DE69832283T2

DE69832283T2 - Herstellung von thioesterasen aus pflanzen und offenbarung von thioesterasen aus pflanzen mit neuer substratspezifität

Info

Publication number: DE69832283T2
Application number: DE69832283T
Authority: DE
Inventors: Ling Yuan
Original assignee: Calgene LLC
Current assignee: Monsanto Co
Priority date: 1997-06-03
Filing date: 1998-06-03
Publication date: 2006-08-10
Anticipated expiration: 2018-06-04
Also published as: BR9810402A; JP2002502263A; EP1003884B1; CA2291452A1; ATE309372T1; WO1998055633A1; US6150512A; EP1003884A1; EP1605048A1; DE69832283D1; ES2251770T3

Description

Fachgebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft gentechnisch veränderte Pflanzen-Acyl-ACP-Thioesterasen, die von Mangostan-Garm-FatA1-Thioesterase abgeleitet ist, und DNA-Sequenzen, die diese codieren.
Einleitung
Hintergrund
Fettsäuren sind organische Säuren, die eine Kohlenwasserstoffkette mit etwa 4 bis 24 Kohlenstoffatomen aufweisen. Es sind viele verschiedene Arten von Fettsäuren bekannt, die sich in Bezug auf die Kettenlänge sowie die Anwesenheit, Zahl und Position von Doppelbindungen voneinander unterscheiden. In Zellen liegen Fettsäuren typischerweise in kovalent gebundenen Formen vor, wobei der Carboxylteil als Fettacylgruppe bezeichnet wird. Die Kettenlänge und der Sättigungsgrad dieser Moleküle wird häufig durch die Formel CX:Y angegeben, wobei "X" die Zahl der Kohlenstoffatome und "Y" die Zahl der Doppelbindungen angibt.
Die Produktion von Fettsäuren in Pflanzen beginnt im Plastid mit der Reaktion zwischen Acetyl-CoA und Malonyl-ACP unter Bildung von Butyryl-ACP, was durch das Enzym β-Ketoacyl-ACP-Synthase III katalysiert wird. Die Verlängerung von Acetyl-ACP zu Fettsäuren mit 16 und 18 Kohlenstoffatomen beinhaltet die zyklische Wirkung der folgenden Reaktionssequenz: Kondensation mit einer C2-Einheit von Malonyl-ACP unter Bildung eines β-Ketoacyl-ACP (β-Ketoacyl-ACP-Synthase), Reduktion der Ketofunktion zu einem Alkohol (β-Ketoacyl-ACP- Reductase), Dehydratation unter Bildung eines Enoyl-ACP (β-Hydroxyacyl-ACP-Dehydrase) und schließlich Reduktion des Enoyl-ACP unter Bildung des verlängerten gesättigten Acyl-ACP (Enoyl-ACP-Reductase). β-Ketoacyl-ACP-Synthase I katalysiert die Verlängerung bis zu Palmitoyl-ACP (C16:0), während β-Ketoacyl-ACP-Synthase II die endgültige Verlängerung zu Stearoyl-ACP (C18:0) katalysiert. Die durch die Fettsäuresynthese erzeugten Fettsäuren mit den längsten Ketten sind typischerweise 18 Kohlenstoffatome lang. Ein weiterer Schritt der Fettsäure-Biochemie, der im Plastid erfolgt, ist die Entsättigung von Stearoyl-ACP (C18:0) unter Bildung von Oleoyl-ACP (C18:1) in einer Reaktion, die durch eine Δ-9-Desaturase katalysiert wird, die wegen ihrer hohen Aktivität gegenüber Stearat, dem C18-Acyl-ACP, häufig auch als "Stearoyl-ACP-Desaturase" bezeichnet wird.
Die Kohlenstoffkettenverlängerung in den Plastiden kann durch Übertragung der Acylgruppe auf Glycerin-3-phosphat beendet werden, wobei das resultierende Glycerolipid im plastidischen, "prokaryontischen" Lipid-Biosyntheseweg zurückgehalten wird. Alternativ dazu können spezifische Thioesterasen in den prokaryontischen Stoffwechselweg eingreifen, indem sie die neu produzierten Acyl-ACPs zu freien Fettsäuren und ACP hydrolysieren.
Anschließend werden die freien Fettsäuren in der Plastidhülle in Fettacyl-CoAs umgewandelt und ins Cytoplasma exportiert. Dort werden sie in den "eukaryontischen" Lipid-Biosyntheseweg im Endoplasmatischen Retikulum eingeschleust, das für die Bildung von Phospholipiden, Triglyceriden und anderen neutralen Fetten verantwortlich ist. Nach dem Transport von Fettacyl-CoAs zum Endoplasmatischen Retikulum können daran anschließende aufeinanderfolgende Schritte der Triglycerid-Produktion erfolgen. Zum Beispiel werden mehrfach ungesättigte Fettacylgruppen, wie Linoleoyl und α-Linolenoyl, als Ergebnis der sequentiellen Entsättigung von Oleoyl-Acylgruppen durch die Einwirkung von membrangebundenen Enzymen produziert. Triglyceride werden durch die Einwirkung der 1-, 2- und 3-Acyl-ACP-Transferase-Enzyme Glycerin-3-phosphat-Acyltransferase, Lysophosphatidinsäure-Acyltransferase und Diacylglycerin-Acyltransferase gebildet. Die Fettsäurezusammensetzung einer Pflanzenzelle spiegelt den Pool der freien Fettsäuren und die als Ergebnis der Acyltransferase-Aktivitäten in Triglyceride eingebauten Fettsäuren (Fettacylgruppen) wider. Die Eigenschaften eines gegebenen Triglycerids hängen von den verschiedenen Kombinationen von Fettacylgruppen in den verschiedenen Positionen im Triglyceridmolekül ab. Wenn die Fettacylgruppen zum Beispiel hauptsächlich gesättigte Fettsäuren sind, ist das Triglycerid bei Raumtemperatur fest. Im Allgemeinen jedoch sind Pflanzenöle häufig Gemische von verschiedenen Triglyceriden. Die Triglycerid-Öleigenschaften sind daher ein Ergebnis der Kombination von Triglyceriden, die das Öl bilden, welche wiederum von ihren jeweiligen Fettacyl-Zusammensetzungen beeinflusst werden.
Pflanzen-Acyl-ACP-Thioesterasen (ACP = Acyl-Trägerprotein) sind wegen ihrer Rolle in der Fettsäuresynthese und ihrer Nützlichkeit bei der gentechnischen Veränderung von Pflanzenölsaat von biochemischem Interesse. Eine Mittelkettiges-Acyl-ACP-Thioesterase aus dem Kalifornischen Berglorbeer, Umbellularia californica, wurde isoliert (Davies et al. (1991) Arch. Biochem. Biophys. 290: 31–45), und ihre cDNA wurde kloniert und in E. coli (Voelker et al. (1994) J. Bacterial. 176: 7320–7327) sowie in Samen von Arabidopsis thaliana und Brassica napus (Voelker et al. (1992) Science 257: 72–74) exprimiert. In allen Fällen wurden große Mengen an Laurat (12:0) und kleine Mengen an Myristat (14:0) akkumuliert. Diese Ergebnisse bewiesen die Rolle der TE bei der Festlegung der Kettenlänge während der de-novo-Fettsäure-Biosynthese in Pflanzen und die Nützlichkeit dieser Enzyme zur Modifikation von Samenölzusammensetzungen in höheren Pflanzen.
Vor kurzem wurden mehrere cDNA kloniert, die verschiedene Pflanzen-Acyl-ACP-Thioesterasen codieren (Knutzon et al. (1992) Plant Physiol. 100: 1751–1758; Voelker et al. (1992), a.a.O.; Dormann et al. (1993) Planta 189: 425–432; Dormann et al. (1994) Biochim. Biophys. Acta 1212: 134–136; Jones et al. (1995) The Plant Cell 7: 359–371). Sequenzanalysen dieser Thioesterasen zeigen eine hohe Homologie, was eine Ähnlichkeit in Struktur und Funktion impliziert. Einige dieser Thioesterase-cDNAs wurden in E. coli exprimiert, und ihre Substratspezifitäten wurden durch in-vitro-Assays bestimmt. Die Tatsache, dass diese Enzyme eine erhebliche Sequenzhomologie aufweisen, aber dennoch unterschiedliche Substratspezifitäten zeigen, weist darauf hin, dass geringfügige Änderungen von Aminosäuren ausreichend sein können, um die Substratselektivität zu verändern.
Es gibt nur wenige Informationen über die strukturelle und funktionelle Divergenz unter diesen Pflanzen-Thioesterasen, und die Tertiärstruktur irgendeiner Pflanzen-Thioesterase muss erst noch bestimmt werden. Protein-Engineering kann sich als mächtiges Werkzeug zum Verständnis des Mechanismus der Thioesterase-Substraterkennung und -Katalyse erweisen und somit zur gezielten Konstruktion neuer Enzyme mit wünschenswerten Substratspezifitäten führen. Solche neuen Enzyme würden beim Pflanzen-Bioengineering Verwendung finden, wobei man verschiedene Modifikationen von Fettacyl-Zusammensetzungen erhält, insbesondere in Bezug auf die Produktion von Pflanzenölen mit wesentlichen Anteilen an gewünschten Fettacylgruppen einschließlich mittelkettiger Fettacylgruppen (C8 bis C14) und längerkettiger Fettacylgruppen (C16 oder C18). Außerdem ist es wünschenswert, die relativen Anteile der verschiedenen Fettacylgruppen, die in dem im Samen gespeicherten Öl vorhanden sind, so zu steuern, dass man eine Vielzahl von Ölen für einen weiten Bereich von Anwendungen erhält.
Literatur
Die Strategie der Verwendung von chimären Genprodukten wurde auf das Studium der Struktur und Funktion. von Phosphotransferasen in Hefen (Hjelmstad et al. (1994) J. Biol. Chem. 269: 20995–21002) und Restriktions-Endonucleasen von Flavobacterium (Kim et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 883–887) angewendet.
Im Protein-Engineering wird der Austausch ganzer Domänen (domain swapping) zur Umordnung von funktionellen Domänen von Proteinen verwendet (Hedstrom (1994) Current Opinion in Structural Biology 4: 608–611). Vor kurzem wurde die Struktur einer Myristoyl-ACP-Thioesterase von Vibrio harveyi bestimmt (Lawson et al. (1994) Biochemistry 33: 9382–9388). Diese Thioesterase weist wie andere bakterielle oder Säuger-Thioesterasen keine Sequenzhomologie mit Pflanzen-Thioesterasen auf (Voelker et al. (1992) a.a.O.).
Beschreibung der Figuren
1. Ein Aminosäuresequenz-Abgleich von repräsentativen Thioesterasen der Klasse I (FatA) und Klasse II (FatB) wird gezeigt. UcFatB1 (SEQ ID Nr. 1) ist eine C12-Thioesterase des Kalifornischen Berglorbeers. CcFatB1 (SEQ ID Nr. 2) ist eine Campher-C14-Thioesterase. CpFatB1 (SEQ ID Nr. 3) ist eine C8- und C10-Thioesterase von Cuphea palustris. CpFatB2 (SEQ ID Nr. 4) ist eine C14-Thioesterase von Cuphea palustris. GarmFatA1 (SEQ ID Nr. 5) ist eine Mangostan-18:1-Thioesterase, die auch eine beträchtliche Aktivität auf C18:0-Acyl-ACP-Substrate hat. BrFatA1 (SEQ ID Nr. 6) ist eine 18:1-Thioesterase von Brassica rapa (= Brassica campestris). Aminosäuresequenzen, die bei allen dargestellten Thioesterasen identisch sind, sind durch Inversion (weiß auf schwarzem Hintergrund) dargestellt.
2. Die Nucleinsäure- und translatierte Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 8) eines Mangostan-Klasse-I-Acyl-ACP-Thioesterase-Klons (GarmFatA1) sind angegeben. GarmFatA1 zeigt primäre Thioesterase-Aktivität auf ein 18:1-Acyl-ACP-Substrat, aber auch eine beträchtliche Aktivität auf ein 18:0-Substrat (ungefähr 10–20% der 18:1-Aktivität).
3. Die Nucleinsäure- und translatierte Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 9) eines Mangostan-Klasse-I-Acyl-ACP-Thioesterase-Klons (GarmFatA2) sind angegeben. GarmFatA2 hat Thioesterase-Aktivität in erster Linie auf ein 18:1-Acyl-ACP-Substrat und eine gleichermaßen geringe Aktivität auf 16:0- und 18:0-Substrate.
4. Die Nucleinsäure- und translatierte Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 10) eines Cuphea-palustris-Klasse-II-Acyl-ACP-Thioesterase-Klons (CpFatB1) mit einer präferentiellen Aktivität auf C8- und C10-Acyl-ACP-Substrate sind angegeben.
5. Die Nucleinsäure- und translatierte Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 11) eines Cuphea-palustris-Klasse-II-Acyl-ACP-Thioesterase-Klons (CpFatB2) mit einer präferentiellen Aktivität auf C14-Acyl-ACP-Substrate sind angegeben.
6. Die relative Thioesterase-Aktivität von Wildtyp- (5247) und mutanter Garcinia-mangifera-Thioesterase (GarmFatA1) auf 18:1-, 18:0- und 16:0-Acyl-ACP-Substrate wird angegeben.
