KR20150069015A - 특정 길이의 지방 알콜 및 관련 화합물의 생산을 위한 미생물 및 방법 - Google Patents

특정 길이의 지방 알콜 및 관련 화합물의 생산을 위한 미생물 및 방법 Download PDF

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KR20150069015A
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fatty
dehydrogenase
enzyme
linear alkyl
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로빈 이 오스터하우트
앤쏘니 피 버가드
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게노마티카 인코포레이티드
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    • C12Y103/00—Oxidoreductases acting on the CH-CH group of donors (1.3)
    • C12Y103/99—Oxidoreductases acting on the CH-CH group of donors (1.3) with other acceptors (1.3.99)
    • C12Y103/99012—2-Methylacyl-CoA dehydrogenase (1.3.99.12)
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    • C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
    • C12Y203/01—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C12Y203/01008—Phosphate acetyltransferase (2.3.1.8)
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    • C12Y203/01—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C12Y203/01016—Acetyl-CoA C-acyltransferase (2.3.1.16)
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    • C12Y203/01—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C12Y203/01054—Formate C-acetyltransferase (2.3.1.54), i.e. pyruvate formate-lyase or PFL
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    • C12Y203/01—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C12Y203/01174—3-Oxoadipyl-CoA thiolase (2.3.1.174)
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    • C12Y203/03—Acyl groups converted into alkyl on transfer (2.3.3)
    • C12Y203/03008—ATP citrate synthase (2.3.3.8)
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    • C12Y207/02—Phosphotransferases with a carboxy group as acceptor (2.7.2)
    • C12Y207/02001—Acetate kinase (2.7.2.1)
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    • C12Y207/02—Phosphotransferases with a carboxy group as acceptor (2.7.2)
    • C12Y207/02007—Butyrate kinase (2.7.2.7)
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    • C12Y207/09—Phosphotransferases with paired acceptors (2.7.9)
    • C12Y207/09002—Pyruvate, water dikinase (2.7.9.2)
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    • C12Y301/03001—Alkaline phosphatase (3.1.3.1)
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    • C12Y301/03—Phosphoric monoester hydrolases (3.1.3)
    • C12Y301/03002—Acid phosphatase (3.1.3.2)
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    • C12Y301/0302—Phosphoglycerate phosphatase (3.1.3.20)
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    • C12Y301/0306—Phosphoenolpyruvate phosphatase (3.1.3.60)
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    • C12Y401/01—Carboxy-lyases (4.1.1)
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    • C12Y401/01—Carboxy-lyases (4.1.1)
    • C12Y401/01003—Oxaloacetate decarboxylase (4.1.1.3)
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    • C12Y401/01032—Phosphoenolpyruvate carboxykinase (GTP) (4.1.1.32)
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    • C12Y401/01—Carboxy-lyases (4.1.1)
    • C12Y401/01049—Phosphoenolpyruvate carboxykinase (ATP) (4.1.1.49)
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    • C12Y401/01082—Phosphonopyruvate decarboxylase (4.1.1.82)
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    • C12Y402/00—Carbon-oxygen lyases (4.2)
    • C12Y402/01—Hydro-lyases (4.2.1)
    • C12Y402/01017—Enoyl-CoA hydratase (4.2.1.17), i.e. crotonase
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    • C12Y602/00—Ligases forming carbon-sulfur bonds (6.2)
    • C12Y602/01—Acid-Thiol Ligases (6.2.1)
    • C12Y602/01001—Acetate-CoA ligase (6.2.1.1)
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    • C12Y602/01—Acid-Thiol Ligases (6.2.1)
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Abstract

본 발명은 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 경로를 함유하는 비-천연 미생물 유기체에 관한 것으로서, 상기 미생물 유기체는 특정 길이의 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산을 선택적으로 생산한다. 또한, 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 경로를 갖는 비-천연 미생물 유기체가 제공되고, 이때 상기 미생물 유기체는 아세틸-CoA 경로를 추가로 포함한다. 일부 태양에서, 본 발명의 미생물 유기체는 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산의 생산을 증가시키는 선택되는 유전자 파괴 또는 효소 약화를 갖는다. 본 발명은 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산을 생산하기 위해 상기 미생물 유기체를 사용하는 방법을 추가로 제공한다.

