BR112020026031A2

BR112020026031A2 - isolamento de linhagens de células microbianas para produção de ácido orgânico

Info

Publication number: BR112020026031A2
Application number: BR112020026031-2A
Authority: BR
Inventors: Paul Blum; Sambasiva Rao Chigurupati; Derrick Jermaine White
Original assignee: S&P Ingredient Development, Llc
Priority date: 2018-06-18
Filing date: 2019-06-17
Publication date: 2021-05-04
Also published as: US11613769B2; EP3807397A4; WO2019245985A1; US20190382809A1; CA3104259A1; JP2021529515A; KR20210084420A; EP3807397A1; US20210040513A1; US10808266B2; AU2019290556A1; US20230265467A1; MX2020013848A; CN112513246A

Abstract

isolamento de linhagens de células microbianas paraprodução de ácido orgânico. linhagens de células microbianas apropriadas para produção em escala industrial de ácidos orgânicos e métodos de produzir e isolar tais linhagens de células.

Description

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ISOLAMENTO DE LINHAGENS DE CÉLULAS MICROBIANAS PARA PRODUÇÃO DE ÁCIDO ORGÂNICO REIVINDICAÇÃO DE PRIORIDADE

[001] Este pedido reivindica prioridade para o Pedido de Patente US No. 62/686.463 depositado em 18 de junho de 2018, cujo conteúdo completo é incorporado aqui por referência.

CAMPO TÉCNICO

[002] A revelação refere-se geralmente a linhagens de células microbianas que produzem em excesso ácido orgânico e métodos de produzir as mesmas.

FUNDAMENTOS

[003] Ácidos orgânicos referem-se a compostos contendo carbono tendo propriedades ácidas. Exemplos de ácidos orgânicos incluem ácido acético, ácido cítrico, ácido glucônico, ácido láctico, ácido propiônico, entre muitos outros. Porque eles são completamente degradáveis, ácidos orgânicos podem ser usados na produção de polímeros biodegradáveis. Eles também têm outras aplicações industriais importantes, incluindo como aditivos para alimentos.

SUMÁRIO

[004] A revelação provê linhagens de células microbianas apropriadas para produção em escala industrial de ácidos orgânicos e métodos de produzir e isolar tais linhagens de células.

[005] Em um aspecto, um método de produzir e isolar uma linhagem de célula microbiana é provido, em que a linhagem de célula microbiana isolada produz em excesso um ácido orgânico em comparação com a linhagem de célula microbiana parental. O método usa passagem em série de uma cepa parental

2 / 35 em meio de cultura controlado no pH suplementado com o ácido orgânico, preferivelmente em cultura não imobilizada, onde o pH é controlado a um valor acima do valor pKa do ácido orgânico. Em algumas modalidades, o pH está preferivelmente na faixa entre cerca de 5,5 e cerca de 7,5, mais preferivelmente em ou próximo ao neutro, entre cerca de 6,0 e cerca de 7,0, e o mais preferivelmente a cerca de 7,0. Em algumas modalidades, o meio de cultura é solidificado. Em algumas modalidades, o meio de cultura é suplementado com o ácido orgânico em uma quantidade suficiente para inibir o crescimento de célula microbiana normal, por exemplo, para reduzir a taxa de duplicação ou taxa de crescimento, por exemplo, em pelo menos 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, ou mais. Em algumas modalidades, o ácido orgânico é suplementado em uma quantidade que aumenta progressivamente em iterações sucessivas da passagem em série. Em algumas modalidades, o ácido orgânico é suplementado na mesma quantidade em iterações sucessivas da passagem em série. Em algumas modalidades, o ácido orgânico é ácido propiônico, ácido láctico, ácido acético, ou ácido butírico. Em algumas modalidades, o ácido orgânico é ácido propiônico, por exemplo, o meio de cultura é suplementado com cerca de 1,0%-3,0% de ácido propiônico, por exemplo, cerca de 3,0% de ácido propiônico. Em algumas modalidades, a linhagem de célula parental é um organismo do tipo selvagem. Em algumas modalidades, a linhagem de célula parental é uma linhagem de célula microbiana que é derivada de micróbios unicelulares.

[006] Em outro aspecto, uma linhagem de célula microbiana que produz em excesso um ácido orgânico é provida, em que a linhagem de célula microbiana é produzida e isolada usando

3 / 35 passagem em série em meios de cultura controlados por pH suplementados com o ácido orgânico, onde o pH é controlado a um valor cima do valor pKa do ácido orgânico, preferivelmente na faixa entre cerca de 5,5 e cerca de 7,5, mais preferivelmente em ou próximo ao neutro, entre cerca de 6,0 e cerca de 7,0, e o mais preferivelmente a cerca de 7,0.

[007] Em outro aspecto, uma linhagem de célula microbiana que produz em excesso um ácido orgânico é provida, onde a linhagem de célula microbiana tem mutações que alteram primariamente, de modo direto ou indireto, a estrutura, composição, e/ou função do envelope celular. Preferivelmente, a linhagem de célula microbiana inclui pelo menos 2 mutações de genoma identificadas em Tabela 3 ou mutações análogas. Mais preferivelmente, a linhagem de célula microbiana inclui todas dentre as mutações de genoma identificadas em Tabela 3 ou mutações homólogas. Em uma modalidade, a linhagem de célula microbiana inclui mutações em, pelo menos, 2 genes identificados em Tabela 3 ou mutações análogas dos mesmos. Em outra modalidade, a linhagem de célula microbiana inclui mutações em todos dos genes identificados em Tabela 3 ou seus homólogos (por exemplo, genes homólogos em outras espécies descritas aqui). Em outra modalidade, a linhagem de célula microbiana inclui uma mutação na proteína contendo domínio de antígeno-O ligase. Em outra modalidade, a linhagem de célula microbiana inclui uma mutação na família M18 de aminopeptidase. Em outra modalidade, a linhagem de célula microbiana inclui uma mutação no aminoácido permease. Em outra modalidade, a linhagem de célula microbiana inclui uma mutação em adenina glicosilase.

[008] O micróbio pode ser qualquer micróbio que produza

4 / 35 um ácido orgânico. Em uma modalidade, o micróbio é do gênero Propionibacterium (Acidipropionibacterium), e mais preferivelmente a espécie P. acidipropionici. Em outra modalidade, o micróbio é do gênero Lactobacillus, e mais preferivelmente a espécie L. acidophilus. Em outra modalidade, o micróbio é do gênero Acetobacter. Em outra modalidade, o micróbio é do gênero Gluconobacter. Em outra modalidade, o micróbio é do gênero Clostridium, e mais preferivelmente a espécie C. butyricum. Em algumas modalidades, o ácido orgânico é ácido propiônico. Em algumas modalidades, o ácido orgânico é ácido láctico. Em algumas modalidades, o ácido orgânico é ácido acético. Em algumas modalidades, o ácido orgânico é ácido butírico.

