JP6925258B2 - 脂肪ジオールの微生物による産生 - Google Patents

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Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年７月１８日出願の米国仮出願第６２／０２６，５７３号の利益を主張し、その全開示は、本明細書により参照によって援用される。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子提出された配列表を含み、この配列表はその全体が本明細書により参照によって援用される。本ＡＳＣＩＩコピーは、２０１５年７月１７日に作成されたもので、名称はＬＳ０００５２ＰＣＴ＿ＳＬ．ｔｘｔであり、ファイルサイズは５０，０６４バイトである。
分野
本開示は、脂肪ジオール及びそれらの産生方法に関する。本明細書中、本開示は、発酵によって脂肪ジオールを産生するように操作された組換え微生物に関連する。さらに包含されるのは、微生物を使用して、単純炭素源から脂肪ジオールを産生させるプロセスである。
脂肪アルコールは、工業用物質及び工業工程の構成成分として、特に洗浄剤及び界面活性剤の製造におけるそのような成分として多数の商業用途がある。脂肪アルコールは、化粧品及び食品では、乳化剤、軟化剤、及び増粘剤として、ならびに産業用溶媒及び可塑剤として使用される。脂肪アルコールは、石油化学または油脂化学由来原料から製造することができる。石油化学物質は、石油に由来する化学製品である。油脂化学物質は、植物及び動物油脂などの自然源に由来する精製油である。
脂肪アルコールの化学合成経路は、エネルギーを大量消費するとともに環境への負担も大きく、しかも有害試薬の使用を必要とする。例えば、エチレンは、トリエチルアルミニウムを使用し、続いて空気酸化させることにより、オリゴマー化させることができる。このプロセスは、偶数鎖の脂肪アルコールを作り出し、Ｚｉｅｇｌｅｒプロセスとして知られる。あるいは、エチレンをオリゴマー化させて、アルケンの混合物とすることができ、次いでこのアルケン混合物をヒドロホルミル化に供して、奇数鎖のアルデヒドとする。続いてこのアルデヒドを水素化して、脂肪アルコールとする。別の化学プロセスでは、オレフィン製品を脂肪アルデヒドに変換し、次いで脂肪アルコールに変換する。オレフィン製品は、Ｓｈｅｌｌ高級オレフィンプロセスにより作製され、このプロセスは、Ｒｏｙａｌ Ｄｕｔｃｈ Ｓｈｅｌｌにより１９７７年に商業化された（例えば、年間約百万トンを超えるオレフィンが製造されている）。
脂肪アルコールの自然合成経路は、環境に優しいプロセスと考えられているものの、依然として化学経路に比べて費用がかかる。従来、脂肪アルコールは、脂肪エステルまたはワックスエステルに由来するものであったが、こうしたエステルは、初めは鯨脳油から、後に、獣脂（例えば、ウシまたはヒツジの動物脂肪）から抽出されるようになった。ワックスエステルの代替植物源として、ホホバ植物がある。現在は、脂肪アルコールは、油脂化学由来原料（例えば、精製植物油）、例えば、菜種油、カラシ油、ココナッツ油、またはパーム核油などからも製造することができる。こうした植物油は、主にトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）で構成され、ＴＡＧは、３つの脂肪酸（ＦＡ）でエステル化したグリセロールを含む。植物油は、ＴＡＧのＦＡ組成によって、それぞれ異なる用途に使用される。例えば、石鹸製造には、高比率のラウリン酸（１２：０）が必要とされるが、一方、オレイン酸（１８：１）が豊富な油は、調理用途が推奨される。ＴＡＧは、エステル転移反応に供してエステルとすることができ、次いでこのエステルを水素化して脂肪アルコールとする。獣脂は、大部分がＣ１６−Ｃ１８であるものの、植物源由来の炭素鎖長は、それより変化に富んでいる（例えば、Ｃ６−Ｃ２４）。長鎖アルコール（例えば、Ｃ２０−Ｃ２２）は、菜種またはカラシ種から得ることができ、一方中鎖脂肪アルコール（例えば、Ｃ１２−Ｃ１４）は、ココナッツまたはパーム核油から得ることができる。ココナッツ及びパーム核油は、ラウリン酸（Ｃ１２）及びミリスチン酸（Ｃ１４）が豊富である。２０００年に、欧州でウシ海綿状脳症（すなわち狂牛病）が大流行したことから、獣脂は、一般に、パーム油及び大豆油に由来する植物性オレイン脂肪酸にとってかわられている。