7. Ein Aminosäuresequenzvergleich der Acyl-ACP-Thioesterasen B.-rapa-BrFatA1 (SEQ ID Nr. 6) und Garcinia-mangifera-GarmFatA1 (C18:1/C18:0) (SEQ ID Nr. 5) wird angegeben. Aminosäurereste, die sich zwischen den Thioesterasen unterscheiden, sind durch Inversion angezeigt.
8. Austausch kurzer Domänen durch PCR. Das Gen in voller Länge ist durch zwei lange parallele Linien gezeigt. Der schraffierte Bereich stellt die interessierende Domäne dar. Für jeden PCR-Primer (a, b, c und d) zeigt eine Pfeilspitze auf das 3'-Ende. Die Primer a und b sind ein Vorwärts- und ein Rückwärts-Primer für die volle Länge der DNA. Die dünnen Linien in den Primern c und d stellen Sequenzen dar, die genau in 3'-Richtung stromabwärts der Domäne passen. Die dicken Schwänze der Primer c und d sind die 5'-Überhänge, die der neuen Domänensequenz entsprechen.
9. Austausch langer Domänen durch PCR. Zwei PCR (PCR 1 und 2) werden mit Gen I als Matrize durchgeführt. Eine dritte PCR wird gleichzeitig mit Gen II als Matrize durchgeführt. Die Primer a und b sind ein Vorwärts- und ein Rückwärts-Primer für die volle Länge von Gen I. Der Primer c passt zur Sequenz unmittelbar in 3'-Richtung stromabwärts der ursprünglichen Domäne in Gen I. Die dünne Linie in Primer d stellt die Sequenz dar, die zur Sequenz in 3'-Richtung stromabwärts der ursprünglichen Domäne in Gen I passt, während der dicke Schwanz zur 3'-terminalen Sequenz der Austauschdomäne in Gen II passt.
Der Primer e repräsentiert das 5'-Ende der Domäne in Gen II, während f das andere Ende repräsentiert. Der dünne Schwanz im Primer f stellt die Sequenz dar, die zur Sequenz in 3'-Richtung stromabwärts der ursprünglichen Domäne in Gen I passt.
10. Relative Änderungen in der Aktivität auf 18:0- und 18:1-Substrate von mutanten Garm-FatA1-Thioesterasen im Vergleich zu Wildtyp-Garm-FatA1-Thioesterasen sind gezeigt.
11. Spezifische Aktivitäten von mutanten Garm-FatA1-Thioesterasen auf 16:0-, 18:0- und 18:1-Acyl-ACP-Substrate sind angegeben.
12. Ein Abgleich der Thioesterasen Garm-FatA1 und Uc-FatB1 als Vertreter von FatA- und FatB-Thioesterasen allgemein wird gezeigt. Einzigartige, partiell homologe und hochgradig homologe Bereiche in den beiden Klassen von Thioesterasen sind angegeben.
13A. Wildtyp und chimäre Mutanten von FatA und FatB sind dargestellt. Die Ergebnisse der Aktivitäts- und Spezifitätsanalysen werden angegeben. Die Bedeutung der verschiedenen Schraffierungen ist gemäß dem in 12 angegebenen Schlüssel.
13B. FatA- und FatB-Rekombinationsmutanten sind dargestellt. Die Ergebnisse von Aktivitäts- und Spezifitätsanalysen sind angegeben. Die Bedeutung der verschiedenen Schraffierungen ist gemäß dem in 12 angegebenen Schlüssel.
14. Histogrammdarstellungen von Fettsäureanalysen von Samen von B.-napus-Quantum-Pflanzen, die mit pCGN5255 und pCGN5274 transformiert sind, sind angegeben.
15. Eine Fettsäurezusammensetzungsanalyse von 5255-Transformanten ist in 15A angegeben. Eine Fettsäurezusammensetzungsanalyse von 5274-Transformanten ist in 15B angegeben.
16. Eine Fettsäurezusammensetzungsanalyse von 5290-Transformanten ist in 16A angegeben. Eine Fettsäurezusammensetzungsanalyse von 5291-Transformanten ist in 16B angegeben.
Eine Fettsäurezusammensetzungsanalyse von 5255-Transformanten ist in 16C angegeben.
Eine Fettsäurezusammensetzungsanalyse von 5266-Transformanten ist in 16D angegeben.
Kurzbeschreibung der Erfindung
Durch diese Erfindung werden gentechnisch veränderte Pflanzen-Acyl-ACP-Thioesterasen bereitgestellt, die eine geänderte Substratspezifität in Bezug auf die von der Pflanzen-Thioesterase hydrolysierten Acyl-ACP-Substrate im Vergleich zur nativen Acyl-ACP-Thioesterase zeigen, wobei die Wildtyp-Thioesterase eine Mangostan-Garm-FatA1-Thioesterase ist und wobei die gentechnisch veränderte Thioesterase eine oder mehrere Substitutionen enthält, die aus S188A, S307A, G185A und V270A ausgewählt sind, wobei die Aminosäurenummerierung der Mangostan-Garm-FatA1-Thioesterase auf die in 1 gezeigte Consensusnummerierung bezogen ist. Verfahren zu ihrer Herstellung umfassen die folgenden Schritte: (1) Modifizieren einer Gensequenz, die ein Pflanzen-Thioesterase-Protein codiert, das zur Modifikation unter Bildung von einer oder mehreren modifizierten Thioesterase-Gensequenzen vorgesehen ist, wobei die modifizierten Sequenzen gentechnisch veränderte Acyl-ACP-Thioesterasen codieren, die Substitutionen von einem oder mehreren Aminosäureresten im reifen Teil der betreffenden Pflanzen-Thioesterase aufweisen; (2) Exprimieren der modifizierten codierenden Sequenzen in einer Wirtszelle, wodurch gentechnisch veränderte Pflanzen-Thioesterasen entstehen; und (3) Testen der gentechnisch veränderten Pflanzen-Thioesterasen, um diejenigen nachzuweisen, die wünschenswerte Veränderungen in der Substratspezifität aufweisen.
Von besonderem Interesse für Aminosäureveränderungen ist der Teil der C-terminalen zwei Drittel der Pflanzen-Thioesterase und insbesondere der Bereich, der den Aminosäuren 229 bis 285 (Consensusnummerierung der obigen Sequenzen) der Pflanzen-Thioesterase-Sequenzen entspricht, wie sie im Sequenzabgleich von 1 dargestellt sind. Außerdem ist der Bereich von Aminosäure 285–312 von Interesse für die Modifikation der Thioesterase-Substratspezifität gegenüber kürzerkettigen Fettsäuren, wie C8 und C10.
Geeignete Informationen bezüglich potentieller Modifikationsstellen bei einer betreffenden Thioesterase können durch Vergleich von verwandten Pflanzen-Acyl-ACP-Thioesterase-Aminosäuresequenzen erhalten werden, wobei die miteinander verglichenen Thioesterasen unterschiedliche Hydrolyseaktivitäten zeigen. Vergleiche von Pflanzen-Thioesterase-Aminosäuresequenzen mit wenigstens 75% Sequenzidentität im reifen Proteinbereich sind in dieser Hinsicht besonders nützlich. Auf diese Weise können Aminosäurereste oder Peptiddomänen, die in den verwandten Thioesterasen unterschiedlich sind, für die Mutagenese ausgewählt werden.
Weitere Verfahren zum Auswählen von Aminosäuren oder Peptiddomänen für die Modifikation umfassen die Analyse von Thioesterase-Proteinsequenzen für vorausgesagte Wirkungen von Substitutionen, Insertionen oder Deletionen auf die Flexibilität und/oder Sekundärstruktur der betreffenden Thioesterase.
Außerdem können geeignete Thioesterase-Genmutationen durch statistische Mutation von Pflanzen-Acyl-ACP-Thioesterase codierenden Sequenzen und anschließende Analyse der Thioesterase-Aktivität oder Fettsäurezusammensetzung zum Nachweis von Veränderungen in der Substratspezifität gefunden werden.
Zur Herstellung einer gentechnisch veränderten Thioesterase kann eine DNA-Sequenz, die die Thioesterase codiert, durch Domänenaustausch oder Mutagenese, entweder statistisch oder ortsspezifisch, zur Einführung von Aminosäuresubstitutionen, -insertionen oder -deletionen verändert werden. Dann können die DNA-Sequenzen in Wirtszellen zur Produktion von gentechnisch veränderten Thioesterasen und zur Analyse der resultierenden Fettsäurezusammensetzungen exprimiert werden. Auf diese Weise hergestellte gentechnisch veränderte Thioesterasen werden auch getestet, um Wirkungen der Modifikationen der Aminosäuresequenz auf die Substratspezifität der Thioesterase zu bestimmen. Auf diese Weise können neue Thioesterasen gefunden werden, die eine Vielzahl von Profilen bezüglich der Kohlenstoff-Kettenlängen der Acyl-ACP-Substrate, die hydrolysiert werden können, oder bezüglich der relativen Aktivität der Thioesterase auf Acyl-ACP-Substrate mit unterschiedlicher Kohlenstoff-Kettenlänge zeigen.
DNA-Sequenzen und Konstrukte für die Expression von gentechnisch veränderten Thioesterasen sowie die daraus hergestellten Thioesterasen gelten ebenfalls als in den Umfang der hier beschriebenen Erfindung fallend. Solche DNA-Sequenzen können für die Expression der gentechnisch veränderten Thioesterasen in Wirtszellen zur Modifikation der Fettsäurezusammensetzung verwendet werden. Von besonderem Interesse in der vorliegenden Erfindung sind DNA-Konstrukte für die Expression von gentechnisch veränderten Thioesterasen in Pflanzenzellen, insbesondere in Pflanzensamenzellen von Ölpflanzen. Infolge der Expression solcher Konstrukte kann Pflanzen-Triglyceridöl hergestellt werden, wobei die Zusammensetzung des Öls die veränderte Substratspezifität der gentechnisch veränderten Thioesterasen widerspiegelt. Pflanzenzellen, Samen und Pflanzen, die die hier bereitgestellten Konstrukte umfassen, sind also alle von der vorliegenden Erfindung mitumfasst, ebenso wie Pflanzenöle, die aus den Pflanzensamen gewonnen werden können.
Zum Beispiel kann eine C12-bevorzugende Pflanzen-Acyl-ACP-Thioesterase, wie sie hier beschrieben wird, so verändert werden, dass man eine Pflanzen-Thioesterase erhält, die ungefähr die gleiche Aktivität auf C14- und C12-Substrate hat. Die weitere Modifikation des C12-Enzyms ergibt eine Thioesterase, die eine größere Aktivität auf C14- als auf C12-Substrate aufweist.
In der vorliegenden Erfindung werden auch Pflanzen-Acyl-ACP-Thioesterase-Sequenzen von Mangostan (Garcinia mangifera) bereitgestellt.
Ein Mangostan-Thioesterase-Gen, GarmFatA1, zeigt primäre Aktivität auf 18:1-ACP-Substrate, zeigt aber auch eine erhebliche Aktivität auf 18:0-ACP. Was wichtig ist, dieser Klon zeigt keine Spezifität für 16:0-Substrate. Verfahren zum Modifizieren der Spezifität dieser C18:1/C18:0-Pflanzen-Thioesterase werden in der vorliegenden Erfindung ebenfalls bereitgestellt. Insbesondere Mutationen, die das 18:0/18:1-Aktivitätsverhältnis des Mangostan-Klons erhöhen, werden bereitgestellt. Die Verwendung solcher mutierter Mangostan-Thioesterase-Klone für die verstärkte Produktion von 18:0-Fettsäuren in transgenen Pflanzensamen wird angegeben. Solche Verwendungen führen zu verbesserten Pflanzen, Samen und Ölen.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Durch diese Erfindung werden gentechnisch veränderte Pflanzen-Thioesterasen mit veränderter Substratspezifität bereitgestellt. Eine gentechnisch veränderte Pflanzen-Thioesterase dieser Erfindung kann eine beliebige Sequenz von Aminosäuren umfassen, wie ein Protein, Polypeptid oder Peptidfragment, wie es oben definiert ist, das aus einer Pflanzenquelle erhältlich ist und die Fähigkeit zeigt, die Produktion von freien Fettsäuren aus Fettacyl-ACP-Substraten unter Bedingungen, bei denen das Pflanzenenzym reaktiv ist, zu katalysieren. "Bedingungen, bei denen das Enzym reaktiv ist" bedeutet, dass alle notwendigen Bedingungen in einer Umgebung (d.h. Faktoren wie Temperatur, pH-Wert, Abwesenheit hemmender Substanzen), die eine Funktion des Enzyms ermöglichen, zur Verfügung stehen.
Gentechnisch veränderte Pflanzen-Thioesterasen können durch statistische oder spezifische Mutagenese einer Thioesterase codierenden Sequenz hergestellt werden, so dass man eine oder mehrere Aminosäuresubstitutionen in der translatierten Aminosäuresequenz erhält. Alternativ dazu kann eine gentechnisch veränderte Pflanzen-Thioesterase durch Domänenaustausch zwischen verwandten Pflanzen-Thioesterasen hergestellt werden, wobei ausgedehnte Bereiche der nativen Thioesterase-codierenden Sequenz durch den entsprechenden Bereich aus einer anderen Pflanzen-Thioesterase ersetzt werden.