Description

특정 길이의 지방 알콜 및 관련 화합물의 생산을 위한 미생물 및 방법{MICROORGANISMS AND METHODS FOR PRODUCTION OF SPECIFIC LENGTH FATTY ALCOHOLS AND RELATED COMPOUNDS}
본 출원은 2012년 10월 15일자로 출원된 미국 가출원 제 61/714,144 호(이의 내용은 전체가 본 발명에 참고로 인용됨)를 우선권 주장한다.
본 발명은 일반적으로 생합성 과정, 및 보다 구체적으로 특정 길이의 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 생합성 능력을 갖는 유기체에 관한 것이다.
1차 알콜은 다양한 생물연료 및 특수 화학물질을 포함하는 다양한 산업 용도를 갖는 화합물의 생성물 부류이다. 1차 알콜은 또한 중합체 및 계면활성제를 포함한 다수의 추가적인 산업 제품의 제조에 사용될 수 있다. 예를 들어, 고급 1차 알콜(또한 지방 알콜(C4-24)로서 공지됨) 및 그의 에톡실레이트는 세계적으로 다수의 소비자 세제, 세척 제품 및 개인용 미용 위생 제품, 예를 들어 세탁용 분말 및 액체, 주방용 액체 세제 및 유리 세정제 중에 계면활성제로서 사용된다. 이들 화합물은 또한 다양한 공업용 화학물질 및 윤활유 첨가제의 제조에 사용된다. 특정 길이의 지방 알콜, 예를 들어 옥탄올 및 헥산올은 유용한 관능 성질을 가지며, 오랫동안 향료 및 풍미 물질로서 사용되어 왔다. 보다 작은 쇄 길이 C4 -8 알콜(예를 들어, 부탄올)은 도료, 코팅제 및 접착제 용도에 사용되는 아크릴레이트와 같은 유도체의 제조에 화학적 중간체로서 사용된다.
지방 알콜은 현재, 예를 들어 지방 산의 수소화, 말단 올레핀의 하이드로폼일화, n-파라핀의 부분 산화 및 에틸렌의 Al-촉매화된 중합으로부터 생산된다. 불행하게도, 지방 알콜을 석유-기재 선형 탄화수소(n-파라핀)의 산화로부터 직접 생산하는 것은 상업적으로 실행 가능하지가 않다. 이러한 실행 불능은 n-파라핀의 산화가 주로 2차 알콜, 3차 알콜 또는 케톤, 또는 이들 화합물의 혼합물을 생산하지만, 높은 수율의 지방 알콜은 생산하지 못하기 때문이다. 또한, 현재 공지된 지방 알콜의 생산 방법은 석유의 열분해를 통해 생산되는, 비교적 값비싼 공급원료, 특히 에틸렌으로 제한된다는 단점이 문제이다. 또한, 현행 방법들은 다수의 단계, 및 다수의 촉매 유형들을 필요로 한다.
미생물에 의한 지방 알콜 생산은 지방 산 합성에 이은 아실-환원 단계를 수반한다. 지방 알콜 및 다른 지방 산 유도체의 생산에 대해서 대부분의 세포에서 발견되는 보편적인 지방 산 생합성 경로들이 조사되었다. 현재 현저하게 더 높은 이론적인 생성물 및 에너지 수율을 갖는 지방 알콜 생산을 위한 보다 효율적인 생합성 경로들의 제공에 상당한 개선을 성취할 수 있다.
따라서, 상업적인 양의 지방 알콜을 유효하게 생산하기 위한 대체 수단이 필요하다. 본 발명은 이러한 필요성을 충족시키고 또한 관련된 이점들을 제공한다.
본 발명은 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 경로를 함유하는 비-천연 미생물 유기체를 제공한다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 비-천연 미생물 유기체는 도 1, 6 및 7에 묘사된 바와 같이 종결 경로와 함께 말로닐-CoA 독립적인 지방 아실-CoA 신장(MI-FAE) 주기 및/또는 말로닐-CoA 의존적인 지방 아실-CoA 신장(MD-FAE) 주기를 가지며, 이때 상기 MI-FAE 주기, MD-FAE 주기 또는 종결 경로의 효소는 하나 이상의 외인성 핵산에 의해 암호화되고 하기 화학식 I의 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산을 생산하기에 충분한 양으로 발현되고:
[화학식 I]
Figure pct00001
[상기 식에서,
R1은 C1 -24 선형 알킬이고;
R2는 CH2OH, CHO 또는 COOH이고;
R3은 H, OH 또는 옥소(=O)이고;
Figure pct00002
은 단일 또는 이중 결합을 나타내되;
R3이 결합되는 탄소 원자의 원자가는 4이다],
이때 상기 MI-FAE 주기, MD-FAE 주기 및 종결 경로의 각각의 효소들의 기질은 하기 화학식 II의 화합물, 말로닐-CoA, 프로피오닐-CoA 및 아세틸-CoA 중에서 독립적으로 선택되고:
[화학식 II]
Figure pct00003
[상기 식에서,
R1은 C1 -24 선형 알킬이고;
R3은 H, OH 또는 옥소(=O)이고;
R4는 S-CoA, ACP, OH 또는 H이고;
Figure pct00004
은 단일 또는 이중 결합을 나타내되;
R3이 결합되는 탄소 원자의 원자가는 4이다],
이때 상기 MI-FAE 주기의 하나 이상의 효소는 각각 상기 화학식 I의 화합물의 R1에서의 탄소수 이하인 R1에서의 탄소수를 갖는 화학식 II의 화합물에 대해 선택성이고, 이때 상기 MD-FAE 주기의 하나 이상의 효소는 각각 상기 화학식 I의 화합물의 R1에서의 탄소수 이하인 R1에서의 탄소수를 갖는 화학식 II의 화합물에 대해 선택성이고, 이때 상기 종결 경로의 하나 이상의 효소는 각각 상기 화학식 I의 화합물의 R1에서의 탄소수 이상인 R1에서의 탄소수를 갖는 화학식 II의 화합물에 대해 선택성이다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 경로를 갖는 비-천연 미생물 유기체를 제공하며, 이때 상기 미생물 유기체는 아세틸-CoA 경로, 및 아세틸-CoA 경로를 생성시키기에 충분한 양으로 발현되는 아세틸-CoA 경로 효소를 암호화하는 하나 이상의 외인성 핵산을 추가로 포함하고, 이때 상기 아세틸-CoA 경로는 도 2, 3, 4 또는 5에 나타낸 경로를 포함한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 경로를 갖는 비-천연 미생물 유기체를 제공하며, 이때 상기 미생물 유기체는 하나 이상의 유전자 파괴를 갖고, 이때 상기 하나 이상의 유전자 파괴는 상기 미생물 유기체에 의한 에탄올, 글리세롤, 아세테이트, 포메이트, 락테이트, CO2, 지방 산, 또는 말로닐-CoA의 고유의 생산; 시토솔 이외의 세포 구획으로의 경로 중간체들의 수송; 또는 상기 미생물 유기체에 의한 MI-FAE 주기 중간체, MD-FAE 주기 중간체 또는 종결 경로 중간체의 고유의 분해와 관련된 단백질 또는 효소를 암호화하는 내인성 유전자에서 발생하며, 상기 하나 이상의 유전자 파괴는 상기 미생물 유기체에서 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산의 증가된 생산을 부여한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 경로를 갖는 비-천연 미생물 유기체를 제공하며, 이때 상기 MI-FAE 주기, MD-FAE 주기 또는 종결 경로의 하나 이상의 효소는 NADH 보조인자와 우선적으로 반응하거나 NAD(PH)H 보조인자와의 반응에 대해 감소된 선호를 갖는다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 경로를 갖는 비-천연 미생물 유기체를 제공하며, 이때 상기 미생물 유기체는 상기 파괴에 따라 상기 미생물 유기체의 시토솔 중에 존재하는 NAD(P)H 대 NAD(P)의 증가된 비를 생성시키는 단백질 또는 효소를 암호화하는 유전자들 중 하나 이상의 유전자 파괴를 갖는다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 비-천연 미생물 유기체는 크랩트리(Crabtree) 양성이며 과잉의 글루코스를 포함하는 배양 배지 중에 존재한다. 상기와 같은 조건에서, 본 발명에 개시된 바와 같이, 상기 미생물 유기체는 상기 미생물 유기체의 시토솔 중에 존재하는 NAD(P)H 대 NAD(P)의 비가 증가할 수 있다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 경로를 갖는 비-천연 미생물 유기체를 제공하며, 이때 상기 미생물 유기체는 본 발명의 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산에 대한 세포외 운반자 또는 세포외 운반 시스템을 암호화하는 하나 이상의 외인성 핵산을 갖는다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 경로를 갖는 비-천연 미생물 유기체를 제공하며, 상기 미생물 유기체에서 상기 미생물 유기체에 의한 에탄올, 글리세롤, 아세테이트, 포메이트, 락테이트, CO2, 지방 산, 또는 말로닐-CoA의 고유의 생산; 시토솔 이외의 세포 구획으로의 경로 중간체들의 수송; 또는 상기 미생물 유기체에 의한 MI-FAE 주기 중간체, MD-FAE 주기 중간체 또는 종결 경로 중간체의 고유의 분해와 관련된 하나 이상의 내인성 효소는 약화된 효소 활성 또는 발현 수준을 갖는다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 경로를 갖는 비-천연 미생물 유기체를 제공하며, 이때 상기 미생물 유기체는 NAD(P)H 또는 NADH의 산화와 관련된 하나 이상의 내인성 효소에 대해 약화된 효소 활성 또는 발현 수준을 갖는다.
본 발명은 추가로 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산을 생산하는 조건 하에서 상기 생산에 충분한 시간 동안 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 경로를 함유하는 비-천연 미생물 유기체를 배양함으로써, 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산을 생산하는 상기 미생물 유기체를 사용하는 방법을 제공한다.
도 1은 MI-FAE 주기 또는 MD-FAE 주기의 아실-CoA 중간체로부터 지방 알콜, 알데하이드 또는 산의 생산을 위한 종결 경로와 함께 예시적인 상기 MI-FAE 주기 및/또는 MD-FAE 주기를 도시한다. 효소는 A. 티올라제; B. 3-옥소아실-CoA 리덕타제; C. 3-하이드록시아실-CoA 데하이드라타제; D. 에노일-CoA 리덕타제; E. 아실-CoA 리덕타제(알데하이드-형성); F. 알콜 데하이드로게나제; G. 아실-CoA 리덕타제(알콜-형성); H. 아실-CoA 하이드롤라제, 트랜스퍼라제 또는 신타제; J. 아실-ACP 리덕타제; K. 아실-CoA:ACP 아실트랜스퍼라제; L. 티오에스테라제; N. 알데하이드 데하이드로게나제(산-형성) 또는 카복실산 리덕타제; 및 O. 엘론가제이다.
도 2는 피루베이트 또는 쓰레오닌으로부터 시토솔 아세틸-CoA의 생산을 위한 예시적인 경로들을 도시한다. 효소는 A. 피루베이트 옥시다제(아세테이트-형성); B. 아세틸-CoA 신시타제, 리가제 또는 트랜스퍼라제; C. 아세테이트 키나제; D. 포스포트랜스아세틸라제; E. 피루베이트 데카복실라제; F. 아세트알데하이드 데하이드로게나제; G. 피루베이트 옥시다제(아세틸-포스페이트-형성); H. 피루베이트 데하이드로게나제, 피루베이트:페레독신 옥시도리덕타제, 피루베이트:NAD(P)H 옥시도리덕타제 또는 피루베이트 포메이트 라이아제; I. 아세트알데하이드 데하이드로게나제(아실화); 및 J. 쓰레오닌 알돌라제이다.
도 3은 포스포에놀피루베이트(PEP)로부터 아세틸-CoA의 생산을 위한 예시적인 경로들을 도시한다. 효소는 A. PEP 카복실라제 또는 PEP 카복시키나제; B. 옥살로아세테이트 데카복실라제; C. 말로네이트 세미알데하이드 데하이드로게나제(아세틸화); D. 아세틸-CoA 카복실라제 또는 말로닐-CoA 데카복실라제; F. 옥살로아세테이트 데하이드로게나제 또는 옥살로아세테이트 옥시도리덕타제; G. 말로네이트 세미알데하이드 데하이드로게나제(아실화); H. 피루베이트 카복실라제; J. 말로네이트 세미알데하이드 데하이드로게나제; K. 말로닐-CoA 신시타제 또는 트랜스퍼라제; L. 말산 효소; M. 말레이트 데하이드로게나제 또는 옥시도리덕타제; 및 N. 피루베이트 키나제 또는 PEP 포스파타제이다.
도 4는 시트레이트 및 말레이트 운반자를 사용하는 미토콘드리아 아세틸-CoA로부터 시토솔 아세틸-CoA의 생산을 위한 예시적인 경로들을 도시한다. 효소는 A. 시트레이트 신타제; B. 시트레이트 운반자; C. 시트레이트/말레이트 운반자; D. ATP 시트레이트 라이아제; E. 시트레이트 라이아제; F. 아세틸-CoA 신시타제 또는 트랜스퍼라제; H. 시토솔 말레이트 데하이드로게나제; I. 말레이트 운반자; J. 미토콘드리아 말레이트 데하이드로게나제; K. 아세테이트 키나제; 및 L. 포스포트랜스아세틸라제이다.
도 5는 시트레이트 및 옥살로아세테이트 운반자를 사용하는 미토콘드리아 아세틸-CoA로부터 시토솔 아세틸-CoA의 생산을 위한 예시적인 경로들을 도시한다. 효소는 A. 시트레이트 신타제; B. 시트레이트 운반자; C. 시트레이트/옥살로아세테이트 운반자; D. ATP 시트레이트 라이아제; E. 시트레이트 라이아제; F. 아세틸-CoA 신시타제 또는 트랜스퍼라제; G. 옥살로아세테이트 운반자; K. 아세테이트 키나제; 및 L. 포스포트랜스아세틸라제이다.
도 6은 R1의 선형 알킬을 신장시키기 위한 예시적인 MI-FAE 주기 및/또는 MD-FAE 주기를 도시한다. 효소는 A. 티올라제; B. 3-케토아실-CoA 리덕타제; C. 3-하이드록시아실-CoA 데하이드라타제; D. 에노일-CoA 리덕타제; 및 E. 엘론가제이다.
도 7은 도 6의 MI-FAE 주기 중간체 및 MD-FAE 주기 중간체 중 어느 하나로부터 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산을 생성시키기 위한 예시적인 종결 주기를 도시한다. 효소는 E. MI-FAE/MD-FAE 중간체-CoA 리덕타제(알데하이드-형성); F. 알콜 데하이드로게나제; G. MI-FAE/MD-FAE 중간체-CoA 리덕타제(알콜-형성); H. MI-FAE/MD-FAE 중간체-CoA 하이드롤라제, 트랜스퍼라제 또는 신타제; J. MI-FAE/MD-FAE 중간체-ACP 리덕타제; K. MI-FAE/MD-FAE 중간체-CoA:ACP 아실트랜스퍼라제; L. 티오에스테라제; 및 N. 알데하이드 데하이드로게나제(산-형성) 또는 카복실산 리덕타제이다. R1은 C1 -24 선형 알킬이고; R3은 H, OH 또는 옥소(=O)이고;
Figure pct00005
은 단일 또는 이중 결합을 나타내되; R3이 결합되는 탄소 원자의 원자가는 4이다.
도 8은 도 6에 묘사된 주기들 및 도 7에 묘사된 종결 경로들을 사용하여 4개의 MI-FAE 또는 MD-FAE 주기 중간체로부터 생성시킬 수 있는 예시적인 화합물들을 도시한다. R은 C1-24 선형 알킬이다.
도 9는 실시예 X에 제공된 바와 같이, pflAV 또는 PDH 우회경로가 있거나 없는, 다양한 MI-FAE 주기 및 종결 경로 효소들을 암호화하는 유전자들을 포함하는 플라스미드에 의해 형질전환된 사카로마이세스 세레비지아에에서의 1,3-부탄다이올(도 9A) 또는 에탄올(도 9B)의 생산을 묘사한다.
도 10은 실시예 X에 제공된 바와 같이, pflAV 또는 PDH 우회경로가 있거나 없는, 다양한 MI-FAE 주기 및 종결 경로 효소들을 암호화하는 유전자들을 포함하는 플라스미드에 의해 형질전환된 사카로마이세스 세레비지아에에서의 피루브산(도 10A), 숙신산(도 12B), 아세트산(도 12C) 또는 글루코스(도 12D)의 생산을 묘사한다.
도 11은 실시예 X에 제공된 바와 같이, pflAV 또는 PDH 우회경로가 있거나 없는, 다양한 MI-FAE 주기 및 종결 경로 효소들을 암호화하는 유전자들을 포함하는 플라스미드에 의해 형질전환된 사카로마이세스 세레비지아에에서의 1,3-부탄다이올의 생산을 묘사한다.
도 12는 실시예 XI에 제공된 바와 같은 에스케리키아 콜라이에서 아세틸-CoA 축합 활성에 대한 5개 티올라제들의 예측된 비활성을 묘사한다.
도 13은 실시예 XI에 제공된 바와 같은 에스케리키아 콜라이에서 아세틸-CoA 축합 활성에 대한 1495(3-하이드록시부티릴-CoA 데하이드로게나제)를 갖는 이중 프로모터 효모 벡터 중에 클로닝된 2개 티올라제(1491 및 560)의 예측된 비활성을 묘사한다.
도 14는 실시예 XI에 제공된 바와 같은, 3-하이드록시부티릴-CoA 데하이드로게나제에 의한 아세토아세틸-CoA의 3-하이드록시부티릴-CoA로의 대사를 측정하는데 사용되는 NADH의 산화의 형광 검출의 시간 과정을 묘사한다. 아세토아세틸-CoA는 3-하이드록시부티릴-CoA 데하이드로게나제에 의해 3-하이드록시부티릴-CoA로 대사된다. 상기 반응은 NADH의 산화를 필요로 하며, 상기 산화를 340 ㎚의 여기 파장 및 460 ㎚의 방출에서 형광에 의해 모니터링할 수 있다. 산화된 형태, NAD+는 형광을 발하지 않는다. 1495(클로스트리디움 베이제린키이(Clostridium beijerinckii)로부터의 Hbd)를 1491(벡터 id = pY3Hd17) 또는 560(벡터 id = pY3Hd16)을 함유하는 이중 프로모터 효모 벡터에서 분석하였다.
도 15는 실시예 XI에 제공된 바와 같은, 1 또는 5 ㎍/㎖ NADH 또는 1 또는 5 ㎍/㎖ NADPH의 존재 하에서의 NAD(P)H 산화의 수준을 묘사하고, Hbd가 NADPH에 비해 NADH를 선호함을 도시한다.
도 16은 실시예 XI에 제공된 바와 같은, 3-하이드록시부티릴-CoA를 3-하이드록시부티르알데하이드로 전환시키고 NAD(P)H 산화(이는 효소 활성을 모니터링할 때 사용될 수 있다)를 필요로 하는 알데하이드 리덕타제의 조 용해물에 대한 활성 데이터를 묘사한다. 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis)로부터의 Ald(유전자 ID 707)를 클로스트리디움 사카로페르부틸아세토니쿰(Clostridium saccharoperbutylacetonicum)으로부터의 알콜 데하이드로게나제(유전자 ID 28)를 함유하는 이중 벡터 중에 클로닝하였다. 상기 두 효소를 Leu 마커를 함유하는 또 다른 이중 프로모터 효모 벡터 중에 클로닝하였다. 에스케리키아 콜라이로부터의 707 용해물을 표준으로서 사용하였다.
도 17은 3-하이드록시부티르알데하이드에 대한 대용 기질인 부티르알데하이드와 함께 ALD(유전자 707)를 갖는 이중 프로모터 벡터에서의 ADH(유전자 28)의 평가를 묘사한다. 1,3-BDO는 NAD(P)H의 존재 하에서 3-하이드록시부티르알데하이드를 환원시키는 알콜 데하이드로게나제(Adh)에 의해 형성되며, 상기 NAD(P)H의 산화를 사용하여 상기 반응을 모니터링한다.
본 발명에 사용되는 바와 같이, "비-천연"이란 용어는 본 발명의 미생물 유기체 또는 미생물에 관하여 사용될 때 상기 미생물 유기체가 기준 종의 야생형 균주를 포함하여 상기 기준 종의 천연 균주에서 통상적으로 발견되지 않는 하나 이상의 유전자 변경을 가짐을 의미하고자 한다. 유전자 변경은 예를 들어 대사 폴리펩타이드를 암호화하는 발현 가능한 핵산, 다른 핵산 첨가, 핵산 결실 및/또는 상기 미생물 유기체의 유전 물질의 다른 기능 파괴를 도입시키는 변형을 포함한다. 상기와 같은 변형은, 예를 들어 상기 기준 종에 대한 이종, 동종 또는 이종 및 동종 모두의 폴리펩타이드에 대한 암호화 영역 및 그의 작용성 단편을 포함한다. 추가적인 변형은, 예를 들어 상기 변형이 유전자 또는 오페론의 발현을 변경시키는 비-암호화 조절 영역을 포함한다. 예시적인 대사 폴리펩타이드는 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 알콜 생합성 경로내의 효소 또는 단백질을 포함한다.
대사적 변형은 천연 상태로부터 변경된 생화학 반응을 지칭한다. 따라서, 비-천연 미생물은 대사 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 또는 그의 작용성 단편에 대한 유전자 변형을 가질 수 있다. 예시적인 대사적 변형은 본 발명에 개시된다.
본 발명에 사용되는 바와 같이, "단리된"이란 용어는 미생물 유기체에 관하여 사용될 때 상기 기준 미생물 유기체가 자연에서 발견된 때의 하나 이상의 성분이 실질적으로 없는 유기체를 의미하고자 한다. 상기 용어는 미생물 유기체가 그의 자연 환경에서 발견된 때의 성분이 일부 또는 전부 제거된 미생물 유기체를 포함한다. 상기 용어는 미생물 유기체가 비-천연 환경에서 발견된 때의 성분이 일부 또는 전부 제거된 미생물 유기체를 추가로 포함한다. 따라서, 단리된 미생물 유기체는 자연에서 발견된 때 또는 비-천연 환경에서 증식되거나, 보관되거나, 존재하는 때의 다른 물질로부터 부분적으로 또는 완전히 분리된다. 단리된 미생물 유기체의 특정한 예는 부분적으로 순수한 미생물, 실질적으로 순수한 미생물 및 비-천연인 배지에서 배양된 미생물을 포함한다.
본 발명에 사용되는 바와 같이, "미생물의", "미생물 유기체" 또는 "미생물"이란 용어들은 고세균, 세균 또는 진핵생물의 도메인 내에 포함되는 미시적 세포로서 존재하는 임의의 유기체를 의미하고자 한다. 따라서, 상기 용어는 미시적 크기를 갖는 원핵생물 또는 진핵생물 세포 또는 유기체를 포함하고자 하며 모든 종의 세균, 고세균 및 진정세균뿐만 아니라 효모 및 진균과 같은 진핵생물 미생물을 포함한다. 상기 용어는 또한 생화학물질의 생산을 위해 배양될 수 있는 임의의 종의 세포 배양물을 포함한다.
본 발명에 사용되는 바와 같이, "CoA" 또는 "조효소 A"란 용어는 활성 효소 시스템을 형성하기 위해 많은 효소들(아포효소)의 활성에 필요한 유기 보조인자 또는 보결기(효소의 비단백질 부분)를 의미하고자 한다. 조효소 A는 몇몇 축합 효소들에서 기능하며, 아세틸 또는 다른 아실기 수송 및 지방 산 합성 및 산화, 피루베이트 산화 및 다른 아세틸화에 작용한다.
본 발명에 사용되는 바와 같이, "ACP" 또는 "아실 담체 단백질"이란 용어는 세균에서부터 식물에 이르는 다수 유기체들의 지방 산 신타제 시스템과 결합하는 비교적 작은 산성 단백질들 중 어느 하나를 지칭한다. ACP는 세린 잔기의 하이드록실기에 포스페이트 에스터 결합에 의해 공유적으로 결합된 하나의 4'-포스포판테테인 보결기를 함유할 수 있다. 상기 4'-포스포판테테인 부분의 설프하이드릴기는 아실 중간체가 지방 산 합성 중 (티오)에스터화되는 앵커로서 작용한다. ACP의 일례는 77 아미노산 잔기(8.85 kDa)를 함유하는 분리된 단일 단백질인 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) ACP이며, 이때 상기 포스포판테테인기는 세린 36에 결합한다.
본 발명에 사용되는 바와 같이, "실질적으로 혐기성"이란 용어는 배양 또는 생육 조건에 관하여 사용될 때 산소의 양이 액체 배지 중에 약 10% 미만의 용존산소 포화임을 의미하고자 한다. 상기 용어는 또한 약 1% 미만의 산소의 분위기로 유지되는 액체 또는 고체 배지의 밀폐된 챔버를 포함하고자 한다.
본 발명에 사용되는 바와 같은 "외인성"은 기준 분자 또는 기준 활성이 숙주 미생물 유기체내로 도입됨을 의미하고자 한다. 상기 분자를, 예를 들어 숙주 염색체내로의 편입에 의해서 또는 플라스미드와 같은 비-염색체 유전 물질로서 숙주 유전 물질 내로의 암호화 핵산의 도입에 의해 도입시킬 수 있다. 따라서, 상기 용어는 암호화 핵산의 발현에 관하여 사용될 때 상기 암호화 핵산을 발현 가능한 형태로 미생물 유기체내로 도입시킴을 지칭한다. 생합성 활성에 관하여 사용될 때 상기 용어는 숙주 기준 유기체내로 도입되는 활성을 지칭힌다. 상기 공급원은 예를 들어 상기 숙주 미생물 유기체내로의 도입에 따라 상기 기준 활성을 발현하는 동종 또는 이종 암호화 핵산일 수 있다. 따라서, "내인성"이란 용어는 숙주 중에 존재하는 기준 분자 또는 활성을 지칭힌다. 유사하게, 상기 용어는 암호화 핵산의 발현에 관하여 사용될 때 상기 미생물 유기체 내에 함유된 암호화 핵산의 발현을 지칭한다. "이종"이란 용어는 상기 기준 종 이외의 공급원으로부터 유래한 분자 또는 활성을 지칭하는 반면 "동종"은 상기 숙주 미생물 유기체로부터 유래한 분자 또는 활성을 지칭한다. 따라서, 본 발명의 암호화 핵산의 외인성 발현은 이종 및 동종 암호화 핵산 중 어느 하나 또는 이들 모두를 사용할 수 있다.
하나보다 많은 외인성 핵산이 미생물 유기체에 포함될 때, 상기 하나보다 많은 외인성 핵산은 상기에 논의된 바와 같이 상기 기준 암호화 핵산 또는 생합성 활성을 지칭하는 것으로 이해된다. 추가로, 본 발명에 개시되는 바와 같이, 상기와 같은 하나보다 많은 외인성 핵산을 분리된 핵산 분자, 다시스트론성 핵산 분자 또는 이들의 조합상의 숙주 미생물 유기체 내로 도입시킬 수 있고, 여전히 하나보다 많은 외인성 핵산으로서 간주할 수 있는 것으로 이해된다. 예를 들어, 본 발명에 개시되는 바와 같이, 미생물 유기체를 목적하는 경로 효소 또는 단백질을 암호화하는 2개 이상의 외인성 핵산을 발현하도록 조작할 수 있다. 목적하는 활성을 암호화하는 2개의 외인성 핵산을 숙주 미생물 유기체 내로 도입시키는 경우에, 상기 2개의 외인성 핵산을, 예를 들어 단일 플라스미드, 분리된 플라스미드 상에 단일 핵산으로서 도입시킬 수 있고, 단일 부위 또는 다수의 부위에서 숙주 염색체 내로 편입시킬 수 있으며, 여전히 2개의 외인성 핵산으로서 간주할 수 있는 것으로 이해된다. 유사하게, 2개보다 많은 외인성 핵산을, 예를 들어 단일 플라스미드, 분리된 플라스미드 상에서 임의의 목적하는 조합으로 숙주 유기체 내로 도입시킬 수 있으며, 단일 부위 또는 다수의 부위에서 상기 숙주 염색체 내로 편입시킬 수 있고 여전히 2개 이상의 외인성 핵산, 예를 들어 3개의 외인성 핵산으로서 간주할 수 있는 것으로 이해된다. 따라서, 기준 외인성 핵산 또는 생합성 활성의 수는 암호화 핵산의 수 또는 생합성 활성의 수를 지칭하는 것이지, 상기 숙주 유기체 내로 도입되는 분리된 핵산들의 수를 지칭하는 것은 아니다.
본 발명에 사용되는 바와 같이, "유전자 파괴"란 용어 또는 그의 문법적으로 동등한 용어는 상기 암호화된 유전자 산물을 불활성으로 또는 약하게 만드는 유전자 변경을 의미하고자 한다. 상기 유전자 변경은, 예를 들어 전체 유전자의 결실, 전사 또는 번역에 필요한 조절 서열의 결실, 절두된 유전자 산물을 생성시키는 유전자의 일부의 결실, 또는 암호화된 유전자 산물을 불활성화하거나 약화시키는 다양한 돌연변이 전략들 중 어느 하나일 수 있다. 유전자 파괴의 특히 유용한 한 가지 방법은 완전한 유전자 결실인데, 이는 상기 결실이 본 발명의 비-천연 미생물에서 유전자 복귀의 발생을 감소시키거나 제거하기 때문이다. 유전자 파괴는 또한 삭제 돌연변이를 포함하며, 상기 돌연변이는 RNA로 전사되지 않고/않거나 기능성 유전자 산물로 번역되지 않는 유전자를 생성시키는 유전자를 함유하는 영역 또는 유전자내 돌연변이를 지칭한다. 상기와 같은 삭제 돌연변이는 다수 유형의 돌연변이, 예를 들어 불활성화 점 돌연변이, 유전자의 일부의 결실, 전체 유전자 결실, 또는 염색체 분절의 결실로부터 발생할 수 있다.
본 발명에 사용되는 바와 같이, "증식-커플링된"이란 용어는 생화학 산물의 생산에 관하여 사용될 때 기준 생화학 산물의 생합성이 미생물의 증식기 동안 생성됨을 의미하고자 한다. 특정 실시태양에서, 상기 증식-커플링된 생산은 필수적일 수 있으며, 이는 상기 기준 생화학 산물의 생합성이 미생물의 증식기 동안 생성되는 필수적인 생성물임을 의미한다.
본 발명에 사용되는 바와 같이, "약화된다"란 용어 또는 그의 문법적으로 동등한 용어는 효소 또는 단백질의 활성 또는 양이 약하게 되거나, 축소되거나, 감소됨을 의미하고자 한다. 효소 또는 단백질의 활성 또는 양의 약화는 상기 약화가 상기 활성 또는 양을 주어진 경로에 필요한 임계 수준 아래로 떨어뜨려 작용하게 하는 경우 완전한 파괴를 모방할 수 있다. 그러나, 하나의 경로에 대한 완전한 파괴를 모방하는 효소 또는 단백질의 활성 또는 양의 약화는 별도의 경로가 계속해서 작용하기에는 여전히 충분할 수 있다. 예를 들어, 내인성 효소 또는 단백질의 약화는 본 발명의 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 생성물의 생산을 위해 동일한 효소 또는 단백질의 완전한 파괴를 모방하기에 충분할 수 있지만, 효소 또는 단백질의 나머지 활성 또는 양은 다른 경로, 예를 들어 숙주 미생물 유기체가 생존하거나, 번식하거나, 성장하는데 중요한 경로를 유지하기에는 충분할 수 있다. 효소 또는 단백질의 약화는 또한 상기 효소 또는 단백질의 활성 또는 양을, 본 발명의 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 생성물의 수율을 증가시키기에 충분하지만 상기 효소 또는 단백질의 완전한 파괴를 반드시 모방하기에는 충분하지 않은 양으로 약화, 축소 또는 감소시킬 수 있다.
본 발명에 사용되는 바와 같은 "지방 알콜"이란 용어는 하나 이상의 하이드록실기를 함유하고 4개 이상의 탄소 원자의 쇄를 함유하는 지방족 화합물을 의미하고자 한다. 상기 지방 알콜은 같은 수의 탄소 원자를 갖는 상응하는 알데하이드 또는 산을 형성하도록 산화시킬 수 있는 -CH2OH 기를 갖는다. 지방 알콜은 또한 포화된 지방 알콜, 불포화된 지방 알콜, 1,3-다이올 또는 3-옥소-알칸-1-올일 수 있다. 예시적인 지방 알콜은 하기 화학식 III 내지 VI의 화합물을 포함한다:
[화학식 III]
Figure pct00006
[화학식 IV]
Figure pct00007
[화학식 V]
Figure pct00008
[화학식 VI]
Figure pct00009
상기 식에서,
R1은 C1 -24 선형 알킬이다.
본 발명에 사용되는 바와 같은 "지방 알데하이드"란 용어는 알데하이드(CHO) 기를 함유하고 4개 이상의 탄소 원자의 쇄를 함유하는 지방족 화합물을 의미하고자 한다. 상기 지방 알데하이드는 환원되어 상응하는 알콜을 형성하거나 산화되어 동일한 수의 탄소 원자를 갖는 카복실산을 형성할 수 있다. 지방 알데하이드는 또한 포화된 지방 알데하이드, 불포화된 지방 알데하이드, 3-하이드록시알데하이드 또는 3-옥소알데하이드일 수 있다. 예시적인 지방 알데하이드는 하기 화학식 VII 내지 X의 화합물을 포함한다:
[화학식 VII]
Figure pct00010
[화학식 VIII]
Figure pct00011
[화학식 IX]
Figure pct00012
[화학식 X]
Figure pct00013
상기 식에서,
R1은 C1 -24 선형 알킬이다.
본 발명에 사용되는 바와 같은 "지방 산"이란 용어는 카복실산 기를 함유하고 4개 이상의 탄소 원자의 쇄를 함유하는 지방족 화합물을 의미하고자 한다. 상기 지방 산은 환원되어 같은 수의 탄소 원자를 갖는 상응하는 알콜 또는 알데하이드를 형성할 수 있다. 지방 산은 또한 포화된 지방 산, 불포화된 지방 산, 3-하이드록시산 또는 3-옥소산일 수 있다. 예시적인 지방 산은 하기 화학식 XI 내지 XIV의 화합물을 포함한다:
[화학식 XI]
Figure pct00014
[화학식 XII]
Figure pct00015
[화학식 XIII]
Figure pct00016
[화학식 XIV]
Figure pct00017
상기 식에서,
R1은 C1 -24 선형 알킬이다.
"알킬"이란 용어는 선형의 포화된 1가 탄화수소를 지칭한다. 상기 알킬은 1 내지 24개(C1-24), 1 내지 17개(C1-17) 또는 9 내지 13개(C9-13)의 탄소원자를 갖는 선형의 포화된 1가 탄화수소일 수 있다. 알킬기의 예는 비제한적으로 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸, 헥실, 헵틸, 옥틸, 노닐, 데실, 운데실 및 도데실을 포함한다. 예를 들어 C9-13 알킬은 9 내지 13개의 탄소 원자의 선형의 포화된 1가 탄화수소를 지칭한다.
본원에 개시된 발명은 적어도 부분적으로 종결 경로와 함께 말로닐-CoA 독립적인 지방 산 신장(MI-FAE) 주기 및/또는 말로닐-CoA 의존적인 지방 산 신장(MD-FAE) 주기를 사용하여 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산을 합성할 수 있는 재조합 미생물을 기본으로 한다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 미생물은 아실-CoA 종결 경로와 커플링된 이종 MI-FAE 주기 및/또는 MD-FAE 주기를 사용하여 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산을 형성할 수 있다. 상기 MI-FAE 주기는 티올라제, 3-옥소아실-CoA 리덕타제, 3-하이드록시아실-CoA 데하이드라타제 및 에노일-CoA 리덕타제를 포함할 수 있다. 상기 MD-FAE 주기는 엘론가제, 3-옥소아실-CoA 리덕타제, 3-하이드록시아실-CoA 데하이드라타제 및 에노일-CoA 리덕타제를 포함할 수 있다. 상기 MI-FAE 주기 및/또는 MD-FAE 주기를 통한 각 경로는 상기 신장 주기에 진입하는 아실-CoA 기질에 비해 단일의 2 탄소 단위에 의해 신장되는 아실-CoA를 형성시킨다. 생성물은 상기 아실-CoA 신장 경로에 진입하는 초기 기질, 즉 2개의 아세틸-CoA 기질, 말로닐-CoA 또는 프로피오닐-CoA 기질과 병용된 하나의 아세틸-CoA 기질에 따라 짝수 또는 홀수 쇄 길이일 수 있다. 상기 두 아세틸-CoA 기질 또는 말로닐-CoA는 짝수 쇄 길이 생성물을 생성시키는 반면, 상기 프로피오닐-CoA 기질에 의한 신장은 홀수 쇄 길이의 생성물을 생성시킨다. 종결 경로는 MI-FAE 중간체 및/또는 MD-FAE 중간체, 예를 들어 아실-COA의 그의 상응하는 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 생성물로의 전환을 촉매화한다. MI-FAE 주기, MD-FAE 주기 및 종결 경로 효소들은 상기 미생물의 하나 이상의 구획에서 발현될 수 있다. 예를 들어, 하나의 실시태양에서, 모든 MI-FAE 주기 및 종결 경로 효소들은 시토솔에서 발현된다. 또 다른 실시태양에서, 모든 MD-FAE 주기 및 종결 경로 효소들은 시토솔에서 발현된다. 추가로, 본 발명의 미생물을, 목적하는 생성물을 추가의 조작 또는 단리를 위해 배양 배지 또는 발효 브로쓰 내로 임의로 분비하도록 가공할 수 있다.
본 발명의 생성물은 상기 MI-FAE 주기 및/또는 MD-FAE 주기의 중간체로부터 유도된 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산을 포함한다. 예를 들어, 알콜 생성물은 포화된 지방 알콜, 불포화된 지방 알콜, 1,3-다이올, 및 3-옥소-알칸-1-올을 포함할 수 있다. 알데하이드 생성물은 포화된 지방 알데하이드, 불포화된 지방 알데하이드, 3-하이드록시알데하이드 및 3-옥소알데하이드를 포함할 수 있다. 산 생성물은 포화된 지방 산, 불포화된 지방 산, 3-하이드록시산 및 3-옥소산을 포함할 수 있다. 이들 생성물을 화학적 또는 효소적 수단에 의해 지방 에스터와 같은 유도체로 추가로 전환시킬 수 있다. 지방 알콜의 에스터로의 전환 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 비-천연 미생물이 탄소 및 환원 당량을 특정한 쇄 길이의 발효 산물로 향하게 효율적으로 지시하도록, 숙주 균주 가공 전략과 함께 지방 알콜, 지방 알데하이드 및 지방 산 쇄-길이 조절 전략을 포함한다.
본 발명의 재조합 미생물은 탄소수 4(C4) 내지 탄소수 24(C24) 또는 그 이상의 쇄 길이 범위의 상업적인 양의 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산을 생산할 수 있다. 본 발명의 미생물은 특정 쇄 길이에 대해 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 85%, 90%, 95% 이상 선택성인 목적하는 생성물을 생산할 수 있다. 상기 생성물의 탄소 쇄-길이는 하나 이상의 종결 경로 효소(도 7의 단계 E 내지 N)와 함께 MI-FAE 주기의 하나 이상의 효소(도 6의 단계 A/B/C/D) 및/또는 MD-FAE 주기의 하나 이상의 효소(도 6의 단계 E/B/C/D)에 의해 조절된다. 쇄 길이를 상기 신장 주기 동안 목적하는 생성물 크기 이하의 탄소 원자 수를 갖는 MI-FAE 주기 기질에 대해 선택성을 나타내는 하나 이상의 MI-FAE 주기 효소(티올라제, 3-옥소아실-CoA 리덕타제, 3-하이드록시아실-CoA 데하이드라타제 및/또는 에노일-CoA 리덕타제)에 의해 캡핑할 수 있다. 다르게는, 또는 또한, 쇄 길이를 상기 신장 주기 동안 하나 이상의 MD-FAE 주기 효소(에놀라제, 3-옥소아실-CoA 리덕타제, 3-하이드록시아실-CoA 데하이드라타제 및/또는 에노일-CoA 리덕타제)에 의해 캡핑할 수 있다. 쇄 길이는 하나 이상의 종결 효소가 오직 목적하는 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 생성물 이상의 탄소수를 갖는 기질과 반응하도록 상기 MI-FAE 주기 중간체의 상기 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 생성물로의 전환을 촉매화하는 하나 이상의 효소에 의해 추가로 제한될 수 있다.
상기 MI-FAE-CoA 중간체 또는 MD-FAE-CoA 중간체의 지방 알콜로의 전환을 촉매화하는 종결 경로 효소는 지방 아실-CoA 리덕타제(알콜 또는 알데하이드 형성), 지방 알데하이드 리덕타제, 아실-ACP 리덕타제, 아실-CoA:ACP 아실트랜스퍼라제, 티오에스테라제, 아실-CoA 하이드롤라제 및/또는 카복실산 리덕타제의 조합(도 7의 경로 G; E/F; H/N/F; 또는 K/L/N/F)을 포함할 수 있다. 상기 MI-FAE-CoA 중간체 또는 MD-FAE-CoA 중간체의 지방 산으로의 전환에 대한 종결 경로 효소는 티오에스테라제, CoA 하이드롤라제, 아실-CoA:ACP 아실트랜스퍼라제, 알데하이드 데하이드로게나제 및/또는 아실-ACP 리덕타제의 조합(도 7의 경로 H; K/L; E/N; K/J/N)을 포함할 수 있다. 지방 알데하이드의 생성을 위해서, 상기 종결 경로 효소는 지방 아실-CoA 리덕타제(알데하이드-형성), 아실-ACP 리덕타제, 아실-CoA:ACP 아실트랜스퍼라제, 티오에스테라제, 아실-CoA 하이드롤라제 및/또는 카복실산 리덕타제의 조합(도 7의 경로 E; K/J; H/N; 또는 K/L/N)을 포함할 수 있다.
본 발명의 비-천연 미생물 유기체는 또한 탄소, 에너지 및 환원 당량을 포함한 세포 자원을 지방 알콜, 지방 알데하이드 및 지방 산의 생산으로 효율적으로 향하게 하여, 천연 유기체에 비해 개선된 수율, 생산성 및/또는 역가를 생성시킬 수 있다. 하나의 실시태양에서, 상기 미생물을 시토솔 아세틸-CoA 수준을 증가시키도록 변형시킨다. 또 다른 실시태양에서, 상기 미생물을, 시토솔 아실-CoA가 다른 부산물 또는 세포 과정보다는 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산으로 효율적으로 향하도록 변형시킨다. 부산물의 형성을 도출하는 효소 또는 경로를 약화시키거나 결실시킬 수 있다. 예시적인 부산물은 비제한적으로 에탄올, 글리세롤, 락테이트, 아세테이트, 에스터 및 이산화 탄소를 포함한다. 추가적인 부산물은 지방-아실-CoA 유도체, 예를 들어 알콜, 알켄, 알칸, 에스터, 산 및 알데하이드를 포함할 수 있다. 따라서, 부산물은 탄소 및/또는 환원 당량을 관심 생성물로부터 딴 데로 돌리는 임의의 발효 산물을 포함할 수 있다.
또 다른 실시태양에서, 환원 당량 또는 산화환원 비의 이용도를 증가시킨다. 더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 미생물의 보조인자 요건들을 탄소 동화 및 중심 대사 중에 생성된 동일한 환원된 보조인자가 MI-FAE 주기, MD-FAE 주기 및/또는 종결 경로 효소에 의해 이용되도록 균형을 잡는다. 더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 생산 유기체는 상기 세포로부터 상기 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산을 수출하는 운반자를 발현한다.
지방 알콜 생산이 가능한 미생물 유기체는 본 발명에서 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisaie) 유전자 배경을 참조하여 예시된다. 그러나, 현재 수천 개의 종에 대해 입수할 수 있는 완전한 게놈 서열(이중 절반 넘게 NCBI와 같은 공개 데이터베이스상에서 입수할 수 있다)과 함께, 하나 이상의 유전자에 대한 대안적인 종 상동기관, 예를 들어 이종 상동체, 상동체 및 비-이종 상동성 유전자 치환의 동정, 및 진핵생물 유기체들 간의 유전자 변경의 교체는 당해 분야에서 통상적이며 널리 공지되어 있다. 따라서, 사카로마이세스 세레비지아에와 같은 특정 유기체를 참조하여 본 발명에 개시된 지방 알콜의 생산을 가능하게 하는 대사적 변경을 다른 유기체들에 쉽게 적용할 수 있다. 본 발명에 제공된 교시 및 지침에 의해, 당해 분야의 숙련가들은 하나의 유기체에서 예시된 대사적 변경을 다른 유기체에 동등하게 적용할 수 있음을 안다.
본 발명의 방법을 다양한 원핵생물 및 진핵생물 유기체, 예를 들어 세균, 효모 및 진균에 적용할 수 있다. 예를 들어, 효모는 사카로마이세스 세레비지아에 및 리조푸스 아리주스(Rhizopus arrhizus)를 포함할 수 있다. 예시적인 진핵생물 유기체는 또한 크랩트리 양성 및 음성 효모, 및 사카로마이세스, 클루이베로마이세스, 칸디다 또는 피키아 속의 효모들을 포함할 수 있다. 추가의 예시적인 진핵생물 종은 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 클루이베로마이세스 마르시아누스(Kluyveromyces marxianus), 아스퍼질러스 테레우스(Aspergillus terreus), 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger), 리조푸스 아리주스, 리조푸스 오리자에(Rhizopus oryzae), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 칸디다 보이디니이(Candida boidinii), 칸디다 소노렌시스(Candida sonorensis), 칸디다 트로피칼리스(Candida tropicalis), 야로위아 리포리티카(Yarrowia lipolytica) 및 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) 중에서 선택된 것들을 포함한다. 또한, 보다 큰 진핵생물 유기체로부터 선택된 세포를 또한 본 발명의 방법에 적용할 수 있다. 예시적인 세균은 에스케리키아 콜라이, 클렙시엘라 옥시토카(Klebsiella oxytoca), 아나에로비오스피릴룸 숙시니시프로듀센스(Anaerobiospirillum succiniciproducens), 액티노바실러스 숙시노제네스(Actinobacillus succinogenes), 만헤이미아 숙시니시프로듀센스(Mannheimia succiniciproducens), 리조븀 에틀리(Rhizobium etli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 글루코노박터 옥시단스(Gluconobacter oxydans), 자이모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis), 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 스트렙토마이세스 코엘리콜라(Streptomyces coelicolor), 클로스트리디움 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum), 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens), 및 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) 중에서 선택된 종을 포함한다.
본 발명의 일부 태양에서, 본 발명에 개시된 MI-FAE 주기 및 종결 경로를 통한 지방 알콜, 지방 알데하이드 및 지방 산의 생성은, 상기 주기 및 경로가 천연 생합성 경로, 예를 들어 널리 공지된 말로닐-CoA 의존적인 지방 산 합성 경로, 또는 일부의 태양에서 말로닐-ACP 의존적인 지방 산 생합성 경로를 통해서 더 높은 생성물 및 ATP 수율을 생성시키기 때문에 특히 유용하다. 예를 들어 C2 연장 단위로서 말로닐-아실 담체 단백질(말로닐-ACP) 대신에 아세틸-CoA를 사용하는 것은(예를 들어, 도 1, 단계 A) 상기 MI-FAE 주기에 진입하는 아세틸-CoA의 단위 흐름(flux)당 1 ATP 분자를 절약한다. 상기 MI-FAE 주기는 아실-ACP 대신에 아실-CoA를 생성시키고, 아세틸-CoA를 연장제 단위로서 사용하는 경우 옥탄올 및 다른 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산의 생성을 위한 ATP-소모성 아실-CoA 신타제 반응의 필요성을 배제시킬 수 있다. 본 발명의 지방 알콜, 지방 알데하이드 및 지방 산 생산 유기체는 또한 화학 제품의 제조에 저렴한 재생 공급원료를 전환시키는데 생합성 공정을 사용할 수 있게 한다.
본 발명의 진핵생물 유기체를 글루코스, 자일로스, 프럭토스, 합성가스, 메탄올 등을 포함한 다양한 공급원료를 대사하고/하거나 함께 사용하도록 추가로 가공할 수 있다.
쇄 길이 조절은 매우 활성인 효소와 목적하는 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산의 생합성에 적합한 범위의 기질을 병용하여 성취할 수 있다. 상기 생성물의 쇄 길이를 MI-FAE 주기, MD-FAE 주기 및 종결 경로 중 하나 이상의 효소를 사용하여 조절할 수 있다. 본 발명에 개시된 바와 같이, 쇄 길이를 상기 MI-FAE 주기 동안 하나 이상의 MI-FAE 주기 효소(티올라제, 3-옥소아실-CoA 리덕타제, 3-하이드록시아실-CoA 데하이드라타제 및/또는 에노일-CoA 리덕타제)에 의해서, 및 상기 MD-FAE 주기의 경우 하나 이상의 MD-FAE 주기 효소(에놀라제, 3-옥소아실-CoA 리덕타제, 3-하이드록시아실-CoA 데하이드라타제 및/또는 에노일-CoA 리덕타제)에 의해 캡핑할 수 있으며, 상기 효소들은 목적하는 생성물 크기 이하의 탄소수를 갖는 MI-FAE 및/또는 MD-FAE 주기 기질에 대해 선택성을 나타낼 수 있다. 효소는 가역적이기 때문에, 상기 신장 경로 효소들 중 어떤 효소도 상기 능력으로 작용할 수 있다. 넓은 기질 범위를 갖지만 한정된 쇄-길이 경계를 갖는 효소를 선택하는 것은 생성물 특이성을 부여하면서 다수의 신장 주기를 촉매화하는 단일 효소의 사용을 가능하게 한다. 보다 짧은 부산물의 특이성을 더욱 연마(hone)하고 축적을 방지하기 위해서, 하나 이상의 효소가 아실-CoA 또는 목적하는 쇄 길이 이상의 탄소수를 갖는 다른 종결 경로 기질들에 대해 선택성이도록, 생성물-형성 종결 효소들에 의해 선택성이 더욱 제한된다. 상이한 쇄 길이 생성물을 생산하는 내인성 경로 효소의 결실 또는 약화는 생성물 특이성을 더욱 연마할 수 있다.
본 발명에 개략된 접근법들을 사용하여, 당해 분야의 숙련가는 특정한 쇄 길이의 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 생성물을 선택적으로 생산하는 특성화된 기질 범위를 갖는 효소를 문헌으로부터 선택할 수 있다. 목적하는 길이의 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산을 선택적으로 생성시키기 위해서, 상술한 바와 같이 상이한 선택성 범위를 갖는 문헌에 공지된 효소들의 조합을 사용할 수 있다. 예를 들어, C16 지방 알콜을 생산하는 비-천연 미생물 유기체는 라투스 노르베기쿠스 아카알라(Rattus norvegicus Acaala) 티올라제 및 마이코박테리움 스메그마티스(Mycobacterium smegmatis)의 에노일-CoA 리덕타제와 같은 효소(이들 효소는 C16 길이 이하의 기질만을 수용한다)를 발현할 수 있다. 1 또는 2개의 쇄 신장 효소 모두와 C16 -18 지방 아실-CoA 리덕타제(알콜 또는 알데하이드 형성), 예를 들어 심몬드시아 키넨시스(Simmondsia chinensis)의 FAR과의 커플링은 보다 짧은 알콜 생성물의 합성을 감소시킴으로써 생성물 특이성을 추가로 증가시킨다. 또 다른 예로서, 본 발명의 비-천연 미생물 유기체는 아라비도프시스 탈리아나의 3-하이드록시아실-CoA 데하이드라타제를 애시네토박터 스페시즈(Acinetobacter species) 균주 M-1의 아실-CoA 리덕타제 Acr1과 병용함으로써 길이 C14의 알콜을 선택적으로 생산할 수 있다. 길이 C14의 3-옥소산을 생성시키기 위해서, 예를 들어 래트 티올라제를 솔라늄 라이코페르시쿰의 3-옥소아실-CoA 하이드롤라제와 병용할 수 있다. 더욱 추가의 예로서, C18 지방 산을 생성시키기 위해서, 살모넬라 엔테리카(Salmolnella enterica) fadE 에노일-CoA 리덕타제를 에스케리키아 콜라이의 tesB 티오에스테라제와 병용할 수 있다. 더욱 또 다른 예에서, C6 알콜의 선택적인 생산은 랄스토니아 유트로파(Ralstonia eutropha)로부터의 paaH1 티올라제를 레이프소니아 스피시즈(Leifsonia species) S749 알콜 데하이드로게나제 lsadh와 병용함으로써 형성된다.
예시적인 MI-FAE 주기, MD-FAE 주기 및 종결 경로 효소들을 실시예 I에 상세히 개시한다. 본 발명에 개시된 생합성 효소들은 다양한 정도의 기질 특이성을 나타낸다. 문헌에서 특성화된 효소들의 예시적인 기질 범위를 하기 표에 나타내고 실시예 I에 더욱 상세히 개시한다.
Figure pct00018
Figure pct00019
상기 MI-FAE 주기 또는 MD-FAE 주기에서 각 효소의 쇄-길이 특이성의 차이를 고려하여, 당해 분야의 숙련가는 각 신장 주기 반응 단계(도 6의 단계 A 내지 D 또는 단계 E/B/C/D)를 촉매화하기 위한 하나 이상의 효소를 선택할 수 있다. 예를 들어, MI-FAE 주기의 티올라제 단계의 경우, 일부 티올라제 효소, 예를 들어 랄스토니아 유트로파의 bktB는 짧은- 및 중간-쇄 아실-CoA 중간체(C6 -8)의 신장을 촉매화하는 반면, 다른 것들, 예를 들어 라투스 노르베기쿠스의 Acaala는 보다 긴-쇄 기질(C10 -16)에 대해 활성이다. 따라서, 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산을 생산하는 미생물 유기체는 티올라제, 엘론가제, 3-옥소아실-CoA 리덕타제, 3-하이드록시아실-CoA 데하이드라타제 및/또는 에노일-CoA 리덕타제 중 1, 2, 3 또는 4개 이상의 변이체를 포함할 수 있다.
효소들의 쇄 길이 특이성을 당해 분야에 널리 공지된 방법에 의해 분석할 수 있다(예를 들어 문헌[Wrensford et al, Anal Biochem 192:49-54 (1991)]). 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 생산 효소의 기질 범위를 당해 분야에 널리 공지된 방법에 의해 더욱 확장시키거나 좁힐 수 있다. 생물학적으로 발생하는 효소의 변이체를 예를 들어 본 발명에 개시된 바와 같은 합리적 및 방향 진화, 돌연변이 및 효소 셔플링에 의해 생성시킬 수 있다. 일례로서, 쇄 길이 특이성을 변경시키기 위한 합리적인 공학적 접근법이 데니치와 바이스만(Denic and Weissman)에 의해 채용되었다(문헌[Denic and Weissman (Denic and Weissman, Cell 130:663-77 (2008)]). 데니치와 바이스만은 쇄 길이를 맡고 있는 효모 엘론가제 단백질 ELOp의 영역을 지도화하고, 돌연변이를 도입시켜 지방 산 생성물의 길이를 변화시켰다. 이 경우에, 소수성 기질 포켓의 기하학적 형태는 쇄 길이에 대한 최대 경계치를 지정하였다. 유사한 접근법이 상기 MI-FAE 주기, MD-FAE 주기 및/또는 종결 경로의 효소들의 쇄 길이 특이성의 변경에 유용할 수 있다.
지방 알콜 생산을 위한 효소 돌연변이, 숙주에서의 발현, 및 선별이 목적하는 용도를 위해 개선된 성질을 갖는 효소 변이체를 생성시키기 위한 또 다른 유용한 접근법이다. 예를 들어, 미국특허공개 제 2012/0009640 호는 야생형 효소에 비해 개선된 활성을 갖는 마리노박터 알기콜라(Marinobacter algicola) 및 마리노박터 아쿠아에올레이(Marinobacter aquaeolei) FAR 효소의 수백 개의 변이체들을 나열한다.
효소 돌연변이(무작위 또는 방향)는 선택 플랫폼과 함께 또 다른 유용한 접근법이다. 예를 들어, 마차도(Machado)와 동료들은 보다 긴 쇄 길이 기질에 대한 아실-CoA 신장 주기 효소의 활성을 증가시킬 목적으로 선택 플랫폼을 개발하였다(문헌[Machado et al., Met Eng in press(2012)]). 마차도 등은 상기 경로의 쇄-길이 제한 단계(3-하이드록시아실-CoA 데하이드로게나제)를 확인하고 이를 혐기성 증식 구제 플랫폼을 사용하여 C6 -8 기질에 대한 개선된 활성을 위해 발전시켰다. 지방 알콜의 생산에 유용한 효소의 추가적인 변이체들을 하기 표에 나열한다.
Figure pct00020
당해 분야의 숙련가들은 본 발명에 예시된 대사 변형을 포함하여, 유전자 변경을 에스케리키아 콜라이와 같은 적합한 숙주 유기체 및 그의 상응하는 대사 반응 또는 목적하는 유전 물질에 적합한 공급원 유기체, 예를 들어 목적하는 대사 경로에 대한 유전자들에 관하여 개시한다. 그러나, 광범위하게 다양한 유기체의 완전한 게놈 서열화 및 상기 유전체학 분야의 높은 기술 수준의 제공으로, 당해 분야의 숙련가들은 본 발명에 제공된 교시 및 지침을 필수적으로 모든 다른 유기체들에 쉽게 적용할 수 있을 것이다. 예를 들어, 본 발명에 예시된 에스케리키아 콜라이 대사 변경을, 상기 기준 종 이외의 종들로부터 동일하거나 유사한 암호화 핵산을 통합시킴으로써 다른 종들에 쉽게 적용할 수 있다. 상기와 같은 유전자 변경은 예를 들어 일반적으로 종 상동 기관의 유전자 변경, 및 특히 이종 상동체, 상동체 또는 비-이종 상동성 유전자 치환을 포함한다.
이종 상동체(ortholog)는 수직 혈통에 의해 관계되고 상이한 유기체에서 실질적으로 동일한 작용들을 맡고 있는 유전자 또는 유전자들이다. 예를 들어, 마우스 에폭사이드 하이드롤라제 및 인간 에폭사이드 하이드롤라제를 에폭사이드의 가수분해의 생물학적 작용에 대해 이종 상동체인 것으로 간주할 수 있다. 유전자들은 예를 들어 이들이 동종임을 가리키기에 충분한 양의 서열 유사성을 공유하거나 공통 조상으로부터의 진화에 의해 관계되는 경우 수직 혈통에 의해 관계된다. 유전자들을 또한 이들이 3차원 구조는 공유하지만 이들이 1차 서열 유사성을 식별할 수 없을 정도로, 공통 조상으로부터 진화했음을 가리키기에 충분한 양의 서열 유사성을 반드시 갖지는 않는 경우 이종 상동체인 것으로 간주할 수 있다. 이종 상동성인 유전자는 약 25% 내지 100% 아미노산 서열 일치성의 서열 유사성을 갖는 단백질들을 암호화한다. 25% 미만의 아미노산 유사성을 공유하는 단백질들을 암호화하는 유전자를 또한 이들의 3차원 구조가 또한 유사성을 보이는 경우 수직 혈통에 의해 발생한 것으로 간주할 수 있다. 조직 플라스미노겐 활성화제 및 엘라스타제를 포함한 효소들의 세린 프로테아제 계열의 구성원들은 공통 조상으로부터 수직 혈통에 의해 발생한 것으로 간주된다.
이종 상동체는 예를 들어 진화를 통해 구조 또는 전체 활성이 갈라진 유전자 또는 그의 암호화된 유전자 산물을 포함한다. 예를 들어, 하나의 종이 2개의 작용을 나타내는 유전자 산물을 암호화하고 상기와 같은 작용들이 두 번째 종에서 별도의 유전자로 분리된 경우, 상기 3개의 유전자 및 이들의 상응하는 산물은 이종 상동체인 것으로 간주된다. 생화학적 생성물의 제조를 위해서, 당해 분야의 숙련가들은 비-천연 미생물의 제작을 위해 도입하거나 파괴하려는 대사 활성을 갖는 이종 상동성 유전자를 선택해야 함을 알 것이다. 분리 가능한 활성들을 나타내는 이종 상동체의 예는 별개의 활성들이 2개 이상의 종 사이에서 또는 단일 종 내에서 별도의 유전자 산물들로 분리된 경우이다. 구체적인 예는 세린 프로테아제 활성의 2 가지 유형인 엘라스타제 단백질 분해 및 플라스미노겐 단백질 분해의, 플라스미노겐 활성화제 및 엘라스타제로서의 별개의 분자들로의 분리이다. 두 번째 예는 마이코플라스마 5'-3' 엑소뉴클레아제와 드로소필라 DNA 폴리머라제 III 활성의 분리이다. 상기 첫 번째 종으로부터의 DNA 폴리머라제를 두 번째 종으로부터의 엑소뉴클레아제 또는 폴리머라제 중 어느 하나 또는 이들 모두에 대한 이종 상동체인 것으로, 또 이와 역으로 간주할 수 있다.
대조적으로, 상동체(paralog)는 예를 들어 복제에 이은 진화적 분기에 의해 관계된 동족체이며 유사하거나 공통의, 그러나 동일하지는 않은 작용들을 갖는다. 상동체는 예를 들어 동일한 종으로부터 또는 상이한 종으로부터 기원하거나 유래할 수 있다. 예를 들어, 미생물 에폭사이드 하이드롤라제(에폭사이드 하이드롤라제 I) 및 용해성 에폭사이드 하이드롤라제(에폭사이드 하이드롤라제 II)는 이들이 별개의 반응들을 촉매화하고 동일한 종에서 별개의 작용을 갖는, 공통의 조상으로부터 함께 진화한 2개의 별개의 효소를 나타내므로 상동체로서 간주될 수 있다. 상동체는 서로 상당한 서열 유사성을 갖는 동일한 종으로부터의 단백질이며, 이는 이들이 동종이거나 공통의 조상으로부터 공 진화를 통해 관계됨을 암시한다. 상동성 단백질 계열의 군은 HipA 동족체, 루시페라제 유전자, 펩티다제 등을 포함한다.
비-이종 상동성(nonorthologous) 유전자 치환은 상이한 종들에서 기준 유전자 작용을 대체할 수 있는 하나의 종으로부터의 비-이종 상동성 유전자이다. 치환은 예를 들어 상이한 종들에서의 기준 작용에 비해 기원 종들에서 실질적으로 동일하거나 유사한 작용을 수행할 수 있음을 포함한다. 일반적으로 비-이종 상동성 유전자 치환을 상기 기준 작용을 암호화하는 기지 유전자와 구조적으로 관련된 것으로서 식별하겠지만, 구조적으로는 덜 관련되었지만 작용상 유사한 유전자들 및 그들의 상응하는 유전자 산물들은 그럼에도 불구하고 여전히 본 발명에 사용되는 상기 용어의 의미 내에 있을 것이다. 작용 유사성은 예를 들어 치환하고자 하는 작용을 암호화하는 유전자에 비해 비-이종 상동성 유전자 산물의 활성 부위 또는 결합 부위에서 적어도 일부의 구조 유사성을 필요로 한다. 따라서, 비-이종 상동성 유전자는 예를 들어 상동체 또는 관련되지 않은 유전자를 포함한다.
따라서, 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 생합성 능력을 갖는 본 발명의 비-천연 미생물 유기체의 동정 및 제작에 있어서, 당해 분야의 숙련가들은 대사 변형의 확인이 이종 상동체의 동정 및 포함 또는 불활성화를 포함할 수 있도록 본 발명에 제공된 교시 및 지침을 특정 종들에 적용함을 이해할 것이다. 당해 분야의 숙련가들은 또한 상동체 및/또는 비-이종 상동성 유전자 치환이 유사하거나 실질적으로 유사한 대사 반응을 촉매화하는 효소를 암호화하는 기준 미생물 중에 존재하는 만큼, 이들 진화에 의해 관계된 유전자들을 사용할 수 있다. 유사하게, 유전자 파괴의 경우, 진화상 관련된 유전자들을 또한 숙주 미생물 유기체에서 파괴하거나 결실시켜 파괴에 대해 표적화된 효소 활성의 기능상 중복성을 감소시키거나 제거할 수 있다.
이종 상동체, 상동체 및 비-이종 상동성 유전자 치환을 당해 분야의 숙련가들에게 널리 공지된 방법에 의해 측정할 수 있다. 예를 들어, 2개의 폴리펩타이드에 대한 핵산 또는 아미노산 서열의 검사는 상기 두 비교된 서열들 간의 서열 일치성 및 유사성을 밝힐 것이다. 상기와 같은 유사성을 근거로, 당해 분야의 숙련가는 상기 유사성이 상기 단백질들이 공통 조상으로부터 진화를 통해 관계됨을 가리킬 만큼 충분히 높은지를 결정할 수 있다. 당해 분야의 숙련가들에게 널리 공지된 연산, 예를 들어 Align, BLAST, Clustal W 등은 원 서열 유사성 또는 일치성을 비교하고 측정하며, 중량 또는 점수를 지정할 수 있는 상기 서열 중 틈의 존재 또는 유의수준을 또한 측정할 수 있다. 상기와 같은 연산은 또한 당해 분야에 공지되어 있으며 뉴클레오타이드 서열 유사성 또는 일치성의 측정에 유사하게 적용될 수 있다. 관련성을 결정하기에 충분한 유사성에 대한 매개변수들을, 통계학적 유사성을 계산하기 위해 널리 공지된 방법, 또는 랜덤 폴리펩타이드에서 유사한 합치를 발견할 기회, 및 상기 측정된 합치의 유의수준을 근거로 측정한다. 2개 이상 서열들의 컴퓨터 비교를 또한 경우에 따라 당해 분야의 숙련가들에 의해 가시적으로 최적화할 수 있다. 관련된 유전자 산물들 또는 단백질들은 높은 유사성, 예를 들어 25% 내지 100% 서열 일치성을 가질 것으로 예상될 수 있다. 관련되지 않은 단백질들은, 충분한 크기의 데이터베이스를 스캐닝하는 경우(약 5%), 우연히 발생할 것으로 예상되는 바와 같이 필수적으로 동일한 일치성을 가질 수 있다. 5% 내지 24%의 서열은, 비교된 서열들이 관련 있다는 결론을 내릴 만큼 충분한 상동성을 나타낼 수도, 나타내지 않을 수도 있다. 상기 데이터 세트의 크기가 제공된, 상기와 같은 합치의 유의수준을 측정하기 위한 추가적인 통계학적 분석을 이들 서열의 관련성을 측정하기 위해 수행할 수 있다.
예를 들어 BLAST 연산을 사용하는 2개 이상 서열의 관련성을 측정하기 위한 예시적인 매개변수들을 하기에 열거할 수 있다. 간단히, 아미노산 서열 정렬을 BLASTP 버전 2.0.8(1999년 1월 5일) 및 하기의 매개변수들을 사용하여 수행할 수 있다: 행렬: 0 BLOSUM62; 간격 개방(gap open): 11; 간격 연장(gap extension): 1; x_드롭오프: 50; 예상: 10.0; 워드크기: 3; 필터: 온. 핵산 서열 정렬을 BLASTN 버전 2.0.6(1998년 9월 16일) 및 하기의 매개변수들을 사용하여 수행할 수 있다: 합치: 1; 불합치: -2; 간격 개방: 5; 간격 연장: 2; x_드롭오프: 50; 예상: 10.0; 워드크기: 11; 필터: 오프. 당해 분야의 숙련가들은 상기 매개변수들에 대해 예를 들어 상기 비교의 엄격성을 증가시키거나 감소시키고 2개 이상 서열의 관련성을 측정하기 위해 변형을 수행할 수 있음을 알 것이다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 종결 경로와 함께 MI-FAE 주기 또는 MD-FAE 주기를 갖는 비-천연 미생물 유기체를 제공하며, 이때 상기 MI-FAE 주기는 하나 이상의 티올라제, 하나 이상의 3-옥소아실-CoA 리덕타제, 하나 이상의 3-하이드록시아실-CoA 데하이드라타제, 및 하나 이상의 에노일-CoA 리덕타제를 포함하고, 이때 상기 MD-FAE 주기는 하나 이상의 엘론가제, 하나 이상의 3-옥소아실-CoA 리덕타제, 하나 이상의 3-하이드록시아실-CoA 데하이드라타제, 및 하나 이상의 에노일-CoA 리덕타제를 포함하며, 이때 상기 종결 경로는 (1) 1H; (2) 1K 및 1L; (3) 1E 및 1N; (4) 1K, 1J, 및 1N; (5) 1E; (6) 1K 및 1J; (7) 1H 및 1N; (8) 1K, 1L, 및 1N; (9) 1E 및 1F; (10) 1K, 1J, 및 1F; (11) 1H, 1N, 및 1F; (12) 1K, 1L, 1N, 및 1F; 및 (13) 1G 중에서 선택된 도 1, 6 또는 7에 도시된 경로를 포함하고, 이때 1E는 아실-CoA 리덕타제(알데하이드-형성)이고, 1F는 알콜 데하이드로게나제이고, 1G는 아실-CoA 리덕타제(알콜-형성)이고, 1H는 아실-CoA 하이드롤라제, 아실-CoA 트랜스퍼라제 또는 아실-CoA 신타제이고, 1J는 아실-ACP 리덕타제이고, 1K는 아실-CoA:ACP 아실트랜스퍼라제이고, 1L은 티오에스테라제이고, 1N은 알데하이드 데하이드로게나제(산-형성) 또는 카복실산 리덕타제이고, 이때 상기 MI-FAE 주기, MD-FAE 주기 또는 종결 경로의 효소는 하나 이상의 외인성 핵산에 의해 암호화되고 하기 화학식 I의 화합물을 생산하기에 충분한 양으로 발현되고:
화학식 I
Figure pct00021
[상기 식에서,
R1은 C1 -24 선형 알킬이고;
R2는 CH2OH, CHO 또는 COOH이고;
R3은 H, OH 또는 옥소(=O)이고;
Figure pct00022
은 단일 또는 이중 결합을 나타내되;
R3이 결합되는 탄소 원자의 원자가는 4이다],
이때 상기 MI-FAE 주기, MD-FAE 주기 및 종결 경로의 각각의 효소들의 기질은 하기 화학식 II의 화합물, 말로닐-CoA, 프로피오닐-CoA 및 아세틸-CoA 중에서 독립적으로 선택되고:
화학식 II
Figure pct00023
[상기 식에서,
R1은 C1 -24 선형 알킬이고;
R3은 H, OH 또는 옥소(=O)이고;
R4는 S-CoA, ACP, OH 또는 H이고;
Figure pct00024
은 단일 또는 이중 결합을 나타내되;
R3이 결합되는 탄소 원자의 원자가는 4이다],
이때 상기 MI-FAE 주기의 하나 이상의 효소는 각각 상기 화학식 I의 화합물의 R1에서의 탄소수 이하인 R1에서의 탄소수를 갖는 화학식 II의 화합물에 대해 선택성이고, 이때 상기 MD-FAE 주기의 하나 이상의 효소는 각각 상기 화학식 I의 화합물의 R1에서의 탄소수 이하인 R1에서의 탄소수를 갖는 화학식 II의 화합물에 대해 선택성이고, 이때 상기 종결 경로의 하나 이상의 효소는 각각 상기 화학식 I의 화합물의 R1에서의 탄소수 이상인 R1에서의 탄소수를 갖는 화학식 II의 화합물에 대해 선택성이다.
본 발명의 일부 태양에서, 본 발명의 비-천연 미생물 유기체는 R1이 C1-17 선형 알킬인 화학식 I의 화합물을 생산할 수 있다. 본 발명의 또 다른 태양에서, 화학식 I의 화합물의 R1은 C1 선형 알킬, C2 선형 알킬, C3 선형 알킬, C4 선형 알킬, C5 선형 알킬, C6 선형 알킬, C7 선형 알킬, C8 선형 알킬, C9 선형 알킬, C10 선형 알킬, C11 선형 알킬, C12 선형 알킬 또는 C13 선형 알킬, C14 선형 알킬, C15 선형 알킬, C16 선형 알킬, C17 선형 알킬, C18 선형 알킬, C19 선형 알킬, C20 선형 알킬, C21 선형 알킬, C22 선형 알킬, C23 선형 알킬, 또는 C24 선형 알킬이다.
본 발명의 일부 태양에서, 상기 미생물 유기체는, 각각의 외인성 핵산이 상기 MI-FAE 주기 또는 MD-FAE 주기의 효소를 암호화하는 2, 3 또는 4개의 상기 외인성 핵산을 포함한다. 본 발명의 일부 태양에서, 상기 미생물 유기체는, 각각의 외인성 핵산이 종결 경로의 효소를 암호화하는 2, 3 또는 4개의 상기 외인성 핵산을 포함한다. 본 발명의 일부 태양에서, 상기 미생물 유기체는 (1) 내지 (13) 중에서 선택된 경로 중 하나 이상의 효소들을 각각 암호화하는 외인성 핵산을 포함한다. 일부 태양에서, 상기 하나 이상의 외인성 핵산은 이종 핵산이다. 일부 태양에서, 상기 비-천연 미생물 유기체는 실질적으로 혐기성 배양 배지 중에 있다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 비-천연 미생물 유기체를 제공하며, 이때 상기 MI-FAE 주기, MD-FAE 주기 또는 종결 경로의 하나 이상의 효소는 하기 화학식 III 내지 VI 중에서 선택된 지방 알콜을 생산하기에 충분한 양으로 발현된다:
화학식 III
Figure pct00025
화학식 IV
Figure pct00026
화학식 V
Figure pct00027
화학식 VI
Figure pct00028
상기 식에서,
R1은 C1 -24 선형 알킬이거나, 다르게는 R1은 C1 -17 선형 알킬이거나, 다르게는 R1은 C9 -13 선형 알킬이다.
본 발명의 일부 태양에서, R1은 C1 선형 알킬, C2 선형 알킬, C3 선형 알킬, C4 선형 알킬, C5 선형 알킬, C6 선형 알킬, C7 선형 알킬, C8 선형 알킬, C9 선형 알킬, C10 선형 알킬, C11 선형 알킬, C12 선형 알킬 또는 C13 선형 알킬, C14 선형 알킬, C15 선형 알킬, C16 선형 알킬, C17 선형 알킬, C18 선형 알킬, C19 선형 알킬, C20 선형 알킬, C21 선형 알킬, C22 선형 알킬, C23 선형 알킬, 또는 C24 선형 알킬이다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 비-천연 미생물 유기체를 제공하며, 이때 상기 MI-FAE 주기, MD-FAE 주기 또는 종결 경로의 하나 이상의 효소는 하기 화학식 VII 내지 X 중에서 선택된 지방 알데하이드를 생산하기에 충분한 양으로 발현된다:
화학식 VII
Figure pct00029
화학식 VIII
Figure pct00030
화학식 IX
Figure pct00031
화학식 X
Figure pct00032
상기 식에서,
R1은 C1 -24 선형 알킬이거나, 다르게는 R1은 C1 -17 선형 알킬이거나, 다르게는 R1은 C9 -13 선형 알킬이다.
본 발명의 일부 태양에서, R1은 C1 선형 알킬, C2 선형 알킬, C3 선형 알킬, C4 선형 알킬, C5 선형 알킬, C6 선형 알킬, C7 선형 알킬, C8 선형 알킬, C9 선형 알킬, C10 선형 알킬, C11 선형 알킬, C12 선형 알킬 또는 C13 선형 알킬, C14 선형 알킬, C15 선형 알킬, C16 선형 알킬, C17 선형 알킬, C18 선형 알킬, C19 선형 알킬, C20 선형 알킬, C21 선형 알킬, C22 선형 알킬, C23 선형 알킬, 또는 C24 선형 알킬이다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 비-천연 미생물 유기체를 제공하며, 이때 상기 MI-FAE 주기, MD-FAE 주기 또는 종결 경로의 하나 이상의 효소는 하기 화학식 XI 내지 XIV 중에서 선택된 지방 산을 생산하기에 충분한 양으로 발현된다:
화학식 XI
Figure pct00033
화학식 XII
Figure pct00034
화학식 XIII
Figure pct00035
화학식 XIV
Figure pct00036
상기 식에서,
R1은 C1 -24 선형 알킬이거나, 다르게는 R1은 C1 -17 선형 알킬이거나, 다르게는 R1은 C9 -13 선형 알킬이다.
본 발명의 일부 태양에서, R1은 C1 선형 알킬, C2 선형 알킬, C3 선형 알킬, C4 선형 알킬, C5 선형 알킬, C6 선형 알킬, C7 선형 알킬, C8 선형 알킬, C9 선형 알킬, C10 선형 알킬, C11 선형 알킬, C12 선형 알킬 또는 C13 선형 알킬, C14 선형 알킬, C15 선형 알킬, C16 선형 알킬, C17 선형 알킬, C18 선형 알킬, C19 선형 알킬, C20 선형 알킬, C21 선형 알킬, C22 선형 알킬, C23 선형 알킬, 또는 C24 선형 알킬이다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 본 발명에 개시된 바와 같은 비-천연 미생물 유기체를 제공하며, 이때 상기 미생물 유기체는 아세틸-CoA 경로, 및 아세틸-CoA를 생산하기에 충분한 양으로 발현되는 아세틸-CoA 경로 효소를 암호화하는 하나 이상의 외인성 핵산을 추가로 포함하고, 이때 상기 아세틸-CoA 경로는 (1) 2A 및 2B; (2) 2A, 2C, 및 2D; (3) 2H; (4) 2G 및 2D; (5) 2E, 2F 및 2B; (6) 2E 및 2I; (7) 2J, 2F 및 2B; (8) 2J 및 2I; (9) 3A, 3B, 및 3C; (10) 3A, 3B, 3J, 3K, 및 3D; (11) 3A, 3B, 3G, 및 3D; (12) 3A, 3F, 및 3D; (13) 3N, 3H, 3B 및 3C; (14) 3N, 3H, 3B, 3J, 3K, 및 3D; (15) 3N, 3H, 3B, 3G, 및 3D; (16) 3N, 3H, 3F, 및 3D; (17) 3L, 3M, 3B 및 3C; (18) 3L, 3M, 3B, 3J, 3K, 및 3D; (19) 3L, 3M, 3B, 3G, 및 3D; (20) 3L, 3M, 3F, 및 3D; (21) 4A, 4B, 4D, 4H, 4I, 및 4J; (22) 4A, 4B, 4E, 4F, 4H, 4I, 및 4J; (23) 4A, 4B, 4E, 4K, 4L, 4H, 4I, 및 4J; (24) 4A, 4C, 4D, 4H, 및 4J; (25) 4A, 4C, 4E, 4F, 4H, 및 4J; (26) 4A, 4C, 4E, 4K, 4L, 4H, 및 4J; (27) 5A, 5B, 5D, 및 5G; (28) 5A, 5B, 5E, 5F, 및 5G; (29) 5A, 5B, 5E, 5K, 5L, 및 5G; (30) 5A, 5C, 및 5D; (31) 5A, 5C, 5E, 및 5F; 및 (32) 5A, 5C, 5E, 5K, 및 5L 중에서 선택된 도 2, 3, 4 또는 5에 도시된 경로를 포함하고, 이때 2A는 피루베이트 옥시다제(아세테이트-형성)이고, 2B는 아세틸-CoA 신시타제, 아세틸-CoA 리가제 또는 아세틸-CoA 트랜스퍼라제이고, 2C는 아세테이트 키나제이고, 2D는 포스포트랜스아세틸라제이고, 2E는 피루베이트 데카복실라제이고, 2F는 아세트알데하이드 데하이드로게나제이고, 2G는 피루베이트 옥시다제(아세틸-포스페이트-형성)이고, 2H는 피루베이트 데하이드로게나제, 피루베이트:페레독신 옥시도리덕타제, 피루베이트:NAD(P)H 옥시도리덕타제 또는 피루베이트 포메이트 라이아제이고, 2I는 아세트알데하이드 데하이드로게나제(아실화)이고, 2J는 쓰레오닌 알돌라제이고, 3A는 포스포에놀피루베이트(PEP) 카복실라제 또는 PEP 카복시키나제이고, 3B는 옥살로아세테이트 데카복실라제이고, 3C는 말로네이트 세미알데하이드 데하이드로게나제(아세틸화)이고, 3D는 아세틸-CoA 카복실라제 또는 말로닐-CoA 데카복실라제이고, 3F는 옥살로아세테이트 데하이드로게나제 또는 옥살로아세테이트 옥시도리덕타제이고, 3G는 말로네이트 세미알데하이드 데하이드로게나제(아실화)이고, 3H는 피루베이트 카복실라제이고, 3J는 말로네이트 세미알데하이드 데하이드로게나제이고, 3K는 말로닐-CoA 신시타제 또는 말로닐-CoA 트랜스퍼라제이고, 3L은 말산 효소이고, 3M은 말레이트 데하이드로게나제 또는 말레이트 옥시도리덕타제이고, 3N은 피루베이트 키나제 또는 PEP 포스파타제이고, 4A는 시트레이트 신타제이고, 4B는 시트레이트 운반자이고, 4C는 시트레이트/말레이트 운반자이고, 4D는 ATP 시트레이트 라이아제이고, 4E는 시트레이트 라이아제이고, 4F는 아세틸-CoA 신시타제 또는 아세틸-CoA 트랜스퍼라제이고, 4H는 시토솔 말레이트 데하이드로게나제이고, 4I는 말레이트 운반자이고, 4J는 미토콘드리아 말레이트 데하이드로게나제이고, 4K는 아세테이트 키나제이고, 4L은 포스포트랜스아세틸라제이고, 5A는 시트레이트 신타제이고, 5B는 시트레이트 운반자이고, 5C는 시트레이트/옥살로아세테이트 운반자이고, 5D는 ATP 시트레이트 라이아제이고, 5E는 시트레이트 라이아제이고, 5F는 아세틸-CoA 신시타제 또는 아세틸-CoA 트랜스퍼라제이고, 5G는 옥살로아세테이트 운반자이고, 5K는 아세테이트 키나제이고, 5L은 포스포트랜스아세틸라제이다.
일부 태양에서, 본 발명의 미생물 유기체는, 각각의 외인성 핵산이 아세틸-CoA 경로 효소를 암호화하는 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개의 상기 외인성 핵산을 포함할 수 있다. 일부 태양에서, 상기 미생물 유기체는 (1) 내지 (32) 중에서 선택된 경로 중 하나 이상의 아세틸-CoA 경로 효소들을 각각 암호화하는 외인성 핵산을 포함한다.
추가의 실시태양에서, 본 발명은 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 경로를 갖는 비-천연 미생물 유기체를 제공하며, 이때 상기 비-천연 미생물 유기체는 기질을 생성물로, 예컨대 2개의 아세틸-CoA 분자를 3-케토아실-CoA로, 아세틸-CoA + 프로피오닐-CoA를 케토아실-CoA로, 말로닐-CoA를 3-케토아실-CoA로, 3-케토아실-CoA를 3-하이드록시아실-CoA로, 3-하이드록시아실-CoA를 에노일-CoA로, 에노일-CoA를 아실-CoA로, 아실-CoA + 아세틸-CoA를 3-케토아실-CoA로, 아실-CoA + 말로닐-CoA를 3-케토아실-CoA로, 아실-CoA를 지방 알데하이드로, 지방 알데하이드를 지방 알콜로, 아실-CoA를 지방 알콜로, 아실-CoA를 아실-ACP로, 아실-ACP를 지방 산으로, 아실-CoA를 지방 산으로, 아실-ACP를 지방 알데하이드로, 지방 산을 지방 알데하이드로, 지방 알데하이드를 지방 산으로, 피루베이트를 아세테이트로, 아세테이트를 아세틸-CoA로, 피루베이트를 아세틸-CoA로, 피루베이트를 아세트알데하이드로, 쓰레오닌을 아세트알데하이드로, 아세트알데하이드를 아세테이트로, 아세트알데하이드를 아세틸-CoA로, 피루베이트를 아세틸-포스페이트로, 아세테이트를 아세틸-포스페이트로, 아세틸-포스페이트를 아세틸-CoA로, 포스포에놀피루베이트(PEP)를 피루베이트로, 피루베이트를 말레이트로, 말레이트를 옥살로아세테이트로, 피루베이트를 옥살로아세테이트로, PEP를 옥살로아세테이트로, 옥살로아세테이트를 말로네이트 세미알데하이드로, 옥살로아세테이트를 말로닐-CoA로, 말로네이트 세미알데하이드를 말로네이트로, 말로네이트를 말로닐-CoA로, 말로네이트 세미알데하이드를 말로닐-CoA로, 말로닐-CoA를 아세틸-CoA로, 말로네이트 세미알데하이드를 아세틸-CoA로, 옥살로아세테이트 + 아세틸-CoA를 시트레이트로, 시트레이트를 옥살로아세테이트 + 아세틸-CoA로, 시트레이트를 옥살로아세테이트 + 아세테이트로, 또는 옥살로아세테이트를 말레이트로 전환시키는 효소 또는 단백질을 암호화하는 하나 이상의 외인성 핵산을 포함한다. 당해 분야의 숙련가는 이들이 단지 예시일뿐이며 목적하는 생성물을 생성시키기에 적합한 본 발명에 개시된 기질-생성물 쌍들 중 어느 하나 및 상기 기질의 생성물로의 전환에 이용 가능한 적합한 활성은 본 발명의 교시를 근거로 당해 분야의 숙련가에 의해 쉽게 결정될 수 있음을 알 것이다. 따라서, 본 발명은 효소 또는 단백질을 암호화하는 하나 이상의 외인성 핵산을 함유하는 비-천연 미생물 유기체를 제공하며, 이때 상기 효소 또는 단백질은 도 1 내지 8에 도시된 것과 같은, 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 경로의 기질 및 생성물을 전환시킨다.
본 발명은 이때 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 경로를 함유하는 미생물 유기체로서 일반적으로 개시되지만, 본 발명은 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 경로의 중간체를 생산하기에 충분한 양으로 발현되는 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 경로 효소 또는 단백질을 암호화하는 하나 이상의 외인성 핵산을 포함하는 비-천연 미생물 유기체를 추가로 제공하는 것으로 이해된다. 예를 들어, 본 발명에 개시된 바와 같이, 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 경로를 도 1 내지 7에 예시한다. 따라서, 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산을 생산하는 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 경로를 함유하는 미생물 유기체 외에, 본 발명은 추가로 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 경로 효소를 암호화하는 하나 이상의 외인성 핵산을 포함하는 비-천연 미생물 유기체를 제공하며, 이때 상기 미생물 유기체는 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 경로 중간체, 예를 들어 3-케토아실-CoA, 3-하이드록시아실-CoA, 에노일-CoA, 아실-CoA, 아실-ACP, 아세테이트, 아세트알데하이드, 아세틸-포스페이트, 옥살로아세테이트, 말레이트, 말로네이트 세미알데하이드, 말로네이트, 말로닐-CoA, 아세틸-CoA 또는 시트레이트를 생산한다.
도 1 내지 7의 경로를 포함하여, 실시예에 개시되고 도면에 예시된 바와 같이 본 발명에 개시된 경로들 중 임의의 경로를 사용하여 임의의 경로 중간체 또는 생성물을 목적하는 대로 생산하는 비-천연 미생물 유기체를 생성시킬 수 있는 것으로 이해된다. 본 발명에 개시된 바와 같이, 중간체를 생산하는 상기와 같은 미생물 유기체를 목적하는 생성물을 생산하는 하류 경로 효소를 발현하는 또 다른 미생물 유기체와 함께 사용할 수 있다. 그러나, 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 경로 중간체를 생산하는 비-천연 미생물 유기체를 사용하여 목적하는 생성물로서 상기 중간체를 생성시킬 수 있는 것으로 이해된다.
본 발명을 대사 반응, 반응물 또는 그의 생성물을 일반적으로 언급하거나, 상기 언급된 대사 반응, 반응물 또는 생성물과 관련되거나 이를 촉매화하는 효소 또는 이와 관련된 단백질을 암호화하는 하나 이상의 핵산 또는 유전자를 구체적으로 언급하여 본 발명에서 개시한다. 달리 본 발명에 명확히 나타내지 않는 한, 당해 분야의 숙련가들은 반응에 대한 언급이 또한 상기 반응의 반응물 및 생성물에 대한 언급을 구성함을 알 것이다. 유사하게, 본 발명에서 명확히 나타내지 않는 한, 반응물 또는 생성물에 대한 언급은 또한 상기 반응을 언급하며, 이들 대사 구성성분들 중 임의의 구성성분에 대한 언급은 상기 언급한 반응, 반응물 또는 생성물을 촉매화하는 효소 또는 상기 중에 수반되는 단백질을 암호화하는 유전자 또는 유전자들을 또한 언급한다. 마찬가지로, 대사 생화학, 효소학 및 유전체학의 널리 공지된 분야에 제공된 바와 같이, 본 발명에서 유전자 또는 핵산 암호화에 대한 언급은 상응하는 암호화된 효소 및 상기 효소가 촉매화하는 반응 또는 상기 반응과 관련된 단백질뿐만 아니라 상기 반응의 반응물 및 생성물에 대한 언급을 또한 구성한다.
본 발명의 비-천연 미생물 유기체는 하나 이상의 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 생합성 경로에 참여하는 효소 또는 단백질 중 하나 이상을 암호화하는 발현 가능한 핵산을 도입시킴으로써 생성될 수 있다. 생합성에 대해 선택된 숙주 미생물 유기체에 따라, 특정 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 생합성 경로 중 일부 또는 전부에 대한 핵산을 발현시킬 수 있다. 예를 들어, 선택된 숙주가 목적하는 생합성 경로에 대해 하나 이상의 효소 또는 단백질이 결핍된 경우, 상기 결핍된 효소(들) 또는 단백질(들)에 대해 발현 가능한 핵산을 후속의 외부 발현을 위해 상기 숙주에 도입시킨다. 다르게는, 상기 선택된 숙주가 일부 경로 유전자들의 내인성 발현을 나타내지만 다른 것들은 결핍된 경우, 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 생합성을 성취하기 위해 상기 결핍 효소(들) 또는 단백질(들)에 대해 암호화 핵산이 필요하다. 따라서, 본 발명의 비-천연 미생물 유기체를, 목적하는 생합성 경로를 획득하기 위해 외인성 효소 또는 단백질 활성을 도입시킴으로써 생성시키거나, 하나 이상의 내인성 효소 또는 단백질과 함께 목적하는 생성물, 예를 들어 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산을 생산하는 하나 이상의 외인성 효소 또는 단백질 활성을 도입시킴으로써 목적하는 생합성 경로를 획득할 수 있다.
숙주 미생물 유기체를 예를 들어 세균, 효모, 진균 또는 발효 과정에 적용할 수 있는 임의의 다양한 다른 미생물들 중에서 선택할 수 있으며 상기 비-천연 미생물 유기체를 이들 중에서 생성시킬 수 있다. 예시적인 세균은 하기 중에서 선택된 임의의 종을 포함한다: 에스케리키아 및 클렙시엘라(Klebsiella) 속을 포함한 엔테로박테리알레스(Enterobacteriales) 목, 엔테로박테리아세아에(Enterobacteriaceae) 과; 아에로모나달레스(Aeromonadales) 목, 숙시니비브리오나세아에(Succinivibrionaceae) 과, 아나에로비오스피릴룸(Anaerobiospirillum) 속 포함; 파스테우렐랄레스(Pasteurellales) 목, 파스테우렐라세아에(Pasteurellaceae) 과, 액티노바실러스(Actinobacillus) 및 만헤이미아(Mannheimia) 속 포함; 리조비알레스(Rhizobiales) 목, 브라디리조비아세아에(Bradyrhizobiaceae) 과, 리조븀(Rhizobium) 속 포함; 바실랄레스(Bacillales) 목, 바실라세아에(Bacillaceae) 과, 바실러스 속 포함; 액티노마이세탈레스(Actinomycetales) 목, 코리네박테리아세아에(Corynebacteriaceae) 및 스트렙토마이세타세아에(Streptomycetaceae) 과, 각각 코리네박테리움 속 및 스트렙토마이세스 속 포함; 로도스피릴랄레스(Rhodospirillales) 목, 아세토박테라세아에(Acetobacteraceae) 과, 글루코노박터(Gluconobacter) 속 포함; 스핑고모나달레스(Sphingomonadales) 목, 스핑고모나다세아에(Sphingomonadaceae) 과, 자이모모나스(Zymomonas) 속 포함; 락토바실랄레스(Lactobacillales) 목, 락토바실라세아에(Lactobacillaceae) 및 스트렙토코카세아에(Streptococcaceae) 과, 각각 락토바실러스 속 및 락토코커스 속 포함; 클로스트리디알레스(Clostridiales) 목, 클로스트리디아세아에(Clostridiaceae) 과, 클로스트리디움 속 포함; 및 슈도모나달레스(Pseudomonadales) 목, 슈도모나다세아에(Pseudomonadaceae) 과, 슈도모나스 속 포함. 숙주 세균의 비제한적인 종은 에스케리키아 콜라이, 클렙시엘라 옥시토카, 아나에로비오스피릴룸 숙시니시프로듀센스(Anaerobiospirillum succiniciproducens), 액티노바실러스 숙시노제네스(Actinobacillus succinogenes), 만헤이미아 숙시니시프로듀센스, 리조븀 에틀리(Rhizobium etli), 바실러스 서브틸리스, 코리네박테리움 글루타미쿰, 글루코노박터 옥시단스, 자이모모나스 모빌리스, 락토코커스 락티스, 락토바실러스 플란타룸, 스트렙토마이세스 코엘리콜라(Streptomycess coelicolor), 클로스트리디움 아세토부틸리쿰, 슈도모나스 플루오레센스, 및 슈도모나스 푸티다를 포함한다.
유사하게, 효모 또는 진균 종의 예시적인 종들은 하기 중에서 선택된 임의의 종을 포함한다: 사카로마이세탈레스(Saccharomycetales) 목, 사카로마이세타세아에(Saccaromycetaceae) 과, 사카로마이세스, 클루이베로마이세스 및 피키아(Pichia) 속 포함; 사카로마이세탈레스 목, 디포다스카세아에(Dipodascaceae) 과, 야로위아 속 포함; 스키조사카로마이세탈레스(Schizosaccharomycetales) 목, 스키조사카로마이세타세아에(Schizosaccaromycetaceae) 과, 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces) 속 포함; 유로티알레스(Eurotiales) 목, 트리코코마세아에(Trichocomaceae) 과, 아스퍼질러스 속 포함; 및 뮤코랄레스(Mucorales) 목, 뮤코라세아에(Mucoraceae) 과, 리조푸스 속 포함. 숙주 효모 또는 진균의 비제한적인 종은 사카로마이세스 세레비지아에, 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 클루이베로마이세스 락티스, 클루이베로마이세스 마르시아누스(Kluyveromyces marxianus), 아스퍼질러스 테레우스(Aspergillus terreus), 아스퍼질러스 니거, 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 리조푸스 아리주스, 리조푸스 오리자에, 야로위아 리포리티카 등을 포함한다. 에스케리키아 콜라이가 특히 유용한 숙주 유기체인데, 그 이유는 유전 공학에 적합한 잘 특성화된 미생물 유기체이기 때문이다. 다른 특히 유용한 숙주 유기체는 효모, 예를 들어 사카로마이세스 세레비지아에를 포함한다. 임의의 적합한 미생물 숙주 유기체를 사용하여 대사 및/또는 유전자 변형을 도입시켜 목적하는 생성물을 생성시킬 수 있는 것으로 이해된다.
선택된 숙주 미생물 유기체의 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 생합성 경로 구성성분들에 따라, 본 발명의 비-천연 미생물 유기체는 하나 이상의 외부적으로 발현된 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 경로-암호화 핵산 내지 하나 이상의 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 생합성 경로에 대한 암호화 핵산 전부를 포함할 것이다. 예를 들어, 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 생합성을, 상응하는 암호화 핵산의 외부 발현을 통해 경로 효소 또는 단백질이 결핍된 숙주에 확립시킬 수 있다. 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 경로의 모든 효소 또는 단백질이 결핍된 숙주에서, 상기 경로 중의 모든 효소 또는 단백질의 외부 발현을 포함할 수 있지만, 상기 숙주가 경로 효소 또는 단백질 중 하나 이상을 함유한다 하더라도 상기 경로의 모든 효소 또는 단백질이 발현될 수 있는 것으로 이해된다. 예를 들어, 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산의 생산 경로에서 모든 효소 또는 단백질의 외부 발현은 예를 들어 지방 알콜의 생산을 위해서 티올라제, 3-옥소아실-CoA 리덕타제, 3-하이드록시아실-CoA 데하이드라타제, 에노일-CoA 리덕타제, 아실-CoA 리덕타제(알데하이드-형성) 및 알콜 데하이드로게나제를 포함할 수 있다.
본 발명에 제공된 교시 및 지침에 따라, 당해 분야의 숙련가들은 발현 가능한 형태로 도입되는 암호화 핵산의 수가 적어도 상기 선택된 숙주 미생물 유기체의 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 경로 결핍에 필적할 것임을 알 것이다. 따라서, 본 발명의 비-천연 미생물 유기체는 본 발명에 개시된 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 생합성 경로를 구성하는 효소 또는 단백질을 암호화하는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8 내지 전체 이하 핵산을 가질 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 비-천연 미생물 유기체는 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 생합성을 촉진 또는 최적화하거나, 상기 숙주 미생물 유기체에 다른 유용한 기능들을 부여하는 다른 유전자 변형을 추가로 포함할 수 있다. 하나의 상기와 같은 다른 기능은 예를 들어 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 경로 전구체 중 하나 이상, 예를 들어 아세틸-CoA, 말로닐-CoA 또는 프로피오닐-CoA의 합성의 증대를 포함할 수 있다.
일반적으로, 숙주 미생물 유기체는 상기 유기체가 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 경로의 전구체를, 자연적으로 생성된 분자로서 또는 목적하는 전구체의 드 노보 생산을 제공하거나 상기 숙주 미생물 유기체에 의해 자연적으로 생산된 전구체의 증가된 생산을 제공하도록 가공된 생성물로서 생산하도록 선택된다. 예를 들어, 아세틸-CoA는 에스케리키아 콜라이와 같은 숙주 유기체에서 자연적으로 생산된다. 숙주 유기체를 본 발명에 개시된 바와 같이, 전구체의 생산을 증가하도록 가공할 수 있다. 또한, 목적하는 전구체를 생산하도록 가공된 미생물 유기체를 숙주 유기체로서 사용하고 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 경로의 효소 또는 단백질을 발현하도록 추가로 가공할 수 있다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 비-천연 미생물 유기체는 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산을 합성하는 효소적 능력을 함유하는 숙주로부터 생성된다. 상기 특정한 실시태양에서, 예를 들어 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 경로 반응이 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 생산을 향하도록 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 경로 생성물의 합성 또는 축적을 증가시키는 것이 유용할 수 있다. 증가된 합성 또는 축적을 예를 들어 상술한 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 경로 효소 또는 단백질 중 하나 이상을 암호화하는 핵산의 과발현에 의해 수행할 수 있다. 상기 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 경로의 효소 또는 효소들 및/또는 단백질 또는 단백질들의 과발현은 예를 들어 내인성 유전자 또는 유전자들의 외부 발현을 통해서, 또는 이종 유전자 또는 유전자들의 외부 발현을 통해서 일어날 수 있다. 따라서, 천연 유기체를, 본 발명의 비-천연 미생물 유기체, 예를 들어 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 생합성 경로 효소 또는 단백질을 암호화하는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8, 즉 전체 이하의 핵산의 과발현을 통해 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산을 생산하는 유기체가 되도록 쉽게 생성시킬 수 있다. 또한, 비-천연 유기체를 상기 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 생합성 경로 효소의 활성을 증가시키는 내인성 유전자의 돌연변이에 의해 생성시킬 수 있다.
특히 유용한 실시태양에서, 상기 암호화 핵산의 외부 발현을 사용한다. 외부 발현은 상기 발현 및/또는 조절 요소를 상기 숙주 및 용도의 주문에 맞추어 사용자에 의해 조절되는 목적하는 발현 수준을 성취하는 능력을 부여한다. 그러나, 내인성 발현은 또한 예를 들어 유도 프로모터 또는 다른 조절 요소에 결합 시 상기 유전자의 프로모터의 음의 조절 효과기 또는 유도를 제거함으로써 다른 실시태양들에도 사용될 수 있다. 따라서, 천연 유도 프로모터를 갖는 내인성 유전자를 적합한 유도체의 제공에 의해 상향 조절하거나, 내인성 유전자의 조절 부위를 유도 조절 요소를 편입하도록 가공할 수 있으며, 이에 의해 목적하는 시기에 내인성 유전자의 증가된 발현의 조절을 허용할 수 있다. 유사하게, 유도 프로모터를 비-천연 미생물 유기체 내에 도입된 외인성 유전자에 대한 조절 요소로서 포함할 수 있다.
본 발명의 방법에서, 상기 하나 이상의 외인성 핵산 중 어느 것이든 미생물 유기체에 도입시켜 본 발명의 비-천연 미생물 유기체를 생산시킬 수 있는 것으로 생각된다. 상기 핵산을 예를 들어 상기 미생물 유기체에 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 생합성 경로가 부여되도록 도입시킬 수 있다. 다르게는, 암호화 핵산을 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 생합성 능력을 부여하도록 상기 필요한 반응들 중 일부를 촉매화하는 생합성 능력을 갖는 중간 미생물 유기체를 생산하도록 도입시킬 수 있다. 예를 들어, 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 생합성 경로를 갖는 비-천연 미생물 유기체는 목적하는 효소 또는 단백질, 예를 들어 티올라제 및 아실-CoA 리덕타제(알콜-형성), 또는 다르게는 2-옥소아실-CoA 리덕타제 및 아실-CoA 하이드롤라제, 또는 다르게는 에노일-CoA 리덕타제 및 아실-CoA 리덕타제(알데하이드-형성) 등의 조합을 암호화하는 2개 이상의 외인성 핵산을 포함할 수 있다. 따라서 생합성 경로의 2개 이상의 효소 또는 단백질의 임의의 조합을 본 발명의 비-천연 미생물 유기체에 포함시킬 수 있는 것으로 생각된다. 유사하게, 경우에 따라, 목적하는 생합성 경로의 효소 및/또는 단백질의 조합이 상응하는 목적하는 생성물을 생성시키는 한, 생합성 경로의 3개 이상의 효소 또는 단백질의 임의의 조합, 예를 들어 티올라제, 에노일-CoA 리덕타제 및 알데하이드 데하이드로게나제(산-형성), 또는 다르게는 3-하이드록시아실-CoA 데하이드라타제, 아실-CoA:ACP 아실트랜스퍼라제 및 티오에스테라제, 또는 다르게는 3-옥소아실-CoA 리덕타제, 아실-CoA 하이드롤라제 및 카복실산 리덕타제 등을 본 발명의 비-천연 미생물 유기체 등에 포함시킬 수 있는 것으로 생각된다. 유사하게, 경우에 따라, 목적하는 생합성 경로의 효소 및/또는 단백질의 조합이 상응하는 목적하는 생성물을 생성시키는 한, 본 발명에 개시된 바와 같은 생합성 경로의 4, 5, 6, 7, 8개 또는 그 이상의 효소 또는 단백질의 임의의 조합을 본 발명의 비-천연 미생물 유기체에 포함시킬 수 있다.
본 발명에 개시된 바와 같은 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산의 생합성 이외에, 본 발명의 비-천연 미생물 유기체 및 방법을 또한 서로 및 다른 경로들에 의해 생성물 생합성을 성취하기 위해 당해 분야에 널리 공지된 다른 미생물 유기체 및 방법들과 다양한 조합으로 사용할 수 있다. 예를 들어 상기 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 생산자의 사용 이외에 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산을 생산하는 한 가지 대안은 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 경로 중간체를 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산으로 전환시킬 수 있는 또 다른 미생물 유기체의 첨가를 통해서이다. 한 가지 상기와 같은 과정은 예를 들어 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 경로 중간체를 생산하는 미생물 유기체의 발효를 포함한다. 이어서 상기 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 경로 중간체를, 상기 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 경로 중간체를 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산으로 전환시키는 두 번째 미생물 유기체에 대한 기질로서 사용할 수 있다. 상기 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 경로 중간체를 상기 두 번째 유기체의 또 다른 배양물에 직접 가하거나 상기 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 경로 중간체 생산자의 원래 배양물을 예를 들어 세포 분리에 의해 상기 미생물 유기체에서 고갈시킬 수 있으며, 이어서 상기 두 번째 유기체의 발효 브로쓰에의 후속 첨가를 사용하여 중간 정제 단계 없이 최종 생성물을 생성시킬 수 있다.
다른 실시태양에서, 본 발명의 비-천연 미생물 유기체 및 방법을 광범위하게 다양한 하위 경로들로 조립하여 예를 들어 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산의 생합성을 성취할 수 있다. 이들 실시태양에서, 본 발명의 목적하는 생성물에 대한 생합성 경로들을 상이한 미생물 유기체들로 분리할 수 있으며, 상기 상이한 미생물 유기체들을 함께 배양하여 최종 생성물을 생산할 수 있다. 상기와 같은 생합성 설계에서, 한 미생물 유기체의 생성물은 상기 최종 생성물이 합성될 때까지 두 번째 미생물 유기체에 대한 기질이다. 예를 들어, 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산의 생합성을, 하나의 경로 중간체의 또 다른 경로 중간체 또는 생성물로의 전환에 대한 생합성 경로를 함유하는 미생물 유기체를 제작함으로써 수행할 수 있다. 다르게는, 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산을 또한 동일한 용기에서 2개의 유기체를 사용하여 공동 배양 또는 공동 발효를 통해 미생물 유기체들로부터 생합성적으로 생산할 수 있으며, 이때 첫 번째 미생물 유기체는 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 중간체를 생산하고 두 번째 미생물 유기체는 상기 중간체를 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산으로 전환시킨다.
본 발명에 제공된 교시 및 지침에 따라, 당해 분야의 숙련가들은 본 발명의 비-천연 미생물 유기체 및 방법들에 대해서, 다른 미생물 유기체, 하위 경로들을 갖는 다른 비-천연 미생물 유기체들의 공동 배양, 및 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산을 생성시키는 것으로 당해 분야에 널리 공지된 다른 화학적 및/또는 생화학적 과정들의 조합과 함께 광범위하게 다양한 조합 및 순열들이 존재함을 알 것이다.
유사하게, 당해 분야의 숙련가들은 숙주 유기체를 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산의 생산을 증가시키기 위해 하나 이상의 유전자 파괴를 도입시키는데 바람직한 특성을 근거로 선택할 수 있는 것으로 생각한다. 따라서, 유전자 변형을 유전자 파괴를 위해 숙주 유기체에 도입시켜야 하는 경우, 유사하지만, 동일하지는 않은 대사 반응들을 촉매화하는 임의의 상동기관, 이종 상동체 또는 상동체를 유사하게 파괴시켜 목적하는 대사 반응이 충분히 파괴되도록 할 수 있다. 대사 네트워크들 간에 어떤 차이가 상이한 유기체들 간에 존재하므로, 당해 분야의 숙련가들은 상이한 유기체들 간의 실제 유전자 사용이 상이할 수 있음을 알 것이다. 그러나, 본 발명에 제공된 교시 및 지침에 따라, 당해 분야의 숙련가들은 또한 본 발명의 교시 및 방법을 본 발명에 예시된 것들과 동족의 대사 변경을 사용하는 모든 미생물 유기체들에 적용하여 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산을 합성하는 관심 종의 미생물 유기체를 제작할 수 있다. 특정한 실시태양에서, 상기 증가된 생산을 상기 유기체의 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산의 생합성과 결부시키고, 경우에 따라서 및 본 발명에 개시된 바와 같이 상기 유기체의 증식에 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산의 생산을 필수적으로 결부시킬 수 있다.