[009] São também providos aqui métodos de produzir ácidos orgânicos usando os métodos e os micróbios aqui descritos.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0010] FIG. 1 mostra o crescimento de P. acidipropionici de tipo selvagem e mutante em meio tamponado sólido com ou sem a adição de 1,0% PA, mostrando um fenótipo de cepa 3-1.

[0011] FIG. 2 mostra a produção de PA por uma cepa mutante de P. acidipropionici (cepa 3-1) em relação ao tipo selvagem em biorreatores usando farinha tipo American Beauty Cake Flour (WFM como bolus) branqueada. Inoculação 1:200, cultura de trabalho 1L, equivalente em glicose 5% (peso/volume) WFM, 30oC, pH 7 (NaOH, 5M).

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0012] Os ácidos orgânicos mais comuns são ácidos carboxílicos, cuja acidez está associada com o grupo carboxila (-COOH). Eles são geralmente ácidos fracos com valores pKa entre cerca de 4-5. Ácido propiônico (“PA”), por

5 / 35 exemplo, é um ácido carboxílico com a fórmula química C2H5COOH ou C3H6O2. Ele é um líquido incolor, oleoso, e de odor pungente (similar a queijo suíço e suor) e tem propriedades físicas entre as dos ácidos carboxílicos, fórmicos, e acéticos menores, e os ácidos graxos maiores. Ele tem um peso molecular de cerca de 74,1g/mol, e um pKa de cerca de 4,9, que significa em uma solução tendo um pH de cerca de 4,9, metade do PA está no estado protonado (ou não dissociado), não carregado (C2H5COOH), enquanto a outra metade está no estado desprotonado (ou dissociado), carregado negativamente (C2H5COO-), conhecido como íon propionato ou propanoato, que pode formar sal ou compostos éster. À medida que o pH diminui (se tornando mais ácido), mais PA está no estado protonado, não carregado; quando o pH aumenta (se tornando mais básico), mais PA está no estado desprotonado, carregado negativamente.

[0013] Como PA inibe o crescimento de mofo e algumas bactérias em níveis entre 0,1 e 1% (peso/volume), PA e seus sais são usados como conservantes tanto em rações para animais como alimentos para humanos (como produtos assados). Nos Estados Unidos, PA é “geralmente reconhecido como seguro,” ou GRAS, pela Food and Drug Administration quando usado como um aditivo alimentício. Ele também é aprovado para uso como um aditivo alimentício na Austrália, Nova Zelândia, e na UE. Em adição, PA é um intermediário importante na síntese de outros produtos químicos, como plásticos derivados de celulose, pesticidas, aromatizantes de frutas, bases de perfume, e produtos farmacêuticos.

[0014] Embora eles estejam amplamente distribuídos na natureza, a produção comercial de ácidos orgânicos depende

6 / 35 geralmente da síntese química porque ela é mais competitiva economicamente. Por exemplo, PA é produzido comercialmente atualmente quase exclusivamente através de processos petroquímicos. À medida que os preços do petróleo bruto e petroquímicos aumentam, junto com o rápido desenvolvimento no campo da biotecnologia, o espaço econômico entre custos de fabricação de PA através de síntese química e através de fermentação microbiana está diminuindo. Associado com preocupações crescentes sobre a escassez de energia e poluição ambiental, tem havido um interesse crescente na biossíntese em escala comercial de ácidos orgânicos, tais como PA, a partir de recursos renováveis.

[0015] A produção microbiana de ácidos orgânicos por fermentação é conhecida e usada há séculos. Por exemplo, Aspergillus niger e Yarrowia lipolytica têm sido usados para produzir ácido cítrico; Lactobacillus tem sido usado para produzir ácido láctico; Clostridium tem sido usado para produzir ácido acético; Aspergillus niger e Gluconobacter têm sido usados para produzir ácido glucônico.

[0016] Propionibacterium é o microrganismo mais frequentemente usado na produção de PA (assim como, vitamina B12 e queijo suíço). Propionibacterium é um gênero de bactéria gram-positiva, anaeróbica, não móvel, não formadora de esporos e de formato em haste, que inclui as espécies P. freudenreichii, P. acidifaciens, P. cyclohexanicum, P. australiense, P. acidipropionici, P. jensenii, P. thoenii, P. microaerophilum, P. olivae, P. damnosum, P. propionicum, P. acnes, P. avidum, P. granulosum, P. humerusii, e P. lymphophilum. Para produção industrial de PA, a cepa mais comumente usada é P. acidipropionici. (Uma proposta foi

7 / 35 produzida para reclassificar as espécies dentro do gênero Propionibacterium em três novos gêneros: Acidipropionibacterium, Cutibacterium, e Pseudopropionibacterium (Scholz & Kilian 2016). No entanto, Propionibacterium acidipropionci e Acidipropionibacterium acidipropionici ainda são usados de alguma forma intercambiavelmente. O pH e temperatura ideais para o crescimento de células de Propionibacterium são cerca de 6,0-7,0 e cerca de 30-37ºC, respectivamente (Ahmadi et al. 2017). O crescimento da célula é inibido em pH menor do que cerca de 5,0, embora os fermentadores com partida a pH neutro, possam alcançar pH 4,4 (Rehberger e Glatz 1998). Ahmadi et al. mostra uma visão geral de produção de PA em várias fontes de carbono por várias espécies de Propionibacterium, como relatado na literatura (Ahmadi et al. 2017) sendo incorporado aqui por referência.

[0017] PA também pode ser produzido por outras bactérias anaeróbicas, tais como certas espécies de Anaerovibrio, Bacteroides, Clostridium, Fusobacterium, Megasphaera, Propionispira, Selenomonas, e Veillonella.

[0018] Existem diversas vias de fermentação que convertem fontes de carbono em PA através de uma série de reações enzimáticas. A via de fermentação principal envolvida na produção de PA, especialmente em propionibactérias, é conhecida como o ciclo de Wood-Werkman, que produz propionato a partir de piruvato, o produto terminal da glicose, e envolve muitos intermediários, incluindo oxaloacetato, malato, fumarato, succinato, succinil-CoA, metilmalonil-CoA, e propionil-CoA, e muitas enzimas, incluindo oxaloacetato transcarboxilase, carboxitransferase dependente de biotina,

8 / 35 CoA transferase, fumarato hidrolase, lactato desidrogenase, coenzima metilmalonil-CoA mutase dependente de B12, malato desidrogenase, e succinato desidrogenase.

[0019] Embora a maior parte do piruvato seja convertida em PA/propionato durante a fermentação, alguma parte é convertida em acetato. A via de formação de acetato envolve intermediários acetil CoA e fosfato de acetila, e complexo de enzimas piruvato desidrogenase, fosfotransacetilase e acetato quinase.

[0020] Diversas fontes de carbono têm sido usadas para a produção de PA microbiano, incluindo glicose, frutose, maltose, sacarose, xilose, lactose, glicerol, lactato, hidrolisado de farinha, melaço, soro de leite, e uma combinação dos mesmos. Diversos sistemas de cultura, como batelada, batelada alimentada e fermentação continua têm sido usados.