Zielbereiche für den Domänenaustausch können Peptide umfassen, deren Länge im Bereich von fünf oder sechs bis zu Dutzenden Aminosäuren liegt. Im Idealfall kann diese Art von Austausch durch die Anwesenheit von einzigartigen konservierten Restriktionsstellen an den genauen Punkten des Austauschs in den Genen, die beide Proteine codieren, erreicht werden. Oligonucleotidspezifische Mutagenese (Looping) kann angewendet werden, wenn keine geeigneten Restriktionsstellen verfügbar sind, obwohl dieses Verfahren zeitraubend sein kann, wenn große Domänensequenzen ausgetauscht werden sollen. Wie in den folgenden Beispielen beschrieben ist, kann alternativ dazu ein schnelles Verfahren für den Domänenaustausch eingesetzt werden, bei dem es sich um eine Modifikation einer Überlappungsverlängerungstechnik unter Verwendung einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR), wie sie von Horton et al. (BioTechniques (1990) 8: 528–535) beschrieben wurde, handelt. Das gesamte Verfahren kann innerhalb von sechs Stunden (Zeit für zwei PCR-Durchläufe) ohne in-vivo-Manipulation durchgeführt werden. Die Grundlage für das Überlappungsverlängerungsverfahren besteht darin, dass in einer PCR die Primer gut genug zu ihrer Matrizensequenz passen müssen, dass sie die Verlängerung einleiten können, aber sie brauchen nicht genau zu passen, insbesondere zum 5'-Ende hin. Tatsächlich werden PCR-Primer mit 5'-Überhängen (nicht genau passenden Sequenzen) routinemäßig verwendet. Der auf PCR beruhende Domänenaustausch ist für Anwendungen vorgesehen, bei denen die Domäne etwa sechs Aminosäuren oder weniger enthält (Kurzdomänenaustausch) oder bei denen Domänen, die eine viel größere Zahl von Aminosäuren enthalten, ausgetauscht werden sollen (Langdomänenaustausch).
Veränderte Substratspezifitäten einer gentechnisch veränderten Thioesterase können sich im Vorliegen von Hydrolyseaktivität auf ein Acyl-ACP-Substrat mit einer besonderen Kettenlänge, das durch das native Thioesterase-Enzym nicht hydrolysiert wird, widerspiegeln. Das neu erkannte Acyl-ACP-Substrat kann sich auf verschiedenerlei Weise von nativen Substraten des Enzyms unterscheiden, wie etwa dadurch, dass es eine größere oder geringere Kohlenstoff-Kettenlänge hat (was sich gewöhnlich in der Addition oder Deletion von einer oder mehreren C2-Einheiten widerspiegelt), dass es einen größeren oder kleineren Sättigungs grad hat, oder durch die Anwesenheit einer Methylgruppe, wie bei bestimmten Fettsäuren, die in Pflanzenzellen gewöhnlich nicht vorhanden sind, d.h. Iso- und Anti-Isofettsäuren. Alternativ dazu kann sich die veränderte Substratspezifität auch in einer Modifikation der relativen Hydrolyseaktivitäten auf zwei oder mehr Acyl-ACP-Substrate mit unterschiedlicher Kettenlänge und/oder unterschiedlichem Sättigungsgrad widerspiegeln.
DNA- und Aminosäuresequenzinformationen für mehr als dreißig Pflanzen-Acyl-ACP-Thioesterasen stehen jetzt zur Verfügung, und diese Sequenzen können verwendet werden, um wünschenswerte Bereiche für die Modifikation zu identifizieren, um Sequenzen für die Expression von genetisch veränderten Thioesterasen herzustellen.
Pflanzen-Thioesterasen können anhand von Sequenzhomologie in zwei Klassen eingeteilt werden. Alle diese Pflanzen-Thioesterasen enthalten ein Transitpeptid mit einer Länge von 60 bis 80 Aminosäuren für die Plastiden-Zielsteuerung. Die Transitpeptide weisen nur eine geringe Homologie zwischen den Spezies auf, während die reifen Proteinbereiche (ohne das Transitpeptid) eine erhebliche Identität der Aminosäuresequenzen zeigen.
Die erste Klasse, Klasse I (oder FatA), umfasst Langkettiges-Acyl-ACP-Thioesterasen mit einer primären Aktivität auf 18:1-ACP. 18:1-ACP ist die unmittelbare Vorstufe der meisten Fettsäuren, die man in Phospholipiden und Triglyceriden findet, die auf dem eukaryontischen Stoffwechselweg synthetisiert werden. Diese Klasse von Thioesterasen wurde im Wesentlichen in allen bisher untersuchten Pflanzenquellen gefunden, und es wird vorgeschlagen, dass es sich um ein wesentliches "Haushalts"-Enzym handelt (Jones et al., a.a.O.), das für die Membran-Biosynthese erforderlich ist. Beispiele für Klasse-I-Thioesterasen aus Färberdistel, Cuphea hookeriana und Brassica rapa (campestris), die eine primäre Aktivität auf 18:1-ACP-Substrat aufweisen, sind beschrieben worden (WO 92/20236 und WO 94/10288). Weitere 18:1-Thioesterasen wurden beschrieben bei Arabidopsis thaliana (Dormann et al. (1995) Arch. Biochem. Biophys. 316: 612–618), Brassica napus (Loader et al. (1993) Plant Mol. Biol. 23: 769–778) und Koriander (Dormann et al. (1994) Biochem. Biophys. Acta 1212: 134–136). Eine ähnliche 18:1-ACP-spezifische Klasse-I-Thioesterase (GarmFatA2) wurde in sich entwickelnden Embryos von Mangostan (Garcinia mangifera) gefunden und wird hier beschrieben. Es wurde berichtet, dass eine Klasse-I-Thioesterase aus Soja (WO 92/11373) eine 10- bzw. 96fache Erhöhung in der 16:0-ACP- und 18:1-ACP-Aktivität bei Expression in E. coli und eine geringere (3–4fache) Erhöhung der 18:0-Aktivität ergab). Die reifen Proteinbereiche von Klasse-I-Pflanzen-Thioesterasen sind hochgradig homolog und zeigen mehr als 80% Sequenzidentität.
Außerdem wurde eine andere Mangostan-Klasse-I-Thioesterase (GarmFatA1), die ebenfalls hier beschrieben ist, gefunden, die eine primäre Thioesterase-Aktivität auf 18:1-ACP-Substrate zeigt (100fache Erhöhung bei Expression in E. coli), aber auch eine selektive Aktivität auf 18:0-ACP gegenüber 16:0-ACP zeigt. Die 18:0-Aktivität von GarmFatA1 beträgt ungefähr 25% der 18:1-Aktivität, während bei den meisten bisher analysierten Klasse-I-Thioesterasen die 18:1-Aktivität in hohem Maße vorherrschend ist, wobei die Aktivität auf 16:0- und 18:0-Substrate bei weniger als 5% der 18:1-Aktivitätsniveaus nachweisbar ist.
Eine zweite Klasse von Pflanzen-Thioesterasen, Klasse-II-(oder FatB)-Thioesterasen, umfasst Enzyme, die Fettsäuren mit kürzeren Kettenlängen, C8:0 bis C14:0 (mittelkettige Fettsäuren) sowie C16:0 verwerten. Klasse-II-Thioesterasen katalysieren vorzugsweise die Hydrolyse von Substraten, die gesättigte Fettsäuren enthalten. Klasse-II-(oder FatB)-Thioesterasen wurden aus Kalifornischem Berglorbeer, Ulme, Cuphea hookeriana, Cuphea palustris, Cuphea lanceolata, Muskat, Arabidopsis thaliana, Mango, Lauch und Campher isoliert. Die reifen Proteinbereiche von Klasse-II-Pflanzen-Thioesterasen sind ebenfalls hochgradig homolog und zeigen 70–80% Sequenzidentität.
Eines der Merkmale von Klasse-II-Thioesterasen ist die Anwesenheit eines relativ hydrophoben Bereichs von ungefähr 40 Aminosäuren im N-terminalen Bereich der reifen Proteine. Dieser hydrophobe Bereich ist in 18:1-ACP-Thioesterasen nicht zu finden und hat keine sichtbare Wirkung auf die Enzymaktivität. Die rekombinante Expression einer Berglorbeer-Klasse-II-Thioesterase mit oder ohne diesen Bereich zeigte in vitro identische Aktivitätsprofile (Jones et al., a.a.O.).
Wie in den folgenden Beispielen ausführlicher gezeigt wird, kann die Acyl-ACP-Substratspezifität von Pflanzen-Thioesterasen durch verschiedene Aminosäureänderungen an der Proteinsequenz, wie Aminosäuresubstitutionen im reifen Proteinteil der Pflanzen-Thioesterasen, modifiziert werden. Eine modifizierte Substratspezifität kann anhand der Expression der genetisch veränderten Pflanzen-Thioesterasen in E. coli und Nachweis der Enzymaktivität nachgewiesen werden.
Eine modifizierte Substratspezifität kann durch eine Verschiebung der Acyl-ACP-Substratpräferenz angezeigt werden, so dass die genetisch veränderte Thioesterase jetzt in der Lage ist, ein Substrat zu hydrolysieren, das von der nativen Thioesterase nicht erkannt wird. Das neu erkannte Substrat kann sich von Substraten des nativen Enzyms durch die Kettenlänge und/oder den Sättigungsgrad des Fettacylteils des Substrats unterscheiden. Alternativ dazu kann sich eine modifizierte Substratspezifität auch in einer Verschiebung der relativen Thioesterase-Aktivität auf zwei oder mehr Substrate der nativen Thioesterase widerspiegeln, so dass eine genetisch veränderte Thioesterase eine andere Reihenfolge der Präferenz für die Acyl-ACP-Substrate aufweist.
Zum Beispiel kann eine Pflanzen-Thioesterase mit einer primären Hydrolyseaktivität auf C12-Substrat und einer geringeren Aktivität auf C14-Substrat so modifiziert werden, dass eine gentechnisch veränderte Thioesterase erzeugt wird, die eine erhöhte Aktivität auf C14 aufweist, zum Beispiel so, dass die gentechnisch veränderte Thioesterase ungefähr die gleiche Aktivität auf C12- und C14-Substrate hat. Ähnlich können solche Pflanzen-C12-Thioesterasen auch weiter so modifiziert werden, dass sie eine genetisch veränderte Thioesterase mit primärer Aktivität auf C14-Substrate und wenig oder keiner Aktivität auf C12-Substrate erzeugen. Alternativ dazu kann eine Pflanzen-Thioesterase auch so modifiziert werden, dass die relative Aktivität gegenüber einem Substrat mit einem höheren oder niedrigeren Sättigungsgrad verändert wird. Zum Beispiel kann eine Klasse-I-(18:1)-Thioesterase so modifiziert werden, dass die relative Aktivität auf C18:0-Substrate im Vergleich zur Aktivität des Enzyms auf andere Substrate, wie C18:1 und C16:0, zunimmt. Beispiele für diese Arten von Thioesterase-Modifikationen werden in den folgenden Beispielen angegeben. Eine weitere Modifikation von Pflanzen-Thioesterasen ist ebenfalls wünschenswert und kann unter Verwendung der hier bereitgestellten Verfahren und Sequenzen erhalten werden. Zum Beispiel können Pflanzen-Thioesterasen so modifiziert werden, dass sich die enzymatische Aktivität hin zu einer Hydrolyse kürzerkettiger Fettsäuren, wie C8 und C10, verschiebt. Ein Vergleich von nahe verwandten Thioesterase-Sequenzen, wie den hier angegebenen C.-palustris-C8/10-, der C.-palustris-C14- und der C.-hookeriana-C8/10-Thioesterase-Sequenz, können verwendet werden, um potentielle Zielaminosäurereste für die Veränderung der Thioesterase-Spezifität zu identifizieren.
Voraussagen der Sekundärstruktur können verwendet werden, um Aminosäuresubstitutionen zu identifizieren, die wahrscheinlich einen Einfluss auf die Sekundärstruktur des Thioesterase-Proteins haben.
Die Expression von genetisch veränderten Thioesterasen mit veränderten Substratspezifitäten in Wirtszellen und die Analyse der resultierenden Fettsäurezusammensetzungen zeigt, dass sich die veränderten Substratspezifitäten der genetisch veränderten Thioesterasen in den Fettsäurezusammensetzungsprofilen der Wirtszellen widerspiegeln. Dies ist bedeutsam, da die Enzymaktivität in vivo sequentielle Wechselwirkungen oder Parameter, wie die Lebensdauer und Faltungs-/Entfaltungs-Geschwindigkeiten, hätte beinhalten können, die sich bei den in-vitro-Aktivitätsassays nicht widergespiegelt hätten. Die Hauptlipidkomponenten von E.-coli-Membranen sind Phosphatidylethanolamin und Phosphatidylglycerin, die vorwiegend langkettige Fettacyl-Struktureinheiten enthalten. Die rekombinante Expression von nativer Berglorbeer-Thioesterase-cDNA in fadD-Zellen stellt das bakterielle Typ-II-Fettsäure-Synthase-System von langkettiger zu mittelkettiger Produktion um, und ähnliche Ergebnisse werden bei der Expression von nativer Berglorbeer-Thioesterase in Samen von transgenen Pflanzen erhalten (Voelker et al. (1994) a.a.O.; Voelker et al. (1992) a.a.O.). So können in-vivo-Daten von E. coli verwendet werden, um die Wirkungen der Expression von genetisch veränderten Thioesterasen in transgenen Pflanzen vorherzusagen.