지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 경로 효소 또는 단백질에 대한 암호화 핵산의 공급원은 예를 들어 상기 암호화된 유전자 산물이 기준 반응을 촉매화할 수 있는 임의의 종들을 포함할 수 있다. 상기와 같은 종들은 원핵생물 및 진핵생물 유기체 모두, 예를 들어 비제한적으로 고세균 및 진정세균을 포함한 세균, 및 효모, 식물, 곤충, 동물, 및 인간을 포함한 포유동물을 포함한 진핵생물 유기체를 포함한다. 상기와 같은 공급원에 대한 예시적인 종은 예를 들어, 에스케리키아 콜라이, 255956237 페니실리움 크리소제눔 위스콘신(Penicillium chrysogenum Wisconsin) 54-1255, 아세토박터 파스퇴리안스(Acetobacter pasteurians), 애시드아미노코커스 페르멘탄스(Acidaminococcus fermentans), 애시네토박터 배일리이(Acinetobacter baylyi), 애시네토박터 칼코아세티쿠스(Acinetobacter calcoaceticus), 애시네토박터 스피시즈(Acinetobacter species) ADP1, 애시네토박터 스피시즈 균주 M-1, 액티노바실러스 숙시노제네스(Actinobacillus succinogenes), 아에데스 아에지프티(Aedes aegypti), 아그로박테리움 튜메파시엔스, 알칼리필루스 메탈리레디젠스(Alkaliphilus metalliredigens ) QYMF, 알칼리필루스 오렘란디이(Alkaliphilus oremlandii ) OhILAs, 아나바에나 바리아빌리스(Anabaena variabilis ) ATCC 29413, 아나에로비오스피릴룸 숙시니시프로듀센스(Anaerobiospirillum succiniciproducens), 아노펠레스 감비아에 균주(Anopheles gambiae str .) PEST, 아피스 멜리페라(Apis mellifera), 아쿠이펙스 아에올리쿠스(Aquifex aeolicus), 아라비도프시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana), 알카에오글로부스 풀기두스(Archaeoglobus fulgidus), 알카에오글로부스 풀기두스 DSM 4304, 아스카리스 수움(Ascaris suum), 아스퍼질러스 푸미가투스, 아스퍼질러스 니둘란스, 아스퍼질러스 니거, 아스퍼질러스 니거 CBS 513.88, 아스퍼질러스 테레우스 NIH2624, 아조토박터 비넬란디이(Azotobacter vinelandii) DJ, 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium), 바실러스 메타놀리쿠스(Bacillus methanolicus) MGA3, 바실러스 메타놀리쿠스 PB1, 바실러스 스피시즈 SG-1, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 베이헨스테파넨시스(Bacillus weihenstephanensis) KBAB4, 박테로이데스 프라길리스(Bacteroides fragilis), 봄빅스 모리(Bombyx mori), 보스 타우루스(Bos taurus), 브라디리조븀 자포니쿰(Bradyrhizobium japonicum), 브라디리조븀 자포니쿰 USDA110, 브라시카 나푸스(Brassica napsus), 부르크홀데리아 암비파리아(Burkholderia ambifaria ) AMMD , 부르크홀데리아 멀티보란스(Burkholderia multivorans) ATCC 17616, 부르크홀데리아 피마툼(Burkholderia phymatum), 부르크홀데리아 스타빌리스(Burkholderia stabilis), 부티레이트-생산 세균 L2-50, 카에노라브디티스 브릭사에(Caenorhabditis briggsae) AF16, 카에노라브디티스 엘레간스(Caenorhabditis elegans), 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 칸디다 알비칸스(Candida albicans ), 칸디다 보이디니이( Candida boidinii ), 칸디다 메틸리카(Candida methylica ), 칸디다 파라프실로시스( Candida parapsilosis ), 칸디다 트로피칼리스(Candida tropicalis ), 칸디다 트로피칼리스 MYA -3404, 칸디다투스 프로토클라미디아 아모에보필라( Candidatus Protochlamydia amoebophila ), 카니스 루푸스 파밀리아리스( Canis lupus familiaris )(개), 카르복시도써무스 하이드로게노포르만스( Carboxydothermus hydrogenoformans ), 카르타무스 팅크토리우스( Carthamus tinctorius), 클라미도모나스 레인하르드티이(Chlamydomonas reinhardtii), 클로로븀 리미콜라(Chlorobium limicola), 클로로븀 테피둠(Chlorobium tepidum), 클로로플렉수스 아우란티아쿠스(Chloroflexus aurantiacus), 시트루스 주노스(Citrus junos), 클로스트리디움 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum), 클로스트리디움 아미노부틸리쿰, 클로스트리디움 베이제린키이(Clostridium beijerinckii), 클로스트리디움 베이제린키이 NCIMB 8052, 클로스트리디움 카르복시디보란스(Clostridium carboxidivorans) P7, 클로스트리디움 클루이베리(Clostridium kluyveri), 클로스트리디움 클루이베리 DSM 555, 클로스트리디움 파스퇴리아눔(Clostridium pasteurianum), 클로스트리디움 사카로페르부틸아세토니쿰(Clostridium saccharoperbutylacetonicum), 클로스트리디움 심비오슘(Clostriduim symbiosum), 클로스트리디움 테타니(Clostridium tetani) E88, 콜벨리아 사이크레리트라에아(Colwellia psychrerythraea) 34H, 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 크립토코커스 네오포르만스 변종(Cryptococcus neoformans var), 크립토스포리디움 파르븀 아이오와(Cryptosporidium parvum Iowa) II, 쿠페아 후케리아나(Cuphea hookeriana), 쿠페아 팔루스트리스(Cuphea palustris), 쿠프리아비두스 네카토르(Cupriavidus necator), 쿠프리아비두스 타이와넨시스(Cupriavidus taiwanensis), 시아노븀(Cyanobium) PCC7001 , 시아노테세 스피시즈(Cyanothece species) PCC 7425, 다니오 레리오(Danio rerio), 데설파티바실룸 알케니보란스(Desulfatibacillum alkenivorans) AK-01, 데설포코커스 올레오바오란스( Desulfococcus oleovaorans ) Hxd3, 데설포비브리오 아프리카누스(Desulfovibrio africanus), 딕티오스텔륨 디스코이데움(Dictyostelium discoideum), 딕티오스텔륨 디스코이데움 AX4, 드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster), 에리쓰로박터 스피시즈(Erythrobacter species) NAP1, 에스케리키아 콜라이 K12 균주 MG1655, 유글레나 그라실리스(Euglena gracilis), 플라보박테리아 박테리움(Flavobacteria bacterium) BAL38, 푸소박테리움 누클레아툼(Fusobacterium nucleatum), 제오바실러스 써모데니트리피칸스(Geobacillus thermodenitrificans), 하에모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenza), 할로아르큘라 마리스모르투이(Haloarcula marismortui), 할로아르큘라 마리스모르투이 ATCC 43049, 할로모나스 스피시즈(Halomonas species) HTNK1, 헬리안투스 안누우스(Helianthus annuus), 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori), 헬리코박터 파이로리 26695, 호모 사피엔스(Homo sapiens), 하이드로게노박터 써모필루스(Hydrogenobacter thermophilus), 클렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumonia), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 클루이베로마이세스 락티스 NRRL Y-1140, 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 레우테리(Lactobacillus reuteri), 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis), 레이프소니아 스피시즈(Leifsonia species) S749, 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides), 링비아 스피시즈(Lyngbya species) PCC 8106, 마카카 뮬라타(Macaca mulatta), 마그네토스피릴룸 마그네티쿰(Magnetospirillum magneticum) AMB-1, 만헤이미아 숙시니시프로듀센스(Mannheimia succiniciproducens), 해양감마 프로테오박테리움 HTCC2080, 마리노박터 아쿠아에올레이(Marinobacter aquaeolei), 마리노박터 아쿠아에올레이 VT8, 메가티르수스 막시무스(Megathyrsus maximus), 메소리조븀 로티(Mesorhizobium loti), 메탈로스파에라 세둘라(Metallosphaera sedula), 메타노사르시나 써모필라(Methanosarcina thermophila), 메타노써모박터 서마유토트로피쿠스(Methanothermobacter thermautotrophicus), 메틸로박테리움 엑스토르쿠엔스(Methylobacterium extorquens), 모노시가 브레비콜리스(Monosiga brevicollis), 무어렐라 써모아세티카(Moorella thermoacetica), 무어렐라 써모아세티카 ATCC 39073, 무스 무스쿨루스(Mus musculus), 마이코박테리움 아비움 서브스피시즈 파라튜베르큘로시스(Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis) K-10, 마이코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis) BCG, 마이코박테리움 마리눔(Mycobacterium marinum) M, 마이코박테리움 스메그마티스(Mycobacterium smegmatis), 마이코박테리움 스메그마티스 MC2 155, 마이코박테리움 스피시즈(균주 JLS), 마이코박테리움 스피시즈 MCS, 마이코박테리움 스피시즈 균주 JLS, 마이코박테리움 튜베르큘로시스(Mycobacterium tuberculosis), 믹소코커스 잔투스(Myxococcus xanthus) DK 1622, 네마토스텔라 벡텐시스(Nematostella vectensis), 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa ) OR74A, 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum), 노카르디아 브라실리엔시스(Nocardia brasiliensis), 노카르디아 파르시니카(Nocardia farcinica) IFM 10152, 노카르디아 이오웬시스(Nocardia iowensis), 노듈라리아 스푸미제나(Nodularia spumigena ) CCY9414 , 노스톡 아졸라에(Nostoc azollae ), 노스톡 스피시즈 PCC 7120, 오피투타세아에 박테리움(Opitutaceae bacterium) TAV2 , 파라코커스 데니트리피칸스 ( Paracoccus denitrificans), 페니실리움 크리소제눔(Penicillium chrysogenum), 페르킨수스 마리누스(Perkinsus marinus) ATCC 50983, 포토박테리움 포스포레움(Photobacterium phosphoreum), 포토박테리움 스피시즈 SKA34, 피세아 시트켄시스(Picea sitchensis), 피키아 파스토리스, 피키아 파스토리스 GS115, 플라스모디움 팔시파룸(Plasmodium falciparum ), 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis), 포리피로모나스 진지발리스 W83, 프로클로로코커스 마리누스(Prochlorococcus marinus) MIT 9312, 프로피오니제니움 모데스툼(Propionigenium modestum), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 슈도모나스 아에루기노사 PAO1, 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens), 슈도모나스 플루오레센스 Pf0-1, 슈도모나스 낵무시이(Pseudomonas knackmussii), 슈도모나스 낵무시이(B13), 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida), 슈도모나스 푸티다 GB-1, 슈도모나스 스피시즈(Pseudomonas species), 슈도모나스 스피시즈 CF600, 슈도모나스 스투트제리(Pseudomonas stutzeri), 슈도모나스 스투트제리 A1501, 슈도모나스 시링가에(Psudomonas syringae), 피로바쿨룸 아에로필룸 균주(Pyrobaculum aerophilum strain) IM2, 랄스토니아 유트로파(Ralstonia eutropha), 랄스토니아 메탈리듀란스(Ralstonia metallidurans), 라투스 노르베기쿠스(Rattus norvegicus), 레이네케아 스피시즈(Reinekea species) MED297, 리조븀 에틀리(Rhizobium etli) CFN 42, 리조븀 레구미노사룸(Rhizobium leguminosarum), 로도박터 스파에로이데스(Rhodobacter spaeroides), 로도코커스 에리쓰로폴리스(Rhodococcus erythropolis), 로도코커스 스피시즈, 로도슈도모나스 팔루스트리스(Rhodopseudomonas palustris), 로세이플렉수스 카스텐홀지이(Roseiflexus castenholzii), 로세오바리우스 스피시즈(Roseovarius species) HTCC2601, 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae), 사카로마이세스 세레비지아에 s288c, 살모넬라 엔테릭(Salmonella enteric), 살모넬라 엔테리카 서브스피시즈 엔테리카 세로바 티피뮤리움(Typhimurium) 균주 LT2, 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium), 살모넬라 티피뮤리움 LT2, 셰페르소마이세스 스티피티스(Scheffersomyces stipitis), 스키조사카로마이세스 폼베, 시겔라 디센테리아에(Shigella dysenteriae), 시겔라 손네이(Shigella sonnei), 심몬드시아 키넨시스(Simmondsia chinensis), 솔라눔 라이코페르시쿰(Solanum lycopersicum), 솔다리아 마크로스포라(Sordaria macrospora), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스테노트로포모나스 말토필리아(Stenotrophomonas maltophilia), 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 스트렙토코커스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae), 스트렙토코커스 상귀니스(Streptococcus sanguinis), 스트렙토마이세스 아눌라투스(Streptomyces anulatus), 스트렙토마이세스 아베르미틸리스(Streptomyces avermitillis), 스트렙토마이세스 신나모넨시스(Streptomyces cinnamonensis), 스트렙토마이세스 코엘리콜라(Streptomyces coelicolor), 스트렙토마이세스 그리세우스 서브스피시즈 그리세우스( Streptomyces griseus subspecies griseus) NBRC 13350, 스트렙토마이세스 루리두스(Streptomyces luridus), 스트렙토마이세스 스피시즈 CL190, 스트렙토마이세스 스피시즈 KO-3988, 스트렙토마이세스 비리도크로모제네스(Streptomyces viridochromogenes), 스트렙토마이세스 베드모렌시스(Streptomyces wedmorensis), 스트롱길로센트로투스 푸르푸라투스(Strongylocentrotus purpuratus ), 설포로부스 토코다이이(Sulfolobus tokodaii), 설포로부스 솔파타리쿠스(Sulfolobus solfataricus), 설포로부스 애시도칼다리우스(Sulfolobus acidocaldarius), 설푸리하이드로제니븀 서브테라네움(Sulfurihydrogenibium subterraneum), 설푸리모나스 데니트리피칸스(Sulfurimonas denitrificans), 수스 스크로파(Sus scrofa), 시네코코커스 엘론가투스(Synechococcus elongatus) PCC 6301, 시네코코커스 엘론가투스 PCC 7942, 시네코코커스 스피시즈 PCC 7002, 신트로포박터 푸마록시단스(Syntrophobacer fumaroxidans), 신트로푸스 애시디트로피쿠스(Syntrophus aciditrophicus), 테트라오돈 니그로비리디스(Tetraodon nigroviridis), 써모아나에로박터 에타노리쿠스(Thermoanaerobacter ethanolicus) JW 200, 써모아나에로박터 슈드에타놀리쿠스 ATCC 33223, 써모코커스 리토랄리스(Thermococcus litoralis), 써모프로테우스 뉴트로필루스(Thermoproteus neutrophilus), 써모토가 마리티메(Thermotoga maritime), 트레포네마 덴티콜라(Treponema denticola), 트리볼리움 카스타네움(Tribolium castaneum), 트리코모나스 바기날리스(Trichomonas vaginalis) G3, 트리티쿰 아에스티븀(Triticum aestivum), 트리파노소마 부르세이(Trypanosoma brucei), 트리파노소마 크루지(Trypanosoma cruzi) 균주 CL 브레너, 츠카무렐라 파우로메타볼라(Tsukamurella paurometabola) DSM 20162, 움벨루라리아 칼리포르니아(Umbellularia California), 베일로넬라 파르뷸라(Veillonella parvula), 비브리오 콜레라에(Vibrio cholerae) V51, 제노푸스 트로피칼리스(Xenopus tropicalis), 야로위아 리포리티카(Yarrowia lipolytica), 제아 메이스(Zea mays), 주글로에아 라미거(Zoogloea ramiger), 자이모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis), 자이모모나스 모빌리스 서브스피시즈 모빌리스 ZM4뿐만 아니라 본 발명에 개시되거나 상응하는 유전자에 대한 공급원 미생물로서 이용할 수 있는 다른 예시적인 종들을 포함한다. 그러나, 395개 미생물 게놈 및 다양한 효모, 진균, 식물, 및 포유동물 게놈들을 포함하여, 현재 550 초과의 종들(이들 중 절반 이상을 NCBI와 같은 공개적인 데이터베이스 상에서 입수할 수 있다)에 대해 입수할 수 있는 완전한 게놈 서열과 함께, 관련된 또는 떨어진 종들 중의 하나 이상의 유전자들에 대한 필수적인 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 생합성 활성을 암호화하는 유전자들의 동정, 예를 들어 공지된 유전자들의 상동 기관, 이종 상동체, 상동체 및 비-이종 상동성 유전자 치환, 및 유기체들 간의 유전자 변경의 교환은 통상적이며 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 따라서, 에스케리키아 콜라이와 같은 특정 유기체에 관하여 본 발명에 개시된 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산의 생합성을 가능하게 하는 대사적 변경을 다른 미생물들, 예를 들어 원핵생물 및 진핵생물 유기체에도 마찬가지로 쉽게 적용할 수 있다. 본 발명에 제공된 교시 및 지침에 따라, 당해 분야의 숙련가들은 하나의 유기체에서 예시된 대사적 변경을 다른 유기체에도 동등하게 적용할 수 있음을 알 것이다.
일부 예에서, 예를 들어 대안적인 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 생합성 경로가 관련없는 종들에서 존재하는 경우, 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 생합성을, 예를 들어 유사하지만, 동일하지는 않은 대사 반응을 촉매화하는 상기 관련없는 종들로부터의 상동체 또는 상동체들의 외부 발현에 의해 숙주 종에 부여하여 상기 기준 반응을 대체할 수 있다. 대사 네트워크들 간에 어떤 차이가 상이한 유기체들 간에 존재하므로, 당해 분야의 숙련가들은 상이한 유기체들 간의 실제 유전자 사용이 상이할 수 있음을 알 것이다. 그러나, 본 발명에 제공된 교시 및 지침에 따라, 당해 분야의 숙련가들은 또한 본 발명의 교시 및 방법을 본 발명에 예시된 것들과 동족의 대사 변경을 사용하는 모든 미생물 유기체들에 적용하여 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산을 합성하는 관심 종의 미생물 유기체를 제작할 수 있다. 본 발명의 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 경로 효소 또는 단백질을 암호화하는 핵산 분자는 또한 서열번호, 젠뱅크(GenBank) 및/또는 GI 번호에 의해 본 발명에 개시된 핵산에 하이브리드화하는 핵산 분자, 또는 서열번호, 젠뱅크 및/또는 GI 번호에 의해 본 발명에 개시된 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 분자에 하이브리드화하는 핵산 분자를 포함할 수 있다. 하이브리드화 조건은 본 발명에 개시된 것들과 같이 당해 분야의 숙련가에게 잘 공지된 매우 엄격함, 보통 엄격함 또는 낮은 엄격성 하이브리드화 조건을 포함할 수 있다. 유사하게, 본 발명에 사용될 수 있는 핵산 분자를 서열번호, 젠뱅크 및/또는 GI 번호에 의해 본 발명에 개시된 핵산, 또는 서열번호, 젠뱅크 및/또는 GI 번호에 의해 본 발명에 개시된 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 분자에 하이브리드화하는 핵산 분자에 대해 일정 퍼센트의 서열 일치성을 갖는 것으로서 개시할 수 있다. 예를 들어, 상기 핵산 분자는 본 발명에 개시된 핵산에 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 일치성을 가질 수 있다.
엄격한 하이브리드화는 하이브리드화된 폴리뉴클레오타이드가 안정성인 조건을 지칭힌다. 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 바와 같이, 상기 하이브리드화된 폴리뉴클레오타이드의 안정성은 상기 하이브리드의 용융 온도(Tm)에서 반영된다. 일반적으로, 상기 하이브리드화된 폴리뉴클레오타이드의 안정성은 염 농도, 예를 들어 나트륨 이온 농도 및 온도의 함수이다. 하이브리드화 반응을 보다 낮은 엄격성의 조건 하에서 수행한 다음 다른, 그러나 보다 높은 엄격성의 세척을 수행할 수 있다. 하이브리드화 엄격성에 대한 언급은 상기와 같은 세척 조건에 관한 것이다. 매우 엄격한 하이브리드화는 65 ℃에서 0.018M NaCl 중에서 안정한 하이브리드화된 폴리뉴클레오타이드를 형성하는 핵산 서열들만의 하이브리드화를 허용하는 조건을 포함하며, 예를 들어 하이브리드가 65 ℃에서 0.018M NaCl 중에서 안정하지 않은 경우, 상기 하이브리드는 본 발명에서 고려되는 바와 같이, 높은 엄격성 조건하에서 안정하지 않을 것이다. 높은 엄격성 조건은 예를 들어 42 ℃에서 50% 폼아미드, 5X 덴하르트 용액, 5X SSPE, 0.2% SDS 중에서의 하이브리드화에 이어서 65 ℃에서 0.1X SSPE 및 0.1% SDS에서의 세척에 의해 제공될 수 있다. 매우 엄격한 하이브리드화 이외의 하이브리드화 조건을 또한 본 발명에 개시된 핵산 서열을 개시하는데 사용할 수 있다. 예를 들어, 보통으로 엄격한 하이브리드화란 어구는 42 ℃에서 50% 폼아미드, 5X 덴하르트 용액, 5X SSPE, 0.2% SDS 중에서의 하이브리드화에 이어서 42 ℃에서 0.2X SSPE 및 0.2% SDS에서의 세척에 상당하는 조건을 지칭한다. 낮은 엄격성 하이브리드화란 어구는 22 ℃에서 10% 폼아미드, 5X 덴하르트 용액, 6X SSPE, 0.2% SDS 중에서의 하이브리드화에 이어서 37 ℃에서 0.1X SSPE 및 0.2% SDS에서의 세척에 상당하는 조건을 지칭한다. 덴하르트 용액은 1% 피콜, 1% 폴리비닐피롤리돈, 및 1% 소 혈청 알부민(BSA)을 함유한다. 20X SSPE(염화 나트륨, 나트륨 포스페이트, 에틸렌 다이아미드 테트라아세트산(EDTA))는 3M 염화 나트륨, 0.2M 나트륨 포스페이트, 및 0.025M(EDTA)을 함유한다. 다른 적합한 낮은, 보통 및 높은 엄격성 하이브리드화 완충제 및 조건들은 당해 분야의 숙련가들에게 널리 공지되어 있으며 예를 들어 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York(2001)] 및 문헌[Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, MD(1999)]에 개시되어 있다.
본 발명의 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 경로 효소 또는 단백질을 암호화하는 핵산은 본 발명에 개시된 뉴클레오타이드 서열에 적어도 일정한 서열 일치성을 가질 수 있다. 따라서, 본 발명의 일부 태양에서, 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 경로 효소 또는 단백질을 암호화하는 핵산 분자는 서열번호, 젠뱅크 및/또는 GI 번호에 의해 본 발명에 개시된 핵산, 또는 서열번호, 젠뱅크 및/또는 GI 번호에 의해 본 발명에 개시된 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 분자에 하이브리드화하는 핵산 분자에 65% 이상의 일치성, 70% 이상의 일치성, 75% 이상의 일치성, 80% 이상의 일치성, 85% 이상의 일치성, 90% 이상의 일치성, 91% 이상의 일치성, 92% 이상의 일치성, 93% 이상의 일치성, 94% 이상의 일치성, 95% 이상의 일치성, 96% 이상의 일치성, 97% 이상의 일치성, 98% 이상의 일치성, 또는 99% 이상의 일치성의 뉴클레오타이드 서열을 갖는다.
서열 일치성(또한 상동성 또는 유사성으로서 공지됨)은 2개의 핵산 분자 간의, 또는 2개의 폴리펩타이드 간의 서열 유사성을 지칭한다. 일치성은 비교를 목적으로 정렬될 수 있는 각 서열 중의 위치를 비교함으로써 측정될 수 있다. 상기 비교된 서열 중의 위치가 동일한 염기 또는 아미노산에 의해 점유될 때, 상기 분자들은 상기 위치에서 일치한다. 서열들 간의 일치성 정도는 상기 서열들에 의해 공유되는 합치되거나 상동성인 위치의 수의 함수이다. 2개의 서열을 그들의 서열 일치성 퍼센트의 측정을 위해 정렬시키는 것을 당해 분야에 공지된 소프트웨어 프로그램, 예를 들어 문헌[Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, MD (1999)]에 개시된 바와 같은 프로그램을 사용하여 수행할 수 있다. 바람직하게, 디폴트 매개변수를 상기 정렬에 사용한다. 사용될 수 있는 당해 분야에 널리 공지된 하나의 정렬 프로그램은 디폴트 매개변수에 대해 지정된 BLAST이다. 특히, 프로그램은 하기의 디폴트 매개변수를 사용하는 BLASTN 및 BLASTP이다: 유전자 암호 = 표준; 필터 = 없음; 가닥 = 둘 다; 컷오프 = 60; 예상 = 10; 행렬 = BLOSUM62; 지정 품목 = 50개 서열; HIGH SCORE에 의해 분류됨; 데이터베이스 = 비-중복, 젠뱅크 + EMBL + DDBJ + PDB + 젠뱅크 CDS 번역 + SwissProtein + SPupdate + PIR. 이들 프로그램에 대한 세부사항은 국립 생명공학 정보 센터에서 찾을 수 있다.
비-천연 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산-생산 숙주의 발현 수준을 구성하고 시험하기 위한 방법을 예를 들어 당해 분야에 널리 공지된 재조합체 및 검출 방법에 의해 수행할 수 있다. 상기와 같은 방법들은 예를 들어 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York(2001)] 및 [Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, MD(1999)]에 개시되어 있다.
지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산의 생산을 위한 경로에 관여하는 외인성 핵산 서열들을 당해 분야에 널리 공지된 기법들, 예를 들어 비제한적으로 접합, 일렉트로포레이션, 화학적 변환, 형질도입, 형질감염, 및 초음파 변환을 사용하여 숙주 세포에 안정하게 또는 일시적으로 도입시킬 수 있다. 에스케리키아 콜라이 또는 다른 원핵 세포에서의 외부 발현을 위해서, 상기 유전자의 일부 핵산 서열 또는 진핵생물 핵산의 cDNA는 표적화 신호, 예를 들어 N-말단 미토콘드리아 또는 다른 표적화 신호를 암호화할 수 있으며, 상기 신호를 경우에 따라 원핵생물 숙주 세포로의 형질전환 전에 제거할 수 있다. 예를 들어, 미토콘드리아 리더 서열의 제거로 에스케리키아 콜라이에서의 발현이 증가되었다(문헌[Hoffmeister et al., J. Biol. Chem. 280:4329-4338(2005)]). 효모 또는 다른 진핵생물 세포에서의 외부 발현을 위해서, 유전자를 리더 서열의 첨가 없이 시토솔에서 발현시키거나, 미토콘드리온 또는 다른 세포 소기관에 표적화하거나, 적합한 표적화 서열, 예를 들어 미토콘드리아 표적화 또는 상기 숙주 세포에 적합한 분비 신호의 첨가에 의해 분비에 대해 표적화할 수 있다. 따라서, 표적화 서열의 제거 또는 포함을 위한 핵산 서열에 대한 적합한 변형을 외인성 핵산 서열에 결합시켜 바람직한 성질들을 부여할 수 있을 것으로 생각된다. 더욱 또한, 유전자에 대해 당해 분야에 널리 공지된 기법으로 코돈 최적화를 수행하여 상기 단백질의 최적화된 발현을 성취할 수 있다.
숙주 유기체 중에서 작용성인 발현 조절 서열에 작동적으로 결합된, 본 발명에 예시된 바와 같은 핵산을 암호화하는 하나 이상의 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 생합성 경로를 포함하는 발현 벡터 또는 벡터들을 제작할 수 있다. 본 발명의 미생물 숙주 유기체에 사용하기에 적용 가능한 발현 벡터는 예를 들어 플라스미드, 파지 벡터, 바이러스 벡터, 에피솜 및 인공 염색체, 예를 들어 숙주 염색체 내로의 안정한 편입을 위해 작동 가능한 벡터 및 선택 서열 또는 마커를 포함한다. 또한, 상기 발현 벡터는 하나 이상의 선택성 마커 유전자 및 적합한 발현 조절 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어 항생제 또는 독소에 대한 내성, 상보성 영양요구성 결핍, 또는 배양 배지 중에 없는 결정적인 영양소를 제공하는 선택성 마커 유전자가 추가로 포함될 수 있다. 발현 조절 서열은 당해 분야에 널리 공지된 구성 및 유도 프로모터, 전사 증진인자, 전사 종결자 등을 포함할 수 있다. 2개 이상의 외인성 암호화 핵산을 공동 발현시켜야 하는 경우, 상기 두 핵산을 모두 예를 들어 단일 발현 벡터 또는 별도의 발현 벡터에 삽입할 수 있다. 단일 벡터 발현의 경우, 상기 암호화 핵산을 하나의 공통 발현 조절 서열에 작동적으로 연결시키거나 상이한 발현 조절 서열, 예를 들어 하나의 유도 프로모터 및 하나의 구성 프로모터에 결합시킬 수 있다. 대사 또는 합성 경로에 관여하는 외인성 핵산 서열의 형질전환을 당해 분야에 널리 공지된 방법을 사용하여 확인할 수 있다. 상기와 같은 방법은 예를 들어 핵산 분석, 예를 들어 mRNA의 노던 블럿 또는 폴리머라제 쇄 반응(PCR) 증폭, 또는 유전자 산물의 발현에 대한 면역블럿팅, 또는 도입된 핵산 서열 또는 그의 상응하는 유전자 산물의 발현을 시험하기 위한 다른 적합한 분석 방법을 포함한다. 당해 분야의 숙련가들은 상기 외인성 핵산이 목적하는 생성물을 생산하기에 충분한 양으로 발현됨을 알 것이며, 발현 수준을 당해 분야에 널리 공지되고 본 발명에 개시된 바와 같은 방법을 사용하여 충분한 발현이 획득되도록 최적화할 수 있음을 또한 알 것이다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 하기 화학식 I의 화합물을 생산하는 조건하에서 및 상기 생산에 충분한 기간 동안 비-천연 미생물 유기체를 배양함을 포함하는, 상기 화학식 I의 화합물의 제조 방법을 제공하며:
화학식 I
Figure pct00037
[상기 식에서,
R1은 C1 -24 선형 알킬이고;
R2는 CH2OH, CHO 또는 COOH이고;
R3은 H, OH 또는 옥소(=O)이고;
Figure pct00038
은 단일 또는 이중 결합을 나타내되;
R3이 결합되는 탄소 원자의 원자가는 4이다],
이때 상기 비-천연 미생물 유기체는 종결 경로와 함께 MI-FAE 주기 또는 MD-FAE 주기를 갖고, 이때 상기 MI-FAE 주기는 하나 이상의 티올라제, 하나 이상의 3-옥소아실-CoA 리덕타제, 하나 이상의 3-하이드록시아실-CoA 데하이드라타제, 및 하나 이상의 에노일-CoA 리덕타제를 포함하고, 이때 상기 MD-FAE 주기는 하나 이상의 엘론가제, 하나 이상의 3-옥소아실-CoA 리덕타제, 하나 이상의 3-하이드록시아실-CoA 데하이드라타제, 및 하나 이상의 에노일-CoA 리덕타제를 포함하며, 이때 상기 종결 경로는 (1) 1H; (2) 1K 및 1L; (3) 1E 및 1N; (4) 1K, 1J, 및 1N; (5) 1E; (6) 1K 및 1J; (7) 1H 및 1N; (8) 1K, 1L, 및 1N; (9) 1E 및 1F; (10) 1K, 1J, 및 1F; (11) 1H, 1N, 및 1F; (12) 1K, 1L, 1N, 및 1F; 및 (13) 1G 중에서 선택된 도 1, 6 또는 7에 도시된 경로를 포함하고, 이때 1E는 아실-CoA 리덕타제(알데하이드-형성)이고, 1F는 알콜 데하이드로게나제이고, 1G는 아실-CoA 리덕타제(알콜-형성)이고, 1H는 아실-CoA 하이드롤라제, 아실-CoA 트랜스퍼라제 또는 아실-CoA 신타제이고, 1J는 아실-ACP 리덕타제이고, 1K는 아실-CoA:ACP 아실트랜스퍼라제이고, 1L은 티오에스테라제이고, 1N은 알데하이드 데하이드로게나제(산-형성) 또는 카복실산 리덕타제이고, 이때 상기 MI-FAE 주기, MD-FAE 주기 또는 종결 경로의 효소는 하나 이상의 외인성 핵산에 의해 암호화되고 하기 화학식 I의 화합물을 생산하기에 충분한 양으로 발현되고, 이때 상기 MI-FAE 주기, MD-FAE 주기 및 종결 경로의 각각의 효소들의 기질은 하기 화학식 II의 화합물, 말로닐-CoA, 프로피오닐-CoA 및 아세틸-CoA 중에서 독립적으로 선택되고:
화학식 II
Figure pct00039
[상기 식에서,
R1은 C1 -24 선형 알킬이고;
R3은 H, OH 또는 옥소(=O)이고;
R4는 S-CoA, ACP, OH 또는 H이고;
Figure pct00040
은 단일 또는 이중 결합을 나타내되;
R3이 결합되는 탄소 원자의 원자가는 4이다],
이때 상기 MI-FAE 주기의 하나 이상의 효소는 각각 상기 화학식 I의 화합물의 R1에서의 탄소수 이하인 R1에서의 탄소수를 갖는 화학식 II의 화합물에 대해 선택성이고, 이때 상기 MD-FAE 주기의 하나 이상의 효소는 각각 상기 화학식 I의 화합물의 R1에서의 탄소수 이하인 R1에서의 탄소수를 갖는 화학식 II의 화합물에 대해 선택성이고, 이때 상기 종결 경로의 하나 이상의 효소는 각각 상기 화학식 I의 화합물의 R1에서의 탄소수 이상인 R1에서의 탄소수를 갖는 화학식 II의 화합물에 대해 선택성이다.
일부 태양에서, 본 발명은 R1이 C1-17 선형 알킬인 화학식 I의 화합물의 생성 방법을 제공한다. 본 발명의 또 다른 태양에서, 화학식 I의 화합물의 R1은 C1 선형 알킬, C2 선형 알킬, C3 선형 알킬, C4 선형 알킬, C5 선형 알킬, C6 선형 알킬, C7 선형 알킬, C8 선형 알킬, C9 선형 알킬, C10 선형 알킬, C11 선형 알킬, C12 선형 알킬 또는 C13 선형 알킬, C14 선형 알킬, C15 선형 알킬, C16 선형 알킬, C17 선형 알킬, C18 선형 알킬, C19 선형 알킬, C20 선형 알킬, C21 선형 알킬, C22 선형 알킬, C23 선형 알킬, 또는 C24 선형 알킬이다.
본 발명의 일부 태양에서, 본 발명의 방법에 사용되는 상기 미생물 유기체는, 각각의 외인성 핵산이 상기 MI-FAE 주기 또는 MD-FAE 주기의 효소를 암호화하는 2, 3 또는 4개의 상기 외인성 핵산을 포함한다. 본 발명의 일부 태양에서, 상기 미생물 유기체는, 각각의 외인성 핵산이 종결 경로의 효소를 암호화하는 2, 3 또는 4개의 상기 외인성 핵산을 포함한다. 본 발명의 일부 태양에서, 본 발명의 방법에 사용되는 상기 미생물 유기체는 (1) 내지 (13) 중에서 선택된 경로 중 하나 이상의 효소들을 각각 암호화하는 외인성 핵산을 포함한다. 일부 태양에서, 상기 하나 이상의 외인성 핵산은 이종 핵산이다. 일부 태양에서, 상기 비-천연 미생물 유기체는 실질적으로 혐기성 배양 배지 중에 있다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 하기 화학식 III 내지 VI 중에서 선택된 지방 알콜을 생성시키는 방법을 제공한다:
화학식 III
Figure pct00041
화학식 IV
Figure pct00042
화학식 V
Figure pct00043
화학식 VI
Figure pct00044
상기 식에서,
R1은 C1 -24 선형 알킬이거나, 다르게는 R1은 C1 -17 선형 알킬이거나, 다르게는 R1은 C9 -13 선형 알킬이다.
본 발명의 일부 태양에서, R1은 C1 선형 알킬, C2 선형 알킬, C3 선형 알킬, C4 선형 알킬, C5 선형 알킬, C6 선형 알킬, C7 선형 알킬, C8 선형 알킬, C9 선형 알킬, C10 선형 알킬, C11 선형 알킬, C12 선형 알킬 또는 C13 선형 알킬, C14 선형 알킬, C15 선형 알킬, C16 선형 알킬, C17 선형 알킬, C18 선형 알킬, C19 선형 알킬, C20 선형 알킬, C21 선형 알킬, C22 선형 알킬, C23 선형 알킬, 또는 C24 선형 알킬이다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 하기 화학식 VII 내지 X 중에서 선택된 지방 알데하이드의 생성 방법을 제공한다:
화학식 VII
Figure pct00045
화학식 VIII
Figure pct00046
화학식 IX
Figure pct00047
화학식 X
Figure pct00048
상기 식에서,
R1은 C1 -24 선형 알킬이거나, 다르게는 R1은 C1 -17 선형 알킬이거나, 다르게는 R1은 C9 -13 선형 알킬이다.
본 발명의 일부 태양에서, R1은 C1 선형 알킬, C2 선형 알킬, C3 선형 알킬, C4 선형 알킬, C5 선형 알킬, C6 선형 알킬, C7 선형 알킬, C8 선형 알킬, C9 선형 알킬, C10 선형 알킬, C11 선형 알킬, C12 선형 알킬 또는 C13 선형 알킬, C14 선형 알킬, C15 선형 알킬, C16 선형 알킬, C17 선형 알킬, C18 선형 알킬, C19 선형 알킬, C20 선형 알킬, C21 선형 알킬, C22 선형 알킬, C23 선형 알킬, 또는 C24 선형 알킬이다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 하기 화학식 XI 내지 XIV 중에서 선택된 지방 산의 생성 방법을 제공한다:
화학식 XI
Figure pct00049
화학식 XII
Figure pct00050
화학식 XIII
Figure pct00051
화학식 XIV
Figure pct00052
상기 식에서,
R1은 C1 -24 선형 알킬이거나, 다르게는 R1은 C1 -17 선형 알킬이거나, 다르게는 R1은 C9 -13 선형 알킬이다.
본 발명의 일부 태양에서, R1은 C1 선형 알킬, C2 선형 알킬, C3 선형 알킬, C4 선형 알킬, C5 선형 알킬, C6 선형 알킬, C7 선형 알킬, C8 선형 알킬, C9 선형 알킬, C10 선형 알킬, C11 선형 알킬, C12 선형 알킬 또는 C13 선형 알킬, C14 선형 알킬, C15 선형 알킬, C16 선형 알킬, C17 선형 알킬, C18 선형 알킬, C19 선형 알킬, C20 선형 알킬, C21 선형 알킬, C22 선형 알킬, C23 선형 알킬, 또는 C24 선형 알킬이다.
일부 실시태양에서, 본 발명에 개시된 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산의 제조 방법은 아세틸-CoA 경로, 및 아세틸-CoA를 생산하기에 충분한 양으로 발현되는 아세틸-CoA 경로 효소를 암호화하는 하나 이상의 외인성 핵산을 갖는 비-천연 미생물 유기체를 사용함을 포함하고, 이때 상기 아세틸-CoA 경로는 (1) 2A 및 2B; (2) 2A, 2C, 및 2D; (3) 2H; (4) 2G 및 2D; (5) 2E, 2F 및 2B; (6) 2E 및 2I; (7) 2J, 2F 및 2B; (8) 2J 및 2I; (9) 3A, 3B, 및 3C; (10) 3A, 3B, 3J, 3K, 및 3D; (11) 3A, 3B, 3G, 및 3D; (12) 3A, 3F, 및 3D; (13) 3N, 3H, 3B 및 3C; (14) 3N, 3H, 3B, 3J, 3K, 및 3D; (15) 3N, 3H, 3B, 3G, 및 3D; (16) 3N, 3H, 3F, 및 3D; (17) 3L, 3M, 3B 및 3C; (18) 3L, 3M, 3B, 3J, 3K, 및 3D; (19) 3L, 3M, 3B, 3G, 및 3D; (20) 3L, 3M, 3F, 및 3D; (21) 4A, 4B, 4D, 4H, 4I, 및 4J; (22) 4A, 4B, 4E, 4F, 4H, 4I, 및 4J; (23) 4A, 4B, 4E, 4K, 4L, 4H, 4I, 및 4J; (24) 4A, 4C, 4D, 4H, 및 4J; (25) 4A, 4C, 4E, 4F, 4H, 및 4J; (26) 4A, 4C, 4E, 4K, 4L, 4H, 및 4J; (27) 5A, 5B, 5D, 및 5G; (28) 5A, 5B, 5E, 5F, 및 5G; (29) 5A, 5B, 5E, 5K, 5L, 및 5G; (30) 5A, 5C, 및 5D; (31) 5A, 5C, 5E, 및 5F; 및 (32) 5A, 5C, 5E, 5K, 및 5L 중에서 선택된 도 2, 3, 4 또는 5에 도시된 경로를 포함하고, 이때 2A는 피루베이트 옥시다제(아세테이트-형성)이고, 2B는 아세틸-CoA 신시타제, 아세틸-CoA 리가제 또는 아세틸-CoA 트랜스퍼라제이고, 2C는 아세테이트 키나제이고, 2D는 포스포트랜스아세틸라제이고, 2E는 피루베이트 데카복실라제이고, 2F는 아세트알데하이드 데하이드로게나제이고, 2G는 피루베이트 옥시다제(아세틸-포스페이트-형성)이고, 2H는 피루베이트 데하이드로게나제, 피루베이트:페레독신 옥시도리덕타제, 피루베이트:NAD(P)H 옥시도리덕타제 또는 피루베이트 포메이트 라이아제이고, 2I는 아세트알데하이드 데하이드로게나제(아실화)이고, 2J는 쓰레오닌 알돌라제이고, 3A는 포스포에놀피루베이트(PEP) 카복실라제 또는 PEP 카복시키나제이고, 3B는 옥살로아세테이트 데카복실라제이고, 3C는 말로네이트 세미알데하이드 데하이드로게나제(아세틸화)이고, 3D는 아세틸-CoA 카복실라제 또는 말로닐-CoA 데카복실라제이고, 3F는 옥살로아세테이트 데하이드로게나제 또는 옥살로아세테이트 옥시도리덕타제이고, 3G는 말로네이트 세미알데하이드 데하이드로게나제(아실화)이고, 3H는 피루베이트 카복실라제이고, 3J는 말로네이트 세미알데하이드 데하이드로게나제이고, 3K는 말로닐-CoA 신시타제 또는 말로닐-CoA 트랜스퍼라제이고, 3L은 말산 효소이고, 3M은 말레이트 데하이드로게나제 또는 말레이트 옥시도리덕타제이고, 3N은 피루베이트 키나제 또는 PEP 포스파타제이고, 4A는 시트레이트 신타제이고, 4B는 시트레이트 운반자이고, 4C는 시트레이트/말레이트 운반자이고, 4D는 ATP 시트레이트 라이아제이고, 4E는 시트레이트 라이아제이고, 4F는 아세틸-CoA 신시타제 또는 아세틸-CoA 트랜스퍼라제이고, 4H는 시토솔 말레이트 데하이드로게나제이고, 4I는 말레이트 운반자이고, 4J는 미토콘드리아 말레이트 데하이드로게나제이고, 4K는 아세테이트 키나제이고, 4L은 포스포트랜스아세틸라제이고, 5A는 시트레이트 신타제이고, 5B는 시트레이트 운반자이고, 5C는 시트레이트/옥살로아세테이트 운반자이고, 5D는 ATP 시트레이트 라이아제이고, 5E는 시트레이트 라이아제이고, 5F는 아세틸-CoA 신시타제 또는 아세틸-CoA 트랜스퍼라제이고, 5G는 옥살로아세테이트 운반자이고, 5K는 아세테이트 키나제이고, 5L은 포스포트랜스아세틸라제이다.
일부 태양에서, 본 발명의 방법에 사용되는 미생물 유기체는, 각각의 외인성 핵산이 아세틸-CoA 경로 효소를 암호화하는 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개의 상기 외인성 핵산을 포함할 수 있다. 일부 태양에서, 상기 미생물 유기체는 (1) 내지 (32) 중에서 선택된 경로 중 하나 이상의 아세틸-CoA 경로 효소들을 각각 암호화하는 외인성 핵산을 포함한다.
상기 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산의 생산을 시험하기에 적합한 정제 및/또는 분석을 널리 공지된 방법을 사용하여 수행할 수 있다. 3중 배양물과 같은 적합한 복제물을, 시험하려는 각각의 가공된 균주에 대해 생육시킬 수 있다. 예를 들어, 상기 가공된 생산 숙주 중의 생성물 및 부산물 형성을 모니터링할 수 있다. 최종 생성물 및 중간체, 및 다른 유기 화합물들을 HPLC(고성능 액체 크로마토그래피), GC-MS(기체 크로마토그래피-질량 분광학) 및 LC-MS(액체 크로마토그래피-질량 분광학) 또는 당해 분야에 널리 공지된 통상적인 과정을 사용하는 다른 적합한 분석 방법에 의해 분석할 수 있다. 발효 브로쓰 중의 생성물의 방출을 또한 배양 상등액을 사용하여 시험할 수 있다. 부산물 및 잔류 글루코스를 예를 들어 글루코스 및 알콜의 경우 굴절률 검출기, 및 유기산의 경우 UV 검출기(문헌[Lin et al., Biotechnol. Bioeng. 90:775-779(2005)])를 사용하는 HPLC, 또는 당해 분야에 널리 공지된 다른 적합한 분석 및 검출 방법에 의해 정량분석할 수 있다. 상기 외인성 DNA 서열로부터의 개별적인 효소 또는 단백질 활성을 당해 분야에 널리 공지된 방법을 사용하여 분석할 수 있다.
상기 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산을 당해 분야에 널리 공지된 다양한 방법을 사용하여 상기 배양물 중의 다른 성분들로부터 분리시킬 수 있다. 상기와 같은 분리 방법은 예를 들어 추출 과정뿐만 아니라 연속적인 액체-액체 추출, 투석 증발, 막 여과, 막 분리, 역삼투, 전기투석, 증류, 결정화, 원심분리, 추출여과, 이온 교환 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 흡착 크로마토그래피, 및 한외여과를 포함한다. 상기 방법들은 모두 당해 분야에 널리 공지되어 있다.
본 발명에 개시된 비-천연 미생물 유기체들 중 어느 것이든 본 발명의 생합성 산물을 생성 및/또는 분리하도록 배양할 수 있다. 예를 들어, 상기 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 생산자를 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산의 생합성 생산을 위해 배양할 수 있다. 따라서, 일부 실시태양에서, 본 발명은 본 발명에 개시된 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 경로 중간체를 갖는 배양 배지를 제공한다. 일부 태양에서, 상기 배양 배지를 또한 상기 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 경로 중간체를 생산하는 본 발명의 비-천연 미생물 유기체로부터 분리시킬 수 있다. 배양 배지로부터 미생물 유기체를 분리시키는 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 예시적인 방법은 여과, 면상 침전, 침전, 원심분리, 침강 등을 포함한다.
상기 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산의 생산을 위해서, 상기 재조합 균주를 탄소원 및 다른 필수 영양소를 갖는 배지에서 배양한다. 전체 공정의 비용을 줄이기 위해서 상기 발효기 중에 혐기성 조건을 유지시키는 것이 매우 바람직하다. 상기와 같은 조건은 예를 들어 먼저 상기 배지를 질소로 살포하고 이어서 상기 플라스크를 격막 및 크림프(crimp)-뚜껑으로 밀봉하여 획득할 수 있다. 생육이 혐기성 조건 하에서 관찰되지 않는 균주의 경우, 상기 격막에 제한된 통기를 위한 작은 구멍을 뚫어 미세 호기성 조건을 적용시킬 수 있다. 예시적인 혐기성 조건은 앞서 개시되었으며 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 예시적인 호기성 및 혐기성 조건들은 예를 들어 2007년 8월 10일자로 출원된, 미국특허공개 제 2009/0047719 호에 개시되어 있다. 발효를 또한 경우에 따라 2단계로 수행할 수 있다. 제 1 단계는 고도의 증식 및 따라서 고생산성을 허용하도록 호기성이고, 이어서, 고수율의 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산의 혐기성 단계가 있을 수 있다.
경우에 따라, 상기 배지의 pH를 필요에 따라 목적하는 pH에서 유지시키기 위해 염기, 예를 들어 NaOH 또는 다른 염기, 또는 산의 첨가에 의해 목적하는 pH, 특히 중성 pH, 예를 들어 대략 7의 pH에서 유지시킬 수 있다. 증식률을 분광광도계(600 ㎚)를 사용하여 광학 밀도를 측정함으로써 측정할 수 있고 글루코스 흡수율을 시간에 따른 탄소원 고갈을 모니터링함으로써 측정할 수 있다.
상기 생육 배지는 예를 들어 상기 비-천연 미생물에 탄소원을 공급할 수 있는 임의의 탄수화물 공급원을 포함할 수 있다. 상기와 같은 공급원은 예를 들어 당, 예를 들어 글루코스, 자일로스, 아라비노스, 갈락토스, 만노오스, 프럭토스, 슈크로스 및 전분; 또는 글리세롤을 포함하며, 탄소원을 탄소의 유일한 공급원으로서 단독으로 또는 본 발명에 개시되거나 당해 분야에 공지된 다른 탄소원과 함께 사용할 수 있는 것으로 이해된다. 탄수화물의 다른 공급원으로는 예를 들어 재생 가능한 공급원료 및 바이오매스가 있다. 본 발명의 방법에 공급원료로서 사용될 수 있는 예시적인 유형의 바이오매스는 셀룰로스 바이오매스, 헤미셀룰로스 바이오매스 및 리그닌 공급원료 또는 공급원료의 부분들을 포함한다. 상기와 같은 바이오매스 공급원료는 예를 들어 탄소원으로서 유용한 탄수화물 기질, 예를 들어 글루코스, 자일로스, 아라비노스, 갈락토스, 만노오스, 프럭토스 및 전분을 포함한다. 본 발명에 제공된 교시 및 지침에 따라, 당해 분야의 숙련가들은 상기 예시된 것들 이외의 재생 가능한 공급원료 및 바이오매스를 또한 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산의 생산을 위한 본 발명의 미생물 유기체의 발현에 사용할 수 있음을 알 것이다.
상기 예시된 바와 같은 재생 가능한 공급 원료 이외에, 본 발명의 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 미생물 유기체를 그의 탄소원으로서 합성 가스상에서의 증식을 위해 변형시킬 수 있다. 상기 특정 실시태양에서, 하나 이상의 단백질 또는 효소를 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 생산 유기체 중에서 발현시켜 합성 가스 또는 다른 기상 탄소원의 사용을 위한 대사 경로를 제공한다.
합성 가스(또한 합성 기체 또는 생산자 기체로서 공지됨)는 농작물 및 잔사를 포함한, 바이오매스 물질과 같은 탄소성 물질 및 목탄 기화의 주 생성물이다. 합성 가스는 주로 H2와 CO의 혼합물이며 임의의 유기 공급원료, 예를 들어 비제한적으로 석탄, 석유, 천연 가스, 바이오매스 및 폐 유기 물질의 기화로부터 수득될 수 있다. 기화는 일반적으로 높은 연료 대 산소 비 하에서 수행된다. 합성가스는 주로 H2 및 CO이기는 하지만, CO2 및 다른 가스들도 보다 소량으로 추가로 포함할 수 있다. 따라서, 합성 가스는 비용 효과적인 기상 탄소원, 예를 들어 CO 및 추가로 CO2를 제공한다.
우드 정달(Wood-Ljungdahl) 경로는 CO 및 H2의 아세틸-CoA 및 다른 산물들, 예를 들어 아세테이트로의 전환을 촉매화한다. CO 및 합성 가스를 사용할 수 있는 유기체들은 또한 일반적으로 상기 우드 정달 경로에 의해 포함되는 동일한 기본적인 효소 및 형질전환 조합을 통해 CO2 및 CO2/H2 혼합물을 사용하는 능력을 갖는다. 미생물에 의한 CO2의 아세테이트로의 H2-의존성 전환은, CO가 또한 동일한 유기체에 의해 사용될 수 있고 동일한 경로들이 관련된 것이 밝혀지기 전까지 오랫동안 인정되었다. 다수의 아세토젠(acetogen)이 CO2의 존재 하에서 증식하며 필요한 환원 당량을 공급하기 위해서 수소가 존재하는 한 아세테이트와 같은 화합물을 생산하는 것으로 나타났다(예를 들어 문헌[Drake, Acetogenesis, pp. 3-60 Chapman and Hall, New York, (1994)]을 참조하시오). 이를 하기 식에 의해 요약할 수 있다:
2 CO2 + 4 H2 + n ADP + n Pi → CH3COOH + 2 H2O + n ATP
따라서, 상기 우드 정달 경로를 갖는 비-천연 미생물은 아세틸-CoA 및 다른 목적하는 생성물의 생산을 위해서 CO2 및 H2 혼합물을 또한 사용할 수 있다.
상기 우드 정달 경로는 당해 분야에 널리 공지되어 있으며 2 개의 가지로 분리될 수 있는 12 개의 반응들로 이루어진다: (1) 메틸 가지; 및 (2) 카보닐 가지. 상기 메틸 가지는 합성 가스를 메틸-테트라하이드로폴레이트(메틸-THF)로 전환시키는 반면 상기 카보닐 가지는 메틸-THF를 아세틸-CoA로 전환시킨다. 상기 메틸 가지에서의 반응들은 하기의 효소들 또는 단백질들에 의해 차례대로 촉매화된다: 페레독신 옥시도리덕타제, 포메이트 데하이드로게나제, 폼일테트라하이드로폴레이트 신시타제, 메테닐테트라하이드로폴레이트 사이클로데하이드라타제, 메틸렌테트라하이드로폴레이트 데하이드로게나제 및 메틸렌테트라하이드로폴레이트 리덕타제. 상기 카보닐 가지에서의 반응들은 하기의 효소들 또는 단백질들에 의해 차례대로 촉매화된다: 메틸테트라하이드로폴레이트:코리노이드 단백질 메틸트랜스퍼라제(예를 들어 AcsE), 코리노이드 철-황 단백질, 니켈-단백질 조립 단백질(예를 들어 AcsF), 페레독신, 아세틸-CoA 신타제, 일산화 탄소 데하이드로게나제 및 니켈-단백질 조립 단백질(예를 들어 CooC). 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 경로를 생성시키기에 충분한 수의 암호화 핵산을 도입시키기 위해 본 발명에 제공된 교시 및 지침에 따라, 당해 분야의 숙련가들은 숙주 유기체 중에 존재하지 않는 상기 우드 정달 효소 또는 단백질을 암호화하는 하나 이상의 핵산을 도입시키는 것에 관하여 동일한 공학 디자인을 또한 수행할 수 있음을 알 것이다. 따라서, 변형된 유기체가 완전한 우드 정달 경로를 함유하도록 하나 이상의 암호화 핵산을 본 발명의 미생물 유기체에 도입시키는 것은 합성가스 사용 능력을 부여할 것이다.
또한, 일산화 탄소 데하이드로게나제와 커플링된 환원적 (역) 트라이카복실산 주기 및/또는 하이드로게나제 활성을 또한 CO, CO2 및/또는 H2의 아세틸-CoA 및 다른 생성물, 예를 들어 아세테이트로의 전환에 사용할 수 있다. 상기 환원적 TCA 경로를 통해 탄소를 고정할 수 있는 유기체는 하기의 효소들 중 하나 이상을 사용할 수 있다: ATP 시트레이트-라이아제, 시트레이트 라이아제, 아코니타제, 아이소시트레이트 데하이드로게나제, 알파-케토글루타레이트:페레독신 옥시도리덕타제, 숙시닐-CoA 신시타제, 숙시닐-CoA 트랜스퍼라제, 퓨마레이트 리덕타제, 퓨마라제, 말레이트 데하이드로게나제, NAD(P)H:페레독신 옥시도리덕타제, 일산화 탄소 데하이드로게나제, 및 하이드로게나제. 구체적으로, 상기 일산화 탄소 데하이드로게나제 및 하이드로게나제에 의해 CO 및/또는 H2로부터 추출된 환원 당량을 사용하여 CO2를 상기 환원적 TCA 주기를 통해 아세틸-CoA 또는 아세테이트 내로 고정시킨다. 아세테이트를 아세틸-CoA 트랜스퍼라제, 아세테이트 키나제/포스포트랜스아세틸라제, 및 아세틸-CoA 신시타제와 같은 효소들에 의해 아세틸-CoA로 전환시킬 수 있다. 아세틸-CoA를 피루베이트:페레독신 옥시도리덕타제 및 글루코스 신생 합성 효소에 의해 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 전구체, 글리세르알데하이드-3-포스페이트, 포스포에놀피루베이트, 및 피루베이트로 전환시킬 수 있다. 상기 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 경로를 생성시키기에 충분한 수의 암호화 핵산을 도입시키기 위해 본 발명에 제공된 교시 및 지침에 따라, 당해 분야의 숙련가들은 동일한 가공 설계를 또한 숙주 유기체 중에 없는 상기 환원적 TCA 경로 효소 또는 단백질을 암호화하는 하나 이상의 핵산을 도입시키는 것에 대해 수행할 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 상기 변형된 유기체가 완전한 환원적 TCA 경로를 함유하도록 본 발명의 미생물 유기체에 하나 이상의 암호화 핵산을 도입시키는 것은 합성 가스 이용 능력을 부여할 것이다.
따라서, 본 발명의 교시 및 지침에 따라, 당해 분야의 숙련가들은 탄소원, 예를 들어 탄수화물 상에서 생육 시 본 발명의 생합성된 화합물을 분비하는 비-천연 미생물 유기체를 생성시킬 수 있음을 알 것이다. 상기와 같은 화합물은 예를 들어 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 경로의 중간 대사 산물들 중 어느 것이든 포함한다. 필요한 것은 상기 필요한 효소 또는 단백질 활성들 중 하나 이상에서 상기 목적하는 화합물 또는 중간체의 생합성을 성취하도록, 예를 들어 상기 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 생합성 경로 중 일부 또는 전부를 포함하도록 가공하는 것이다. 따라서, 본 발명은 탄수화물 또는 다른 탄소원 상에서 생육 시 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산을 생산하고/하거나 분비하고 탄수화물 또는 다른 탄소원상에서 생육 시 상기 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 경로에 나타낸 중간 대사 산물들 중 임의의 것을 생산하고/분비하는 비-천연 미생물 유기체를 제공한다. 본 발명의 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 생산 미생물 유기체는 중간체, 예를 들어 3-케토아실-CoA, 3-하이드록시아실-CoA, 에노일-CoA, 아실-CoA, 아실-ACP, 아세테이트, 아세트알데하이드, 아세틸-포스페이트, 옥살로아세테이트, 말레이트, 말로네이트, 세미알데하이드, 말로네이트, 말로닐-CoA, 아세틸-CoA, 또는 시트레이트로부터 합성을 개시시킬 수 있다.
본 발명의 비-천연 미생물 유기체를, 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산을 생성시키기에 충분한 양의 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 경로 효소 또는 단백질을 암호화하는 하나 이상의 핵산을 외부적으로 발현하도록 본 발명에 예시된 바와 같이 당해 분야에 널리 공지된 방법을 사용하여 제작한다. 본 발명의 미생물을 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산을 생산하기에 충분한 조건 하에서 배양함이 이해된다. 본 발명에 제공된 교시 및 지침에 따라, 본 발명의 비-천연 미생물 유기체는 약 0.1 내지 200 mM 이상의 세포 내 농도를 생성시키는 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산의 생합성을 성취할 수 있다. 일반적으로, 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산의 세포 내 농도는 약 3 내지 150 mM, 특히 약 5 내지 125 mM, 보다 특히 약 8 내지 100 mM, 예를 들어 약 10 mM, 20 mM, 50 mM, 80 mM 또는 그 이상이다. 이들 예시적인 범위 사이 및 그 이상의 세포 내 농도도 또한 본 발명의 비-천연 미생물 유기체로부터 성취될 수 있다.
일부 실시태양에서, 배양 조건은 혐기성 또는 실질적으로 혐기성인 생육 또는 유지 조건을 포함한다. 예시적인 혐기성 조건들은 앞서 개시되었으며 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 발효 공정에 예시적인 혐기성 조건은 본 발명에 개시되어 있으며, 예를 들어 2007년 8월 10일자로 출원된 미국특허공개 제 2009/0047719 호에 개시되어 있다. 이들 조건 중 어느 것이든 상기 비-천연 미생물 유기체뿐만 아니라 당해 분야에 널리 공지된 다른 혐기성 조건들과 함께 사용될 수 있다. 상기와 같은 혐기성 또는 실질적으로 혐기성 조건 하에서, 상기 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 생산자는 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산을 5 내지 10 mM 이상의 세포 내 농도뿐만 아니라 본 발명에 예시된 다른 농도들로 합성할 수 있다. 비록 상기 설명이 세포 내 농도를 지칭하지만, 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 생산 미생물 유기체가 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산을 세포 내적으로 및/또는 상기 생성물을 배양 배지 내로 분비할 수 있음이 이해된다.
예시적인 발효 과정은 비제한적으로 유가 발효(fed-batch) 및 배치 분리; 유가 발효 및 연속 분리; 및 연속 발효 및 연속 분리를 포함한다. 예시적인 배치 발효 프로토콜에서, 상기 생산 유기체를 적합한 기체가 살포된 적합한 크기의 생물반응기에서 증식시킨다. 혐기성 조건하에서, 상기 배양물에 불활성 기체 또는 기체들의 조합, 예를 들어 질소, N2/CO2 혼합물, 아르곤, 헬륨 등을 살포한다. 상기 세포가 증식하고 탄소원을 이용함에 따라, 추가적인 탄소원(들) 및/또는 다른 영양분을 상기 생물반응기에 상기 탄소원 및/또는 영양분의 소비가 적합하게 균형을 이루는 속도로 공급한다. 상기 생물반응기의 온도를 목적하는 온도, 일반적으로는 22 내지 37 ℃에서 유지시키지만, 상기 온도를 상기 생산 유기체의 생육 특성 및/또는 상기 발효 과정에 바람직한 조건에 따라 보다 높거나 보다 낮은 온도에서 유지시킬 수 있다. 상기 발효기에서 상기 배양물의 목적하는 특성, 예를 들어 세포 밀도, 생성물 농도 등을 성취하기에 바람직한 기간동안 증식을 계속한다. 배치 발효 과정에서, 상기 발효 기간은 일반적으로 목적하는 배양 조건에 따라 수시간 내지 수일, 예를 들어 8 내지 24 시간, 또는 1, 2, 3, 4 또는 5일, 또는 1주일 이하의 범위이다. pH를 경우에 따라 조절하거나 조절하지 않을 수 있으며, pH가 조절되지 않는 배양물의 경우에 상기 pH는 전형적으로 상기 실행의 끝까지 pH 3 내지 6으로 감소할 것이다. 상기 배양 기간의 완료시, 상기 발효기 내용물을 세포 분리 유닛, 예를 들어 원심분리기, 여과 유닛 등에 통과시켜 세포 및 세포 찌꺼기를 제거할 수 있다. 상기 목적하는 생성물이 세포내에서 발현되는 경우에, 상기 세포를, 경우에 따라 추가적인 생성물을 방출시키기 위해서, 발효 브로쓰로부터 상기 세포의 분리 전 또는 분리 후에 효소에 의해서 또는 화학적으로 용해시키거나 파괴시킬 수 있다. 상기 발효 브로쓰를 생성물 분리 유닛으로 이동시킬 수 있다. 생성물의 단리는 희석된 수용액으로부터 목적하는 생성물을 분리시키기 위해 당해 분야에서 사용된 표준 분리 과정에 의해 발생한다. 상기와 같은 방법은 상기 발효 과정 산물의 화학적 특성에 따라, 비제한적으로 수 혼화성 유기 용매(예를 들어 톨루엔 또는 다른 적합한 용매, 예를 들어 비제한적으로 다이에틸 에테르, 에틸 아세테이트, 테트라하이드로퓨란(THF), 염화 메틸렌, 클로로폼, 벤젠, 펜탄, 헥산, 헵탄, 석유 에테르, 메틸 3급 부틸 에테르(MTBE), 다이옥산, 다이메틸폼아미드(DMF), 다이메틸 설폭사이드(DMSO) 등)를 사용하여 상기 생성물의 유기 용액을 제공하는 액체-액체 추출, 적합한 경우 표준 증류 방법 등을 포함한다.
예시적인 완전히 연속적인 발효 프로토콜에서, 상기 생산 미생물을 목적하는 세포 밀도를 성취하기 위해서 일반적으로는 먼저 배치 방식으로 증식시킨다. 탄소원 및/또는 다른 영양분이 고갈되면, 동일한 조성의 공급 배지를 목적하는 속도로 연속적으로 공급하고, 발효액을 동일한 속도로 회수한다. 상기와 같은 조건 하에서, 상기 생물반응기 중의 생성물 농도뿐만 아니라 세포 밀도는 일반적으로 일정하게 남아있는다. 상기 발효기의 온도를 상기에 논의된 바와 같이, 목적하는 온도에서 유지시킨다. 상기 연속적인 발효 단계 동안, 최적의 생산을 위해서 적합한 pH 범위를 유지시키는 것이 일반적으로 바람직하다. 상기 pH를 모니터링하고 통상적인 방법을 사용하여 유지시킬 수 있고, 예를 들어 적합한 산 또는 염기의 첨가를 첨가하여 목적하는 pH 범위를 유지시킬 수 있다. 상기 생물반응기를 적합하고 바람직한 대로, 연장된 기간 동안, 일반적으로 1주일 이상 내지 수주일 및 1개월 이하, 또는 그 이상 연속적으로 작동시킨다. 상기 발효액 및/또는 배양물을, 생성물 농도 및/또는 세포 밀도의 일관성을 보장하기 위해서, 경우에 따라 수일 이하의 샘플링을 포함하여 주기적으로 모니터링한다. 연속적인 방식에서, 발효기 내용물을 새로운 공급 배지가 공급됨에 따라 끊임없이 제거한다. 세포, 배지 및 생성물을 함유하는 배출 스트림에 일반적으로, 경우에 따라 세포 및 세포 찌꺼기를 제거하면서 또는 제거하지 않으면서, 연속적인 생성물 분리 과정을 가한다. 당해 분야에 사용되는 연속적인 분리 방법들, 예를 들어 비제한적으로 수 혼화성 유기 용매(예를 들어 톨루엔 또는 다른 적합한 용매, 예를 들어 비제한적으로 다이에틸 에테르, 에틸 아세테이트, 테트라하이드로퓨란(THF), 염화 메틸렌, 클로로폼, 벤젠, 펜탄, 헥산, 헵탄, 석유 에테르, 메틸 3급 부틸 에테르(MTBE), 다이옥산, 다이메틸폼아미드(DMF), 다이메틸 설폭사이드(DMSO) 등)를 사용하는 연속적인 액체-액체 추출, 표준 연속적인 증류 방법 등, 또는 당해 분야에 널리 공지된 다른 방법들을 사용하여 상기 생성물을 묽은 수용액으로부터 분리시킬 수 있다.
본 발명에 개시된 배양 및 발효 조건 이외에, 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산의 생합성을 성취하기 위한 생육 조건은 상기 배양 조건에 삼투보호제(osmoprotectant)의 첨가를 포함할 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명의 비-천연 미생물 유기체를 삼투보호제의 존재 하에서 본 발명에 개시된 바와 같이 지속시키거나, 배양하거나, 발효시킬 수 있다. 간단히, 삼투보호제는, 삼투물질로서 작용하고 본 발명에 개시된 바와 같은 미생물 유기체가 삼투 응력을 견디는데 일조하는 화합물을 의미한다. 삼투보호제는 비제한적으로 베타인, 아미노산 및 상기 트레할로스 당을 포함한다. 상기와 같은 삼투보호제의 비제한적인 예는 글리신 베타인, 프랄린 베타인, 다이메틸쎄틴, 다이메틸슬포니오프로프리오네이트, 3-다이메틸설포니오-2-메틸프로프리오네이트, 피페콜산, 다이메틸설포니오아세테이트, 콜린, L-카르니틴 및 엑토인이다. 하나의 태양에서, 상기 삼투보호제는 글리신 베타인이다. 당해 분야의 숙련가는 본 발명에 개시된 미생물 유기체를 삼투 응력으로부터 보호하기에 적합한 삼투보호제의 양 및 유형이, 사용되는 상기 미생물 유기체에 따라 변할 것임을 이해한다. 상기 배양 조건 하에서 삼투보호제의 양은 예를 들어 약 0.1 mM 이하, 약 0.5 mM 이하, 약 1.0 mM 이하, 약 1.5 mM 이하, 약 2.0 mM 이하, 약 2.5 mM 이하, 약 3.0 mM 이하, 약 5.0 mM 이하, 약 7.0 mM 이하, 약 10 mM 이하, 약 50 mM 이하, 약 100 mM 이하 또는 약 500 mM 이하일 수 있다.
일부 실시태양에서, 탄소 공급원료 및 다른 세포 섭취원, 예를 들어 포스페이트, 암모니아, 설페이트, 클로라이드 및 다른 할로겐을 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 또는 임의의 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 경로 중간체 중에 존재하는 원자들의 동위원소 분포를 변경하도록 선택할 수 있다. 상기 열거된 다양한 탄소 공급원료 및 다른 섭취원을 본 발명에서는 집합적으로 "섭취원"이라 칭할 것이다. 섭취원은 생성물 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 또는 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 중간체 중에 존재하는 임의의 원자, 또는 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 경로로부터 갈라져 나온 반응들에서 생성된 부산물의 동위원소 농축을 제공할 수 있다. 동위원소 농축은 예를 들어 탄소, 수소, 산소, 질소, 황, 인, 염소 또는 다른 할로겐을 포함한 임의의 표적 원자들에 대해 성취될 수 있다.
일부 실시태양에서, 상기 섭취원을 탄소-12, 탄소-13 및 탄소-14 비의 변경을 위해 선택할 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 섭취원을 산소-16, 산소-17, 및 산소-18 비의 변경을 위해 선택할 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 섭취원을 수소, 중수소 및 삼중수소 비의 변경을 위해 선택할 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 섭취원을 질소-14 및 질소-15 비의 변경을 위해 선택할 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 섭취원을 황-32, 황-33, 황-34 및 황-35 비의 변경을 위해 선택할 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 섭취원을 인-31, 인-32, 및 인-33 비의 변경을 위해 선택할 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 섭취원을 염소-35, 염소-36, 및 염소-37 비의 변경을 위해 선택할 수 있다.
일부 실시태양에서, 표적 원자의 동위원소 비를, 하나 이상의 섭취원을 선택함으로써 목적하는 비로 변화시킬 수 있다. 섭취원은 천연 공급원으로부터, 자연에서 발견되는 대로, 또는 인공 공급원으로부터 유래할 수 있으며, 당해 분야의 숙련가는 표적 원자의 목적하는 동위원소 비를 성취하기 위해서 천연 공급원, 인공 공급원, 또는 이들의 조합을 선택할 수 있다. 인공 섭취원의 일례는 예를 들어 화학 합성 반응으로부터 적어도 부분적으로 유도되는 섭취원을 포함한다. 상기와 같은 동위원소 농축 섭취원을 상업적으로 구입하거나 목적하는 동위원소 비를 성취하기 위해서 실험실에서 제조하고/하거나 상기 섭취원의 천연 공급원과 임의로 혼합할 수 있다. 일부 실시태양에서, 섭취원의 표적 원자 동위원소 비를, 목적하는 기원의 섭취원을 자연에서 발견되는 대로 선택함으로써 성취할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 논의된 바와 같이, 천연 공급원은 생물학적 유기체 또는 석유-기재 산물 또는 대기와 같은 공급원으로부터 유래하거나 합성되는 생물기반(biobased)일 수 있다. 일부 상기와 같은 실시태양에서, 탄소원을 예를 들어 화석 연료-유래된 탄소원(탄소-14가 비교적 고갈될 수 있다), 또는 환경 또는 대기 탄소원, 예를 들어 CO2(석유-유래된 대응물보다 더 많은 양의 탄소-14를 가질 수 있다)로부터 선택할 수 있다.
불안정한 탄소 동위원소 탄소-14 또는 방사성탄소는 지구 대기의 1012 탄소 원자 중 대략 1을 구성하며 약 5700년의 반감기를 갖는다. 탄소족은 우주선과 보통 질소(14N)를 수반하는 핵반응에 의해 상층 대기에 가득하다. 화석 연료는 오래전에 붕괴되었기 때문에 탄소-14가 없다. 화석 연료의 연소는 대기 탄소-14 분획을 감소시킨다(소위 "수스(Suess) 효과").
화합물 중 원자의 동위원소 비를 측정하는 방법은 당해 분야의 숙련가들에게 잘 알려져 있다. 동위원소 농축은 당해 분야에 공지된 기법들, 예를 들어 가속화된 질량분석법(AMS), 안정한 동위원소 비 질량분석법(SIRMS) 및 핵자기 공명에 의한 부위-특이적 천연 동위원소 분별(SNIF-NMR)을 사용하는 질량분석법에 의해 쉽게 평가된다. 상기와 같은 질량분석 기법들을 분리 기법, 예를 들어 액체 크로마토그래피(LC), 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 및/또는 기체 크로마토그래피 등과 통합시킬 수 있다.
탄소의 경우에, ASTM D6866이, 국제 미국 재료 시험 학회(ASTM)에 의해 방사성탄소 연대결정을 사용하여 고체, 액체 및 기상 샘플의 생물기반 함량을 측정하는 표준화된 분석 방법으로서 미국에서 개발되었다. 표준은 생성물의 생물기반 함량의 측정을 위한 방사성탄소 연대결정의 사용에 근거한다. ASTM D6866은 2004년에 최초로 공개되었으며, 현재 상기 표준의 활동 버전은 ASTM D6866-11이다(2011년 4월 1일 효력). 방사성탄소 연대결정 기법은 본 발명에 개시된 것들을 포함하여, 당해 분야의 숙련가들에게 잘 알려져 있다.
화합물의 생물기반 함량을 탄소-14(14C) 대 탄소-12(12C)의 비에 의해 추정한다. 구체적으로, 현대 분획(Fm)을 하기 식으로부터 계산한다: Fm = (S-B)/(M-B)(이때 B, S 및 M은 각각 블랭크, 샘플 및 현대 기준의 14C/12C 비를 나타낸다). 현대 분획은 "현대"로부터의 샘플의 14C/12C 비의 편차의 크기이다. 현대는 δ13CVPDB = -19/mil(문헌[Olsson, The use of Oxalic acid as a Standard. in, Radiocarbon Variations and Absolute Chronology, Nobel Symposium, 12th Proc., John Wiley & Sons, New York (1970)])에 대해 표준화된 미국 규격 표준국(NBS) 옥살산 I(즉 표준 기준 물질(SRM) 4990b)의 방사성탄소 농도의 95%로서 정의된다(AD 1950년). 예를 들어 ASM에 의해 측정된 질량 분석 결과는, δ13CVPDB = -19/mil에 대해 표준화된 NBS 옥살산 I(SRM 4990b)의 비활성의 0.95배의 국제적으로 인정된 정의를 사용하여 계산된다. 이는 1.176±0.010 x 1012의 절대(AD1950) 14C/12C 비와 같다(문헌[Karlen et al., Arkiv Geofysik, 4:465-471 (1968)]). 표준 계산은 또 다른 것에 대한 한 동위원소의 차별적인 섭취, 예를 들어 C12/C13/C14의 생물학적 시스템에서 우선적인 섭취를 고려하며, 상기 보정은 δ13에 대해 보정된 Fm으로서 반영된다.
옥살산 표준(SRM 4990b 또는 HOx 1)은 1955년 사탕무 농작물로부터 제조되었다. 1000 lb가 제조되었지만, 상기 옥살산 표준은 더 이상 상업적으로 이용 가능하지 않다. 옥살산 II 표준(HOx 2; N.I.S.T 명칭 SRM 4990 C)이 1977년 프랑스 당밀 농작물로부터 제조되었다. 1980년대 초에, 12개 실험 집단이 상기 두 표준의 비를 측정하였다. 옥살산 II 대 1의 활성비는 1.2933±0.001(가중 평균)이다. HOx II의 동위원소 비는 -17.8/mil이다. ASTM D6866-11은 현대 표준에 대해 상기 이용 가능한 옥살산 II 표준 SRM 4990 C(Hox2)의 사용을 제안한다(문헌[Mann, Radiocarbon, 25(2):519-527 (1983)]에서 원래 대 현재 이용 가능한 옥살산 표준에 대한 논의를 참조하시오). Fm = 0%는 물질 중 탄소-14 원자의 완전한 결여를 나타내며, 따라서 이는 화석(예를 들어 석유 기재) 탄소원을 가리킨다. Fm = 100%는, 1950년대 후반 핵폭발 시험으로부터 대기내로 탄소-14의 주입에 대한 보정 후의, 완전한 현대 탄소원을 가리킨다. 본 발명에 개시된 바와 같이, 상기와 같은 "현대" 공급원은 생물기반 공급원을 포함한다.
ASTM D6866에 개시된 바와 같이, 현대 탄소 퍼센트(pMC)는, 계속되고 있지만 1950년대 핵시험 프로그램의 효과의 감소로 인해(이는 ASTM D6866-11에 개시된 바와 같이 대기 중 탄소-14의 상당한 농축을 생성시켰다) 100%보다 클 수 있다. 모든 샘플 탄소-14 활성은 "폭발-전" 표준을 기준으로 하고 거의 모든 새로운 생물기반 제품은 폭발-후 환경에서 생산되기 때문에, 모든 pMC 값들(동위원소 분획에 대한 보정 후)은 상기 샘플의 진정한 생물기반 함량을 보다 양호하게 반영하기 위해서 0.95(2010년 현재)를 곱해야 한다. 103%를 초과하는 생물기반 함량은 분석 오차가 발생하였든지, 또는 상기 생물기반 탄소의 공급원이 수년보다 더 오래됨을 암시한다.
ASTM D6866은 물질의 전체 유기물 함량에 대한 생물기반 함량을 정량분석하며 존재하는 무기 탄소 및 다른 비-탄소 함유 물질은 고려하지 않는다. 예를 들어, 50% 전분-기재 물질 및 50% 물인 생성물은 ASTM D6866을 근거로 생물기반 함량 = 100%(100% 생물기반인 50% 유기물 함량)를 갖는 것으로 간주될 것이다. 또 다른 예에서, 50% 전분-기재 물질, 25% 석유-기재, 및 25% 물인 생성물은 생물기반 함량 = 66.7%(75% 유기물 함량이지만 상기 생성물의 단지 50%만이 생물기반이다)를 가질 것이다. 또 다른 예에서, 50% 유기 탄소이고 석유-기재 생성물인 생성물은 생물기반 함량 = 0%(50% 유기 탄소이지만 화석 공급원으로부터)를 갖는 것으로 간주될 것이다. 따라서, 화합물 또는 물질의 생물기반 함량을 측정하기 위한 널리 공지된 방법 및 공지된 표준을 근거로, 당해 분야의 숙련가는 상기 생물기반 함량을 쉽게 측정할 수 있고/있거나 목적하는 생물기반 함량을 갖는 본 발명을 사용하는 하류부분 제품들을 제조할 수 있다.
물질의 생물기반 함량을 정량분석하기 위한 탄소-14 연대결정 기법의 적용은 당해 분야에 공지되어 있다(문헌[Currie et al., Nuclear Instruments and Methods in Physics Research B, 172:281-287 (2000)]). 예를 들어, 탄소-14 연대결정을 사용하여 테레프탈레이트-함유 물질의 생물기반 함량을 정량분석하였다(문헌[Colonna et al., Green Chemistry, 13:2543-2548 (2011)]). 현저하게, 재생성 1,3-프로판다이올 및 석유-유래된 테레프탈산으로부터 유도된 프로필렌 테레프텔레이트(PPT) 중합체는 30%에 가까운 Fm 값을 생성시켰다(즉, 상기 중합체성 탄소의 3/11이 재생성 1,3-프로판다이올로부터, 및 8/11이 화석 최종 구성원 테레프탈산으로부터 유도되기 때문에)(상기 문헌[Currie et al., 2000]). 대조적으로, 재생성 1,4-부탄다이올 및 재생성 테레프탈산 모두로부터 유도된 폴리부틸렌 테레프탈레이트 중합체는 90%를 초과하는 생물기반 함량을 생성시켰다(상기 문헌[Colonna et al., 2011]).
따라서, 일부 실시태양에서, 본 발명은 대기 탄소(또한 대기 탄소 섭취원으로서 지칭됨)를 반영하는 탄소-12, 탄소-13 및 탄소-14 비를 갖는 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 또는 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 경로 중간체를 제공한다. 예를 들어, 일부 태양에서, 상기 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 또는 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 경로 중간체는 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상 또는 100% 정도의 Fm 값을 가질 수 있다. 일부 상기와 같은 실시태양에서, 상기 섭취원은 CO2이다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 석유-기재 탄소 섭취원을 반영하는 탄소-12, 탄소-13 및 탄소-14 비를 갖는 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 또는 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 경로 중간체를 제공한다. 상기 태양에서, 상기 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 또는 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 경로 중간체는 95% 미만, 90% 미만, 85% 미만, 80% 미만, 75% 미만, 70% 미만, 65% 미만, 60% 미만, 55% 미만, 50% 미만, 45% 미만, 40% 미만, 35% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 2% 미만 또는 1% 미만의 Fm 값을 가질 수 있다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 대기 탄소 섭취원과 석유-기재 탄소 섭취원의 조합에 의해 획득되는 탄소-12, 탄소-13 및 탄소-14 비를 갖는 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 또는 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 경로 중간체를 제공한다. 상기와 같은 섭취원들의 조합을 사용하는 것은, 탄소-12, 탄소-13 및 탄소-14 비를 변화시킬 수 있고 각각의 비가 상기 섭취원의 비율을 반영하는 한 가지 방식이다.
더욱이, 본 발명은 본 발명에 개시된 바와 같은 생물학적으로 생산된 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 또는 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 경로 중간체, 및 이로부터 유도된 생성물에 관한 것이며, 이때 상기 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 또는 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 경로 중간체는 환경 중에 존재하는 CO2와 대략 동일한 값의 탄소-12, 탄소-13 및 탄소-14 동위원소 비를 갖는다. 예를 들어, 일부 태양에서 본 발명은 환경 중에 존재하는 CO2와 대략 동일한 값의 탄소-12 대 탄소-13 대 탄소-14 동위원소 비를 갖는 생물유래(bioderived) 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 또는 생물유래 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 경로 중간체를 제공한다. 본 발명에 개시된 바와 같이, 생성물은 환경 중에 존재하는 CO2와 대략 동일한 값의 탄소-12 대 탄소-13 대 탄소-14 동위원소 비를 가질 수 있으며, 이때 상기 생성물은 본 발명에 개시된 바와 같은 생물유래 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 또는 생물유래 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 경로 중간체로부터 생성되며, 상기 생물유래 생성물은 화학적으로 변형되어 최종 생성물을 생성시키는 것으로 이해된다. 목적하는 생성물을 생성시키기 위해 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 또는 이들의 중간체의 생물유래 생성물을 화학적으로 변형시키는 방법은 본 발명에 개시된 바와 같이 당해 분야의 숙련가들에게 널리 공지되어 있다. 본 발명은 또한 환경 중에 존재하는 CO2와 대략 동일한 값의 탄소-12 대 탄소-13 대 탄소-14 동위원소 비를 갖는 생물연료, 화학제품, 중합체, 계면활성제, 비누, 세제, 샴푸, 윤활유 첨가제, 향료, 풍미 물질 또는 아크릴레이트를 제공하며, 이때 상기 생물연료, 화학제품, 중합체, 계면활성제, 비누, 세제, 샴푸, 윤활유 첨가제, 향료, 풍미 물질 또는 아크릴레이트는 본 발명에 개시된 바와 같은 생물유래 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 또는 생물유래 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 경로 중간체로부터 직접 또는 이들과 함께 생성된다.
지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산은 상업용 및 공업용으로 사용되는 화학물질이다. 상기와 같은 용도의 비제한적인 예는 생물연료, 화학제품, 중합체, 계면활성제, 비누, 세제, 샴푸, 윤활유 첨가제, 향료, 풍미 물질 및 아크릴레이트의 생산을 포함한다. 따라서, 일부 실시태양에서, 본 발명은 본 발명의 비-천연 미생물에 의해 생산되거나 본 발명에 개시된 방법을 사용하여 생성된 하나 이상의 생물유래 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 또는 생물유래 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 경로 중간체를 포함하는 생물연료, 화학제품, 중합체, 계면활성제, 비누, 세제, 샴푸, 윤활유 첨가제, 향료, 풍미 물질 및 아크릴레이트를 제공한다.
본 발명에 사용되는 바와 같이, "생물유래"란 용어는 생물학적 유기체로부터 유래하거나 상기 유기체에 의해 합성됨을 의미하며 생물학적 유기체에 의해서 생성되기 때문에 재생 자원으로 간주될 수 있다. 상기와 같은 생물학적 유기체, 특히 본 발명에 개시된 미생물 유기체는 농업, 식물, 세균 또는 동물 공급원으로부터 수득된 공급원료 또는 바이오매스, 예를 들어 당 또는 탄수화물을 이용할 수 있다. 다르게는, 상기 생물학적 유기체는 대기 탄소를 이용할 수 있다. 본 발명에 사용되는 바와 같이, "생물기반"이란 용어는 전적으로 또는 부분적으로 본 발명의 생물유래 화합물로 구성된 상술한 바와 같은 제품을 의미한다. 생물기반 또는 생물유래 제품은 석유유래 제품(이때 상기와 같은 생성물은 석유 또는 석유화학 공급원료로부터 유래되거나 합성된다)과 대비된다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 생물유래 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 또는 생물유래 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 경로 중간체를 포함하는 생물연료, 화학제품, 중합체, 계면활성제, 비누, 세제, 샴푸, 윤활유 첨가제, 향료, 풍미 물질 또는 아크릴레이트를 제공하며, 이때 상기 생물유래 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 또는 생물유래 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 경로 중간체는 생물연료, 화학제품, 중합체, 계면활성제, 비누, 세제, 샴푸, 윤활유 첨가제, 향료, 풍미 물질 또는 아크릴레이트의 제조에 사용되는 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 또는 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 경로 중간체의 일부 또는 전부를 포함한다. 예를 들어 최종적인 생물연료, 화학제품, 중합체, 계면활성제, 비누, 세제, 샴푸, 윤활유 첨가제, 향료, 풍미 물질 또는 아크릴레이트는 생물연료, 화학제품, 중합체, 계면활성제, 비누, 세제, 샴푸, 윤활유 첨가제, 향료, 풍미 물질 또는 아크릴레이트의 제조의 결과로서 상기 생물유래 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 또는 생물유래 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 경로 중간체를 함유할 수 있다. 상기와 같은 제조는 상기 최종적인 생물연료, 화학제품, 중합체, 계면활성제, 비누, 세제, 샴푸, 윤활유 첨가제, 향료, 풍미 물질 또는 아크릴레이트를 생산하는 반응에서 상기 생물유래 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 또는 생물유래 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 경로 중간체를 자신 또는 또 다른 화합물과 화학적으로 반응시킴(예를 들어 화학적 전환, 화학적 작용화, 화학적 결합, 산화, 환원, 중합, 공중합 등)을 포함할 수 있다. 따라서, 일부 태양에서, 본 발명은 2% 이상, 3% 이상, 5% 이상, 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상 또는 100%의 본 발명에 개시된 바와 같은 생물유래 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 또는 생물유래 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 경로 중간체를 포함하는 생물기반 생물연료, 화학제품, 중합체, 계면활성제, 비누, 세제, 샴푸, 윤활유 첨가제, 향료, 풍미 물질 또는 아크릴레이트를 제공한다. 일부 태양에서, 상기 제품이 본 발명에 개시된 생물유래 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산, 또는 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 경로 중간체를 포함하거나 이로부터 수득되는 생물기반 중합체인 경우, 상기 생물기반 중합체를 당해 분야에 널리 공지된 방법을 사용하여 성형시킬 수 있다. 따라서, 일부 실시태양에서, 본 발명은 본 발명에 개시된 생물기반 중합체를 포함하는 성형품을 제공한다.
또한, 일부 실시태양에서, 본 발명은 본 발명에 개시된 생물유래 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산, 또는 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 경로 중간체 및 상기 생물유래 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산, 또는 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 경로 중간체 이외의 화합물을 갖는 조성물을 제공한다. 예를 들어, 일부 태양에서, 본 발명은 생물기반 생물연료, 화학제품, 중합체, 계면활성제, 비누, 세제, 샴푸, 윤활유 첨가제, 향료, 풍미 물질 또는 아크릴레이트를 제공하며, 이때 이들의 생산에 사용되는 상기 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산, 또는 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 경로 중간체는 생물유래 및 석유 유래된 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산, 또는 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 경로 중간체의 조합이다. 예를 들어, 생물기반 생물연료, 화학제품, 중합체, 계면활성제, 비누, 세제, 샴푸, 윤활유 첨가제, 향료, 풍미 물질 또는 아크릴레이트를, 상기 제품의 적어도 일부가 본 발명에 개시된 미생물 유기체에 의해 생산된 생물유래 생성물을 포함하는 한, 50% 생물유래 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 및 50% 석유유래 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 또는 다른 목적하는 비, 예를 들어 60%/40%, 70%/30%, 80%/20%, 90%/10%, 95%/5%, 100%/0%, 40%/60%, 30%/70%, 20%/80%, 10%/90%의 생물유래/석유유래 전구체를 사용하여 제조할 수 있다. 본 발명의 생물유래 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 또는 생물유래 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 경로 중간체를 사용하는 생물연료, 화학제품, 중합체, 계면활성제, 비누, 세제, 샴푸, 윤활유 첨가제, 향료, 풍미 물질 또는 아크릴레이트의 제조 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있는 것으로 생각된다.
본 발명은 또한 생물유래 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산, 및 상기 생물유래 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 이외의 화합물을 포함하는 조성물을 제공한다. 상기 생물유래 생성물 이외의 화합물은 예를 들어 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 경로를 갖는 본 발명의 비-천연 생물 유기체의 세포 부분, 예를 들어 미량의 세포 부분이거나, 발효 브로쓰 또는 배양 배지, 또는 상기 유기체의 존재하에서 생성된 정제되거나 부분적으로 정제된 그의 분획일 수 있다. 상기 조성물은 예를 들어 본 발명에 개시된 바와 같이 감소된 부산물 형성을 갖는 유기체에 의해 생산될 때 감소된 수준의 부산물을 포함할 수 있다. 상기 조성물은 예를 들어 생물유래 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산, 또는 본 발명의 미생물 유기체의 세포 용해물 또는 배양 상등액을 포함할 수 있다.
몇몇 실시태양에서, 본 발명은 본 발명에서 제공된 생물유래 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산, 예를 들어 본 발명에 제공된 바와 같은 MI-FAE 주기 및/또는 MD-FAE 주기를 종결 경로와 함께 갖는 비-천연 미생물 유기체를 배양함으로써 생성된 생물유래 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산을 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 실시태양에서, 상기 조성물은 또한 상기 생물유래 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 이외의 화합물을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 생물유래 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 이외의 화합물은 MI-FAE 주기 및/또는 MD-FAE 주기를 종결 경로와 함께 갖는 비-천연 미생물 유기체의 미량의 세포 부분이다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 본 발명에 제공된 생물유래 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산을 포함하는 생물기반 제품을 제공한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 생물기반 제품은 생물연료, 화학제품, 중합체, 계면활성제, 비누, 세제, 샴푸, 윤활유 첨가제, 향료, 풍미 물질 또는 아크릴레이트이다. 몇몇 실시태양에서, 상기 생물기반 제품은 5% 이상의 생물유래 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 생물기반 제품은 10% 이상의 생물유래 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 생물기반 제품은 20% 이상의 생물유래 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산을 포함한다. 다른 실시태양에서, 상기 생물기반 제품은 30% 이상의 생물유래 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 생물기반 제품은 40% 이상의 생물유래 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산을 포함한다. 다른 실시태양에서, 상기 생물기반 제품은 50% 이상의 생물유래 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 상기 생물기반 제품은 반복 단위로서 상기 생물유래 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산의 일부를 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 본 발명은 본 발명에 제공된 생물기반 제품을 성형시킴으로써 수득된 성형품을 제공한다. 다른 실시태양에서, 본 발명은 상기 생물유래 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산을 자신 또는 또 다른 화합물과, 본 발명에서 제공된 생물기반 제품을 생성시키는 반응으로 화학적으로 반응시킴을 포함하는, 상기 생물기반 제품의 제조 방법을 제공한다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명은 상기 생물유래 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산을 포함하거나 이를 전환시킴으로써 수득한 중합체를 제공한다. 다른 실시태양에서, 본 발명은 상기 생물유래 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산을 중합체로 화학적으로 또는 효소에 의해 전환시킴을 포함하는, 상기 중합체의 제조 방법을 제공한다. 더욱 다른 실시태양에서, 본 발명은 상기 생물유래 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산, 또는 세포 용해물 또는 그의 배양 상등액을 포함하는 조성물을 제공한다.
상기 배양 조건은 예를 들어 액체 배양 과정뿐만 아니라 발효 및 다른 대규모 배양 과정을 포함할 수 있다. 본 발명에 개시된 바와 같이, 본 발명의 생합성 생성물의 특히 유용한 수율을 혐기성 또는 실질적으로 혐기성 배양 조건 하에서 획득할 수 있다.
본 발명에 개시된 바와 같이, 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산의 생합성을 성취하기 위한 하나의 예시적인 생육 조건은 혐기성 배양 또는 발효 조건을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명의 비-천연 미생물 유기체를 혐기성 또는 실질적으로 혐기성인 조건 하에서 지속시키거나, 배양하거나 발효시킬 수 있다. 간단히, 혐기성 조건은 산소가 없는 환경을 지칭한다. 실질적으로 혐기성 조건은 예를 들어 배지 중에 용해된 산소 농도가 0 내지 10%의 포화율로 남아 있도록 하는 배양, 배치 발효 또는 연속 발효를 포함한다. 실질적으로 혐기성 조건은 또한 1% 미만의 산소 분위기로 유지된 밀폐된 챔버 내부의 액체 배지 중에서 또는 고체 아가 상에서의 세포의 생육 또는 휴지를 포함한다. 상기 산소의 퍼센트를 예를 들어 상기 배양물에 N2/CO2 혼합물 또는 다른 적합한 비-산소 기체 또는 기체들을 살포함으로써 유지시킬 수 있다.
본 발명에 개시된 배양 조건을 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산의 제조를 위해 규모 확대하고 연속적으로 키울 수 있다. 예시적인 증식 과정은 예를 들어 유가 발효(fed-batch) 및 배치 분리; 유가 발효 및 연속 분리, 또는 연속 발효 및 연속 분리를 포함한다. 이들 과정은 모두 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 발효 과정은 상업적인 양의 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산의 생합성적 생산에 특히 유용하다. 일반적으로, 및 비-연속 배양 과정의 경우에서와 같이, 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산의 연속 및/또는 거의 연속 생산은 본 발명의 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 생산 유기체를, 증식을 지수 증식기에서 유지 및/또는 거의 유지시키기에 충분한 양분 및 배지에서 배양함을 포함할 것이다. 상기와 같은 조건 하에서 연속 배양은 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일 또는 그 이상을 포함할 수 있다. 또한, 연속 배양은 1, 2, 3, 4 또는 5 주 또는 그 이상 수 개월 이하를 포함할 수 있다. 다르게는, 본 발명의 유기체를 특정 용도에 적합한 경우, 수 시간 동안 배양할 수 있다. 상기 연속 및/또는 거의 연속 배양 조건이 이들 예시적인 기간들 사이의 모든 시간 간격들을 포함할 수 있음은 물론이다. 본 발명의 미생물 유기체의 배양 시간은 원하는 목적을 위해 충분한 양의 생성물을 생산하기에 충분한 기간 동안인 것으로 또한 여겨진다.
발효 과정은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 간단히, 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산의 생합성적 생산을 위한 발효를 예를 들어 유가 발효 및 배치 분리; 유가 발효 및 연속 분리, 또는 연속 발효 및 연속 분리에 사용할 수 있다. 배치 및 연속 발효 과정의 예들은 당해 분야에 널리 공지되어 있다.
상당량의 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산의 연속 생산을 위해 본 발명의 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 생산자를 사용하는 상기 발효 과정 이외에, 상기 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 생산자에 또한 상기 생성물을 다른 화합물로 전환시키는 화학적 합성 과정을 동시에 가하거나, 상기 생성물을 상기 발효 배양물로부터 분리시키고 경우에 따라 상기 생성물을 다른 화합물로 전환시키는 화학적 전환을 연속해서 가할 수 있다.
더 양호한 생산자를 생성시키기 위해서, 대사 모델링을 증식 조건의 최적화에 사용할 수 있다. 모델링을 또한 상기 경로의 사용을 추가로 최적화하는 유전자 녹아웃의 설계에 사용할 수 있다(예를 들어 미국특허공개 제 2002/0012939 호, 제 2003/0224363 호, 제 2004/0029149 호, 제 2004/0072723 호, 제 2003/0059792 호, 제 2002/0168654 호 및 제 2004/0009466 호, 및 미국 특허 제 7,127,379 호를 참조하시오). 모델링 분석은 상기 대사가 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산의 보다 효율적인 생산을 향해 이동하는 세포 생육에 대한 영향들의 신뢰성 있는 예견을 허용한다.
지방 알콜, 지방 알데하이드 및 지방 산을 높은 수율, 역가 및 생산성으로 생산하는 활성 및 선택성 효소 외에, 탄소 및 환원 당량을 지방 알콜, 지방 알데하이드 및 지방 산으로 효율적으로 지시하는 확고한 숙주 유기체가 이로울 수 있다. 본 발명에 개시된 숙주 변형은 목적하는 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 생성물의 형성에 유리한 본 발명에 개시된 선택성 효소와 함께 특히 유용하다. 본 발명에 개시된 여러 숙주 변형들은 상기 숙주 유기체내로 이종 효소 활성을 도입시킴을 수반한다. 다른 변형은 야생형 수준에 비해 효소 활성을 과발현시키거나 상승시킴을 포함한다. 더욱 다른 변형은 내인성 유전자의 파괴 또는 내인성 유전자 활성의 약화를 포함한다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, 상기 미생물 유기체는 탄소 및 에너지원을 효율적으로, 상기 MI-FAE 주기에서 프라이머 및 연장 단위 모두로서 사용되는 아세틸-CoA의 생산을 향하게 한다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, 상기 미생물 유기체는 탄소 및 에너지원을 효율적으로, MD-FAE 주기에서 프라이머 및 연장 단위 모두로서 사용되는 말로닐-CoA의 생산을 향하게 한다. 변형되지 않은 미생물 유기체에서, 시토솔에서의 지방 알콜, 지방 알데하이드 및 지방 산 생산은 필요한 전구체를 제공하는 고유의 세포 기구에 따라 변한다. 따라서, 고농도의 시토솔 아세틸-CoA 및/또는 말로닐-CoA가, 아세틸-CoA 또는 말로닐-CoA로부터 기원하는 시토솔 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 생산 경로의 전개를 촉진하는데 바람직하다. 시토솔 아세틸-CoA 및 말로닐-CoA를 증가시키기 위한 대사 공학 전략을 본 발명에 개시한다.
다수의 진핵생물 유기체들은 글루코스상에서 증식하는 동안 미토콘드리아에서 대부분의 그들의 아세틸-CoA를 합성하기 때문에, 시토솔에서 아세틸-CoA의 이용도를 증가시키는 것은 시토솔 아세틸-CoA 생합성 경로의 도입에 의해 획득될 수 있다. 따라서, 아세틸-CoA 생합성 경로를 본 발명에서 개시한다. 하나의 실시태양에서, 도 2에 도시된 경로들을 사용하여, 아세틸-CoA를 피루베이트 또는 쓰레오닌 전구체로부터 시토솔에서 합성할 수 있다. 다른 실시태양에서, 아세틸-CoA를 포스포에놀피루베이트(PEP) 또는 피루베이트로부터 시토솔에서 합성할 수 있다(도 3). 더욱 다른 실시태양에서, 아세틸-CoA를 세포 구획에서 합성하고 시토솔로 운반할 수 있다. 예를 들어, 하나의 기전은 미토콘드리아 아세틸-CoA를 대사 중간체, 예를 들어 시트레이트 또는 시트라말레이트로 전환시키고, 이들 중간체를 시토솔로 운반하고, 이어서 상기 아세틸-CoA를 재생시킴을 포함한다(도 4 및 5 참조). 예시적인 아세틸-CoA 경로 및 상응하는 효소를 실시예 II 내지 IV에 추가로 개시한다.
또 다른 실시태양에서, 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 생합성을 위해 시토솔 아세틸-CoA 이용도를 증가시키는 것은 아세틸-CoA 또는 그의 전구체를 사용하는 경쟁 효소 및 경로를 파괴하거나 약화시키는 것이다. 예시적인 경쟁 효소 활성은 비제한적으로 피루베이트 데카복실라제, 락테이트 데하이드로게나제, 단쇄 알데하이드 및 알콜 데하이드로게나제, 아세테이트 키나제, 포스포트랜스아세틸라제, 글리세르알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나제, 피루베이트 옥시다제 및 아세틸-CoA 카복실라제를 포함한다. 파괴 또는 약화가 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 생산을 개선시킬 수 있는 예시적인 아세틸-CoA 소비 경로는 미토콘드리아 TCA 주기, 지방 산 생합성, 에탄올 생산 및 아미노산 생합성을 포함한다. 이들 효소 및 경로를 본 발명에 추가로 개시한다.
시토솔 아세틸-CoA 생산을 증가시키기 위한 더욱 또 다른 전략은 세포질에서 이용가능한 CoA의 풀을 증가시키는 것이다. 이는 시토솔에서 CoA 생합성 효소의 과발현에 의해 성취될 수 있다. 특히, 판토테네이트 키나제(EC 2.7.1.33)의 발현을 사용할 수 있다. 상기 효소는 CoA 생합성의 첫 번째 단계 및 율속 효소를 촉매화한다. CoA에 의한 피드백 억제에 대해 내성인 예시적인 판토테네이트 키나제 변이체는 당해 분야에 널리 공지되어 있으며(문헌[Rock et al, J Bacteriol 185: 3410-5 (2003)]) 하기 표에 개시된다.
Figure pct00053
본 발명의 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산의 생산으로부터 아세틸-CoA 기질을 다른 데로 돌리는 경쟁 효소 및 경로를 또한 약화시키거나 파괴시킬 수 있다. 예시적인 약화를 위한 효소는 아실트랜스퍼라제, 카르니틴 셔틀 효소 및 MI-FAE 주기, MD-FAE 주기 또는 종결 경로 효소의 음의 조절인자를 포함한다.
아실 부분을 CoA로부터 다른 수용체, 예를 들어 ACP, 글리세롤, 에탄올 및 다른 것들로 운반하는 아실트랜스퍼라제의 파괴 또는 약화는 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 생산을 위한 아실-CoA의 이용도를 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 아실-CoA:ACP 트랜스아실라제(EC 2.3.1.38; 2.3.1.39) 효소, 예를 들어 에스케리키아 콜라이의 fabH(KASIII)는 아실 부분을 CoA로부터 ACP로 운반한다. FabH는 아세틸-CoA 및 부티릴-CoA 상에서 활성이다(문헌[Prescott et al, Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol, 36:269-311 (1972)]). 플라스모디움 팔시파룸 및 스트렙토마이세스 아베르미틸리스로부터의 아세틸-CoA:ACP 트랜스아실라제 효소는 에스케리키아 콜라이에서 이종 발현되었다(문헌[Lobo et al, Biochem 40:11955-64 (2001)]). fabH-결핍 락토코커스 락티스 숙주에서 발현된 플라스모디움 팔시파룸으로부터의 합성 KASIII(FabH)는 고유의 fadH 활성을 보완할 수 있었다(문헌[Du et al, AEM 76:3959-66 (2010)]). 스피나시아 올레라세아로부터의 아세틸-CoA:ACP 트랜스아실라제 효소는 부티릴-ACP를 포함하여, 기질로서 다른 아실-ACP 분자를 수용한다(문헌[Shimakata et al, Methods Enzym 122:53-9 (1986)]). 말로닐-CoA:ACP 트랜스아실라제 효소는 에스케리키아 콜라이 및 브라시카 나푸수스의 FabD를 포함한다(문헌[Verwoert et al, J Bacteriol, 174:2851-7 (1992)]; 문헌[Simon et al, FEBS Lett 435:204-6 (1998)]). 브라시카 나푸수스의 FabD는 fabD-결핍 에스케리키아 콜라이를 보완할 수 있었다. 상기 다기능 진핵생물 지방 산 신타제 효소 복합체(본 발명에 개시됨)가 또한 상기 활성을 촉매화한다. 다른 예시적인 아실트랜스퍼라제는 다이아실글리세롤 아실트랜스퍼라제, 예를 들어 사카로마이세스 세레비지아에의 LRO1 및 DGA1 및 야로위아 리포리티카의 DGA1 및 DGA2, 글리세로리피드 아실트랜스퍼라제 효소, 예를 들어 에스케리키아 콜라이의 plsB(젠뱅크: AAC77011.2, GI:87082362; 문헌[Heath and Rock, J Bacteriol 180:1425-30 (1998)]), 스테롤 아실트랜스퍼라제, 예를 들어 사카로마이세스 세레비지아에의 ARE1 및 ARE2, 에탄올 아실트랜스퍼라제(EEB1, EHT1), 추정적인 아실트랜스퍼라제(YMR210W) 및 다른 것들을 포함한다.
Figure pct00054
지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산의 생산을 증가시키는 것은 아세틸-CoA 및 아실-CoA 분자의 시토솔에서 유기체의 다른 구획, 예를 들어 미토콘드리아, 소포체, 프로테오리포솜 및 페록시솜으로의 수송에 관련된 효소들의 파괴 또는 약화를 필요로 할 수도 있다. 이들 구획에서, 상기 아실-CoA 중간체들은 분해되거나 구성요소로서 사용되어 지방 산, 보조인자 및 다른 부산물을 합성할 수 있다.
시토솔에 국소화된 아세틸-CoA 및 아실-CoA 분자들은 카르니틴 셔틀을 통해 담체 분자 카르니틴의 도움으로 다른 세포 구획으로 운반될 수 있다(문헌[van Roermund et al., EMBO J 14:3480-86 (1995)]). 세포 구획들 사이의 아실-카르니틴 셔틀은 효모, 예를 들어 칸디다 알비칸스에서 특성화되었다(문헌[Strijbis et al, J Biol Chem 285:24335-46 (2010)]). 상기 셔틀에서, 아실-CoA의 아실 부분은 아실카르니틴 트랜스퍼라제 효소에 의해 카르니틴으로 가역적으로 운반된다. 이어서 아세틸카르니틴은 세포소기관-특이성 아실카르니틴/카르니틴 트랜스로카제 효소에 의해 막을 관통하여 운반될 수 있다. 전좌 후에, 상기 아실-CoA는 아세틸카르니틴 트랜스퍼라제에 의해 재생된다. 파괴 또는 약화에 적합한 효소는 카르니틴 생합성에 관련된 카르니틴 아실트랜스퍼라제 효소, 아실카르니틴 트랜스로카제, 아실카르니틴 담체 단백질 및 효소를 포함한다.
카르니틴 아세틸트랜스퍼라제(CAT, EC 2.3.1.7)는 아세틸 단위를 아세틸-CoA로부터 담체 분자, 카르니틴으로 가역적으로 결합시킨다. 칸디다 알비칸스는 3개의 CAT 아이소자임: Cat2, Yat1 및 Yat2를 암호화한다(문헌[Strijbis et al., J Biol Chem 285:24335-46 (2010)]). Cat2는 미토콘드리온 및 페록시솜 모두에서 발현되는 반면, Yat1 및 Yat2는 시토솔성이다. 상기 Cat2 전사물은 상이한 탄소원 조건 하에서 조절되는 2개의 개시 코돈을 함유한다. 보다 긴 전사물은 미토콘드리아 표적화 서열을 함유하는 반면 보다 짧은 전사물은 페록시솜에 표적화된다. 사카로마이세스 세레비지아에의 Cat2 및 아스퍼질러스 니둘란스의 AcuJ는 이중 국소화의 유사한 기전을 사용한다(문헌[Elgersma et al., EMBO J 14:3472-9 (1995)]; 문헌[Hynes et al., Euk Cell 10:547-55 (2011)]). 아스퍼질러스 니둘란스의 시토솔 CAT는 facC에 의해 암호화된다. 다른 예시적인 CAT 효소들은 라투스 노르베기쿠스 및 호모 사피엔스에서 발견된다(문헌[Cordente et al., Biochem 45:6133-41 (2006)]). 예시적인 카르니틴 아실트랜스퍼라제 효소(EC 2.3.1.21)는 라투스 노르베기쿠스의 Cpt1 및 Cpt2 유전자 산물이다(문헌[de Vries et al., Biochem 36:5285-92 (1997)]).
Figure pct00055
카르니틴-아실카르니틴 트랜스로카제는 카르니틴 및 카르니틴-지방 산 복합체의 양방향 운반을 촉매화할 수 있다. Cact 유전자 산물은 미토콘드리아 막을 가로질러 아실-카르니틴 기질을 운반하는 기전을 제공한다(문헌[Ramsay et al Biochim Biophys Acta 1546:21-42 (2001)]). 유사한 단백질이 인간에서 연구되었다(문헌[Sekoguchi et al., J Biol Chem 278:38796-38802 (2003)]). 사카로마이세스 세레비지아에 미토콘드리아 카르니틴 담체는 Crc1이다(상기 문헌[van Roermund et al.]; 문헌[Palmieri et al., Biochimica et Biophys Acta 1757:1249-62 (2006)]). 인간 카르니틴 트랜스로카제는 사카로마이세스 세레비지아에의 Crc1-결핍 균주를 보완할 수 있었다(상기 문헌[van Roermund et al.]). 드로소필라 멜라노가스터 및 카에노라브디티스 엘레간스에서 발견되는 2개의 추가적인 카르니틴 트랜스로카제는 Crc-결핍 효소를 또한 보완할 수 있었다(문헌[Oey et al., Mol Genet Metab 85:121-24 (2005)]). 4개의 미토콘드리아 카르니틴/아세틸카르니틴 담체가 효모 및 인간 운반자에 대한 서열 상동성을 근거로 트리파노소마 브루세이에서 동정되었다(문헌[Colasante et al., Mol Biochem Parasit 167:104-117 (2009)]). 칸디다 알비칸스의 카르니틴 운반자가 또한 서열 상동성에 의해 동정되었다. 추가적인 미토콘드리아 카르니틴 운반자는 아스퍼질러스 니둘란스의 acuH 유전자 산물이며, 이는 독점적으로 미토콘드리아 막에 국소화된다(문헌[Lucas et al., FEMS Microbiol Lett 201:193-8 (2006)]).
Figure pct00056
페록시솜 막을 가로지르는 카르니틴 및 아실카르니틴의 운반은 잘-특성화되지 않았다. 효모에서 특이적인 페록시솜 아실카르니틴 담체 단백질은 지금까지 동정되지 않았다. 그러나, 미토콘드리아 카르니틴 트랜스로카제는 카르니틴 및 아세틸카르니틴의 페록시솜 운반에 또한 작용할 수 있다. 실험적 증거는 무스 무스쿨루스의 OCTN3 단백질이 페록시솜 카르니틴/아실카르니틴 트랜스로카제임을 암시한다.
더욱 또 다른 가능성은 아실-CoA 또는 아실-카르니틴이 사카로마이세스 세레비지아에의 Pxa1 및 Pxa2 ABC 운반자 또는 호모 사피엔스의 ALDP ABC 운반자와 같은 아실-CoA 운반자에 의해 페록시솜 또는 미토콘드리아 막을 통해 운반되는 것이다(문헌[van Roermund et al., FASEB J 22:4201-8 (2008)]). Pxa1 및 Pxa2(Pat1 및 Pat2)는 페록시솜 막에서 이종이량체성 복합체를 형성하며 지방 아실-CoA 에스터의 페록시솜으로의 ATP-의존성 운반을 촉매화한다(문헌[Verleur et al., Eur J Biochem 249: 657-61 (1997)]). pxa1/pxa2 결핍 효모의 돌연변이체 표현형은 ALDP의 이종 발현에 의해 구제될 수 있으며, 상기 ALDP는 일련의 아실-CoA 기질을 운반하는 것으로 나타났다(문헌[van Roermund et al., FASEB J 22:4201-8 (2008)]). Pxa12 운반 시스템의 결실은 페록시솜 지방 아실-CoA 신시타제(Faa2)의 결실과 협력하여, 사카로마이세스 세레비지아에에서 페록시솜 베타-산화를 없앴다. 경로 중간체 또는 산물의 페록시솜으로의 운반을 감소시키기 위한 더욱 또 다른 전략은 페록시솜 생물발생에 관련된 시스템들을 방해함으로써 페록시솜 기능을 약화 또는 제거하는 것이다. 예시적인 표적은 야로위아 리포리티카의 Pex10 및 상동기관이다.
Figure pct00057
카르니틴 생합성 경로 효소는 또한 파괴 또는 약화에 적합한 후보이다. 예를 들어 칸디다 알비칸스에서, 카르니틴은 4개의 효소 단계에서 트라이메틸-L-리신으로부터 합성된다(문헌[Strijbis et al., FASEB J 23:2349-59(2009)]). 카르니틴 경로 전구체, 트라이메틸리신(TML)은 단백질 분해 도중 생성된다. TML 다이옥시게나제(CaO13.4316)는 TML을 하이드록실화하여 3-하이드록시-6-N-트라이메틸리신을 형성한다. 이어서 피리독살-5'-포스페이트 의존성 알돌라제(CaO19.6305)는 HTML을 4-트라이메틸아미노부티르알데하이드로 절단한다. 상기 4-트라이메틸아미노부티르알데하이드는 데하이드로게나제(CaO19.6306)에 의해 4-트라이메틸아미노부티레이트로 후속으로 산화된다. 최종 단계에서, 4-트라이메틸아미노부티레이트는 CaO19.7131의 유전자 산물에 의해 하이드록실화되어 카르니틴을 형성한다. 상기 카르니틴 생합성 경로를 통한 흐름은 상기 경로 기질의 이용도에 의해 제한되며 매우 낮은 수준의 카르니틴이면 통상적인 카르니틴 셔틀 활성에 충분한 것으로 보인다(문헌[Strejbis et al., IUBMB Life 62:357-62(2010)]).
Figure pct00058
지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산의 생성을 향한 탄소 흐름을 경쟁 경로의 결실 또는 약화에 의해 개선시킬 수 있다. 효모의 전형적인 발효 산물은 에탄올, 글리세롤 및 CO2를 포함한다. 이들 부산물의 제거 또는 감소는 본 발명에 개시된 접근법들에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 호흡으로 인한 탄소 손실을 줄일 수 있다. 다른 잠재적인 부산물은 락테이트, 아세테이트, 포메이트, 지방 산 및 아미노산을 포함한다.
아세틸-CoA의 에탄올로의 전환은 상기 전환 과정이 MI-FAE 주기, MD-FAE 주기 및 종결 경로로부터 탄소 및 환원 당량을 모두 떼어놓을 수 있기 때문에 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산의 생산에 해로울 수 있다. 에탄올을 피루베이트 데카복실라제 및 에탄올 데하이드로게나제에 의해 촉매화된 2개의 효소 단계에서 피루베이트로부터 형성시킬 수 있다. 사카로마이세스 세레비지아에는 3개의 피루베이트 데카복실라제(PDC1, PDC5 및 PDC6)를 갖는다. PDC1은 주요 아이소자임이며 능동적으로 발효하는 세포에서 강하게 발현된다. PDC5는 또한 해당 발효 동안 작용하지만, 오직 PDC1의 부재하에서 또는 티아민 제한 조건하에서만 발현된다. PDC6은 비발효성 탄소원상에서 생육하는 동안 작용한다. PDC1 및 PDC5 결실은 에탄올 생산을 현저하게 감소시킬 수 있지만; 이들 결실은 증가된 PDC6 발현을 갖는 돌연변이체를 이끌어낼 수 있다. 상기 3개 모두의 결실은 에탄올 형성을 완전히 제거하지만, 상기 세포가 바이오매스 형성에 충분한 아세틸-CoA를 형성할 수 없기 때문에 증식 결함을 야기할 수 있다. 이는, 그러나, 세포를, 감소하는 양의 C2 탄소원(에탄올 또는 아세테이트)의 존재하에서 진화시킴으로써 극복될 수 있다(문헌[van Maris et al, AEM 69:2094-9 (2003)]). 또한, 피루베이트 데카복실라제 PDC1 및 PDC5의 양의 조절인자 PDC2의 결실은 에탄올 형성을, 야생형에 의해 만들어진 경우의 약 10%까지 감소시킨다(문헌[Hohmann et al, Mol Gen Genet 241:657-66 (1993)]). PDC 효소의 단백질 서열 및 식별번호를 실시예 II에 나열한다.