[0021] No entanto, para que a produção microbiana em escala comercial de ácidos orgânicos seja economicamente viável, o processo de fermentação deve ser capaz de converter fontes de carbono com um alto rendimento (quantidade de produção de ácido orgânico a partir da fonte de carbono, tipicamente medida em g/g) e alta produtividade (taxa de produção de ácido orgânico, tipicamente medida em g/L.h).

[0022] Várias tecnologias de fermentação, incluindo sistemas de batelada alimentada, cultura contínua, múltiplos estágios, imobilização de células, e fermentação extrativa, têm sido exploradas para aumentar o rendimento da produção de ácido orgânico. No entanto, o aumento modesto no rendimento e produtividade, obtido com frequência, é desviado por um aumento significativo no custo de produção.

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[0023] Por exemplo, métodos de co-cultura têm sido usados para produzir PA usando soro de leite como carga de alimentação (WO 85/04901; EP 0141642 A1). WO 85/04901 descreve o uso de Lactobacillus casei subespécies rhamnosus na presença de Veillonella cricetid para interconverter lactato em propionato através de um processo de fermentação de dois estágios. No primeiro estágio, carboidratos são convertidos em ácido láctico por L. casei; no segundo estágio, ácido láctico é fermentado em PA por V. cricetid. (Ambos os gêneros Lactobacillus e Veillonella pertencem ao filo Firmicutes, enquanto o gênero Propionibacterium pertence ao filo Actinobacteria.) EP 0141642 também descreve o uso de uma cultura mista de bactéria produtora de ácido láctico (L. casei) e bactéria produtora de PA (P. shermanii) para maximizar o rendimento da fermentação. Os sistemas de co- cultura de WO 85/04901 e EP 0141642 são relatados como sendo muito produtivos em termos de produção de PA a partir de lactose, com rendimentos finais na faixa de 20 – 100 g/L. No entanto, tais sistemas de co-cultura têm implicações consideráveis para parâmetros do processo. Por exemplo, eles sofrem de uma falta de controle em relação ao crescimento e atividade metabólica de cada membro do sistema, o que pode levar à falta de crescimento de um dos membros ou contribuir para a formação do produto desejado. Uma falta de reprodutibilidade é comum com sistemas de co-cultura.

[0024] Um problema principal associado com a produção microbiana de ácidos orgânicos é o efeito forte inibitório do produto final no crescimento da célula e o processo de fermentação, levando a baixo rendimento de produção e produtividade. A tolerância ao ácido foi presumida como sendo

10 / 35 crucial para melhorar o rendimento e produtividade de cepas produtoras de PA (Rehberger e Glatz 1998). O efeito inibitório elevado de PA a pH 4,5-5,0 em comparação com ácido láctico foi atribuído ao fato de que nesta faixa de pH, cerca de metade de PA (que tem um pKa de cerca de 4,9) estaria presente na forma não dissociada, protonada, e não carregada, enquanto ácido láctico (que tem um pKa de cerca de 3,1) estaria principalmente na forma dissociada, desprotonada e carregada. Foi presumido que como o ácido não dissociado poderia penetrar na parede da célula e membrana mais facilmente, mais PA do que ácido láctico poderia entrar na célula e exercer seu efeito inibitório. A intensificação da tolerância ao ácido foi, assim, considerada como sendo uma estratégia eficaz para aliviar a inibição do produto final e melhorar a produção de PA. Consequentemente, tentativas foram produzidas para criar mutantes “tolerantes a ácido” de propionibactérias sob alto teor de PA e ou condições não controladas ou de baixo pH.

[0025] Por exemplo, evolução adaptativa via passagem em série tem sido usada para obter P. acidipropionici mutante com tolerância melhorada a ácido (Woskow e Glatz 1991; Zhu et al. 2010). Passagem em série é um método de crescimento de microrganismos, como bactérias em duas ou mais iterações em ambientes artificiais, frequentemente criados em um cenário de laboratório, para gerar mutações espontâneas nos microrganismos à medida que se desenvolvem ao longo do decorrer do experimento para se adaptar a uma ou mais condições ambientais novas projetadas para o experimento. Por exemplo, submeter micróbios repetidamente a condições ácidas extremas levará a mutações espontâneas que permitem

11 / 35 que os micróbios se adaptem ou tolerem tais condições.

[0026] Em trabalho anterior, para criar mutações que conferem tolerância a ácido, as cepas mutantes de P. acidipropionici foram adaptadas para aumentar as concentrações de PA por transferências repetidas e em série em meios de seleção contendo quantidades aumentadas de PA (de 0,5% a 5% (Woskow e Glatz 1991) ou 1,5g/L a 20 g/L (Zhu et al. 2010)) ao longo de um período de um ano ou mais. Particularmente, nestes experimentos, o pH nos meios de seleção tendo quantidades aumentadas de PA não foi controlado, presumivelmente porque foi assumido que os efeitos inibitórios no crescimento da célula e produção de PA foram causados pela acidez de PA.

[0027] Mutante(s) de P. acidipropionici com produção intensificada de PA também foram obtidos por imobilização e adaptação em um biorreator de leito fibroso (Suwannakham e Yang 2005; Suwannakham 2005). A capacidade para obter mutante(s) tolerante(s) a ácido em biorreator de leito fibroso foi atribuída à alta densidade da célula e viabilidade mantida no biorreator e fisiologia distinta e capacidade de sobrevivência de células imobilizadas como um resultado de seu contato direto umas com as outras e com uma superfície sólida. A produção maior de PA foi atribuída em parte aos níveis mais altos de atividade de oxaloacetato transcarboxilase e CoA transferase no(s) mutante(s). Apesar do rendimento maior de PA, no biorreator de leito fibroso com alta densidade de células, o crescimento da célula é limitado. Além do mais, biorreatores de leito fibroso são caros e não escalonáveis, e seus usos são limitados a produções em pequena a média escala.

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[0028] Mais recentemente, estratégias de mutagênese aleatória, como embaralhamento de genoma, foram usadas para acelerar a evolução microbiana direcionada. Por exemplo, Guan et al. relataram o uso de embaralhamento de genoma para gerar uma de cepa de P. acidipropionici mutante tolerante a ácido (Guan et al. 2012). Para obter a cepa, quatro ciclos sucessivos de embaralhamento de genoma via fusão de protoplastos foram realizados, e a cepa tolerante a ácido foi selecionada usando meios suplementados com quantidades aumentadas de PA (de 5 a 20 g/L). Novamente, pH no meio de seleção tendo quantidades aumentadas de PA não foi controlado, presumivelmente porque foi assumido que os efeitos inibitórios sobre crescimento celular e produção de PA foram causados pela acidez de PA.

[0029] Análises subsequentes identificaram 24 proteínas que diferiam significativamente entre as cepas parentais embaralhada (Guan et al. 2014). As proteínas detectadas foram detectadas como estando em quatro classes funcionais amplas: metabolismo celular e produção de energia; replicação de DNA, síntese de RNA, e tradução; modificação pós-tradução, duplicação de proteína, e chaperonas; e proteínas hipotéticas de função desconhecida.