Die genetische Veränderung von Pflanzen-FatA-Thioesterasen wird hier ebenfalls beschrieben. Insbesondere werden Mutationen gefunden, die mutante Garm-FatA1-Thioesterasen ergeben, die sowohl eine größere spezifische Aktivität als auch eine wünschenswertere relative Aktivität auf 18:0-Substrate gegenüber 18:1-Substraten haben. Zum Beispiel hat eine Garm-FatA1-Mutante D261K, die einen Lysinrest (K) anstelle des Aspartatrests, der im Wildtypklon auf Position 261 vorhanden ist (die Nummerierung ist so, wie sie in der Consensuszeile über den Sequenzen im Sequenzvergleich von 1 angegeben ist), aufweist, eine erhöhte Aktivität auf 18:0- gegenüber 18:1-Substraten. Doppel- und Dreifachmutanten, die die D261K-Mutation enthalten, haben eine noch größere Aktivität auf 18:0.
Andere Mutationen, die die 18:0-Aktivität von Mangostan-Garm-FatA1-Thioesterase erhöhen, sind hier beschrieben und umfassen S188A, S370A, G185A und V270A. Diese mutanten Thioesterasen sowie Mutanten mit verschiedenen Kombinationen dieser Mutationen sind von besonderem Interesse zur Verwendung bei Pflanzen-Gentechnik-Anwendungen zur Erhöhung des Gehalts an Stearat(18:0)-Fettsäure in Ölpflanzen. Wie in den folgenden Beispielen ausführlicher beschrieben wird, haben zum Beispiel Pflanzen, die so transformiert wurden, dass sie eine Garm-FatA1-Doppelmutante, S188A/V270A, exprimieren, bei der ein Alaninrest sowohl anstelle des Serinrests auf Position 188 als auch anstelle des Valinrests auf Position 270 vorhanden ist (die Nummerierung ist so, wie sie in der Consensuszeile über den Sequenzen im Sequenzvergleich von 1 angegeben ist), signifikant erhöhte Stearatkonzentrationen. Transgene Pflanzen mit erhöhten Konzentrationen an C18:0-Fettsäuren als Ergebnis der Expression von Garm-FatA1-Thioesterase in Brassica-napus-Samen werden in WO 97/12047 beschrieben.
Die mutanten Thioesterasen in der vorliegenden Erfindung können verwendet werden, um noch größere Zunahmen des Stearatgehalts in transgenen Pflanzensamen zu erhalten, wie in den folgenden Beispielen ausführlicher beschrieben ist. Stearatreiche Pflanzenöle sind wünschenswert für die Verwendung in Anwendungen wie unhydrierten ("transfreien") Margarinen und Kakaobutterersatz, wie in WO 97/12047 beschrieben ist, oder in Anwendungen mit flüssigem Backfett, wie in der gleichzeitig anhängigen US-Anmeldung Serial No. 08/843,400 mit dem Titel "Food Products Containing Structured Triglycerides" beschrieben ist, die am 15. April 1997 eingereicht wurde.
Wie man also sieht, können als Ergebnis von Modifikationen der Substratspezifität von Pflanzen-Thioesterasen die relativen Mengen der in einer Zelle, wo verschiedene Substrate zur Verfügung stehen, erzeugten Fettsäuren verändert werden. Weiterhin können Moleküle, die aus verfügbaren freien Fettsäuren, wie Pflanzensamen-Triglyceriden, gebildet werden, als Ergebnis der Expression von gentechnisch veränderten Thioesterasen mit veränderten Substratspezifitäten ebenfalls verändert werden.
Die Nucleinsäure- oder Aminosäuresequenzen, die eine gentechnisch veränderte Acyl-ACP-Thioesterase dieser Erfindung codieren, können auf vielerlei Weise mit anderen nichtnativen ("heterologen") Sequenzen kombiniert werden. "Heterologe" Sequenzen bedeutet jede Sequenz, die man natürlicherweise nicht mit der Pflanzen-Acyl-ACP-Thioesterase verbunden findet, einschließlich zum Beispiel Kombinationen von Nucleinsäuresequenzen aus derselben Pflanze, die man natürlicherweise nicht miteinander verbunden findet.
Für die Expression in Wirtszellen wird eine Sequenz, die eine gentechnisch veränderte Pflanzen-Thioesterase codiert, in einem DNA-Konstrukt miteinander kombiniert, das in 5'→3'-Richtung der Transcription einen Transcriptionsstart-regulierenden Bereich, der die Transcription und Translation in einer Wirtszelle fördern kann, die DNA-Sequenz, die die gentechnisch veränderte Pflanzen-Acyl-ACP-Thioesterase codiert, und einen Transcriptions- und Translationsterminationsbereich aufweist.
DNA-Konstrukte können Preprozessierungssequenzen, wie Transitpeptidsequenzen, enthalten oder auch nicht. Transitpeptidsequenzen erleichtern die Abgabe des Proteins an eine gegebene Organelle und werden beim Eintritt in die Organelle vom Aminosäureteil abgespalten, wobei die "reife" Sequenz freigesetzt wird. Die Verwendung der Pflanzen-Acyl-ACP-Thioesterase-Vorläufer-DNA-Sequenz ist in Pflanzenzellen-Expressionscassetten bevorzugt. Andere Plastiden-Transitpeptidsequenzen, wie ein Transitpeptid von Samen-ACP, können ebenfalls eingesetzt werden, um Pflanzen-Acyl-ACP-Thioesterasen in verschiedene interessierende Organellen zu transportieren.
So können in verschiedenen Konstrukten gentechnisch veränderte Pflanzen-Thioesterase-Sequenzen verwendet werden, wie etwa für die Expression der interessierenden Thioesterase in einer Wirtszelle zur Gewinnung oder Untersuchung des Enzyms in vitro oder in vivo. Zu den potentiellen Wirtszellen gehören sowohl prokaryontische als auch eukaryontische Zellen. Eine Wirtszelle kann je nach Verwendungszweck einzellig sein oder sich in einem mehrzelligen differenzierten oder undifferenzierten Organismus befinden. Zellen dieser Erfindung können daran erkannt werden, dass sie eine gentechnisch veränderte Pflanzen-Acyl-ACP-Thioesterase enthalten.
Je nach dem Wirt werden die regulatorischen Bereiche variieren; dazu gehören Bereiche aus viralen, Plasmid- oder chromosomalen Genen. Für die Expression in prokaryontischen oder eukaryontischen Mikroorganismen, insbesondere einzelligen Wirten, kann eine Vielzahl von konstitutiven oder regulierbaren Promotoren eingesetzt werden. Die Expression in einem Mikroorganismus kann eine leicht verfügbare Quelle für das gentechnisch veränderte Pflanzenenzym liefern und ist nützlich, um die besonderen Merkmale solcher Enzyme zu identifizieren. Zu den Transcriptionsstartbereichen, die beschrieben wurden, gehören Bereiche aus bakteriellen und Hefewirten, wie E. coli, B. subtilis, Saccharomyces cerevisiae, einschließlich solcher von den Genen von β-Galactosidase, T7-Polymerase, Tryptophan E.
Der größte Teil der Konstrukte wird regulatorische Bereiche beinhalten, die in Pflanzen funktionieren und für eine Expression der Pflanzen-Acyl-ACP-Thioesterase sorgen, was somit zur Modifikation der Fettsäurezusammensetzung in Pflanzenzellen führt. Das offene Leseraster, das für die Pflanzen-Acyl-ACP-Thioesterase codiert, wird an seinem 5'-Ende mit einem den Transcriptionsstart regulierenden Bereich verbunden, wie der Wildtypsequenz, die man natürlicherweise 5'-stromaufwärts von dem Thioesterase-Strukturgen findet. Es stehen zahlreiche andere Transcriptionsstartbereiche zur Verfügung, die für eine Vielzahl von konstitutiven oder regulierbaren, z.B. induzierbaren, Transcriptionen der Strukturgenfunktionen sorgen. Zu den Transcriptionsstartbereichen, die für Pflanzen verwendet werden, gehören solche Bereiche, die mit den Strukturgenen, wie für Nopalin- und Mannopin-Synthase, oder mit Napin verbunden sind, sowie ACP-Promotoren.
Die Transcriptions/Translations-Startbereiche, die solchen Strukturgenen entsprechen, findet man unmittelbar 5'-stromaufwärts von den jeweiligen Startcodons. In Ausführungsformen, bei denen die Expression des gentechnisch veränderten Thioesterase-Proteins in einem Pflanzenwirt gewünscht wird, wird die Verwendung eines Teils des nativen Pflanzen-Acyl-ACP-Thioesterase-Gens in Betracht gezogen. Es kann nämlich der ganze oder ein Teil der 5'-stromaufwärts liegenden nichtcodierenden Bereiche (Promotor) zusammen mit 3'-stromabwärts liegenden nichtcodierenden Bereichen eingesetzt werden. Wenn ein anderer Promotor gewünscht wird, wie ein bezüglich des interessierenden Pflanzenwirts nativer Promotor oder ein modifizierter Promotor, d.h. mit Transcriptionsstartbereichen, die von einer Genquelle abgeleitet sind, und Translationsstartbereichen, die von einer anderen Genquelle abgeleitet sind (verstärkte Promotoren), wie Doppel-355-CaMV-Promotoren, können die Sequenzen unter Verwendung von Standardtechniken miteinander verbunden werden.
Wenn bei solchen Anwendungen 5'-stromaufwärts liegende nichtcodierende Bereiche von anderen Genen erhalten werden, die während der Samenreifung reguliert werden, sind solche erwünscht, die vorzugsweise in Pflanzenembryonalgewebe exprimiert werden, wie von ACP und Napin abgeleitete Transcripti onsstart-regulierende Bereiche. Solche "samenspezifischen Promotoren" können im Einklang mit den Lehren von US-Anmeldung Serial Nr. 07/147,781, eingereicht am 25.1.88 (jetzt US-Anmeldung Serial Nr. 07/550,804, eingereicht am 9.7.90), und US-Anmeldung Serial Nr. 07/494,722, eingereicht am oder etwa am 16. März 1990, mit dem Titel "Novel Sequences Preferentially Expressed in Early Seed Development and Methods Related Thereto" erhalten und verwendet werden.
Transcriptionsstartbereiche, die präferentiell in Samengewebe exprimiert werden, d.h. die in anderen Pflanzenteilen nicht nachweisbar sind, gelten für Fettsäuremodifikationen als wünschenswert, um zellzerstörende oder nachteilige Wirkungen des Genprodukts zu minimieren.
Regulatorische Transcriptionsterminationsbereiche können in DNA-Konstrukten dieser Erfindung ebenfalls vorhanden sein. Transcriptionsterminationsbereiche können durch die DNA-Sequenz, die die Pflanzen-Acyl-ACP-Thioesterase codiert, oder einen zweckmäßigen Transcriptionsterminationsbereich, der von einer anderen Genquelle abgeleitet ist, zum Beispiel den Transcriptionsterminationsbereich, der natürlicherweise mit dem Transcriptionsstartbereich verbunden ist, bereitgestellt werden. Wenn der Transcriptionsterminationsbereich aus einer anderen Genquelle stammt, enthält er wenigstens etwa 0,5 kb, vorzugsweise etwa 1–3 kb, der Sequenz in 3'-Richtung vom Strukturgen, von dem der Terminationsbereich abgeleitet ist.
Pflanzenexpressions- oder -transcriptionskonstrukte, die eine Pflanzen-Acyl-ACP-Thioesterase als interessierende DNA-Sequenz aufweisen, können in einer Vielzahl von Pflanzen eingesetzt werden, insbesondere Pflanzen, die an der Herstellung von Pflanzenölen für Nahrungs- und industrielle Verwendungen beteiligt sind. Am meisten bevorzugt sind in gemäßigten Breiten angebaute Ölpflanzen. Zu den interessierenden Pflanzen gehören unter anderem Raps (Canola und erucasäurereiche Sorten), Sonnenblume, Färberdistel, Baumwolle, Cuphea, Soja, Erdnuss, Kokos- und Ölpalme sowie Mais. Je nach dem Verfahren zur Einführung der rekombinanten Konstrukte in die Wirtszelle können andere DNA-Sequenzen erforderlich sein. Was wichtig ist, diese Erfindung lässt sich gleichermaßen auf Zweikeimblättrige wie auf Einkeimblättrige Spezies anwenden und wird leicht auf neue und/oder verbesserte Transformations- und Regulationstechniken anwendbar sein.
Das Verfahren der Transformation ist nicht entscheidend, und zur Zeit stehen verschiedene Verfahren zur Pflanzentransformation zur Verfügung. Wenn neuere Verfahren zur Transformation von Kulturpflanzen verfügbar sind, können sie hier direkt angewendet werden. Zum Beispiel können viele Pflanzenspezies, die natürlicherweise anfällig für eine Agrobacterium-Infektion sind, durch Verfahren der Agrobacterium-vermittelten Transformation mit dreiteiligen oder binären Vektoren erfolgreich transformiert werden. Außerdem wurden Techniken der Mikroinjektion, DNA-Teilchenbombardierung und Elektroporation entwickelt, die die Transformation verschiedener Einkeimblättriger und Zweikeimblättriger Pflanzenspezies ermöglichen.