脂肪ジオールまたは脂肪族ジオールは、脂肪アルコールの例であり、化学的方法によって製造することができる。例えば、１，３−ジオールは、エチレン及びカルボン酸クロリドから合成することができる（例えば、Ｋｉｒｃｈａｎｏｖ ｅｔ ａｌ． （１９８１）、Ｉｚｖｅｓｔｉｙａ Ａｋａｄｅｍｉｉ Ｎａｕｋ ＳＳＳＲ， Ｓｅｒｉｙａ Ｋｈｉｍｉｃｈｅｓｋａｙａ ４：９０９−９１１（非特許文献１）からの翻訳を参照）。１，３−ジオールは、α，β−不飽和ケトン及びアルデヒドの水和反応によっても作ることができ、この反応で生じるケトアルコールを水素化する。１，３−ジオールの別の化学合成は、エポキシドのヒドロホルミル化、続いてアルデヒドの水素化が含まれる（例えば、エチレンオキシドから１，３−プロパンジオールを作る場合）。１，３−ジオールに対してより特化した経路は、アルケンとホルムアルデヒドの反応及びβ−ヒドロキシケトンの使用を含む。１，３−ジオールは、食品添加物としての有用性と関連してきた（例えば、米国特許第３，８０６，６１５号（特許文献１）を参照）。１，３−ジヒドロキシ配置が、これらの化学成分の無毒性質に関わっている。
１，３ジオールは、二官能性であり、他の分子間の連結分子として、例えば、重合体製造において使用することができる。例えば、１，３プロパンジオールは、重合体製造において単量体として使用される。１，３脂肪ジオールは、界面活性剤、例えば、「ジェミニ型」界面活性剤の前駆体としても使用することができる。「ジェミニ型」界面活性剤では、両方のアルコール部分が化学修飾される（例えば、エトキシ化、グリコシル化、硫酸化など）。１，３−脂肪ジオールの３−ヒドロキシ部分はキラルでもあり、このことは、１，３−脂肪ジオールを、単量体、医薬品、栄養補助食品、殺虫剤、除草剤、香味剤、香料、溶媒などのキラルであることが重要な化合物の製造のためのシントンとして有用なものにしている。
脂肪ジオールは、工業用物質及び工業工程の重要成分であることから、環境への影響を低く抑えたままで、産業上の需要に十分見合う高品質の脂肪ジオールを製造することが望ましいであろう。本開示は、この必要性に対処する。
米国特許第３，８０６，６１５号
Ｋｉｒｃｈａｎｏｖ ｅｔ ａｌ． （１９８１）、Ｉｚｖｅｓｔｉｙａ Ａｋａｄｅｍｉｉ Ｎａｕｋ ＳＳＳＲ， Ｓｅｒｉｙａ Ｋｈｉｍｉｃｈｅｓｋａｙａ ４：９０９−９１１
本開示の１つの態様は、単純炭素源を含む発酵ブロス中で増殖させた場合に１，３脂肪ジオールを産生させるための組換え微生物を提供し、この微生物は、チオエステラーゼ（ＥＣ３．１．２．−、ＥＣ３．１．１．５、またはＥＣ３．１．２．１４）活性、及びカルボン酸レダクターゼ（ＥＣ６．２．１．３またはＥＣ１．２．１．４２）活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む。１つの態様において、１，３脂肪ジオールは、インビボで産生される。別の態様において、１，３脂肪ジオールとして、Ｃ５ １，３脂肪ジオール、Ｃ６ １，３脂肪ジオール、Ｃ７ １，３脂肪ジオール、Ｃ８ １，３脂肪ジオール、Ｃ９ １，３脂肪ジオール、Ｃ１０ １，３脂肪ジオール、Ｃ１１ １，３脂肪ジオール、Ｃ１２ １，３脂肪ジオール、Ｃ１３ １，３脂肪ジオール、Ｃ１４ １，３脂肪ジオール、Ｃ１５ １，３脂肪ジオール、Ｃ１６ １，３脂肪ジオール、Ｃ１７ １，３脂肪ジオール、Ｃ１８ １，３脂肪ジオール、及びＣ１９ １，３脂肪ジオールが挙げられるが、これらに限定されない。さらに別の態様において、単純炭素源は、再生可能な原料に由来する。