[0030] Em outro estudo, embaralhamento de genoma foi usado para gerar cepas mutantes de P. acidipropionici, P. intermedium, e P. jensenii tolerantes a ácido (WO 2017/055932 A2). Três ciclos sucessivos de embaralhamento de genoma foram realizados para cada conjunto de cepas, cada seguido por seleção de colônias do lado ácido (pH 3) de placas de gradiente de pH/PA preparadas usando meio de cultura ágar suplementado com 5 g/L de PA a pH 3 ou pH 6,5. Recombinantes

13 / 35 individuais finais foram selecionados aleatoriamente após diluições em série em placas de meio de cultura e triados em uma placa de 96 cavidades contendo 100 l de meio de cultura a pH 5 e 25 g/L de PA. As cepas mutantes foram relatadas como tendo rendimentos intensificados de PA em relação ao Propionibacterium nativo e outras cepas derivadas conhecidas. Análises genômicas de uma das cepas mutantes de P. acidipropionici identificaram diversos genes modificados, incluindo aqueles codificando o transportador de aminoácido polar ABC, a proteína de biogênese do citocromo C, o transportador de açúcar múltiplo ABC, a subunidade grande de RNA ribossômico, a cadeia longa acil-CoA sintetase, e o facilitador de difusão de cátions. Em adição, uma cópia extra do gene do RNA ribossômico completo e uma cópia extra do regulon arginina deiminase (ArgR) com um ponto de mutação foram encontradas na cepa mutante.

[0031] Modificação metabólica direcionada de propionibactérias também foi usada para aumentar a produção de PA. Estes estudos geralmente direcionam ao alvo enzimas envolvidas nas vias de metabolismo de piruvato para, por exemplo, ou inibir a via de formação de acetato ou intensificar a via de formação de PA. Por exemplo, Yang e Suwannakham criaram cepas de P. acidipropionici modificadas com genes codificando acetato quinase (que catalisa a conversão de acetil fosfato em acetato) e/ou fosfotransacetilase (que catalisa a conversão de acetil CoA em acetil fosfato) nocauteadas, com o objetivo de eliminar ou reduzir a formação de acetato e, desse modo, intensificar a produção de PA (US 2011/0151529 A1; Suwannakham 2005).

[0032] Yang et al. criaram cepas modificadas de P.

14 / 35 acidipropionici e P. freudenreichii subsp. shermanii transformadas com genes de propionil-CoA:succinato CoA transferase para aumentar a produção de PA pela superexpressão de propionil-CoA:succinato CoA transferase, que catalisa a conversão de propionil CoA em propionato (WO 2012/064883 A2). As cepas resultantes foram relatadas como tendo produção aumentada de PA e resistência a PA, assim como resistência a pH ácido em geral. Acredita-se que a atividade aumentada de CoA transferase aumenta o fluxo de carbono através da via de formação de PA em relação à via de formação de acetato.

[0033] A tabela abaixo descreve uma lista de genes que foram manipulados usando DNA recombinante. Estes genes constituem alvos genéticos convencionais onde pode ser esperado que mutações regulatórias aumentem os rendimentos de PA.

TABELA 1 Gene(s) Organismo Efeito Referência OtsA P. acidipropionici Super Jiang et al. 2015 (biossíntese expressado de trealose) artifici- almente Vários genes em P. jensenii Super Guan et al. 2016 sistemas expressado arginina artificial deaminase e mente glutamato decarboxilase Propionil- P. acidipropionici Super Wang et al. 2015 CoA:succinato P. shermanii expressado WO 2012/064883 A2 CoA artifici- transferase almente Acetato P. acidipropionici Nocaute Suwannakham et al. quinase artificial 2006 Suwannakham 2005 US 2011/0151529 A1 Fosfotransa- P. acidipropionici Nocaute US 2011/0151529 A1 cetilase artificial

[0034] A modificação genética direcionada em propionibactérias, no entanto, é desafiadora. Como uma

15 / 35 questão inicial, o efeito de alteração de ácido e estresse na fisiologia bacteriana é complexo e não está bem compreendido, tornando difícil melhorar a tolerância para ácidos orgânicos através da manipulação de genes específicos. De fato, apesar do conhecimento sobre a identidade dos intermediários e enzimas na via de Wood-Werkman que formam PA em propionibactérias, manipulações genéticas dos genes nesta via não aumentaram os rendimentos de PA em uma extensão significativa.

[0035] Além do mais, o alto teor de GC em propionibactérias torna difícil identificar os locais de genes individuais e todas as regiões de codificação no genoma, o que complica a manipulação genética. Em adição, existe apenas um pequeno número de vetores de clonagem disponíveis para a introdução de DNA recombinante em células de propionibactérias, que são conhecidos por terem baixa eficiência de transformação. A seleção de transformantes também é complicada pela capacidade das propionibactérias desenvolverem rapidamente resistência espontânea a marcadores antibióticos.

[0036] Além destes desafios, o uso de DNA recombinante para produzir linhagens de células microbianas é incompatível com o desenvolvimento de um ingrediente alimentício orgânico como PA. Pelo menos nos Estados Unidos, PA ou outros ácidos orgânicos produzidos por micróbios modificados geneticamente não podem ser rotulados como “orgânicos” ou “conservantes naturais,” o que é especialmente importante na indústria de alimentos. Portanto, permanece uma necessidade de novas cepas microbianas apropriadas para produção em escala industrial de ácidos

16 / 35 orgânicos e métodos de produzir e isolar tais cepas.

[0037] A toxidade de ácidos orgânicos para micróbios não é bem compreendida apesar de sua relevância nas indústrias de produtos alimentícios e químicos que usam fermentação para a produção de ácido orgânico. Apesar do conhecimento sobre a identidade dos intermediários e enzimas na via de Wood-Werkman que forma PA em propionibactérias, manipulações genéticas dos genes nesta via não aumentaram os rendimentos de PA em uma extensão significativa. Uma razão poderia ser que estes genes não limitam a formação de PA. Portanto, alterar sua sequência ou expressão não mudaria os níveis de PA. Em vez disso, argumenta-se aqui que outros alvos celulares controlam os rendimentos de PA, mas suas identidades não poderiam ser previstas com base no conhecimento atual. O processo desconhecido é o que limita a formação de PA. Como este processo não é conhecido, os genes envolvidos neste processo não podem ser previstos.

[0038] Esforços anteriores na criação de bactérias resistentes a PA através da passagem em série ou embaralhamento de genoma têm usado geralmente meios com quantidades aumentadas de PA, mas ou sem controle de pH ou a um pH significativamente abaixo do pKa de PA. Isto é com base na ideia de que a toxidade e, portanto, resistência, surge da concentração do ácido orgânico. No entanto, esta abordagem não considera o mecanismo de absorção de ácido orgânico pela célula que envolve o sistema de transporte, que depende da natureza do transportador e da membrana ou envelope em que está localizado.