Bei der Entwicklung des DNA-Konstrukts werden die verschiedenen Komponenten des Konstrukts oder Fragmente davon normalerweise in einen zweckmäßigen Klonierungsvektor eingesetzt, der zur Replikation in einem bakteriellen Wirt, z.B. E. coli, befähigt ist. Es gibt zahlreiche Vektoren, die in der Literatur beschrieben wurden. Nach jeder Klonierung kann das Plasmid isoliert und einer weiteren Manipulation, wie Restriktionsspaltung, Insertion von neuen Fragmenten, Ligierung, Deletion, Insertion oder Resektion, unterzogen werden, um die Komponenten der gewünschten Sequenz maßzuschneidern. Sobald das Konstrukt fertiggestellt ist, kann es dann zur weiteren Manipulation im Einklang mit der Art der Transformation der Wirtszelle auf einen geeigneten Vektor übertragen werden.
Das DNA-Konstrukt wird normalerweise auch ein Strukturgen umfassen, das die notwendigen regulatorischen Bereiche für die Expression in einem Wirt aufweist und für eine Selektion der transformanten Zellen sorgt. Das Gen kann für eine Resistenz gegen ein cytotoxisches Agens, z.B. gegen ein Antibiotikum, Schwermetall oder Toxin, für eine Komplementierung, die einem auxotrophen Wirt Prototrophie verleiht, oder virale Immunität sorgen. Je nach der Anzahl der verschiedenen Wirtsspezies werden das Expressionskonstrukt oder seine Komponenten eingeführt, ein oder mehrere Marker können eingesetzt werden, wobei für die verschiedenen Wirte unterschiedliche Bedingungen für die Selektion verwendet werden.
Es sei angemerkt, dass die Degeneration des DNA-Codes dafür sorgt, dass einige Codonsubstitutionen von DNA-Sequenzen ohne irgendeine entsprechende Modifikation der Aminosäuresequenz zulässig sind.
Die Art und Weise, in der das DNA-Konstrukt in den Pflanzenwirt eingeführt wird, ist für diese Erfindung nicht entscheidend. Jedes Verfahren, das für eine effiziente Transformation sorgt, kann eingesetzt werden. Zu den verschiedenen Verfahren der Pflanzenzelltransformation gehören die Verwendung von Ti- oder Ri-Plasmiden, die Mikroinjektion, Elektroporation, DNA-Teilchenbombardierung, Liposomenfusion und DNA-Bombardierung.
In vielen Fällen wird es wünschenswert sein, dass das Konstrukt auf einer oder beiden Seiten mit T-DNA-Borderbereichen flankiert ist, insbesondere am linken und rechten Rand, insbesondere am rechten Rand. Dies ist insbesondere dann nützlich, wenn bei dem Konstrukt A. tumefaciens oder A. rhizogenes als Transformationsmethode verwendet wird, doch können die T-DNA-Flankierungen auch bei anderen Transformationsmethoden verwendet werden.
Wenn Agrobacterium für die Pflanzenzelltransformation verwendet wird, kann ein Vektor verwendet werden, welcher für eine homologe Rekombination mit T-DNA oder dem im Agrobacterium-Wirt vorhandenen Ti- oder Ri-Plasmid in den Agrobacterium-Wirt eingeführt werden kann. Das Ti- oder Ri-Plasmid, das die T-DNA für die Rekombination enthält, kann funktionell (armed; zur Bewirkung einer Gallenbildung befähigt) oder unschädlich gemacht (disarmed; zur Bewirkung einer Gallenbildung nicht befähigt) sein, wobei letzteres zulässig ist, solange in dem transformierten Agrobacterium-Wirt die vir-Gene vorhanden sind. Das funktionelle Plasmid kann ein Gemisch von normalen Pflanzenzellen und Gallengewebe ergeben.
In manchen Fällen, wenn Agrobacterium als Überträger zum Transformieren von Pflanzenzellen verwendet wird, wird das von den T-DNA-Borderbereichen flankierte Expressionskonstrukt in einen Vektor mit einem breiten Wirtsspektrum eingesetzt, wobei Vektoren mit einem breiten Wirtsspektrum in der Literatur beschrieben sind. Häufig verwendet werden pRK2 oder Derivate davon. Siehe zum Beispiel Ditta et al., PNAS USA (1980) 77: 7347–7351, und EP-A-0 120 515.
Mit eingeschlossen im Expressionskonstrukt und der T-DNA sind ein oder mehrere Marker, die eine Selektion von transformiertem Agrobacterium und transformierten Pflanzenzellen ermöglichen. Zur Verwendung mit Pflanzenzellen wurden mehrere Marker entwickelt, wie Gene für die Resistenz gegen Chloramphenicol, das Aminoglycosid G418 oder Hygromycin.
Der besondere eingesetzte Marker ist für diese Erfindung nicht wesentlich, wobei je nach dem besonderen Wirt und der Art der Konstruktion der eine oder andere Marker bevorzugt ist.
Sobald eine transgene Pflanze erhalten wird, die Samen mit einer modifizierten Fettsäurezusammensetzung erzeugen kann, können traditionelle Pflanzenzuchttechniken einschließlich Mutageneseverfahren eingesetzt werden, um die Fettsäurezusammensetzung weiter zu manipulieren. Alternativ dazu kann durch Gentechnik eine zusätzliche fremde fettsäuremodifizierende DNA-Sequenz eingeführt werden, um die Fettsäurezusammensetzung weiter zu manipulieren. Es sei angemerkt, dass das Transformationsverfahren für diese Erfindung nicht entscheidend ist. Entscheidend ist jedoch die Verwendung von gentechnischen Pflanzentransformationsverfahren, d.h. die Fähigkeit, eine einzige gewünschte DNA-Sequenz einzusetzen. Bisher war die Fähigkeit zum Modifizieren der Fettsäurezusammensetzung von Pflanzenölen auf die Einführung von Eigenschaften, die bei Pflanzenkreuzungen geschlechtlich übertragen werden konnten, oder durch Mutagenese erzeugten lebensfähigen Eigenschaften beschränkt. Durch die Verwendung von gentechnischen Methoden, die die Einführung von interspezifischer genetischer Information erlauben, und die Mittel zum Regulieren der gewebespezifischen Expression von endogenen Genen steht ein neues Verfahren für die Produktion von Pflanzensamenölen mit modifizierten Fettsäurezusammensetzungen zur Verfügung. Außerdem gibt es bei Anwendung der hier beschriebenen Werkzeuge ein Potential für die Entwicklung von neuen Pflanzensamenölen.
Man kann sich dafür entscheiden, für die Transcription oder Transcription und Translation von einer oder mehreren anderen interessierenden Sequenzen im Einklang mit der Expression einer gentechnisch veränderten Pflanzen-Acyl-ACP-Thioesterase in einer Pflanzenwirtszelle zu sorgen. Insbesondere kann bei einigen Anwendungen die Expression eines Pflanzen-LPAAT-Proteins mit Aktivität auf mittelkettige oder sehr langkettige Fettsäuren in Kombination mit der Expression einer gentechnisch veränderten Pflanzen-Acyl-ACP-Thioesterase bevorzugt sein. Siehe WO 95/27791 wegen Sequenzen, die Pflanzen-LPAAT codieren.
Wenn man eine Pflanze bereitstellen möchte, die bezüglich der kombinierten Wirkung von mehr als einer interessierenden Nucleinsäuresequenz transformiert ist, wird typischerweise für jede ein eigenes Nucleinsäurekonstrukt bereitgestellt. Die Konstrukte, wie sie oben beschrieben sind, enthalten Transcriptions- oder Translations- oder Transcriptions- und Translations-regulierende Kontrollbereiche: Der Fachmann wird in der Lage sein, regulatorische Sequenzen zu bestimmen, die für eine gewünschte zeitliche Steuerung und Gewebespezifität sorgen, die im Einklang mit den obigen Prinzipien für das Endprodukt geeignet ist, und die für die jeweilige Expression oder für Antisense-Konstrukte ausgelegt sind. Wenn zwei oder mehr Konstrukte eingesetzt werden sollen, ob sie sich nun beide auf dieselbe fettsäuremodifizierende Sequenz oder auf verschiedene fettsäuremodifizierende Sequenzen beziehen, kann es wünschenswert sein, dass in jeder Cassette andere regulatorische Sequenzen eingesetzt werden, um eine spontane homologe Rekombination zwischen Sequenzen zu reduzieren. Die Konstrukte können nach demselben oder nach verschiedenen Verfahren in die Wirtszellen eingeführt werden, einschließlich der Einführung einer solchen Eigenschaft durch Kreuzen von transgenen Pflanzen über traditionelle Pflanzenzuchtverfahren, solange das resultierende Produkt eine Pflanze ist, die beide Merkmale in ihr Genom integriert hat.
Nachdem die Erfindung nun allgemein beschrieben wurde, wird sie anhand der folgenden Beispiele besser verständlich sein.
Beispiele
Beispiel 1: Sequenzen von Pflanzen-Acyl-ACP-Thioesterasen
A. Kalifornischer Berglorbeer (Umbellularia californica)
Die DNA-Sequenz und translatierte Aminosäuresequenz des Klons pCGN3822 der Klasse-II-Thioesterase des Kalifornischen Berglorbeers sind in 1 von WO 92/20236 angegeben.
B. Campher (Cinnamomum camphora)
Die DNA-Sequenz und translatierte Aminosäuresequenz eines durch PCR erzeugten codierenden Bereichs der Klasse-II-Campher-Thioesterase sind in 5B von WO 92/20236 angegeben.
C. Mangostan (Garcinia mangifera)
Eine cDNA-Bank wird aus Samen hergestellt, die aus reifen Mangostanfrüchten entnommen wurden, wobei man die Verfahren verwendet, wie sie im Zap-cDNA-Synthese-Kit von Stratagene (Stratagene; La Jolla, CA) beschrieben sind. Eine Ölanalyse der für die RNA-Isolierung verwendeten Mangostangewebe ergibt 18:0-Anteile von ungefähr 50%. Eine Ölanalyse der Samen von weniger reifen Mangostanfrüchten ergibt 18:0-Anteile von 20–40%. Die Gesamt-RNA wird aus den Mangostansamen isoliert, indem man das CTAB-DNA-Isolierungsverfahren von Webb und Knapp (Plant Mol. Biol. Reporter (1990) 8: 180–195) modifiziert. Zu den Puffern gehören:
REC: 50 mM TrisCl, pH 9, 0,7 M NaCl, 10 mM EDTA, pH 8, 0,5% CTAB.
REC+: Unmittelbar vor der Verwendung β-Mercaptoethanol bis 1% hinzufügen.
RECP: 50 mM TrisCl, pH 9, 10 mM EDTA, pH 8, und 0,5% CTAB.
RECP+: Unmittelbar vor der Verwendung β-Mercaptoethanol bis 1% hinzufügen.
Für die Extraktion von 1 g Gewebe werden 10 ml REC+ und 0,5 g PVPP zu Gewebe gegeben, das in flüssigem Stickstoff gemahlen und homogenisiert wurde. Das homogenisierte Material wird 10 min lang bei 12000 U/min zentrifugiert. Der Überstand wird durch ein Miracloth-Filter auf 3 ml kaltes Chloroform gegossen und erneut homogenisiert. Nach der Zentrifugation mit 12000 U/min während 10 min wird die obere Phase entnommen, und ihr Volumen wird bestimmt. Ein gleiches Volumen an RECP+ wird hinzugefügt, und man lässt das Gemisch 20 min lang bei Raumtemperatur stehen. Das Material wird zweimal 20 min lang mit 10000 U/min zentrifugiert, und der Überstand wird nach jeder Zentrifugation verworfen. Das Sediment wird in 0,4 ml 1 M NaCl (DEPC) aufgelöst und mit einem gleichen Volumen Phenol/Chloroform extrahiert. Nach der Ethanolfällung wird das Sediment in 1 ml DEPC-Wasser gelöst.
Das Klonierungsverfahren für die cDNA-Synthese stellt sich kurz wie folgt dar. Die Synthese des ersten Stranges der cDNA erfolgt gemäß dem Anleitungshandbuch von Stratagene mit einigen Modifikationen nach Robinson et al. (Methods in Molecular and Cellular Biology (1992) 3: 118–127). Insbesondere wurden ungefähr 57 μg LiCl-gefällte Gesamt-RNA anstelle von 5 μg Poly(A)+-RNA verwendet, und die Reaktion wurde 1 Stunde lang bei 45°C anstatt 37°C inkubiert.