다르게는, 알데하이드를 에탄올 및/또는 다른 단쇄 알콜 데하이드로게나제로 전환시키는 알콜 데하이드로게나제를 파괴하거나 약화시켜 MI-FAE 주기, MD-FAE 주기 또는 종결 경로에 탄소 및 환원 당량을 제공할 수 있다. 지금까지, 7개의 알콜 데하이드로게나제, ADHI 내지 ADHVII이 사카로마이세스 세레비지아에에서 보고되었다(문헌[de Smidt et al, FEMS Yeast Res 8:967-78 (2008)]). ADH1(GI:1419926)은 혐기성 조건하에서 시토솔에서 아세트알데하이드의 알콜로의 환원을 맡고 있는 핵심 효소이다. ADH1 결핍 효모 균주는, 능동적인 호흡 연쇄가 NADH를 재생시키고 ATP의 순이익을 도출하는 유일한 대체 경로이기 때문에, 혐기적으로 생육할 수 없는 것으로 보고되었다(문헌[Drewke et al, J Bacteriol 172:3909-17 (1990)]). 상기 효소는 에탄올 생산을 제한하기 위한 하향조절에 이상적인 후보이다. ADH2는 글루코스의 존재하에서 심하게 억제된다. 클루이베로마이세스 락티스에서, 2개의 NAD-의존성 시토솔 알콜 데하이드로게나제가 동정되고 특성화되었다. 이들 유전자는 또한 다른 지방족 알콜에 대해 활성을 보인다. 유전자 ADH1(GI:113358) 및 ADHII(GI:51704293)는 글루코스-생육 세포에서 우선적으로 발현된다(문헌[Bozzi et al, Biochim Biophys Acta 1339:133-142 (1997)]). 시토솔 알콜 데하이드로게나제는 칸디다 알비칸스에서 ADH1(GI:608690)에 의해, 스키조사카로마이세스 폼베에서 ADH1(GI:3810864)에 의해, 야로위아 리포리티카에서 ADH1(GI:5802617)에 의해, 피키아 스티피티스 또는 셰페르소마이세스 스티피티스에서 ADH1(GI:2114038) 및 ADHII(GI:2143328)에 의해 암호화된다(문헌[Passoth et al, Yeast 14:1311-23 (1998)]). 후보 알콜 데하이드로게나제를 하기 표에 나타낸다.
Figure pct00059
하나 이상의 글리세롤-3-포스파타제 또는 글리세롤-3-포스페이트(G3P) 데하이드로게나제 효소의 약화 또는 파괴는 글리세롤의 형성을 제거하거나 감소시킬 수 있으며, 이에 의한 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산의 생산을 위한 탄소 및 환원 당량을 보존할 수 있다.
G3P 포스파타제는 G3P의 글리세롤로의 가수분해를 촉매화한다. 상기 활성을 갖는 효소들은 사카로마이세스 세레비지아에(GPP1 및 GPP2), 칸디다 알비칸스 및 듀날레일라 파르바의 글리세롤-1-포스파타제(EC 3.1.3.21) 효소를 포함한다(문헌[Popp et al, Biotechnol Bioeng 100:497-505 (2008)]; 문헌[Fan et al, FEMS Microbiol Lett 245:107-16 (2005)]). 상기 듀날레일라 파르바 유전자는 지금까지 동정되지 않았다. 이들 및 추가적인 G3P 포스파타제 효소들을 하기 표에 나타낸다.
Figure pct00060
사카로마이세스 세레비지아에는 시토솔에서 GPD1 및 GPD2 및 미토콘드리온에서 GUT2에 의해 암호화되는 3개의 G3P 데하이드로게나제 효소를 갖는다. GPD2는 글리세롤 형성의 대부분을 맡고 있는 효소를 암호화하는 것으로 공지되어 있으며 혐기성 조건하에서 산화환원 균형을 유지하는 책임이 있다. GPD1은 주로 삼투압 스트레스에 대한 사카로마이세스 세레비지아에의 적응을 맡고 있다(문헌[Bakker et al., FEMS Microbiol Rev 24:15-37 (2001)]). GPD1, GPD2 및/또는 GUT2의 약화는 글리세롤 형성을 감소시킬 것이다. GPD1 및 GUT2는 야로위아 리포리티카에서 G3P 데하이드로게나제를 암호화한다(문헌[Beopoulos et al, AEM 74:7779-89 (2008)]). GPD1 및 GPD2는 스키조사카로마이세스 폼베에서 G3P 데하이드로게나제를 암호화한다. 유사하게, G3P 데하이드로게나제는 칸디다 트로피칼리스에서 CTRG_02011에 의해 및 칸디다 알비칸스에서 GI:20522022에 의해 나타내는 유전자에 의해 암호화된다.
Figure pct00061
아세테이트, 포메이트 및 락테이트와 같은 산 부산물을 형성하는 효소들을 또한 약화시키거나 파괴할 수 있다. 상기와 같은 효소는 아세테이트 키나제, 포스포트랜스아세틸라제 및 피루베이트 옥시다제를 포함한다. 피루베이트 포메이트 라이아제 및 포메이트 데하이드로게나제의 파괴 또는 약화는 포메이트 및 이산화 탄소의 형성을 제한할 수 있었다. 이들 효소를 실시예 II에 추가로 상세히 개시한다.
피루베이트를 락테이트로 전환시키는 알콜 데하이드로게나제가 또한 파괴 또는 약화 후보이다. 락테이트 데하이드로게나제 효소는 에스케리키아 콜라이의 ldhA 및 랄스토니아 유트로파로부터의 ldh를 포함한다(문헌[(Steinbuchel and Schlegel, Eur . J. Biochem. 130:329-334 (1983)]). 상술한 다른 알콜 데하이드로게나제들도 또한 LDH 활성을 나타낼 수 있다.
Figure pct00062
미토콘드리아 피루베이트 데하이드로게나제 복합체의 활성을 감소시키는 것은 미토콘드리아 TCA 주기로의 흐름을 제한할 것이다. 혐기성 조건하에서 및 글루코스 농도가 배지 중에 높은 조건에서, 상기 미토콘드리아 효소의 능력은 매우 제한되며 이를 통한 현저한 흐름은 없다. 그러나, 일부 실시태양에서, 상기 효소를 파괴 또는 약화시켜 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 생산을 증가시킬 수 있다. 예시적인 피루베이트 데하이드로게나제 유전자는 PDB1, PDA1, LAT1 및 LPD1을 포함한다. 수탁번호 및 상동기관들을 실시예 II에 나열한다.
TCA 주기로의 흐름을 감소시키기 위한 또 다른 전략은 미토콘드리아 피루베이트 담체를 감소시키거나 결실시킴으로써 미토콘드리아내로의 피루베이트의 운반을 제한하는 것이다. 사카로마이세스 세레비지아에에서 미토콘드리아내로의 피루베이트의 운반은 MPC1 및 MPC2에 의해 암호화된 이종복합체에 의해 촉매화된다(문헌[Herzig et al, Science 337:93-6 (2012)]; 문헌[Bricker et al, Science 337:96-100 (2012)]). 사카로마이세스 세레비지아에는 5개의 다른 추정적인 모노카복실레이트 운반자(MCH1-5)를 암호화하며, 이중 여러 개는 미토콘드리아 막에 국소화될 수 있다(문헌[Makuc et al, Yeast 18:1131-43 (2001)]). NDT1은 또 다른 추정적인 피루베이트 운반자이지만, 상기 단백질의 역할은 문헌에서 논쟁 중에 있다(문헌[Todisco et al, J Biol Chem 20:1524-31 (2006)]). 예시적인 피루베이트 및 모노카복실레이트 운반자를 하기 표에 나타낸다:
Figure pct00063
말로닐-CoA 및 지방 산을 합성하는 효소들의 파괴 또는 약화는 아세틸-CoA로부터 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 생합성에 이용될 수 있는 탄소의 공급을 증가시킬 수 있다. 예시적인 파괴 또는 약화를 위한 효소는 지방 산 신타제, 아세틸-CoA 카복실라제, 비오틴:아포효소 리가제, 아실 담체 단백질, 티오에스테라제, 아실트랜스퍼라제, ACP 말로닐트랜스퍼라제, 지방 산 엘론가제, 아실-CoA 신시타제, 아실-CoA 트랜스퍼라제 및 아실-CoA 하이드롤라제를 포함한다.
지방 산 생합성을 감소시키는 또 다른 전략은 지방 산 형성 유전자를 억제하는 조절 단백질의 발현 또는 과발현이다. 아세틸-CoA 카복실라제(EC 6.4.1.2)는 다수의 유기체들에서 지방 산 생합성의 첫 번째 단계를 촉매화한다: 아세틸-CoA에서 말로닐-CoA의 ATP-의존성 카복실화. 상기 효소는 보조인자로서 비오틴을 사용한다. 예시적인 ACC 효소는 에스케리키아 콜라이의 accABCD(문헌[Davis et al., J Biol Chem 275:28593-8(2000)]), 사카로마이세스 세레비지아에의 ACC1 및 상동기관(문헌[Sumper et al., Methods Enzym 71:34-7(1981)])에 의해 암호화된다. 사카로마이세스 세레비지아에의 미토콘드리아 아세틸-CoA 카복실라제는 HFA1에 의해 암호화된다. 아세틸-CoA 카복실라제 홀로효소 형성은 사카로마이세스 세레비지아에의 BPL1과 같은 비오틴:아포단백질 리가제에 의한 비오틴의 부착을 요한다.
Figure pct00064
지방 산의 합성에 참여하는 단백질들을 하기에 나타낸다. 효모의 지방 산 신타제 효소 복합체는 2개의 다기능 서브유닛, FAS1 및 FAS2(이들은 함께 아세틸-CoA 및 말로닐-CoA의 지방 산으로의 순 전환을 촉매화한다)로 구성된다(문헌[Lomakin et al., Cell 129:319-32(2007)]). 미토콘드리아 지방 산 생합성과 관련된 추가적인 단백질은 OAR1, Mct1, ETR1, ACP1 및 PPT2를 포함한다. ACP1은 미토콘드리아 아실 담체 단백질이고 PPT2는 포스포판테테인 트랜스퍼라제(이는 미토콘드리아 ACP를 판테테인화하고 미토콘드리아에서 지방 산 생합성에 필요하다)를 암호화한다(문헌[Stuible et al, J Biol Chem:273:22334-9(1998)]). 지방 산 신타제의 활성을 감소시키기 위한 비-유전적 전략은 세룰레닌과 같은 억제제를 첨가하는 것이다. 지질 생합성의 포괄적인 조절인자를 또한 장쇄 알콜 또는 관련된 산물의 생산 중에 내인성 지방 산 생합성 경로를 감소시키도록 변경시킬 수 있다. 예시적인 포괄적 조절인자는 야로위아 리포리티카 및 사카로마이세스 세레비지아에의 SNF1이다.
Figure pct00065
아실-CoA 기질을 보다 긴 쇄 길이 지방 산으로 전환시키는 엘론가제 효소의 파괴 또는 약화를 또한 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 생산의 증가에 사용할 수 있다. 엘론가제 효소는 미토콘드리아, 소포체, 프로테오리포솜 및 페록시솜과 같은 구획에서 발견된다. 예를 들어, 사카로마이세스 세레비지아에와 같은 일부 효모는 외인성 또는 내인성 아실-CoA 기질을 수용하는 미토콘드리아 엘론가제를 통해 C16 이상의 쇄 길이의 장쇄 지방 산을 합성할 수 있다(문헌Bessoule et al, FEBS Lett 214: 158-162 (1987)]). 상기 시스템은 활성에 ATP를 필요로 한다. 소포체가 또한 다양한 길이의 아실-CoA 기질로부터 매우 긴 쇄의 지방 산(C18+)을 합성하기 위한 엘론가제 시스템을 갖는다(문헌[Kohlwein et al, Mol Cell Biol 21:109-25 (2001)]). 상기 시스템에 관련된 유전자들은 TSC13, ELO2 및 ELO3을 포함한다. ELO1은 C12 아실-CoA의 C16 -18 지방 산으로의 신장을 촉매화한다.
Figure pct00066
아실-CoA 경로 중간체를 산 부산물로 전환시키는 고유의 효소들이 또한 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 수율을 감소시킬 수 있다. 예를 들어, CoA 하이드롤라제, 트랜스퍼라제 및 신시타제는 아실-CoA 중간체에 작용하여 짧은-, 중간- 또는 긴 쇄의 산들을 형성시킬 수 있다. 내인성 CoA 하이드롤라제, CoA 트랜스퍼라제 및/또는 가역성 CoA 신시타제의 파괴 또는 약화를 사용하여 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 수율을 증가시킬 수 있다. 예시적인 효소를 하기 표에 나타낸다.
Figure pct00067
생성물, MI-FAE 주기 중간체, MD-FAE 주기 중간체 또는 종결 경로 중간체의 분해에 유리한 효소들을 또한 파괴 또는 약화시킬 수 있다. 예로는 알데하이드 데하이드로게나제, 알데하이드 데카보닐라제, 산화성 알콜 데하이드로게나제, 및 비가역성 지방 아실-CoA 분해 효소를 포함한다.
본 발명의 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산의 생산을 위해서, 불특정 알데하이드 데하이드로게나제의 결실 또는 약화가 수율을 개선시킬 수 있다. 지방 산의 생산을 위해서, 상기와 같은 효소의 발현은 생성물 형성을 개선시킬 수 있다. 상기와 같은 효소들은 예를 들어 아세틸-CoA를 아세트알데하이드로, 지방 알데하이드를 지방 산으로, 또는 지방 알콜을 지방 산으로 전환시킬 수 있다. 아실화 알데하이드 데하이드로게나제 효소들을 실시예 I에 개시한다. 산-형성 알데하이드 데하이드로게나제를 실시예 III 및 IX에 개시한다.
역 방향에 유리한 경로 효소들을 또한, 이들 효소가 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 생산에 해로운 경우 감소시키거나 약화시킬 수 있다. 일례로 산화 방향을 촉진하는 장쇄 알콜 데하이드로게나제(EC 1.1.1.192)가 있다. 예시적인 장쇄 알콜 데하이드로게나제는 제오바실러스 써모데니트리피칸스의 ADH1 및 ADH2이며, 이들은 C30의 쇄 길이 이하의 알콜을 산화시킨다(문헌[Liu et al., Physiol Biochem 155:2078-85(2009)]). 이들 및 다른 예시적인 지방 알콜 데하이드로게나제 효소들을 실시예 I 및 II에 나열한다. 알콜-형성 아실-CoA 리덕타제를 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 생합성에 사용하는 경우, 내인성 지방 알콜 데하이드로게나제의 결실은 역류(backflux)를 실질적으로 감소시킬 것이다.
베타-산화 효소들은 가역적이며 아실-CoA 합성의 방향으로 작동할 수 있다. 그러나, 이들 효소가 비가역적이고 분해 방향으로 강하게 촉진되는 경우, 이들은 파괴 또는 약화의 후보들이다. 상기 범주 내에 있는 효소는 사카로마이세스 세레비지아에의 FOX2로, 상기 효소는 3-하이드록시아실-CoA 데하이드로게나제와 함께 다기능 효소이며 에노일-CoA 하이드라타제 활성을 갖는다(문헌[Hiltunen et al, J Biol Chem 267:6646-6653(1992)]). 추가적인 유전자는 에스케리키아 콜라이의 fadE와 같이, NAD(P)H(EG. EC 1.3.8.-) 외의 보조인자를 사용하는 분해성 티올라제, 예를 들어 POT1 및 아실-CoA 데하이드로게나제를 포함한다.
Figure pct00068
사카로마이세스 세레비지아에의 POX1과 같은 지방 아실-CoA 옥시다제 효소는 지방 아실-CoA 기질의 산소-의존성 산화를 촉매화한다. 상기 활성을 갖는 효소는 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 생산 조건하에서 발현될 때 파괴되거나 약화될 수 있다. POX1(EC 1.3.3.6) 유전자 및 상동기관을 하기 표에 나타낸다. POX1은 OAF1(또한 페록시솜 베타-산화, 조직화 및 생물발생에 관련된 유전자를 활성화한다)에 의해 조절되기 쉽다(문헌[Luo et al, J Biol Chem 271:12068-75 (1996)]). OAF1과 유사한 기능을 갖는 조절인자, 및 페록시솜 지방 산 운반자 PXA1 및 PXA2가 또한 결실 후보이다.
Figure pct00069
또 다른 파괴 또는 약화 후보는 아실-CoA 결합 단백질이다. 예를 들어 사카로마이세스 세레비지아에의 아실 결합 단백질은 아실-CoA 에스터에 결합하고 이를 아실-CoA 사용 과정으로 왕복 수송한다(문헌[Schjerling et al, J Biol Chem 271: 22514-21 (1996)]). 상기 단백질의 결실은 증식률에 영향을 미치지 않으며 보다 긴 쇄 아실-CoA 분자의 증가된 축적을 도출하지 않았다. 아실-CoA 에스터는 지질 생합성 및 항상성, 신호 전달, 생육 조절 및 세포 분화를 포함한 다양한 세포 과정에 관련된다(문헌[Rose et al, PNAS USA 89: 11287-11291 (1992)]).
Figure pct00070
지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산의 높은 수율을 성취하기 위해서, 숙주 유기체가 MI-FAE 주기, MD-FAE 및/또는 종결 경로에 의해 요구되는 보조인자를 충분량으로 공급할 수 있는 것이 바람직하다. 여러 유기체, 특히 진핵생물 유기체, 예를 들어 다수의 사카로마이세스, 클루이베로마이세스, 칸디다, 아스퍼질러스 및 야로위아 종에서, NADH는 해당작용에 의해 다량으로 생산되기 때문에 시토솔에서 NADPH보다 더 풍부하다. NADH는 시토솔에서 피루베이트를 이종 또는 고유 NAD-의존성 효소, 예를 들어 NAD-의존성 피루베이트 데하이드로게나제, NAD-의존성 포메이트 데하이드로게나제, NADH:페레독신 옥시도리덕타제, 또는 NAD-의존성 아실화 아세트알데하이드 데하이드로게나제에 의해 아세틸-CoA로 전환시킴으로써 훨씬 더 풍부하게 만들어질 수 있다. 대부분의 유기체의 시토솔에서 NADH가 풍부한 경우, 상기 MI-FAE 주기, MD-FAE 주기 및/또는 종결 경로의 모든 환원 단계들이 환원제로서 NADPH와 같은 다른 환원제보다 우선적으로 NADH를 수용하는 것이 이로울 수 있다. 따라서 높은 수율의 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산은 예를 들어 1) NADPH와 같은 다른 환원 당량보다 NADH를 더 강하게 선호하는 내인성 또는 외인성 MI-FAE 주기, MD-FAE 주기 및/또는 종결 경로를 확인하고 실행함으로써; 2) NADPH-의존성 환원 활성에 기여하는 하나 이상의 내인성 MI-FAE 주기, MD-FAE 주기 및/또는 종결 경로를 약화시킴으로써; 3) 고유 버전보다는 NADH를 더 강하게 선호하도록 내인성 또는 외인성 MI-FAE 주기, MD-FAE 주기 및/또는 종결 경로의 보조인자 특이성을 변경시킴으로써; 또는 4) 고유 버전보다는 NADPH를 더 약하게 선호하도록 내인성 또는 외인성 MI-FAE 주기, MD-FAE 주기 및/또는 종결 경로의 보조인자 특이성을 변경시킴으로써 성취될 수 있다.
NADH-선호성 MI-FAE 주기, MD-FAE 주기 및/또는 종결 경로의 가공을 위한 경로들을 실시예 V에 보다 상세히 개시한다. 효소의 보조인자 특이성을 변화시키는 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있으며, 일례를 실시예 VI에 개시한다.
상기 MI-FAE 주기, MD-FAE 주기 및/또는 종결 경로 효소들 중 하나 이상이 보조인자로서 NADPH를 사용하는 경우, 숙주 유기체에서 NADPH의 생산을 증가시키는 것이 이로울 수 있다. 특히, 상기 MI-FAE 주기, MD-FAE 주기 및/또는 종결 경로가 숙주 유기체의 시토솔 중에 존재하는 경우, 상기 시토솔에서 NADPH 생산을 증가시키는 방법이 이로울 수 있다. NADPH의 시토솔 생산을 증가시키기 위한 여러 접근법들, 예를 들어 야생형에 비해 펜토스 포스페이트 경로의 산화 가지를 통해 증가된 양의 흐름을 채널링하거나, 야생형에 비해 엔트너 듀도로프 경로를 통해 증가된 양의 흐름을 채널링하거나, 용해성 또는 막-결합된 트랜스하이드로게나제를 도입시켜 NDAH를 NADPH로 전환시키거나, 하기 효소들의 NADP-의존성 버전을 사용함을 실행할 수 있다: 인산화 또는 비-인산화 글리세르알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나제, 피루베이트 데하이드로게나제, 포메이트 데하이드로게나제 또는 아실화 아세틸알데하이드 데하이드로게나제. 이들 활성을 글리세르알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나제, 피루베이트 데하이드로게나제, 포메이트 데하이드로게나제, 또는 아실화 아세틸알데하이드 데하이드로게나제를 포함한 고유 NAD-의존성 효소의 파괴 또는 약화에 의해 증대시킬 수 있다. 증가된 NADPH 이용도를 조작하기 위한 전략을 실시예 VII에 개시한다.
시토솔에서 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산의 합성은 충분한 탄소 및 환원 당량의 이용도에 따라 변할 수 있다. 따라서, 임의의 특정한 실행 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, NAD(P)H 대 NAD(P)의 산화환원 비의 증가는 상기 MI-FAE 주기, MD-FAE 주기 및/또는 종결 경로의 순방향으로의 구동을 도울 수 있다. NAD(P)H 대 NAD(P)의 산화환원 비의 증가 방법은 호흡을 제한시키고, 에탄올 및 글리세롤과 같은 환원된 부산물을 생성시키는 경쟁 경로를 약화 또는 파괴하고, NADH 데하이드로게나제에 의한 NADH의 사용을 약화 또는 제거하고, 구획들 간의 산화환원 셔틀을 약화 또는 제거함을 포함한다.
지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산의 형성을 가능하게 하기 위해서, 증가된 수의 NAD(P)H와 같은 환원 당량을 제공하는 한 가지 예시적인 방법은 호흡 중 상기와 같은 환원 당량의 사용을 제한하는 것이다. 호흡은 산소 이용도의 감소, NADH 데하이드로게나제 및/또는 시토크롬 옥시다제 활성의 약화, G3P 데하이드로게나제의 약화, 및/또는 크랩트리 양성 유기체에 대한 과도한 글루코스의 제공에 의해 제한될 수 있다.
발효기에서 비-천연 진핵생물 유기체를 배양함에 의한 산소 이용도의 제한이, 호흡을 제한하고 이에 의해 NAD(P)H 대 NAD(P)의 비를 증가시키기 위한 일례이다. 상기 NAD(P)H/NAD(P)의 비는 배양 조건이 보다 혐기성으로 됨에 따라 증가하며, 이때 완전한 혐기성 조건은 가장 높은 환원된 보조인자 대 산화된 보조인자의 비를 제공한다. 예를 들어, 에스케리키아 콜라이에서 호기성 조건에서 NADH/NAD의 비 = 0.02이고 혐기성 조건에서 0.75인 것으로 보고되었다(문헌[de Graes et al, J Bacteriol 181:2351-57(1999)]).
호흡을 또한 호기성 조건하에서 세포에서의 NADH 데하이드로게나제 및/또는 시토크롬 옥시다제의 발현 또는 활성을 감소시킴으로써 제한할 수 있다. 이 경우에, 호흡은 전자 운반쇄의 능력에 의해 제한될 수 있다. 상기와 같은 접근법을 사용하여 완전한 호기성 조건하에서 에스케리키아 콜라이의 혐기성 대사가 가능하였다(문헌[Portnoy et al, AEM 74:7561-9 (2008)]). 사카로마이세스 세레비지아에는 NDE1 및 NDE2에 의해 암호화된, 외부 NADH 데하이드로게나제를 사용하여 시토솔 NADH를 직접 산화시킬 수 있다. 야로위아 리포리티카 중의 하나의 상기와 같은 NADH 데하이드로게나제는 NDH2에 의해 암호화된다(문헌[Kerscher et al, J Cell Sci 112:2347-54 (1999)]). 상기 및 다른 NADH 데하이드로게나제 효소를 하기 표에 나열한다.
Figure pct00071
사카로마이세스 세레비지아에의 시토크롬 옥시다제는 COX 유전자 산물을 포함한다. COX1-3은 미토콘드리아 게놈에 의해 암호화되는 3개의 핵심 서브유닛인 반면, COX4-13은 핵 유전자에 의해 암호화된다. 상기 시트크롬 유전자들 중 어느 하나의 약화 또는 파괴는 호흡 증식을 감소시키거나 차단한다(문헌[Hermann and Funes, Gene 354:43-52 (2005)]). 다른 유기체 중의 시토크롬 옥시다제 유전자들은 서열 상동성에 의해 추정될 수 있다.
Figure pct00072
시토솔 NADH를 또한, 시토솔 NADH-연결된 G3P 데하이드로게나제 및 막-결합된 G3P:유비퀴논 옥시도리덕타제로 이루어지는 G3P 데하이드로게나제 셔틀을 통한 호흡 연쇄에 의해 산화시킬 수 있다. G3P 데하이드로게나제 효소의 결실 또는 약화는 또한 호흡을 위한 NADH의 산화를 방지할 것이다. 이들 효소를 암호화하는 효소 후보를 본 발명에 개시한다.
또한, 크랩트리 양성 유기체에서, 발효 대사는 과잉의 글루코스의 존재하에서 성취될 수 있다. 예를 들어, 사카로마이세스 세레비지아에는 호기성 조건하에서조차 에탄올을 만든다. 에탄올 및 글리세롤의 형성은, 크랩트리 양성 유기체에 과잉의 글루코스를 공급함으로써 상기 크랩트리 양성 유기체에서의 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산의 생산에 의해 감소/제거되고 대체될 수 있다. 또 다른 태양에서, 본 발명은 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산을 생산하는 조건하에서 상기 생산에 충분한 기간 동안 비-천연 진핵생물 유기체를 배양함을 포함하는, 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산의 생산 방법을 제공하며, 이때 상기 진핵생물 유기체는 MI-FAE 주기, MD-FAE 주기 및/또는 종결 경로 효소를 암호화하는 하나 이상의 외인성 핵산을 포함하는 크랩트리 양성 유기체이고, 상기 진핵생물 유기체는 과잉의 글루코스를 포함하는 배양 배지 중에 있다.
환원된 발효 부산물의 형성을 방지하는 것은 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 생산에 대한 탄소 및 환원 당량의 이용도를 증가시킬 것이다. 혐기성 및 미세호기성 조건하에서 2개의 핵심 환원 부산물은 에탄올 및 글리세롤이다. 에탄올은 전형적으로 피루베이트 데카복실라제 및 에탄올 데하이드로게나제에 의해 촉매화되는 2개의 효소 단계에서 피루베이트로부터 형성된다. 글리세롤은 글리세롤-3-포스페이트 데하이드로게나제 및 글리세롤-3-포스페이트 포스파타제 효소에 의해 해당 중간체인 다이하이드록시아세톤 포스페이트로부터 형성된다. 이들 효소 활성 중 하나 이상의 약화는 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산의 수율을 증가시킬 것이다. 에탄올 및 글리세롤 형성의 감소 또는 제거를 위한 균주 공학 전략을 본 발명에 개시한다.
사카로마이세스 세레비지아에와 같은 효모는 혐기성 조건하에서 글리세롤을 생산하여 NAD(P)의 재생을 허용할 수 있다. 글리세롤 생산을 감소 또는 제거하는 또 다른 방식은 산소-제한된 배양에 의해서이다(상기 문헌[Bakker et al.]). 글리세롤 형성은 오직 세포의 특정한 산소 섭취율이 생합성에서 형성된 NADH를 재산화시키는데 필요한 섭취율 이하로 감소하는 경우로만 지정된다.
상기 나열된 산화환원 싱크 외에, 말레이트 데하이드로게나제가 환원 방향으로 작용할 때 환원 당량을 잠재적으로 떼어놓을 수 있다. 사카로마이세스 세레비지아에에서 작용성인 것으로 여겨지는 다수의 산화환원 셔틀은 상기 효소를 이용하여 환원 당량을 시토솔과 미토콘드리아 사이로 수송한다. 이러한 산화환원의 수송은 말레이트 데하이드로게나제 및/또는 말산 효소 활성을 약화시킴으로써 방지될 수 있다. mdh의 약화에 의해 차단될 수 있는 산화환원 셔틀은 (i) 말레이트-아스파테이트 셔틀, (ii) 말레이트-옥살로아세테이트 셔틀, 및 (iii) 말레이트-피루베이트 셔틀을 포함한다. 말레이트 데하이드로게나제 및 말산 효소를 암호화하는 유전자들을 하기 표에 나열한다.
Figure pct00073
종합적으로, 상기 언급한 산화환원을 위한 싱크들의 파괴 또는 약화는 개별적으로 또는 다른 산화환원 싱크들과 함께 호흡 또는 부산물 형성을 위한 환원력의 사용을 제거하거나 낮출 수 있다. 상기 외부 NADH 데하이드로게나제(NDE1 및 NDE2) 및 미토콘드리아 G3P 데하이드로게나제(GUT2)의 결실은 사카로마이세스 세레비지아에서 시토솔 NAD+ 재생을 거의 완전히 제거한다(문헌[Overkamp et al, J Bacteriol 182:2823-30(2000)]).
본 발명의 미생물은 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산을 생산하고 상기 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산을 배양 배지내로 임의로 분비한다. 이종 지방 알콜 형성 활성을 갖는 사카로마이세스 세레비지아에, 야로위아 리포리티카 및 에스케리키아 콜라이는 지방 알콜을 세포내에 고이게 하였으나; 지방 알콜은 배양 배지에서 검출되지 않았다(베루지안(Behrouzian) 등, 미국특허공개 제 2010/0298612 호). 개선된 활성을 갖는 지방 아실-CoA 리덕타제 효소의 도입은 배양 배지내로 분비된 보다 높은 수준의 지방 알콜을 생성시켰다. 다르게는, 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 운반자 또는 운반 시스템의 도입은 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산의 세포외 축적을 개선시킬 수 있다. 예시적인 운반자들을 하기 표에 나열한다.
Figure pct00074
따라서, 일부 실시태양에서, 본 발명은 하나 이상의 유전자 파괴를 갖는 본 발명에 개시된 바와 같은 비-천연 미생물 유기체를 제공하며, 이때 상기 하나 이상의 유전자 파괴는 상기 미생물 유기체에 의한 에탄올, 글리세롤, 아세테이트, 포메이트, 락테이트, CO2, 지방 산 또는 말로닐-CoA의 고유 생산; 경로 중간체들의 시토솔 이외의 세포 구획으로의 수송; 또는 상기 미생물 유기체에 의한 MI-FAE 주기 중간체, MD-FAE 주기 중간체 또는 종결 경로 중간체의 고유 분해와 관련된 단백질 또는 효소를 암호화하는 내인성 유전자에서 발생하며, 상기 하나 이상의 유전자 파괴는 상기 미생물 유기체에서 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산의 증가된 생산을 부여한다. 따라서, 상기 단백질 또는 효소는 지방 산 신타제, 아세틸-CoA 카복실라제, 비오틴:아포효소 리가제, 아실 담체 단백질, 티오에스테라제, 아실트랜스퍼라제, ACP 말로닐트랜스퍼라제, 지방 산 엘론가제, 아실-CoA 신시타제, 아실-CoA 트랜스퍼라제, 아실-CoA 하이드롤라제, 피루베이트 데카복실라제, 락테이트 데하이드로게나제, 알콜 데하이드로게나제, 산-형성 알데하이드 데하이드로게나제, 아세테이트 키나제, 포스포트랜스아세틸라제, 피루베이트 옥시다제, 글리세롤-3-포스페이트 데하이드로게나제, 글리세롤-3-포스페이트 포스파타제, 미토콘드리아 피루베이트 담체, 페록시솜 지방 산 운반자, 페록시솜 아실-CoA 운반자, 페록시솜 카르니틴/아실카르니틴 트랜스퍼라제, 아실-CoA 옥시다제, 또는 아실-CoA 결합 단백질일 수 있다. 일부 태양에서, 상기 하나 이상의 유전자 파괴는 상기 하나 이상의 유전자의 결실을 포함한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 본 발명에 개시된 바와 같은 비-천연 미생물 유기체를 제공하며, 이때 상기 MI-FAE 주기, MD-FAE 주기 또는 종결 경로의 하나 이상의 효소는 NADH 보조인자와 우선적으로 반응하거나 NAD(P)H 보조인자와의 반응에 대해 감소된 선호를 갖는다. 예를 들어, 상기 MI-FAE 주기의 하나 이상의 효소는 3-케토아실-CoA 리덕타제 또는 에노일-CoA 리덕타제일 수 있다. 상기 종결 경로의 경우, 상기 하나 이상의 효소는 아실-CoA 리덕타제(알데하이드-형성), 알콜 데하이드로게나제, 아실-CoA 리덕타제(알콜-형성), 알데하이드 데카보닐라제, 아실-ACP 리덕타제, 알데하이드 데하이드로게나제(산-형성) 또는 카복실산 리덕타제일 수 있다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 상기 파괴에 따라 상기 미생물 유기체의 시토솔 중에 존재하는 NAD(P)H 대 NAD(P)의 증가된 비를 생성시키는 단백질 또는 효소를 암호화하는 유전자에서의 하나 이상의 유전자 파괴를 갖는 본 발명에 개시된 바와 같은 비-천연 미생물 유기체를 제공한다. 따라서, 상기 파괴에 따라 상기 미생물 유기체의 시토솔 중에 존재하는 NAD(P)H 대 NAD(P)의 증가된 비를 생성시키는 단백질 또는 효소를 암호화하는 유전자는 NADH 데하이드로게나제, 시토크롬 옥시다제, G3P 데하이드로게나제, G3P 포스파타제, 알콜 데하이드로게나제, 피루베이트 데카복실라제, 알데하이드 데하이드로게나제(산-형성), 락테이트 데하이드로게나제, 글리세롤-3-포스페이트 데하이드로게나제, 글리세롤-3-포스페이트:퀴논 옥시도리덕타제, 말산 효소 및 말레이트 데하이드로게나제일 수 있다. 일부 태양에서, 상기 하나 이상의 유전자 파괴는 상기 하나 이상의 유전자의 결실을 포함한다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 비-천연 미생물 유기체는 크랩트리 양성이며 과잉의 글루코스를 포함하는 배양 배지 중에 있다. 상기와 같은 조건에서, 본 발명에 개시된 바와 같이 상기 미생물 유기체는 상기 미생물 유기체의 시토솔 중에 존재하는 NAD(P)H 대 NAD(P)의 비가 증가할 수 있다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 본 발명의 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산에 대한 세포외 운반자 또는 세포외 운반 시스템을 암호화하는 하나 이상의 외인성 핵산을 갖는 본 발명에 개시된 바와 같은 비-천연 미생물 유기체를 제공한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 본 발명에 개시된 바와 같은 비-천연 미생물 유기체를 제공하며, 이때 상기 미생물 유기체에 의한 에탄올, 글리세롤, 아세테이트, 포메이트, 락테이트, CO2, 지방 산 또는 말로닐-CoA의 고유 생산; 경로 중간체들의 시토솔 이외의 세포 구획으로의 수송; 또는 상기 미생물 유기체에 의한 MI-FAE 주기 중간체, MD-FAE 주기 중간체 또는 종결 경로 중간체의 고유 분해와 관련된 상기 하나 이상의 내인성 효소는 약화된 효소 활성 또는 발현 수준을 갖는다. 따라서, 상기 내인성 효소는 지방 산 신타제, 아세틸-CoA 카복실라제, 비오틴:아포효소 리가제, 아실 담체 단백질, 티오에스테라제, 아실트랜스퍼라제, ACP 말로닐트랜스퍼라제, 지방 산 엘론가제, 아실-CoA 신시타제, 아실-CoA 트랜스퍼라제, 아실-CoA 하이드롤라제, 피루베이트 데카복실라제, 락테이트 데하이드로게나제, 알콜 데하이드로게나제, 산-형성 알데하이드 데하이드로게나제, 아세테이트 키나제, 포스포트랜스아세틸라제, 피루베이트 옥시다제, 글리세롤-3-포스페이트 데하이드로게나제, 글리세롤-3-포스페이트 포스파타제, 미토콘드리아 피루베이트 담체, 페록시솜 지방 산 운반자, 페록시솜 아실-CoA 운반자, 페록시솜 카르니틴/아실카르니틴 트랜스퍼라제, 아실-CoA 옥시다제, 또는 아실-CoA 결합 단백질일 수 있다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 본 발명에 개시된 바와 같은 비-천연 미생물 유기체를 제공하며, 이때 NAD(P)H 또는 NADH의 산화와 관련된 하나 이상의 내인성 효소는 약화된 효소 활성 또는 발현 수준을 갖는다. 따라서, 하나 이상의 내인성 효소는 NADH 데하이드로게나제, 시토크롬 옥시다제, G3P 데하이드로게나제, G3P 포스파타제, 알콜 데하이드로게나제, 피루베이트 데카복실라제, 알데하이드 데하이드로게나제(산-형성), 락테이트 데하이드로게나제, 글리세롤-3-포스페이트 데하이드로게나제, 글리세롤-3-포스페이트:퀴논 옥시도리덕타제, 말산 효소 및 말레이트 데하이드로게나제일 수 있다.
본 발명의 비-천연 미생물 유기체는 안정한 유전자 변경을 함유할 수 있으며, 이는 상기 변경의 상실 없이 5 세대를 초과하여 배양될 수 있는 미생물을 지칭한다. 일반적으로, 안정한 유전자 변경은 10 세대를 초과하여 지속되는 변형을 포함하며, 특히 안정한 변형은 약 25 세대를 초과하여 지속할 것이고, 보다 특히 안정한 유전자 변형은 무기한을 포함하여, 50 세대를 초과할 것이다.
유전자 파괴의 경우에, 특히 유용한 안정한 유전자 변경은 유전자 결실이다. 안정한 유전자 변경을 도입시키기 위한 유전자 결실의 사용은 상기 유전자 변경에 앞서 표현형으로의 전환의 가능성을 감소시키는데 특히 유용하다. 예를 들어 생화학물질의 안정한 증식-커플링된 생산은 예를 들어 일련의 대사 변형내에서 하나 이상의 반응을 촉매화하는 효소를 암호화하는 유전자의 결실에 의해 성취될 수 있다. 상기 생화학물질의 증식-커플링된 생산의 안정성은 다수의 결실을 통해 추가로 증대될 수 있고, 이는 각각의 파괴된 활성에 대해 다수의 보상적 전환이 발생할 가능성을 현저하게 감소시킬 수 있다.
또한 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산의 안정한 증식-커플링된 생산을 갖는 비-천연 미생물 유기체의 생산 방법을 제공한다. 상기 방법은 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산의 생산을 증가시키는, 예를 들어 지수 증식 중의 생산을 증가시키는 일련의 대사 변형을 인실리코(in silico) 확인하고; 유기체를 상기 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산의 생산을 증가시키는 일련의 대사 변형을 함유하도록 유전자 변형시키고, 상기 유전자 변형된 유기체를 배양함을 포함할 수 있다. 경우에 따라, 배양은 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산의 생산을 요하는 조건하에서 상기 유전자 변형된 유기체를 적응 진화시킴을 포함할 수 있다. 본 발명의 방법을 세균, 효모 및 진균뿐만 아니라 본 발명에 개시된 바와 같은 다양한 다른 세포 및 미생물에 적용할 수 있다.
따라서, 본 발명은 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산의 증가된 생산을 부여하는 하나 이상의 유전자 파괴를 포함하는 비-천연 미생물 유기체를 제공한다. 하나의 실시태양에서, 상기 하나 이상의 유전자 파괴는 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산의 증식-커플링된 생산을 부여하고, 예를 들어 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산의 안정한 증식-커플링된 생산을 부여할 수 있다. 또 다른 실시태양에서, 상기 하나 이상의 유전자 파괴는 상기 미생물 유기체의 증식에 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산의 필수적인 커플링을 부여할 수 있다. 상기와 같은 하나 이상의 유전자 파괴는 상기 각각의 하나 이상의 암호화된 효소의 활성을 감소시킨다.
상기 비-천연 미생물 유기체는 본 발명에 개시된 효소 또는 단백질을 암호화하는 유전자에 포함된 하나 이상의 유전자 파괴를 가질 수 있다. 본 발명에 개시된 바와 같이, 상기 하나 이상의 유전자 파괴는 결실일 수 있다. 본 발명의 상기와 같은 비-천연 미생물 유기체는 세균, 효모, 진균, 또는 본 발명에 개시된 바와 같은 발효 과정들에 적용 가능한 다양한 다른 미생물들 중 어느 하나를 포함한다.
따라서, 본 발명은 하나 이상의 유전자 파괴를 포함하는 비-천연 미생물 유기체를 제공하며, 이때 상기 하나 이상의 유전자 파괴는, 상기 하나 이상의 유전자 파괴가 상기 유기체 중의 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산의 증가된 생산을 부여하는 경우, 단백질 또는 효소를 암호화하는 유전자에서 발생한다. 상기 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산의 생산은 증식-커플링되거나 증식-커플링되지 않을 수 있다. 특정한 실시태양에서, 상기 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산의 생산은 본 발명에 개시된 바와 같이, 유기체의 증식에 필수적으로 커플링될 수 있다.
본 발명은 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산의 생산, 예를 들어 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산의 증식-커플링된 생산을 증가시키는 유전자 파괴와 같은 유전자 변경을 갖는 비-천연 미생물 유기체를 제공한다. 생성물 생산은 예를 들어 본 발명에 개시된 바와 같이, 세포의 대사 경로를 유전적으로 변경시킴으로써 상기 미생물의 지수 증식기에 필수적으로 관련될 수 있다. 상기 유전자 변경은 목적하는 생성물의 생산을 증가시키거나 심지어 상기 목적하는 생성물을 상기 증식기 동안 필수적인 생성물로 만들 수 있다. 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 생합성의 증가된 생산 및 상승된 수준을 생성시키는 대사 변경 또는 형질전환을 본 발명에 예시한다. 각각의 변경은 기능적으로 파괴되어야 하는 필수적인 대사 반응에 상응한다. 상기 경로들 중 하나 이상 내의 모든 반응들의 기능 파괴는 상기 증식기 중 가공된 균주에 의한 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산의 증가된 생산을 생성시킬 수 있다.
이들 비-천연 변경들은 각각 적합한 배양 조건하에서, 상기와 같은 대사 변경을 함유하지 않는 균주에 비해, 예를 들어 상기 미생물 유기체의 지수 증식기 동안 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 생산의 증가된 생산 및 증대된 수준을 생성시킨다. 적합한 조건은 예를 들어 특정한 탄소원 또는 반응물 이용도 및/또는 적응 진화와 같은 조건을 포함하여, 본 발명에 개시된 것들을 포함한다.
본 발명에 제공된 교시 및 지침에 따라, 당해 분야의 숙련가들은 효소의 약화와 같은 대사 변경을 도입시키기 위해서, 상기 반응에 관련된 하나 이상의 효소의 촉매 활성을 파괴하는 것이 필요할 수 있음을 이해할 것이다. 다르게는, 대사 변경은 효소 활성 또는 최대 활성에 필요한 조절 단백질 또는 보조인자의 발현을 파괴함을 포함할 수 있다. 더욱 또한, 효소 반응에 필요한 보조인자의 유전자 상실은 또한 상기 효소를 암호화하는 유전자의 파괴와 같은 효과를 가질 수 있다. 파괴는, 예를 들어 암호화 유전자의 결실 또는 상기 암호화 유전자 서열 중 하나 이상에서 유전자 변경의 통합을 포함한 다양한 방법들에 의해 발생할 수 있다. 파괴가 표적화된 암호화 유전자는 상기 촉매 활성에 관련된 효소를 암호화하는 유전자들 중 하나, 일부 또는 전부일 수 있다. 예를 들어, 단일 효소가 표적화된 촉매 활성에 관련되는 경우, 파괴는 상기 암호화된 유전자 산물의 촉매 활성을 감소하거나 제거하는 유전자 변경에 의해 발생할 수 있다. 유사하게, 상기 단일 효소가 헤테로머를 포함한 다량체성인 경우, 파괴는 상기 암호화된 유전자 산물의 하나 또는 모든 서브유닛의 기능을 감소하거나 파괴하는 유전자 변경에 의해 발생할 수 있다. 활성의 파괴는 활성 복합체를 형성하는데 필요한 하나 이상의 서브유닛의 결합 활성의 상실에 의해서, 상기 다량체성 복합체의 촉매 서브유닛의 파괴에 의해서, 또는 상기 둘 다에 의해서 수행될 수 있다. 다량체성 단백질 결합 및 활성의 다른 기능들이 또한 본 발명의 대사 반응을 파괴하기 위해서 표적화될 수 있다. 상기와 같은 다른 기능들은 당해 분야의 숙련가들에게 널리 공지되어 있다. 유사하게, 표적 효소 활성을, 상기 표적 효소를 변형시키고/시키거나 활성화시키는 단백질 또는 효소, 예를 들어 아포효소를 홀로효소로 전환시키는데 필요한 분자의 발현을 파괴함으로써 감소시키거나 제거할 수 있다. 더욱이, 단일 폴리펩타이드 또는 다량체성 복합체의 기능들 중 일부 또는 전부를, 본 발명의 반응 또는 대사 변형에 관련된 하나 이상의 효소들의 촉매 활성을 감소시키거나 제거하기 위해서 본 발명에 따라 파괴할 수 있다. 유사하게, 본 발명의 반응 또는 대사 변형에 관련된 효소들 중 일부 또는 전부를, 표적화된 반응이 감소되거나 제거되는 한 파괴할 수 있다.
본 발명에 제공된 교시 및 지침에 따라, 당해 분야의 숙련가들은 또한 효소 반응을, 공통 유전자에 의해 및/또는 유사한 또는 실질적으로 동일한 활성을 나타내는 상기 유전자의 하나 이상의 이종상동체에 의해 암호화되는 반응들을 감소시키거나 제거함으로써 파괴시킬 수 있음을 이해할 것이다. 상기 공통 유전자 및 모든 이종상동체 모두의 감소는 표적화된 반응의 임의의 촉매 활성의 완전한 제거를 도출할 수 있다. 그러나, 상기 공통 유전자 또는 하나 이상의 이종상동체의 파괴는 생성물 생합성에 대한 증식의 커플링을 촉진하기에 충분한 표적화된 반응의 촉매 활성의 감소를 도출할 수 있다. 다양한 대사 변형을 위한 촉매 활성을 암호화하는 공통 유전자뿐만 아니라 그의 이종상동체 모두를 본 발명에 예시한다. 당해 분야의 숙련가들은 표적화된 대사 반응의 효소를 암호화하는 유전자들 중 일부 또는 전부의 파괴가 본 발명의 방법에서 실행될 수 있으며 이를 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산의 증가된 생산 또는 증식-커플링된 생성물 생산을 성취하기 위해서 본 발명의 비-천연 미생물 유기체에 통합시킬 수 있음을 이해할 것이다.
본 발명에 제공된 교시 및 지침에 따라, 당해 분야의 숙련가들은 또한 효소 활성 및 발현을 널리 공지된 방법을 사용하여 약화시킬 수 있음을 이해할 것이다. 효소의 활성 또는 양의 감소는, 상기 감소가 상기 효소의 활성을 경로가 기능하는데 통상적으로 필요한 임계 수준 아래로 떨어뜨리는 경우, 유전자의 완전한 파괴를 모방할 수 있다. 유전자 파괴의 사용보다는 다양한 기법들에 의한 효소 활성의 감소가 유기체의 생육력에 중요할 수 있다. 유사하거나 동일한 유전자 파괴 효과를 생성시키는 효소 활성의 감소 방법은 비제한적으로 유전자 전사 또는 번역의 감소; mRNA, 단백질 또는 촉매 RNA의 탈안정화; 및 효소 활성 또는 동역학에 영향을 미치는 유전자의 돌연변이를 포함한다(문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Third Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York (2001)]; 및 문헌[Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, MD (1999)]을 참조하시오). 천연 또는 부과된 조절 억제가 또한 프로모터 치환(문헌[Wang et al., Mol . Biotechnol . 52(2):300-308 (2012)]을 참조하시오); 전사 인자의 상실 또는 변경(문헌[Dietrick et al., Annu . Rev. Biochem . 79:563-590 (2010)]; 및 문헌[Simicevic et al., Mol . Biosyst . 6(3):462-468 (2010)]); 억제성 RNA 또는 펩타이드, 예를 들어 siRNA, 안티센스 RNA, RNA 또는 펩타이드/소분자 결합 앱타머, 리보자임, 앱타자임 및 리보스위치의 도입(문헌[Wieland et al., Methods 56(3):351-357 (2012)]; 문헌[O'Sullivan, Anal. Bioanal . Chem . 372(1):44-48 (2002)]; 및 문헌[Lee et al., Curr . Opin . Biotechnol. 14(5):505-511 (2003)]); 및 효소 활성을 감소시키거나 파괴하는 약물 또는 다른 화학물질, 예를 들어 효소 억제제, 항생제 또는 표적-특이성 약물의 첨가를 포함하여 효소 약화를 수행할 수 있다.
당해 분야의 숙련가는 효소의 약화가 다양한 수준으로 수행될 수 있음을 또한 이해하고 인식할 것이다. 예를 들어, 유전자 수준에서, 부분적인 또는 완전한 삭제 표현형을 유발하는 돌연변이, 예를 들어 유전자 파괴, 또는 유전자 산물의 활성을 가리는 상위 유전자 효과를 유발하는 돌연변이(문헌[Miko, Nature Education 1(1) (2008)])를 사용하여 효소를 약화시킬 수 있다. 유전자 발현 수준에서, 약화 방법은 내인성 또는 외인성 유도인자, 예를 들어 아이소프로필티오-β-갈락토사이드(IPTG)에의 전사 커플링, 이어서 생산 단계 동안 낮은 양의 유도인자의 첨가 또는 비첨가(문헌[Donovan et al., J. Ind . Microbiol . 16(3):145-154 (1996)]; 및 문헌[Hansen et al., Curr . Microbiol . 36(6):341-347 (1998)]); 유전자의 양 또는 음의 조절인자 도입 또는 변형; 진핵생물 염색체 영역(이때 유전자가 통합된다)에서 히스톤 아세틸화/탈아세틸화 변형(문헌[Yang et al., Curr . Opin . Genet. Dev . 13(2):143-153 (2003)] 및 문헌[Kurdistani et al., Nat . Rev . Mol . Cell Biol . 4(4):276-284 (2003)]); 프로모터 또는 조절 유전자의 파괴를 위한 전위의 도입(문헌[Bleykasten-Brosshans et al., C. R. Biol . 33(8-9):679-686 (2011)]; 및 문헌[McCue et al., PLoS Genet . 8(2):e1002474 (2012)]); 인접 유전자의 유전자 발현을 조절하기 위한 전이 인자 또는 프로모터 영역의 배향 플리핑(flipping)(문헌[Wang et al., Genetics 120(4):875-885 (1988)]; 문헌[Hayes, Annu. Rev. Genet. 37:3-29 (2003)]); 이배체 유기체에서, 이형접합성을 상실시키는 하나의 대립유전자의 결실(문헌[Daigaku et al., Mutation Research / Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis 600(1-2)177-183 (2006)]); RNA 분해를 증가시키는 핵산의 도입(문헌[Houseley et al., Cell, 136(4):763-776 (2009)]); 또는 세균에서, 예를 들어 RNA 분해 및 리보솜 정지를 야기할 수 있는 수송-전령 RNA(tmRNA) 태그의 도입(문헌[Sunohara et al., RNA 10(3):378-386 (2004)]; 및 문헌[Sunohara et al., J. Biol . Chem . 279:15368-15375 (2004)])을 포함한다. 번역 수준에서, 약화는 번역을 제한하는 희귀 코돈의 도입(문헌[Angov, Biotechnol . J. 6(6):650-659 (2011)]); 번역을 차단하는 RNA 간섭 분자의 도입(문헌[Castel et al., Nat . Rev . Genet. 14(2):100-112 (2013)]; 및 문헌[Kawasaki et al., Curr . Opin . Mol . Ther . 7(2):125-131 (2005)]); 암호화 서열 밖 영역의 변형, 예를 들어 번역을 차단하거나 번역의 효율을 감소시키기 위해 번역되지 않은 영역(UTR)내로 2차 구조의 도입(문헌[Ringner et al., PLoS Comput. Biol . 1(7):e72 (2005)]); 빠른 전사물 분해를 위한 RNAase 부위의 첨가(문헌[Pasquinelli, Nat . Rev . Genet . 13(4):271-282 (2012)]; 및 문헌[Arraiano et al., FEMS Microbiol. Rev . 34(5):883-932 (2010)]); 안티센스 RNA 올리고머 또는 안티센스 전사물의 도입(문헌[Nashizawa et al., Front . Biosci . 17:938-958 (2012)]); RNA 또는 펩타이드 앱타머, 리보자임, 앱타자임, 리보스위치의 도입(문헌[Wieland et al., Methods 56(3):351-357 (2012)]; 문헌[O'Sullivan, Anal . Bioanal . Chem . 372(1):44-48 (2002)]; 및 문헌[Lee et al., Curr . Opin . Biotechnol. 14(5):505-511 (2003)]); 또는 소분자의 존재 또는 부재에 의해 조절될 수 있는 번역을 방지하거나 감소시킬 수 있는 RNA 구조를 포함하는 번역 조절 요소의 도입(문헌[Araujo et al., Comparative and Functional Genomics, Article ID 475731, 8 pages (2012)])을 포함할 수 있다. 효소 국소화 및/또는 수명의 수준에서, 효소 약화는 보다 빠른 단백질 턴오버를 위한 분해 태그의 첨가(문헌[Hochstrasser, Annual Rev . Genet . 30:405-439 (1996)]; 및 문헌[Yuan et al., PLoS One 8(4):e62529 (2013)]); 또는 진핵생물 세포에서 세포내 구획에 분비되거나 국한되는 효소를 생성시키는 국소화 태그의 첨가(이때 상기 효소는 그의 정상 기질과 반응할 수 없을 것이다)(문헌[Nakai et al. Genomics 14(4):897-911 (1992)]; 및 문헌[Russell et al., J. Bact . 189(21)7581-7585 (2007)])를 포함할 수 있다. 번역-후 조절의 수준에서, 효소 약화는 공지된 억제제의 세포내 농도 증가; 또는 번역-후 변형된 부위 변형을 포함할 수 있다(문헌[Mann et al., Nature Biotech. 21:255-261 (2003)]). 효소 활성의 수준에서, 효소 약화는 효소 활성을 감소시키기 위한 내인성 또는 외인성 억제제, 예를 들어 효소 억제제, 항생제 또는 표적-특이성 약물의 첨가; 보조인자를 필요로 하는 효소에 대해서 필수 보조인자, 예를 들어 비타민 B12의 이용도 제한; 효소 활성에 필요한 금속 이온의 킬레이트화; 또는 우세한 음성 돌연변이의 도입을 포함할 수 있다. 상술한 약화 기법의 적용성은 주어진 숙주 미생물 유기체가 원핵생물인지 혹은 진핵생물인지에 따라 변할 것이며; 주어진 숙주에 적합한 기법이 무엇인지의 결정은 당해 분야의 숙련가에 의해 쉽게 이루어질 수 있는 것으로 이해된다.
일부 실시태양에서, 미세호기성 설계는 목적하는 생성물의 증식-커플링된 형성을 근거로 사용할 수 있다. 이를 검사하기 위해서, 생산 원뿔을, 먼저 네트워크 중 실행 가능한 상이한 바이오매스 형성률에서 생성물 수율을 최대화하고 후속으로 최소화함으로써 각각의 전략에 대해 제작할 수 있다. 상기 돌연변이체 네트워크의 모든 가능한 표현형의 가장 오른쪽 경계가 단일 점인 경우, 이는 상기 네트워크에서 가능한 최대 바이오매스 형성률에서 상기 생성물의 독특한 최적 수율이 존재함을 암시한다. 다른 경우에, 상기 실행 가능한 표현형의 가장 오른쪽 경계는 수직선이며, 이는 최대 바이오매스 점에서 상기 네트워크가 상기 수직선의 가장 아래 점의 최저량을 포함하여, 계산된 범위에서 상기 생성물의 임의의 양을 만들 수 있음을 가리킨다. 상기와 같은 설계는 우선권이 낮다.
본 발명에 개시된 다양한 표에 나타낸 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산-생산 전략을 파괴하여 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산의 생산을 증가시킬 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산을 비-천연 유기체의 증식에 커플링시키는 대사 변형을 갖는 상기 유기체를 제공하며, 이때 상기 대사 변형은 본 발명에 개시된 다양한 표에 나타낸 단백질 및/또는 효소를 암호화하는 유전자 중에서 선택된 하나 이상의 유전자의 파괴를 포함한다.
상기 균주들은 각각, 상기 균주가 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산의 생산성을 충분하게 증가시키지 않고/않거나 상기 생성물의 형성을 바이오매스 형성과 충분하게 커플링시키지 않는 것으로 결정되는 경우 추가적인 결실이 보충될 수 있다. 다르게는, 생육 조건하에서 그다지 활성을 갖지 않는 것으로 공지된 일부 다른 효소들은 적응 진화 또는 무작위 돌연변이로 인해 활성으로 될 수 있다. 상기와 같은 활성을 또한 녹아웃시킬 수 있다. 그러나, 본 발명에 개시된 유전자 결실의 목록은 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산의 증식-커플링된 생산을 포함하여, 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산의 고-수율 생산을 나타내는 균주의 제작을 허용한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 하기 화학식 I의 화합물을 생산하는 조건하에서 상기 생산에 충분한 기간 동안 비-천연 미생물 유기체를 배양함을 포함하는, 상기 화학식 I의 화합물의 제조 방법을 제공하며:
화학식 I
Figure pct00075
[상기 식에서,
R1은 C1 -24 선형 알킬이고;
R2는 CH2OH, CHO 또는 COOH이고;
R3은 H, OH 또는 옥소(=O)이고;
Figure pct00076
은 단일 또는 이중 결합을 나타내되;
R3이 결합되는 탄소 원자의 원자가는 4이다],
이때 상기 비-천연 미생물 유기체는 하나 이상의 유전자 파괴를 갖고, 이때 상기 하나 이상의 유전자 파괴는 상기 미생물 유기체에 의한 에탄올, 글리세롤, 아세테이트, 포메이트, 락테이트, CO2, 지방 산, 또는 말로닐-CoA의 고유의 생산; 시토솔 이외의 세포 구획으로의 경로 중간체들의 수송; 또는 상기 미생물 유기체에 의한 MI-FAE 주기 중간체, MD-FAE 주기 중간체 또는 종결 경로 중간체의 고유의 분해와 관련된 단백질 또는 효소를 암호화하는 내인성 유전자에서 발생하며, 상기 하나 이상의 유전자 파괴는 상기 미생물 유기체에서 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산의 증가된 생산을 부여한다. 따라서, 상기 단백질 또는 효소는 지방 산 신타제, 아세틸-CoA 카복실라제, 비오틴:아포효소 리가제, 아실 담체 단백질, 티오에스테라제, 아실트랜스퍼라제, ACP 말로닐트랜스퍼라제, 지방 산 엘론가제, 아실-CoA 신시타제, 아실-CoA 트랜스퍼라제, 아실-CoA 하이드롤라제, 피루베이트 데카복실라제, 락테이트 데하이드로게나제, 단쇄 알데하이드 및 알콜 데하이드로게나제, 아세테이트 키나제, 포스포트랜스아세틸라제, 글리세르알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나제, 피루베이트 옥시다제, 글리세롤-3-포스페이트 데하이드로게나제, 글리세롤-3-포스페이트 포스파타제, 미토콘드리아 피루베이트 담체, 페록시솜 지방 산 운반자, 페록시솜 아실-CoA 운반자, 페록시솜 카르니틴/아실카르니틴 트랜스퍼라제, 아실-CoA 옥시다제, 또는 아실-CoA 결합 단백질일 수 있다. 일부 태양에서, 상기 하나 이상의 유전자 파괴는 상기 하나 이상의 유전자의 결실을 포함한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 본 발명에 개시된 바와 같은 비-천연 미생물 유기체를 사용하는 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산의 생산 방법을 제공하며, 이때 상기 MI-FAE 주기, MD-FAE 주기 또는 종결 경로의 하나 이상의 효소는 NADH 보조인자와 우선적으로 반응하거나 NAD(P)H 보조인자와의 반응에 대해 감소된 선호를 갖는다. 예를 들어, 상기 MI-FAE 주기의 하나 이상의 효소는 3-케토아실-CoA 리덕타제 또는 에노일-CoA 리덕타제일 수 있다. 상기 종결 경로의 경우, 상기 하나 이상의 효소는 아실-CoA 리덕타제(알데하이드-형성), 알콜 데하이드로게나제, 아실-CoA 리덕타제(알콜-형성), 알데하이드 데카보닐라제, 아실-ACP 리덕타제, 알데하이드 데하이드로게나제(산-형성) 또는 카복실산 리덕타제일 수 있다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 상기 파괴에 따라 상기 미생물 유기체의 시토솔 중에 존재하는 NAD(P)H 대 NAD(P)의 증가된 비를 생성시키는 단백질 또는 효소를 암호화하는 유전자에서의 하나 이상의 유전자 파괴를 갖는 본 발명에 개시된 바와 같은 비-천연 미생물 유기체를 사용하는 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산의 생산 방법을 제공한다. 따라서, 상기 파괴에 따라 상기 미생물 유기체의 시토솔 중에 존재하는 NAD(P)H 대 NAD(P)의 증가된 비를 생성시키는 단백질 또는 효소를 암호화하는 유전자는 NADH 데하이드로게나제, 시토크롬 옥시다제, G3P 데하이드로게나제, G3P 포스파타제, 알콜 데하이드로게나제, 피루베이트 데카복실라제, 알데하이드 데하이드로게나제(산-형성), 락테이트 데하이드로게나제, 글리세롤-3-포스페이트 데하이드로게나제, 글리세롤-3-포스페이트:퀴논 옥시도리덕타제, 말산 효소 및 말레이트 데하이드로게나제일 수 있다. 일부 태양에서, 상기 하나 이상의 유전자 파괴는 상기 하나 이상의 유전자의 결실을 포함한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은, 크랩트리 양성이며 과잉의 글루코스를 포함하는 배양 배지 중에 있는 본 발명의 비-천연 미생물 유기체를 사용하는 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산의 생산 방법을 제공한다. 상기와 같은 조건에서, 본 발명에 개시된 바와 같이 상기 미생물 유기체는 상기 미생물 유기체의 시토솔 중에 존재하는 NAD(P)H 대 NAD(P)의 비가 증가할 수 있다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 본 발명의 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산에 대한 세포외 운반자 또는 세포외 운반 시스템을 암호화하는 하나 이상의 외인성 핵산을 갖는 본 발명에 개시된 바와 같은 비-천연 미생물 유기체를 사용하는 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산의 생산 방법을 제공한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 본 발명에 개시된 바와 같은 비-천연 미생물 유기체를 사용하는 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산의 생산 방법을 제공하며, 이때 상기 미생물 유기체에 의한 에탄올, 글리세롤, 아세테이트, 포메이트, 락테이트, CO2, 지방 산 또는 말로닐-CoA의 고유 생산; 경로 중간체들의 시토솔 이외의 세포 구획으로의 수송; 또는 상기 미생물 유기체에 의한 MI-FAE 주기 중간체, MD-FAE 주기 중간체 또는 종결 경로 중간체의 고유 분해와 관련된 상기 하나 이상의 내인성 효소는 약화된 효소 활성 또는 발현 수준을 갖는다. 따라서, 상기 내인성 효소는 지방 산 신타제, 아세틸-CoA 카복실라제, 비오틴:아포효소 리가제, 아실 담체 단백질, 티오에스테라제, 아실트랜스퍼라제, ACP 말로닐트랜스퍼라제, 지방 산 엘론가제, 아실-CoA 신시타제, 아실-CoA 트랜스퍼라제, 아실-CoA 하이드롤라제, 피루베이트 데카복실라제, 락테이트 데하이드로게나제, 알콜 데하이드로게나제, 산-형성 알데하이드 데하이드로게나제, 아세테이트 키나제, 포스포트랜스아세틸라제, 피루베이트 옥시다제, 글리세롤-3-포스페이트 데하이드로게나제, 글리세롤-3-포스페이트 포스파타제, 미토콘드리아 피루베이트 담체, 페록시솜 지방 산 운반자, 페록시솜 아실-CoA 운반자, 페록시솜 카르니틴/아실카르니틴 트랜스퍼라제, 아실-CoA 옥시다제, 및 아실-CoA 결합 단백질일 수 있다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 본 발명에 개시된 바와 같은 비-천연 미생물 유기체를 사용하는 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산의 생산 방법을 제공하며, 이때 NAD(P)H 또는 NADH의 산화와 관련된 하나 이상의 내인성 효소는 약화된 효소 활성 또는 발현 수준을 갖는다. 따라서, 하나 이상의 내인성 효소는 NADH 데하이드로게나제, 시토크롬 옥시다제, G3P 데하이드로게나제, G3P 포스파타제, 알콜 데하이드로게나제, 피루베이트 데카복실라제, 알데하이드 데하이드로게나제(산-형성), 락테이트 데하이드로게나제, 글리세롤-3-포스페이트 데하이드로게나제, 글리세롤-3-포스페이트:퀴논 옥시도리덕타제, 말산 효소 및 말레이트 데하이드로게나제일 수 있다.
지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산을 상기 미생물 유기체의 배양 중에, 예를 들어 본 발명에 개시된 바와 같이 연속적 및/또는 거의-연속적인 배양 기간 중에 어느 시점이라도 수확하거나 단리할 수 있다. 일반적으로, 상기 미생물을 연속적 및/또는 거의 연속적인 증식기에서 오래 유지시킬수록, 비례적으로 더 많은 양의 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산이 생산될 수 있다.
따라서, 본 발명은 본 발명에 개시된 바와 같이, 하나 이상의 유전자 파괴를 갖는 비-천연 미생물 유기체를 배양함을 포함하는 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산의 생산 방법을 추가로 제공한다. 상기 파괴는 상기 유전자 파괴가 효소의 활성을 감소시키거나 제거할 때 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 생산을 상기 미생물의 증식과 임의로 커플링시킴을 포함하는, 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산의 생산을 증가시키는 효소를 암호화하는 하나 이상의 유전자에서 발생할 수 있다. 예를 들어, 상기 파괴는 상기 비-천연 미생물 유기체에 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산의 안정한 증식-커플링된 생산을 부여할 수 있다.
일부 실시태양에서, 상기 유전자 파괴는 완전한 유전자 결실을 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서 유전자를 파괴하는 다른 방법은 예를 들어 올리고뉴클레오타이드의 생략 또는 첨가에 의한, 또는 상기 유전자를 작동할 수 없게 만드는 돌연변이에 의한 프레임이동을 포함한다. 당해 분야의 숙련가는 그러나, 상기 비-천연 유기체가 상기 유전자 파괴가 발생하지 않은 모 표현형으로 전환하는 것에 대해 부여되는 안정성으로 인해 유전자 결실의 이점을 인식할 것이다. 특히, 상기 유전자 파괴는 본 발명에 개시된 바와 같은 유전자 세트 중에서 선택된다.
일단 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산의 생산을 증가시키기 위한 파괴에 대해서 유전자 세트에 대해 수치적 추정이 수행되면, 상기 균주를 제작하고, 진화시키고, 시험할 수 있다. 유전자 결실을 포함한 유전자 파괴를 당해 분야에 널리 공지된 방법에 의해 숙주 유기체에 도입시킨다. 특히 유용한 유전자 파괴 방법은 본 발명에 개시된 바와 같이, 동종 재조합에 의한 것이다.
상기 가공된 균주를 증식률, 기질 섭취율 및/또는 생성물/부산물 분비율을 측정함으로써 특성화할 수 있다. 배양물을 증식시키고 이를 지수 증식기 동안 측정을 수행하기 위해 신선한 배치 배양물에 대한 접종물로서 사용할 수 있다. 상기 증식률은 분광광도계(A600)를 사용하여 광학 밀도를 측정함으로써 측정될 수 있다. 배양 상등액 중의 글루코스 및 다른 유기산 부산물의 농도를 널리 공지된 방법, 예를 들어 HPLC, GC-MS, 또는 본 발명에 개시된 바와 같은 목적하는 생성물의 분석에 적합한 다른 널리 공지된 분석 방법에 의해 측정하고, 이를 섭취율 및 분비율의 계산에 사용할 수 있다.
유전자 파괴를 함유하는 균주는 그의 대사 네트워크가 그의 누락 기능에 대해 조절될 때까지 차선의 증식률을 나타낼 수 있다. 이러한 조절을 지원하기 위해서, 상기 균주를 적응 진화시킬 수 있다. 상기 균주에 적응 진화를 가함으로써, 세포 증식률이 1차적인 선택압으로 되고 상기 돌연변이 세포는 그의 증식률을 증대시키기 위해서 그의 대사 흐름을 강제로 재배정하게 된다. 이러한 대사 재프로그램화가 최근에, 다양한 기질상에서 적응 진화되어 인실리코 모델에 의해 연역적으로 예견된 증식률에 도달된 다수의 에스케리키아 콜라이 돌연변이체에 대해 입증되었다(문헌[Fong and Palsson, Nat . Genet . 36:1056-1058 (2004)]). 적응 진화에 의해 발생한 증식 개선은 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 생산의 증대된 비율이 동반될 수 있다. 상기 균주는 일반적으로 반복해서 적응 진화되어(병행하여 실행됨), 다른 것들에 비해 우수한 생산 품질을 갖는 하나의 균주를 잠재적으로 생성시킬 수 있는, 숙주 유기체에 의해 나타날 수 있는 진화 패턴의 차이를 설명한다(문헌[Fong and Palsson, Nat . Genet . 36:1056-1058 (2004)]; 문헌[Fong et al., J. Bacteriol . 185:6400-6408 (2003)]; 문헌[Ibarra et al., Nature 420:186-189 (2002)]). 진화를 획득되는 증식률 개선에 따라 일정한 기간, 전형적으로는 2 내지 6주간 실행할 수 있다. 일반적으로, 안정한 표현형이 획득되면 진화를 멈춘다.
상기 적응 진화 과정에 이어서, 새로운 균주를 다시, 상기 증식률, 기질 섭취율, 및 생성물/부산물 분비율에 의해 특성화한다. 이들 결과를 대사 모델링으로부터의 생산 속력(production envelope)과 함께 실제 증식 및 생산 수율을 플롯팅함으로써 이론적인 예측과 비교한다. 가장 성공적인 설계/진화 조합이 추가의 추적을 위해 선택되며, 실험규모 배치 및 연속 발효에서 특성화된다. 본 발명에 개시된 방법 이면의 상기 증식-커플링된 생화학적 생산 개념, 예를 들어 옵트녹(OptKnock) 접근법이 또한 유전적으로 안정한 과잉생산자의 발생을 생성시킬 것이다. 따라서, 상기 배양물을 장기간 안정성을 평가하기 위해서, 연장된 기간 동안, 예를 들어 1개월 이상 연속적인 방식으로 유지시킨다. 수율 및 생산성이 유지되도록 샘플을 주기적으로 취할 수 있다.
적응 진화는 비천연 환경 조건하에서 돌연변이 또는 가공된 미생물 균주, 또는 야생형 균주의 증식률을 증가시키는데 사용될 수 있는 강력한 기법이다. 적응 진화는 증식-커플링된 생성물 형성을 생성시키는 옵트녹과 같은 방법을 통해 설계되는 균주에 특히 유용하다. 따라서, 최적으로 증식하는 균주를 향한 진화가 또한 생산을 간접적으로 최적화할 것이다. 에스케리키아 콜라이 K-12 MG1655의 독특한 균주가 유전자 녹아웃 및 적응 진화를 통해 생성되었다(문헌[Fong and Palsson, Nat. Genet. 36:1056-1058 (2004)]). 이 연구에서, 모든 적응 진화 배양물들을 정지기에 도달하기 전에 배치 배양물의 새로운 배지내로의 일련의 계대배양에 의해 연장된 지수 증식으로 유지시켰으며, 따라서 증식률이 1차 선택압이 되게 하였다. 녹아웃 균주를 제작하고 상이한 탄소 기질(각각의 녹아웃 균주에 대해서 4개)이 보충된 최소 배지상에서 진화시켰다. 진화 배양을 중복해서 또는 3회 중복해서 수행하여, 총 50개의 진화 녹아웃 균주를 제공하였다. 상기 진화 배양물을 안정한 증식률에 도달될 때까지 지수 증식으로 유지시켰다. 수치적 추정은 검사된 50개의 사례중 38개에서 상기 녹아웃 균주의 진화후 증식률 예견시 정확하였다(10% 이내). 더욱 또한, 옵트녹 설계와 적응 진화의 조합은 개선된 젖산 생산 균주를 도출하였다(문헌[Fong et al., Biotechnol . Bioeng . 91:643-648 (2005)]). 유사한 방법들을 본 발명에 개시된 균주에 적용하고 다양한 숙주 군주에 적용할 수 있다.
적응 진화를 수행하기 위해 개발된 다수의 기술들이 존재한다. 예시적인 방법들을 본 발명에 개시한다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 비-천연 유기체의 최적화는 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 생산 및/또는 상기 생산 균주의 안정성을 증가시키는 적응 진화 기법을 사용함을 포함한다.
일련의 배양은 작은 부피의 증식 배양물의 새로운 생육 배지를 함유하는 훨씬 더 큰 용기로의 반복적인 수송을 수반한다. 상기 배양된 유기체가 새로운 용기에서 포화까지 증식되었을 때, 상기 과정을 반복한다. 상기 방법을 사용하여 수년의 기간에 걸쳐 증식률의 일관된 개선을 명확히 입증한 실험으로, 문헌에서 지속된 배양물의 가장 긴 증명을 성취하였다(문헌[Lenski and Travisano, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 91:6808-6814 (1994)]). 전형적으로, 배양물의 수송은 대개 지수기 동안 수행되며, 따라서 매일 상기 수송 부피를 정확히 계산하여 다음 24 시간 기간을 통해 지수 증식을 유지시킨다. 다수의 일련의 희석은 저렴하며 비교하기가 용이하다.
연속 배양에서 물질환경조절장치(chemostat) 중의 세포의 증식은 매우 높은 분획의 세포 집단이 남아있는 극단적인 희석 사례를 나타낸다. 배양물이 증식하고 포화됨에 따라, 상기 증식된 배양물의 작은 부분이 새로운 배지로 대체되어, 상기 배양물이 그의 최대 집단 크기에 가깝게 계속해서 증식하게 된다. 물질환경조절장치를 사용하여 단기간의 빠른 증식률의 개선을 입증하였다(문헌[Dykhuizen, Methods Enzymol. 613-631 (1993)]). 상기 장치의 잠재적인 유용성은 인정되었지만, 전통적인 물질환경조절장치는 희석-내성(정적) 변이체의 의도하지 않은 선택으로 인해, 증가된 증식률에 대해 오랜 기간의 선택을 지속할 수 없었다. 이들 변이체는 상기 물질환경조절장치의 표면에의 부착에 의해 희석을 견딜 수 있으며, 이렇게 함으로써, 보다 높은 증식률을 갖는 것들을 포함하여 덜 부착된 개체들은 경쟁에서 밀려나고, 따라서 상기 장치의 의도된 목적이 제거된다(문헌[Chao and Ramsdell, J. Gen . Microbiol 20:132-138 (1985)]). 이러한 결점을 극복하기 위한 한 가지 가능한 방법은 2개의 증식 챔버를 갖는 장치의 수행이며, 상기 챔버는 앞서 개시된 바와 같이, 일시적인 멸균 단계를 주기적으로 겪는다(말리어와 뮤첼(Marliere and Mutzel), 미국특허 제 6,686,194 호).
이볼류게이터(Evolugator)(상표)는 이볼류게이트 LLC(미국 플로리다주 게인스빌 소재)에 의해 개발된 연속 배양 장치이며 전통적인 진화 기법에 비해 현저한 시간 및 노력 절감을 나타낸다(문헌[de Crecy et al.,. Appl. Microbiol. Biotechnol. 77:489-496 (2007)]). 세포를 정지기가 획득되기 전에 새로운 배지내로의 배치 배양물의 일련의 계대배양에 의해 연장된 지수 증식기에서 유지시킨다. 광학 밀도 측정 및 액체 취급을 자동화함으로써, 상기 이볼류게이터(상표)는 큰 배양 부피를 사용하여 일련의 수송을 높은 속도로 수행할 수 있으며, 따라서 세포 적응의 진화에 있어서 물질환경조절장치의 효율에 접근할 수 있다. 예를 들어, 번역 기구의 성분에서 애시네토박터 sp ADP1 결핍되고 심하게 방해된 증식을 갖는 돌연변이체를 200 세대에서 야생형 증식률의 80%까지 진화시켰다. 그러나, 세포를 단일 용기에서 유지시키는 물질환경조절장치와 대조적으로, 상기 기계는 튜빙 스풀의 세분된 영역에서 하나의 "반응기"를 다음으로 이동시킴으로써 작동한다. 상기 수송 부피는 조절 가능하며, 통상적으로 약 50%로 정해진다. 상기 장치에 대한 결점은 상기 장치가 크고 비용이 든다는 것이며, 따라서 다수의 진화를 병행 실시하는 것은 실용적이지 않다. 더욱 또한, 가스 첨가가 잘 조절되지 않으며, 엄격한 혐기성 조건이 현행 장치 형태로는 유지되지 않는다. 그럼에도 불구하고, 상기는 생산 균주를 적응 진화시키기 위한 대체 방법이다.
본 발명에 개시된 바와 같이, 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 경로의 목적하는 활성을 암호화하는 핵산을 숙주 유기체에 도입시킬 수 있다. 일부의 경우에, 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 경로 효소 또는 단백질의 활성을 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산의 생산을 증가시키도록 변형시키는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 단백질 또는 효소의 활성을 증가시키는 공지된 돌연변이를 암호화 핵산 분자에 도입시킬 수 있다. 또한, 최적화 방법을 효소 또는 단백질의 활성 증가, 및/또는 억제 활성의 감소, 예를 들어 음의 조절인자의 활성의 감소에 적용시킬 수 있다.
한 가지 상기와 같은 최적의 방법은 방향 진화이다. 방향 진화는 효소의 성질들을 개선 및/또는 변경시키기 위해서 특정 유전자에 표적화된 돌연변이의 도입을 수반하는 강력한 접근법이다. 개선 및/또는 변경된 효소를 다수의 효소 변이체들(예를 들어 >104)의 자동화된 선별을 허용하는 민감한 고속 대량 선별 분석의 개발 및 실행을 통해 확인할 수 있다. 반복되는 라운드의 돌연변이 및 선별을 전형적으로 수행하여 최적화된 성질을 갖는 효소를 제공한다. 돌연변이에 대한 유전자 영역을 확인하는데 일조할 수 있는 컴퓨터 연산방식이 또한 개발되었으며 이는 생성 및 선별에 필요한 효소 변이체의 수를 현저하게 줄일 수 있다. 다양한 변이체 라이브러리를 생성시키는데 유효한 다수의 방향 진화 기술들이 개발되었으며(문헌[Hibbert et al., Biomol . Eng 22:11-19 (2005)]; 문헌[Huisman and Lalonde, In Biocatalysis in the pharmaceutical and biotechnology industries pgs. 717-742 (2007), Patel (ed.), CRC Press]; 문헌[Otten and Quax. Biomol.Eng 22:1-9 (2005)]; 및 문헌[Sen et al., Appl Biochem . Biotechnol 143:212-223 (2007)]), 이들 방법은 다수의 효소 부류들에 걸쳐 광범위한 성질들의 개발에 성공적으로 적용되었다. 방향 진화 기술에 의해 개선되고/되거나 변경된 효소 특징들은 예를 들어 비-천연 기질 전환의 경우 선택성/특이성; 확고한 고온 처리의 경우 온도 안정성; 보다 낮거나 보다 높은 pH 조건 하에서 생물처리의 경우 pH 안정성; 높은 생성물 역가를 성취할 수 있도록 하기 위한 기질 또는 생성물 허용성; 비-천연 기질을 포함하도록 기질 결합을 확장시키는 결합(Km); 생성물, 기질 또는 핵심 중간체에 의한 억제를 제거하기 위한 억제(Ki); 목적하는 유출을 성취하기 위해 효소 반응 속도를 증가시키는 활성(kcat); 단백질 수율 및 전체 경로 유출을 증가시키는 발현 수준; 호기성 조건 하에서 공기 민감성 효소의 작용을 위한 산소 안정성; 및 산소의 부재 하에서 호기성 효소의 작용을 위한 혐기성 활성을 포함한다.
특정 효소들의 목적하는 성질들을 표적화하기 위한 유전자들의 돌연변이 및 변형을 위해 개발된 예시적인 방법들을 하기에 보다 상세히 개시한다. 상기와 같은 방법들은 당해 분야의 숙련가들에게 널리 공지되어 있다. 이들 중 어느 것이든 사용하여 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 경로 효소 또는 단백질의 활성을 변경/최적화할 수 있다.
EpPCR(문헌[Pritchard et al., J Theor. Biol 234:497-509(2005)])은 Mn2 + 이온의 첨가에 의해 PCR 반응에서 DNA 폴리머라제의 충실도를 감소시키거나, dNTP 농도를 치우치게 하거나, 다른 조건 변화에 의해 랜덤한 점 돌연변이를 도입시킨다. 돌연변이를 관심 표적 유전자에 국한하기 위한 5 단계 클로닝 공정은 1) 상기 관심 유전자의 실수유발 PCR 증폭; 2) 제한 효소 절단; 3) 목적하는 DNA 단편의 젤 정제; 4) 벡터 내로의 연결; 5) 유전자 변이체의 적합한 숙주 내로의 형질전환 및 개선된 실행을 위한 상기 라이브러리의 선별을 수반한다. 상기 방법은 단일 유전자에서 다수의 돌연변이를 동시에 발생시킬 수 있으며, 이는 목적하는 활성을 갖는 다수의 잠재적인 변이체를 선별하는데 유용할 수 있다. 다수의 돌연변이체가 EpPCR에 의해 생성될 수 있으며, 따라서 고속 대량 선별 분석 또는 선택 방법(특히 로봇공학 사용)은 바람직한 특성들을 갖는 것들을 확인하는데 유용하다.
실수유발 회전 환 증폭(epRCA)(문헌[Fujii et al., Nucleic Acids Res 32:e145(2004)]; 및 문헌[Fujii et al., Nat.Protoc. 1:2493-2497(2006)])은, 전체 환상 플라스미드가 주형으로서 사용되고 마지막 2개의 뉴클레오타이드 상에 엑소뉴클레아제 내성 티오포스페이트 결합을 갖는 랜덤한 6-머들을 사용하여 상기 플라스미드를 증폭시킨 다음 세포 내로 형질전환시키고, 이때 상기 플라스미드를 직렬 반복부에서 다시 환화시킴을 제외하고, epPCR과 동일한 다수의 요소들을 갖는다. 상기 Mn2 + 농도를 조절하는 것은 상기 돌연변이율을 다소 변화시킬 수 있다. 상기 기법은 단순한 실수 유발, 단일 단계 방법을 사용하여 3 내지 4개의 돌연변이/kbp를 갖는 플라스미드의 전체 사본을 생성시킨다. 제한효소 절단이나 특정 프라이머들을 필요로 하지 않는다. 또한, 상기 방법을 전형적으로는 키트로서 입수할 수 있다.
DNA 또는 패밀리 셔플링(문헌[Stemmer, W.P. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 91:10747-10751(1994)]; 및 문헌[Stemmer, W.P. Nature 370:389-391(1994)])은 전형적으로는 Dnase I 또는 EndoV와 같은 뉴클레아제들로 2개 이상의 변이체 유전자를 절단하여 DNA 폴리머라제의 존재하에서 어닐링 및 연장의 주기에 의해 재조립되어 키메릭 유전자들의 라이브러리를 생성시키는 랜덤한 단편들의 풀을 생성시킴을 수반한다. 단편들은 서로 점화(priming)시키며 하나의 사본이 또 다른 사본을 점화할 때(주형 스위치) 재조합이 발생한다. 상기 방법을 >1kbp DNA 서열과 함께 사용할 수 있다. 단편 재조립에 의해 생성된 돌연변이 재조합체 이외에, 상기 방법은 연장 단계에서 실수유발 PCR과 유사한 비율로 점 돌연변이를 도입시킨다. 상기 방법을, 항원성을 부여할 수도 있는 유해한 랜덤 중성 돌연변이를 제거하는데 사용할 수 있다.
엇갈린 연장(StEP)(문헌[Zhao et al., Nat. Biotechnol 16:258-261(1998)])은 주형 점화에 이어서 변성 및 어닐링/연장의 매우 짧은 지속(5초 정도로 짧은)의 반복된 주기의 2단계 PCR을 수반한다. 성장하는 단편들이 상이한 주형에 어닐링하고 추가로 연장되며, 이는 충분한 길이의 서열이 만들어질 때까지 반복된다. 주형 스위칭은 대부분의 생성 단편들이 다수의 어버이를 가짐을 의미한다. 저 충실도 폴리머라제들의 조합(Taq 및 뮤타자임)은 정반대의 돌연변이 스펙트럼으로 인해 실수유발 치우침을 감소시킨다.
랜덤 프라이밍 재조합(RPR)에서 랜덤 서열 프라이머를 사용하여 상기 주형의 상이한 분절들에 상보성인 다수의 짧은 DNA 단편들을 생성시킨다(문헌[Shao et al., Nucleic Acids Res., 26:681-683(1998)]). epPCR을 통한 염기 오결합(misincorporation) 및 오점화(mispriming)는 점 돌연변이를 제공한다. 짧은 DNA 단편들은 상동성을 근거로 서로 점화하고 재조합되며 반복된 열순환에 의해 완전한 길이로 재조립된다. 상기 단계에 앞서 주형의 제거는 낮은 어버이 재조합을 보장한다. 상기 방법은 대부분의 다른 방법들처럼 수 회의 반복에 걸쳐 수행되어 독특한 성질들을 진화시킬 수 있다. 이러한 기술은 서열 치우침을 피하며, 유전자 길이와 무관하고, 상기 용도를 위해 매우 적은 어버이 DNA를 필요로 한다.
이형 이중 가닥 재조합에서 선형화된 플라스미드 DNA를 사용하여 이형 이중 가닥을 형성시키며, 이는 불일치 수복에 의해 수복된다(문헌[Volkov et al., Nucleic Acids Res 27:e18(1999)]; 및 문헌[Volkov et al., Methods Enzymol. 328:456-463(2000)]). 상기 불일치 수복 단계는 적어도 어느 정도 돌연변이 유발성이다. 이형 이중 가닥은 선형의 동형 이중 가닥보다 더 효율적으로 형질전환된다. 상기 방법은 큰 유전자 및 전체 오페론에 적합하다.
일시적인 주형 상의 랜덤 키메라 발생(RACHITT)(문헌[Coco et al., Nat. Biotechnol 19:354-359(2001)])은 Dnase I 단편화 및 단일 가닥 DNA(ssDNA)의 크기 분류를 사용한다. 동종 단편을 폴리머라제의 부재 하에서 상보성 ssDNA 골격에 하이브리드화한다. 임의의 중복되는 하이브리드화되지 않은 단편 단부들을 엑소뉴클레아제에 의해 다듬는다. 단편들 간의 틈을 채우고, 이어서 연결시켜 상기 골격(증폭을 방해하는 U를 함유한다)에 하이브리드화된 완전한 길이의 다양한 가닥들의 풀을 제공한다. 이어서 상기 골격을 파괴하고 PCR 증폭에 의해 상기 다양한 가닥에 상보성인 새로운 가닥으로 대체한다. 상기 방법은 오직 하나의 어버이로부터 나온 하나의 가닥(골격)을 수반하는 반면 상기 점화 단편들은 다른 유전자들로부터 유래하며; 상기 어버이 골격은 대비되게 선택된다. 따라서, 어버이 단편들과의 재 어닐링은 발생하지 않는다. 중복되는 단편들을 엑소뉴클레아제로 다듬는다. 그렇지 않으면, 이는 DNA 셔플링 및 StEP와 개념상 유사하다. 따라서, 자매 세포가 없고, 불활성이 거의 없으며, 셔플링되지 않은 어버이가 없어야 한다. 이러한 기법은 어버이 유전자가 거의 또는 전혀 생성되지 않으며 표준 DNA 셔플링에 비해 다수의 보다 많은 교차들이 생성될 수 있다는 점에서 이점을 갖는다.
절두된 주형 상에서의 재조합 연장(RETT)은 주형의 풀로서 사용된 단일방향 ssDNA 단편들의 존재 하에서 프라이머들로부터 단일방향으로 성장하는 가닥들의 주형 스위칭을 수반한다(문헌[Lee et al., J. Molec. Catalysis 26:119-129(2003)]). DNA 엔도뉴클레아제는 사용되지 않는다. 단일방향 ssDNA는 랜덤 프라이머와 DNA 폴리머라제에 의해 또는 엑소뉴클레아제에 의한 일련의 결실에 의해 제조된다. 단일 방향 ssDNA는 단지 주형이며 프라이머가 아니다. 랜덤 점화 및 엑소뉴클레아제는 DNA 셔플링/RACHITT의 효소 절단의 사실로서 서열 치우침을 도입하지 않는다. RETT는 매우 짧은 연장 대신에 통상적인 PCR 조건을 사용하므로 StEP보다 최적화가 더 용이할 수 있다. 재조합은 상기 PCR 단계의 성분으로서 발생한다(직접 셔플링이 없다). 상기 방법은 또한 중단의 부재로 인해 StEP보다 더 랜덤할 수 있다.
퇴화된 올리고뉴클레오타이드 유전자 셔플링(DOGS)에서 퇴화된 프라이머를 사용하여 분자들 간의 재조합을 조절한다(문헌[Bergquist and Gibbs, Methods Mol. Biol 352:191-204(2007)]; 문헌[Bergquist et al., Biomol.Eng 22:63-72(2005)]; 문헌[Gibbs et al., Gene 271:13-20(2001)]). 이를 사용하여 어버이 유전자를 재생시키는 DNA 셔플링과 같은 다른 방법의 의도를 억제할 수 있다. 이 방법을 선택된 유전자 분절의 랜덤 돌연변이(epPCR)와 병행할 수 있다. 이는 어버이 서열의 재형성을 차단하는 좋은 방법일 수 있다. 엔도뉴클레아제는 필요하지 않다. 제조된 분절들의 투입 농도를 조절함으로써, 목적하는 주쇄를 향해 기울일 수 있다. 상기 방법은 제한 효소 절단 없이 관련되지 않은 어버이로부터 DNA 셔플링을 허용하며 랜덤한 돌연변이 방법의 선택을 허용한다.
하이브리드 효소의 생성을 위한 점증적인 절두(ITCHY)는 관심 유전자 또는 유전자 단편의 1 염기쌍 결실과의 조합적인 라이브러리를 생성시킨다(문헌[Ostermeier et al., Proc Natl Acad Sci U.S.A. 96:3562-3567(1999)]; 문헌[Ostermeier et al, Nat. Biotechnol. 17:1205-1209(1999)]). 절두를 2개의 상이한 유전자 조각 상에서 반대 방향으로 도입시킨다. 이들을 함께 연결하고 융합물을 클로닝한다. 상기 기법은 상기 두 어버이 유전자들 간에 상동성을 필요로 하지 않는다. ITCHY를 DNA 셔플링과 병행하는 경우, 상기 시스템을 SCRATCHY라 칭한다(하기 참조). 상기 둘의 주요 이점은 어버이 유전자들 간에 상동성이 필요하지 않다는 것이다; 예를 들어 에스케리키아 콜라이와 인간 유전자 간의 작용성 융합물이 ITCHY를 통해 생성되었다. ITCHY 라이브러리가 제조되면, 모든 가능한 교차가 포착된다.
상기 하이브리드 효소의 생산을 위한 티오-증분 절두(THIO-ITCHY)는, 포스포티올레이트 dNTP를 사용하여 절두를 생성시킴을 제외하고 ITCHY와 유사하다(문헌[Lutz et al., Nucleic Acids Res 29:E16(2001)]). ITCHY에 비해, THIO-ITCHY는 최적화하기에 보다 용이하고 보다 많은 재현성과 조절성을 제공할 수 있다.
SCRATCH는 2개의 유전자 재조합 방법, ITCHY 및 DNA 셔플링을 병행한다(문헌[Lutz et al., Proc Natl Acad Sci U.S.A. 98:11248-11253(2001)]). SCRATCHY는 ITCHY와 DNA 셔플링의 최상의 특징들을 겸비한다. 먼저, ITCHY를 DNA 상동성-독립적인 방식으로 유전자 단편들 사이에 포괄적인 세트의 융합을 생성시키는데 사용한다. 이어서 상기 인공 패밀리에 DNA-셔플링 단계를 가하여 교차의 수를 증대시킨다. 수치상 추정을 최적화에 사용할 수 있다. 서열 일치성이 80% 이하인 경우 SCRATCHY가 DNA 셔플링보다 더 유효하다.
랜덤 표류 돌연변이(RNDM)에서 돌연변이는 epPCR에 이어서 유용한 활성을 보유하는 것들에 대한 선별/선택을 통해 이루어졌다(문헌[Bergquist et al., Biomol. Eng. 22:63-72(2005)]). 이어서, 이들을 DOGS에 사용하여 다수의 활성 돌연변이체들 사이 또는 활성 돌연변이체와 일부 다른 바람직한 어버이 사이의 융합을 갖는 재조합체를 생성시킨다. 중립 돌연변이의 단리를 촉진하도록 디자인하는 목적은 보유된 촉매 활성이 원래의 유전자에서보다 더 높든 더 낮든 간에 상기 활성을 선별하는 것이다. RNDM은 선별이 배경 이상의 활성을 검출할 수 있는 경우 고속 대량 분석에 사용 가능하다. RNDM을 다양성의 발생에 있어서 DOGS에 대한 전단(front end)으로서 사용하였다. 상기 기법은 셔플링 또는 다른 후속 단계들에 앞서 활성에 대한 요구를 부과하며; 중립 표류 라이브러리는 보다 작은 라이브러리로부터 보다 높고/신속한 개선을 생성시키는 것으로 나타났다. epPCR을 사용함이 공개되었다 하더라도, 상기를 다른 대규모 돌연변이 방법들에 적용할 수 있다.
서열 포화 돌연변이(SeSaM)는 1) 포스포티오에이트 뉴클레오타이드의 랜덤한 통합 및 절단을 사용하여 랜덤한 길이의 단편들의 풀을 생성시키고; 상기 풀을 주형으로서 사용하여 2) 이노신과 같은 "보편적인" 염기의 존재 하에서 연장시키고; 3) 이노신-함유 보체의 복제가 랜덤한 염기 통합 및 결과적으로 돌연변이를 제공하는 랜덤한 돌연변이 방법이다(문헌[Wong et al., Biotechnol J. 3:74-82(2008)]; 문헌[Wong et al., Nucleic Acids Res 32:e26(2004)]; 및 문헌[Wong et al., Anal.Biochem. 341:187-189(2005)]). 상기 기법을 사용하는 경우, 간단한 방법을 사용하여 2 내지 3일 이내에 돌연변이체의 큰 라이브러리를 생성시키는 것이 가능할 수 있다. 이는 DNA 폴리머라제의 돌연변이 치우침에 비해 매우 비-방향성이다. 상기 접근법의 차이는 상기 기법을 epPCR에 대해 상보성(또는 대안적)으로 만든다.
합성 셔플링에서, 중복되는 올리고뉴클레오타이드는 "표적 중의 모든 유전자 다양성"을 암호화하도록 디자인되며 상기 셔플링된 자손에 대해 매우 높은 다양성을 허용한다(문헌[Ness, et al, Nat. Biotechnol 20:1251-1255(2002)]). 상기 기법에서, 상기 단편이 셔플링되도록 디자인할 수 있다. 이는 상기 생성되는 자손의 다양성을 증가시키는데 일조한다. 보다 멀리 관련된 서열들을 보다 밀접하게 관련된 서열들에 접근하는 비율로 재조합하기 위해서 서열/코돈 치우침을 디자인할 수 있다. 추가로 상기 기법은 상기 주형 유전자들을 물리적으로 소유할 것을 요구하지 않는다.
뉴클레오타이드 교환 및 절제 기술 NexT는 dUTP 통합에 이은 유라실 DNA 글리코실라제 및 이어서 피페리딘에 의한 처리의 조합을 활용하여 종점 DNA 단편화를 수행한다(문헌[Muller et al., Nucleic Acids Res 33:e117(2005)]). 상기 유전자를 교정 폴리머라제와 함께 내부 PCR 프라이머 연장을 사용하여 재조립한다. 상기 셔플링의 크기는 변하는 dUPT::dTTP 비를 사용하여 직접 조절할 수 있다. 이는 간단한 유라실 통합 및 절단 방법을 사용하는 종점 반응이다. 상기 방법에 다른 뉴클레오타이드 동족체, 예를 들어 8-옥소-구아닌을 사용할 수 있다. 또한, 상기 기법은 매우 짧은 단편(86 pb)으로 잘 작용하며 낮은 오류율을 갖는다. DNA의 화학적 절단은 매우 적은 셔플링되지 않은 클론들을 의미한다.
서열 상동성-독립적인 단백질 재조합(SHIPREC)에서 링커를 사용하여 2개의 먼 관련되거나 관련되지 않은 유전자들 간의 융합을 촉진한다. 뉴클레아제 처리를 사용하여 상기 둘 사이에 일련의 키메라들을 생성시킨다. 그 결과 이들 융합물의 단일 교차 라이브러리가 생성된다(문헌[Sieber et al., Nat.Biotechnol 19:456-460(2001)]). 이는 제한된 유형의 셔플링을 생성시키며, 돌연변이는 별도의 공정이다. 또한 상동성은 필요하지 않기 때문에 상기 기법은 2개의 관련되지 않은 어버이 유전자들 각각의 변하는 분획들을 갖는 키메라의 라이브러리를 생성시킬 수 있다. 상동성은 필요하지 않다. SHIPREC를 포유동물 CP450의 N-말단 부위에 융합된 세균 CP450의 헴-결합 도메인으로 시험하였으며; 이는 보다 용해성인 효소에서 포유동물 활성을 생성시켰다.
유전자 부위 포화 돌연변이(GSSM)(상표)에서 출발 물질은 삽입물이 있는 초나선(supercoiled) dsDNA 플라스미드이며 2 개의 프라이머가 목적하는 돌연변이 부위에서 퇴화된다(문헌[Kretz et al., Methods Enzymol. 388:3-11(2004)]). 프라이머는 관심 돌연변이를 지니며 DNA의 반대 가닥 상의 동일한 서열에 어닐링한다. 상기 프라이머의 가운데에 돌연변이가 있고 양쪽의 측면에 정확한 서열의 약 20 뉴클레오타이드가 인접해 있다. 상기 프라이머 중의 서열은 NNN 또는 NNK(암호화) 및 MNN(비-암호화)(N = 모두 4개, K = G,T, M = A,C)이다. 연장 후에, DpnI를 사용하여 댐-메틸화된 DNA를 절단하여 야생형 주형을 제거한다. 상기 기법은 주어진 유전자 좌(즉 하나의 코돈)에서 모든 가능한 아미노산 치환들을 조사한다. 상기 기법은 넌센스 코돈 및 대부분의 가능한 대립유전자들의 동일하거나 거의 동일한 표시 없이 하나의 부위에서 모든 가능한 치환의 발생을 촉진한다. 상기 표적 효소의 구조, 기전, 또는 도메인에 대한 선행 지식은 필요하지 않다. 셔플링 또는 유전자 재조립이 이어지는 경우, 상기 기술은 단일 부위 상향 돌연변이의 모든 가능한 조합들을 함유하는 다양한 재조합체 라이브러리를 생성시킨다. 상기 기술 조합의 유용성은 50개 이상의 상이한 효소들의 성공적인 진화, 및 또한 주어진 효소에서의 하나보다 많은 성질에 대해 입증되었다.
조합적인 카세트 돌연변이(CCM)는 한정된 부위들을 다수의 가능한 아미노산 서열 변경으로 대체하는 짧은 올리고뉴클레오타이드 카세트의 사용을 포함한다(문헌[Reidhaar-Olson et al., Methods Enzymol. 208:564-586(1991)]; 및 문헌[Reidhaar-Olson et al., Science 241:53-57(1988)]). 2 또는 3개 부위들에서의 동시 치환이 상기 기법을 사용하여 가능하다. 또한, 상기 방법은 제한된 범위의 부위들에서 대다수의 가능한 서열 변화들을 시험한다. 상기 기법은 람다 억제인자 DNA-결합 도메인의 정보 내용을 탐구하는데 사용되었다.
조합적인 복합 카세트 돌연변이(CMCM)는 보다 큰 프로그램의 일부로서 사용됨을 제외하고 CCM과 본질적으로 유사하다: 즉 1) 높은 돌연변이율로의 epPCR의 사용, 2) ID 다발점 및 다발 영역을 확인하기 위한 이의 사용, 및 이어지는 3) 단백질 서열 공간의 한정된 영억을 덮기 위한 CMCM에 의한 연장(문헌[Reetz et al., Angew. Chem. Int. Ed Engl. 40:3589-3591(2001)]). CCM과 같이, 상기 방법은 표적 부위에 걸쳐 사실상 모든 가능한 변경들을 시험할 수 있다. 랜덤 돌연변이 및 셔플링된 유전자를 생성시키는 방법들과 함께 사용되는 경우, 다양한 셔플링된 단백질은 탁월한 생성 수단을 제공한다. 상기 접근법은 효소의 거울상 선택성을 51배까지 성공적으로 증가시켰다.
돌연변이 유발 균주 기법에서 조합적인 ts 돌연변이유발 플라스미드는 선택 중에 랜덤한 천연 돌연변이 빈도의 20- 내지 4000-X의 증가를 허용하고 선택이 필요하지 않은 경우 유해 돌연변이의 축적을 방지한다(문헌[Selifonova et al., Appl Environ Microbiol 67:3645-3649(2001)]). 상기 기술은 플라스미드-유래된 mutD5 유전자를 기본으로 하며, 상기 유전자는 DNA 폴리머라제 III의 돌연변이 서브유닛을 암호화한다. 상기 서브유닛은 내인성 DNA 폴리머라제 III에 결합하고 상기 플라스미드를 갖고 있는 균주들 중 임의의 균주에서 폴리머라제 III의 교정 능력을 절충한다. 광범위한 염기 치환 및 프레임이동 돌연변이가 발생한다. 유효한 사용을 위해서, 일단 목적하는 표현형이 성취되면 상기 돌연변이 유발 플라스미드를 제거해야 하며; 이는 온도 민감성(ts) 복제 기원을 통해 수행되고, 이는 41 ℃에서 플라스미드 경화를 허용한다. 돌연변이 유발 균주가 상당한 기간 동안 탐구되었음을 알아야 한다(문헌[Low et al., J. Mol. Biol. 260:359-3680(1996)]). 상기 기법에서 매우 높은 자발적인 돌연변이율이 관찰된다. 상기 조건적인 성질은 목적하지 않는 배경 돌연변이를 최소화한다. 이러한 기술을 적응 진화와 병행하여 돌연변이 발생률을 증대시키고 목적하는 표현형들을 보다 신속하게 성취할 수 있었다.
룩-스루(Look-Through) 돌연변이(LTM)는 선택된 아미노산들의 조합적인 돌연변이들을 평가하고 최적화하는 다차원적 돌연변이 방법이다(문헌[Rajpal et al., Proc Natl Acad Sci U.S.A 102:8466-8471(2005)]). 각 부위를 모든 가능한 아미노산 변화들로 포화시키는 것보다 오히려, 아미노산 R-기 화학의 범위를 포함하도록 9개의 세트를 선택한다. 부위당 더 적은 변화는 다수의 부위가 상기 유형의 돌연변이를 쉽게 일으키게 한다. 낮은 나노몰에서부터 피코몰까지의 항체의 결합 친화성의 800배 초과의 증가가 상기 방법을 통해 성취되었다. 이는 랜덤한 조합의 수를 최소화하는데 합리적인 접근법이며 선별할 클론들의 수를 크게 감소시킴으로써 개선된 특성을 찾는 능력을 증가시킬 것이다. 이를 항체 공학, 구체적으로 결합 친화성을 증가시키고/시키거나 해리를 감소시키는데 적용하였다. 상기 기법을 선별 또는 선택과 병행할 수 있다.
유전자 재조립은 한 번에 다수의 유전자에 적용되거나 단일 유전자의 큰 키메라 라이브러리(다수의 돌연변이)를 생성시키는데 적용될 수 있는 DNA 셔플링 방법이다(베레니움 코포레이션(Verenium Corporation)에 의해 공급된 조율 가능한 진리어셈블리(GeneReassembly)(상표)(TGR(상표)) 기술). 전형적으로 상기 기술을, 상기 나타낸 서열 공간을 목적하는 개선에 대해 질문하기 위해 초고속 대량 선별과 함께 사용한다. 상기 기법은 상동성과 무관하게 다수의 유전자 재조합을 허용한다. 교차 사건들의 정확한 수 및 위치를 생물정보 분석을 통해 디자인된 단편들을 사용하여 미리 측정할 수 있다. 상기 기술은 실질적으로 어버이 유전자 재형성 없이 낮은 수준의 불활성 유전자와 함께 매우 높은 수준의 다양성을 도출시킨다. GSSM(상표)과 병행 시, 큰 범위의 돌연변이들을 개선된 활성에 대해 시험할 수 있다. 상기 방법은 DNA 셔플링의 "블렌딩" 및 "미세 조정"을 허용하고, 예를 들어 코돈 사용을 최적화할 수 있다.
인 실리코(In silico) 단백질 디자인 자동화(PDA)는 특정한 주름을 갖는 구조적으로 한정된 단백질 주쇄를 고정시키고 상기 주름 및 전체 단백질 에너지학을 안정화할 수 있는 아미노산 치환을 위한 서열 공간을 탐색하는 최적화 연산방식이다(문헌[Hayes et al., Proc Natl Acad Sci U.S.A. 99:15926-15931(2002)]). 상기 기술은 단백질 아미노산 변이에 대한 구조적 허용성을 탐색하기 위해서 인 실리코 구조 기재 엔트로피 예견을 허용한다. 통계 역학을 각 위치에서의 커플링 상호작용을 계산하는데 적용한다. 아미노산 치환에 대한 구조 허용성이 커플링의 척도이다. 최종적으로, 상기 기술은 구조 특징들의 완전성을 유지하면서 단백질 성질의 목적하는 변형들을 제공하도록 디자인된다. 상기 방법은 매우 큰 수의 가능한 서열 변형들(1050)의 필터링을 계산적으로 평가하고 허용한다. 시험하기 위한 서열 변형의 선택은 가장 유리한 열역학에 근거한 예견과 관련된다. 외면상 오직 안정성 또는 안정성과 연결된 성질들만이 상기 기술에 의해 유효하게 다루어질 수 있다. 상기 방법은 일부 치료학적 단백질들, 특히 공학용 면역글로불린에 성공적으로 사용되었다. 인 실리코 예견은 대단히 많은 수의 잠재적인 변형들을 시험하는 것을 피한다. 기존 3차원 구조에 근거한 예견이 가설적인 구조에 근거한 예견보다 더 성공할 듯하다. 상기 기술은 다수의 동시적인 돌연변이들, 급격한 수의 증가로 인해 순수하게 실험적인 기술들로는 가능하지 않은 것들의 표적화된 선별을 쉽게 예견할 수 있으며 이를 허용한다.
반복하는 포화 돌연변이(ISM)는 1) 효소 개선에 가능한 부위를 선택하기 위한 구조/작용 지식의 사용, 2) 스트라타진 퀵체인지(Stratagene QuikChange)(스트라타진; 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재)와 같은 돌연변이 방법을 사용하는 선택된 부위에서의 포화 돌연변이 수행, 3) 목적하는 성질에 대한 선별/선택, 4) 개선된 클론(들)의 사용과 함께, 또 다른 부위에서의 다시 시작 및 목적하는 활성이 성취될 때까지 연속적인 반복을 수반한다(문헌[Reetz et al., Nat. Protoc. 2:891-903(2007)]; 및 문헌[Reetz et al., Angew. Chem. Int. Ed Engl. 45:7745-7751(2006)]). 이는 주어진 위치에서 모든 가능한 치환들이 선별/선택에 대해 수행됨을 보장하는 입증된 방법이다.
상기 언급한 돌연변이 방법들 중 임의의 방법을 단독으로 사용하거나 병행할 수 있다. 또한, 상기 방향 진화 방법들 중 어느 하나 또는 조합을 본 발명에 개시된 바와 같이 적응 진화 기법들과 함께 사용할 수 있다.
본 발명의 다양한 실시태양들의 활성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 변형들이 또한 본 발명에 제공된 본 발명의 정의 내에 있음은 물론이다. 따라서, 하기의 실시예들은 본 발명을 예시하고자 하는 것이지 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예 I
MI - FAE 주기, MD - FAE 주기 및 아실- CoA 종결 주기에 의한 지방 알콜 및 지방 알데하이드의 생산
숙주 미생물 유기체상에 지방 알콜 및 지방 알데하이드 생산 능력을 부여하기 위한 공급원으로서 사용될 수 있는 암호화 핵산 및 종을 하기에 추가로 예시한다.
다중효소 복합체
하나의 예시적인 실시태양에서, 유전자 fadA 및 fadB는 말로닐-CoA 독립적인 FAS 경로의 3가지 구성성분 활성, 즉 케토아실-CoA 티올라제, 3-하이드록시아실-CoA 데하이드로게나제 및 에노일-CoA 하이드라타제 활성을 나타내는 다중효소 복합체를 암호화한다(문헌[Nakahigashi, K. and H. Inokuchi, Nucleic Acids Research 18:4937 (1990)]; 문헌[Yang et al., Journal of Bacteriology 173:7405-7406 (1991)]; 문헌[Yang et al, Journal of Biological Chemistry 265:10424-10429 (1990)]; 문헌[Yang et al., Biochemistry 30:6788-6795 (1990)]). 상기 fadI 및 fadJ 유전자는 유전자 fadA 및 fadB를 부여하는 상기 말로닐-CoA 독립적인 FAS를 대체할 수 있는 유사한 활성들을 암호화한다. 에스케리키아 콜라이의 아실-Coa 데하이드로게나제는 fadE에 의해 암호화된다(문헌[Campbell et al, J Bacteriol 184: 3759-64)]). 상기 효소는 베타-산화의 율속 단계를 촉매화한다(문헌[O'Brien et al, J Bacteriol 132:532-40 (1977)]). 상기 fad 유전자들 각각에 대한 핵산 서열은 당해 분야에 널리 공지되어 있으며 하기의 수탁번호를 사용하여 젠뱅크와 같은 공개 데이터베이스에서 접근될 수 있다.
Figure pct00077
단계 A. 티올라제
지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 생산에 적합한 티올라제 효소들(또한 베타-케토 티올라제, 아실-CoA C-아세틸트랜스퍼라제, 아실-CoA:아세틸-CoA C-아실트랜스퍼라제, 3-옥소아실-CoA 티올라제, 3-케토아실-CoA 티올라제, 베타-케토아실-CoA 티올라제, 및 아실-CoA 티올라제로서 공지됨)을 본 발명에 개시한다(도 1A 및 6A). 예시적인 아세토아세틸-CoA 티올라제 효소는 에스케리키아 콜라이로부터의 atoB 및 상동기관 yqeF(문헌[Martin et al., Nat . Biotechnol 21:796-802 (2003)]), 클로스트리디움 아세토부틸리쿰으로부터의 thlA 및 thlB(문헌[Hanai et al., Appl Environ Microbiol 73:7814-7818 (2007)]; 문헌[Winzer et al., J.Mol.Microbiol Biotechnol 2:531-541 (2000)]), 및 사카로마이세스 세레비지아에로부터의 ERG10(문헌[Hiser et al., J. Biol . Chem . 269:31383-31389 (1994)])의 유전자 산물을 포함한다. 사카로마이세스 세레비지아에의 변성 티올라제는 POT1에 의해 암호화된다. 또 다른 후보 티올라제는 랄스토니아 유트로파의 phaA 유전자 산물이다(문헌[Jenkins et al, Journal of Bacteriology 169:42-52 (1987)]). 주글로에아 라미게라로부터의 아세토아세틸-CoA 티올라제는 생합성 방향으로 비가역적이며 결정 구조를 입수할 수 있다(문헌[Merilainen et al, Biochem 48: 11011-25 (2009)]). 이들 티올라제 및 상동기관들의 수탁번호는 하기 표에 포함되어 있다.
Figure pct00078
다수의 티올라제 효소들이 보다 긴 쇄의 아실-CoA 산물의 형성을 촉매화한다. 예시적인 티올라제는 예를 들어 3-옥소아디필-CoA 티올라제(EC 2.3.1.174) 및 아실-CoA 티올라제(EC 2.3.1.16)를 포함한다. 3-옥소아디필-CoA 티올라제는 숙시닐-CoA 및 아세틸-CoA를 3-옥소아디필-CoA로 전환시키며, 방향족 화합물 분해에 대한 베타-케토아디페이트 경로의 핵심 효소이다. 상기 효소는 슈도모나스 푸티다(문헌[Harwood et al., J Bacteriol . 176:6479-6488 (1994)]) 및 애시네토박터 칼코아세티쿠스(문헌[Doten et al., J Bacteriol . 169:3168-3174 (1987)])를 포함한 토양 세균 및 진균에 만연되어 있다. 슈도모나스 균주 B13 중의 pcaF(문헌[Kaschabek et al., J Bacteriol . 184:207-215 (2002)]), 슈도모나스 푸티다 U 중의 phaD(문헌[Olivera et al., Proc . Natl . Acad . Sci U.S.A 95:6419-6424 (1998)]), 슈도모나스 플루오레센스 ST 중의 paaE(문헌[Di et al., Arch . Microbiol 188:117-125 (2007)]), 및 에스케리키아 콜라이로부터의 paaJ(문헌[Nogales et al., Microbiology 153:357-365 (2007)])에 의해 암호화된 유전자 산물들이 또한 상기 형질전환을 촉매화한다. 다수의 베타-케토티올라제들이 슈도모나스 푸티다로부터의 bkt, 슈도모나스 아에루기노사 PAO1로부터의 pcaF 및 bkt, 부르크홀데리아 암비파리아 AMMD로부터의 bkt, 에스케리키아 콜라이로부터의 paaJ, 및 슈도모나스 푸티다로부터의 phaD를 포함하여 옥소아디필-CoA 형성 방향으로 현저하고 선택적인 활성을 나타낸다. 유전자 bktB 및 bktC에 의해 암호화된, 랄스토니아 유트로파(이전에는 알칼리게네스 유트로프스로서 공지됨)의 2개의 유전자 산물이 3-옥소피멜로일-CoA의 형성을 촉매화한다(문헌[Slater et al., J.Bacteriol. 180:1979-1987 (1998)]; 문헌[Haywood et al., FEMS Microbiology Letters 52:91-96 (1988)]). 상기 BktB 단백질의 서열은 공지되어 있으나; 상기 BktC 단백질의 서열은 보고되지 않았다. BktB는 또한 길이 C6 및 C8의 기질상에서 활성이다(문헌[Machado et al, Met Eng in press (2012)]). 로도슈도모나스 팔루스트리스의 pim 오페론이 또한, pimB에 의해 암호화되고, 벤조일-CoA 분해 동안 변성 방향으로 상기 형질전환을 촉매화하는 것으로 예측된 베타-케토티올라제를 암호화한다(문헌[Harrison et al., Microbiology 151:727-736 (2005)]). 신트로푸스 애시디트로피쿠스에서 베타-케토티올라제 효소 후보가 bktB에 대한 서열 상동성에 의해 동정되었다(43% 일치성, e값 = 1e-93).
Figure pct00079
지방 산 분해의 베타-산화 주기에 관련된 아실-CoA 티올라제(EC 2.3.1.16) 효소는 다양한 쇄 길이의 광범위한 아실-CoA 기질에 대해 활성을 나타낸다. 예시적인 아실-CoA 티올라제는 아라비도프시스 탈리아나(문헌[Cruz et al, Plant Physiol 135:85-94 (2004)]), 호모 사피엔스(문헌[Mannaerts et al, Cell Biochem Biphys 32:73-87 (2000)]), 헬리안투스 안누우스(문헌[Schiedel et al, Prot Expr Purif 33:25-33 (2004)])에서 발견된다. 티올라제 효소들의 쇄 길이 특이성은 당해 분야에 널리 공지된 방법들에 의해 분석될 수 있다(문헌[Wrensford et al, Anal Biochem 192:49-54 (1991)]). 래트 간에서 발견된 페록시솜 티올라제는 옥타노일-CoA로부터 보다 긴 장쇄 아실-CoA 산물의 아세틸-CoA 의존적인 형성을 촉매화한다(문헌[Horie et al, Arch Biochem Biophys 274: 64-73 (1989)]; 문헌[Hijikata et al, J Biol Chem 265, 4600-4606 (1990)]).
Figure pct00080
아세토아세틸-CoA는 또한 아세토아세틸-CoA 신타제(EC 2.3.1.194)에 의해 아세틸-CoA 및 말로닐-CoA로부터 합성될 수 있다. 상기 효소(FhsA)는 토양 세균 스트렙토마이세스 스피시즈 CL190(이때 상기는 메발로네이트 생합성에 참여한다)에서 특성화되었다(문헌[Okamura et al, PNAS USA 107:11265-70(2010)]). 상기 효소가 필수적으로 비가역적인 반응을 촉매화함에 따라, 상기 효소는 장쇄 알콜과 같은 아세토아세틸-CoA로부터 유도되는 대사산물, 연료 또는 화학물질을 과잉생산하기 위한 대사 공학 용도에 특히 유용하다. 다른 아세토아세틸-CoA 신타제 유전자들이 fhsA에 대한 서열 상동성에 의해 동정될 수 있다. 아실-CoA 신타제 효소, 예를 들어 fhsA 및 상동기관이 당해 분야에 공지된 방법에 의해 보다 긴 아실-CoA 기질을 수용하도록 가공되거나 진화될 수 있다.
Figure pct00081
상술한 선택된 티올라제 효소의 쇄 길이 선택성을 하기 표에 요약한다.
Figure pct00082
단계 B. 3- 옥소아실 - CoA 리덕타제