１つの実施形態において、本開示は、組換え微生物を提供し、この微生物は、チオエステラーゼ（ＥＣ３．１．２．−、ＥＣ３．１．１．５、またはＥＣ３．１．２．１４）活性、及びカルボン酸レダクターゼ（ＥＣ６．２．１．３またはＥＣ１．２．１．４２）活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含み、かつこの微生物は、単純炭素源を含む発酵ブロス中で増殖させた場合に、１，３脂肪ジオールを産生する。別の実施形態において、前記核酸配列は、外因性である。別の実施形態において、前記核酸配列は、１種類または複数種類の核酸配列を含む。
本開示の別の態様は、単純炭素源を含む発酵ブロス中で増殖させた場合に１，３脂肪ジオールを産生させるための組換え微生物を提供し、この微生物は、チオエステラーゼ（ＥＣ３．１．２．−、ＥＣ３．１．１．５、またはＥＣ３．１．２．１４）活性、及びカルボン酸レダクターゼ（ＥＣ６．２．１．３またはＥＣ１．２．１．４２）活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を発現するように操作された経路を含む。１つの態様において、１，３脂肪ジオールは、インビボで産生される。別の態様において、１，３脂肪ジオールとして、Ｃ５ １，３脂肪ジオール、Ｃ６ １，３脂肪ジオール、Ｃ７ １，３脂肪ジオール、Ｃ８ １，３脂肪ジオール、Ｃ９ １，３脂肪ジオール、Ｃ１０ １，３脂肪ジオール、Ｃ１１ １，３脂肪ジオール、Ｃ１２ １，３脂肪ジオール、Ｃ１３ １，３脂肪ジオール、Ｃ１４ １，３脂肪ジオール、Ｃ１５ １，３脂肪ジオール、Ｃ１６ １，３脂肪ジオール、Ｃ１７ １，３脂肪ジオール、Ｃ１８ １，３脂肪ジオール、及びＣ１９ １，３脂肪ジオールが挙げられるが、これらに限定されない。さらに別の態様において、単純炭素源は、再生可能な原料に由来する。１つの実施形態において、本開示は、チオエステラーゼ（ＥＣ３．１．２．−、ＥＣ３．１．１．５、またはＥＣ３．１．２．１４）活性、及びカルボン酸レダクターゼ（ＥＣ６．２．１．３またはＥＣ１．２．１．４２）活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を発現するように操作された経路を有する組換え微生物を提供し、この微生物は、単純炭素源を含む発酵ブロス中で増殖させた場合に、１，３脂肪ジオールを産生する。別の実施形態において、前記核酸配列は、外因性である。別の実施形態において、前記核酸配列は、１種類または複数種類の核酸配列を含む。
本開示の別の態様は、単純炭素源を含む発酵ブロス中で増殖させた場合に１，３脂肪ジオールを産生させるための組換え微生物を提供し、この微生物は、チオエステラーゼ（ＥＣ３．１．２．−、ＥＣ３．１．１．５、またはＥＣ３．１．２．１４）活性、カルボン酸レダクターゼ（ＥＣ６．２．１．３またはＥＣ１．２．１．４２）活性、及び任意選択でアルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．）活性を有するポリペプチドをコードする１種類または複数種類の核酸配列を発現するように操作されている。１つの態様において、１，３脂肪ジオールは、インビボで産生される。別の態様において、１，３脂肪ジオールとして、Ｃ５ １，３脂肪ジオール、Ｃ６ １，３脂肪ジオール、Ｃ７ １，３脂肪ジオール、Ｃ８ １，３脂肪ジオール、Ｃ９ １，３脂肪ジオール、Ｃ１０ １，３脂肪ジオール、Ｃ１１ １，３脂肪ジオール、Ｃ１２ １，３脂肪ジオール、Ｃ１３ １，３脂肪ジオール、Ｃ１４ １，３脂肪ジオール、Ｃ１５ １，３脂肪ジオール、Ｃ１６ １，３脂肪ジオール、Ｃ１７ １，３脂肪ジオール、Ｃ１８ １，３脂肪ジオール、及びＣ１９ １，３脂肪ジオールが挙げられるが、これらに限定されない。さらに別の態様において、単純炭素源は、再生可能な原料に由来する。１つの実施形態において、本開示は、チオエステラーゼ（ＥＣ３．１．２．−、ＥＣ３．１．１．５、またはＥＣ３．１．２．１４）活性、カルボン酸レダクターゼ（ＥＣ６．２．１．３またはＥＣ１．２．１．４２）活性、及びアルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．）活性を有するポリペプチドをコードする１種類または複数種類の核酸配列を発現するように操作された組換え微生物を提供し、この微生物は、単純炭素源を含む発酵ブロス中で増殖させた場合に、１，３脂肪ジオールを産生する。別の実施形態において、前記１種類または複数種類の核酸配列は、外因性である。