Sonden für die Durchmusterung der Bibliothek werden durch PCR aus Mangostan-cDNA unter Verwendung von Oligonucleotiden hergestellt, die mit konservierten Bereichen der Pflanzen-Acyl-ACP-Thioesterase hybridisieren. Die Sonde Garm 2 und Garm 106 werden unter Verwendung der folgenden Oligonucleotide hergestellt. Die Nucleotidbasencodes für die folgenden Oligonucleotide sind wie folgt:

A = Adenin	C = Cytosin
T = Thymin	U = Uracil
G = Guanin	S = Guanin oder Cytosin
K = Guanin oder Thymin	W = Adenin oder Thymin
M = Adenin oder Cytosin	R = Adenin oder Guanin
Y = Cytosin oder Thymin
B = Guanin, Cytosin oder Thymin
H = Adenin, Cytosin oder Thymin
N = Adenin, Cytosin, Guanin oder Thymin

Garm 2

4874: 5' CUACUACUACUASYNTVNGYNATGATGAA 3' (SEQ ID Nr. 12)
4875: 5' CAUCAUCAUCAURCAYTCNCKNCKRTANTC 3' (SEQ ID Nr. 13)

Der Primer 4874 ist ein Sense-Primer, der so gestaltet ist, dass er möglichen codierenden Sequenzen für das konservierte Peptid V/L/A W/S/Y V/A M M N entspricht, wobei der Ein-Buchstaben-Aminosäurecode verwendet wird und ein Schrägstrich zwischen Aminosäuren darauf hinweist, dass mehr als eine Aminosäure für diese Position möglich ist. Der Primer 4875 ist ein Antisense-Primer, der so gestaltet ist, dass er möglichen codierenden Sequenzen für das Peptid D/E Y R R E C entspricht.
Garm 106

5424: 5' AUGGAGAUCUCUGAWCRBTAYCCTAMHTGGGGWGA 3' (SEQ ID Nr. 14)
5577: 5' ACGCGUACUAGUTTNKKNCKCCAYTCNGT 3' (SEQ ID Nr. 15)

Der Primer 5424 ist ein Sense-Primer, der so gestaltet ist, dass er möglichen codierenden Sequenzen für das Peptid E/D H/R Y P K/T W G D entspricht.
Der Primer 5577 ist ein Antisense-Primer, der so gestaltet ist, dass er möglichen codierenden Sequenzen für das Peptid T E W R K/P K entspricht.
Die DNA-Fragmente, die aus den obigen Reaktionen resultieren, werden durch Klonierung oder durch weitere PCR zur Verwendung als Sonden amplifiziert und durch statistisches oder spezifisches Primen radioaktiv markiert.
Ungefähr 800 000 Plaques werden gemäß den Anweisungen des Herstellers ausgestrichen. Für das Screening werden Plaquefilter bei Raumtemperatur in 50% Formamid, 5 × SSC, 10 × Denhardt-Lösung, 0,1% (w/v) SDS, 5 mM Na₂EDTA, 0,1 mg/ml denaturierte Lachssperma-DNA, vorhybridisiert. Die Hybridisierung mit einem Gemisch der Sonden Garm 2 und Garm 106 wird bei Raumtemperatur in demselben Puffer wie oben mit zugesetzten 10% (w/v) Dextransulfat und Sonde durchgeführt. Die Plaquereinigung und die Phagemid-Excision wurden so durchgeführt, wie es in der Anleitung zum Zap-cDNA-Synthesekit von Stratagene beschrieben ist.
Ungefähr 90 Acyl-ACP-Thioesterase-Klone wurden identifiziert und durch DNA-Sequenzierung und/oder PCR-Analyse nach dem Thioesterase-Typ sortiert. Von den analysierten Klonen waren wenigstens 28 Klasse-I-(FatA)-Typen, und 59 waren Klasse-II-(FatB)-Typen. Zwei Unterklassen von FatA-Typ-Klonen wurden beobachtet, der häufigste Typ wird GarmFatA1 genannt, und der einzelne Klon der zweiten Unterklasse wird GarmFatA2 genannt. Die DNA- und translatierte Aminosäuresequenz des GarmFatA1-Klons C14-4 (pCGN5252) (SEQ ID Nr. 8) sind in 2 dargestellt. Die DNA-Sequenz und die translatierte Aminosäuresequenz des FatA2-Klons C14-3 (SEQ ID Nr. 9) sind in 3 dargestellt.
Konstrukte für die Expression des GarmFatA1-Klons von 2 in E. coli werden wie folgt hergestellt. Restriktionsstellen werden durch PCR-Mutagenese an Aminosäure 49 (SacI), die in der Nähe des Aminoterminus des angenommenen reifen Proteins liegt, und nach dem Stopcodon für den proteincodierenden Bereich (BamHI) eingesetzt. Der für das reife Protein codierende Bereich wird als SacI/BamHI-Fragment in pBC SK (Stratagene; La Jolla, CA) eingesetzt, was zu pCGN5247 führt, das verwendet werden kann, um für eine Expression der Mangostan-Thioesterase als lacZ-Fusionsprotein zu sorgen.
Ergebnisse von Thioesterase-Aktivitätsassays mit dem Mangostan-Klasse-I-Thioesterase-Klon GarmFatA1 unter Verwendung von 16:0-, 18:0- und 18:1-Acyl-ACP-Substraten sind im Folgenden gezeigt.,
Der GarmFatA1-Klon zeigt präferentielle Aktivität auf C18:1-Acyl-ACP-Substrat und zeigt auch eine erhebliche Aktivität (ungefähr 25% der 18:1-Aktivität) auf C18:0-Acyl-ACP-Substrate. Es wird nur eine kleine Erhöhung der C16:0-Aktivität gegenüber der Aktivität in Kontrollzellen beobachtet, und die 16:0-Aktivität stellt nur ungefähr 3% der 18:1-Aktivität dar.
Die Expression von GarmFatA2-Thioesterase in E. coli und die Bestimmung der resultierenden Thioesterase-Aktivität zeigt, dass C18:1 als Acyl-ACP-Substrat in hohem Maße bevorzugt ist. Die Thioesterase-Aktivitäten auf 16:0- und 18:0-Acyl-ACP-Substrate sind ungefähr gleich und stellen weniger als 5% der beobachteten 18:1-Aktivität dar.
D. Brassica campestris (rapa)
Die DNA-Sequenz und translatierte Aminosäuresequenz einer Brassica-campestris-Klasse-I-Acyl-ACP-Thioesterase sind in WO 92/20236 (6) angegeben.
E. Cuphea palustris C8/C10
Die Gesamt-RNA wird aus sich entwickelnden Samen von C. palustris isoliert, wobei das oben beschriebene modifizierte CTAB-Verfahren verwendet wird. Eine lambda-ZipLox-cDNA-Bibliothek (BRL; Gaithersburg, MD), die ungefähr 6 × 10⁶ pfu enthält, wird aus Gesamt-RNA aufgebaut. Ungefähr 500000 Plaques aus der nicht amplifizierten Bibliothek werden unter Verwendung einer gemischten Sonde durchmustert, die die Thioesterase-codierenden Bereiche der Cuphea-hookeriana-Klasse-II-Thioesterase-Klone CUPH-1 (CMT-9), CUPH-2 (CMT-7) und CUPH-5 (CMT-10) enthält. (DNA-Sequenzen dieser Klone sind in WO 94/10288 angegeben.) Hybridisierungsbedingungen geringer Stringenz werden wie folgt verwendet: Die Hybridisierung wird bei Raumtemperatur in einer Lösung von 30% Formamid und 2 × SSC durchgeführt (1 × SSC = 0,15 M NaCl; 0,015 M Na-Citrat). Zweiundachtzig mutmaßlich positive Klone wurden identifiziert, und 30 davon wurden einer Plaquereinigung unterzogen. Die Nucleinsäuresequenz und die translatierte Aminosäuresequenz eines Klons, der als MCT29 (CpFatBi) bezeichnet wird (SEQ ID Nr. 10), sind in 4 angegeben. Die translatierte Aminosäuresequenz dieses Klons ist zu ungefähr 83% identisch mit der Sequenz eines Cuphea-hookeriana-CUPH-2-Klons (CMT-7 in 7 von WO 94/10288) mit einer primären Thioesterase-Aktivität auf C8:0- und C10:0-Fettacyl-ACP-Substrate.
Konstrukte für die Expression von MCT29 in E. coli werden hergestellt. SphI- und StuI-Stellen werden durch PCR in 5'-Richtung vom N-Terminus des mutmaßlichen reifen Proteins eingesetzt, der sich an Aminosäure 114 befindet. Der reife N-Terminus, der durch Entsprechung zu Leu 84 vorausgesagt wurde, wurde ursprünglich als N-Terminus des reifen Proteins der Berglorbeer-Thioesterase identifiziert. Der das reife Protein codierende Bereich wird als StuI/XbaI-Fragment in pUC118 kloniert, was zu dem Klon MCT29LZ führt, so dass für eine Expression der C.-palustris-Thioesterase in E. coli als lacZ-Fusionsprotein gesorgt wird. Lysate von transformierten E.-coli-Zellen, die das MCT29-Thioesterase-Protein exprimieren, werden auf Acyl-ACP-Thioesterase-Aktivität getestet. Die Ergebnisse zeigen, dass CpFATB1 ein Thioesterase-Enzym codiert, dessen Aktivität primär auf C8- und C10-ACP-Substrate wirkt, wobei die Aktivität auf C8-ACP um 50% höher ist als auf C10-ACP. Eine geringe Aktivität auf C14-ACP-Substrat wird ebenfalls auf Niveaus beobachtet, die ungefähr bei 10% der C8-ACP-Aktivität liegen.
MCT29LZ wird zur Analyse der Lipidzusammensetzung auch in E. coli fadD transformiert, eine E.-coli-Mutante, der die mittelkettenspezifische Acyl-CoA-Synthetase fehlt (Overath et al., Eur. J. Biochem. (1969) 7: 559–574). Ergebnisse dieser Analysen zeigen eine wesentliche Erhöhung der Produktion von 8:0- und 10:0-Fettsäuren in Zellen, die mit dem C.-palustris-MCT29LZ-Klon transformiert wurden.
Der nahe verwandte C.-hookeriana-ChFatB2-Klon zeigt auch eine präferentielle Aktivität auf C8:0- und C10:0-Acyl-ACP-Substrate, mit einer um 50% höheren Aktivität auf C10:0- im Vergleich zu C8:0-Substraten. Die Expression des ChFatB2-Klons in Samen von transgenen Brassica-Pflanzen führt zu einer erhöhten Produktion von C8- und C10-Fettsäuren in den Samen, wobei die C10-Konzentrationen höher sind als die C8-Konzentrationen. (Siehe gleichzeitig anhängige US-Anmeldung Serial Nr. 08/261,695, eingereicht am 16. Juni 1994.)
F. Cuphea palustris C14
Die Nucleinsäuresequenz und translatierte Aminosäuresequenz eines zusätzlichen C.-palustris-Klasse-II-Thioesterase-Klons, MCT34 (CpFatB2) (SEQ ID Nr. 11), sind in 5 angegeben. Die translatierte Aminosäuresequenz dieses Klons ist zu ungefähr 80% identisch mit der Sequenz eines Cuphea-hookeriana-CUPH-4-Klons (CMT-13 in 8 von WO 94/10288).
Konstrukte für die Expression von MCT34 in E. coli werden hergestellt. SphI- und StuI-Stellen werden durch PCR in 5'-Richtung vom N-Terminus des mutmaßlichen reifen Proteins eingesetzt, der sich an Aminosäure 108 befindet. Der das reife Protein codierende Bereich wird als StuI/XbaI-Fragment in pUC118 kloniert, was zu dem Klon MCT34LZ führt, so dass für eine Expression der C.-palustris-Thioesterase in E. coli als lacZ-Fusionsprotein gesorgt wird. Lysate von transformierten E.-coli-Zellen, die das MCT34-Thioesterase-Protein exprimieren, werden auf Acyl-ACP-Thioesterase-Aktivität getestet. Die Ergebnisse zeigen, dass CpFATB2 ein Thioesterase-Enzym codiert, dessen Aktivität primär auf C14- ACP-Substrat wirkt. Eine Aktivität auf C16-ACP-Substrat wird ebenfalls auf Niveaus beobachtet, die ungefähr bei 30% der C14-ACP-Aktivität liegen.
MCT34LZ wird zur Analyse der Lipidzusammensetzung auch in E. coli fadD transformiert, eine E.-coli-Mutante, der die mittelkettenspezifische Acyl-CoA-Synthetase fehlt (Overath et al., Eur. J. Biochem. (1969) 7: 559–574). Ergebnisse dieser Analysen zeigen eine wesentliche Erhöhung der Produktion von 14:0- und 14:1-Fettsäuren in Zellen, die mit dem C.-palustris-MCT34LZ-Klon transformiert wurden.
Beispiel 2: Gentechnische Veränderung von FatA-Thioesterasen
Die Veränderung der Thioesterase-Enzymspezifität eines Mangostan-Garm-FatA1-Klons wird als Beispiel für die Modifikation von Thioesterasen des FatA- oder Klasse-I-Typs angegeben. Zu den wünschenswerten Modifikationen in Bezug auf FatA-Thioesterasen gehört die Veränderung der Substratspezifität, so dass die Aktivität auf C18:0-Fettacyl-ACP relativ zur Aktivität auf C18:1- oder C16:0-Fettacyl-ACP-Substrate erhöht ist.