[0039] Ácidos orgânicos são ácidos fracos com valores pKa geralmente entre cerca de 4-5. A relação entre pH e pKa é

17 / 35 descrita pela equação de Henderson-Hasselbalch: pH = pKa + log10([A-]/[HA]); em que [HA] é a concentração do ácido fraco protonado, não dissociado, e não carregado, e [A-] é a concentração da base conjugada desprotonada, dissociada e carregada negativamente. Em um processo de fermentação típico, o pH da cultura microbiana, quando o ácido orgânico alcança a concentração máxima, está aproximadamente no pKa do ácido orgânico sem o uso de um agente tamponante. Uma solução tendo um pH de cerca de 4-5 não é tão ácida em relação à tolerância de pH conhecida de bactérias produtoras de ácido. A maioria destas bactérias crescem em valores de pH nesta faixa, embora o pH ótimo para crescimento da célula seja tipicamente cerca de 6-7.

[0040] O transporte intracelular de ácidos orgânicos pode ser alcançado através de difusão ou através da ação de sistemas de proteínas de transporte de membrana dependendo se os ácidos orgânicos estão carregados ou não carregados. Quando os ácidos orgânicos não são desprotonados ou dissociados, eles não são carregados. Neste estado, eles podem se difundir através de membranas celulares sem depender de sistemas de transporte. Moléculas carregadas, no entanto, sempre exigem um sistema de transporte para serem translocadas através de membranas.

[0041] A um valor de pH que se iguala a seu valor pKa, metade do ácido orgânico está na forma protonada (ou não dissociada), não carregada, enquanto a outra metade está na forma desprotonada (ou dissociada), carregada negativamente. Em valores de pH abaixo de seus valores de pKa, ácidos orgânicos estariam principalmente não carregados porque seus

18 / 35 grupos carboxila estariam protonados. Em valores de pH acima de seus valores pKa, os ácidos orgânicos estariam principalmente desprotonados ou dissociados e, portanto, carregados negativamente.

[0042] Com altas concentrações de ácido orgânico, o pH é relativamente baixo, e o ácido orgânico estaria principalmente no estado não carregado e poderia se difundir na célula em sua forma ácida. Esta é a base para os esforços anteriores para isolar micróbios resistentes a ácido orgânico ou sem controle de pH ou a um pH significativamente abaixo do pKa do ácido orgânico. A abordagem, em teoria, poderia gerar linhagens de células com mutações que produzem resistência devido à entrada na célula de ácido orgânico com base na difusão. É assumido que o ácido orgânico não carregado se difunde através da membrana da célula no citoplasma e libera prótons devido ao pH relativamente alcalino no interior da célula; o aumento na acidez intracelular inibe o crescimento da célula e formação de ácido orgânico. Em outras palavras, foi presumido que ácidos orgânicos em seu estado não carregado limitavam sua própria produção. Apesar da literatura e das patentes publicadas, na experiência dos requerentes, esta abordagem não gera micróbios resistentes de modo eficaz, e pode requerer anos de passagem para funcionar.

[0043] Os requerentes formularam a hipótese que não era a acidez do ácido orgânico que era tóxica, como previamente presumido por outros. Ao contrário, era a forma desprotonada, negativamente carregada ou o sal neutro do ácido orgânico (propionato) que era tóxico, e seria mais eficaz como um agente de seleção para recuperar mutações de resistência

19 / 35 espontânea.

[0044] Diferente de esforços anteriores, os requerentes formularam a hipótese que o uso de controle de pH a um valor acima do valor pKa dos ácidos orgânicos a serem produzidos, e preferível pelo menos 1 unidade acima, iria assegurar que a maior parte dos ácidos orgânicos permanecessem em uma forma carregada e desprotonada. Nesta forma, eles permaneceriam dependentes de sistemas de transporte de proteínas para absorção intracelular. Isto evitaria a recuperação de linhagens de células com mutações que produziram resistência devido à entrada nas células de ácido orgânico com base em difusão, se tais mutações pudessem ser descobertas.

[0045] Especificamente, o processo usado foi a passagem em série da linhagem de célula microbiana inicial (usualmente, mas não necessariamente, um tipo selvagem) em cultura de células livres (isto é, não imobilizadas ou planctônicas) em um meio de cultura bacteriológico suplementado com ácido orgânico de interesse em uma quantidade que é suficiente para inibir o crescimento microbiano normal (ou em quantidades progressivamente crescentes ou na mesma quantidade para todas as passagens) sob condições de controle de pH contínuo a um pH específico que está acima do valor pKa do ácido orgânico. O pH é controlado a um valor acima do valor pKa do ácido orgânico, preferivelmente na faixa entre cerca de 5,5 e cerca de 7,5, mais preferivelmente em ou próximo ao neutro, entre cerca de 6,0 e cerca de 7,0, e o mais preferivelmente a cerca de 7,0. Embora os presentes exemplos descrevam o uso de Propionibacterium, outros micróbios podem ser usados que são organismos fermentativos que excretam ácidos orgânicos, por exemplo, Lactobacillus,

20 / 35 Acetobacter, Gluconobacter, ou Clostridium. O ácido orgânico usado pode ser, por exemplo, PA, ácido láctico, ácido acético, ou ácido butírico. Em algumas modalidades, o micróbio é do gênero Propionibacterium (Acidipropionibacterium) e, mais preferivelmente, a espécie P. acidipropionici, e o ácido orgânico é PA. Em algumas modalidades, o micróbio é do gênero Lactobacillus, e mais preferivelmente a espécie L. acidophilus, e o ácido orgânico é ácido láctico. Em algumas modalidades, o micróbio é do gênero Acetobacter ou do gênero Gluconobacter, e o ácido orgânico é ácido acético. Em algumas modalidades, o micróbio é do gênero Clostridium e mais preferivelmente a espécie é C. butyricum, e o ácido orgânico é ácido butírico.

[0046] Usando seu método de passagem em série com controle de pH, os requerentes foram capazes de criar e isolar uma nova cepa microbiana tendo produção de ácido orgânico aumentada em comparação com a cepa parental em menos do que duas semanas, muito mais rápido do que usando o método de passagem em série convencional descrito em Woskow e Glatz 1991, que leva geralmente pelo menos um ano. O método dos requerentes também é muito menos complexo e mais facilmente escalonável do que outros métodos de mutagênese aleatórios, tais como embaralhamento de genoma e imobilização de células em um biorreator de leito fibroso ou modificação genética direcionada. Ácidos orgânicos produzidos por linhagens de células mutantes criadas e isoladas usando passagem em série com controle de pH podem ser rotulados como “orgânicos” ou “conservantes naturais,” o que é especialmente importante na indústria alimentícia.

[0047] O mesmo método de passagem em série com controle

21 / 35 de pH pode ser usado para produzir e isolar uma variedade de micróbios, incluindo, mas não limitados a propionibactérias, lactobacilos, bactérias de ácido acético, e clostrideos, que produzem em excesso diversos de ácidos orgânicos, incluindo, mas não limitado a PA, ácido láctico, ácido acético, e ácido butírico. Todas as moléculas carregadas dependem de sistemas de transporte e suas membranas/envelopes associadas para funcionar. Alterações nestes componentes celulares alcançariam o mesmo resultado como descrito aqui para propionato para outros ácidos orgânicos.