3-옥소아실-CoA 리덕타제들(또한 3-하이드록시아실-CoA 데하이드로게나제, 3-케토아실-CoA 리덕타제, 베타-케토아실-CoA 리덕타제, 베타-하이드록시아실-CoA 데하이드로게나제, 하이드록시아실-CoA 데하이드로게나제, 및 케토아실-CoA 리덕타제로서 공지됨)은 3-옥소아실-CoA 기질의 3-하이드록시아실-CoA 산물로의 환원을 촉매화한다(도 1B 및 도 6B). 이들 효소는 종종 지방 산 베타-산화 및 방향족 분해 경로에 관련된다. 예를 들어, fadB 및 fadJ에 의해 암호화되는, 에스케리키아 콜라이 중의 2개의 지방 산 산화 복합체의 서브유닛은 3-하이드록시아실-CoA 데하이드로게나제로서 작용한다(문헌[Binstock et al., Methods Enzymol. 71 Pt C:403-411 (1981)]). fadR에 의해 암호화된 음성 조절인자의 녹아웃을 사용하여 fadB 유전자 산물을 활성화시킬 수 있다(문헌[Sato et al., J Biosci.Bioeng 103:38-44(2007)]). 에스케리키아 콜라이로부터의 또 다른 3-하이드록시아실-CoA 데하이드로게나제는 paaH이다(문헌[Ismail et al., European Journal of Biochemistry 270:3047-3054 (2003)]). 추가의 3-옥소아실-CoA 효소는 슈도모나스 푸티다 중의 phaC(문헌[Olivera et al., Proc . Natl . Acad . Sci U.S.A 95:6419-6424 (1998)]) 및 슈도모나스 플루오레센스 중의 paaC(문헌[Di et al., 188:117-125 (2007)])의 유전자 산물을 포함한다. 이들 효소는 페닐아세테이트 또는 스타이렌의 이화작용 동안 3-하이드록시아디필-CoA의 3-옥소아디필-CoA로의 가역적인 산화를 촉매화한다. 다른 적합한 효소 후보는 유글레나 그라실리스로부터의 AAO72312.1(문헌[Winkler et al., Plant Physiology 131:753-762 (2003)]) 및 슈도모나스 푸티다로부터의 paaC(문헌[Olivera et al., PNAS USA 95:6419-6424 (1998)])를 포함한다. 아세토아세틸-CoA의 3-하이드록시부티릴-CoA로의 환원을 촉매화하는 효소는 클로스트리디움 아세토부틸리쿰의 hbd(문헌[Youngleson et al., J Bacteriol . 171:6800-6807 (1989)]), 주글로에아 라미게라로부터의 phbB(문헌[Ploux et al., Eur .J Biochem . 174:177-182 (1988)]), 로도박터 스파에로이데스로부터의 phaB(문헌[Alber et al., Mol.Microbiol 61:297-309 (2006)]) 및 랄스토니아 유트로파로부터의 paaH1(문헌[Machado et al, Met Eng, In Press(2012)])을 포함한다. 상기 주글로에아 라미게라 효소는 NADPH-의존성이며 기질로서 3-옥소프로피오닐-CoA를 또한 수용한다(문헌[Ploux et al., Eur .J Biochem . 174:177-182 (1988)]). 추가적인 유전자는 파라코커스 데니트리피칸스의 phaB, 클로스트리디움 클루이베리의 Hbd1(C-말단 도메인) 및 Hbd2(N-말단 도메인)(문헌[Hillmer and Gottschalk, Biochim . Biophys . Acta 3334:12-23 (1974)]) 및 보스 타우루스의 HSD17B10(문헌[Wakil et al., J Biol.Chem. 207:631-638 (1954)])을 포함한다. 파라코커스 데니트리피칸스로부터의 효소는 에스케리키아 콜라이에서 기능적으로 발현되고 특성화되었다(문헌[Yabutani et al., FEMS Microbiol Lett . 133:85-90 (1995)]). 다수의 유사한 효소들이 클로스트리디아의 다른 종들 및 메탈로스파에라 세둘라에서 발견되었다(문헌[Berg et al., Science . 318:1782-1786 (2007)]). 칸디다 트로피칼리스로부터의 효소는 페록시솜 지방 산 베타-산화 다기능성 효소 유형 2(MFE-2)의 성분이다. 상기 단백질의 데하이드로게나제 B 도메인은 아세토아세틸-CoA상에서 촉매적으로 활성이다. 상기 도메인은 에스케리키아 콜라이에서 기능적으로 발현되었으며, 결정 구조를 입수할 수 있고, 촉매 기전은 충분히 이해되어 있다(문헌[Ylianttila et al., Biochem Biophys Res Commun 324:25-30 (2004)]; 문헌[Ylianttila et al., J Mol Biol 358:1286-1295 (2006)]). 보다 긴 아실-CoA 기질(예를 들어 EC 1.1.1.35)을 수용하는 3-하이드록시아실-CoA 데하이드로게나제는 전형적으로 베타-산화와 관련된다. 일례는 보스 타우루스의 HSD17B10이다(문헌[Wakil et al., J Biol.Chem. 207:631-638 (1954)]). 돼지 간 효소가 단쇄 및 중간쇄 아실-CoA 기질상에서 우선적으로 활성인 반면, 심장 효소는 덜 선택성이다(문헌[He et al, Biochim Biophys Acta 1392:119-26 (1998)]). 사카로마이세스 세레비지아에 효소 FOX2는 베타-분해 경로에서 활성이고 또한 에노일-CoA 하이드라타제 활성을 갖는다(문헌[Hiltunen et al, J Biol Chem 267: 6646-6653 (1992)]).
Figure pct00083
선택된 하이드록시아실-CoA 데하이드로게나제 효소의 쇄 길이 특이성을 하기에 나타낸다. 방향 진화는 보다 긴 장쇄 기질에 대한 효소들의 선택성을 증대시킬 수 있다. 예를 들어, 마차도(Machado)와 동료들은 보다 긴 아실-CoA 기질에 유리한 쇄 신장 효소의 방향 진화를 위한 선택 플랫폼을 개발하였다. 상기 군은 3-옥소-헥사노일-CoA에 대한 개선된 활성을 위해 랄스토니아 유트로파의 paaH1을 진화시켰다(문헌[Machado et al, Met Eng, In Press (2012)).
Figure pct00084
단계 C. 3- 하이드록시아실 - CoA 데하이드라타제
3-하이드록시아실-CoA 데하이드라타제(예를 들어 EC 4.2.1.17, 또한 에노일-CoA 하이드라타제로서 공지됨)는 일련의 3-하이드록시아실-CoA 기질의 재수화를 촉매화하며(문헌[Roberts et al., Arch . Microbiol 117:99-108 (1978)]; 문헌[Agnihotri et al., Bioorg . Med . Chem . 11:9-20 (2003)]; 문헌[Conrad et al., J Bacteriol. 118:103-111 (1974)]) 3-하이드록시아실-CoA의 에노일-CoA로의 전환에 사용될 수 있다(도 1C 및 도 6C). 슈도모나스 푸티다의 ech 유전자 산물은 3-하이드록시부티릴-CoA의 크로토닐-CoA로의 전환을 촉매화한다(문헌[Roberts et al., Arch.Microbiol 117:99-108 (1978)]). 이러한 형질전환은 또한 클로스트리디움 아세토부틸리쿰의 crt 유전자 산물, 클로스트리디움 클루이베리의 crt1 유전자 산물, 및 다른 클로스트리디움 유기체에 의해 촉매화된다(문헌[Atsumi et al., Metab Eng 10:305-311 (2008)]; 문헌[Boynton et al., J Bacteriol . 178:3015-3024 (1996)]; 문헌[Hillmer et al., FEBS Lett . 21:351-354 (1972)]). 추가적인 에노일-CoA 하이드라타제 후보는 슈도모나스 푸티다의 phaA 및 phaB, 및 슈도모나스 플루오레센스로부터의 paaA 및 paaB이다(문헌[Olivera et al., Proc . Natl . Acad . Sci U.S.A 95:6419-6424 (1998)]). 로도슈도모나스 팔루스트리스 중의 pimF의 유전자 산물은 피멜로일-CoA 분해에 참여하는 에노일-CoA 하이드라타제를 암호화하는 것으로 예측된다(문헌[Harrison et al., Microbiology 151:727-736 (2005)]). 마지막으로, 다수의 에스케리키아 콜라이 유전자들이 에노일-CoA 하이드라타제 기능, 예를 들어 maoC(문헌[Park et al., J Bacteriol . 185:5391-5397 (2003)]), paaF(문헌[Ismail et al., Eur .J Biochem . 270:3047-3054 (2003)]; 문헌[Park et al., Appl.Biochem.Biotechnol 113-116:335-346 (2004)]; 문헌[Park et al., Biotechnol Bioeng 86:681-686 (2004)]) 및 paaG(문헌[Ismail et al., Eur .J Biochem . 270:3047-3054 (2003)]; 문헌[Park and Lee, Appl . Biochem . Biotechnol 113-116:335-346 (2004)]; 문헌[Park and Yup, Biotechnol Bioeng 86:681-686(2004)])를 입증하는 것으로 나타났다. 사카로마이세스 세레비지아에에서 3-하이드록시아실-CoA 데하이드라타제 활성을 갖는 효소는 PHS1 및 FOX2를 포함한다.
Figure pct00085
베타-산화와 관련된 에노일-CoA 하이드라타제를 또한 지방 알콜, 지방 알데하이드 및 지방 산 생합성 경로에 사용할 수 있다. 예를 들어, 아라비도프시스 탈리아나의 다기능성 MFP2 유전자 산물은 C14 이하의 쇄 길이에 대해 선택성인 에노일-CoA 리덕타제 활성을 나타낸다(문헌[Arent et al, J Biol Chem 285:24066-77 (2010)]). 다르게는, fadA 및 fadB의 에스케리키아 콜라이 유전자 산물은 에노일-CoA 하이드라타제 활성을 나타내는 지방 산 산화와 관련된 다중효소 복합체를 암호화한다(문헌[Yang et al., Biochemistry 30:6788-6795 (1991)]; 문헌[Yang, J Bacteriol. 173:7405-7406 (1991)]; 문헌[Nakahigashi et al., Nucleic Acids Res. 18:4937 (1990)]). fadI 및 fadJ 유전자는 유사한 기능을 암호화하며 혐기성 조건하에서 자연적으로 발현된다(문헌[Campbell et al., Mol . Microbiol 47:793-805 (2003)]).
Figure pct00086
선택된 3-하이드록시아실-CoA 데하이드라타제 효소의 쇄 길이 특이성을 하기에 나타낸다.
Figure pct00087
단계 D. 에노일 - CoA 리덕타제
에노일-CoA 리덕타제(또한 아실-CoA 데하이드로게나제, 트랜스-2-에노일-CoA 리덕타제, 또는 아실-CoA 옥시도리덕타제로서 공지됨)는 에노일-CoA의 아실-CoA로의 전환을 촉매화한다(도 1 및 6의 단계 D). 예시적인 아실-CoA 데하이드로게나제 또는 에노일-CoA 리덕타제(ECR) 효소는 에스케리키아 콜라이 및 살모넬라 엔테리카의 fadE의 유전자 산물이다(문헌[Iram et al, J Bacteriol 188:599-608 (2006)]). 클로스트리디움 아세토부틸리쿰으로부터의 bcd 유전자 산물(문헌[Atsumi et al., 10:305-311 (2008)]; 문헌[Boynton et al., J Bacteriol . 178:3015-3024 (1996)])은 크로토닐-CoA의 부티릴-CoA(EC 1.3.99.2)로의 환원을 촉매화한다. 상기 효소는 클로스트리디움 종에서 부티레이트로의 아세틸-CoA 발효 경로에 참여한다(문헌[Jones et al., Microbiol Rev . 50:484-524 (1986)]). 부티릴-CoA 리덕타제의 활성은, 전자 수송 플라보단백질을 암호화하는, 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 etfAB 유전자의 발현과 함께 bcd를 발현시킴으로써 증대될 수 있다. 에노일-CoA 리덕타제 단계에 대한 추가적인 후보는 유글레나 그라실리스로부터의 에노일-CoA 리덕타제(EC 1.3.1.44) TER이다(문헌[Hoffmeister et al., J Biol . Chem 280:4329-4338 (2005)]). 미토콘드리아 표적화 리더 서열의 제거에 따라 상기 서열로부터 유도된 구조물을 에스케리키아 콜라이에 클로닝하여 활성 효소를 생성시켰다. TDE0597에 의해 암호화된, 원핵생물 트레포네마 덴티콜라로부터의 ECR 단백질의 가까운 상동기관이 또한 에스케리키아 콜라이에서 클로닝되고 발현되었다(문헌[Tucci et al., FEBS Lett, 581:1561-1566 (2007)]). 신트로푸스 애시디트로피쿠스에서 6개의 유전자가 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 bcd 유전자 산물에 대한 서열 상동성에 의해 동정되었다. 상기 신트로푸스 애시디트로피쿠스 유전자 syn _02637 및 syn _02636은 클로스트리디움 아세토부틸리쿰의 etfAB 유전자에 대해 높은 서열 상동성을 가지며, 전자 수송 플라보 단백질의 알파 및 베타 서브유닛을 암호화하는 것으로 예측된다.
Figure pct00088
추가적인 에노일-CoA 리덕타제 효소 후보들이 방향족 화합물을 분해하는 유기체에서 발견된다. 벤조에이트 분해에 대한 모델 유기체인 로도슈도모나스 팔루스트리스는 피멜로일-CoA의 베타-산화를 통해 피멜레이트를 분해하는 효소 능력을 갖는다. pim 오페론, pimC 및 pimD에서 인접한 유전자들은 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 bcd에 대해 서열 상동성을 가지며 플라빈-함유 피멜로일-CoA 데하이드로게나제를 암호화하는 것으로 예측된다(문헌[Harrison et al., 151:727-736 (2005)]). 질소-고정 대두 공생체 브라디리조븀 자포니쿰의 게놈이 또한 로도슈도모나스 팔루스트리스의 pimC 및 pimD에 대해 높은 서열 유사성을 갖는 유전자들로 구성된 pim 오페론을 함유한다(문헌[Harrison and Harwood, Microbiology 151:727-736 (2005)]).
Figure pct00089
추가의 후보는 입체 장애 트랜스-에노일-CoA 기질의 환원을 촉매화하는 효소인 2-메틸-분지쇄 에노일-CoA 리덕타제(EC 1.3.1.52 및 EC 1.3.99.12)이다. 상기 효소는 선충류 아스카리스 수움(Ascaris suum)에서의 분지쇄 지방 산 합성에 참여하며 2-메틸발레릴-CoA, 2-메틸부타노일-CoA, 2-메틸펜타노일-CoA, 옥타노일-CoA 및 펜타노일-CoA를 포함한 다양한 선형 및 분지쇄 기질들을 환원시킬 수 있다(문헌[Duran et al., 268:22391-22396 (1993)]). 유전자 acad1 및 acad에 의해 암호화된, 상기 효소의 2개의 동형이 특성화되었다.
Figure pct00090
3개 이상의 미토콘드리아 에노일-CoA 리덕타제 효소가 유글레나 그라실리스 중에 존재하고 이를 본 발명에 사용하기 위해 적용할 수 있다. 유글레나 그라실리스의 3개의 미토콘드리아 에노일-CoA 리덕타제 효소(ECR1-3)는 상이한 쇄 길이 선호(문헌[Inui et al., European Journal of Biochemistry 142:121-126 (1984)])를 나타내며, 이는 목적하는 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 생성물의 쇄 길이를 지정하는데 특히 유용하다. EST의 ELL00002199, ELL00002335, 및 ELL00002648(이들은 모두 미토콘드리아 트랜스-2-에노일-CoA 리덕타제로서 주석이 달린다)을 사용하여 당해 분야에 공지된 방법에 의해 이들 추가적인 에노일-CoA 리덕타제 유전자를 단리시킬 수 있다. 래트 간 마이크로솜으로부터 2개의 ECR 효소가 또한 상이한 기질 특이성을 나타낸다(문헌[Nagi et al, Arch Biochem Biophys 226:50-64 (1983)]). 이들 효소의 서열은 지금까지 동정되지 않았다. 마이코박테리움 스메그마티스 에노일-CoA 리덕타제는 C10 -16의 쇄 길이의 아실-CoA 기질들을 수용한다(문헌[Shimakata et al, J Biochem 89:1075-80 (1981)]).
에노일-CoA 리덕타제들 및 이들의 쇄 길이 특이성을 하기 표에 나타낸다.
Figure pct00091
단계 E. 아실- CoA 리덕타제 ( 알데하이드 -형성)
아실-CoA의 지방 알콜로의 환원은 아실-CoA 리덕타제 및 알콜 데하이드로게나제 활성을 나타내는 단일 효소 또는 한 쌍의 효소에 의해 촉매화된다. 아실-CoA를 그의 상응하는 알데하이드로 환원시키는 아실-CoA 데하이드로게나제는 지방 아실-CoA 리덕타제(EC 1.2.1.42, 1.2.1.50), 숙시닐-CoA 리덕타제(EC 1.2.1.76), 아세틸-CoA 리덕타제, 부티릴-CoA 리덕타제 및 프로피오닐-CoA 리덕타제(EC 1.2.1.3)를 포함한다. 아실-CoA, 3-하이드록시아실-CoA 및 3-옥소아실-CoA 기질에 대해 입증된 활성을 갖는 알데하이드 형성 아실-CoA 리덕타제 효소들이 문헌에 공지되어 있다. 다수의 아실-CoA 리덕타제 효소가 3-하이드록시아실-CoA 기질상에서 활성이다. 예를 들어, 클로스트리디움 유기체로부터의 일부 부티릴-CoA 리덕타제는 3-하이드록시프로피오닐-CoA상에서 활성이고, 락토바실러스 류테리의 프로피오닐-CoA 리덕타제는 3-하이드록시프로피오닐-CoA상에서 활성이다. 3-옥소아실-CoA 기질의 그의 상응하는 알데하이드로의 전환을 위한 효소는 말로닐-CoA 리덕타제이다. 에노일-CoA 기질상에서 활성을 나타내는 상기 부류의 효소들은 지금까지 동정되지 않았다. 특정 기질에 대한 특이성을 당해 분야에 공지된 진화 또는 효소 공학 방법을 사용하여 상세히 논할 수 있다.
예시적인 지방 아실-CoA 리덕타제 효소는 애시네토박터 칼코아세티쿠스(문헌[Reiser, Journal of Bacteriology 179:2969-2975 (1997)]) 및 애시네토박터 스피시즈 M-1(문헌[Ishige et al., Appl. Environ. Microbiol. 68:1192-1195 (2002)])의 acr1에 의해 암호화된다. 마이코박테리움 튜베르큘로시스로부터의 2개의 유전자 산물은 길이 C16 -18의 보다 긴 장쇄 아실-CoA 기질을 수용한다(문헌[Harminder Singh, U. Central Florida (2007)]). 더욱 또 다른 아실-CoA 리덕타제는 포토박테리움 포스포레움의 LuxC이다(문헌[Lee et al, Biochim Biohys Acta 1388:215-22 (1997)]). 숙시닐-CoA 리덕타제 활성을 갖는 효소는 클로스트리디움 클루이베리의 sucD(문헌[Sohling, J. Bacteriol. 178:871-880 (1996)]) 및 포르피로모나스 진지발리스의 sucD(문헌[Takahashi, J. Bacteriol 182:4704-4710 (2000)])에 의해 암호화된다. 추가의 숙시닐-CoA 리덕타제 효소는 메탈로스파에라 세둘라(문헌[Berg et al., Science 318:1782-1786 (2007)]) 및 써모프로테우스 뉴트로필루스(문헌[Ramos-Vera et al., J Bacteriol, 191:4286-4297 (2009)])를 포함한 호열성 고세균의 3-하이드록시프로피오네이트/4-하이드록시부티레이트 주기에 참여한다. Msed_0709에 의해 암호화된 메탈로스파에라 세둘라 효소는 엄격하게 NADPH-의존성이며 또한 말로닐-CoA 리덕타제 활성을 갖는다. 상기 써모프로테우스 뉴트로필루스 효소는 NADPH 및 NADH 모두와 활성이다. bphG에 의해 암호화된, 슈도모나스 스피시즈 중의 아실화 아세트알데하이드 데하이드로게나제 효소는, 상기 효소가 아세트알데하이드, 프로피온알데하이드, 부티르알데하이드, 아이소부티르알데하이드 및 폼알데하이드를 산화시키고 아실화시키는 것으로 입증되었기 때문에 더욱 또 다른 것이다(문헌[Powlowski, J. Bacteriol. 175:377-385 (1993)]). 아세틸-CoA의 에탄올로의 환원 외에, 류코노스톡 메센테로이데스에서 adhE에 의해 암호화된 효소는 분지쇄 화합물 아이소부티르알데하이드를 아이소부티릴-CoA로 산화시키는 것으로 나타났다(문헌[Kazahaya, J. Gen . Appl . Microbiol. 18:43-55 (1972)]; 및 문헌[Koo et al., Biotechnol Lett. 27:505-510 (2005)]). 부티르알데하이드 데하이드로게나제는 용매발생성 유기체, 예를 들어 클로스트리디움 사카로페르부틸아세토니쿰에서 유사한 반응인 부티릴-CoA의 부티르알데하이드로의 전환을 촉매화한다(문헌[Kosaka et al., Biosci Biotechnol Biochem., 71:58-68 (2007)]). 예시적인 프로피오닐-CoA 리덕타제 효소는 살모넬라 티피뮤리움 LT2의 pduP(문헌[Leal, Arch. Microbiol. 180:353-361 (2003)]) 및 에스케리키아 콜라이의 eutE(스크랠리(Skraly), WO 특허 제 2004/024876 호)를 포함한다. 상기 살모넬라 티피뮤리움 LT2의 프로피오닐-CoA 리덕타제(프로피오닐-CoA를 프로피온알데하이드로 자연적으로 전환시킨다)는 또한 5-하이드록시발레릴-CoA의 5-하이드록시펜탄알로의 환원을 촉매화한다(제 WO 2010/068953 A2 호). 락토바실러스 류테리의 프로피온알데하이드 데하이드로게나제, PduP는 부티르알데하이드, 발레르알데하이드 및 3-하이드록시프로피온알데하이드를 포함하는 넓은 기질 범위를 갖는다(문헌[Luo et al, Appl Microbiol Biotech, 89: 697-703 (2011)]). 또한, 일부 아실-ACP 리덕타제 효소, 예를 들어 시네코코커스 엘론가투스 PCC7942의 orf1594 유전자 산물은 또한 알데하이드-형성 아실-CoA 리덕타제 활성을 나타낸다(문헌[Schirmer et al, Science, 329: 559-62 (2010)]). 아실-ACP 리덕타제 효소 및 상동기관을 실시예 IX에 더욱 상세히 개시한다.
Figure pct00092
아실-CoA를 그의 상응하는 알데하이드로 전환시키는 추가적인 효소 유형은 말로닐-CoA 리덕타제이며, 상기 효소는 말로닐-CoA를 말론산 세미알데하이드로 형질전환시키는 말로닐-CoA 리덕타제이다. 말로닐-CoA 리덕타제는 호열호산성 고세균에서 3-하이드록시프로피오네이트 주기를 통한 독립영양성 탄소 고정에 핵심 효소이다(문헌[Berg, Science 318:1782-1786 (2007)]; 및 문헌[Thauer, Science 318:1732-1733 (2007)]). 상기 효소는 보조인자로서 NADPH를 사용하며, 메탈로스파에라 및 설포로부스 스피시즈에서 특성화되었다(문헌[Alber et al., J. Bacteriol. 188:8551-8559 (2006)]; 및 문헌[Hugler, J. Bacteriol. 184:2404-2410 (2002)]). 상기 효소는 메탈로스파에라 세둘라에서 Msed _0709에 의해 암호화된다(문헌[Alber et al., J. Bacteriol. 188:8551-8559 (2006)]; 및 문헌[Berg, Science 318:1782-1786 (2007)]). 설포로부스 토코다이이로부터 말로닐-CoA 리덕타제를 암호화하는 유전자가 에스케리키아 콜라이에서 클로닝되고 이종 발현되었다(문헌[Alber et al., J. Bacteriol 188:8551-8559 (2006)]). 상기 효소는 또한 메틸말로닐-CoA의 그의 상응하는 알데하이드로의 전환을 촉매화하는 것으로 나타났다(제 WO 2007/141208 호(2007)). 이들 효소의 알데하이드 데하이드로게나제 작용성은 클로로플렉수스 아우란티아쿠스로부터의 이작용성 데하이드로게나제와 유사하지만, 서열 유사성은 거의 없다. 2개의 말로닐-CoA 리덕타제 효소 후보는 모두, 아스파틸-4-포스페이트의 아스파테이트 세미알데하이드로의 환원 및 동반 탈인산화를 촉매화하는 효소인 아스파테이트-세미알데하이드 데하이드로게나제와 높은 서열 유사성을 갖는다. 추가적인 유전자 후보들이 설포로부스 솔파타리쿠스 및 설포로부스 애시도칼다리우스를 포함한 다른 유기체 중의 단백질들에 대한 서열 상동성에 의해 발견될 수 있으며, 하기에 나열되었다. CoA-아실화 알데하이드 데하이드로게나제에 대한 더욱 또 다른 후보는 클로스트리디움 베이제린키이로부터의 ald 유전자이다(문헌[Toth, Appl . Environ . Microbiol. 65:4973-4980 (1999)]). 상기 효소는 아세틸-CoA 및 부티릴-CoA를 이들의 상응하는 알데하이드로 환원시키는 것으로 보고되었다. 상기 유전자는 살모넬라 티피뮤리움 및 에스케리키아 콜라이의 아세트알데하이드 데하이드로게나제를 암호화하는 eutE와 매우 유사하다(문헌[Toth, Appl. Environ. Microbiol. 65:4973-4980 (1999)]).
Figure pct00093
선택된 알데하이드-형성 아실-CoA 리덕타제 효소의 쇄 길이 특이성 범위를 하기 표에 나타낸다.
Figure pct00094
단계 G. 아실- CoA 리덕타제 ( 알콜 -형성)
이작용성 알콜-형성 아실-CoA 리덕타제 효소는 도 1 및 6의 단계 G(즉 단계 E 및 F)를 촉매화한다. 상기 활성을 갖는 효소들은 에스케리키아 콜라이의 adhE(문헌[Kessler et al., FEBS . Lett . 281:59-63 (1991)]) 및 클로스트리디움 아세토부틸리쿰의 adhE2(문헌[Fontaine et al., J. Bacteriol . 184:821-830 (2002)])를 포함한다. 상기 에스케리키아 콜라이 효소는 C2 기질상에서 활성인 반면, 상기 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 효소는 C2 -8에 걸쳐있는 넓은 기질 범위를 갖는다(문헌[Dekishima et al, J Am Chem Soc 133:11399-11401 (2011)]). bdh I 및 bdh II에 의해 암호화된 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 효소들(문헌[Walter, et al., J. Bacteriol. 174:7149-7158 (1992)])은 아세틸-CoA 및 부티릴-CoA를 각각 에탄올 및 부탄올로 환원시킨다. 류코노스톡 메센테로이데스로부터의 adhE 유전자 산물은 아세틸-CoA 및 아이소부티릴-CoA상에서 활성이다(문헌[Kazahaya et al., J.Gen.Appl.Microbiol. 18:43-55 (1972)]; 문헌[Koo et al., Biotechnol Lett , 27:505-510 (2005)]). 로세이플렉수스 카스텐홀지이, 에리쓰로박터 스피시즈 NAP1 및 해양 감마 프로테오박테리움 HTCC2080을 포함한 다른 유기체들 중의 효소 후보들이 서열 유사성에 의해 추론될 수 있다. 보다 긴 쇄 아실-CoA 분자들이 알콜-형성 지방 아실-CoA 리덕타제를 암호화하는 호호바(심몬드시아 키넨시스) FAR과 같은 효소들에 의해 그들의 상응하는 알콜로 환원될 수 있다. 에스케리키아 콜라이에서의 그의 과발현은 FAR 활성 및 C16 -18 지방 알콜의 축적을 생성시켰다(문헌[Metz, Plant Physiology, 122:635-644(2000)]). 아라비도프시스 탈리아나의 FAR 효소들은 At3g11980 및 At3g44560(문헌[Doan et al, J Plant Physiol 166 (2006)])의 유전자 산물을 포함한다. 이작용성 원핵생물 FAR 효소들은 마리노박터 아쿠아에올레이 VT8(문헌[Hofvander et al, FEBS Lett 3538-43 (2011)]), 마리노박터 알기콜라 및 오세아노박터 균주 RED65(미국특허공개 제 2011/0000125 호)에서 발견된다. 다른 적합한 효소는 봄빅스 모리로부터의 bfar , 무스 무스쿨루스로부터의 mfar1 및 mfar2; 무스 무스쿨루스로부터의 mfar2; 애시네토박터 스피시즈 M1로부터의 acrM1; 및 호모 사피엔스로부터의 hfar을 포함한다.
Figure pct00095
선택된 알콜-형성 아실-CoA 리덕타제 효소의 쇄 길이 특이성 범위를 하기 표에 나타낸다.
Figure pct00096
단계 F. 지방 알데하이드 리덕타제
알데하이드의 알콜로의 전환을 촉매화하는 효소(즉 알콜 데하이드로게나제 또는 동등하게 알데하이드 리덕타제)를 암호화하는 예시적인 유전자는 C2 -14의 경우 중간-쇄 알콜 데하이드로게나제를 암호화하는 alrA(문헌[Tani et al., Appl. Environ. Microbiol., 66:5231-5235(2000)]), 에스케리키아 콜라이로부터 yqhD 및 fucO(문헌[Sulzenbacher et al., 342:489-502(2004)]), 및 부티르알데하이드를 부탄올로 전환시키는 클로스트리디움 아세토부틸리쿰으로부터의 bdhI 및 bdhII(문헌[ Walter et al., Journal of Bacteriology, 174:7149-7158(1992)])를 포함한다. 상기 alrA 유전자 산물은 C14보다 긴 알데하이드상에서는 활성을 보이지 않았으며, 환원 방향을 촉진하였다(상기 문헌[Tani et al]). YqhD는 보조인자로서 NADPH를 사용하는 광범위한 알데하이드의 환원을 촉매화하며, 이때 C(3)를 초과하는 쇄 길이를 선호한다(문헌[Sulzenbacher et al, J Mol Biol 342:489-502 (2004)]; 문헌[Perez et al., J Biol.Chem. 283:7346-7353 (2008)]). 자이모모나스 모빌리스로부터의 adhA 유전자 산물은 폼알데하이드, 아세트알데하이드, 프로피온알데하이드, 부티르알데하이드, 및 아크롤레인을 포함한 다수의 알데하이드에 대해 활성을 갖는 것으로 입증되었다(문헌[Kinoshita et al., Appl. Microbiol. Biotechnol, 22:249-254(1985)]). 추가의 알데하이드 리덕타제 후보는 클로스트리디움 사카로페르부틸아세토니쿰에서 bdh 및 클로스트리디움 베이제린키이에서 Cbei _1722, Cbei_2181 및 Cbei _2421에 의해 암호화된다. 레이프소니아 스피시즈 S749로부터의 알콜 데하이드로게나는 길이 C6 -7의 중간쇄 길이 기질상에서 최대 활성을 나타낸다(문헌[Inoue et al, AEM 71: 3633-3641 (2005)]). 슈도모나스 푸티다의 adh 유전자 산물은 길이 C3 -10의 기질상에서 활성이다(문헌[Nagashima et al, J Ferment Bioeng 82:328-33(1996)]). 제오바실러스 써모데니트리피칸스의 알콜 데하이드로게나제 효소 ADH1 및 ADH2는 C30의 쇄 길이 이하의 알콜을 산화시킨다(문헌[Liu et al, Physiol Biochem 155:2078-85 (2009)]).
Figure pct00097
고유 알콜 데하이드로게나제는 또한 알데하이드 기질을 알콜 산물로 전환시킨다. 지금까지, 7개의 알콜 데하이드로게나제, ADHI 내지 ADHVII이 사카로마이세스 세레비지아에에서 보고되었다(문헌[de Smidt et al, FEMS Yeast Res 8:967-78 (2008)]). ADH1(GI:1419926)은 혐기성 조건하에서 시토솔에서 아세트알데하이드의 알콜로의 환원을 맡고 있는 핵심 효소이다. 클루이베로마이세스 락티스에서, 2개의 NAD-의존성 시토솔 알콜 데하이드로게나제가 동정되고 특성화되었다. 이들 유전자는 또한 다른 지방족 알콜에 대해 활성을 보인다. 유전자 ADH1(GI:113358) 및 ADHII(GI:51704293)는 글루코스-생육 세포에서 우선적으로 발현된다(문헌[Bozzi et al, Biochim Biophys Acta 1339:133-142 (1997)]). 시토솔 알콜 데하이드로게나제는 칸디다 알비칸스에서 ADH1(GI:608690)에 의해, 스키조사카로마이세스 폼베에서 ADH1(GI:3810864)에 의해, 야로위아 리포리티카에서 ADH1(GI:5802617)에 의해, 피키아 스티피티스 또는 셰페르소마이세스 스티피티스에서 ADH1(GI:2114038) 및 ADHII(GI:2143328)에 의해 암호화된다(문헌[Passoth et al, Yeast 14:1311-23 (1998)]). 후보 알콜 데하이드로게나제를 하기 표에 나타낸다.
Figure pct00098
선택된 알콜 데하이드로게나제 효소의 기질 특이성 범위를 하기 표에 나타낸다.
Figure pct00099
단계 O. 엘론가제
엘론가제(ELO) 효소는 말로닐-CoA를 사용하여 성장하는 아실-CoA 쇄에 C2 단위를 가한다. 상기 과정은 또한 데카복실화를 수반하며 따라서 주로 비가역적이다. 진핵생물 인간 기생균인 트리파노소마 브루세이는 엘론가제 시스템을 사용하여 장쇄 지방 산을 생산하는 것으로 공지되어 있다. 상기 과정은 부티릴-CoA에 의해 개시된다. 특히, 상기 ELO 시스템은 성장하는 지방 산쇄를 세균 및 다른 미생물 대응물들처럼 ACP 중간체보다는 CoA 중간체로 에스터화한다(문헌[Lee et al, Cell 126, 691-699, 2006]; 문헌[Cronan, Cell, 126, 2006]). 이는 말로닐-ACP로부터 아세토아세틸 아실-ACP의 형성에 따라 개시되는 전형적인 세균 지방 산 신장과 대조적이다. 지금까지, 동물 대응물과 상동성인 4개의 ELO(ELO1 내지 4에 의해 암호화됨)가 트리파노소마 브루세이에서 발견되었다(문헌[Lee et al, Nature Reviews Microbiology, Vol 5, 287-297, 2007]). ELO1 내지 3은 함께 C18 쇄 길이 이하의 포화된 지방 산의 합성을 맡고 있다. ELO1은 C4를 C10으로 전환시키고, ELO2는 상기 쇄 길이를 C10에서 미리스테이트(C14)로 연장시키고, ELO3은 미리스테이트를 C18로 연장시킨다. EL0 특이성에 있어서 일부 중복이 존재한다; 예를 들어 ELO1은 낮은 활성에도 불구하고, C10 프라이머를 C12로 연장시킬 수 있다. ELO4는 다중 불포화된 지방 산(PUFA)에 특이적인 ELO의 일례이다. 상기는 2개의 탄소 원자에 의해 아라키도네이트(C20:4)를 연장시킨다. 다수의 추가적인 ELO 효소들이 서열 상동성에 의해 밝혀질 수 있다(문헌[Lee et al, Nature Reviews Microbiology, Vol 5, 287-297, 2007]).
엘론가제 효소는 미토콘드리아, 소포체, 프로테오리포솜 및 페록시솜을 포함한 다수의 구획들에서 발견된다. 예를 들어, 일부 효모, 예를 들어 사카로마이세스 세레비지아에는 외인성 또는 내인성 아실-CoA 기질을 수용하는 미토콘드리아 엘론가제를 통해 쇄 길이 C16 이상의 장쇄 지방 산을 합성할 수 있다(문헌[Bessoule et al, FEBS Lett 214: 158-162 (1987)]). 상기 시스템은 활성을 위해 ATP를 필요로 한다. 소포체가 또한 다양한 길이의 아실-CoA 기질로부터 매우 긴 쇄의 지방 산(C18+)을 합성하기 위한 엘론가제 시스템을 갖는다(문헌[Kohlwein et al, Mol Cell Biol 21:109-25 (2001)]). 상기 시스템에 관련된 유전자들은 TSC13, ELO2 및 ELO3을 포함한다. ELO1은 C12 아실-CoA의 C16 -18 지방 산으로의 신장을 촉매화한다.
Figure pct00100
당해 분야의 숙련가들은 또한 입수할 수 있는 공급원으로부터 공지된 서열을 사용하여 클로닝에 의해 말로닐-CoA 독립적인 FAS 경로 또는 아실-환원 경로 효소 중 어느 하나 또는 전부를 암호화하는 핵산을 수득할 수 있다. 예를 들어, 상기 말로닐-CoA 독립적인 FAS 경로에 대한 암호화 핵산 중 어느 하나 또는 전부를, 상기 경로가 유글레나 그라실리스에서 잘 특성화되었으므로 상기 유기체로부터 당해 분야에 널리 공지된 방법을 사용하여 쉽게 수득할 수 있다. 유글레나 그라실리스 암호화 핵산을 예를 들어 공지된 서열의 탐침을 사용하여 유글레나 그라실리스 cDNA 라이브러리로부터 단리할 수 있다. 상기 탐침을 공개적으로 입수할 수 있는 서열 데이터베이스 TBestDB(http://tbestdb.bcm.umontreal.ca)로부터 하기 EST 서열로부터의 전체 또는 부분적인 DNA 서열로 설계할 수 있다. 상기 과정으로부터 생성된 핵산들을 적합한 발현 벡터에 삽입하고 에스케리키아 콜라이 또는 다른 미생물내로 형질전환시켜 본 발명의 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 생산 유기체를 생성시킬 수 있다.
티올라제(도 1A): ELL00002550, ELL00002493, ELL00000789
3-하이드록시아실-CoA 데하이드로게나제(도 1B): ELL00000206, ELL00002419, ELL00006286, ELL00006656
에노일-CoA 하이드라타제(도 1C): ELL00005926, ELL00001952, ELL00002235, ELL00006206
에노일-CoA 리덕타제(도 1D): ELL00002199, ELL00002335, ELL00002648
아실-CoA 리덕타제(도 1E; 1E/F): ELL00002572, ELL00002581, ELL00000108
다르게는, 상기 EST 서열들을 사용하여 BLAST 검색을 통해 젠뱅크에서 상동성 폴리펩타이드를 확인할 수 있다. 생성되는 상동성 폴리펩타이드들 및 이들의 상응하는 유전자 서열은 에스케리키아 콜라이 또는 다른 미생물내로의 형질전환을 위해 추가적인 암호화 핵산을 제공하여 본 발명의 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 생산 유기체를 생성시킨다. 하기에 본 발명의 비-천연 유기체에 사용하기 위해 적용될 수 있는 젠뱅크에서의 예시적인 상동성 폴리펩타이드들 및 이들의 유전자 수탁번호를 나열한다.
케토아실 - CoA 아실트랜스퍼라제 (또는 케토아실 - CoA 티올라제 )
Figure pct00101
3- 하이드록시아실 - CoA 데하이드로게나제
Figure pct00102
에노일 - CoA 하이드라타제
Figure pct00103
에노일 - CoA 리덕타제
Figure pct00104
상기 예시적인 암호화 핵산 외에, 본 발명의 MI-FAE 주기, MD-FAE 및/또는 종결 경로내의 핵산 이외의 핵산들을 또한 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산의 추가적인 생산을 위해 숙주 유기체에 도입시킬 수 있다. 예를 들어, 랄스토니아 유트로파 bktB 및 PhbB 유전자는 부티릴-CoA 및 아세틸-CoA의 축합을 촉매화하여 β-케토-헥사노일-CoA를 형성시키고 β-케토-헥사노일-CoA의 3-하이드록시-헥사노일-CoA로의 환원을 촉매화한다(문헌[Fukui et al., Biomacromolecules 3:618-624(2002)). 지방 알콜의 생산을 개선시키기 위해서, 상기 특정 효소를 암호화하는 외인성 DNA 서열을 관심 생산 숙주에서 발현시킬 수 있다. 더욱 또한, 상술한 효소에 방향 진화를 수행하여 높은 활성 및 높은 기질 특이성을 갖는 상기 효소의 개선된 버전을 생성시킬 수 있다. 유사한 접근법을 또한 본 발명의 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 생산 경로의 임의의 또는 모든 다른 효소 단계들과 함께 사용하여 효소 활성 및/또는 특이성을 개선시키고/시키거나 소정의 쇄 길이 또는 길이들의 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산을 생성시킬 수 있다.
실시예 II
시토솔 피루베이트로부터 시토솔 아세틸- CoA의 생성 경로
하기의 실시예는 도 2에 도시된 바와 같이, 시토솔 피루베이트 및 쓰레오닌의 시토솔 아세틸-CoA로의 전환을 위한 예시적인 경로들을 개시한다.
시토솔 피루베이트 및 쓰레오닌의 시토솔 아세틸-CoA로의 전환을 위한 경로는 아세틸-CoA로부터 기원하는 시토솔 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 생산 경로의 개발을 가능하게 할 수 있었다. 시토솔 피루베이트의 시토솔 아세틸-CoA로의 전환을 위한 다수의 경로들을 도 2에 도시한다. 피루베이트의 아세틸-CoA로의 직접 전환은 피루베이트 데하이드로게나제, 피루베이트 포메이트 라이아제, 피루베이트:PNAD(P) 옥시도리덕타제 또는 피루베이트:페레독신 옥시도리덕타제에 의해 촉매화될 수 있다. 피루베이트 포메이트 라이아제를 사용하는 경우, 상기 포메이트 부산물을 포메이트 데하이드로게나제 또는 포메이트 수소 라이아제에 의해 CO2로 추가로 전환시킬 수 있다.
피루베이트의 아세틸-CoA로의 간접 전환을 다수의 대체 경로를 통해 진행시킬 수 있다. 피루베이트를 피루베이트 데카복실라제에 의해 아세트알데하이드로 전환시킬 수 있다. 이어서 아세트알데하이드를 아실화(CoA-의존성) 아세트알데하이드 데하이드로게나제에 의해 아세틸-CoA로 전환시킬 수 있다. 다르게는, 피루베이트 데카복실라제에 의해 생성된 아세트알데하이드를 "PDH 우회" 경로에 의해 아세틸-CoA로 전환시킬 수 있다. 이 경로에서, 아세트알데하이드를 아세트알데하이드 데하이드로게나제에 의해 아세테이트로 산화시키고, 이어서 이를 CoA 리가제, 신시타제 또는 트랜스퍼라제에 의해 아세틸-CoA로 전환시킨다. 또 다른 실시태양에서, 상기 아세테이트 중간체를 아세테이트 키나제에 의해 아세틸-포스페이트로 전환시키고 이어서 이를 포스포트랜스아세틸라제에 의해 아세틸-CoA로 전환시킨다. 더욱 또 다른 실시태양에서, 피루베이트를 피루베이트 옥시다제에 의해 아세틸-포스페이트로 직접 전환시킨다(아세틸-포스페이트-형성). 피루베이트의 아세테이트로의 전환을 또한 아세테이트-형성 피루베이트 옥시다제에 의해 촉매화한다.
시토솔 아세틸-CoA를 또한 고유 또는 이종 쓰레오닌 알돌라제의 발현에 의해 쓰레오닌으로부터 합성할 수 있다(도 5J)(문헌[van Maris et al, AEM 69:2094-9 (2003)]). 쓰레오닌 알돌라제는 쓰레오닌을 아세트알데하이드 및 글리신으로 전환시킨다. 상기 아세트알데하이드 생성물을 후속으로 상술한 다양한 경로에 의해 아세틸-CoA로 전환시킨다.
도 2에 도시된 아세틸-CoA 형성 효소에 대한 유전자 후보들을 하기에 개시한다.
피루베이트 옥시다제(아세테이트-형성)(도 2A) 또는 피루베이트:퀴논 옥시도리덕타제(PQO)는 전자 수용체로서 유비퀴온(EC 1.2.5.1) 또는 퀴논(EC 1.2.2.1)을 사용하여, 피루베이트의 아세테이트로의 산화적 데카복실화를 촉매화할 수 있다. 에스케리키아 콜라이 효소, PoxB는 내막상에 국소화된다(문헌[Abdel-Hamid et al., Microbiol 147:1483-98 (2001)]). 상기 효소는 티아민 피로포스페이트 및 플라빈 아데닌 다이뉴클레오타이드(FAD) 보조인자를 갖는다(문헌[Koland and Gennis, Biochemistry 21:4438-4442 (1982)]; 문헌[O'Brien et al., Biochemistry 16:3105-3109 (1977)]; 문헌[O'Brien and Gennis, J. Biol. Chem. 255:3302-3307 (1980)]). PoxB는 사카로마이세스 세레비지아에 및 자이모모나스 모빌리스의 피루베이트 데카복실라제와 유사성을 갖는다. 코리네박테리움 글루타미쿰의 pqo 전사물은 퀴논-의존성 및 아세테이트-형성 피루베이트 옥시도리덕타제를 암호화한다(문헌[Schreiner et al., J Bacteriol 188:1341-50 (2006])). 유사한 효소들이 서열 상동성에 의해 추론될 수 있다.
Figure pct00105
아세테이트의 아세틸-CoA로의 아실화(도 2B)는 아세틸-CoA 신시타제, 리가제 또는 트랜스퍼라제 활성을 갖는 효소에 의해 촉매화될 수 있다. 상기 반응을 촉매화할 수 있는 2개의 효소는 AMP-형성 아세틸-CoA 신시타제 또는 리가제(EC 6.2.1.1) 및 ADP-형성 아세틸-CoA 신시타제(EC 6.2.1.13)이다. AMP-형성 아세틸-CoA 신시타제(ACS)는 아세테이트의 아세틸-CoA로의 활성화에 우세한 효소이다. 예시적인 ACS 효소들은 에스케리키아 콜라이(문헌[(Brown et al., J. Gen . Microbiol. 102:327-336 (1977)]), 랄스토니아 유트로파(문헌[Priefert and Steinbuchel, J. Bacteriol . 174:6590-6599 (1992)]), 메타노써모박터 써마유토트로피쿠스(문헌[Ingram-Smith and Smith, Archaea 2:95-107 (2007)]), 살모넬라 엔테리카(문헌[Gulick et al., Biochemistry 42:2866-2873 (2003)]) 및 사카로마이세스 세레비지아에(문헌[Jogl and Tong, Biochemistry 43:1425-1431 (2004)])에서 발견된다. ADP-형성 아세틸-CoA 신시타제는 일반적으로 넓은 기질 범위를 갖는 가역적인 효소이다(문헌[Musfeldt and Schonheit, J. Bacteriol. 184:636-644 (2002)]). ADP-형성 아세틸-CoA 신시타제의 2개의 아이소자임이 AF1211 및 AF1983에 의해 암호화된 알카에오글로부스 풀기두스 게놈에서 암호화된다(상기 문헌[Musfeldt and Schonheit(2002)]). 할로알큘라 마리스모르투이로부터의 효소(숙시닐-CoA 신시타제로서 주석이 달린다)는 또한 기질로서 아세테이트를 수용하며 상기 효소의 가역성이 입증되었다(문헌[Brasen and Schonheit, Arch . Microbiol . 182:277-287 (2004)]). 초고온성 크렌고세균 파이로바쿨룸 아에로필룸으로부터의 PAE3250에 의해 암호화된 ACD는 아세테이트, 아이소부티릴-CoA(바람직한 기질) 및 페닐아세틸-CoA와 반응하는, 모든 특성화된 ACD의 가장 넓은 기질 범위를 나타내었다(상기 문헌[Brasen and Schonheit(2004)]). 방향 진화 또는 공학을 사용하여 상기 효소가 상기 숙주 유기체의 생리학적 온도에서 작동하도록 변형시킬 수 있다. 알카에오글로부스 풀기두스, 할로알큘라 마리스모르투이 및 파이로바쿨룸 아에로필룸으로부터의 효소들이 모두 에스케리키아 콜라이에서 클로닝되고, 기능 발현되고, 특성화되었다(상기 문헌[Brasen and Schonheit(2004)]; 상기 문헌[Musfeldt and Schonheit(2002)]). 추가적인 후보는 에스케리키아 콜라이에서 sucCD에 의해 암호화된 숙시닐-CoA 신시타제(문헌[Buck et al., Biochemistry 24:6245-6252 (1985)]) 및 슈도모나스 푸티다로부터의 아실-CoA 리가제(문헌[Fernandez-Valverde et al., Appl . Environ . Microbiol. 59:1149-1154 (1993)])를 포함한다. 상기 언급한 단백질들을 하기에 나타낸다.
Figure pct00106
아세테이트의 아세틸-CoA로의 아실화가 또한 CoA 트랜스퍼라제 효소에 의해 촉매화될 수 있다(도 2B). 다수의 효소들은 CoA 수용체로서 아세테이트를 사용하여, 아세틸-CoA를 형성시킨다. 예시적인 CoA 트랜스퍼라제는, 에스케리키아 콜라이 atoA(알파 서브유닛) 및 atoD(베타 서브유닛) 유전자에 의해 암호화된 아세토아세틸-CoA 트랜스퍼라제이다(문헌[Korolev et al., Acta Crystallogr.D.Biol.Crystallogr. 58:2116-2121 (2002)]; 문헌[Vanderwinkel et al., 33:902-908 (1968)]). 상기 효소는 넓은 기질 범위를 가지며(문헌[Sramek et al., Arch Biochem Biophys 171:14-26 (1975)]), 아이소부티레이트(문헌[Matthies et al., Appl Environ . Microbiol 58:1435-1439 (1992)]), 발레레이트(문헌[Vanderwinkel et al., Biochem . Biophys . Res . Commun . 33:902-908 (1968)]) 및 부타노에이트(문헌[Vanderwinkel et al., Biochem . Biophys . Res . Commun . 33:902-908 (1968)])를 포함하여, 다양한 분지 및 선형 아실-CoA 기질로부터 아세테이트로 CoA 부분을 수송하는 것으로 나타났다. 유사한 효소들이 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032(문헌[Duncan et al., 68:5186-5190 (2002)]), 클로스트리디움 아세토부틸리쿰(문헌[Cary et al., Appl Environ Microbiol 56:1576-1583 (1990)]; 문헌[Wiesenborn et al., Appl Environ Microbiol 55:323-329 (1989)]), 및 클로스트리디움 사카로페르부틸아세토니쿰(문헌[Kosaka et al., Biosci . Biotechnol Biochem. 71:58-68 (2007)]) 중에 존재한다.
Figure pct00107
아세테이트 키나제(EC 2.7.2.1)는 아세테이트의 아세틸-포스페이트로의 가역적인 ATP-의존적인 인산화를 촉매화할 수 있다(도 2C). 예시적인 아세테이트 키나제 효소들이 에스케리키아 콜라이, 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 및 메타노사르시나 써모필라를 포함한 다수의 유기체들에서 특성화되었다(문헌[(Ingram-Smith et al., J. Bacteriol. 187:2386-2394 (2005)]; 문헌[Fox and Roseman, J. Biol . Chem. 261:13487-13497 (1986)]; 문헌[Winzer et al., Microbioloy 143 (Pt 10):3279-3286 (1997)]). 아세테이트 키나제 활성이 또한 에스케리키아 콜라이 purT의 유전자 산물에서 입증되었다(문헌[Marolewski et al., Biochemistry 33:2531-2537 (1994)]). 일부 부티레이트 키나제 효소(EC 2.7.2.7), 예를 들어 클로스트리디움 아세토부틸리쿰으로부터의 buk1 및 buk2가 또한 기질로서 아세테이트 수용한다(문헌[Hartmanis, M.G., J. Biol . Chem. 262:617-621 (1987)]). 살모넬라 엔테리카 및 클라미도모나스 레인하르드티이를 포함한 다수의 다른 유기체들 중에 상동기관이 존재한다.
Figure pct00108
아세틸-포스페이트로부터 아세틸-CoA의 형성을 포스포트랜스아세틸라제(EC 2.3.1.8)에 의해 촉매화할 수 있다(도 2D). 에스케리키아 콜라이로부터 pta 유전자는 아세틸-CoA를 아세틸-포스페이트로 가역적으로 전환시키는 효소를 암호화한다(문헌[Suzuki, T., Biochim . Biophys . Acta 191:559-569 (969)]). 추가의 아세틸트랜스퍼라제 효소가 바실러스 서브틸리스(문헌[Rado and Hoch, Biochim . Biophys . Acta 321:114-125 (1973)]), 클로스트리디움 클루이베리(문헌[Stadtman, E., Methods Enzymol. 1:5896-599 (1955)]) 및, 써모토가 마리티마(문헌[Bock et al., J. Bacteriol. 181:1861-1867 (1999)])에서 특성화되었다. 상기 반응은 또한 클로스트리디움 아세토부틸리쿰으로부터의 ptb 유전자 산물(문헌[Wiesenborn et al., App . Environ. Microbiol. 55:317-322 (1989)]; 문헌[Walter et al., Gene 134:107-111 (1993)])을 포함하여, 일부 포스포트랜부티릴라제 효소(EC 2.3.1.19)에 의해 촉매화될 수 있다. 추가적인 ptb 유전자들이 부티레이트-생산 세균 L2-50(문헌[Louis et al., J. Bacteriol. 186:2099-2106 (2004)]) 및 바실러스 메가테리움(문헌[Vazquez et al., Curr . Microbiol. 42:345-349 (2001)])에서 발견된다. 상기 에스케리키아 콜라이 pta 유전자에 대한 상동기관들이 살모넬라 엔테리카 및 클라미도모나스 레인하르드티이를 포함한 다수의 다른 유기체들 중에 존재한다.
Figure pct00109
피루베이트 데카복실라제(PDC)는 알콜 발효에 핵심 효소이며, 피루베이트의 아세트알데하이드로의 데카복실화를 촉매화한다(도 2E). 사카로마이세스 세레비지아에로부터의 PDC1 효소가 광범위하게 연구되었다(문헌[Killenberg-Jabs et al., Eur.J.Biochem. 268:1698-1704 (2001)]; 문헌[Li et al., Biochemistry . 38:10004-10012 (1999)]; 문헌[ter Schure et al., Appl.Environ.Microbiol. 64:1303-1307 (1998)]). 다른 잘-특성화된 PDC 효소들이 자이모모나스 모빌리우스(문헌[Siegert et al., Protein Eng Des Sel 18:345-357 (2005)]), 아세토박터 파스퇴리안스(문헌[Chandra et al., 176:443-451 (2001)]) 및 클루이베로마이세스 락티스(문헌[Krieger et al., 269:3256-3263 (2002)])에서 발견된다. 사카로마이세스 세레비지아에의 PDC1 및 PDC5 효소는 PDC2에 의해 양의 전사 조절이 가해진다(문헌[Hohmann et al, Mol Gen Genet 241:657-66 (1993)]). 피루베이트 데카복실라제 활성은 또한 칸디다 트로피칼리스에서 CTRG_03826 (GI:255729208), 클루이베로마이세스 락티스에서 PDC1 (GI 번호: 1226007), 야로위아 리포리티카에서 YALI0D10131g (GI:50550349), 피키아 파스토리스에서 PAS_chr3_0188 (GI:254570575), 스키조사카로마이세스 폼베에서 피루베이트 데카복실라제(GI: GI:159883897), 아스퍼질러스 니거에서 ANI_1_1024084 (GI:145241548), ANI_1_796114 (GI:317034487), ANI_1_936024 (GI:317026934) 및 ANI_1_2276014 (GI:317025935)에 의해 암호화된 단백질에 의해 또한 소유된다.
Figure pct00110
EC 부류 1.2.1에서 알데하이드 데하이드로게나제 효소는 아세트알데하이드의 아세테이트로의 산화를 촉매화한다(도 2F). 상기 활성을 암호화하는 예시적인 유전자는 상기에 개시되었다. 상기 아세트알데하이드의 아세테이트로의 산화는 또한 아세트알데하이드 옥시다제 활성을 갖는 알데하이드 옥시다제에 의해 촉매화될 수 있다. 상기와 같은 효소는 아세트알데하이드, 물 및 O2를 아세테이트 및 과산화 수소로 전환시킬 수 있다. 상기 전환을 촉매화하는 것으로 나타난 예시적인 알데하이드 옥시다제 효소들은 보스 타우루스 및 무스 무스쿨루스에서 발견될 수 있다(문헌[Garattini et al., Cell Mol Life Sci 65:1019-48 (2008)]; 문헌[Cabre et al., Biochem Soc Trans 15:882-3 (1987)]). 추가적인 알데하이드 옥시다제 유전자 후보는 zmAO -1 및 zmAO -2에 의해 암호화된, 제아 메이스의 2개의 플라빈- 및 몰리브데늄-함유 알데하이드 옥시다제를 포함한다(문헌[Sekimoto et al., J Biol Chem 272:15280-85 (1997)]).
Figure pct00111
피루베이트 옥시다제(아세틸-포스페이트-형성)는 피루베이트, 산소 및 포스페이트의 아세틸-포스페이트 및 과산화 수소로의 전환을 촉매화할 수 있다(도 2G). 이러한 유형의 피루베이트 옥시다제는 용해성이며 보조인자 티아민 다이포스페이트 및 플라빈 아데닌 다이뉴클레오타이드(FAD)를 필요로 한다. 아세틸-포스페이트-형성 피루베이트 옥시다제 효소는 젖산균 락토바실러스 델브루엑키이 및 락토바실러스 플란타룸에서 발견될 수 있다(문헌[Lorquet et al., J Bacteriol 186:3749-3759 (2004)]; 문헌[Hager et al., Fed Proc 13:734-38 (1954)]). 락토바실러스 플란타룸 효소의 결정 구조가 풀렸다(문헌[Muller et al., (1994)]). 스트렙토코커스 상귀니스 및 스트렙토코커스 뉴모니아에서, 아세틸-포스페이트-형성 피루베이트 옥시다제 효소가 spxB 유전자에 의해 암호화된다(문헌[Spellerberg et al., Mol Micro 19:803-13 (1996)]; 문헌[Ramos-Montanez et al., Mol Micro 67:729-46 (2008)]). 상기 SpxR는 스트렙토코커스 뉴모니아에에서 spxB의 전사를 양으로 조절하는 것으로 나타났다(상기 문헌[Ramos-Montanez et al.]). 스트렙토코커스 상귀니스에서 유사한 조절인자들이 서열 상동성에 의해 동정되었다. 카탈라제 활성의 도입 또는 변형은 상기 과산화 수소 생성물의 축적을 감소시킬 수 있다.
Figure pct00112
피루베이트 데하이드로게나제(PDH) 복합체는 피루베이트의 아세틸-CoA로의 전환을 촉매화한다(도 2H). 에스케리키아 콜라이 PDH 복합체는 유전자 aceEF 및 lpdA에 의해 암호화된다. 효소 공학 노력은 혐기성 조건하에서 에스케리키아 콜라이 PDH 효소 활성을 개선시켰다(문헌[Kim et al., J. Bacteriol . 190:3851-3858 (2008)]; 문헌[Kim et al., Appl . Environ . Microbiol . 73:1766-1771 (2007)]; 문헌[Zhou et al., Biotechnol.Lett. 30:335-342 (2008)]). 상기 에스케리키아 콜라이 PDH와 대조적으로, 바실러스 서브틸리스 복합체는 혐기성 조건하에서 활성이고 생육에 필요하다(문헌[Nakano et al., 179:6749-6755 (1997)]). 글리세롤상에서 생육하는 동안 특성화된 클렙시엘라 뉴모니아에 PDH가 또한 혐기성 조건하에서 활성이다(문헌[Menzel et al., 56:135-142 (1997)]). 소 신장으로부터의 효소 복합체의 결정 구조(문헌[Zhou et al., 98:14802-14807 (2001)]) 및 아조토박터 비넬란디이로부터의 E2 촉매 도메인을 입수할 수 있다(문헌[Mattevi et al., Science. 255:1544-1550 (1992)]). 일부 포유동물 PDH 효소 복합체는 대체 기질, 예를 들어 2-옥소부타노에이트상에서 반응할 수 있다. 라투스 노르베기쿠스 PDH 및 BCKAD의 상대적인 동역학은 BCKAD가 기질로서 2-옥소부타노에이트상에서 보다 높은 활성을 가짐을 가리킨다(문헌[Paxton et al., Biochem .J. 234:295-303 (1986)]). 사카로마이세스 세레비지아에 PDH 복합체는 E1 (PDA1, PDB1), E3 (LPD1), 및 단백질 X (PDX1) 성분과 결합하는 E2(LAT1)로 이루어질 수 있다(문헌[Pronk et al., Yeast 12:1607-1633 (1996)]). 사카로마이세스 세레비지아에의 PDH 복합체는 PKP1 (PDH 키나제 I), PTC5 (PDH 포스파타제 I), PKP2 및 PTC6을 수반하는 E1의 인산화에 의해 조절된다. 이들 조절인자의 변형은 또한 PDH 활성을 증대시킬 수 있다. 시토솔에서 리포일 리가제(에스케리키아 콜라이의 LplA 및 사카로마이세스 세레비지아에의 AIM22)와 PDH와의 동시발현이 상기 PDH 효소 복합체의 활성화에 필요할 수 있다. 대사 경로의 변형 또는 리포에이트에 의한 배지 보충에 의해 시토솔 리포에이트의 공급을 증가시키는 것이 또한 PDH 활성을 개선시킬 수 있다.
Figure pct00113
상술한 큰 다중효소 PDH 복합체에 대한 대안으로서, 일부 유기체는 2-케토-산의 아실화 산화 데카복실화를 촉매화하기 위해 2-케토산 옥시도리덕타제 계열(OFOR)의 효소들을 사용한다. 상기 PDH 복합체와 달리, PFOR 효소는 철-황 클러스터를 함유하고, 상이한 보조인자를 사용하며, NAD(P)H 대신에 전자 수용체로서 페레독신 또는 플라보딕신을 사용한다. 피루베이트 페레독신 옥시도리덕타제(PFOR)는 피루베이트의 산화를 촉매화하여 아세틸-CoA를 형성시킬 수 있다(도 2H). 데설포비브리오 아프리카누스로부터의 PFOR이 에스케리키아 콜라이에서 클로닝되고 발현되어 산소의 존재하에서 수일간 안정한 활성 재조합 효소를 생성시켰다(문헌[Pieulle et al., J Bacteriol. 179:5684-5692 (1997)]). 산소 안정성은 PFOR에서 비교적 통상적이지 않으며 데설포비브리오 아프리카누스 효소의 폴리펩타이드 쇄에서 60 잔기 연장에 의해 부여되는 것으로 여겨진다. 무어렐라 써모아세티카 PFOR이 또한 잘 특성화되었으며(문헌[Menon et al., Biochemistry 36:8484-8494 (1997)]) 심지어 독립영양성 생육 중에 피루베이트 합성의 방향에서 높은 활성을 갖는 것으로 나타났다(문헌[Furdui et al., J Biol Chem. 275:28494-28499 (2000)]). 더욱이, 에스케리키아 콜라이는 상기 무어렐라 써모아세티카 PFOR과 51% 일치하는 단백질을 암호화하는, 특성화되지 않은 개방 판독 프레임, ydbK를 갖는다. 에스케리키아 콜라이에서 피루베이트 옥시도리덕타제 활성에 대한 증거가 개시되었다(문헌[Blaschkowski et al., Eur.J Biochem. 123:563-569 (1982)]). 다수의 추가적인 PFOR 효소들이 문헌[Ragsdale, Chem . Rev . 103:2333-2346 (2003)]에 개시되어 있다. 최종적으로, 플라보독신 리덕타제(예를 들어 헬리코박터 파이로리 또는 캄필로박터 제주니로부터의 fqrB(문헌[St Maurice et al., J. Bacteriol . 189:4764-4773 (2007)])) 또는 Rnf-유형 단백질(문헌[Seedorf et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U S.A . 105:2128-2133 (2008)]; 문헌[Herrmann et al., J.Bacteriol. 190:784-791 (2008)])이 PFOR에 의해 생성된 환원된 페레독신으로부터 NADH 또는 NADPH를 생성시키는 수단을 제공한다. 이들 단백질을 하기에 나타낸다.
Figure pct00114
에스케리키아 콜라이에서 pflB에 의해 암호화된, 피루베이트 포메이트-라이아제(PFL, EC 2.3.1.54)(도 2H)는 피루베이트를 아세틸-CoA 및 포메이트로 전환시킬 수 있다. PFL의 활성을 pflA에 의해 암호화된 활성화 효소에 의해 증대시킬 수 있다(문헌[Knappe et al., Proc . Natl . Acad . Sci U.S.A 81:1332-1335 (1984)]; 문헌[Wong et al., Biochemistry 32:14102-14110 (1993)]). 케토산 포메이트-라이아제(EC 2.3.1.-)(또한 2-케토부티레이트 포메이트-라이아제(KFL) 및 피루베이트 포메이트-라이아제 4로서 공지됨)는 에스케리키아 콜라이 중의 tdcE의 유전자 산물이다. 상기 효소는 혐기성 쓰레오닌 분해 중에 2-케토부티레이트의 프로피오닐-CoA 및 포메이트로의 전환을 촉매화하고, 또한 혐기성 이화작용에서 피루베이트 포메이트-라이아제에 대한 대용물일 수 있다(문헌[Simanshu et al., J Biosci. 32:1195-1206 (2007)]). 상기 효소는 산소-민감성이며, PflB와 같이, 활성 부위에서 글리실 라디칼을 활성화시키기 위해 PFL-AE에 의한 번역 후 변형을 필요로 할 수 있다(문헌[Hesslinger et al., Mol . Microbiol 27:477-492 (1998)]). pflD에 의해 암호화된 알카에오글로부스 풀기두스로부터의 피루베이트 포메이트-라이아제가 에스케리키아 콜라이에서 클로닝되고, 발현되고 특성화되었다(문헌[Lehtio et al., Protein Eng Des Sel 17:545-552 (2004)]). 알카에오글로부스 풀기두스 및 에스케리키아 콜라이 효소의 결정 구조가 분석되었다(문헌[Lehtio et al., J Mol . Biol . 357:221-235 (2006)]; 문헌[Leppanen et al., Structure . 7:733-744 (1999)]). 추가적인 PFL 및 PFL-AE 후보가 락토코커스 락티스(문헌[Melchiorsen et al., Appl Microbiol Biotechnol 58:338-344 (2002)]), 및 스트렙토코커스 뮤탄스(문헌[Takahashi-Abbe et al., Oral.Microbiol Immunol . 18:293-297 (2003)]), 클라미도모나스 레인하르드티이(문헌[Hemschemeier et al., Eukaryot . Cell 7:518-526 (2008b)]; 문헌[Atteia et al., J. Biol . Chem . 281:9909-9918 (2006)]) 및 클로스트리디움 파스퇴리아눔(문헌[Weidner et al., J Bacteriol . 178:2440-2444 (1996)])에서 발견된다.
Figure pct00115
피루베이트 포메이트 라이아제가 피루베이트의 아세틸-CoA로의 전환에 사용되는 경우, 포메이트 데하이드로게나제 또는 포메이트 수소 라이아제 효소의 동시발현은 포메이트를 이산화 탄소로 전환시킬 것이다. 포메이트 데하이드로게나제(FDH)는 포메이트로부터 수용체로의 전자의 가역적인 수송을 촉매화한다. FDH 활성을 갖는 효소들은 다양한 전자 담체, 예를 들어 NADH(EC 1.2.1.2), NADPH(EC 1.2.1.43), 퀴놀(EC 1.1.5.6), 시토크롬(EC 1.2.2.3) 및 하이드로게나제(EC 1.1.99.33)를 사용한다. FDH 효소는 무어렐라 써모아세티카로부터 특성화되었다(문헌[Andreesen and Ljungdahl, J Bacteriol 116:867-873 (1973)]; 문헌[Li et al., J Bacteriol 92:405-412 (1966)]; 문헌[Yamamoto et al., J Biol Chem. 258:1826-1832 (1983)]). 유전자좌, Moth_2312는 포메이트 데하이드로게나제의 알파 서브유닛을 암호화하는 책임이 있는 반면, 베타 서브유닛은 Moth_2314에 의해 암호화된다(문헌[Pierce et al., Environ Microbiol (2008)]). CO2 환원 성질과 함께 포메이트 데하이드로게나제 활성을 암호화하는 유전자의 또 다른 세트는 신트로포박터 퓨마록시단스에서 Sfum_2703 내지 Sfum_2706에 의해 암호화된다(문헌[de Bok et al., Eur J Biochem . 270:2476-2485 (2003)]; 문헌[Reda et al., PNAS 105:10654-10658 (2008)]). 동일한 기능을 수행하는 것으로 추정되는 유사한 유전자 세트들은 카르복시도써무스 하이드로게노포르만스에서 CHY_0731, CHY_0732, 및 CHY_0733에 의해 암호화된다(문헌[Wu et al., PLoS Genet 1:e65 (2005)]). 포메이트 데하이드로게나제는 또한 클로스트리디움 카르복시디보란스 P7, 바실러스 메타놀리쿠스, 부르크홀데리아 스타빌리스, 무어렐라 써모아세티카 ATCC 39073, 칸디다 보이디니이, 칸디다 메틸리카, 및 사카로마이세스 세레비지아에 S288c를 포함한 다수의 추가적인 유기체들에서 발견된다.
Figure pct00116
다르게는, 포메이트 수소 라이아제 효소를 사용하여 포메이트를 이산화 탄소 및 수소로 전환시킬 수 있다. 예시적인 포메이트 수소 라이아제 효소는 에스케리키아 콜라이에서 발견될 수 있다. 상기 에스케리키아 콜라이 포메이트 수소 라이아제는 하이드로게나제 3 및 포메이트 데하이드로게나제-H로 이루어진다(문헌[Maeda et al., Appl Microbiol Biotechnol 77:879-890 (2007)]). 상기는 fhlA의 유전자 산물에 의해 활성화된다(문헌[Maeda et al., Appl Microbiol Biotechnol 77:879-890 (2007)]). 미량 원소, 셀레늄, 니켈 및 몰리브데늄의 발효 브로쓰에의 첨가는 포메이트 수소 라이아제 활성을 증대시키는 것으로 나타났다(문헌[Soini et al., Microb.Cell Fact. 7:26 (2008)]). 다양한 하이드로게나제 3, 포메이트 데하이드로게나제 및 전사 활성제 유전자를 하기에 나타낸다. 포메이트 수소 라이아제 효소는 또한 초고온 고세균, 써모코커스 리토랄리스 중에 존재한다(문헌[Takacs et al., BMC. Microbiol 8:88 (2008)]). 추가적인 포메이트 수소 라이아제 시스템들이 살모넬라 티피뮤리움, 클렙시엘라 뉴모니아에, 로도스피릴룸 루브룸, 메타노박테리움 포르미시쿰에서 발견되었다(문헌[Vardar-Schara et al., Microbial Biotechnology 1:107-125 (2008)]).
Figure pct00117
피루베이트:NADP 옥시도리덕타제(PNO)는 피루베이트의 아세틸-CoA로의 전환을 촉매화한다. 상기 효소는 단일 유전자에 의해 암호화되며 상기 활성 효소는, 상술한 다중-서브유닛 PDH 효소 복합체와 대조적으로, 동종이량체이다. 유글레나 그라실리스로부터의 효소는 그의 보조인자, 티아민 피로포스페이트에 의해 안정화된다(문헌[Nakazawa et al, Arch Biochem Biophys 411:183-8 (2003)]). 상기 효소의 미토콘드리아 표적화 서열은 시토솔에서 발현을 위해 제거되어야 한다. 유글레나 그라실리스 단백질의 PNO 단백질 및 다른 NADP-의존성 피루베이트:NADP+ 옥시도리덕타제 효소들을 하기 표에 나열한다.
Figure pct00118
아세트알데하이드의 아세틸-CoA로의 NAD(P)+ 의존성 산화(도 2I)를 아실화 아세트알데하이드 데하이드로게나제(EC 1.2.1.10)에 의해 촉매화할 수 있다. 에스케리키아 콜라이의 아실화 아세트알데하이드 데하이드로게나제 효소들은 adhE, eutE, 및 mhpF에 의해 암호화된다(문헌[Ferrandez et al, J Bacteriol 179:2573-81 (1997)]). dmpF에 의해 암호화된 슈도모나스 스피시즈 CF600 효소는 메타-절단 경로에 참여하며 4-하이드록시-2-옥소발레레이트 알돌라제와 복합체를 형성한다(문헌[Shingler et al, J Bacteriol 174:711-24 (1992)]). 클로스트리디움 아세토부틸리쿰과 같은 용매발생 유기체는 알콜 데하이드로게나제 및 아세트알데하이드 데하이드로게나제 활성을 갖는 이작용성 효소를 암호화한다. 이작용성 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 효소는 bdh I 및 adhE2에 의해 암호화된다(문헌[Walter, et al., J. Bacteriol. 174:7149-7158 (1992)]; 문헌[Fontaine et al., J.Bacteriol. 184:821-830 (2002)]). 아실화 아세트알데하이드 데하이드로게나제에 대한 더욱 또 다른 후보는 클로스트리디움 베이제린키이로부터의 ald 유전자이다(문헌[Toth, Appl . Environ . Microbiol. 65:4973-4980 (1999)]). 상기 유전자는 살모넬라 티피뮤리움 및 에스케리키아 콜라이의 eutE 아세트알데하이드 데하이드로게나제 유전자와 매우 유사하다(문헌[Toth, Appl . Environ. Microbiol. 65:4973-4980 (1999)]).
Figure pct00119
쓰레오닌 알돌라제(EC 4.1.2.5)는 쓰레오닌의 글리신 및 아세트알데하이드로의 절단을 촉매화한다(도 2J). 사카로마이세스 세레비지아에 및 칸디다 알비칸스 효소는 GLY1에 의해 암호화된다(문헌[Liu et al, Eur J Biochem 245:289-93 (1997)]; 문헌[McNeil et al, Yeast 16:167-75 (2000)]). 에스케리키아 콜라이의 ltaE 및 glyA 유전자 산물은 또한 상기 활성을 갖는 효소들을 암호화한다(문헌[Liu et al, Eur J Biochem 255:220-6 (1998)]).
Figure pct00120
실시예 III
PEP 및 피루베이트로부터 아세틸- CoA의 생산 경로
시토솔 포스포에놀피루베이트(PEP) 및 피루베이트의 시토솔 아세틸-CoA로의 전환을 위한 경로들은 또한 아세틸-CoA로부터의 시토솔 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 생산 경로의 전개를 가능하게 할 수 있다. 도 3은 PEP 및 피루베이트의 아세틸-CoA로의 전환에 대한 다수의 경로들을 도시한다.
PEP의 옥살로아세테이트로의 전환은 1, 2 또는 3개의 효소 단계에서 촉매화된다. 옥살로아세테이트는 말로네이트 세미알데하이드 또는 말로닐-CoA 중간체를 통해 아세틸-CoA로 추가로 전환된다. 하나의 경로에서, PEP 카복실라제 또는 PEP 카복시키나제는 PEP를 옥살로아세테이트로 전환시키고(단계 A); 옥살로아세테이트 데카복실라제는 옥살로아세테이트를 말로네이트로 전환시키고(단계 B); 말로네이트 세미알데하이드 데하이드로게나제(아세틸화)는 말로네이트 세미알데하이드를 아세틸-CoA로 전환시킨다(단계 C). 또 다른 경로에서 피루베이트 키나제 또는 PEP 포스파타제는 PEP를 피루베이트로 전환시키고(단계 N); 피루베이트 카복실라제는 피루베이트를 옥살로아세테이트로 전환시키고(단계 H); 옥살로아세테이트 데카복실라제는 옥살로아세테이트를 말로네이트로 전환시키고(단계 B); 말로네이트 세미알데하이드 데하이드로게나제(아세틸화)는 말로네이트 세미알데하이드를 아세틸-CoA로 전환시킨다(단계 C). 또 다른 경로에서 피루베이트 키나제 또는 PEP 포스파타제는 PEP를 피루베이트로 전환시키고(단계 N); 말산 효소는 피루베이트를 말레이트로 전환시키고(단계 L); 말레이트 데하이드로게나제 또는 옥시도리덕타제는 말레이트를 옥살로아세테이트로 전환시키고(단계 M); 옥살로아세테이트 데카복실라제는 옥살로아세테이트를 말로네이트로 전환시키고(단계 B); 말로네이트 세미알데하이드 데하이드로게나제(아세틸화)는 말로네이트 세미알데하이드를 아세틸-CoA로 전환시킨다(단계 C). 또 다른 경로에서, PEP 카복실라제 또는 PEP 카복시키나제는 PEP를 옥살로아세테이트로 전환시키고(단계 A); 옥살로아세테이트 데카복실라제는 옥살로아세테이트를 말로네이트 세미알데하이드로 전환시키고(단계 B); 말로닐-CoA 리덕타제는 말로네이트 세미알데하이드를 말로닐-CoA로 전환시키고(단계 G); 말로닐-CoA 데카복실라제는 말로닐-CoA를 아세틸-CoA로 전환시킨다(단계 D). 또 다른 경로에서, 피루베이트 키나제 또는 PEP 포스파타제는 PEP를 피루베이트로 전환시키고(단계 N); 피루베이트 카복실라제는 피루베이트를 옥살로아세테이트로 전환시키고(단계 H); 옥살로아세테이트 데카복실라제는 옥살로아세테이트를 말로네이트 세미알데하이드로 전환시키고(단계 B); 말로닐-CoA 리덕타제는 말로네이트 세미알데하이드를 말로닐-CoA로 전환시키고(단계 G); 말로닐-CoA 데카복실라제는 말로닐-CoA를 아세틸-CoA로 전환시킨다(단계 D). 또 다른 경로에서, 피루베이트 키나제 또는 PEP 포스파타제는 PEP를 피루베이트로 전환시키고(단계 N); 말산 효소는 피루베이트를 말레이트로 전환시키고(단계 L); 말레이트 데하이드로게나제 또는 옥시도리덕타제는 말레이트를 옥살로아세테이트로 전환시키고(단계 M); 옥살로아세테이트 데카복실라제는 옥살로아세테이트를 말로네이트 세미알데하이드로 전환시키고(단계 B); 말로닐-CoA 리덕타제는 말로네이트 세미알데하이드를 말로닐-CoA로 전환시키고(단계 G); 말로닐-CoA 데카복실라제는 말로닐-CoA를 아세틸-CoA로 전환시킨다(단계 D). 또 다른 경로에서, PEP 카복실라제 또는 PEP 카복시키나제는 PEP를 옥살로아세테이트로 전환시키고(단계 A); 옥살로아세테이트 데카복실라제는 옥살로아세테이트를 말로네이트 세미알데하이드로 전환시키고(단계 B); 말로네이트 세미알데하이드 데하이드로게나제는 말로네이트 세미알데하이드를 말로네이트로 전환시키고(단계 J); 말로닐-CoA 신시타제 또는 트랜스퍼라제는 말로네이트를 말로닐-CoA로 전환시키고(단계 K); 말로닐-CoA 데카복실라제는 말로닐-CoA를 아세틸-CoA로 전환시킨다(단계 D). 또 다른 경로에서, 피루베이트 키나제 또는 PEP 포스파타제는 PEP를 피루베이트로 전환시키고(단계 N); 피루베이트 카복실라제는 피루베이트를 옥살로아세테이트로 전환시키고(단계 H); 옥살로아세테이트 데카복실라제는 옥살로아세테이트를 말로네이트 세미알데하이드로 전환시키고(단계 B); 말로네이트 세미알데하이드 데하이드로게나제는 말로네이트 세미알데하이드를 말로네이트로 전환시키고(단계 J); 말로닐-CoA 신시타제 또는 트랜스퍼라제는 말로네이트를 말로닐-CoA로 전환시키고(단계 K); 말로닐-CoA 데카복실라제는 말로닐-CoA를 아세틸-CoA로 전환시킨다(단계 D). 또 다른 경로에서, 피루베이트 키나제 또는 PEP 포스파타제는 PEP를 피루베이트로 전환시키고(단계 N); 말산 효소는 피루베이트를 말레이트로 전환시키고(단계 L); 말레이트 데하이드로게나제 또는 옥시도리덕타제는 말레이트를 옥살로아세테이트로 전환시키고(단계 M); 옥살로아세테이트 데카복실라제는 옥살로아세테이트를 말로네이트 세미알데하이드로 전환시키고(단계 B); 말로네이트 세미알데하이드 데하이드로게나제는 말로네이트 세미알데하이드를 말로네이트로 전환시키고(단계 J); 말로닐-CoA 신시타제 또는 트랜스퍼라제는 말로네이트를 말로닐-CoA로 전환시키고(단계 K); 말로닐-CoA 데카복실라제는 말로닐-CoA를 아세틸-CoA로 전환시킨다(단계 D). 또 다른 경로에서, PEP 카복실라제 또는 PEP 카복시키나제는 PEP를 옥살로아세테이트로 전환시키고(단계 A); 옥살로아세테이트 데하이드로게나제 또는 옥살로아세테이트 옥시도리덕타제는 옥살로아세테이트를 말로닐-CoA로 전환시키고(단계 F); 말로닐-CoA 데카복실라제는 말로닐-CoA를 아세틸-CoA로 전환시킨다(단계 D). 또 다른 경로에서, 피루베이트 키나제 또는 PEP 포스파타제는 PEP를 피루베이트로 전환시키고(단계 N); 피루베이트 카복실라제는 피루베이트를 옥살로아세테이트로 전환시키고(단계 H); 옥살로아세테이트 데하이드로게나제 또는 옥살로아세테이트 옥시도리덕타제는 옥살로아세테이트를 말로닐-CoA로 전환시키고(단계 F); 말로닐-CoA 데카복실라제는 말로닐-CoA를 아세틸-CoA로 전환시킨다(단계 D). 또 다른 경로에서, 피루베이트 키나제 또는 PEP 포스파타제는 PEP를 피루베이트로 전환시키고(단계 N); 말산 효소는 피루베이트를 말레이트로 전환시키고(단계 L); 말레이트 데하이드로게나제 또는 옥시도리덕타제는 말레이트를 옥살로아세테이트로 전환시키고(단계 M); 옥살로아세테이트 데하이드로게나제 또는 옥살로아세테이트 옥시도리덕타제는 옥살로아세테이트를 말로닐-CoA로 전환시키고(단계 F); 말로닐-CoA 데카복실라제는 말로닐-CoA를 아세틸-CoA로 전환시킨다(단계 D).
도 3에 도시된 반응들에 대한 효소 후보들을 하기에 개시한다.
Figure pct00121
도 3에서 다수의 효소들에 대한 효소 후보들을 본 발명의 어딘가에 개시하였다. 이들 효소는 아세틸-CoA 데카복실라제, 아세토아세틸-CoA 신타제, 아세토아세틸-CoA 티올라제, 말로닐-CoA 리덕타제(또한 말로네이트 세미알데하이드 데하이드로게나제(아실화)라 칭함), 말레이트 데하이드로게나제를 포함한다.
1.1.n .a. 옥시도리덕타제 ( 알콜에서 옥소로 )
말레이트 데하이드로게나제 또는 옥시도리덕타제는 말레이트의 옥살로아세테이트로의 산화를 촉매화한다. 상이한 담체들이 상기 부류의 효소들에 대한 전자 수용체로서 작용할 수 있다. 말레이트 데하이드로게나제 효소는 NADP 또는 NAD를 전자 수용체로서 사용한다. 말레이트 데하이드로게나제(단계 M) 효소 후보는 상기 실시예 1에 개시되어 있다(표 7, 23). 말레이트:퀴논 옥시도리덕타제 효소(EC 1.1.5.4)는 막-결합되며, 퀴논, 플라보단백질 또는 비타민 K를 전자 수용체로서 사용한다. 에스케리키아 콜라이, 헬리코박터 파이로리 및 슈도모나스 시린가에의 말레이트:퀴논 옥시도리덕타제 효소들은 mqo에 의해 암호화된다(문헌[Kather et al, J Bacteriol 182:3204-9 (2000)]; 문헌[Mellgren et al, J Bacteriol 191:3132-42 (2009)]). 코리네박테리움 글루아미쿰의 Cgl2001 유전자가 또한 MQO 효소를 암호화한다(문헌[Mitsuhashi et al, Biosci Biotechnol Biochem 70:2803-6 (2006)]).
Figure pct00122
1.1.1.d 말산 효소
말산 효소(말레이트 데하이드로게나제)는 피루베이트의 말레이트로의 가역적인 산화 카복실화를 촉매화한다. 에스케리키아 콜라이는 2개의 말산 효소, MaeA 및 maeB를 암호화한다(문헌[Takeo, J. Biochem. 66:379-387 (1969)]). 말산 효소는 전형적으로는 말레이트로부터 피루베이트 형성의 방향으로 작동하는 것으로 추정되지만, maeA에 의해 암호화된 NAD-의존성 효소는 탄소-고정 방향으로 작동하는 것으로 나타났다(문헌[Stols and Donnelly, Appl . Environ . Microbiol . 63(7) 2695-2701 (1997)]). 유사한 관찰이 에스케리키아 콜라이에서 아스카리스 수움으로부터 말산 효소의 과발현시 이루어졌다(문헌[Stols et al., Appl. Biochem. Biotechnol. 63-65(1), 153-158 (1997)]). maeB에 의해 암호화된, 두 번째 에스케리키아 콜라이 말산 효소는 NADP-의존성이며, 또한 옥살로아세테이트 및 다른 알파-케토산을 데카복실화한다(문헌[Iwakura et al., J. Biochem. 85(5):1355-65 (1979)]). 또 다른 적합한 효소 후보는 제아 메이스로부터의 me1이다(문헌[Furumoto et al, Plant Cell Physiol 41:1200-1209 (2000)]).
Figure pct00123
1.2.1.a 옥시도리덕타제 ( 알데하이드에서 산으로)
말로네이트 세미알데하이드의 말로네이트로의 산화는 말로네이트 세미알데하이드 데하이드로게나제(EC 1.2.1.15)에 의해서 촉매화된다. 상기 효소는 슈도모나스 아에루기노사에서 특성화되었다(문헌[Nakamura et al, Biochim Biophys Acta 50:147-52 (1961)]). 유글레나 그라실리스의 NADP 및 NAD-의존성 숙시네이트 세미알데하이드 데하이드로게나제 효소는 기질로서 말로네이트 세미알데하이드를 수용한다(문헌[Tokunaga et al, Biochem Biophys Act 429:55-62 (1976)]). 이들 효소를 암호화하는 유전자는 지금까지 동정되지 않았다. 진핵생물 유기체, 예를 들어 사카로마이세스 세레비지아에, 칸디다 알비칸스, 야로위아 리포리티카 및 아스퍼질러스 니거로부터의 알데하이드 데하이드로게나제 효소는 광범위한 기질 특이성을 가지며 적합한 후보들이다. 이들 효소 및 다른 산형성 알데하이드 데하이드로게나제 및 알데하이드 옥시다제 효소들은 앞서 개시되었으며 표 9 및 30에 나열된다. 추가의 MSA 데하이드로게나제 효소 후보들은 NAD(P)+-의존성 알데하이드 데하이드로게나제 효소(EC 1.2.1.3)를 포함한다. 인간의 간에서 발견되는 2개의 알데하이드 데하이드로게나제, ALDH-1 및 ALDH-2는 다양한 지방족, 방향족 및 폴리사이클릭 알데하이드에 대해서 넓은 기질 범위를 갖는다(문헌[Klyosov, Biochemistry 35:4457-4467 (1996a)]). 활성 ALDH-2는 샤페로닌으로서 GroEL 단백질을 사용하여 에스케리키아 콜라이에서 효율적으로 발현되었다(문헌[Lee et al., Biochem . Biophys . Res . Commun . 298:216-224 (2002)]). 래트 미토콘드리아 알데하이드 데하이드로게나제는 또한 넓은 기질 범위를 갖는다(문헌[Siew et al., Arch . Biochem . Biophys . 176:638-649 (1976)]). 에스케리키아 콜라이 유전자 astD 및 aldH는 NAD+-의존성 알데하이드 데하이드로게나제를 암호화한다. AstD는 숙신산 세미알데하이드상에서 활성이며(문헌[Kuznetsova et al., FEMS Microbiol Rev 29:263-279 (2005)]) aldH는 광범위한 방향족 및 지방족 기질상에서 활성이다(문헌[Jo et al, Appl Microbiol Biotechnol 81:51-60 (2008)]).
Figure pct00124
1.2.1.f 옥시도리덕타제 ( 데카복실화 아실- CoA에서 알데하이드로 )
말로네이트 세미알데하이드 데하이드로게나제(아세틸화)(EC 1.2.1.18)는 말로네이트 세미알데하이드의 아세틸-CoA로의 산화 데카복실화를 촉매화한다. 예시적인 효소는 할로모나스 스피시즈 HTNK1의 ddcC(문헌[Todd et al, Environ Microbiol 12:237-43 (2010)]) 및 락토바실러스 카제이의 IolA(문헌[Yebra et al, AEM 73:3850-8 (2007)])에 의해서 암호화된다. 상기 DdcC 효소는 하기 표에 나타낸, 아스퍼질러스 니거 및 칸디다 알비칸스에서의 상동기관을 갖는다. 라투스 노르베기쿠스에서 말로네이트 세미알데하이드 데하이드로게나제 효소, Mmsdh는 또한 말로네이트 세미알데하이드를 아세틸-CoA로 전환시킨다(미국특허 제 8,048,624 호). 말로네이트 세미알데하이드 데하이드로게나제(아세틸화) 효소는 또한 슈도모나스 플루오레센스에서 특성화되었지만, 유전자는 지금까지 동정되지 않았다(문헌[Hayaishi et al, J Biol Chem 236:781-90 (1961)]). 메틸말로네이트 세미알데하이드 데하이드로게나제(아세틸화) 효소(EC 1.2.1.27)가 또한, 상기 부류의 여러 효소들이 바실러스 서브틸리스의 Msdh(문헌[Stines-Chaumeil et al, Biochem J 395:107-15 (2006)]) 및 라투스 노르베기쿠스의 메틸말로네이트 세미알데하이드 데하이드로게나제(문헌[Kedishvii et al, Methods Enzymol 324:207-18 (2000)])를 포함하여 기질로서 말로네이트 세미알데하이드를 수용하기 때문에 적합한 후보이다.
Figure pct00125
2.7.2.a 키나제
피루베이트 키나제(단계 10N)(또한 포스포에놀피루베이트 신타제(EC 2.7.9.2)로서 공지됨)는 피루베이트 및 ATP를 PEP 및 AMP로 전환시킨다. 상기 효소는 사카로마이세스 세레비지아에의 PYK1(문헌[Burke et al., J. Biol . Chem . 258:2193-2201 (1983)]) 및 PYK2(문헌[Boles et al., J. Bacteriol . 179:2987-2993 (1997)]) 유전자에 의해 암호화된다. 에스케리키아 콜라이에서, 상기 활성은 pykF 및 pykA의 유전자 산물에 의해서 촉매화된다. 상기 사카로마이세스 세레비지아에 효소들의 선택된 상동기관을 또한 하기 표에 나타낸다.
Figure pct00126
2.8.3.a CoA 트랜스퍼라제
말로네이트의 말로닐-CoA로의 활성화는 EC 부류 2.8.3.a에서 CoA 트랜스퍼라제에 의해 촉매화된다. 말로닐-CoA:아세테이트 CoA 트랜스퍼라제(EC 2.8.3.3) 효소는 슈도모나스 플루오레센스 및 슈도모나스 푸티다를 포함한 슈도모나스 종에서 특성화되었다(문헌[Takamura et al, Biochem Int 3:483-91 (1981)]; 문헌[Hayaishi et al, J Biol Chem 215:125-36 (1955)]). 이들 효소와 관련된 유전자들은 지금까지 동정되지 않았다. 라투스 노르베기쿠스 간에서 발견되는 미토콘드리아 CoA 트랜스퍼라제가 또한 상기 반응을 촉매화하며 일련의 CoA 공여체 및 수용체들을 사용할 수 있다(문헌[Deana et al, Biochem Int 26:767-73 (1992)]). 상술한 여러 CoA 트랜스퍼라제 효소들을 또한 도 10의 단계 K의 촉매화를 위해 적용할 수 있다. 이들 효소는 아세틸-CoA 트랜스퍼라제(표 26), 3-HB CoA 트랜스퍼라제(표 8), 아세토아세틸-CoA 트랜스퍼라제(표 55), SCOT(표 56) 및 다른 CoA 트랜스퍼라제(표 57)를 포함한다.
3.1. 3.a 포스파타제
포스포에놀피루베이트 포스파타제(EC 3.1.3.60, 단계 10N)는 PEP의 피루베이트 및 포스페이트로의 가수분해를 촉매화한다. 알칼리성 포스파타제(EC 3.1.3.1), 산 포스파타제(EC 3.1.3.2), 포스포글리세레이트 포스파타제(EC 3.1.3.20) 및 PEP 포스파타제(EC 3.1.3.60)를 포함한 다수의 포스파타제 효소들이 상기 활성을 촉매화한다. PEP 포스파타제 효소는 비그니아 라디에이트, 브루귀에라 섹스앵굴라 및 브라시카 니그라와 같은 식물에서 특성화되었다. 아스퍼질러스 푸미가테스로부터의 피타제, 호모 사피엔스로부터의 산 포스파타제 및 에스케리키아 콜라이의 알칼리성 포스파타제는 PEP의 피루베이트로의 가수분해를 촉매화한다(문헌[Brugger et al, Appl Microbiol Biotech 63:383-9 (2004)]; 문헌[Hayman et al, Biochem J 261:601-9 (1989)]; 문헌[et al, The Enzymes 3rd Ed. 4:373-415 (1971)]). 유사한 효소들이 캄필로박터 제주니(문헌[van Mourik et al., Microbiol. 154:584-92 (2008)]), 사카로마이세스 세레비지아에(문헌[Oshima et al., Gene 179:171-7 (1996)]) 및 스타필로코커스 아우레우스(문헌[Shah and Blobel, J. Bacteriol . 94:780-1 (1967)])에서 특성화되었다. 효소 공학 및/또는 표적 서열의 제거가 알칼리성 포스파타제 효소들이 세포질에서 작용하기 위해 필요할 수 있다.
Figure pct00127
4.1.1.a 데카복실라제
도 10의 여러 반응들은 옥살로아세테이트 데카복실라제(단계 B), 말로닐-CoA 데카복실라제(단계 D) 및 피루베이트 카복실라제 또는 카복시키나제(단계 A)를 포함한, EC 부류 4.1.1의 데카복실라제 효소들에 의해 촉매화된다.
포스포에놀피루베이트의 옥살로아세테이트로의 카복실화는 포스포에놀피루베이트 카복실라제(EC 4.1.1.31)에 의해 촉매화된다. 예시적인 PEP 카복실라제 효소는 에스케리키아 콜라이에서 ppc(문헌[Kai et al., Arch. Biochem. Biophys. 414:170-179 (2003)]), 메틸로박테리움 엑스토르쿠엔스 AM1에서 ppcA(문헌[Arps et al., J. Bacteriol. 175:3776-3783 (1993)]), 및 코리네박테리움 글루타미쿰에서 ppc(문헌[Eikmanns et al., Mol . Gen . Genet. 218:330-339 (1989)])에 의해 암호화된다.
Figure pct00128
포스포에놀피루베이트의 옥살로아세테이트로의 카복실화를 위한 대체 효소는 PEP 카복시키나제(EC 4.1.1.32, 4.1.1.49)이며, 이는 ATP 또는 GTP를 동시에 형성한다. 대부분의 유기체에서 PEP 카복시키나제는 글루코스신생합성 기능을 수행하며 1 ATP의 댓가로 옥살로아세테이트를 PEP로 전환시킨다. 사카로마이세스 세레비지아에는 고유의 PEP 카복시키나제, PCK1이 글루코스신생합성 역할을 수행하는 하나의 상기와 같은 유기체이다(문헌[Valdes-Hevia et al., FEBS Lett. 258:313-316 (1989)]). 에스케리키아 콜라이는, 옥살로아세테이트를 생산함에 있어서 PEP 카복시키나제의 역할이 PEP 카복실라제에 비해 부수적인 것으로 여겨지기 때문에, 또 다른 상기와 같은 유기체이다(문헌[Kim et al., Appl . Environ . Microbiol . 70:1238-1241 (2004)]). 그럼에도 불구하고, PEP로부터 옥살로아세테이트를 향한 고유 에스케리키아 콜라이 PEP 카복시키나제의 활성이 최근에 에스케리키아 콜라이 K-12의 ppc 돌연변이체에서 입증되었다(문헌[Kwon et al., J. Microbiol . Biotechnol . 16:1448-1452 (2006)]). 이들 균주는 생육 결함을 나타내지 않았으며 높은 NaHCO3 농도에서 증가된 숙시네이트 생산을 가졌다. 에스케리키아 콜라이의 돌연변이 균주는 적응 진화에 이어서 우세한 CO2-고정 효소로서 Pck를 채택할 수 있다(문헌[Zhang et al. 2009]). 일부 유기체, 특히 반추위내 세균에서, PEP 카복시키나제는 PEP로부터 옥살로아세테이트를 생산하고 ATP를 생성시키는데 매우 효율적이다. 에스케리키아 콜라이내로 클로닝된 PEP 카복시키나제 유전자의 예는 만헤이미아 숙시니시프로듀센스(문헌[Lee et al., Biotechnol . Bioprocess Eng . 7:95-99 (2002)]), 아나에로비오스피릴룸 숙시니시프로듀센스(문헌[Laivenieks et al., Appl. Environ . Microbiol . 63:2273-2280 (1997)]), 및 액티노바실러스 숙시노제네스(상기 문헌[Kim et al.])로부터의 것들을 포함한다. 하에모필루스 인플루엔자에 의해 암호화된 PEP 카복시키나제 효소는 PEP로부터 옥살로아세테이트의 형성에 유효하다. 또 다른 적합한 후보는 메가티르수스 막시무스로부터의 PEPCK 효소이며, 이는 에스케리키아 콜라이 효소에서 율속인 것으로 생각되는 기질인 CO2에 대해 낮은 Km을 갖는다(문헌[Chen et al., Plant Physiol 128:160-164 (2002)]; 문헌[Cotelesage et al., Int .J Biochem . Cell Biol . 39:1204-1210 (2007)]). 쿠프리아비두스 네카토르로부터의 GTP-의존성 pepck 유전자 산물의 동역학은 옥살로아세테이트 형성을 촉진한다(미국특허 제 8,048,624 호 및 문헌[Lea et al, Amino Acids 20:225-41 (2001)]).
Figure pct00129
옥살로아세테이트 데카복실라제는 옥살로아세테이트의 말로네이트 세미알데하이드로의 데카복실화를 촉매화한다. 상기 반응을 촉매화하는 효소들은 마이코박테리움 튜베르큘로시스(젠뱅크 ID: O50463.4, GI: 160395583)의 kgd를 포함한다. 개선된 활성 및/또는 옥살로아세테이트에 대한 기질 특이성을 갖는 kgd로부터 진화된 효소들이 또한 개시되었다(미국특허 제 8,048,624 호). 상기 반응을 촉진하는데 유용한 추가적인 효소는 하기 표에 나타낸 케토-산 데카복실라제를 포함한다.
Figure pct00130
케토산의 탈카복실화는 피루베이트 데카복실라제(EC 4.1.1.1), 벤조일포메이트 데카복실라제(EC 4.1.1.7), 알파-케토글루타레이트 데카복실라제 및 분지쇄 알파-케토산 데카복실라제를 포함한, 다양한 기질 특이성을 갖는 다양한 효소들에 의해 촉매화된다. 피루베이트 데카복실라제(PDC)(또한 케토산 데카복실라제로 지칭됨)는 알콜 발효에 핵심 효소이며, 피루베이트의 아세트알데하이드로의 탈카복실화를 촉매화한다. 사카로마이세스 세레비지아에로부터의 PDC1 효소는 2-케토부티레이트, 2-케토발레레이트, 3-하이드록시피루베이트 및 2-페닐피루베이트를 포함한 지방족 2-케토산에 대해 광범위한 기질 범위를 갖는다(22). 상기 효소는 광범위하게 연구되어 왔으며, 변경된 활성에 대해 가공되었고, 에스케리키아 콜라이에서 기능적으로 발현되었다(문헌[Killenberg-Jabs et al., Eur. J. Biochem., 268:1698-1704(2001)]; 문헌[Li et al., Biochemistry. 38:10004-10012(1999)]; 문헌[ter Schure et al., Appl. Environ. Microbiol., 64:1303-1307(1998)]). pdc에 의해 암호화되는, 자이모모나스 모빌루스로부터의 PDC는 또한 광범위한 기질 범위를 가지며 상이한 기질들에 대한 친화성 변경에 지정된 공학 연구의 주제였다(문헌[Siegert et al., Protein Eng. Des. Sel., 18:345-357(2005)]). 상기 효소의 결정 구조를 입수할 수 있다(문헌[Killenberg-Jabs et al., Eur .J. Biochem . 268:1698-1704 (2001)]). 다른 잘-특성화된 PDC 효소는 아세토박터 파스퇴리안스(문헌[Chandra et al., Arch. Microbiol. 176:443-451(2001)]) 및 클루이베로마이세스 락티스(문헌[Krieger et al., Eur. J. Biochem., 269:3256-3263(2002)])로부터의 효소들을 포함한다.
Figure pct00131
PDC처럼, 벤조일포메이트 데카복실라제(EC 4.1.1.7)는 광범위한 기질 범위를 가지며 효소 공학 연구의 표적이었다. 슈도모나스 푸티다로부터의 효소가 광범위하게 연구되어 왔으며 상기 효소의 결정 구조를 입수할 수 있다(문헌[Polovnikova et al., 42:1820-1830(2003)]; 문헌[Hasson et al., 37:9918-9930(1998)]). 상기 슈도모나스 푸티다 효소의 활성 부위 중 2개 잔사의 부위-지정된 돌연변이는 천연 및 비-천연 기질들의 친화성(Km)을 변경시켰다(문헌[Siegert et al., Protein Eng. Des. Sel., 18:345-357(2005)]). 상기 효소의 성질들은 지정된 공학에 의해 추가로 개질되었다(문헌[Lingen et al., Chembiochem 4:721-726(2003)]; 문헌[Lingen et al., Protein Eng., 15:585-593(2002)]). mdlC에 의해 암호화되는, 슈도모나스 아에루기노사로부터의 효소가 또한 실험적으로 특성화되었다(문헌[Barrowman et al., 34:57-60(1986)]). 슈도모나스 스투트제리, 슈도모나스 플루오레센스 및 다른 유기체들로부터의 추가의 유전자들이 서열 상동성에 의해 추리되거나 슈도모나스 푸티다에서 개발된 생육 선택 시스템을 사용하여 동정될 수 있다(문헌[Henning et al., Appl. Environ. Microbiol., 72:7510-7517(2006)]).
Figure pct00132
2-옥소산을 데카복실화할 수 있는 세 번째 효소는 알파-케토글루타레이트 데카복실라제(KGD, EC 4.1.1.71)이다. 상기 부류 효소의 기질 범위는 지금까지 연구되지 않았다. 예시적인 KDC는 마이코박테리움 튜베르큘로시스로부터의 kdc에 의해 암호화되었다(문헌[Tian et al., PNAS 102:10670-10675(2005)]). KDC 효소 활성은 또한 브라디리조븀 자포니쿰 및 메소리조븀 로티를 포함한 리조비아의 몇몇 종들에서 검출되었다(문헌[Green et al., J. Bacteriol., 182:2838-2844(2000)]). 상기 KDC-암호화 유전자(들)가 이들 유기체에서 단리되지 않았지만, 게놈 서열을 입수할 수 있으며 각 게놈 중의 여러 유전자들이 추정적인 KDC로서 주석이 달린다. 유글레나 그라실리스로부터의 KDC가 또한 특성화되었으나 상기 활성과 관련된 유전자는 지금까지 동정되지 않았다(문헌[Shigeoka et al., Arch. Biochem. Biophys., 288:22-28(1991)]). 상기 N-말단으로부터 시작하여 처음 20개 아미노산이 서열화되었다 MTYKAPVKDVKFLLDKVFKV(문헌[Shigeoka and Nakano, Arch . Biochem . Biophys . 288:22-28 (1991)]). 상기 유전자는 KDC 활성에 대해 상기 N-말단 서열을 함유하는 유전자들을 시험함으로써 동정될 수 있었다. 신규 부류의 AKG 데카복실라제 효소들이 최근에 시아노박테리아, 예를 들어 시네코코커스 스피시즈 PCC 7002 및 상동기관에서 동정되었다(문헌[Zhang and Bryant, Science 334:1551-3 (2011)]).
Figure pct00133
상기 반응을 촉매화하기 위한 네 번째 후보 효소는 분지 쇄 알파-케토산 데카복실라제(BCKA)이다. 상기 부류의 효소는 탄소수 3 내지 6의 다양한 쇄 길이의 다양한 화합물들 상에서 작용하는 것으로 나타났다(문헌[Oku et al., J Biol Chem . 263:18386-18396 (1988)]; 문헌[Smit et al., Appl Environ Microbiol 71:303-311 (2005)]). 락토코커스 락티스 중의 효소가 2-옥소부타노에이트, 2-옥소헥사노에이트, 2-옥소펜타노에이트, 3-메틸-2-옥소부타노에이트, 4-메틸-2-옥소부타노에이트 및 아이소카프로에이트를 포함한 다양한 분지 및 선형 기질들 상에서 특성화되었다(문헌[Smit et al., Appl Environ Microbiol 71:303-311(2005)]). 상기 효소는 구조적으로 특성화되었다(문헌[Berg et al., Science . 318:1782-1786 (2007)]). 락토코커스 락티스 효소와 자이모모나스 모빌루스의 피루베이트 데카복실라제 간의 서열 정렬은 상기 촉매 및 기질 인식 잔기들이 거의 동일함을 가리키며(문헌[Siegert et al., Protein Eng Des Sel 18:345-357 (2005)]), 따라서 상기 효소는 방향 가공에 유망한 후보일 것이다. 사카로마이세스 세레비지아에의 여러 케토산 데카복실라제들은 ARO10, PDC6, PDC5, PDC1 및 THI3을 포함하여, 분지된 기질의 데카복실화를 촉매화한다(문헌[Dickenson et al, J Biol Chem 275:10937-42 (2000)]). 더욱 또 다른 BCKAD 효소는 마이코박테리움 튜베르큘로시스의 rv0853c에 의해 암호화된다(문헌[Werther et al, J Biol Chem 283:5344-54 (2008)]). 상기 효소는 알파-케토산 기질에 의해 알로스테릭 활성화되기 쉽다. BCKA에 의한 알파-케토글루타레이트의 데카복실화는 바실러스 서브틸리스에서 검출되었으나; 상기 활성은 다른 분지쇄 기질상에서의 활성에 비해 낮았으며(5%)(문헌[Oku and Kaneda, J Biol Chem . 263:18386-18396 (1988)]) 상기 효소를 암호화하는 유전자는 지금까지 동정되지 않았다. 추가적인 BCKA 유전자 후보를 락토코커스 락티스 단백질 서열에 대한 상동성에 의해 동정할 수 있다. 상기 효소에 대한 고득점 BLAST 적중 중 다수는 인돌피루베이트 데카복실라제(EC 4.1.1.74)로서 주석이 달린다. 인돌피루베이트 데카복실라제(IPDA)는 식물 및 식물 세균에서 인돌피루베이트의 인돌아세트알데하이드로의 데카복실화를 촉매화하는 효소이다. 호모 사피엔스 및 보스 타우루스로부터의 미토콘드리아 분지쇄 케토산 데하이드로게나제 복합체의 E1 서브유닛으로부터 유래한 재조합 분지쇄 알파-케토산 데카복실라제 효소가 에스케리키아 콜라이에서 클로닝되고 기능 발현되었다(문헌[Davie et al., J. Biol . Chem . 267:16601-16606 (1992)]; 문헌[Wynn et al., J. Biol . Chem . 267:12400-12403 (1992)]; 문헌[Wynn et al., J. Biol . Chem . 267:1881-1887 (1992)]). 이들 연구에서, 저자들은 샤페로닌 GroEL 및 GroES의 동시 발현이 상기 데카복실라제의 특이적 활성을 500배까지 증대시킴을 발견하였다(문헌[Wynn et al., J. Biol . Chem . 267:12400-12403 (1992)]). 이들 효소는 2개의 알파 및 2개의 베타 서브유닛으로 구성된다.
Figure pct00134
3-포스포노피루베이트 데카복실라제(EC 4.1.1.82)는 3-포스포노피루베이트에서 2-포스포노아세트알데하이드로의 데카복실화를 촉매화한다. 예시적인 포스포노피루베이트 데카복실라제 효소들은 스트렙토마이세스 루리두스의 dhpF, 스트렙토마이세스 비리도크로모게네스의 ppd, 스트렙토마이세스 베드모렌시스의 form2 및 스트렙토마이세스 하이그로스코피우스의 bcpC에 의해 암호화된다(문헌[Circello et al, Chem Biol 17:402-11 (2010)]; 문헌[Blodgett et al, FEMS Microbiol Lett 163:149-57 (2005)]; 문헌[Hidaka et al, Mol Gen Genet 249:274-80 (1995)]; 문헌[Nakashita et al, Biochim Biophys Acta 1490:159-62 (2000)]). aepY에 의해 암호화된 박테로이데스 프라길리스 효소는 또한 피루베이트 및 설포피루베이트를 데카복실화한다(문헌[Zhang et al, J Biol Chem 278:41302-8 (2003)]).
Figure pct00135
다수의 옥살로아세테이트 데카복실라제 효소, 예를 들어 에스케리키아 콜라이에서 eda 유전자 산물(EC 4.1.1.3)은 옥살로아세테이트의 말단산에 작용하여 피루베이트를 형성한다. 3-케토산 위치에서 데카복실화는 2-케토산 위치에서 말로네이트 세미알데하이드 형성 데카복실화와 경쟁하므로, 상기 효소 활성은 말로네이트 세미알데하이드 중간체를 통해 진행하는 경로를 갖는 숙주 균주에서 녹아웃될 수 있다.
말로닐-CoA 데카복실라제(EC 4.1.1.9)는 말로닐-CoA에서 아세틸-CoA로의 데카복실화를 촉매화한다. 효소들이 리조븀 레구미노사룸 및 애시네토박터 칼코아세티쿠스에서 특성화되었다(문헌[An et al, Eur J Biochem 257: 395-402 (1998)]; 문헌[Koo et al, Eur J Biochem 266:683-90 (1999)]). 유사한 효소들이 스트렙토마이세스 에리쓰레우스에서 특성화되었다(문헌[Hunaiti et al, Arch Biochem Biophys 229:426-39 (1984)]). 재조합 인간 말로닐-CoA 데카복실라제가 에스케리키아 콜라이에서 과발현되었다(문헌[Zhou et al, Prot Expr Pur 34:261-9 (2004)]). 말로닐-CoA를 데카복실화하는 메틸말로닐-CoA 데카복실라제 효소도 또한 적합한 후보이다. 예를 들어 베일로넬라 파르뷸라 효소는 기질로서 말로닐-CoA를 수용한다(문헌[Hilpert et al, Nature 296:584-5 (1982)]). 상기 에스케리키아 콜라이 효소는 ygfG에 의해 암호화된다(문헌[Benning et al., Biochemistry . 39:4630-4639 (2000)]; 문헌[Haller et al., Biochemistry . 39:4622-4629 (2000)]). 상기 에스케리키아 콜라이 효소의 입체 특이성은 보고되지 않았으나, 프로피오니제니움 모데스툼(문헌[Bott et al., Eur.J.Biochem. 250:590-599 (1997)]) 및 베일로넬라 파르뷸라(문헌[Huder et al., J.Biol.Chem. 268:24564-24571 (1993)])의 효소는 메틸말로닐-CoA의 (S)-입체이성체의 데카복실화를 촉매화한다(문헌[Hoffmann et al., FEBS.Lett. 220:121-125 (1987)]). 프로피오니제니움 모데스툼 및 베일로넬라 파르뷸라로부터의 효소들은 (S)-메틸말로닐-CoA를 데카복실화할 뿐만 아니라 에너지를 생산하는 수단으로서 세포막을 가로질러 나트륨 이온을 운반하는 펌프를 생성시키는 다수의 서브유닛들로 구성된다.
Figure pct00136
6.2.1.a CoA 신시타제
말로네이트의 말로닐-CoA로의 활성화는 EC 부류 6.2.1.a의 CoA 신시타제에 의해 촉매화된다. 상기 반응을 촉매화하는 CoA 신시타제 효소는 지금까지 문헌에 개시되지 않았다. 상술한 다수의 CoA 신시타제 효소들을 또한 도 10의 단계 K를 촉매화하는데 적용할 수 있다. 이들 효소는 아세틸-CoA 신시타제(표 16, 25) 및 ADP 형성 CoA 신시타제(표 17)를 포함한다.
6.4. 1.a 카복실라제
피루베이트 데카복실라제(EC 6.4.1.1)는 1 ATP의 비용으로 피루베이트를 옥살로아세테이트로 전환시킨다(단계 H). 예시적인 피루베이트 카복실라제 효소들은 사카로마이세스 세레비지아에의 PYC1(문헌[Walker et al., Biochem . Biophys . Res . Commun. 176:1210-1217 (1991)]) 및 PYC2(상기 문헌[Walker et al.]), 및 마이코박테리움 스메그마티스의 pyc(문헌[Mukhopadhyay and Purwantini, Biochim . Biophys . Acta 1475:191-206 (2000)])에 의해 암호화된다.
Figure pct00137
실시예 IV
미토콘드리아 아세틸- CoA로부터 시토솔 아세틸- CoA의 생산 경로
미토콘드리온으로부터 시토솔로 아세틸-CoA를 운반하는 기전은 아세틸-CoA로부터 기원하는 시토솔 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 생산 경로의 전개를 촉진할 수 있다. 예시적인 아세틸-CoA의 수출 기전은 도 4 및 5에 묘사된 것들을 포함하며, 미토콘드리온에서 아세틸-CoA 및 옥살로아세테이트로부터 시트레이트를 형성하고, 상기 시트레이트를 상기 미토콘드리온으로부터 시토솔로 전하고, 상기 시트레이트를 옥살로아세테이트 및 아세테이트 또는 아세틸-CoA로 전환시킴을 수반할 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명은 도 4 및 5 중 어느 하나에 묘사된 형질전환을 수행할 수 있는 효소들을 도입시킴으로써 시토솔 아세틸-CoA의 이용도를 증가시키도록 진핵생물 유기체를 가공하는 방법을 제공한다. 상기 필요한 형질전환을 수행할 수 있는 예시적인 효소들을 또한 본 발명에 개시한다.
미토콘드리아 아세틸-CoA로부터 시토솔 아세틸-CoA의 생산은 다수의 경로에 의해, 예를 들어 3 내지 5개의 효소 단계에 의해 수행될 수 있다. 하나의 예시적인 경로에서, 미토콘드리아 아세틸-CoA 및 옥살로아세테이트를 시트레이트 신타제에 의해 시트레이트에 결합시키고 상기 시트레이트를 시트레이트 또는 시트레이트/옥살로아세테이트 운반자에 의해 상기 미토콘드리온 밖으로 수출한다. 상기 시토솔에서 시트레이트의 효소 전환 결과 시토솔 아세틸-CoA 및 옥살로아세테이트가 생성된다. 이어서 상기 시토솔 옥살로아세테이트는 임의로 옥살로아세테이트 운반자 및/또는 시트레이트/옥살로아세테이트 운반자에 의해 상기 미토콘드리온내로 다시 운반될 수 있다. 또 다른 예시적인 경로에서, 상기 시토솔 옥살로아세테이트는 먼저 시토솔에서 말레이트로 효소에 의해 전환되고 이어서 말레이트 운반자 및/또는 말레이트/시트레이트 운반자에 의해 미토콘드리온내로 수송된다. 이어서 미토콘드리아 말레이트는 미토콘드리아 말레이트 데하이드로게나제에 의해 옥살로아세테이트로 전환될 수 있다.
더욱 또 다른 예시적인 경로에서, 미토콘드리아 아세틸-CoA는 시트라말레이트 중간체를 통해 시토솔 아세틸-CoA로 전환될 수 있다. 예를 들어, 미토콘드리아 아세틸-CoA 및 피루베이트는 시트라말레이트 신타제에 의해 시트라말레이트로 전환된다. 이어서 시트라말레이트는 시트라말레이트 또는 다이카복실산 운반자에 의해 시토솔로 운반될 수 있다. 이어서 시토솔 아세틸-CoA 및 피루베이트는 시트라말레이트로부터 직접 또는 간접적으로 재생되고, 상기 피루베이트는 미토콘드리아에 다시 들어갈 수 있다.
이들 라인을 따라, 미토콘드리아 아세틸-CoA로부터 시토솔 아세틸-CoA의 생산을 위한 다수의 예시적인 아세틸-CoA 경로를 도 4 및 5에 나타낸다. 하나의 실시태양에서, 미토콘드리아 옥살로아세테이트를 미토콘드리아 아세틸-CoA와 결합시켜 시트레이트 신타제에 의해 시트레이트를 형성한다. 상기 시트레이트는 시트레이트 운반자, 시트레이트/옥살로아세테이트 운반자 또는 시트레이트/말레이트 운반자에 의해 미토콘드리온 밖으로 운반된다. 시토솔 시트레이트는 ATP 시트레이트 라이아제에 의해 시토솔 아세틸-CoA 및 옥살로아세테이트로 전환된다. 또 다른 경로에서, 시토솔 시트레이트는 시트레이트 라이아제에 의해 아세테이트 및 옥살로아세테이트로 전환된다. 이어서 아세테이트는 아세틸-CoA 신시타제 또는 트랜스퍼라제에 의해 시토솔 아세틸-CoA로 전환될 수 있다. 다르게는, 아세테이트는 아세테이트 키나제에 의해 아세틸-포스페이트로 전환될 수 있고, 아세틸-포스페이트는 포스포트랜스아세틸라제에 의해 시토솔 아세틸-CoA로 전환될 수 있다. 아세틸-CoA 경로 효소에 예시적인 효소 후보를 하기에 개시한다.
옥살로아세테이트 및 미토콘드리아 아세틸-CoA의 전환은 시트레이트 신타제에 의해 촉매화된다(도 4 및 5, 단계 A). 몇몇 실시태양에서, 상기 시트레이트 신타제는 본 발명에 제공된 비-천연 진핵생물 유기체의 미토콘드리온에서 발현된다.
Figure pct00138
상기 시트레이트의 미토콘드리온에서 시토솔로의 운반은 다수의 운반 단백질들에 의해 수행될 수 있다. 상기와 같은 단백질들은 시트레이트를 직접(즉 시트레이트 운반자, 도 4 및 5, 단계 B) 시토솔로 전하거나 시트레이트를 시토솔로 수출하는 동시에 말레이트(즉 시트레이트/말레이트 운반자, 도 4, 단계 C) 또는 옥살로아세테이트(즉 시트레이트/옥살로아세테이트 운반자 도 5, 단계 C)와 같은 분자를 도 4 및 5에 나타낸 바와 같이 시토솔에서 미토콘드리아온으로 운반한다. 이러한 전환을 수행하는 예시적인 운반 효소를 하기 표에 제공한다.
Figure pct00139
ATP 시트레이트 라이아제(ACL, EC 2.3.3.8, 도 4 및 5, 단계 D)(또한 ATP 시트레이트 신타제라 칭한다)는 시트레이트의 옥살로아세테이트 및 아세틸-CoA로의 ATP-의존성 절단을 촉매화한다. 몇몇 실시태양에서, ATP 시트레이트 라이아제는 진핵생물 유기체의 시토솔에서 발현된다. ACL은 녹색 황 세균 클로로븀 리미콜라 및 클로로븀 테피듐에서 연구된 RTCA 주기의 효소이다. 클로로븀 리미콜라로부터의 알파(4)베타(4) 헤테로머성 효소가 에스케리키아 콜라이에서 클로닝되고 특성화되었다(문헌[Kanao et al., Eur. J. Biochem. 269:3409-3416 (2002)]). aclAB에 의해 암호화된 클로로븀 리미콜라 효소는 비가역적이며 상기 효소의 활성은 ADP/ATP의 비에 의해 조절된다. 상기 클로로븀 테피듐에서 클로로븀 테피듐으로부터의 재조합 ACL이 또한 에스케리키아 콜라이에서 발현되었으며, 촉매 기전에서 상기 알파 및 베타 서브유닛의 역할을 추론하는 연구에서 홀로효소가 시험관내에서 재현되었다(문헌[Kim and Tabita, J. Bacteriol. 188:6544-6552 (2006)]). ACL 효소는 또한 발네아륨 리토트로피쿰, 설퓨리하이드로제니븀 서브테라네움 및 세균 문 아퀴피카에의 다른 구성원들에서 동정되었다(문헌[Hugler et al., Environ . Microbiol. 9:81-92 (2007)]). 상기 활성은 또한 일부 진균에서 보고되었다. 예시적인 유기체는 솔다리아 마크로스포라(문헌[Nowrousian et al., Curr. Genet . 37:189-93 (2000)]), 아스퍼질러스 니둘란스 및 야로위아 리포리티카(문헌[Hynes and Murray, Eukaryotic Cell, July: 1039-1048, (2010)]), 및 아스퍼질러스 니거(문헌[Meijer et al. J. Ind . Microbiol . Biotechnol. 36:1275-1280 (2009)])를 포함한다. 다른 후보들은 서열 상동성을 근거로 발견될 수 있다. 이들 효소와 관련된 정보는 하기에 표로 작성되어 있다.
