Promotor ist.
11. Transgene Pflanze und/oder Pflanzensamen, hergestellt nach einem Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche.
12. Pflanzliches Samenöl, gewonnen aus einer transgenen Pflanze bzw. Pflanzensamen gemäß Anspruch 11.
13. Verwendung von Antiköφern, die gegen Abscisinsäure oder gegen an der Abscisinsäure-Biosynthese beteiligte Enzyme gerichtet sind, zur Erhöhung des Öl- und Fettsäuregehalts in transgenen Pflanzensamen.
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