[0048] O mesmo método de seleção (isto é, uso de meio de cultura bacteriológica suplementado com ácido orgânico de interesse em uma quantidade que é suficiente para inibir o crescimento microbiano normal sob condições de controle de pH contínuo a um pH que está acima do valor pKa do ácido orgânico) pode ser usado na triagem de bibliotecas microbianas geradas a partir do embaralhamento de genoma ou outros métodos de mutagênese aleatórios para isolados que exibem tolerância e produção de ácido orgânico aumentada.

[0049] Usando este método de controle de pH, os requerentes foram capazes de direcionar mecanismos únicos para resistência que dependiam do transporte e/ou alvos intracelulares imprevisíveis incluindo aqueles envolvidos na regulação e metabolismo. Então, o ressequenciamento do genoma foi usado para identificar os genes críticos através de suas mudanças mutacionais que causaram a resistência genética a altas concentrações de ácidos orgânicos.

[0050] As mutações resultantes afetaram geralmente as funções do envelope celular, como mostrado em Tabela 2. TABELA 2. ENVELOPE E CATEGORIAS ASSOCIADAS

22 / 35 FUNÇÕES DO ENVELOPE: Transportadores/proteínas de membrana (10 ORFS afetados): Proteínas da superfamília de facilitadores principais, aminoácido permeases, proteína da membrana hipotética, proteína da membrana LemA, metaloprotease intramembrana, AAA ATPase, antiportador sódio-próton Ganho de função em proteína de ligação a penicilina e aminoácido permease Síntese parede celular/peptidoglicano: Proteínas de ligação a penicilina, proteínas contendo o domínio de antígeno-O ligase (muitas mutações) FUNÇÕES DE MODIFICAÇÃO DO ENVELOPE: Oxidação/redução: Flavina redutase, alfa/beta hidrolase, piruvato carboxilase, MocA oxidorredutase, protofiringênio oxidase, KGD Glicosil transferases/hidrolases: Glicosil transferase, glicosil hidrolase, adenina glicosilase

[0051] Estas mutações alteraram principalmente a estrutura e composição e função do envelope celular, que consiste na parede da célula e membrana(s), incluindo a membrana citoplasmática. Uma lista completa das mutações identificadas é provida em Tabela 3. Os requerentes não observaram quaisquer mutações em genes que foram direcionados para modificação metabólica e manipulados usando DNA recombinante como relatado previamente (ver Tabela 1). Mutações em múltiplos genes parecem ser necessárias para produzir o fenótipo mutante (tal como crescimento aumentado em meios suplementados com ácido orgânico e/ou produção em excesso de ácido orgânico em

23 / 35 comparação com a linhagem de célula microbiana inicial. Isto está em contraste direto com o conhecimento anterior, onde genes únicos foram manipulados para tentar mudar os rendimentos de PA.

[0052] De acordo com a presente invenção, outras técnicas convencionais de microbiologia, biologia molecular, DNA recombinante e bioquímica podem ser usadas. Tais técnicas são completamente explicadas na literatura e dentro da competência dos versados na técnica. A invenção será descrita adicionalmente nos exemplos seguintes, que não limitam o escopo dos métodos e composições da matéria recitada nas reivindicações.

EXEMPLOS Exemplo 1 Isolamento de cepa 3-1

[0053] Uma P. acidipropionici (ATCC 25562) foi cultivada em alta densidade celular em 10mL M24 + 2,0% de meio de glicose. Diluições em série desta cultura (100 a 10-3) foram então colocadas em placas em M24 sólido + 2,0% de meios de glicose, solidificados com ágar, suplementados com 1,0%, 2,0%, e 3,0% (peso/volume) de PA, todos neutralizados para pH 7,0 usando hidróxido de sódio. As células também foram colocadas em placas em M24 sólido + 2,0% de meio de glicose sem nenhum PA adicional.

[0054] Após uma incubação anaeróbica de 5 dias a 30ºC, o crescimento da colônia em diferentes concentrações de PA foi avaliado. Três colônias cresceram na placa de PA a 3% colocadas na placa com células não diluídas; nenhuma colônia cresceu nas placas de PA a 3% colocadas na placa com células diluídas. As três colônias foram isoladas e re-semeadas em

24 / 35 placas sem PA, PA a 2,0%, e PA a 3,0% PA (todas neutralizadas para pH 7,0 usando hidróxido de sódio), junto com células de P. acidipropionici do tipo selvagem cultivado recentemente.

[0055] Após uma segunda incubação anaeróbica de 5 dias a 30ºC, o crescimento da colônia em diferentes concentrações de PA foi novamente avaliado. Todos os três isolados, mas não do tipo selvagem, foram capazes de crescer na placa de PA a 1,0% (Fig. 1). Apenas o isolado #1 foi capaz de crescer nas placas de PA a 2,0% e 3,0%. Este isolado foi chamado cepa 3-1 (“3” denota PA a 3,0%, e “1” denota o isolado #1). O isolado #1 foi inoculado em 5 mL de meio líquido M24 + 2,0% de glicose e cultivado até alta densidade celular, e linhagens permanentes congeladas destas células foram produzidas.

[0056] Após o fenótipo de resistência a PA a 3,0% em meios sólidos ter sido confirmado para a cepa 3-1, a produção de PA em culturas contínuas de 10mL e culturas de biorreator de 1L desta cepa foi comparada com suas células parentais de P. acidipropionici (ATCC 25562) por HPLC em uma ampla faixa de meios e condições de cultivo. Exemplo 2 Produção de PA pela cepa 3-1 e P. acidipropionici do tipo selvagem

[0057] P. acidipropionici do tipo selvagem (ATCC 255562) e cepa 3-1 foram cultivados a partir de uma linhagem permanente congelada a 30°C sob condição anaeróbica em meio M24 suplementado com 2% de glicose. As células foram subcultivadas a cada 48 h em meio M24 fresco começando com 10 mL e então 50 mL para usar como semente para os vasos do biorreator de 1 L.

25 / 35

[0058] Para a preparação de meio de farinha de trigo, 75 g de farinha de bolo tipo americano foram adicionados em 1L de ddH2O em um frasco estéril de 2L enquanto misturando. Um mL de Enzenco alfa-amilase e 500 mL de 50 ppm de CaCl2 foram adicionados à mistura para hidrolisar a farinha de bolo. O pH foi ajustado para 6,0 por adição de 5 mL de 5M NaOH e a temperatura foi mantida a 90°C por 1 hora. A mistura foi deixada resfriar, então incubada a 37°C durante a noite. Após a incubação durante a noite, a temperatura foi aumentada a 60°C e o pH ajustado a 7,0 por adição de 2 mL de 5M NaOH. Para liberar glicose, 1 mL de Enzenco glucoamilase, 0,05 g de protease, 0,4 g de MgSO4, e 10 g de estrato de levedura Ohly KAT foram adicionados à mistura enquanto agitando. A mistura foi mantida a 60°C por 2 horas. A mistura foi deixada resfriar, então adicionada a um vaso do biorreator com camisa de vidro e, então, vedado. Antes da autoclavagem, o pH foi calibrado.