Figure pct00140
일부 유기체에서, 시트레이트의 옥살로아세테이트 및 아세틸-CoA로의 전환은 시트릴-CoA 중간체를 통해 진행되며 2개의 별도의 효소, 시트릴-CoA 신시타제(EC 6.2.1.18) 및 시트릴-CoA 라이아제(EC 4.1.3.34)에 의해 촉매화된다(문헌[Aoshima, M., Appl . Microbiol. Biotechnol . 75:249-255 (2007)]). 시트릴-CoA 신시타제는 시트레이트의 시트릴-CoA로의 활성화를 촉매화한다. 하이드로게노박터 서모필루스 효소는 각각 ccsA 및 ccsB에 의해 암호화된 크고 작은 서브유닛들로 구성된다(문헌[Aoshima et al., Mol . Micrbiol. 52:751-761 (2004)]). 아쿠이펙스 아에오리쿠스의 시트릴-CoA 신시타제는 sucC1 및 sucD1에 의해 암호화된 알파 및 베타 서브유닛으로 구성된다(문헌[Hugler et al., Environ. Microbiol. 9:81-92 (2007)]). 시트릴-CoA 라이아제는 시트릴-CoA를 옥살로아세테이트 및 아세틸-CoA로 분할한다. 상기 효소는 하이드로게노박터 써모필루스에서 ccl(문헌[Aoshima et al., Mol . Microbiol. 52:763-770 (2004)]) 및 아퀴펙스 아에오리쿠스에서 aq_150(상기 문헌[Hugler et al.(2007)])에 의해 암호화된 동종삼량체이다. 시트레이트를 옥살로아세테이트 및 시트릴-CoA로 전환시키는 상기 기전에 대한 유전자들이 또한 최근에 클로로븀 테피듐에서 보고되었다(문헌[Eisen et al., PNAS 99(14): 9509-14 (2002)).
Figure pct00141
시트레이트 라이아제(EC 4.1.3.6, 도 4 및 5, 단계 E)는 시트레이트의 아세테이트 및 옥살로아세테이트로의 절단을 생성시키는 일련의 반응을 촉매화한다. 몇몇 실시태양에서, 시트레이트 라이아제는 진핵생물 유기체의 시토솔에서 발현된다. 상기 효소는 혐기성 조건하에서 활성이며 3개의 서브유닛: 아실-담체 단백질(ACP, 감마), ACP 트랜스퍼라제(알파) 및 아실 라이아제(베타)로 구성된다. 효소 활성화는 통상적이지 않은 보결기, 2'-(5"-포스포리보실)-3'-데포스포-CoA(이는 구조가 아세틸-CoA와 유사하다)의 공유 결합 및 아세틸화를 사용한다. 아실화는 시트레이트 라이아제 신시타제 CitC에 의해 촉매화된다. 2개의 추가적인 단백질, CitG 및 CitX가 아포효소를 활성 홀로 효소로 전환시키는데 사용된다(문헌[Schneider et al., Biochemistry 39:9438-9450 (2000)]). 야생형 에스케리키아 콜라이는 시트레이트 라이아제 활성을 갖지 않지만; 몰리브데늄 보조인자 합성이 결핍된 돌연변이체는 활성 시트레이트 라이아제를 갖는다(문헌[Clark, FEMS Microbiol. Lett. 55:245-249 (1990)]). 상기 에스케리키아 콜라이 효소는 citEFD에 의해 암호화되며 시트레이트 라이아제 신시타제는 citC에 의해 암호화된다(문헌[Nilekani and SivaRaman, Biochemistry 22:4657-4663 (1983)]). 류코노스톡 메센테로이데스 시트레이트 라이아제가 에스케리키아 콜라이에서 클로닝되고, 특성화되고 발현되었다(문헌[Bekal et al., J. Bacteriol. 180:647-654 (1998)]). 시트레이트 라이아제 효소가 또한 살모넬라 티피뮤리움 및 클렙시엘라 뉴모니아에를 포함하여, 탄소 및 에너지원으로서 시트레이트를 사용하는 장내세균에서 동정되었다(문헌[Bott, Arch . Microbiol. 167: 78-88 (1997)]; 문헌[Bott and Dimroth, Mol. Microbiol. 14:347-356 (1994)]). 상기 언급한 단백질들을 하기에 표로 작성하였다.
Figure pct00142
아세테이트의 아세틸-CoA로의 아실화는 아세틸-CoA 신시타제 활성을 갖는 효소에 의해 촉매화된다(도 4 및 5, 단계 F). 몇몇 실시태양에서, 아세틸-CoA 신시타제는 진핵생물 유기체의 시토솔에서 발현된다. 상기 반응을 촉매화하는 2개의 효소는 AMP-형성 아세틸-CoA 신시타제(EC 6.2.1.1) 및 ADP-형성 아세틸-CoA 신시타제(EC 6.2.1.13)이다. AMP-형성 아세틸-CoA 신시타제(ACS)는 아세테이트의 아세틸-CoA로의 활성화에 우세한 효소이다. 예시적인 ACS 효소들이 에스케리키아 콜라이(문헌[Brown et al., J. Gen. Microbiol . 102:327-336 (1977)]), 랄스토니아 유트로파(문헌[Priefert and Steinbuchel, J. Bacteriol . 174:6590-6599 (1992)]), 메타노써모박터 써마유토트로피쿠스(문헌[Ingram-Smith and Smith, Archaea 2:95-107 (2007)]), 살모넬라 엔테리카(문헌[Gulick et al., Biochemistry 42:2866-2873 (2003)]) 및 사카로마이세스 세레비지아에(문헌[Jogl and Tong, Biochemistry 43:1425-1431 (2004)])에서 발견된다.
Figure pct00143
ADP-형성 아세틸-CoA 신시타제(ACD, EC 6.2.1.13)는 아실-CoA 에스터의 그의 상응하는 산으로의 전환을 ATP의 동시적인 합성과 커플링시키는 또 다른 후보 효소이다. 넓은 기질 특이성을 갖는 몇몇 효소들이 문헌에 개시되었다. AF1211에 의해 암호화되는, 알카에오글로부스 풀기두스로부터의 ACDI은 아세틸-CoA, 프로피오닐-CoA, 부티릴-CoA, 아세테이트, 프로피오네이트, 부티레이트, 아이소부티레이트, 아이소발레레이트, 숙시네이트, 퓨마레이트, 페닐아세테이트, 인돌아세테이트를 포함한 다양한 선형 및 분지 쇄 기질들 상에서 작용하는 것으로 나타났다(문헌[Musfeldt et al., J Bacteriol 184:636-644(2002)]). 할로알큘라 마리스모르투이로부터의 효소(숙시닐-CoA 신시타제로서 주석이 달린다)는 기질로서 프로피오네이트, 부티레이트, 및 분지 쇄 산(아이소발레레이트 및 아이소부티레이트)을 수용하고, 순 방향 및 역방향으로 작용하는 것으로 나타났다(문헌[Brasen et al., Arch Microbiol 182:277-287(2004)]). 초고온성 크렌고세균 파이로바쿨룸 아에로필룸으로부터의 PAE3250에 의해 암호화된 ACD는 모든 특성화된 ACD 중 가장 넓은 기질 범위를 보였으며, 아세틸-CoA, 아이소부티릴-CoA(바람직한 기질) 및 페닐아세틸-CoA와 반응하였다(상기 문헌[Brasen et al.(2004)]). 알카에로글로부스 풀기두스, 할로알큘라 마리스모르투이 및 파이로바쿨룸 아에로필룸으로부터의 효소들이 모두 에스케리키아 콜라이에서 클로닝되었으며, 기능적으로 발현되었고, 에스케리키아 콜라이에서 특성화되었다(상기 문헌[Musfeldt et al.]; 상기 문헌[Brasen et al.]). 추가적인 후보는 에스케리키아 콜라이에서 sucCD에 의해 암호화된 숙시닐-CoA 신시타제(문헌[Buck et al., Biochemistry 24:6245-6252 (1985)]) 및 슈도모나스 푸티다에서 아실-CoA 리가제(문헌[Fernandez-Valverde et al., Appl . Environ . Microbiol. 59:1149-1154 (1993)])를 포함한다. 이들 단백질 및 유전자와 관련된 정보를 하기에 나타낸다.
Figure pct00144
아세테이트에 CoA 부분을 가하기 위한 대체 방법은 한 쌍의 효소, 예를 들어 포스페이트-수송 아실트랜스퍼라제 및 아세테이트 키나제를 적용하는 것이다(도 4 및 5, 단계 F). 상기 활성은 ATP의 동시 소비와 함께 아세틸-CoA의 순 형성을 가능하게 한다. 몇몇 실시태양에서, 포스포트랜스아세틸라제는 진핵생물 유기체의 시토솔에서 발현된다. 예시적인 포스페이트-수송 아실트랜스퍼라제는 pta에 의해 암호화된 포스포트랜스아세틸라제이다. 에스케리키아 콜라이로부터의 pta 유전자는 아세틸-CoA를 아세틸-포스페이트로, 및 이와 역으로 전환시킬 수 있는 효소를 암호화한다(문헌[Suzuki, T. Biochim.Biophys.Acta 191:559-569 (1969)]). 상기 효소는 또한 상기 과정에서 아세틸-CoA 형성 프로피오네이트 대신에 프로피오닐-CoA를 사용할 수 있다(문헌[Hesslinger et al. Mol . Microbiol 27:477-492 (1998)]). 살모넬라 엔테리카 및 클라미도모나스 레인하르드티이를 포함한 다수의 다른 유기체들 중에 상동기관이 존재한다.
Figure pct00145
예시적인 아세테이트 키나제는 ackA에 의해 암호화된 에스케리키아 콜라이 아세테이트 키나제이다(문헌[Skarstedt and Silverstein J. Biol . Chem . 251:6775-6783 (1976)]). 살모넬라 엔테리카 및 클라미도모나스 레인하르드티이를 포함한 다수의 다른 유기체들 중에 상동기관이 존재한다. 이들 단백질 및 유전자와 관련된 정보를 하기에 나타낸다:
Figure pct00146
일부 실시태양에서, 시토솔 옥살로아세테이트를 옥살로아세테이트 운반자에 의해 미토콘드리온내로 다시 운반한다. 이어서 미토콘드리온내로 다시 운반된 옥살로아세테이트는 본 발명에 개시된 아세틸-CoA 경로에 사용될 수 있다. 상기 시토솔로부터 미토콘드리온으로의 옥살로아세테이트의 운반은 여러 운반 단백질들에 의해 수행될 수 있다. 상기와 같은 단백질들은 옥살로아세테이트를 직접(즉 옥살로아세테이트 운반자) 미토콘드리온내로 가져오거나 옥살로아세테이트를 상기 시토솔로 가져오는 동시에 시트레이트와 같은 분자(즉 시트레이트/옥살로아세테이트 운반자)를 도 5에 나타낸 바와 같이 상기 미토콘드리온으로부터 시토솔로 운반한다. 이러한 전환을 수행하는 예시적인 운반 시스템들을 하기 표에 제공한다.
Figure pct00147
일부 실시태양에서, 시토솔 옥살로아세테이트를 먼저 시토솔 말레이트 데하이드로게나제에 의해 말레이트로 전환시킨다(도 4, 단계 H). 시토솔 말레이트를 말레이트 운반자 또는 시트레이트/말레이트 운반자에 의해 미토콘드리온으로 운반한다(도 4, 단계 I). 이어서 미토콘드리아 말레이트를 미토콘드리아 말레이트 데하이드로게나제에 의해 옥살로아세테이트로 전환시킨다(도 4, 단계 J). 이어서 미토콘드리아 옥살로아세테이트를 본 발명에 개시된 아세틸-CoA 경로에 사용할 수 있다. 이들 효소 각각의 예시적인 예들을 하기에 제공한다.
옥살로아세테이트를 말레이트 데하이드로게나제(EC 1.1.1.37, 도 4, 단계 H)에 의해 말레이트로 전환시킨다. 말레이트가 시토솔로부터 미토콘드리온으로 운반된 다이카복실레이트인 경우, 예를 들어 도 3에 나타낸 바와 같이, 상기 두 시토솔 및 미토콘드리아 버전의 말레이트 데하이드로게나제 모두의 발현을 사용할 수 있다. 사카로마이세스 세레비지아에는 말레이트 데하이드로게나제의 3개의 사본, MDH1(문헌[McAlister-Henn and Thompson, J. Bacteriol. 169:5157-5166 (1987)]), MDH2(문헌[Minard and McAlister-Henn, Mol . Cell . Biol. 11:370-380 (1991)]; 문헌[Gibson and McAlister-Henn, J. Biol . Chem. 278:25628-25636 (2003)]), 및 MDH3(문헌[Steffan and McAlister-Henn, J. Biol . Chem. 267:24708-24715 (1992)])(이들은 각각 미토콘드리온, 시토솔 및 페록시솜으로 국소화된다)을 갖는다. 사카로마이세스 세레비지아에로부터의 상기 시토솔 말레이트 데하이드로게나제, MDH2에 가까운 상동기관들이 클루이베로마이세스 락티스 및 칸디다 트로피칼리스를 포함한 다수의 유기체들에서 발견된다. 에스케리키아 콜라이가 또한 mdh에 의해 암호화된 활성 말레이트 데하이드로게나제를 갖는 것으로 공지되어 있다.
Figure pct00148
시토솔로부터 미토콘드리온으로의 말레이트의 운반은 다수의 운반 단백질들에 의해 수행될 수 있다. 상기와 같은 단백질들은 말레이트를 미토콘드리온으로 직접(즉 말레이트 운반자) 가져오거나 말레이트를 시토솔로 가져오는 동시에 도 4에 나타낸 바와 같이 시트레이트와 같은 분자(예를 들어 시트레이트/말레이트 운반자)를 상기 미토콘드리온으로부터 시토솔로 운반한다. 이러한 전환을 수행하는 예시적인 운반 효소들을 하기 표에 제공한다.
Figure pct00149
말레이트를 말레이트 데하이드로게나제(EC 1.1.1.37, 도 4, 단계 J)에 의해 옥살로아세테이트로 전환시킬 수 있다. 말레이트가 시토솔로부터 미토콘드리온으로 운반된 다이카복실레이트인 경우, 몇몇 실시태양에서, 도 3 및 4에 나타낸 바와 같이, 상기 두 시토솔 및 미토콘드리아 버전의 말레이트 데하이드로게나제 모두가 발현된다. 사카로마이세스 세레비지아에는 말레이트 데하이드로게나제의 3개의 사본, MDH1(문헌[McAlister-Henn and Thompson, J. Bacteriol. 169:5157-5166 (1987)]), MDH2(문헌[Minard and McAlister-Henn, Mol . Cell . Biol. 11:370-380 (1991)]; 문헌[Gibson and McAlister-Henn, J. Biol . Chem. 278:25628-25636 (2003)]), 및 MDH3(문헌[Steffan and McAlister-Henn, J. Biol . Chem. 267:24708-24715 (1992)])(이들은 각각 미토콘드리온, 시토솔 및 페록시솜으로 국소화된다)을 갖는다. 사카로마이세스 세레비지아에로부터의 상기 미토콘드리아 말레이트 데하이드로게나제, MDH1에 가까운 상동기관들이 클루이베로마이세스 락티스, 야로위아 리포리티카, 칸디다 트로피칼리스를 포함한 다수의 유기체들에서 발견된다. 에스케리키아 콜라이가 또한 mdh에 의해 암호화된 활성 말레이트 데하이드로게나제를 갖는 것으로 공지되어 있다.
Figure pct00150
실시예 V
NADH를 선호하는 경로 효소의 사용
글루코스로부터 아세틸-CoA의 생산은 NADH의 형태로 4 이하의 환원 당량을 생성시킬 수 있다. 상기 환원 당량의 수율을 최대화하는 간단하고 에너지 효율적인 방식은 엠덴-마이어호프-파르나스 해당 경로(EMP 경로)를 사용하는 것이다. 다수의 탄수화물 사용 유기체에서, 글리세르알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나제에 의해 각각 글리세르알데하이드-3-포스페이트 분자의 산화당 하나의 NADH 분자가 생성된다. 상기 EMP 경로를 통해 대사된 글루코스 분자당 2 분자의 글리세르알데하이드-3-포스페이트가 생성된다면, 글루코스의 피루베이트로의 전환으로부터 2개의 NADH 분자가 수득될 수 있다.
상기 EMP 경로를 통해 대사된 글루코스의 분자당 2개의 피루베이트 분자가 생성된다면, 2개의 추가적인 NADH 분자가 피루베이트에서 아세틸-CoA로의 전환으로부터 생성될 수 있다. 이는 피루베이트를 아세틸-CoA로 전환시키는 하기의 효소 또는 효소들 중 어느 하나를 사용함으로써 수행될 수 있었다:
I. NAD-의존성 피루베이트 데하이드로게나제;
II. 피루베이트 포메이트 라이아제 및 NAD-의존성 포메이트 데하이드로게나제;
III. 피루베이트:페레독신 옥시도리덕타제 및 NADH:페레독신 옥시도리덕타제;
IV. 피루베이트 데카복실라제 및 NAD-의존성 아실화 아세틸알데하이드 데하이드로게나제;
V. 피루베이트 데카복실라제, NAD-의존성 아실화 아세트알데하이드 데하이드로게나제, 아세테이트 키나제, 및 포스포트랜스아세틸라제; 및
VI. 피루베이트 데카복실라제, NAD-의존성 아실화 아세트알데하이드 데하이드로게나제, 및 아세틸-CoA 신시타제.
종합해서, 4개의 NADH 분자가, 대사된 글루코스 분자당 획득될 수 있다. 하나의 태양에서, 상기 지방 알콜 경로는 아세틸-CoA로부터 3개의 환원 단계를 요한다. 따라서, 이들 3개의 환원 단계들은 각각 환원제로서 NADPH 또는 NADH를 사용할 것이며, 차례로 이들 분자는 각각 NADP 또는 NAD로 전환되는 것이 가능할 수 있다. 따라서, 일부 태양에서, 모든 환원 단계는, 상기 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산의 수율을 최대화하기 위해서 NADH-의존성인 것이 바람직할 수 있다. 따라서 높은 수율의 지방 알콜, 지방 알데하이드 및 지방 산이 하기에 의해 수행될 수 있다:
다른 환원 당량, 예를 들어 NADPH보다 NADH를 더 강하게 선호하는 내인성 또는 외인성 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 경로 효소의 동정 및 실행,
I. NADPH-의존성 환원 활성에 기여하는 하나 이상의 내인성 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 경로 효소를 약화시키거나,
II. 천연 버전보다 NADH를 더 강하게 선호하도록 내인성 또는 외인성 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 경로 효소의 보조인자 특이성을 변경시키거나,
III. 천연 버전보다 NADPH를 더 약하게 선호하도록 내인성 또는 외인성 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 경로 효소의 보조인자 특이성을 변경시킴.
상기 내인성 또는 외인성 DNA 서열로부터의 개별적인 효소 또는 단백질 활성을 당해 분야에 널리 공지된 방법을 사용하여 분석할 수 있다. 예를 들어, 상기 유전자들을 에스케리키아 콜라이에서 발현시키고 이들의 암호화된 단백질의 활성을 세포 추출물을 사용하여 측정할 수 있다. 다르게는, 상기 효소들을 당해 분야에 널리 공지된 표준 과정을 사용하여 정제하고 활성에 대해 분석할 수 있다. 분광광도측정 분석이 특히 유효하다.
상기 효소들의 보조인자 특이성을 변경시키는 다수의 예 및 방법들이 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어 카우리(Khoury) 등(문헌[Protein Sci. 2009 October; 18(10): 2125-2138])은 NADH에 대한 증가된 친화성 및 NADPH에 대한 감소된 친화성을 갖는 다수의 자일로스 리덕타제 효소들을 생성시켰다. 에사니(Ehsani) 등(문헌[Biotechnology and Bioengineering, Volume 104, Issue 2, pages 381-389, 1 October 2009])은 NADPH에 대한 활성을 증가시키면서 NADH에 대한 2,3-부탄다이올 데하이드로게나제의 활성을 대단히 감소시켰다. 마키엘센(Machielsen) 등(문헌[Engineering in Life Sciences, Volume 9, Issue 1, pages 38-44, February 2009])은 NADH에 대한 알콜 데하이드로게나제의 활성을 극적으로 증가시켰다. 카우리 등(문헌[Protein Sci. 2009 October; 18(10): 2125-2138])은 표 I에 25개가 넘는 다른 효소들의 보조인자 선호를 성공적으로 변화시킨 다수의 선행 예들을 나열한다. 추가적인 설명을 문헌[Lutz et al, Protein Engineering Handbook, Volume 1 and Volume 2, 2009, Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, in particular, Chapter 31: Altering Enzyme Substrate and Cofactor Specificity via Protein Engineering]에서 찾을 수 있다.
실시예 VI
경로 효소들의 보조인자 선호 측정
본 실시예는 효소의 보조인자 선호를 측정하기 위한 실험 방법을 개시한다.
상기 경로 단계들 각각에 대한 효소의 보조인자 선호를, 구성 또는 유도 프로모터 뒤의 플라스미드상에서 개별적인 유전자들을 클로닝하고 숙주 유기체, 예를 들어 에스케리키아 콜라이내로 형질전환시킴으로써 측정할 수 있다. 예를 들어, 1) 아세토아세틸-CoA에서 3-하이드록시부티릴-CoA로, 2) 3-하이드록시부티릴-CoA에서 3-하이드록시부티르알데하이드로, 3) 3-하이드록시부티르알데하이드에서 1,3-부탄다이올로의 경로 단계들을 촉매화하는 효소들을 암호화하는 유전자들을 하기에 개시하는 바와 같이 pZ-기본 발현 벡터상에 모을 수 있다.
pZ -기본 발현 벡터에서 스터퍼 ( Stuffer ) 단편의 치환
익스프레시스(Expressys)의 롤프 루츠(Rolf Lutz) 박사로부터 벡터 주쇄를 수득하였다(http://www.expressys.de/). 상기 벡터 및 균주는 루츠와 부야드(Lutz and Bujard)(문헌[Nucleic Acids Res 25, 1203-1210 (1997)])에 의해 개발된 pZ 발현 시스템을 기본으로 한다. pZE13luc, pZA33luc, pZS*13luc 및 pZE22luc는 스터퍼 단편으로서 루시페라제 유전자를 함유한다. 상기 루시페라제 스터퍼 단편을 적합한 제한 효소 부위들이 측면에 인접한 lacZ-알파 단편으로 치환하기 위해서, 상기 루시페라제 스터퍼 단편을 EcoRI 및 XbaI에 의한 절단에 의해 각각의 벡터로부터 제거한다. 상기 lacZ-알파 단편은 하기의 프라이머들과 pUC19로부터 PCR 증폭된다:
lacZ알파-RI
5'GACGAATTCGCTAGCAAGAGGAGAAGTCGACATGTCCAATTCACTGGCCGTCGTTTTAC3' (서열번호 1)
lacZ알파 3'BB
5'-GACCCTAGGAAGCTTTCTAGAGTCGACCTATGCGGCATCAGAGCAGA-3' (서열번호 2)
상기는 EcoRI 부위, NheI 부위, 리보솜 결합 부위, SalI 부위 및 개시 코돈의 5' 단부를 갖는 단편을 생성시킨다. 상기 단편의 3' 단부에는 정지 코돈, XbaI, HindIII 및 AvrII 부위가 있다. 상기 PCR 산물을 EcoRI 및 AvrII로 절단하고 EcoRI 및 XbaI로 절단된 기본 벡터에 연결시킨다(XbaI 및 AvrII는 양립성 단부이며 "비-부위"를 생성시킨다). NheI 및 XabI 제한 효소 부위는 함께 연결될 수 있는 양립성 단부를 생성시키기 때문에(그러나 어느 효소로도 절단되지 않는 연결 후 부위를 생성시킨다), 상기 벡터내로 클로닝된 유전자들은 함께 "바이오브릭(Biobrick)"될 수 있다(http://openwetware.org/wiki/Synthetic_Biology:BioBricks). 간단히, 상기 방법은, 유전자들 사이의 부위들이 각각의 첨가 후에 파괴되기 때문에, 제한된 수의 유전자를 동일한 2개의 제한 부위(상기 부위들이 상기 유전자들의 내부에 나타나지 않는 한)를 사용하여 상기 벡터내에 결합시킬 수 있다. 이들 벡터를 후속으로 퓨전(Phusion)(등록상표) 위치지정 돌연변이 키트(NEB, 미국 메릴랜드주 입스위치 소재)를 사용하여 변형시켜 EcoRI와 NheI 부위 사이에 이격자 서열 AATTAA를 삽입할 수 있다. 이는 RBS 및 개시 코돈을 결합시킨 RNA 중의 추정적인 줄기 루프 구조를 제거한다.
모든 벡터는 pZ 명칭 다음에 복제 기원, 항생제 내성 마커 및 프로모터/조절 단위를 가리키는 문자 및 숫자를 갖는다. 상기 복제 기원은 2문자이며 ColE1의 경우 E, p15A의 경우 A, 및 pSC101의 경우 S(뿐만 아니라 pSC101의 보다 낮은 사본수 버전은 S*로 표시한다)-계 기원에 의해 나타낸다. 첫 번째 숫자는 항생제 내성 마커(암피실린의 경우 1, 가나마이신의 경우 2, 클로람페니콜의 경우 3)를 나타낸다. 마지막 숫자는 관심 유전자를 조절하는 프로모터를 한정한다(PLtetO-1의 경우 1, PLlacO-1의 경우 2, 및 PA1lacO-1의 경우 3). 여기에 논의된 연구의 경우 우리는 상기 논의된 바와 같이 바이오브릭 삽입에 대해 변형된 3개의 기본 벡터, pZS*13S, pZA33S 및 pZE13S를 사용하였다.
이어서 경로 효소들을 암호화하는 유전자를 함유하는 플라스미드를 lacIQ(이는 아이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노사이드(IPTG)의 첨가에 의한 유도성 발현을 허용한다)를 함유하는 숙주 균주내로 형질전환시킬 수 있다. 이종 효소들의 활성을 시험관내 분석에서, 상기 경로 유전자들을 함유하는 플라스미드 구조물에 대한 숙주로서 균주 에스케리키아 콜라이 MG1655 lacIQ를 사용하여 시험한다. 세포를 각각의 구조물에 적합한 항생제를 함유하는 LB 배지(디프코(Difo))에서 호기성으로 증식시키고, 광학 밀도(OD600)가 대략 0.5에 도달했을 때 IPTG를 1 mM로 첨가하여 유도하였다. 세포를 6 시간 후에 수확하고 효소 분석을 하기에 논의된 바와 같이 수행하였다.
시험관내 효소 분석
활성 분석을 위한 조 추출물을 수득하기 위해서, 세포를 4,500 rpm에서 10분 동안 원심분리(벡크만-쿨터(Beckman-Coulter), 알레제라(Allegera) X-15R)에 의해 수확할 수 있다. 펠릿을 벤조나제 및 라이소자임과 함께 0.3 ㎖ 버그버스터(BugBuster)(노바겐(Novagen)) 시약에 재현탁시키고, 실온에서 서서히 진탕시키면서 약 15분 동안 용해를 진행한다. 무세포 용해물을 4 ℃에서 30분 동안 14,000 rpm에서 원심분리(에펜도르프 원심분리기 5402)에 의해 수득한다. 상기 샘플 중의 세포 단백질을 문헌[Bradford et al., Anal. Biochem. 72:248-254 (1976)]의 방법을 사용하여 측정하고, 특정한 효소 분석을 하기에 개시하는 바와 같이 수행한다. 활성을 단위/㎎ 단백질로 보고하며, 이때 활성 단위는 실온에서 1 분간 1 마이크로몰의 기질을 전환시키는데 필요한 효소의 양으로서 정의된다.
경로 단계들을 여러 문헌 출처로부터 적합한 과정을 사용하여 환원 방향으로 분석할 수 있다(문헌[Durre et al., FEMS Microbiol. Rev. 17:251-262 (1995)]; 문헌[Palosaari and Rogers, Bacteriol. 170:2971-2976 (1988)] 및 문헌[Welch et al., Arch. Biochem. Biophys. 273:309-318 (1989)]). NADH 또는 NADPH의 산화에 이어서 실온에서 총 240초 동안 4초마다 340 nM에서 흡광도를 판독할 수 있다. 상기 환원 분석을 100 mM MOPS(KOH로 pH 7.5로 조절됨), 0.4 mM NADH 또는 0.4 mM NADPH, 및 1 내지 50 μmol의 세포 추출물에서 수행할 수 있다. 카복실산 리덕타제-유사 효소들의 경우, ATP를 또한 포화 농도로 가할 수 있다. 상기 반응을 하기의 시약들의 첨가에 의해 개시시킬 수 있다: 100 μmol의 100 mM 아세토아세틸-CoA, 3-하이드록시부티릴-CoA, 3-하이드록시부티레이트, 또는 3-하이드록시부티르알데하이드. 분광광도계를 신속하게 공백으로 하고 이어서 동역학 판독을 시작한다. 생성되는 분당 340 nM에서의 흡광도 감소의 기울기를, 340 nM(6000)에서의 NAD(P)H의 몰 소광 계수 및 추출물의 단백질 농도와 함께 사용하여 비활성을 측정할 수 있다.
실시예 VII
NADPH 이용도의 증가 방법
본 발명의 일부 태양에서, 환원제로서 NADPH를 사용하는 활성을 갖는 경로 효소들을 사용하는 것이 유리할 수 있다. 예를 들어, NADPH-의존성 경로 효소들은 MI-FAE 주기, MD-FAE 주기 및/또는 종결 경로 중간체에 매우 특이적이거나, 기질로서 NADPH를 사용하는 유리한 동역학적 성질들을 가질 수 있다. 하나 이상의 경로 단계가 NADPH 의존성인 경우, NADPH 이용도를 증가시키기 위한 다수의 대체 접근법들을 사용할 수 있다. 이들 접근법은 하기를 포함한다:
1) 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제, 6-포스포글루코노락토나제, 및 6-포스포글루코네이트 데하이드로게나제(데카복실화)를 포함하는 펜토스 포스페이트 경로의 산화 분지를 통한, 야생형에 비교되는 흐름의 증가(이는 대사된 글루코스-6-포스페이트당 2개의 NADPH 분자를 생성시킬 것이다. 그러나 상기 데카복실화 단계는 1,3-부탄다이올의 최대 이론 수율을 감소시킬 것이다);
2) 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제, 6-포스포글루코노락토나제, 포스포글루코네이트 데하이드라타제, 및 2-케토-3-데옥시글루코네이트 6-포스페이트 알돌라제를 포함하는 엔트너 듀도로프 경로를 통한, 야생형에 비교되는 흐름의 증가;
3) NADH를 NADPH로 전환시키기 위한 용해성 트랜스하이드로게나제의 도입;
4) NADH를 NADPH로 전환시키기 위한 막-결합된 트랜스하이드로게나제의 도입;
5) NADP-의존성 글리세르알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나제의 사용;
6) 피루베이트를 아세틸-CoA로 전환시키기 위한 하기 효소들 및 효소 세트 중 어느 하나의 사용:
a) NADP-의존성 피루베이트 데하이드로게나제;
b) 피루베이트 포메이트 라이아제 및 NADP-의존성 포메이트 데하이드로게나제;
c) 피루베이트:페레독신 옥시도리덕타제 및 NADPH:페레독신 옥시도리덕타제;
d) 피루베이트 데카복실라제 및 NADP-의존성 아실화 아세트알데하이드 데하이드로게나제;
e) 피루베이트 데카복실라제, NADP-의존성 아세트알데하이드 데하이드로게나제, 아세테이트 키나제 및 포스포트랜스아세틸라제; 및
f) 피루베이트 데카복실라제, NADP-의존성 아세트알데하이드 데하이드로게나제, 및 아세틸-CoA 신시타제; 및 임의로 이들 효소의 약화된 NAD-의존성 버전들;
7) 고유의 글리세르알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나제, 피루베이트 데하이드로게나제, 포메이트 데하이드로게나제, 또는 아실화 아세틸알데하이드 데하이드로게나제의 보조인자 특이성을, 고유의 버전들보다 NADPH에 대해 더 강한 선호를 갖도록 변경시킴;
8) 고유의 글리세르알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나제, 피루베이트 데하이드로게나제, 포메이트 데하이드로게나제, 또는 아실화 아세틸알데하이드 데하이드로게나제의 보조인자 특이성을, 고유의 버전들보다 NADH에 대해 더 약한 선호를 갖도록 변경시킴.
상기 내인성 또는 외인성 DNA 서열들로부터의 개별적인 효소 또는 단백질 활성을 당해 분야에 널리 공지된 방법을 사용하여 분석할 수 있다. 예를 들어, 상기 유전자들을 에스케리키아 콜라이에서 발현시키고 이들의 암호화된 단백질의 활성을 선행 실시예에 개시된 바와 같이 세포 추출물을 사용하여 측정할 수 있다. 다르게는, 상기 효소들을 당해 분야에 널리 공지된 표준 과정을 사용하여 정제하고 활성에 대해 분석할 수 있다. 분광광도측정 분석이 특히 유효하다.
상기 효소들의 보조인자 특이성을 변경시키는 다수의 예 및 방법들이 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어 카우리 등(문헌[Protein Sci. 2009 October; 18(10): 2125-2138])은 NADH에 대한 증가된 친화성 및 NADPH에 대한 감소된 친화성을 갖는 다수의 자일로스 리덕타제 효소들을 생성시켰다. 에사니 등(문헌[Biotechnology and Bioengineering, Volume 104, Issue 2, pages 381-389, 1 October 2009])은 NADPH에 대한 활성을 증가시키면서 NADH에 대한 2,3-부탄다이올 데하이드로게나제의 활성을 대단히 감소시켰다. 마키엘센 등(문헌[Engineering in Life Sciences, Volume 9, Issue 1, pages 38-44, February 2009])은 NADH에 대한 알콜 데하이드로게나제의 활성을 극적으로 증가시켰다. 카우리 등(문헌[Protein Sci. 2009 October; 18(10): 2125-2138])은 표 I에 25개가 넘는 다른 효소들의 보조인자 선호를 성공적으로 변화시킨 다수의 선행 예들을 나열한다. 추가적인 설명을 문헌[Lutz et al, Protein Engineering Handbook, Volume 1 and Volume 2, 2009, Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, in particular Chapter 31: Altering Enzyme Substrate and Cofactor Specificity via Protein Engineering]에서 찾을 수 있다.
이들 단계에 대한 효소 후보들을 하기에 제공한다.
글루코스 -6- 포스페이트 데하이드로게나제
Figure pct00151
6- 포스포글루코노락토나제
Figure pct00152
6- 포스포글루코네이트 데하이드로게나제( 데카복실화 )
Figure pct00153
포스포글루코네이트 데하이드라타제
Figure pct00154
2- 케토 -3- 데옥시글루코네이트 6- 포스페이트 알돌라제
Figure pct00155
용해성 트랜스하이드로게나제
Figure pct00156
막- 결합된 트랜스하이드로게나제
Figure pct00157
NADP -의존성 글리세르알데하이드 -3- 포스페이트 데하이드로게나제
Figure pct00158
NAD -의존성 글리세르알데하이드 -3- 포스페이트 데하이드로게나제
Figure pct00159
문헌[Biochemistry, 1993, 32 (11), pp 2737-2740]에 개시된 에스케리키아 콜라이 K-12 MG1655로부터 돌연변이된 LpdA:
MSTEIKTQVVVLGAGPAGYSAAFRCADLGLETVIVERYNTLGGVCLNVGCIPSKALLHVAKVIEEAKALAEHGIVFGEPKTDIDKIRTWKEKVINQLTGGLAGMAKGRKVKVVNGLGKFTGANTLEVEGENGKTVINFDNAIIAAGSRPIQLPFIPHEDPRIWDSTDALELKEVPERLLVMGGGIIGLEMGTVYHALGSQIDVVVRKHQVIRAADKDIVKVFTKRISKKFNLMLETKVTAVEAKEDGIYVTMEGKKAPAEPQRYDAVLVAIGRVPNGKNLDAGKAGVEVDDRGFIRVDKQLRTNVPHIFAIGDIVGQPMLAHKGVHEGHVAAEVIAGKKHYFDPKVIPSIAYTEPEVAWVGLTEKEAKEKGISYETATFPWAASGRAIASDCADGMTKLIFDKESHRVIGGAIVGTNGGELLGEIGLAIEMGCDAEDIALTIHAHPTLHESVGLAAEVFEGSITDLPNPKAKKK (서열번호 3).
문헌[Biochemistry, 1993, 32 (11), pp 2737-2740]에 개시된 에스케리키아 콜라이 K-12 MG1655로부터 돌연변이된 LpdA:
MSTEIKTQVVVLGAGPAGYSAAFRCADLGLETVIVERYNTLGGVCLNVGCIPSKALLHVAKVIEEAKALAEHGIVFGEPKTDIDKIRTWKEKVINQLTGGLAGMAKGRKVKVVNGLGKFTGANTLEVEGENGKTVINFDNAIIAAGSRPIQLPFIPHEDPRIWDSTDALELKEVPERLLVMGGGIIALEMATVYHALGSQIDVVVRKHQVIRAADKDIVKVFTKRISKKFNLMLETKVTAVEAKEDGIYVTMEGKKAPAEPQRYDAVLVAIGRVPNGKNLDAGKAGVEVDDRGFIRVDKQLRTNVPHIFAIGDIVGQPMLAHKGVHEGHVAAEVIAGKKHYFDPKVIPSIAYTEPEVAWVGLTEKEAKEKGISYETATFPWAASGRAIASDCADGMTKLIFDKESHRVIGGAIVGTNGGELLGEIGLAIEMGCDAEDIALTIHAHPTLHESVGLAAEVFEGSITDLPNPKAKKK (서열번호 4).
NADP -의존성 포메이트 데하이드로게나제
Figure pct00160
문헌[Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, Volume 61, Issues 3-4, December 2009, Pages 157-161]에 개시된 돌연변이 칸디다 보디니이 효소:
MKIVLVLYDAGKHAADEEKLYGCTENKLGIANWLKDQGHELITTSDKEGETSELDKHIPDADIIITTPFHPAYITKERLDKAKNLKLVVVAGVGSDHIDLDYINQTGKKISVLEVTGSNVVSVAEHVVMTMLVLVRNFVPAHEQIINHDWEVAAIAKDAYDIEGKTIATIGAGRIGYRVLERLLPFNPKELLYYQRQALPKEAEEKVGARRVENIEELVAQADIVTVNAPLHAGTKGLINKELLSKFKKGAWLVNTARGAICVAEDVAAALESGQLRGYGGDVWFPQPAPKDHPWRDMRNKYGAGNAMTPHYSGTTLDAQTRYAEGTKNILESFFTGKFDYRPQDIILLNGEYVTKAYGKHDKK (서열번호 5).
문헌[Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, Volume 61, Issues 3-4, December 2009, Pages 157-161]에 개시된 돌연변이 칸디다 보디니이 효소:
MKIVLVLYDAGKHAADEEKLYGCTENKLGIANWLKDQGHELITTSDKEGETSELDKHIPDADIIITTPFHPAYITKERLDKAKNLKLVVVAGVGSDHIDLDYINQTGKKISVLEVTGSNVVSVAEHVVMTMLVLVRNFVPAHEQIINHDWEVAAIAKDAYDIEGKTIATIGAGRIGYRVLERLLPFNPKELLYYSPQALPKEAEEKVGARRVENIEELVAQADIVTVNAPLHAGTKGLINKELLSKFKKGAWLVNTARGAICVAEDVAAALESGQLRGYGGDVWFPQPAPKDHPWRDMRNKYGAGNAMTPHYSGTTLDAQTRYAEGTKNILESFFTGKFDYRPQDIILLNGEYVTKAYGKHDKK (서열번호 6).
문헌[Biochem J. 2002 November 1:367(Pt. 3):841-847]에 개시된 돌연변이 사카로마이세스 세레비지아에 효소:
MSKGKVLLVLYEGGKHAEEQEKLLGCIENELGIRNFIEEQGYELVTTIDKDPEPTSTVDRELKDAEIVITTPFFPAYISRNRIAEAPNLKLCVTAGVGSDHVDLEAANERKITVTEVTGSNVVSVAEHVMATILVLIRNYNGGHQQAINGEWDIAGVAKNEYDLEDKIISTVGAGRIGYRVLERLVAFNPKKLLYYARQELPAEAINRLNEASKLFNGRGDIVQRVEKLEDMVAQSDVVTINCPLHKDSRGLFNKKLISHMKDGAYLVNTARGAICVAEDVAEAVKSGKLAGYGGDVWDKQPAPKDHPWRTMDNKDHVGNAMTVHISGTSLDAQKRYAQGVKNILNSYFSKKFDYRPQDIIVQNGSYATRAYGQKK (서열번호 7).
NADPH : 페레독신 옥시도리덕타제
Figure pct00161
NADP -의존성 아실화 아세틸알데하이드 데하이드로게나제
Figure pct00162
피루베이트 데하이드로게나제, 피루베이트:페레독신 옥시도리덕타제, 피루베이트 포메이트 라이아제, 피루베이트 데카복실라제, 아세테이트 키나제, 포스포트랜스아세틸라제 및 아세틸-CoA 신시타제를 암호화하는 예시적인 유전자들은 상기 실시예 II에 개시되어 있다.
실시예 VIII
화학적 생산을 위한 사카로마이세스 세레비지아에 가공
진핵생물 숙주들은 원핵생물계에 비해 여러 가지 이점들을 갖는다. 상기 숙주는 번역-후 변형을 지지하고 막-고정되고 세포 소기관-특이성인 효소들을 접대할 수 있다. 진핵생물 중의 유전자들은 전형적으로, 유전자 발현의 타이밍 및 단백질 구조에 영향을 미칠 수 있는 인트론을 갖는다.
산업적인 화학적 생산에 매우 적합한 예시적인 원핵생물 유기체는 사카로마이세스 세레비지아에이다. 상기 유기체는 잘 특성화되어 있고, 유전적으로 다루기 쉬우며 산업적으로 확고하다. 유전자들을 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여 쉽게 삽입, 결실, 치환, 과발현 또는 저발현시킬 수 있다. 일부의 방법은 플라스미드-기재인 반면 다른 것들은 염색체를 변형시킨다(문헌[Guthrie and Fink. Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology , Part B,Volume 350, Academic Press (2002)]; 문헌[Guthrie and Fink, Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology , Part C, Volume 351, Academic Press (2002)]).
플라스미드-매개된 유전자 발현은 효모 에피솜 플라스미드(YEp)에 의해 가능하다. YEp는 높은 수준의 발현을 허용하지만; 그다지 안정하지 않으며 선택성 배지에서의 배양을 필요로 한다. YEp는 숙주 대사에 대해 높은 유지 비용을 갖는다. 영양요구성(예를 들어 URA3, TRP1, HIS3, LEU2) 또는 항생제 선택성 마커(예를 들어 ZeoR 또는 KanR)를 사용하는 고 사본수 플라스미드를, 종종 강한 구성 프로모터, 예를 들어 PGK1 또는 ACT1 및 전사 종결자-폴리아데닐화 영역, 예를 들어 CYC1 또는 AOX로부터의 것과 함께 사용할 수 있다. 당해 분야에 정통한 사람은 다수의 예를 입수할 수 있다. 상기 예는 pVV214(URA3 선택성 마커를 갖는 2 ㎛ 플라스미드) 및 pVV200(TRP1 선택성 마커를 갖는 2 ㎛ 플라스미드)를 포함한다(문헌[Van et al., Yeast 20:739-746 (2003)]). 다르게는, 낮은 사본수 플라스미드, 예를 들어 동원체 또는 CEN 플라스미드를 사용할 수 있다. 다시, 당해 분야에 정통한 사람은 다수의 예를 입수할 수 있다. 상기 예는 pRS313 및 pRS315(문헌[Sikorski and Hieter, Genetics 122:19-27 (1989)])를 포함하며, 이들은 둘 다 프로모터(예를 들어 PGK1 또는 ACT1) 및 종결자(예를 들어 CYC1, AOX)를 가할 것을 요한다.
산업적인 용도를 위해서, 유전자의 염색체 과발현이 플라스미드-매개된 과발현에 바람직할 수 있다. 미켈슨(Mikkelsen)과 동료들은 염색체 X, XI 및 XII상의 사카로마이세스 세레비지아에 게놈의 고도로 발현된 영역상에서 11개의 편입 부위를 동정하였다(문헌[Mikkelsen et al, Met Eng 14:104-11 (2012)]). 상기 부위들은 필수 유전자에 의해 분리되어, 부위들 간의 재조합 가능성을 최소화한다.
유전자를 진핵생물 유기체, 예를 들어 사카로마이세스 세레비지아에내로 삽입하기 위한 도구들이 당해 분야에 공지되어 있다. 특히 유용한 도구는 효모 편입형 플라스미드(YIp), 효모 인공 염색체(YAC) 및 유전자 표적화/상동성 재조합을 포함한다. 이들 도구를 또한 숙주 게놈의 삽입, 결실, 치환, 저발현 또는 달리 변경에 사용할 수 있다.
효모 편입형 플라스미드(YIp)는 DNA를 염색체에 효율적으로 편입시키는 고유 효모 상동성 재조합 시스템을 사용한다. 이들 플라스미드는 복제 기원을 함유하지 않으며, 따라서 오직 염색체 편입 후에만 유지될 수 있다. 예시적인 구조물은 프로모터, 관심 유전자, 종결자, 및 FRT 부위, loxP 부위가 측면에 인접한 프로모터, 또는 내성 마커의 제거 및 재순환을 가능하게 하는 직접적인 반복부를 갖는 선택성 마커를 포함한다. 상기 방법은 적합한 프라이머에 의한 관심 유전자의 합성 및 증폭에 이어서, 독특한 제한 부위, 예를 들어 EcoRI 및 XhoI 효소에 의해 생성된 부위에서 상기 유전자의 절단을 수반한다(문헌[Vellanki et al., Biotechnol Lett . 29:313-318 (2007)]). 상기 관심 유전자를 상기 프로모터의 하류에서, EcoRI 및 XhoI 부위에서 적합한 발현 벡터내로 삽입한다. 상기 유전자 삽입을 PCR 및 DNA 서열 분석에 의해 확인한다. 이어서 상기 재조합 플라스미드를 선형화하고 적합한 형질전환 방법을 사용하여 사카로마이세스 세레비지아에의 염색체 DNA내로 목적하는 부위에 편입시킨다. 상기 세포를 적합한 선택 마커가 있는 YPD 배지상에 도말하고 2 내지 3일 동안 배양한다. 형질전환체를 콜로니 PCR에 의해 필수 유전자 삽입에 대해 분석한다. loxP 부위가 측면에 인접한 구조물로부터 항생제 마커를 제거하기 위해서, Cre 리콤비나제를 함유하는 플라스미드를 도입시킨다. Cre 리콤비나제는 loxP 부위가 측면에 인접한 서열의 절제를 촉진한다(문헌[Gueldener et al., Nucleic Acids Res 30:e23 (2002)]). 생성 균주를 임의의 항생제의 존재 없이 배지 상에서 연속 배양에 의해 상기 Cre 플라스미드로 치유한다. 다르게는, 상기 Cre 리콤비나제 플라스미드는 URA 선택 마커를 가지며 상기 플라스미드를, URA에 대한 역-선별로서 작용하는 5-FOA 상에서 세포를 증식시킴으로써 효율적으로 제거한다. 이 방법을 또한 loxP의 사용 대신에 흔적없는 편입에 사용할 수 있다. 당해 분야의 숙련가는 URA를 마커로서 사용하여 편입시키고, URA-마이너스 플레이트상에서 증식시킴으로써 편입에 대해 선택하고, 이어서 5-FOA 플레이트상에서 증식시킴으로써 URA 돌연변이체에 대해 선택할 수 있다. 5-FOA를 URA 유전자 산물에 의해 독성 5-플루오로유라실로 전환시킨다. 다르게는, FLP-FRT 시스템을 사용하여 유전자를 염색체에 편입시킬 수 있다. 상기 시스템은 효모 사카로마이세스 세레비지아에의 2μ 플라스미드로부터 유래된 플리파제(Flipase) 재조합 효소(FLP)에 의한 짧은 플리파제 인식 표적(FRT) 부위 사이의 서열들의 재조합을 수반한다(문헌[Sadowski, P. D., Prog . Nucleic . Acid . Res . Mol . Biol . 51:53-91 (1995)]; 문헌[Zhu and Sadowski J . Biol . Chem . 270:23044-23054 (1995)]). 유사하게, 유전자 결실 방법론을 참고문헌들에 개시된 바와 같이 수행할 것이다: 문헌[Baudin et al. Nucleic.Acids Res . 21:3329-3330 (1993)]; 문헌[Brachmann et al., Yeast 14:115-132 (1998)]; 문헌[Giaever et al., Nature 418:387-391 (2002)]; 문헌[Longtine et al., Yeast 14:953-961 (1998)]; 문헌[ Winzeler et al., Science 285:901-906 (1999)].
효모 염색체의 조작에 대한 또 다른 접근법은 유전자 표적화이다. 상기 접근법은 효모에서 이중 가닥 DNA 파괴가 상동성 재조합에 의해 수복된다는 사실을 이용한다. 따라서 표적화 서열이 측면에 인접한 선형 DNA 단편들을 고유의 상동성 재조합 기구를 사용하여 효모 게놈내로 효율적으로 편입시킬 수 있다. 삽입 유전자의 적용 외에, 유전자 표적화 접근법은 게놈 DNA 조작, 예를 들어 유전자 결실, 유전자, 그의 프로모터 또는 다른 조절 요소 내의 돌연변이 도입, 또는 유전자로의 태그의 첨가에 유용하다.
효모 인공 염색체(YAC)는 경로 구성 및 조립에 유용한 인공 염색체이다. YAC는 큰 DNA 서열(100 내지 3000 kB)을 함유하는 다수 유전자의 발현을 가능하게 한다. YAC의 사용은 최근에 효모에서 플라베노이드 생합성의 가공에 적용되었다(문헌[Naesby et al, Microb Cell Fact 8:49-56 (2009)]). 상기 접근법에서, YAC는 최상의 조합을 찾기 위해서 무작위로 조립된 경로 유전자들을 신속하게 시험하는데 사용되었다.
유전자의 발현 수준을, 유전자의 서열 및/또는 그의 조절 영역을 변경시킴으로써 조절할 수 있다. 상기와 같은 유전자 조절 영역은 예를 들어 프로모터, 인헨서, 인트론 및 종결자를 포함한다. 음의 조절 요소, 예를 들어 억제인자 및/또는 침묵인자의 기능 파괴를 또한 유전자 발현의 증대에 사용할 수 있다. RNA계 도구를 또한 유전자 발현의 조절에 사용할 수 있다. 상기와 같은 도구는 RNA 앱타머, 리보스위치, 안티센스 RNA, 리보자임 및 리보스위치를 포함한다.
그의 프로모터에 의한 유전자의 변경을 위해서, 다양한 강도의 구성 및 유도 프로모터의 라이브러리들을 이용할 수 있다. 강한 구성 프로모터는 pTEF1, pADH1 및 해당 경로 유전자들로부터 유래된 프로모터를 포함한다. pGAL 프로모터가, 갈락토스에 의해 활성화되고 글루코스에 의해 억제되는 잘-연구된 유도 프로모터이다. 또 다른 통상적으로 사용되는 유도 프로모터는 구리 유도 프로모터 pCUP1이다(문헌[Farhi et al, Met Eng 13:474-81 (2011)]). 프로모터 강도의 추가적인 변화를 돌연변이 또는 셔플링 방법에 의해 도입시킬 수 있다. 예를 들어, 오류 유발 PCR을 적용하여 알퍼(Alper)와 동료에 의해 입증된 바와 같이 합성 프로모터 라이브러리를 생성시킬 수 있다(문헌[Alper et al, PNAS 102:12678-83 (2005)]). 프로모터 강도를 리포터 단백질, 예를 들어 베타-갈락토시다제, 형광 단백질 및 루시페라제에 의해 특성화할 수 있다.
상기 게놈 중의 삽입된 유전자의 배치는 그의 발현 수준을 변경시킬 수 있다. 예를 들어, 편입된 유전자의 과발현은 상기 유전자를 반복하는 DNA 요소, 예를 들어 리보솜 DNA 또는 긴 말단 반복부에 편입시킴으로써 성취될 수 있다.
효모 또는 다른 진핵생물 세포에서 외인성 발현의 경우, 유전자를 리더 서열의 첨가 없이 시토솔에서 발현시키거나, 적합한 표적화 서열, 예를 들어 상기 숙주 세포에 적합한 미토콘드리아 표적화 또는 분비 신호의 첨가에 의해, 미토콘드리온 또는 다른 세포 소기관에 표적화하거나 분비에 대해 표적화할 수 있다. 따라서, 표적화 서열의 제거 또는 포함을 위한 핵산 서열의 적합한 변형을 외인성 핵산 서열에 통합시켜 바람직한 성질들을 제공할 수 있는 것으로 생각된다. 유전자 변형을 또한 폴리펩타이드 합성을 증대시키기 위해 수행할 수 있다. 예를 들어, 리보솜 결합 부위를 최적 또는 공통 서열로 치환하고/하거나 유전자의 서열을 변경시켜 2차 구조를 가하거나 제거함으로써 번역 효율을 증대시킨다. 번역 속도를 또한, 하나의 암호화 서열을 또 다른 것으로 치환하여 숙주의 코돈 선호에 더 양호하게 부합시킴으로써 증가시킬 수 있다.
실시예 IX
지방 알콜 , 알데하이드 및 산의 제조를 위한 종결 경로
본 실시예는 MI-FAE 주기 또는 MD-FAE 주기의 중간체들을 관심 생성물, 예를 들어 지방 알콜, 지방 알데하이드 및 지방 산으로 전환시키기 위한 효소들을 개시한다. 경로를 도 1 및 7에 나타낸다. 단계 A 내지 G를 촉매화하는 효소들을 실시예 I에 개시한다. 본 실시예는 단계 H 내지 N을 촉매화하기에 적합한 효소들을 개시한다.
효소는 A. 티올라제, B. 3-케토아실-CoA 리덕타제, C. β-하이드록실-ACP 데하이드라타제, D. 에노일-CoA 리덕타제, E. 아실-CoA 리덕타제(알데하이드-형성), F. 알콜 데하이드로게나제, G. 아실-CoA 리덕타제(알콜-형성), H. 아실-CoA 하이드롤라제, 트랜스퍼라제 또는 신시타제, J. 아실-ACP 리덕타제, K. 아실-CoA:ACP 아실트랜스퍼라제, L. 티오에스테라제, N. 알데하이드 데하이드로게나제(산-형성) 또는 카복실산 리덕타제를 포함한다.
MI-FAE 주기 중간체의 지방 알콜, 지방 알데하이드 또는 지방 산 생성물로의 전환을 위한 경로들을 하기 표에 나타낸다. 이들 경로를 또한 본 발명에서 "종결 경로"라 칭한다.
Figure pct00163
생성물 특이성을 도 1 및 6에 나타낸 하나 이상의 효소들을 사용하여 미세-조정할 수 있다. 쇄 길이를 상술한 바와 같이 종결 경로의 하나 이상의 효소와 함께 신장 경로의 하나 이상의 효소들에 의해 조절한다. 상기 생성물의 구조를 상기 종결 경로의 하나 이상의 효소들에 의해 조절한다. 다양한 경로 중간체들과 반응하는 선택된 종결 경로 효소들의 예를 하기 표에 나타낸다. 추가적인 예를 본 발명에 개시한다.
Figure pct00164
단계 H. 아실- CoA 하이드롤라제 , 트랜스퍼라제 또는 신타제
아실-CoA 하이드롤라제, 트랜스퍼라제 및 신타제 효소는 아실-CoA 부분을 그들의 상응하는 산으로 전환시킨다. 상기와 같은 효소를 예를 들어 지방 아실-CoA를 지방 산으로, 3-하이드록시아실-CoA를 3-하이드록시산으로, 3-옥소아실-CoA를 3-옥소산으로, 또는 에노일-CoA를 에노산으로 전환시키는데 사용할 수 있다.
3.1.2 계열의 CoA 하이드롤라제 또는 티오에스테라제 효소는 아실-CoA 분자를 그의 상응하는 산으로 가수분해한다. 상이한 기질 범위를 갖는 다수의 CoA 하이드롤라제는 아실-CoA, 3-하이드록시아실-CoA, 3-옥소아실-CoA 및 에노일-CoA 기질을 그들의 상응하는 산으로 가수분해하기에 적합하다. 예를 들어, 라투스 노르베기쿠스 뇌로부터 acot12에 의해 암호화된 효소(문헌[Robinson et al., Biochem.Biophys.Res.Commun. 71:959-965 (1976)])는 부티릴-CoA, 헥사노일-CoA 및 말로닐-CoA와 반응할 수 있다. acot8에 의해 암호화된 인간 다이카복실산 티오에스테라제는 글루타릴-CoA, 아디필-CoA, 수베릴-CoA, 세바실-CoA, 및 도데칸다이오일-CoA에 대해 활성을 나타낸다(문헌[Westin et al., J.Biol.Chem. 280:38125-38132 (2005)]). 상기 효소에 가장 가까운 에스케리키아 콜라이 상동기관, tesB는 또한 일련의 CoA 티올에스터를 가수분해시킬 수 있다(문헌[Naggert et al., J Biol Chem 266:11044-11050 (1991)]). 유사한 효소가 래트 간에서 또한 특성화되었다(문헌[Deana R., Biochem Int 26:767-773 (1992)]). 에스케리키아 콜라이에서 하이드롤라제 활성을 갖는 추가의 효소로는 ybgC, paaI, 및 ybdB(문헌[Kuznetsova, et al., FEMS Microbiol Rev, 2005, 29(2):263-279]; 문헌[Song et al., J Biol Chem, 2006, 281(16):11028-38])가 있다. 완두콩 잎의 미토콘드리온으로부터의 효소가, 그의 서열이 보고되지는 않았지만, 광범위한 기질 특이성을 가지며, 아세틸-CoA, 프로피오닐-CoA, 부티릴-CoA, 팔미토일-CoA, 올레오일-CoA, 숙시닐-CoA 및 크로토닐-CoA에 대한 활성이 입증되었다(문헌[Zeiher et al., Plant . Physiol . 94:20-27 (1990)]). 사카로마이세스 세레비지아에로부터의 아세틸-CoA 하이드롤라제, ACH1은 또 다른 후보 하이드롤라제를 나타낸다(문헌[Buu et al., J. Biol . Chem . 278:17203-17209 (2003)]). 아릴-CoA 하이드롤라제 활성을 갖는 추가의 효소로는 마이코박테리움 튜베르큘로시스의 팔미토일-CoA 하이드롤라제(문헌[Wang et al., Chem . Biol . 14:543-551 (2007)]) 및 entH에 의해 암호화된 에스케리키아 콜라이의 아실-CoA 하이드롤라제(문헌[Guo et al., Biochemistry 48:1712-1722 (2009)])가 있다. 추가의 CoA 하이드롤라제 효소들은 상기에 개시되어 있다.
Figure pct00165
3-하이드록시아실-CoA, 3-옥소아실-CoA 및 에노일-CoA 중간체에 대해 활성인 CoA 하이드롤라제 효소가 또한 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 에노일-CoA 기질을 그의 상응하는 산으로 전환시키기 위한 효소는 애시드아미노코커스 페르멘탄스로부터의 글루타코네이트 CoA-트랜스퍼라제이다. 상기 효소는 글루타릴-CoA, 아세틸-CoA 및 3-부테노일-CoA에 대한 활성을 갖는 아실-CoA 하이드롤라제로 부위-지정 돌연변이에 의해 형질전환된다(문헌[Mack et al., FEBS . Lett . 405:209-212 (1997)]). 또 다른 적합한 효소는 에스케리키아 콜라이의 fadM 티오에스테라제 III이다. 상기 효소는 올리에이트 베타-산화에 관련되며 바람직한 기질은 3,5-테트라데카다이에노일-CoA이다(문헌[Nie et al, Biochem 47:7744-51 (2008)]).
Figure pct00166
3-하이드록시아이소부티릴-CoA 하이드롤라제는 3-하이드록시아실-CoA 기질에 대해 활성이다(문헌[Shimomura et al., J Biol Chem . 269:14248-14253 (1994)]). 상기 효소를 암호화하는 유전자는 라투스 노르베기쿠스(문헌[Shimomura et al., Methods Enzymol. 324:229-240 (2000)]) 및 호모 사피엔스(상기 문헌[Shimomura et al.])의 hibch를 포함한다. 유사한 유전자 후보들, 예를 들어 사카로마이세스 세레비지아에의 hibch 및 바실러스 세레우스의 BC _2292가 또한 서열 상동성에 의해 동정될 수 있다. 예시적인 3-옥소아실-CoA 하이드롤라제는 솔라눔 라이코페르시쿰의 MKS2이다(문헌[Yu et al, Plant Physiol 154:67-77 (2010)]). 상기 효소의 고유 기질은 3-옥소-미리스토일-CoA이며, C14 쇄 길이 생성물을 생산한다.
Figure pct00167
CoA 트랜스퍼라제는 CoA 부분의 하나의 분자에서 또 다른 분자로의 가역적인 수송을 촉매화한다. 다수의 형질전환들이 카복실산을 그의 상응하는 아실-CoA 유도체로 활성화시키는데 CoA 트랜스퍼라제를 필요로 한다. CoA 트랜스퍼라제 효소들은 개방 문헌에 개시되었으며 상기 단계들에 적합한 후보들을 나타낸다. 이들을 하기에 개시한다.
클로스트리디움 클루이베리의 cat1, cat2, 및 cat3의 유전자 산물들이 각각 숙시닐-CoA, 4-하이드록시부티릴-CoA 및 부티릴-CoA 트랜스퍼라제 활성을 나타내는 것으로 입증되었다(문헌[ Seedorf et al., Proc . Natl . Acad . Sci U.S.A 105:2128-2133 (2008)]; 문헌[Sohling et al., J Bacteriol. 178:871-880 (1996)]). 유사한 CoA 트랜스퍼라제 활성들이 또한 트리코모나스 바기날리스, 트리파노소마 브루세이, 클로스트리디움 아미노부티리쿰 및 포르피로모나스 진지발리스 중에 존재한다(문헌[Riviere et al., J. Biol . Chem . 279:45337-45346 (2004)]; 문헌[van Grinsven et al., J. Biol . Chem . 283:1411-1418 (2008)]).
Figure pct00168
CoA 공여체로서 아세틸-CoA를 사용하는 지방 아실-CoA 트랜스퍼라제는 에스케리키아 콜라이 atoA(알파 서브유닛) 및 atoD(베타 서브유닛) 유전자에 의해 암호화된 아세토아세틸-CoA 트랜스퍼라제이다(문헌[Korolev et al., Acta Crystallogr.D.Biol.Crystallogr. 58:2116-2121 (2002)]; 문헌[Vanderwinkel et al., 33:902-908 (1968)]). 상기 효소는 쇄 길이 C3 -6의 기질상에서 넓은 기질 범위를 가지며(문헌[Sramek et al., Arch Biochem Biophys 171:14-26 (1975)]) 다양한 분지 및 선형 3-옥소 및 아실-CoA 기질, 예를 들어 아이소부티레이트(문헌[Matthies et al., Appl Environ Microbiol 58:1435-1439(1992)]), 발레레이트(문헌[Vanderwinkel et al., Biochem . Biophys . Res . Commun . 33:902-908 (1968)]) 및 부타노에이트(문헌[Vanderwinkel et al., Biochem . Biophys . Res . Commun . 33:902-908 (1968)])로부터 CoA 부분을 아세테이트로 수송하는 것으로 나타났다. 상기 효소는 아세토아세테이트에 의해 전사 수준에서 유도되며, 따라서 조절성 조절의 변형이 상기 효소를 경로내로 가공하기 위해 필요할 수 있다(문헌[Pauli et al., Eur.J Biochem. 29:553-562 (1972)]). 유사한 효소들이 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032(문헌[Duncan et al., 68:5186-5190 (2002)]), 클로스트리디움 아세토부틸리쿰(문헌[Cary et al., Appl Environ Microbiol 56:1576-1583 (1990)]; 문헌[Wiesenborn et al., Appl Environ Microbiol 55:323-329 (1989)]), 및 클로스트리디움 사카로페르부틸아세토니쿰(문헌[Kosaka et al., Biosci . Biotechnol Biochem. 71:58-68 (2007)]) 중에 존재한다.
Figure pct00169
베타-케토아디필-CoA 트랜스퍼라제(또한 숙시닐-CoA:3:옥소산-CoA 트랜스퍼라제로서 공지됨)는 3-옥소아실-CoA 기질상에서 활성이다. 상기 효소는 슈도모나스 푸티다에서 pcaI 및 pcaJ에 의해 암호화된다(문헌[Kaschabek et al., J Bacteriol. 184:207-215 (2002)]). 유사한 효소들이 애시네토박터 스피시즈 ADP1(문헌[Kowalchuk et al., Gene 146:23-30 (1994)]), 스트렙토마이세스 코엘리콜라 및 슈도모나스 낵무시이(이전에는 sp.B13)에서 발견된다(문헌[Gobel et al., J Bacteriol. 184:216-223 (2002)]; 문헌[Kaschabek et al., J Bacteriol . 184:207-215 (2002)]). 추가의 예시적인 숙시닐-CoA:3:옥소산-CoA 트랜스퍼라제가 헬리코박터 파이로리(문헌[Corthesy-Theulaz et al., J Biol . Chem . 272:25659-25667 (1997)]), 바실러스 서브틸리스(문헌[Stols et al., Protein Expr . Purif . 53:396-403 (2007]) 및 호모 사피엔스(문헌[Fukao, T., et al., Genomics 68:144-151 (2000)]; 문헌[Tanaka, H., et al., Mol Hum Reprod 8:16-23 (2002)])에서 특성화되었다. 이들 효소와 관련된 젠뱅크 정보를 하기에 요약한다.
Figure pct00170
아실-CoA 기질의 그의 산 생성물로의 전환을 6.2.1 계열 효소 중 CoA 산-티올 리가제 또는 CoA 신시타제에 의해 촉매화할 수 있다. ATP를 ADP로 전환시키는 CoA 신시타제(ADP-형성)는 가역적이며 산 형성 방향으로 반응하는 반면, AMP 형성 효소는 아실-CoA에 대한 산의 활성화만을 촉매화한다. 지방 산 형성의 경우, AMP 형성 효소의 결실 또는 약화는 반대 흐름을 감소시킨다. ADP-형성 아세틸-CoA 신시타제(ACD, EC 6.2.1.13)는 아실-CoA 에스터의 그의 상응하는 산으로의 전환을 ATP의 동반 합성과 커플링시키는 효소이다. AF1211에 의해 암호화된, 알카에오글로부스 풀기두스로부터의 ACD I은 아이소부티레이트, 아이소펜타노에이트 및 퓨마레이트를 포함한 다양한 선형 및 분지 쇄 기질들 상에서 작용하는 것으로 나타났다(문헌[Musfeldt et al., J bacteriol 184:636-644(2002)]). AF1983에 의해 암호화된, 알카에오글로부스 풀기두스 중의 두 번째 가역적인 ACD가 또한 광범위한 기질 범위를 갖는 것으로 나타났다(문헌[Musfeldt et al., J bacteriol 184:636-644(2002)]). 할로알큘라 마리스모르투이로부터의 효소(숙시닐-CoA 신시타제로서 주석이 달렸다)는 기질로서 프로피오네이트, 부티레이트, 및 분지 쇄 산(아이소발레레이트 및 아이소부티레이트)을 수용하며, 순 방향 및 역방향으로 작용하는 것으로 나타났다(문헌[Brasen et al., Arch Microbiol 182:277-287(2004)]). 초고온성 크렌고세균인 파이로바큘룸 아에로필룸으로부터의 PAE3250에 의해 암호화된 ACD는, 아세틸-CoA, 아이소부티릴-CoA(바람직한 기질) 및 페닐아세틸-CoA와 반응하는 모든 특성화된 ACD 중 가장 광범위한 기질 범위를 나타내었다(상기 문헌[Brasen et al.]). 상기 효소가 숙주 유기체의 생리 온도에서 작용하기 위해서는 방향 진화 또는 공학이 필요할 수도 있다. 알카에오글로부스 풀기두스, 할로알큘라 마리스모르투이 및 파이로바큘룸 아에로필룸으로부터의 효소들은 모두 에스케리키아 콜라이에서 클로닝되었으며, 기능 발현되었고, 특성화되었다(상기 문헌[Brasen and Schonheit et al.]; 문헌[Musfeldt et al., J bacteriol 184:636-644(2002)]). 추가의 후보는 에스케리키아 콜라이 중의 sucCD에 의해 암호화된 숙시닐-CoA 신시타제 및 사카로마이세스 세레비지아에의 LSC1 및 LSC2 유전자이다. 이들 효소는 1 ATP의 동반 소비(생체 내에서 가역적인 반응이다)로 숙시네이트로부터 숙시닐-CoA의 형성을 촉매화한다(문헌[Buck et al., Biochemistry 24:6245-6252(1985)]). 슈도모나스 푸티다로부터 아실 CoA 리가제는 아세트산, 프로피온산, 부티르산, 발레르산, 헥산산, 헵탄산 및 옥탄산을 포함한 다수의 지방족 기질 및 페닐아세트산 및 페녹시아세트산과 같은 방향족 화합물상에서 작용하는 것으로 입증되었다(문헌[Fernandez-Valverde et al., Appl.Environ.Microbiol. 59:1149-1154 (1993)]). 관련된 효소인, 리조븀 레구미노사룸으로부터의 말로닐 CoA 신시타제(6.3.4.9)는 다수의 이산, 즉 에틸-, 프로필-, 알릴-, 아이소프로필-, 다이메틸-, 사이클로프로필-, 사이클로프로필메틸렌-, 사이클로부틸-, 및 벤질-말로네이트를 그들의 상응하는 모노티오에스터로 전환시킨다(문헌[Pohl et al., J.Am. Chem . Soc . 123:5822-5823 (2001)]).
Figure pct00171
단계 J. 아실 - ACP 리덕타제
아실-ACP의 그의 상응하는 알데하이드로의 환원은 아실-ACP 리덕타제(AAR)에 의해 촉매화된다. 상기와 같은 형질전환은 도 1 및 7의 단계 J에 묘사되어 있다. 적합한 효소 후보는 시네코코커스 엘론가투스 PCC7942의 orf1594 유전자 산물 및 그의 상동기관을 포함한다(문헌[Schirmer et al, Science, 329: 559-62 (2010)]). 상기 시네코코커스 엘론가투스 PCC7942 아실-ACP 리덕타제는, 대부분의 시아노세균 유기체에서 보존되는 것으로 보이는 오페론에서 알데하이드 데카보닐라제와 동시발현된다. 알데하이드 데카보닐라제와 함께 에스케리키아 콜라이에서 발현된 상기 효소는 알칸을 생산하는 능력을 제공한다. 프로클로로코커스 마리누스 AAR이 또한 에스케리키아 콜라이내로 클로닝되었으며, 데카보닐라제와 함께 알칸을 생산하는 것으로 입증되었다(미국특허공개 제 2011/0207203 호).
Figure pct00172
단계 K. 아실- CoA : ACP 아실트랜스퍼라제
아실-CoA의 아실-ACP로의 수송은 EC 부류 2.3.1에서 아실트랜스퍼라제 효소에 의해 촉매화된다. 상기 능력을 갖는 효소들은 상기에 개시되어 있다.
단계 L. 티오에스테라제
아실-ACP 티오에스테라제 효소는 아실-ACP를 그의 상응하는 산으로 전환시킨다. 상기와 같은 형질전환은 도 1의 단계 L에서 요구된다. 예시적인 효소는 아라비도프시스 탈리아나의 FatA 및 FatB 동형을 포함한다(문헌[Salas et al, Arch Biochem Biophys 403:25-34 (2002)]). 이들 두 단백질의 활성은 탄소쇄 길이에 따라 변하며, FatA는 올레일-ACP를 선호하고 FatB는 팔미토일-ACP를 선호한다. 상이한 쇄 길이 특이성을 갖는 다수의 티오에스테라제는 제 WO 2008/113041 호에 나열되어 있으며 하기 표에 포함된다. 예를 들어, 앞서 에스케리키아 콜라이에서 움벨루라리아 칼리포르니카로부터의 FatB와 같은 중간쇄 식물 티오에스테라제의 발현은 높은 수준의 중간쇄 지방 산, 주로 라우레이트(C12:0)를 축적시키는 것으로 나타났다. 유사하게, 에스케리키아 콜라이에서 쿠페아 팔루스트리스 FatB1 티오에스테라제의 발현은 C8-10:0 생성물의 축적을 도출하였다(문헌[Dehesh et al, Plant Physiol 110:203-10 (1996)]). 유사하게, 에스케리키아 콜라이에서 발현된 카르타무스 팅크토리우스 티오에스테라제는 C18:1 쇄 종결의 50배 초과의 상승 및 유리 지방 산으로서의 방출을 도출한다(문헌[Knutzon et al, Plant Physiol 100:1751-58 (1992)]). 티오에스테라제의 기질 특이성 변경 방법이 또한 당해 분야에 공지되어 있다(예를 들어 EP1605048).
Figure pct00173
단계 N. 알데하이드 데하이드로게나제 (산-형성) 또는 카복실산 리덕타제
알데하이드의 산으로의 전환은 산-형성 알데하이드 데하이드로게나제에 의해 촉매화된다. 다수의 사카로마이세스 세레비지아에 효소, 예를 들어 ALD1(ALD6), ALD2 및 ALD3(문헌[Navarro-Avino et al, Yeast 15:829-42 (1999)]; 문헌[Quash et al, Biochem Pharmacol 64:1279-92 (2002)])은 알데하이드의 산으로의 산화를 촉매화한다. 미토콘드리아 단백질 ALD4 및 ALD5는 유사한 형질전환을 촉매화한다(문헌[Wang et al, J Bacteriol 180:822-30 (1998)]; 문헌[Boubekeur et al, Eur J Biochem 268:5057-65 (2001)]). HFD1은 헥사데칸알 데하이드로게나제를 암호화한다. 예시적인 산-형성 알데하이드 데하이드로게나제 효소를 하기 표에 나열한다.
Figure pct00174
산의 알데하이드로의 전환은 열역학적으로 불리하며 전형적으로는 에너지-풍부 보조인자 및 다수의 효소 단계들을 필요로 한다. 예를 들어, 부탄올 생합성에서 부티레이트의 부티르알데하이드로의 전환은 CoA 트랜스퍼라제 또는 라이가제에 의한 부티레이트의 그의 상응하는 아실-CoA로의 활성화에 이어서 CoA-의존성 알데하이드 데하이드로게나제에 의한 부티르알데하이드로의 환원에 의해 촉매화된다. 다르게는, 산을 아실-포스페이트로 활성화시키고 후속으로 포스페이트 리덕타제에 의해 환원시킬 수 있다. 단일 효소에 의한 산에서 알데하이드로의 직접적인 전환은 1.2.1 계열의 이작용성 카복실산 리덕타제 효소에 의해 촉매화된다. 이들 형질전환을 촉매화하는 예시적인 효소는 카복실산 리덕타제, 알파-아미노아디페이트 리덕타제 및 레티노산 리덕타제를 포함한다.
노카르디아 이오웬시스에서 발견되는 카복실산 리덕타제(CAR)는 카복실산의 그의 상응하는 알데하이드로의 마그네슘, ATP 및 NADPH-의존성 환원을 촉매화한다(문헌[Venkitasubramanian et al., J Biol . Chem . 282:478-485 (2007)]). 상기 효소의 천연 기질은 벤조산이며 상기 효소는 길이 C12 -18의 지방 산을 포함하여 방향족 및 지방족 기질의 넓은 허용성을 나타낸다(문헌[Venkitasubramanian et al., Biocatalysis in Pharmaceutical and Biotechnology Industries. CRC press (2006)]; 제 WO 2010/135624 호). CAR은 불활성 아포-효소를 활성 홀로-효소로 전환시키는 포스포판테테인 트랜스퍼라제(PPTase)에 의한 번역후 활성화를 요한다(문헌[Hansen et al., Appl . Environ . Microbiol 75:2765-2774 (2009)]). 노카르디아 CAR 효소는 에스케리키아 콜라이에서 클로닝되고 기능 발현되었다(문헌[Venkitasubramanian et al., J Biol. Chem. 282:478-485(2007)]). 특이적인 PPTase를 암호화하는 npt 유전자의 동시발현은 상기 효소의 활성을 개선시킨다. 마이코박테리움 스피시즈 균주 JLS로부터의 관련 효소는 길이 C12 -16의 지방 산의 환원을 촉매화한다. 지방 산에 대해 증대된 활성을 갖는 상기 효소의 변이체들이 제 WO 2010/135624 호에 개시되어 있다. 알파-아미노아디페이트 리덕타제(AAR, EC 1.2.1.31)는 일부 진균 종에서 리신 생합성 경로에 참여한다. 상기 효소는 자연적으로 알파-아미노아디페이트를 알파-아미노아디페이트 세미알데하이드로 환원시킨다. 상기 카복실기는 먼저 아데닐레이트의 ATP-의존성 형성을 통해 활성화되고, 이어서 NAD(P)H에 의해 환원되어 알데하이드 및 AMP를 제공한다. CAR처럼, 상기 효소는 마그네슘을 사용하며 PPTase에 의한 활성화를 요한다. AAR 및 그의 상응하는 PPTase의 후보 효소들은 사카로마이세스 세레비지아에(문헌[Morris et al., Gene 98:141-145 (1991)]), 칸디다 알비칸스(문헌[Guo et al., Mol.Genet.Genomics 269:271-279 (2003)]), 및 스키조사카로마이세스 폼베(문헌[Ford et al., Curr . Genet . 28:131-137 (1995)])에서 발견된다. 상기 스키조사카로마이세스 폼베로부터의 AAR은 에스케리키아 콜라이에서 발현시 현저한 활성을 나타내었다(문헌[Guo et al., Yeast 21:1279-1288 (2004)]). 페니실리움 크리소제눔으로부터의 AAR은 대체 기질로서 S-카복시메틸-L-시스테인을 수용하지만, 아디페이트, L-글루타메이트 또는 다이아미노피멜레이트와 반응하지 않는다(문헌[Hijarrubia et al., J Biol . Chem . 278:8250-8256 (2003)]). 페니실리움 크리소제눔 PPTase를 암호화하는 유전자는 지금까지 동정되지 않았으며 높은-신뢰도 적중도 서열 비교 상동성 검색에 의해 확인되지 않았다.
Figure pct00175
추가적인 car 및 npt 유전자들을 서열 상동성에 근거하여 동정할 수 있다.
Figure pct00176
스트렙토마이세스 그리세우스에서 발견된 추가적인 효소 후보는 griC 및 griD 유전자에 의해 암호화된다. 상기 효소는 griC 또는 griD의 결실이 3-아미노-4-하이드록시벤조산 대사의 분류 산물인 세포외 3-아세틸아미노-4-하이드록시벤조산의 축적을 도출하기 때문에 3-아미노-4-하이드록시벤조산을 3-아미노-4-하이드록시벤즈알데하이드로 전환시키는 것으로 여겨진다(문헌[Suzuki, et al., J. Antibiot. 60(6):380-387 (2007)]). griC 및 griD와 SGR_665(노카르디아 이오웬시스 npt와 서열이 유사한 효소)와의 동시발현이 이로울 수 있다.
Figure pct00177
실시예 X
사카로마이세스 세레비지아에에서 글루코스로부터 1,3- 부탄다이올의 생산
본 실시예는 사카로마이세스 세레비지아에에서 글루코스로부터 1,3-BDO의 제작 및 생합성 생산을 예시한다.
1,3-BDO 생산을 위한 경로는 2개의 MI-FAE 주기 효소(티올라제 및 3-옥소아실-CoA 리덕타제)와 종결 경로 효소(아실-CoA 리덕타제(알데하이드-형성) 및 알콜 데하이드로게나제)로 구성된다. 사카로마이세스 세레비지아에내로 가공된 상기 1,3-BDO 경로는 아세틸-CoA를 1,3-BDO로 형질전환시키는 4개의 효소 단계로 구성된다. 첫 번째 단계는 아세토아세틸-CoA 티올라제 효소(THL)에 의한 아세틸-CoA의 아세토아세틸-CoA로의 2개 분자의 축합을 수반한다. 두 번째 단계에서, 아세토아세틸-CoA는 아세토아세틸-CoA 리덕타제(또한 3-하이드록시부티릴-CoA 데하이드로게나제(HBD)라 칭함)에 의해 3-하이드록시부티릴-CoA로 환원된다. 3-하이드록시부티릴-CoA 리덕타제(ALD)는 아실-CoA로부터 알데하이드의 형성을 촉매화한다. 3-하이드록시부티르알데하이드의 1,3-BDO로의 추가적인 환원은 1,3-BDO 데하이드로게나제(ADH)에 의해 촉매화된다.
시토솔에서 13-BDO 생산이 가능하기 위해서, 2개의 아세틸-CoA 형성 경로를 사카로마이세스 세레비지아에내로 가공하였다. 첫 번째 경로는 피루베이트 데카복실라제(도 2E), 아세트알데하이드 데하이드로게나제(도 2F) 및 아세틸-CoA 신시타제(도 2B)에 의한 피루베이트의 아세틸-CoA로의 전환을 수반한다. 두 번째 경로는 피루베이트 포메이트 라이아제(도 2H)이다.
상기 1,3-BDO 경로의 각각의 효소 단계에 대해서, 적용 가능한 유전자의 목록을 보강증거를 위해 모았다. 상기 연구에서 클로닝되고 평가된 유전자들을 하기 표 1에, 폴리펩타이드 서열에 적합한 참고문헌 및 URL 인용과 함께 나타낸다.
아세토아세틸 - CoA 티올라제 ( THL )
예시적인 단계 ID 유전자 NCBI 수탁번호 GI 공급원 유기체
도 1A 1502 thiI P45359.1 1174677 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 ATCC 824
도 1A 1491 atoB NP_416728 16130161 에스케리키아 콜라이 균주 K-12 서브균주 MG1655
도 1A 560 thiA NP_349476.1 15896127 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 ATCC 824
도 1A 1512 phbA P07097.4 135759 주글로에아 라미게라
도 1A 1501 phbA P14611.1 135754 랄스토니아 유트로파 H16
3- 하이드록시부티릴 - CoA 데하이드로게나제 ( HBD )
도 1B 1495 hbd AAM14586.1 20162442 클로스트리디움 베이제린키이 NCIMB 8052
3- 하이드록시부티릴 - CoA 리덕타제 ( ALD )
도 1E 707 Lvis _1603 YP_795711.1 116334184 락토바실러스 브레비스 ATCC 367
3- 하이드록시부티르알데하이드 리덕타제 ( ADH )
도 1F 28 bdh BAF45463.1 124221917 클로스트리디움 사카로페르부틸아세토니쿰
피루베이트 포메이트 라이아제 ( PflAB )
도 2H 1799 pflA NP_415422.1 16128869 에스케리키아 콜라이 MG1655
도 2H 500 pflB NP_415423 16128870 에스케리키아 콜라이 MG1655
PDH 우회 ( 알데하이드 데하이드로게나제 , 아세틸- CoA 신타제 )
도 2F 1849 ALD6 NP_015264.1 6325196 사카로마이세스 세레비지아에 S288c
도 2B 1845 Acs AAL23099.1 16422835 살모넬라 엔테리카 LT2
도 2B 1845A Acsm AAL23099.1 16422835 살모넬라 엔테리카 LT2
유전자들이 고유 또는 야생형 유기체의 게놈 DNA로부터 PCR을 통해 클로닝되었다. 상기 경로 유전자들의 증폭에 사용된 프라이머들은 하기와 같다(5'에서 3'으로; 밑줄 친 서열들은 유전자 특이적이다):
Thl 1502:
FP:TCTAATCTAAGTTTTCTAGAACTAGTAAAGATGAGAGATGTAGTAATAGTAAGTGCTGTA (서열번호 8)
RP:GATATCGAATTCCTGCAGCCCGGGGGATCCTTAGTCTCTTTCAACTACGAGAGCTGTT (서열번호 9)
Thl 1491:
FP:TCTAATCTAAGTTTTCTAGAACTAGTAAAGATGAAAAATTGTGTCATCGTCAGTG (서열번호 10)
RP:GATATCGAATTCCTGCAGCCCGGGGGATCCTTAATTCAACCGTTCAATCACCATCGCAAT (서열번호 11)
Thl 560:
FP:AATCTAAGTTTTCTAGAACTAGTAAAGATGAAAGAAGTTGTAATAGCTAGTGCAGTAA (서열번호 12)
RP:TATCGAATTCCTGCAGCCCGGGGGATCCTTAATGGTGATGGTGATGATGGCACTTTTCTA (서열번호 13)
Thl 1512:
FP:TCTAATCTAAGTTTTCTAGAACTAGTAAAGATGAGCACCCCGTCCATCGTCA (서열번호 14)
PR:GATATCGAATTCCTGCAGCCCGGGGGATCCCTAAAGGCTCTCGATGCACATCGCC (서열번호 15)
Thl 1501:
FP:TAAGCTAGCAAGAGGAGAAGTCGACATGACTGACGTTGTCATCGTATCCGC (서열번호 16)
RP: GCCTCTAGGAAGCTTTCTAGATTATTATTTGCGCTCGACTGCCAGC (서열번호 17)
Hbd 1495:
FP:AAGCATACAATCAACTATCTCATATACAATGAAAAAGATTTTTGTACTTGGAGCA (서열번호 18)
RP:AAAAATCATAAATCATAAGAAATTCGCTTATTTAGAGTAATCATAGAATCCTTTTCCTGA (서열번호 19)
Ald 707:
FP:AATCTAAGTTTTCTAGAACTAGTAAAGATGAACACAGAAAACATTGAACAAGCCAT (서열번호 20)
RP:TATCGAATTCCTGCAGCCCGGGGGATCCCTAAGCCTCCCAAGTCCGTAATGAGAACCCTT (서열번호 21)
Adh 28:
FP:CCAAGCATACAATCAACTATCTCATATACAATGGAGAATTTTAGATTTAATGCATATACA (서열번호 22)
RP:AATAAAAATCATAAATCATAAGAAATTCGCTTAAAGGGACATTTCTAAAATTTTATATAC (서열번호 23)
1845A는 야생형(1845) 효소의 서열 변이체이다. 상기 변이는 스타라이(Starai)와 동료(문헌[Starai et al, J Biol Chem 280: 26200-5 (2005)])에 의해 개시된, 잔기 Leu-641(L641P)에서의 점 돌연변이이다. 상기 돌연변이의 기능은 예를 들어 아세틸화에 의한 번역후 조절을 방지하고 Acs 효소를 그의 활성 상태에서 유지시키는 것이다.
표 2에 나타낸 셔틀 플라스미드를 사카로마이세스 세레비지아에에서 이종 유전자의 발현을 위해 제작하였다. 플라스미드 d9, d10 및 d11은 각각 Ura, His 및 Leu의 선택 마커를 갖는 빈 플라스미드 대조군들이다. 플라스미드 d12 또는 d13은 URA3 선택 마커와 함께 단일 ALD 또는 ADH 유전자를 함유한다. 플라스미드 d14, d16 및 d17은 HIS3 선택 마커와 함께 hbd 및 thil 유전자를 함유한다.
플라스미드 선택 마커 유전자
pESC-L URA3 NA
pESC-H HIS3 NA
pESC-U LEU2 NA
pY3Hd1 URA3 1799(pflA)-500(pflB)
pY3Hd2 HIS3 1799(pflA)-500(pflB)
pY3Hd3 LEU2 1799(pflA)-500(pflB)
pY3Hd4 URA3 1849(ALD6)-1845(Acs)
pY3Hd5 URA3 1849(ALD6)-1845A(Acsm)
pY3Hd6 URA3 1495(Hbd) - 1491(Thl)
pY3Hd7 URA3 1495(Hbd) - 560(Thl)
pY3Hd8 LEU2 28(ADH)-707(ALD)
pY3Hd9 URA3 NA
pY3Hd10 HIS3 NA
pY3Hd11 LEU2 NA
pY3Hd12 URA3 707(ALD)
pY3Hd13 URA3 28(ADH)
pY3Hd14 HIS3 1495(Hbd) - 1502(Thl)
pY3Hd15 HIS3 1495(Hbd) - 1512(Thl)
pY3Hd16 HIS3 1495(Hbd) - 1491(Thl)
pY3Hd17 HIS3 1495(Hbd) - 560 (Thl)
효모 숙주 BY4741[MATa his3Δ0 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0]은 상기 경로 플라스미드들을 접대하기 위해서 적합한 영양요구성 마커와 함께 야생형 실험 균주로서 상기 연구를 위한 숙주 균주로서 선택되었다. BY4741을 1,3-BDO 경로 유전자를 함유하는 플라스미드 단독으로 또는 PDH 우회 유전자 또는 pflAB 유전자를 함유하는 플라스미드와 함께 형질전환시켰다. 본 실시예에 사용된 벡터 주쇄는 p427TEF 효모 발현 벡터, pY3H 가교 벡터(선라이즈 사이언스(Sunrise Science)) 및 pESC 효모 에피토프 표지 벡터(에이질런트 테크놀로지스(Agilent Technologies))를 포함한다. 사카로마이세스 세레비지아에로부터의 TEF1 프로모터, CYC 종결자 및 URA3 선택 마커를 함유하는 pY3H 벡터를 사용하여 상이한 선택 마커들을 갖는 이중-프로모터 플라스미드를 형성시켰다. 사카로마이세스 세레비지아에로부터 ADH1 프로모터 및 종결자 서열을 상기 TEF1 프로모터의 상류에 삽입하였으며 따라서 상기 두 전사 단위는 연이은 배향으로 있다. SV40 핵 국소화 신호 서열을 상기 클로닝 과정 중에 제거하였다. 생성 플라스미드를 pY3Hd9라 명명하였다. 상이한 선택 마커를 갖는 플라스미드를 제작하기 위해서, 상기 pY3Hd9 중의 URA3 유전자를 사카로마이세스 세레비지아에로부터의 HIS3 또는 LEU2 유전자로 치환하여 각각 pY3Hd10 및 pY3Hd11을 생성시켰다. 4개의 1,3-BDO 경로 유전자 중 2개, Hbd 및 Th1(유전자 번호에 대해서 표 103을 참조하시오)을, 상기 Hbd 유전자의 발현이 ADH1 프로모터에 의해 조절되는 반면 상기 Th1 유전자의 발현은 TEF1 프로모터에 의해 조절되도록 HIS3 마커를 갖는 이중-프로모터 플라스미드 내로 클로닝시켰다(pY3Hd14 내지 17). Ald 및 Adh 유전자를 상기 ADH1 프로모터가 상기 adh 유전자를 구동하고 상기 TEF1 프로모터가 상기 ald 유전자를 구동하도록 LEU2 선택 마커를 갖는 이중-프로모터 플라스미드 내로 클로닝시켰다(pY3Hd8). 상기 PflAB 유전자 또는 PDH 우회 유전자(ALD6 및 acs)를 상기 URA3 마커를 갖는 이중-프로모터 플라스미드 내로 클로닝시켰으며, 이때 pflA 또는 ALD6은 상기 ADH1 프로모터 하에서 조절되고 pflB 또는 acs는 TEF1 프로모터 하에서 조절된다. 효모 형질전환을 동결된-EZ 효모 형질전환(자이모 리써치(Zymo Research))을 사용하여 수행하였다.
표 3 및 4는 시험된 플라스미드 및 실험 조건의 조합을 나타낸다.
Figure pct00178
Figure pct00179
표 3에서, 콜로니들을 상응하는 아미노산 드롭아웃을 갖는 2% 글루코스 배지 5 ㎖에 접종하고 대략 48시간 동안 30 ℃에서 배양하였다. 세포를 간단히 회전시키고, 트윈-80을 갖고 에르고스테롤이 첨가된 2 ㎖의 신선한 2% 글루코스 배지에 재-현탁하였다. 재현탁된 배양물을 20 ㎖ 병 중의 10 ㎖의 신선한 글루코스 배지에 가하여 0.2의 출발 OD를 획득하였다. 혐기성 배양을 위해서, 상기 배양물을 함유하는 병을 진공시키고 질소로 충전하였다. 미세-호기성 증식을 위해서, 23G 바늘을 삽입하였다. 모든 배양물을 24 시간 동안 진탕시키면서 30 ℃에서 배양하였다. 표 4에서, 상기 실험을 96-웰 플레이트에서 수행하고 세포를 변화하는 글루코스 및 아세테이트 농도(5% 글루코스, 10% 글루코스, 5% 글루코스 + 50 mM 아세테이트, 및 10% 글루코스 + 50 mM 아세테이트)를 갖는 1.2 ㎖의 배지에서 호기성으로 증식시켰다.
상기 배양 상등액 중의 글루코스, 1,3-BDO, 알콜 및 다른 유기산 부산물의 농도를 HPX-87H 컬럼(바이오래드(BioRad))을 사용하여 HPLC에 의해 측정하였다.
MI-FAE 주기 및 종결 경로 유전자들을 pflAB 또는 PDH 우회의 존재 또는 부재하에서 시험하였다. 도 9 내지 11에 도시된 바와 같이, 이들 구조물은 효모 사카로마이세스 세레비지아에 BY4741에서 0.3 내지 3.35 mM의 1,3-BDO를 생산하였고, 에탄올이 상기 시험된 샘플에서 생산되었다. 상기 PDH 우회(이때, ALD6 및 acs 또는 acsm 유전자의 과발현)는 1,3-BDO의 생산을 개선시켰다.
실시예 XI
1,3- 부탄다이올 경로 효소의 효소 활성
본 실시예는 시험관내 분석을 사용하는 1,3-BDO 경로 효소 활성의 검출을 개시한다.
이종 효소의 활성을, 상기 경로 유전자들을 함유하는 플라스미드 구조물에 대한 숙주로서 내부 효모 균주를 사용하여, 시험관내 분석으로 시험하였다. 세포를 각 구조물들에 적합한 아미노산을 함유하는 효모 배지에서 호기성으로 증식시켰다. 활성 분석을 위한 조 추출물을 수득하기 위해서, 세포를 원심분리에 의해 수확하였다. 상기 플레이트를 프로테아제 억제제 칵테일을 함유하는 0.1 ㎖의 100 mM 트리스 pH 7.0 완충제에 재현탁하였다. 용해물을 3분 동안 비드 박동 방법을 사용하여 제조하였다. 비드 박동에 이어서, 상기 용액을 4 ℃에서 15분간 14,000 rpm에서 원심분리(에펜도르프 원심분리기 5402)시켰다. 상기 샘플 중의 세포 단백질을 문헌[Bradford et al., Anal. Biochem. 72:248-254(1976)]의 방법을 사용하여 측정하고 비 효소 분석을 하기 개시되는 바와 같이 수행하였다.
티올라제
티올라제 효소는 2개의 아세틸-CoA의 축합을 촉매화하여 아세토아세틸-CoA를 형성시킨다. 상기 반응에서, 조효소 A(CoA)가 방출되며 유리 CoA를 5,5'-다이티오비스-2-나이트로벤조산(DTNB)(CoA와 반응시 410 ㎚에서 흡수된다)을 사용하여 검출할 수 있다. 5개의 티올라제를 시험하였다(실시예 X, 표 1 참조). 에스케리키아 콜라이 조 추출물에서 추정된 비활성을 도 12에 나타낸다.
발현된 단백질을 나타낸 Th1 중에서, 1512 및 1502가 에스케리키아 콜라이 조 용해물에서 아세틸-CoA 축합 활성에 대해 가장 높은 비활성을 나타내었다.
1491 및 560을 모두 1495(이는 3-하이드록시부티릴-CoA 데하이드로게나제이다)를 갖는 이중 프로모터 효모 벡터에 클로닝시켰다(도 13 참조). 이들 티올라제를 아세틸-CoA 축합 활성에 대해서 평가하였으며, 데이터를 도 13에 나타낸다. 결과는 560 및 1491이 모두 측정하기에는 너무 빠른 초기 활성 폭발을 나타냄을 가리킨다. 그러나, 상기 초기 효소 속도 후에, 560의 축합률은 1491보다 더 크다. 따라서, 조 용해물에서 관찰된 활성 티올라제 활성에 의해 지시되는 바와 같이, 상기 효모 이중 프로모터 벡터와 함께 단백질 발현 및 활성 효소가 존재한다.
3- 하이드록시부티릴 - CoA 데하이드로게나제 ( Hbd )
아세토아세틸-CoA는 3-하이드록시부티릴-CoA 데하이드로게나제에 의해 3-하이드록시부티릴-CoA로 대사된다. 상기 반응은 NADH의 산화를 요하며, 이를 340 ㎚에서의 여기 파장 및 460 ㎚에서의 방출에서 형광에 의해 모니터링할 수 있다. 산화된 형태, NAD+는 형광을 발하지 않는다. 상기 검출 전략을 모든 데하이드로게나제 단계들에 사용하였다. 클로스트리디움 베이제린키이로부터의 Hbd인 1495를 1491(벡터 id = pY3Hd17) 또는 560(벡터 id = pY3Hd16)을 함유하는 이중 프로모터 효모 벡터에서 분석하였다. 각 효소의 젠뱅크 식별번호에 대해서 표 1을 참조하시오. 시간 경과 데이터를 도 14에 나타낸다.
560을 함유하는 1495의 Hbd 속도는 1491보다 훨씬 더 빨랐다. 도 15에 제공된 결과는 Hbd가 NADPH보다 NADH를 선호함을 보인다. 상기 Hbd 효소는 조 용해물 중의 4개의 경로 효소들 중에서 가장 빠른 촉매 활성을 나타내는 것으로 보인다. 상기 Hbd 효소, 즉 3-케토아실-CoA 리덕타제는 NADH 보조인자와 우선적으로 반응하는 MI-FAE 주기 또는 MD-FAE 주기의 일례이다.
알데하이드 데하이드로게나제 ( Ald )
알데하이드 리덕타제는 3-하이드록시부티릴-CoA를 3-하이드록시부티르알데하이드로 전환시킨다. 상기 반응은 NAD(P)H 산화를 요하며, 상기 산화를 효소 활성을 모니터링하는데 사용할 수 있다. 락토바실러스 브레비스로부터의 Ald(유전자 ID 707)를, 클로스트리디움 사카로페르부틸아세토니쿰으로부터의 알콜 데하이드로게나제(유전자 ID 28)를 함유하는 이중 벡터에 클로닝시켰다. 이들 두 효소를 Leu 마커를 함유하는 또 다른 이중 프로모터 효모 벡터에 클로닝시켰다.
상기 조 용해물에 대한 Ald 활성 데이터를, 표준으로서 에스케리키아 콜라이로부터의 707 용해물과 함께 도 16에 나타낸다. 상기 결과는 상기 707이 효모 용해물 중에서 세균으로부터의 용해물에 필적하는 효소 활성을 보였음을 가리킨다. 또한, 상기 707 유전자 산물은 보조인자로서 NADPH보다 NADH를 선호한다. 상기 707 유전자 산물, 즉 아실-CoA 리덕타제(알데하이드-형성)는 NADH 보조인자와 우선적으로 반응하는 종결 경로 효소의 일례이다.
알콜 데하이드로게나제 ( Adh )
1,3-BDO는 NAD(P)H의 존재하에서 3-하이드록시부티르알데하이드를 환원시키는 알콜 데하이드로게나제(Adh)에 의해 형성된다. 상기 NAD(P)H의 산화를 사용하여 상술한 바와 같이 상기 반응을 모니터링할 수 있다.
ALD(유전자 707)를 갖는 이중 프로모터 벡터에서 ADH(유전자 28)의 평가를, 3-하이드록시부티르알데하이드에 대한 대용 기질인 부티르알데하이드와 함께 도 17에 나타낸다. 상기 데이터는 유전자 28이, 부티르알데하이드 및 NADPH를 갖는 삽입물이 없는 대조군(EV)과 유사한 Adh 활성을 가짐을 가리킨다. 이는 28과 동일한 능력으로 작용할 수 있는 효모 중에 존재하는 내인성 ADH 효소에 의해 야기되는 듯하다.
요약하면, 1,3-BDO를 생산하는 Th1, Hbd, Ald 및 Adh에 대한 후보들은 제작된 이중 프로모터 벡터들에 대해서 효모 조 용해물 중에서 효소 활성을 보였다.
본 출원 전체를 통해 다양한 공보들을 참조하였다. 이들 공보의 명세는 본 발명이 속하는 분야의 기술의 발달 상태를 보다 충분히 개시하기 위해서, 젠뱅크 및 GI 번호 공개를 포함하여 내용 전체가 본 발명에 참고로 인용된다. 본 발명을 상기 제공된 실시예들을 참고로 개시하였지만, 본 발명의 진의로부터 이탈됨 없이 다양한 변경들을 수행할 수 있음은 물론이다.
SEQUENCE LISTING <110> GENOMATICA, INC. <120> MICROORGANISMS AND METHODS FOR PRODUCTION OF SPECIFIC LENGTH FATTY ALCOHOLS AND RELATED COMPOUNDS <130> 12956-210-228 <140> PCT/US2013/064827 <141> 2013-10-14 <150> 61/714,144 <151> 2012-10-15 <160> 23 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> lacZalpha-RI primer <400> 1 gacgaattcg ctagcaagag gagaagtcga catgtccaat tcactggccg tcgttttac 59 <210> 2 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> lacZalpha 3prime-BB primer <400> 2 gaccctagga agctttctag agtcgaccta tgcggcatca gagcaga 47 <210> 3 <211> 474 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutated LpdA from E. coli K-12 MG1655 <400> 3 Met Ser Thr Glu Ile Lys Thr Gln Val Val Val Leu Gly Ala Gly Pro 1 5 10 15 Ala Gly Tyr Ser Ala Ala Phe Arg Cys Ala Asp Leu Gly Leu Glu Thr 20 25 30 Val Ile Val Glu Arg Tyr Asn Thr Leu Gly Gly Val Cys Leu Asn Val 35 40 45 Gly Cys Ile Pro Ser Lys Ala Leu Leu His Val Ala Lys Val Ile Glu 50 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Arg Val Pro Asn Gly Lys Asn Leu Asp Ala Gly Lys Ala Gly Val Glu 275 280 285 Val Asp Asp Arg Gly Phe Ile Arg Val Asp Lys Gln Leu Arg Thr Asn 290 295 300 Val Pro His Ile Phe Ala Ile Gly Asp Ile Val Gly Gln Pro Met Leu 305 310 315 320 Ala His Lys Gly Val His Glu Gly His Val Ala Ala Glu Val Ile Ala 325 330 335 Gly Lys Lys His Tyr Phe Asp Pro Lys Val Ile Pro Ser Ile Ala Tyr 340 345 350 Thr Glu Pro Glu Val Ala Trp Val Gly Leu Thr Glu Lys Glu Ala Lys 355 360 365 Glu Lys Gly Ile Ser Tyr Glu Thr Ala Thr Phe Pro Trp Ala Ala Ser 370 375 380 Gly Arg Ala Ile Ala Ser Asp Cys Ala Asp Gly Met Thr Lys Leu Ile 385 390 395 400 Phe Asp Lys Glu Ser His Arg Val Ile Gly Gly Ala Ile Val Gly Thr 405 410 415 Asn Gly Gly Glu Leu Leu Gly Glu Ile Gly Leu Ala Ile Glu Met Gly 420 425 430 Cys Asp Ala Glu Asp Ile Ala Leu Thr Ile His Ala His Pro Thr Leu 435 440 445 His Glu Ser Val Gly Leu Ala Ala Glu Val Phe Glu Gly Ser Ile Thr 450 455 460 Asp Leu Pro Asn Pro Lys Ala Lys Lys Lys 465 470 <210> 4 <211> 474 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutated LpdA from E. coli K-12 MG1655 <400> 4 Met Ser Thr Glu Ile Lys Thr Gln Val Val Val Leu Gly Ala Gly Pro 1 5 10 15 Ala Gly Tyr Ser Ala Ala Phe Arg Cys Ala Asp Leu Gly Leu Glu Thr 20 25 30 Val Ile Val Glu Arg Tyr Asn Thr Leu Gly Gly Val Cys Leu Asn Val 35 40 45 Gly Cys Ile Pro Ser Lys Ala Leu Leu His Val Ala Lys Val Ile Glu 50 55 60 Glu Ala Lys Ala Leu Ala Glu His Gly Ile Val Phe Gly Glu Pro Lys 65 70 75 80 Thr Asp Ile Asp Lys Ile Arg Thr Trp Lys Glu Lys Val Ile Asn Gln 85 90 95 Leu Thr Gly Gly Leu Ala Gly Met Ala Lys Gly Arg Lys Val Lys Val 100 105 110 Val Asn Gly Leu Gly Lys Phe Thr Gly Ala Asn Thr Leu Glu Val Glu 115 120 125 Gly Glu Asn Gly Lys Thr Val Ile Asn Phe Asp Asn Ala Ile Ile Ala 130 135 140 Ala Gly Ser Arg Pro Ile Gln Leu Pro Phe Ile Pro His Glu Asp Pro 145 150 155 160 Arg Ile Trp Asp Ser Thr Asp Ala Leu Glu Leu Lys Glu Val Pro Glu 165 170 175 Arg Leu Leu Val Met Gly Gly Gly Ile Ile Ala Leu Glu Met Ala Thr 180 185 190 Val Tyr His 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Glu Ser His Arg Val Ile Gly Gly Ala Ile Val Gly Thr 405 410 415 Asn Gly Gly Glu Leu Leu Gly Glu Ile Gly Leu Ala Ile Glu Met Gly 420 425 430 Cys Asp Ala Glu Asp Ile Ala Leu Thr Ile His Ala His Pro Thr Leu 435 440 445 His Glu Ser Val Gly Leu Ala Ala Glu Val Phe Glu Gly Ser Ile Thr 450 455 460 Asp Leu Pro Asn Pro Lys Ala Lys Lys Lys 465 470 <210> 5 <211> 364 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant Candida bodinii enzyme <400> 5 Met Lys Ile Val Leu Val Leu Tyr Asp Ala Gly Lys His Ala Ala Asp 1 5 10 15 Glu Glu Lys Leu Tyr Gly Cys Thr Glu Asn Lys Leu Gly Ile Ala Asn 20 25 30 Trp Leu Lys Asp Gln Gly His Glu Leu Ile Thr Thr Ser Asp Lys Glu 35 40 45 Gly Glu Thr Ser Glu Leu Asp Lys His Ile Pro Asp Ala Asp Ile Ile 50 55 60 Ile Thr Thr Pro Phe His Pro Ala Tyr Ile Thr Lys Glu Arg Leu Asp 65 70 75 80 Lys Ala Lys Asn Leu Lys Leu Val Val Val Ala Gly Val Gly Ser Asp 85 90 95 His Ile Asp Leu Asp Tyr Ile Asn Gln Thr Gly Lys Lys Ile Ser Val 100 105 110 Leu Glu Val Thr Gly Ser Asn Val Val Ser Val Ala Glu His Val Val 115 120 125 Met Thr Met Leu Val Leu Val Arg Asn Phe Val Pro Ala His Glu Gln 130 135 140 Ile Ile Asn His Asp Trp Glu Val Ala Ala Ile Ala Lys Asp Ala Tyr 145 150 155 160 Asp Ile Glu Gly Lys Thr Ile Ala Thr Ile Gly Ala Gly Arg Ile Gly 165 170 175 Tyr Arg Val Leu Glu Arg Leu Leu Pro Phe Asn Pro Lys Glu Leu Leu 180 185 190 Tyr Tyr Gln Arg Gln Ala Leu Pro Lys Glu Ala Glu Glu Lys Val Gly 195 200 205 Ala Arg Arg Val Glu Asn Ile Glu Glu Leu Val Ala Gln Ala Asp Ile 210 215 220 Val Thr Val Asn Ala Pro Leu His Ala Gly Thr Lys Gly Leu Ile Asn 225 230 235 240 Lys Glu Leu Leu Ser Lys Phe Lys Lys Gly Ala Trp Leu Val Asn Thr 245 250 255 Ala Arg Gly Ala Ile Cys Val Ala Glu Asp Val Ala Ala Ala Leu Glu 260 265 270 Ser Gly Gln Leu Arg Gly Tyr Gly Gly Asp Val Trp Phe Pro Gln Pro 275 280 285 Ala Pro Lys Asp His Pro Trp Arg Asp Met Arg Asn Lys Tyr Gly Ala 290 295 300 Gly Asn Ala Met Thr Pro His Tyr Ser Gly Thr Thr Leu Asp Ala Gln 305 310 315 320 Thr Arg Tyr Ala Glu Gly Thr Lys Asn 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360 <210> 7 <211> 376 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant Saccharomyces cerevisiae <400> 7 Met Ser Lys Gly Lys Val Leu Leu Val Leu Tyr Glu Gly Gly Lys His 1 5 10 15 Ala Glu Glu Gln Glu Lys Leu Leu Gly Cys Ile Glu Asn Glu Leu Gly 20 25 30 Ile Arg Asn Phe Ile Glu Glu Gln Gly Tyr Glu Leu Val Thr Thr Ile 35 40 45 Asp Lys Asp Pro Glu Pro Thr Ser Thr Val Asp Arg Glu Leu Lys Asp 50 55 60 Ala Glu Ile Val Ile Thr Thr Pro Phe Phe Pro Ala Tyr Ile Ser Arg 65 70 75 80 Asn Arg Ile Ala Glu Ala Pro Asn Leu Lys Leu Cys Val Thr Ala Gly 85 90 95 Val Gly Ser Asp His Val Asp Leu Glu Ala Ala Asn Glu Arg Lys Ile 100 105 110 Thr Val Thr Glu Val Thr Gly Ser Asn Val Val Ser Val Ala Glu His 115 120 125 Val Met Ala Thr Ile Leu Val Leu Ile Arg Asn Tyr Asn Gly Gly His 130 135 140 Gln Gln Ala Ile Asn Gly Glu Trp Asp Ile Ala Gly Val Ala Lys Asn 145 150 155 160 Glu Tyr Asp Leu Glu Asp Lys Ile Ile Ser Thr Val Gly Ala Gly Arg 165 170 175 Ile Gly Tyr Arg Val Leu Glu Arg Leu Val Ala Phe Asn Pro Lys Lys 180 185 190 Leu Leu Tyr Tyr Ala Arg Gln Glu Leu Pro Ala Glu Ala Ile Asn Arg 195 200 205 Leu Asn Glu Ala Ser Lys Leu Phe Asn Gly Arg Gly Asp Ile Val Gln 210 215 220 Arg Val Glu Lys Leu Glu Asp Met Val Ala Gln Ser Asp Val Val Thr 225 230 235 240 Ile Asn Cys Pro Leu His Lys Asp Ser Arg Gly Leu Phe Asn Lys Lys 245 250 255 Leu Ile Ser His Met Lys Asp Gly Ala Tyr Leu Val Asn Thr Ala Arg 260 265 270 Gly Ala Ile Cys Val Ala Glu Asp Val Ala Glu Ala Val Lys Ser Gly 275 280 285 Lys Leu Ala Gly Tyr Gly Gly Asp Val Trp Asp Lys Gln Pro Ala Pro 290 295 300 Lys Asp His Pro Trp Arg Thr Met Asp Asn Lys Asp His Val Gly Asn 305 310 315 320 Ala Met Thr Val His Ile Ser Gly Thr Ser Leu Asp Ala Gln Lys Arg 325 330 335 Tyr Ala Gln Gly Val Lys Asn Ile Leu Asn Ser Tyr Phe Ser Lys Lys 340 345 350 Phe Asp Tyr Arg Pro Gln Asp Ile Ile Val Gln Asn Gly Ser Tyr Ala 355 360 365 Thr Arg Ala Tyr Gly Gln Lys Lys 370 375 <210> 8 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer used to amplify Thl 1502 gene <400> 8 tctaatctaa gttttctaga actagtaaag atgagagatg tagtaatagt aagtgctgta 60 <210> 9 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer used to amplify Thl 1502 gene <400> 9 gatatcgaat tcctgcagcc cgggggatcc ttagtctctt tcaactacga gagctgtt 58 <210> 10 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer used to amplify Thl 1491 gene <400> 10 tctaatctaa gttttctaga actagtaaag atgaaaaatt gtgtcatcgt cagtg 55 <210> 11 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer used to amplify Thl 1491 gene <400> 11 gatatcgaat tcctgcagcc cgggggatcc ttaattcaac cgttcaatca ccatcgcaat 60 <210> 12 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer used to amplify Thl 560 gene <400> 12 aatctaagtt ttctagaact agtaaagatg aaagaagttg taatagctag tgcagtaa 58 <210> 13 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer used to amplify Thl 560 gene <400> 13 tatcgaattc ctgcagcccg ggggatcctt aatggtgatg gtgatgatgg cacttttcta 60 <210> 14 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer used to amplify Thl 1512 gene <400> 14 tctaatctaa gttttctaga actagtaaag atgagcaccc cgtccatcgt ca 52 <210> 15 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer used to amplify Thl 1512 gene <400> 15 gatatcgaat tcctgcagcc cgggggatcc ctaaaggctc tcgatgcaca tcgcc 55 <210> 16 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer used to amplify Thl 1501 gene <400> 16 taagctagca agaggagaag tcgacatgac tgacgttgtc atcgtatccg c 51 <210> 17 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer used to amplify Thl 1501 gene <400> 17 gcctctagga agctttctag attattattt gcgctcgact gccagc 46 <210> 18 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer used to amplify Hbd 1495 gene <400> 18 aagcatacaa tcaactatct catatacaat gaaaaagatt tttgtacttg gagca 55 <210> 19 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer used to amplify Hbd 1495 gene <400> 19 aaaaatcata aatcataaga aattcgctta tttagagtaa tcatagaatc cttttcctga 60 <210> 20 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer used to amplify Ald 707 gene <400> 20 aatctaagtt ttctagaact agtaaagatg aacacagaaa acattgaaca agccat 56 <210> 21 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer used to amplify Ald 707 gene <400> 21 tatcgaattc ctgcagcccg ggggatccct aagcctccca agtccgtaat gagaaccctt 60 <210> 22 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer used to amplify Adh 28 gene <400> 22 ccaagcatac aatcaactat ctcatataca atggagaatt ttagatttaa tgcatataca 60 <210> 23 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer used to amplify Adh 28 gene <400> 23 aataaaaatc ataaatcata agaaattcgc ttaaagggac atttctaaaa ttttatatac 60