Um zum Beispiel die relative Aktivität auf gesättigte Fettsäuren, wie C18:0, zu erhöhen, können Mutationen in Bereichen von Klasse-I-Thioesterasen, die sich von den entsprechenden Bereichen in Klasse-II-Thioesterasen, welche primär auf gesättigte Fettsäuren wirken, unterscheiden, nützlich sein. Die Daten von Gentechnikexperimenten mit Berglorbeer-Thioesterase weisen darauf hin, dass der Bereich von Aminosäure 229 bis 285 (wie in der Consensus-Sequenz der oberen Zeile in 1 nummeriert) für die Thioesterase-Substrat-Bindung wichtig ist. Ein Aminosäuresequenzvergleich dieses Bereichs weist darauf hin, dass im hochgradig konservierten Bereich der Aminosäuren 250–265 mehrere geladene Aminosäuren in FatA anders sind als bei FatB-Thioesterasen. In FatA-Thioesterasen ist die Aminosäure 261 mit einigen Ausnahmen negativ geladen, während Aminosäure 261 in den bisher analysierten FatB-Klonen in den meisten Fällen positiv geladen ist. Außerdem ist in FatA-Thioesterasen die Aminosäure 254 bei allen bisher untersuchten FatA-Thioesterasen positiv geladen, während die Aminosäure 254 in bisher analysierten FatB-Klonen in allen Fällen eine Aminosäure ohne Ladung ist. Eine Veränderung der Aminosäureladung an diesen Positionen kann also zu einer Veränderung der Substratpräferenz führen.
Eine FatA-TE-Mutante in Aminosäure 261 (Consensusnummerierung der 1), D261K von Mangostan-FatA1, wird unter Verwendung von ortsgerichteter Mutagenese durch PCR nach ähnlichen Verfahren erzeugt, wie sie für die Modifikation von Berglorbeer-Thioesterase-Sequenzen beschrieben sind. Von dem Mutanten D261K wird die Thioesterase-Aktivität gemessen, wie oben beschrieben ist (Davies, H. M. (1993) a.a.O.).
Ergebnisse dieser Analysen (6) zeigen, dass die Präferenz für 18:0 gegenüber 18:1 bei Mutante D261K 35% (18:0/18:1) im Vergleich zu 25% beim Wildtyp-Garm-FatA1 betrug. Sowohl der Wildtyp- als auch der mutante Garm-FatA1-Klon zeigen eine sehr geringe Aktivität auf 16:0 und keine Aktivität auf Substrate mit mittlerer Kettenlänge, wie C10:0 bis C14:0. Eine zusätzliche Garm-FatA1-Mutante wurde hergestellt, die die oben angegebene D261K-Mutation sowie eine Mutation der Veränderung von Aminosäure 254 von Lysin nach Valin aufwies. Diese Mutante, K254V/D261K, zeigte ein erhöhtes 18:0/18:1-Verhältnis von 40%. Diese Ergebnisse stützen wiederum den Berglorbeer-Beweis, der darauf hinweist, dass eine Modifikation dieses Bereichs die Enzymaktivität und -spezifität ändern kann. Eine Dreifachmutante, G249T/K254V/D261K, wird gerade aufgebaut, um den Garm-FatA1-Klon zur Bewertung einer weiteren Spezifitätsmodifikation weiter in Richtung auf die FatB-Thioesterase-Struktur zu modifizieren.
Weitere wünschenswerte Aminosäuremodifikationen von Mangostan-Garm-FatA1-Klonen können durch Vergleich der 18:0-angereicherten Garm-FatA1-Thioesterase-Aminosäuresequenz mit der Aminosäuresequenz für einen FatA-Klon mit primärer Aktivität auf 18:1-Substrate und wenig oder keiner Aktivität auf 18:0-Substrate ausgewählt werden. Ein Vergleich der Aminosäuresequenzen von Garm FatA1 und eines 18:1-bevorzugenden Thioesterase-Klons von Brassica campestris (rapa), Br FatA1, ist in 7 bereitgestellt. Im Hinblick auf die Veränderungen des Bindungssubstrats, die für die Berglorbeer-Thioesterase in dem Bereich nachgewiesen wurden, der auf die vorausgesagte β-Faltblatt- und Turn-Struktur folgt (verankert durch Aminosäuren G169 und G172 des Vergleichs von 7 zwischen Mangostan- und Brassica-Thioesterase), ist dieser Bereich auch ein Ziel für die Veränderung der Substratspezifität des Mangostan-Thioesterase-Klons Garm FatA1. Eine Analyse der Sekundärstruktur und ein Aminosäuresequenzvergleich der Mangostan- und Brassica-rapa-Klasse-I-Thioesterasen führt zur Identifizierung von mehreren Zielmutationen zur weiteren Veränderung der Substratspezifität der Mangostan-Thioesterase, Garm FatA1. Zu den Zielaminosäuren gehören Y182V, Q186E, D209S, V210D und H219F.
Die weitere Analyse der Peptidsequenzabgleiche von Pflanzen-Thioesterasen des FatA-Typs zeigt mehrere Aminosäurereste, die innerhalb von allen Pflanzen-Thioesterasen des FatA-Typs außer der Mangostan-Garm-FatA1-Thioesterase konserviert sind. Fünf dieser Garm-FatA1-spezifischen Aminosäuren sind (unter Verwendung der Consensusnummerierung von 1) G185 (Consensus ist D), S188 (Consensus ist A), V270 (Consensus ist D), H279 (Consensus ist F) und S307 (Consensus ist A). Diese fünf Aminosäuren sind von besonderem Interesse, da sie nichtkonservative Substitutionen darstellen. Im Vergleich zu konservativen Substitutionen, zum Beispiel S223T, verursachen nichtkonservative Substitutionen mit höherer Wahrscheinlichkeit strukturelle oder biochemische Veränderungen im Mangostan-Enzym und tragen so zu dessen einzigartiger Spezifität gegenüber 18:0-ACP und äußerst geringen Aktivität gegenüber 16:0-ACP bei.
Diese fünf identifizierten Aminosäuren wurden in Garm FatA1 entweder zur Consensus-Aminosäure oder zu Alanin mutagenisiert. Bei 5188 und 5307 wurden nur Alaninsubstitutionen vorgenommen, da Alanin auch die Consensus-Aminosäure für diese Reste ist. Außerdem wurden Mutanten hergestellt, die verschiedene Kombinationen der obigen Aminosäuresubstitutionen enthalten. Eine Affinitätsmarkerexpression/Proteinreinigung wird für die Analyse der obigen Garm-FatA1-Mutanten verwendet. Garm-FatA1-Wildtyp- und mutante Thioesterasen werden in E. coli unter Verwendung des Vektors pQE32 (Qiagen) expri miert. Die rekombinanten Proteine, die einen Affinitätsmarker enthalten, der aus sechs aufeinanderfolgenden Histidinresten besteht, werden in hohen Konzentrationen produziert und mit Hilfe des Qiagen-Ni-NTA-Harzes gemäß den Anweisungen des Herstellers gereinigt.
Zum Aufbau der Expressionsplasmide wurde der reife Teil des GarmFatA-1 (Aminosäure 65 bis zum Ende des C-Terminus) durch PCR amplifiziert und zwischen der BamHI- und der SalI-Restriktionsstelle im Polylinker in den pQE-Vektor eingesetzt. Die DNA-Sequenz wurde durch Sequenzieren überprüft, und das Plasmid wurde in E.-coli-M15-Zellen (Qiagen) transformiert. Die Zellen wurden bei 30°C in LB-Medium gezüchtet, das 100 mg/l Ampicillin und 30 mg/l Kanamycin enthielt, und die Produktion des rekombinanten Proteins wurde durch die Zugabe von 2 mM IPTG induziert, und die Zellen wurden weitere 4 h wachsen gelassen. Zellen wurden sedimentiert und lysiert, und die rekombinanten Proteine wurden mit Ni-NTA-Harz gemäß den Anweisungen des Herstellers gereinigt. Mutante Garm-FatA1-Enzyme wurden auch in E. coli von pQE-Konstrukten aus exprimiert, gereinigt und auf 18:0-ACP- und 18:1-ACP-Hydrolyseaktivität getestet. Ergebnisse dieser Assays, die als Auftragung des Vervielfachungsfaktors der spezifischen Aktivität vorgestellt werden, sind in 10 gezeigt. Die spezifische Aktivität von ausgewählten Mutanten ist in 11 angegeben.
Die Mutante S188A zeigt eine Zunahme der 18:0-ACP-Aktivität auf das Vierfache und eine Zunahme der 18:1-Aktivität auf das Zweifache. S307A erhöht selektiv die 18:0-ACP-Aktivität (auf das Zweifache), ohne die 18:1-ACP-Aktivität zu verändern. Andererseits hatte die Modifikation bestimmter Reste negative Wirkungen. Zum Beispiel zeigen G185D, V270D und H279F eine Reduktion der Aktivitäten auf weniger als die Hälfte. In manchen Fällen jedoch, insbesondere bei kleinen hydrophoben Aminosäuren, kehrt eine Substitution von Alanin (z.B. G185A und V270A) die negativen Wirkungen wieder um (G185A führt zu einer Erhöhung der Aktivität auf das Doppelte). Dies ist wahrscheinlich auf die neutrale Wirkung von Alanin auf die Proteinstruktur und seine Ähnlichkeit mit diesen kleinen Aminosäuren zurückzuführen. Dieses Ergebnis lässt auch vermu ten, dass ein Alanin-Scanning von konservierten Aminosäuren in FatA zur Produktion von Mutanten mit einer erhöhten Hydrolyseaktivität führen könnte.
Diese Untersuchungen zeigen auch, dass Substitutionen mit positiver Wirkung auf die Enzymaktivität additiv sind. Wenn zwei Mutationen, die eine erhöhte Aktivität zeigen (z.B. S188A und V270A) unter Bildung einer Doppelmutante miteinander kombiniert werden, wird eine weitere Erhöhung der Enzymaktivität beobachtet. Die Mutante S188A/V270A zeigt eine Erhöhung der 18:0-ACP-Aktivität auf das Dreizehnfache. Wenn eine positive Mutation mit einer Mutation kombiniert wird, die eine selektive Erhöhung bei einem Substrat, aber nicht bei einem anderen zeigt, zeigt die resultierende Mutante außerdem eine stark verbesserte Gesamtaktivität und ein stark verbessertes 18:0/18:1-ACP-Verhältnis. Zum Beispiel zeigt S188A/V270A/S307A eine Erhöhung der 18:0-ACP-Aktivität auf das Siebenfache und ein 18:0/18:1-Verhältnis von 0,8/1 im Vergleich zu einem Verhältnis von 0,3/1 für den Wildtyp Garm FatA1.
Beispiel 3: Domänenaustausch
Verfahren zur Herstellung von Thioesterase-Domänenaustauschkonstrukten, wenn keine geeigneten Restriktionsstellen verfügbar sind, werden bereitgestellt.
A. Verfahren mit kurzen Domänen
Ein Verfahren für den Kurzdomänenaustausch ist in 8 gezeigt. Zwei getrennte PCR führen zu zwei Fragmenten (Produkte der Primer a + d und der Primer b + c), die eine überlappende Sequenz enthalten, die mit der neuen Domäne identisch ist. Die Primer c und d werden so synthetisiert, dass sie zu der genauen Sequenz am 3'-Ende stromabwärts der ursprünglichen Domäne passen, plus einem 5'-Überhang, der einer neuen Domänensequenz entspricht. Die Länge der übereinstimmenden Sequenz sollte groß genug sein, um ein Tm von 50°C oder darüber zu ergeben (berechnet unter der Annahme von 4°C für C oder G und 2°C für T oder A). Idealerweise sollte die Länge der 5'-Überhänge nicht größer sein als 18 Basen (6 Aminosäuren), obwohl auch längere Überhänge mit geringeren Effizienzen funktionieren können. Die ersten beiden PCR werden mit ungefähr 0,2 μM Primern und 0,1 μg Matrizen-DNA unter den im Folgenden beschriebenen PCR-Bedingungen durchgeführt: Der zweite PCR-Durchlauf (PCR 3) wird durchgeführt, indem man 10 μl jedes Produkts von PCR 1 und 2 miteinander mischt und die Primer a und b bis zu einer Endkonzentration von 0,2 μM hinzufügt. Das resultierende Produkt ist das gewünschte Gen, bei dem die ursprüngliche Domäne durch eine neue Domänensequenz ersetzt ist. Das PCR-Produkt kann auf einem Agarose-Gel untersucht werden, bevor es ausgefällt und für die Subklonierung einem Restriktionsabbau unterzogen wird. Das modifizierte DNA-Fragment sollte sequenziert werden, um die gewünschte Mutation zu bestätigen.
B. Verfahren mit langen Domänen
Zum Austausch längerer Domänen, wie in 9 gezeigt ist, kann der Wechsel einer Domäne von Gen II zu Gen I erreicht werden, indem man zuerst drei Fragmente aus PCR 1, 2 und 3 amplifiziert. Diese teilweise überlappenden Fragmente werden dann für die nächste PCR mit den Primern a und b miteinander gemischt. Die PCR-Bedingungen sind im Folgenden beschrieben. Das resultierende Produkt mit der vollen Länge ist Gen I mit einer neuen Domäne aus Gen II. Nach demselben Prinzip können durch eine zusätzliche PCR im ersten Durchlauf mit einer anschließenden zweiten PCR in Gegenwart der vier Fragmente (nicht gezeigt) in Gen I zwei Domänen gleichzeitig ausgetauscht werden.