[0059] Fermentações foram realizadas em volumes de 1L volumes nos vasos do biorreator de 3L. A temperatura foi mantida a 30°C, o pH foi mantido a 7,0 usando 5M NaOH, e as culturas foram agitadas a 200 rpm. 3 mL de solução de elemento traço estéril filtrado foram adicionados ao biorreator antes da inoculação. A concentração de glicose foi determinada usando um analisador YSI 2900. O 1L de meio de farinha de trigo foi semeado com 5% de inóculo. Amostras foram removidas a cada 24 horas para análise de PA no HPLC. Os resultados são mostrados em Fig. 2.

[0060] Tanto a cepa 3-1 como a cepa do tipo selvagem parental alcançaram a concentração máxima de PA em cerca de 120 horas. A concentração máxima de PA produzida pela cepa

26 / 35 3-1 é cerca de 36 g/L, em comparação com cerca de 30 g/L pela cepa do tipo selvagem parental.

[0061] Experimentos adicionais foram realizados sob 5-6 condições diferentes, 3-4 vezes cada, para comparar a produção de PA pela cepa 3-1 e P. acidipropionici do tipo selvagem. Resultados similares aos mostrados em Fig. 2 foram obtidos. Existe um aumento mínimo de 15% na produção de PA pela cepa 3-1 em comparação com o tipo selvagem após 60 horas de cultivo. Exemplo 3 Análises genômicas de cepa 3-1

[0062] Ressequenciamento do genoma da cepa 3-1 foi usado para identificar os genes críticos através de suas mudanças mutacionais que causaram a resistência a altas concentrações de ácidos orgânicos.

[0063] 65 mutações de perda de função em 29 genes foram identificadas. As mutações afetaram geralmente as funções do envelope celular, como mostrado em Tabela 2. Estas mutações alteram principalmente a estrutura e a composição e a função do envelope celular, que consiste na parede da célula e membrana(s), incluindo a membrana citoplásmica. Uma lista completa das mutações identificadas na cepa 3-1 é apresentada em Tabela 3. TABELA 3. MUTAÇÕES DE GENOMA DA CEPA 3-1 Coordenadas ORF Mudança Não sinônimo ASQ49_RS00690 metiltransferase dependente de 130744-130746 Arg  His SAM classe I ASQ49_RS00695 130744-130746 transportador MFS Thr  Pro

27 / 35

Coordenadas ORF Mudança ASQ49_RS00690 metiltransferase dependente de 130748 Pro  Leu SAM classe I

ASQ49_RS00695 130752 transportador MFS Arg  Gly

181601 ASQ49_RS00915 Inserção (sem (80% de proteína da família LemA deslocamento de confiança) quadro) ASQ49_RS00915 181607-181609 proteína da família LemA Gln  Leu

ASQ49_01155 240311 Flavina redutase Pro  His

ASQ49_01155 240440 Flavina redutase Ala  Val

ASQ49_RS01330 Proteína hipotética 281222 (‘acerto’ BLAST para Trp  STOP transportador MFS)

ASQ49_RS01635 344598 Transportador MFS Thr  Pro

ASQ49_RS02385 525954 Ala  Glu família 1 glicosil transferase ASQ49_RS02475 Proteína hipotética (‘Acertos’ BLAST fortes para Ala  Gly 548143-548147 antígeno-O ligase e proteína Gly  Leu da membrana)

ASQ49_RS02475 Proteína hipotética (‘Acertos’ BLAST fortes para Ala  Val 548153-548156 antígeno-O ligase e proteína Gly  Leu da membrana)

ASQ49_RS02475 Proteína hipotética (‘Acertos’ BLAST fortes para 548162 Ala  Val antígeno-O ligase e proteína da membrana)

ASQ49_RS02520 Proteína contendo domínio de 558158-558160 His  Gly antígeno-O ligase

ASQ49_RS02520 Proteína contendo domínio de 558181 Gln  His antígeno-O ligase

28 / 35

Coordenadas ORF Mudança ASQ49_RS02520 Proteína contendo domínio de 558228 Ala  Thr antígeno-O ligase

ASQ49_RS02520 Proteína contendo domínio de 558252 Ser  Pro antígeno-O ligase

ASQ49_RS02520 558258 Proteína contendo domínio de Ser  Pro antígeno-O ligase ASQ49_RS02520 Proteína contendo domínio de 558266 Arg  Leu antígeno-O ligase

ASQ49_RS02520 Proteína contendo domínio de 558273 Ser  Ala antígeno-O ligase

ASQ49_RS02520 558279 Proteína contendo domínio de Gln  Glu antígeno-O ligase ASQ49_RS02520 Proteína contendo domínio de 558282 Glu  Gln antígeno-O ligase

ASQ49_RS02520 Proteína contendo domínio de 558288-588290 Leu  Pro antígeno-O ligase

ASQ49_RS02520 Proteína contendo domínio de 558291-558293 Glu  Val antígeno-O ligase

ASQ49_RS02520 Proteína contendo domínio de 558306 Pro  Ala antígeno-O ligase

ASQ49_RS02520 Proteína contendo domínio de 558308-558310 Thr  Ser antígeno-O ligase

ASQ49_RS02535 Proteína contendo domínio de 562835 Val  Leu antígeno-O ligase

ASQ49_RS02535 Proteína contendo domínio de 562840 Ala  Val antígeno-O ligase

ASQ49_RS02535 Proteína contendo domínio de 562843 Gly  Ala antígeno-O ligase

29 / 35

Coordenadas ORF Mudança ASQ49_RS02550 566353 proteína de ligação à (*50% Lys  Gln penicilina frequência) ASQ49_RS02550 566356 proteína de ligação à (*50% Ala  Ser penicilina frequência) ASQ49_RS02820 618017-618019 Fosfotransferase Glu  Ala

ASQ49_RS03340 738302 Alfa/beta hidrolase Thr  Ala

ASQ49_RS03360 Proteína hipotética 742073 (‘Acertos’ BLAST para Ile  Leu metaloprotease intramembrana)

ASQ49_RS05220 oxidoredutase da família 1176596 Ala  Val gfo/Idh/MocA

ASQ49_RS05630 1279986 Alfa/beta hidrolase Ile  Val

ASQ49_RS05840 1331356 Aminoácido permease Gly  Ser

ASQ49_RS05840 1331366 Aminoácido permease Arg  His

ASQ49_RS06625 Proteína hipotética 1521847 (‘Acertos’ BLAST para Thr  Ala protoporfirinogênio oxidase)

ASQ49_RS07985 1816621 Adenina glicosilase Ser  Ala

ASQ49_RS07985 1816687 Inserção no quadro Adenina glicosilase (1 aminoácido) ASQ49_RS07985 1817191 Adenina glicosilase Gly  Glu