Claims (41)

  1. 종결 경로와 함께 말로닐-CoA 독립적인 지방 아실-CoA 신장(MI-FAE) 주기 및/또는 말로닐-CoA 의존적인 지방 아실-CoA 신장(MD-FAE) 주기를 갖는 비-천연 미생물 유기체로서,
    상기 MI-FAE 주기가 하나 이상의 티올라제, 하나 이상의 3-옥소아실-CoA 리덕타제, 하나 이상의 3-하이드록시아실-CoA 데하이드라타제 및 하나 이상의 에노일-CoA 리덕타제를 포함하고,
    상기 MD-FAE 주기가 하나 이상의 엘론가제, 하나 이상의 3-옥소아실-CoA 리덕타제, 하나 이상의 3-하이드록시아실-CoA 데하이드라타제 및 하나 이상의 에노일-CoA 리덕타제를 포함하고,
    상기 종결 경로가
    (1) 1H;
    (2) 1K 및 1L;
    (3) 1E 및 1N;
    (4) 1K, 1J 및 1N;
    (5) 1E;
    (6) 1K 및 1J;
    (7) 1H 및 1N;
    (8) 1K, 1L 및 1N;
    (9) 1E 및 1F;
    (10) 1K, 1J 및 1F;
    (11) 1H, 1N 및 1F;
    (12) 1K, 1L, 1N 및 1F; 및
    (13) 1G
    중에서 선택되는 경로를 포함하고, 이때 1E가 알데하이드-형성 아실-CoA 리덕타제이고, 1F가 알콜 데하이드로게나제이고, 1G가 알콜-형성 아실-CoA 리덕타제이고, 1H가 아실-CoA 하이드롤라제, 아실-CoA 트랜스퍼라제 또는 아실-CoA 신타제이고, 1J가 아실-ACP 리덕타제이고, 1K가 아실-CoA:ACP 아실트랜스퍼라제이고, 1L이 티오에스테라제이고, 1N이 산-형성 알데하이드 데하이드로게나제 또는 카복실산 리덕타제이고,
    상기 MI-FAE 주기, MD-FAE 주기 또는 종결 경로의 효소가 하나 이상의 외인성 핵산에 의해 암호화되고 하기 화학식 I의 화합물을 생산하기에 충분한 양으로 발현되고:
    화학식 I
    Figure pct00180