Die PCR-Bedingungen, die erfolgreich verwendet wurden, sind wie folgt: Fünf Cyclen mit einer Denaturierung bei 94°C während 1 min, Renaturierung bei 48°C während 30 Sekunden und Verlängerung bei 72°C während 2 min wurden programmiert. Auf die ersten fünf Cyclen folgten 30 Cyclen unter Verwendung desselben Programms, außer dass die Renaturierung 30 Sekunden lang bei 60°C erfolgte. Der Hintergrund der ersten fünf Cyclen bei einer niedrigeren Temperatur besteht darin, eine Assoziation der PCR-Primer mit 5'-Überhängen zu gewährleisten. Die erhöhte Temperatur bei den späteren Cyclen beschränkt die weitere Amplifikation auf Sequenzen, die während der ersten fünf Cyclen amplifiziert wurden. Die Tms für alle Primer sollten auf etwa 60°C gelegt werden. Für die anschließende Klonierung ist es zweckmäßig, dass die Ankerprimer der vollen Länge (a und b, 8 und 9) gewöhnlich zusätzliche Restriktionsstellen und/oder Überhänge für verschiedene PCR-Subklonierungsvektoren enthalten. Es ist wichtig, eine möglichst geringe Menge an Matrizen-DNA (üblicherweise weniger als 0,1 μg) zu verwenden, um den nichtmutagenisierten Hintergrund zu reduzieren.
C. FatA- und FatB-Domänenaustausch
FatA- und FatB-Thioesterase-Peptidsequenzen können abgeglichen werden, um eindeutige Ähnlichkeiten und Unterschiede zwischen den beiden Enzymklassen aufzuzeigen (Voelker (1996) Genetic Engineering, Vol. 18, Hrsg. J. K. Setlow, S. 111–133; 3). Es gibt einen hydrophoben Bereich in der Nähe des N-Terminus, der in FatB-Thioesterasen hochgradig konserviert ist und in FatA-Thioesterasen fehlt. Es gibt jedoch fünf Bereiche, die in beiden Klassen von Thioesterasen vorhanden sind, die somit als partiell homolog klassifiziert werden können, sowie einen Bereich des aktiven Zentrums um die Histidin- und Cysteinreste herum, der bei allen Mitgliedern der FatA- und FatB-Thioesterasen hochgradig konserviert ist. Außer dem hydrophoben Abschnitt, der einzigartig für FatB ist, gibt es drei zusätzliche einzigartige Bereiche, die nur wenig oder gar keine Homologie aufweisen. Eine Darstellung dieser verschiedenen Peptidbereiche, die die Orte der einzigartigen und der konservierten Bereiche für Garm FatA1 und UC FatB1 zeigt, ist in 12 gezeigt. Die Nummerierung der Aminosäuren erfolgt gemäß der Consensussequenz-Nummerierung in der oberen Zeile in 1.
Durch Entfernen oder Austausch dieser einzigartigen und konservierten Bereiche zwischen Garm FatA1 und Uc FatB1 unter Verwendung der oben beschriebenen Domänenaustauschtechniken wurden Mutanten erzeugt, und ihre Enzymaktivität und -spezifität wurde untersucht.
Ergebnisse der Analyse dieser Deletions- und Austauschmutanten sind in 13A und B angegeben.
Diese Ergebnisse zeigen Folgendes. Der einzigartige hydrophobe Abschnitt in FatB beeinflusst die Aktivität oder Substratspezifität von FatB-Thioesterasen nicht. Durch die Deletion des einzigartigen C-terminalen Abschnitts von FatB wird die Enzymaktivität gesenkt, aber die Substratspezifität nicht verändert. Die Bereiche der aktiven Zentren sind untereinander austauschbar, ohne die Substratspezifität zu verändern, was darauf hinweist, dass Sequenzen außerhalb der Bereiche der aktiven Zentren die Enzymspezifität bestimmen. Ein Austausch der einzigartigen Sequenz der Reste 275 bis 298 verändert die Substratspezifität nicht, verursacht aber eine Abnahme der Enzymaktivität. Ein chimäres Enzym, das durch Fusion des N-terminalen Teils von FatB bis zu Rest 382 und des C-terminalen Teils von FatA (382 bis 430) gebildet wird, ist inaktiv, was vermuten lässt, dass der C-terminale Teil von FatB für die Gesamtenzymaktivität entscheidend ist. Chimäre Enzyme, die durch Fusion des N- und C-Terminus von FatA und FatB (Rest 275 als Schnittpunkt) gebildet werden, sind inaktiv, was darauf hinweist, dass Sequenzen zwischen 65 und 275 die Gesamtstruktur jedes Enzyms beeinflussen.
Beispiel 4: Pflanzentransformation und Analyse
Transgene Pflanzen mit erhöhten Konzentrationen an C18:0-Fettsäure als Ergebnis der Expression von Garm-FatA1-Thioesterase in Brassica-napus-Samen sind in WO 97/12047 beschrieben. Ein Konstrukt, pCGN5255, das ein Garm-FatA1-Thioesterase-Gen unter der Regulation der 5'- und 3'-regulatorischen Bereiche von Napin umfasst, wird für die Pflanzentransformation verwendet. Fettsäurezusammensetzungen in einer Linie mit hohem Ölsäuregehalt von bis zu 39% im Vergleich zu ungefähr 2% bei nichttransformierten Kontrollpflanzen werden bei individuellen halbierten Samen von einer ausgewählten 5255-transgenen Pflanze beschrieben. Ähnliche Konzentrationen von 18:0-Fettsäuren werden bei transgenen Pflanzen aus einer B.-napus-Linie mit geringem Linolensäuregehalt berichtet, die mit einem doppelten Garm-FatA1-Expressions konstrukt, pCGN5266, transformiert war. Stearatkonzentrationen in gepoolten Samenproben von segregierenden Samenpopulationen lagen im Bereich von bis zu 14,2% bei 5255-Transformanten und 22% bei 5266-Transformanten.
Für die Analyse der Stearatproduktion in transgenen Pflanzen, die mit der doppelten Garm-FatA1-Mutante G185A/S188A transformiert sind, wird ein Napin-Expressionskonstrukt hergestellt, das mit pCGN5255 identisch ist, wobei aber die Sequenz, die die G185A/S188A-Mutante codiert, an die Stelle der Sequenz tritt, die das Wildtyp-Garm-FatA1 codiert. Mit dem doppelt mutanten Konstrukt pCGN5274 wird Agrobacterium tumefaciens transformiert und verwendet, um transgene B.-napus-Pflanzen der Sorte Quantum zu erzeugen. Gleichzeitig wird auch pCGN5255 verwendet, um transgene B.-napus-Pflanzen der Sorte Quantum als Kontrolle für die 5274-Pflanzen zu erzeugen.
Gepoolte segregierende Samen von Quantum-5255- und -5274-Pflanzen werden analysiert, um die Fettsäurezusammensetzung zu bestimmen. Eine statistische Analyse dieser Ergebnisse ist im Folgenden in tabellarischer Form gezeigt.
Tabelle I Deskriptive Statistik
Tabelle II Einzelproben-95%-Konfidenzniveau für Mittelwerte
Histogrammdarstellungen der 5255- und 5274-Daten sind in 14 gezeigt. Ausführliche Ergebnisse der Zusammensetzungsanalyse sind in 15 angegeben.
Zusätzliche Konstrukte werden mit der Garm-FatA1-Doppelmutante S188A/V270A hergestellt. Ein Napin-Expressionskonstrukt, pCGN5290, wird hergestellt, das mit pCGN5255 identisch ist, außer dass im Garm-FatA1-codierenden Bereich die Sequenz eingesetzt ist, die die S188A/V270A-Mutante codiert (oben beschrieben). Weiterhin wird ein Doppelkonstrukt, pCGN5291, hergestellt, das mit pCGN5266 identisch ist, außer dass die beiden Wildtyp-Garm-FatA1-codierenden Sequenzen durch zwei die S188A/V270A-Mutante codierende Sequenzen ersetzt wurden. Mit den Konstrukten pCGN5290 und pCGN5291 wird Agrobacterium tumefaciens transformiert und verwendet, um transgene B.-napus-Pflanzen der Sorte Quantum zu erzeugen. Für jedes Konstrukt werden ungefähr 25 transgene Pflanzen erhalten. Reife Samen von jeder transgenen Pflanze werden geerntet, und ihre Fettsäurezusammensetzungen werden analysiert.
Die Ergebnisse der Fettsäurezusammensetzungsanalyse von T2-gepoolten Samen zeigen, dass Pflanzen, die die S188A/V270A-Mutante Garm FatA1 exprimieren, erheblich größere Mengen an Stearat (C18:0) als Prozentsatz der Gesamtfettsäuren erzeugen als transgene Pflanzen, die entweder pCGN5255 oder pCGN5266 exprimieren (16). Genauer gesagt, die Stearatkonzentrationen in Samen von Pflanzen, die pCGN5290 und pCGN5291 exprimieren, sind um 68% bzw. 57% höher als die Konzentrationen, die man in Samen von Pflanzen erhält, die pCGN5255 bzw. pCGN5266 exprimieren. Stearatkonzentrationen in gepoolten Samenproben von segregierenden Samenpopulationen lagen im Bereich von bis zu 16,3% bei 5290-Transformanten und 9,9% bei Kontroll-5255-Transformanten. Weiterhin lagen die Stearatkonzentrationen in gepoolten Samenproben von segregierenden Samenpopulationen im Bereich von bis zu 20,9% bei 5291-Transformanten im Vergleich zu 13% bei Kontroll-5266-Transformanten. Nichttransformierte Brassica-napus-Kontrollpflanzen enthalten weniger als 3% Stearat. Eine statistische Analyse dieser Ergebnisse ist im Folgenden in tabellarischer Form gezeigt.
Tabelle III Deskriptive Statistik
Tabelle IV Einzelproben-95%-Konfidenzniveau für Mittelwerte
Diese Ergebnisse zeigen, dass verbesserte Stearatkonzentrationen in transgenen Thioesterase-Pflanzen durch Expression von mutanten Thioesterasen mit erhöhter C18:0-Aktivität im Vergleich zur C18:1-Aktivität erhalten werden können.
Die obigen Ergebnisse beweisen die Möglichkeit, Pflanzen-Acyl-ACP-Thioesterase-Sequenzen so zu modifizieren, dass gentechnisch veränderte Thioesterasen mit einer veränderten Substratspezifität erzeugt werden können. Solche Thioesterasen können in Wirtszellen exprimiert werden, so dass man einen Vorrat an der gentechnisch veränderten Thioesterase erhält und der bestehende Stoffwechselweg der Fettsäuresynthese so modifiziert wird, dass neue Zusammensetzungen von Fettsäuren erhalten werden. Insbesondere können die gentechnisch veränderten Thioesterasen in Samen von Ölpflanzen exprimiert werden, so dass man eine natürliche Quelle für wünschenswerte TAG-Moleküle erhält.
Alle in dieser Patentschrift genannten Publikationen und Patentanmeldungen definieren den Wissensstand des Fachmanns, an den sich diese Erfindung richtet.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Gentechnisch veränderte Pflanzen-Acyl-ACP-Thioesterase, wobei die gentechnisch veränderte Thioesterase eine gegenüber der in der Pflanze vorkommenden Wildtyp-Acyl-ACP-Thioesterase veränderte Substratspezifität in Bezug auf die von der Thioesterase hydrolysierten Acyl-ACP-Substrate aufweist, wobei die Wildtyp-Thioesterase eine Mangostan-Garm-FatA1-Thioesterase ist und wobei die gentechnisch veränderte Thioesterase eine oder mehrere Substitutionen enthält, die aus S188A, S307A, G185A und V270A ausgewählt sind, wobei die Aminosäurenummerierung der Mangostan-Garm-FatA1-Thioesterase auf die in 1 gezeigte Konsensnummerierung bezogen ist.
Gentechnisch veränderte Thioesterase gemäß Anspruch 1, wobei die gentechnisch veränderte Thioesterase eine Doppelmutante ist.
Gentechnisch veränderte Thioesterase gemäß Anspruch 1, wobei die gentechnisch veränderte Thioesterase eine Dreifachmutante ist.
DNA-Sequenz, die eine gentechnisch veränderte Pflanzen-Acyl-ACP-Thioesterase codiert, wobei die gentechnisch veränderte Thioesterase eine gegenüber der Acyl-ACP-Thioesterase der Wildtyp-Pflanze veränderte Substratspezifität in Bezug auf die von der Thioesterase hydrolysierten Acyl-ACP-Substrate aufweist, wobei die Wildtyp-Thioesterase eine Mangostan-Garm-FatA1-Thioesterase ist und wobei die gentechnisch veränderte Thioesterase eine oder mehrere der Aminosäuresubstitutionen enthält, die aus S188A, S307A, G185A und V270A ausgewählt sind, wobei die Amino säurenummerierung der Mangostan-Garm-FatA1-Thioesterase auf die in 1 gezeigte Konsensnummerierung bezogen ist.
DNA-Sequenz gemäß Anspruch 4, wobei die DNA-Sequenz eine doppelmutante Mangostan-Garm-FatA1-Thioesterase codiert.
DNA-Sequenz gemäß Anspruch 4, wobei die DNA-Sequenz eine dreifachmutante Mangostan-Garm-FatA1-Thioesterase codiert.