ASQ49_RS07985 1817202 Adenina glicosilase Glu  Ala

SQ49_RS08150 Proteína hipotética 1854503 (‘acerto’ BLAST para Lys  Arg antiportador sódio-próton)

30 / 35 Coordenadas ORF Mudança SQ49_RS08150 Proteína hipotética 1854520 (‘acerto’ BLAST para Ile  Met antiportador sódio-próton) ASQ49_12020 oxoglutarato decarboxilase multifuncional/subunidade de ligação de oxoglutarato 2679601 desidrogenase tiamina His  Asp pirofosfato / subunidade de dihidrolipoilisina-resíduo de succiniltransferase (kgd) ASQ49_RS13125 2927020 Inserção no quadro Aminoácido permease (4 aminoácidos) ASQ49_RS13125 2927030 Aminoácido permease Gly-Ser  Ala-Ala ASQ49_RS13130 2928883 Proteína hipotética Asn  Tyr (família glicosil gidrolase) 3517645 (*50% ASQ49_RS15965 Thr  Arg frequência) aminopeptidase da família M18 3517646 ASQ49_RS15965 (*50% Aminopeptidase da família M18 Thr  Ser frequência) 3517648 ASQ49_RS15965 (*50% Aminopeptidase da família M18 Ser  Thr frequência) 3517649 ASQ49_RS15965 (*50% Aminopeptidase da família M18 Ser  Gly frequência) ASQ49_RS15965 3517652 Aminopeptidase da família M18 Ser  Tyr ASQ49_RS15965 3517655 Aminopeptidase da família M18 Ser  Asn

DESLOCAMENTOS

DE QUADRO ASQ49_RS02520 558244 Proteína contendo domínio de antígeno-O ligase ASQ49_RS02520 558246 Proteína contendo domínio de antígeno-O ligase

31 / 35 Coordenadas ORF Mudança ASQ49_RS12835 2867178 AAA ATPase

REPAROS DE DESLOCAMENTO

DE QUADRO ASQ49_RS02075 448285 proteína contendo domínio DUF1116 ASQ49_RS02530 561527 Glicosil transferase ASQ49_RS03980 subunidade da proteína 900222 carreadora de acetil-CoA carboxilase carboxil biotina ASQ49_RS04070 919056 Proteína de ligação à penicilina ASQ49_RS05840 1330401 Aminoácido permease ASQ49_RS05840 1330407 Aminoácido permease

[0064] Mutações nestes genes (ou seus homólogos em outras espécies descritas aqui) conferem provavelmente resistência genética a altas concentrações de ácidos orgânicos alterando os sistemas de proteína de transporte da membrana e/ou alvos intracelulares previamente desconhecidos envolvidos na regulação e/ou metabolismo.

[0065] Mutações múltiplas no mesmo gene implicam que o gene é muito importante para o traço e requerem múltiplas mudanças para contribuir para o traço. De modo notável, vários genes tinham três ou mais mutações, o que pode indicar seus papéis críticos na limitação de formação de ácido orgânico. Eles incluem genes codificando: Proteína contendo domínio de antígeno-O ligase (15 mutações em ASQ49_RS02520; 3 mutações em ASQ49_RS02535; e 3 mutações em ASQ49_RS02475 (Proteína hipotética com ‘acertos’ BLAST fortes para

32 / 35 antígeno-O ligase e proteína da membrana)); família M18 aminopeptidase (6 mutações em ASQ49_RS15965); aminoácido permease (4 mutações em ASQ49_RS05840); e adenina glicosilase (4 mutações em ASQ49_RS07985).

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[0086] 21. EP 0141642.

[0087] 22. WO 85/04901.

[0088] 23. US 2011/0151529 A1.

[0089] 24. WO 2012/064883 A2.

[0090] 25. WO 2017/055932 A2.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método de produzir e isolar uma linhagem de célula microbiana que produz um ácido orgânico, caracterizado pelo fato de que compreende a passagem em série em cultura não imobilizada de uma linhagem de célula parental em um meio de cultura suplementado com o ácido orgânico em uma quantidade suficiente para inibir crescimento de célula microbiana normal, em que o pH do meio de cultura é controlado a um valor acima do valor pKa do ácido orgânico, e em que a linhagem de célula microbiana isolada produz em excesso o ácido orgânico em comparação com a linhagem de célula parental.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o meio de cultura é solidificado.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o ácido orgânico é suplementado em uma quantidade que aumenta progressivamente em iterações sucessivas da passagem em série.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o ácido orgânico é suplementado na mesma quantidade em iterações sucessivas da passagem em série.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o pH do meio é controlado a um valor na faixa de cerca de 5,5-7,5.

6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o pH do meio é controlado a um valor na faixa de cerca de 6,0-7,0.

7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o pH do meio é controlado a cerca de 7,0.

8. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a linhagem de célula parental é tipo selvagem.

9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-8, caracterizado pelo fato de que a linhagem de célula microbiana é derivada de micróbios unicelulares.

10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a linhagem de célula microbiana é derivada do gênero Propionibacterium, Lactobacillus, Acetobacter, Gluconobacter ou Clostridium.

11. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a linhagem de célula microbiana é derivada de P. acidipropionici.

12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-8, caracterizado pelo fato de que o ácido orgânico é ácido propiônico, ácido láctico, ácido acético ou ácido butírico.

13. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o meio de cultura é suplementado com cerca de 1,0%-3,0% de ácido propiônico.

14. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o meio de cultura é suplementado com cerca de 3,0% de ácido propiônico.

15. Linhagem de célula microbiana, caracterizada pelo fato de que é produzida de acordo com o método, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1-14.

16. Linhagem de célula microbiana, caracterizada pelo fato de ter pelo menos 2 mutações identificadas na Tabela 3, preferivelmente em que a linhagem de célula microbiana é derivada do gênero Propionibacterium, Lactobacillus, Acetobacter, Gluconobacter ou Clostridium.

17. Linhagem de célula microbiana, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que a linhagem de célula microbiana tem todas as mutações identificadas na Tabela 3.

18. Linhagem de célula microbiana, caracterizada pelo fato de ter perda de mutações de função em pelo menos 2 genes codificando as proteínas identificadas na Tabela 3 ou seus homólogos.

19. Linhagem de célula microbiana, de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo fato de que a linhagem de célula microbiana tem perda de mutações de função em todos os genes codificando as proteínas identificadas na Tabela 3 ou seus homólogos.

20. Linhagem de célula microbiana, caracterizada pelo fato de ter pelo menos uma perda de mutação de função em genes codificando proteínas selecionadas dentre o grupo consistindo em (1) proteína contendo domínio O-antígeno ligase (2) família M18 aminopeptidase, (3) aminoácido permease e (4) adenina glicosilase.

21. Linhagem de célula microbiana, de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo fato de que a pelo menos uma perda de mutação de função está no gene codificando proteína contendo domínio O-antígeno ligase.

6HPiFLGRSURSL{QLFR ÈFLGRSURSL{QLFR Petição 870210035188, de 19/04/2021, pág. 43/44

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