    [상기 식에서,
    R1은 C1 -24 선형 알킬이고;
    R2는 CH2OH, CHO 또는 COOH이고;
    R3은 H, OH 또는 옥소(=O)이고;
    Figure pct00181
    은 단일 또는 이중 결합을 나타내되;
    R3이 결합되는 탄소 원자의 원자가는 4이다],
    상기 MI-FAE 주기, MD-FAE 주기 및 종결 경로의 각각의 효소의 기질이 하기 화학식 II의 화합물, 말로닐-CoA, 프로피오닐-CoA 및 아세틸-CoA 중에서 독립적으로 선택되고:
    화학식 II
    Figure pct00182

    [상기 식에서,
    R1은 C1 -24 선형 알킬이고;
    R3은 H, OH 또는 옥소(=O)이고;
    R4는 S-CoA, ACP, OH 또는 H이고;
    Figure pct00183
    은 단일 또는 이중 결합을 나타내되;
    R3이 결합되는 탄소 원자의 원자가는 4이다],
    상기 MI-FAE 주기의 하나 이상의 효소가 각각 상기 화학식 I의 화합물의 R1에서의 탄소수 이하인 R1에서의 탄소수를 갖는 화학식 II의 화합물에 대해 선택성이고,
    상기 MD-FAE 주기의 하나 이상의 효소가 각각 상기 화학식 I의 화합물의 R1에서의 탄소수 이하인 R1에서의 탄소수를 갖는 화학식 II의 화합물에 대해 선택성이고,
    상기 종결 경로의 하나 이상의 효소가 각각 상기 화학식 I의 화합물의 R1에서의 탄소수 이상인 R1에서의 탄소수를 갖는 화학식 II의 화합물에 대해 선택성인
    비-천연 미생물 유기체.
  2. 제 1 항에 있어서,
    R1이 C1-17 선형 알킬인 비-천연 미생물 유기체.
  3. 제 2 항에 있어서,
    R1이 C9 선형 알킬, C10 선형 알킬, C11 선형 알킬, C12 선형 알킬 또는 C13 선형 알킬인 비-천연 미생물 유기체.
  4. 제 1 항에 있어서,
    각각의 외인성 핵산이 MI-FAE 주기 또는 MD-FAE 주기의 효소를 암호화하는 2, 3 또는 4개의 상기 외인성 핵산을 포함하는 비-천연 미생물 유기체.
  5. 제 1 항에 있어서,
    각각의 외인성 핵산이 종결 경로의 효소를 암호화하는 2, 3 또는 4개의 상기 외인성 핵산을 포함하는 비-천연 미생물 유기체.
  6. 제 3 항에 있어서,
    (1) 내지 (13) 중에서 선택되는 경로 중 하나 이상의 효소를 각각 암호화하는 외인성 핵산을 포함하는 비-천연 미생물 유기체.
  7. 제 1 항에 있어서,
    하나 이상의 외인성 핵산이 이종 핵산인 비-천연 미생물 유기체.
  8. 제 1 항에 있어서,
    실질적으로 혐기성 배양 배지 중에 있는 비-천연 미생물 유기체.
  9. 제 1 항에 있어서,
    MI-FAE 주기, MD-FAE 주기 또는 종결 경로의 효소가 하기 화학식 III 내지 VI 중에서 선택되는 화합물을 생산하기에 충분한 양으로 발현되는 비-천연 미생물 유기체:
    화학식 III
    Figure pct00184

    화학식 IV
    Figure pct00185

    화학식 V
    Figure pct00186

    화학식 VI
    Figure pct00187

    상기 식에서,
    R1은 C1 -17 선형 알킬이다.
  10. 제 9 항에 있어서,
    R1이 C9 선형 알킬, C10 선형 알킬, C11 선형 알킬, C12 선형 알킬 또는 C13 선형 알킬인 비-천연 미생물 유기체.
  11. 제 1 항에 있어서,
    아세틸-CoA 경로 및 아세틸-CoA를 생산하기에 충분한 양으로 발현되는 아세틸-CoA 경로 효소를 암호화하는 하나 이상의 외인성 핵산을 추가로 포함하고, 상기 아세틸-CoA 경로가
    (1) 2A 및 2B;
    (2) 2A, 2C 및 2D;
    (3) 2H;
    (4) 2G 및 2D;
    (5) 2E, 2F 및 2B;
    (6) 2E 및 2I;
    (7) 2J, 2F 및 2B;
    (8) 2J 및 2I;
    (9) 3A, 3B 및 3C;
    (10) 3A, 3B, 3J, 3K 및 3D;
    (11) 3A, 3B, 3G 및 3D;
    (12) 3A, 3F 및 3D;
    (13) 3N, 3H, 3B 및 3C;
    (14) 3N, 3H, 3B, 3J, 3K 및 3D;
    (15) 3N, 3H, 3B, 3G 및 3D;
    (16) 3N, 3H, 3F 및 3D;
    (17) 3L, 3M, 3B 및 3C;
    (18) 3L, 3M, 3B, 3J, 3K 및 3D;
    (19) 3L, 3M, 3B, 3G 및 3D;
    (20) 3L, 3M, 3F 및 3D;
    (21) 4A, 4B, 4D, 4H, 4I 및 4J;
    (22) 4A, 4B, 4E, 4F, 4H, 4I 및 4J;
    (23) 4A, 4B, 4E, 4K, 4L, 4H, 4I 및 4J;
    (24) 4A, 4C, 4D, 4H 및 4J;
    (25) 4A, 4C, 4E, 4F, 4H 및 4J;
    (26) 4A, 4C, 4E, 4K, 4L, 4H 및 4J;
    (27) 5A, 5B, 5D 및 5G;
    (28) 5A, 5B, 5E, 5F 및 5G;
    (29) 5A, 5B, 5E, 5K, 5L 및 5G;
    (30) 5A, 5C 및 5D;
    (31) 5A, 5C, 5E 및 5F; 및
    (32) 5A, 5C, 5E, 5K 및 5L
    중에서 선택되는 경로를 포함하고, 이때 2A가 아세테이트-형성 피루베이트 옥시다제이고, 2B가 아세틸-CoA 신시타제, 아세틸-CoA 리가제 또는 아세틸-CoA 트랜스퍼라제이고, 2C가 아세테이트 키나제이고, 2D가 포스포트랜스아세틸라제이고, 2E가 피루베이트 데카복실라제이고, 2F가 아세트알데하이드 데하이드로게나제이고, 2G가 아세틸-포스페이트-형성 피루베이트 옥시다제이고, 2H가 피루베이트 데하이드로게나제, 피루베이트:페레독신 옥시도리덕타제, 피루베이트:NAD(P)H 옥시도리덕타제 또는 피루베이트 포메이트 라이아제이고, 2I가 아실화 아세트알데하이드 데하이드로게나제이고, 2J가 쓰레오닌 알돌라제이고, 3A가 포스포에놀피루베이트(PEP) 카복실라제 또는 PEP 카복시키나제이고, 3B가 옥살로아세테이트 데카복실라제이고, 3C가 아세틸화 말로네이트 세미알데하이드 데하이드로게나제이고, 3D가 아세틸-CoA 카복실라제 또는 말로닐-CoA 데카복실라제이고, 3F가 옥살로아세테이트 데하이드로게나제 또는 옥살로아세테이트 옥시도리덕타제이고, 3G가 아실화 말로네이트 세미알데하이드 데하이드로게나제이고, 3H가 피루베이트 카복실라제이고, 3J가 말로네이트 세미알데하이드 데하이드로게나제이고, 3K가 말로닐-CoA 신시타제 또는 말로닐-CoA 트랜스퍼라제이고, 3L이 말산 효소이고, 3M이 말레이트 데하이드로게나제 또는 말레이트 옥시도리덕타제이고, 3N이 피루베이트 키나제 또는 PEP 포스파타제이고, 4A가 시트레이트 신타제이고, 4B가 시트레이트 운반자이고, 4C가 시트레이트/말레이트 운반자이고, 4D가 ATP 시트레이트 라이아제이고, 4E가 시트레이트 라이아제이고, 4F가 아세틸-CoA 신시타제 또는 아세틸-CoA 트랜스퍼라제이고, 4H가 시토솔 말레이트 데하이드로게나제이고, 4I가 말레이트 운반자이고, 4J가 미토콘드리아 말레이트 데하이드로게나제이고, 4K가 아세테이트 키나제이고, 4L이 포스포트랜스아세틸라제이고, 5A가 시트레이트 신타제이고, 5B가 시트레이트 운반자이고, 5C가 시트레이트/옥살로아세테이트 운반자이고, 5D가 ATP 시트레이트 라이아제이고, 5E가 시트레이트 라이아제이고, 5F가 아세틸-CoA 신시타제 또는 아세틸-CoA 트랜스퍼라제이고, 5G가 옥살로아세테이트 운반자이고, 5K가 아세테이트 키나제이고, 5L이 포스포트랜스아세틸라제인 비-천연 미생물 유기체.
  12. 제 11 항에 있어서,
    각각의 외인성 핵산이 아세틸-CoA 경로 효소를 암호화하는 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개의 상기 외인성 핵산을 포함하는 비-천연 미생물 유기체.
  13. 제 12 항에 있어서,
    (1) 내지 (32) 중에서 선택되는 경로 중 하나 이상의 아세틸-CoA 경로 효소를 각각 암호화하는 외인성 핵산을 포함하는 비-천연 미생물 유기체.
  14. 제 1 항에 있어서,
    하나 이상의 유전자 파괴를 추가로 포함하고, 상기 하나 이상의 유전자 파괴가 미생물 유기체에 의한 에탄올, 글리세롤, 아세테이트, 포메이트, 락테이트, CO2, 지방 산 또는 말로닐-CoA의 고유 생산; 경로 중간체의 시토솔 이외의 세포 구획으로의 수송; 또는 미생물 유기체에 의한 MI-FAE 주기 중간체, MD-FAE 주기 중간체 또는 종결 경로 중간체의 고유 분해와 관련된 단백질 또는 효소를 암호화하는 내인성 유전자에서 발생하고, 상기 하나 이상의 유전자 파괴가 미생물 유기체에서 화학식 I의 화합물의 증가된 생산을 부여하는 비-천연 미생물 유기체.
  15. 제 14 항에 있어서,
    단백질 또는 효소가 지방 산 신타제, 아세틸-CoA 카복실라제, 비오틴:아포효소 리가제, 아실 담체 단백질, 티오에스테라제, 아실트랜스퍼라제, ACP 말로닐트랜스퍼라제, 지방 산 엘론가제, 아실-CoA 신시타제, 아실-CoA 트랜스퍼라제, 아실-CoA 하이드롤라제, 피루베이트 데카복실라제, 락테이트 데하이드로게나제, 알콜 데하이드로게나제, 산-형성 알데하이드 데하이드로게나제, 아세테이트 키나제, 포스포트랜스아세틸라제, 피루베이트 옥시다제, 글리세롤-3-포스페이트 데하이드로게나제, 글리세롤-3-포스페이트 포스파타제, 미토콘드리아 피루베이트 담체, 페록시솜 지방 산 운반자, 페록시솜 아실-CoA 운반자, 페록시솜 카르니틴/아실카르니틴 트랜스퍼라제, 아실-CoA 옥시다제 및 아실-CoA 결합 단백질로 이루어진 군 중에서 선택되는 비-천연 미생물 유기체.
  16. 제 1 항에 있어서,
    MI-FAE 주기, MD-FAE 주기 또는 종결 경로의 하나 이상의 효소가 NADH 보조인자와 우선적으로 반응하거나 NAD(P)H 보조인자와의 반응에 대해 감소된 선호를 갖고, 상기 MI-FAE 주기 또는 MD-FAE 주기의 하나 이상의 효소가 3-케토아실-CoA 리덕타제 또는 에노일-CoA 리덕타제이고, 상기 종결 경로의 하나 이상의 효소가 알데하이드-형성 아실-CoA 리덕타제, 알콜 데하이드로게나제, 알콜-형성 아실-CoA 리덕타제, 알데하이드 데카보닐라제, 아실-ACP 리덕타제, 산-형성 알데하이드 데하이드로게나제 및 카복실산 리덕타제 중에서 선택되는 비-천연 미생물 유기체.
  17. 제 1 항에 있어서,
    하나 이상의 유전자 파괴를 추가로 포함하고, 상기 하나 이상의 유전자 파괴가 상기 파괴에 따라 미생물 유기체의 시토솔 중에 존재하는 NAD(P)H 대 NAD(P)의 증가된 비를 생성시키는 단백질 또는 효소를 암호화하는 유전자에서 발생하는 비-천연 미생물 유기체.
  18. 제 17 항에 있어서,
    파괴에 따라 미생물 유기체의 시토솔 중에 존재하는 NAD(P)H 대 NAD(P)의 증가된 비를 생성시키는 단백질 또는 효소를 암호화하는 유전자가 NADH 데하이드로게나제, 시토크롬 옥시다제, 글리세롤-3-포스페이트 데하이드로게나제, 글리세롤-3-포스페이트 포스파타제, 알콜 데하이드로게나제, 피루베이트 데카복실라제, 산-형성 알데하이드 데하이드로게나제, 락테이트 데하이드로게나제, 글리세롤-3-포스페이트 데하이드로게나제, 글리세롤-3-포스페이트:퀴논 옥시도리덕타제, 말산 효소 및 말레이트 데하이드로게나제로 이루어진 군 중에서 선택되는 비-천연 미생물 유기체.
  19. 제 14 항 또는 제 17 항에 있어서,
    하나 이상의 유전자 파괴가 하나 이상의 유전자의 결실을 포함하는 비-천연 미생물 유기체.
  20. 제 1 항에 있어서,
    크랩트리(Crabtree) 양성이고 과잉의 글루코스를 포함하는 배양 배지 중에 존재하고, 이에 의해 미생물 유기체의 시토솔 중에 존재하는 NAD(P)H 대 NAD(P)의 비가 증가하는 비-천연 미생물 유기체.
  21. 제 1 항에 있어서,
    화학식 I의 화합물에 대한 세포외 운반자 또는 세포외 운반 시스템을 암호화하는 하나 이상의 외인성 핵산을 추가로 포함하는 비-천연 미생물 유기체.
  22. 제 1 항에 있어서,
    미생물 유기체에 의한 에탄올, 글리세롤, 아세테이트, 포메이트, 락테이트, CO2, 지방 산 또는 말로닐-CoA의 고유 생산; 경로 중간체의 시토솔 이외의 세포 구획으로의 수송; 또는 미생물 유기체에 의한 MI-FAE 주기 중간체, MD-FAE 주기 중간체 또는 종결 경로 중간체의 고유 분해와 관련된 하나 이상의 내인성 효소가 약화된 효소 활성 또는 발현 수준을 갖는 비-천연 미생물 유기체.
  23. 제 22 항에 있어서,
    효소가 지방 산 신타제, 아세틸-CoA 카복실라제, 비오틴:아포효소 리가제, 티오에스테라제, 아실 담체 단백질, 티오에스테라제, 아실트랜스퍼라제, ACP 말로닐트랜스퍼라제, 지방 산 엘론가제, 아실-CoA 신시타제, 아실-CoA 트랜스퍼라제, 아실-CoA 하이드롤라제, 피루베이트 데카복실라제, 락테이트 데하이드로게나제, 단쇄 알콜 데하이드로게나제, 산-형성 알데하이드 데하이드로게나제, 아세테이트 키나제, 포스포트랜스아세틸라제, 피루베이트 옥시다제, 글리세롤-3-포스페이트 데하이드로게나제, 글리세롤-3-포스페이트 포스파타제, 미토콘드리아 피루베이트 담체, 페록시솜 지방 산 운반자, 페록시솜 아실-CoA 운반자, 페록시솜 카르니틴/아실카르니틴 트랜스퍼라제, 아실-CoA 옥시다제 및 아실-CoA 결합 단백질로 이루어진 군 중에서 선택되는 비-천연 미생물 유기체.
  24. 제 1 항에 있어서,
    NAD(P)H 또는 NADH의 산화와 관련된 하나 이상의 내인성 효소가 약화된 효소 활성 또는 발현 수준을 갖는 비-천연 미생물 유기체.
  25. 제 24 항에 있어서,
    하나 이상의 내인성 효소가 NADH 데하이드로게나제, 시토크롬 옥시다제, 글리세롤-3-포스페이트 데하이드로게나제, 글리세롤-3-포스페이트 포스파타제, 알콜 데하이드로게나제, 피루베이트 데카복실라제, 산-형성 알데하이드 데하이드로게나제, 락테이트 데하이드로게나제, 글리세롤-3-포스페이트 데하이드로게나제, 글리세롤-3-포스페이트:퀴논 옥시도리덕타제, 말산 효소 및 말레이트 데하이드로게나제로 이루어진 군 중에서 선택되는 비-천연 미생물 유기체.
  26. 하기 화학식 I의 화합물을 생산하는 조건하에서 상기 생산에 충분한 기간 동안 제 1 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 따른 비-천연 미생물 유기체를 배양함을 포함하는, 화학식 I의 화합물의 생산 방법:
    화학식 I
    Figure pct00188

    상기 식에서,
    R1은 C1 -24 선형 알킬이고;
    R2는 CH2OH, CHO 또는 COOH이고;
    R3은 H, OH 또는 옥소(=O)이고;
    Figure pct00189
    은 단일 또는 이중 결합을 나타내되;
    R3이 결합되는 탄소 원자의 원자가는 4이다.
  27. 제 26 항에 있어서,
    화학식 I의 화합물을 배양물 중의 다른 성분으로부터 분리시킴을 추가로 포함하는 생산 방법.
  28. 제 27 항에 있어서,
    분리가 추출, 연속적인 액체-액체 추출, 투석증발, 막 여과, 막 분리, 역삼투, 전기투석, 증류, 결정화, 원심분리, 추출여과, 이온 교환 크로마토그래피, 흡수 크로마토그래피 또는 한외여과를 포함하는 생산 방법.
  29. 대기 이산화탄소 섭취원을 반영하는 탄소-12, 탄소-13 및 탄소-14 동위원소 비를 갖는 하기 화학식 I의 생물유래 화합물(bioderived compound)을 포함하는 배양 배지:
    화학식 I
    Figure pct00190

    상기 식에서,
    R1은 C1 -24 선형 알킬이고;
    R2는 CH2OH, CHO 또는 COOH이고;
    R3은 H, OH 또는 옥소(=O)이고;
    Figure pct00191
    은 단일 또는 이중 결합을 나타내되;
    R3이 결합되는 탄소 원자의 원자가는 4이다.
  30. 제 29 항에 있어서,
    종결 경로와 함께 말로닐-CoA 독립적인 지방 아실-CoA 신장(MI-FAE) 주기 및/또는 말로닐-CoA 의존적인 지방 아실-CoA 신장(MD-FAE) 주기를 갖는 비-천연 미생물 유기체로부터 분리되는 배양 배지.
  31. 대기 이산화탄소 섭취원을 반영하는 탄소-12, 탄소-13 및 탄소-14 동위원소 비를 갖는 하기 화학식 I의 생물유래 화합물:
    화학식 I
    Figure pct00192

    상기 식에서,
    R1은 C1 -24 선형 알킬이고;
    R2는 CH2OH, CHO 또는 COOH이고;
    R3은 H, OH 또는 옥소(=O)이고;
    Figure pct00193
    은 단일 또는 이중 결합을 나타내되;
    R3이 결합되는 탄소 원자의 원자가는 4이다.
  32. 제 31 항에 있어서,
    80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 98% 이상의 Fm 값을 갖는 생물유래 화합물.
  33. 제 26 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 따른 생산 방법에 따라 생산된 생물유래 화합물.
  34. 제 31 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 따른 생물유래 화합물 및 상기 생물유래 화합물 이외의 화합물을 포함하는 조성물.
  35. 제 34 항에 있어서,
    생물유래 화합물 이외의 화합물이 미량의, 종결 경로와 함께 말로닐-CoA 독립적인 지방 아실-CoA 신장(MI-FAE) 주기 및/또는 말로닐-CoA 의존적인 지방 아실-CoA 신장(MD-FAE) 주기를 갖는 비-천연 미생물 유기체의 세포 부분인 조성물.
  36. 제 31 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 따른 생물유래 화합물, 또는 세포 용해물 또는 그의 배양 상등액을 포함하는 조성물.
  37. 제 31 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 따른 생물유래 화합물을 포함하는, 생물연료, 화학제품, 중합체, 계면활성제, 비누, 세제, 샴푸, 윤활유 첨가제, 향료, 풍미 물질 또는 아크릴레이트인 생물기반 제품(biobased product).
  38. 제 37 항에 있어서,
    5% 이상, 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상 또는 50% 이상의 생물유래 화합물을 포함하는 생물기반 제품.
  39. 제 37 항 또는 제 38 항에 있어서,
    생물유래 화합물의 일부를 반복 단위로서 포함하는 생물기반 제품.
  40. 중합체인 제 37 항 내지 제 39 항 중 어느 한 항에 따른 생물기반 제품을 성형시킴으로써 수득된 성형품.
  41. 생물유래 화합물을 자신 또는 다른 화합물과, 제 37 항 내지 제 39 항 중 어느 한 항에 따른 생물기반 제품을 제조하는 반응으로 화학적으로 반응시킴을 포함하는, 상기 생물기반 제품의 제조 방법.
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