本開示の別の態様は、単純炭素源を含む発酵ブロス中で増殖させた場合に１，３脂肪ジオールを産生させるための組換え微生物を提供し、この微生物は、チオエステラーゼ（ＥＣ３．１．２．−、ＥＣ３．１．１．５、またはＥＣ３．１．２．１４）活性、カルボン酸レダクターゼ（ＥＣ６．２．１．３またはＥＣ１．２．１．４２）活性、及び任意選択でアルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．）活性を有するポリペプチドをコードする１種類または複数種類の核酸配列を発現するように操作された経路を含む。１つの態様において、１，３脂肪ジオールは、インビボで産生される。別の態様において、１，３脂肪ジオールとして、Ｃ５ １，３脂肪ジオール、Ｃ６ １，３脂肪ジオール、Ｃ７ １，３脂肪ジオール、Ｃ８ １，３脂肪ジオール、Ｃ９ １，３脂肪ジオール、Ｃ１０ １，３脂肪ジオール、Ｃ１１ １，３脂肪ジオール、Ｃ１２ １，３脂肪ジオール、Ｃ１３ １，３脂肪ジオール、Ｃ１４ １，３脂肪ジオール、Ｃ１５ １，３脂肪ジオール、Ｃ１６ １，３脂肪ジオール、Ｃ１７ １，３脂肪ジオール、Ｃ１８ １，３脂肪ジオール、及びＣ１９ １，３脂肪ジオールが挙げられるが、これらに限定されない。さらに別の態様において、単純炭素源は、再生可能な原料に由来する。１つの実施形態において、本開示は、チオエステラーゼ（ＥＣ３．１．２．−、ＥＣ３．１．１．５、またはＥＣ３．１．２．１４）活性、カルボン酸レダクターゼ（ＥＣ６．２．１．３またはＥＣ１．２．１．４２）活性、及びアルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．）活性を有するポリペプチドをコードする１種類または複数種類の核酸配列を発現するように操作された経路を有する組換え微生物を提供し、この微生物は、単純炭素源を含む発酵ブロス中で増殖させた場合に、１，３脂肪ジオールを産生する。別の実施形態において、前記１種類または複数種類の核酸配列は、外因性である。
本開示の別の態様は、単純炭素源を含む発酵ブロス中で増殖させた場合に１，３脂肪ジオールを産生させるための組換え微生物を提供し、この単純炭素源は、再生可能な原料に由来する。
本開示の別の態様は、単純炭素源を含む発酵ブロス中で増殖させた場合に１，３脂肪ジオールを産生させるための組換え微生物を提供し、この微生物は、チオエステラーゼ（ＥＣ３．１．２．−、ＥＣ３．１．１．５、またはＥＣ３．１．２．１４）活性、及びカルボン酸レダクターゼ（ＥＣ６．２．１．３またはＥＣ１．２．１．４２）活性を有するポリペプチドをコードする１種類または複数種類の核酸配列を発現する。１つの実施形態において、チオエステラーゼとして、ｆａｔＢ１、ＴＥ＿ＥＥＩ８２５６４、ＴＥ＿ＣＡＤ６３３１０、ｐｈａＧ、及びｔｅｓＡが挙げられるが、これらに限定されない。別の実施形態において、カルボン酸レダクターゼは、ｃａｒＢである。さらに別の実施形態において、前記１種類または複数種類の核酸配列は、外因性である。
本開示の別の態様は、単純炭素源を含む発酵ブロス中で増殖させた場合に１，３脂肪ジオールを産生させるための組換え微生物を提供し、この微生物は、チオエステラーゼ（ＥＣ３．１．２．−、ＥＣ３．１．１．５、またはＥＣ３．１．２．１４）活性、及びカルボン酸レダクターゼ（ＥＣ６．２．１．３またはＥＣ１．２．１．４２）活性を有するポリペプチドをコードする１種類または複数種類の核酸配列を発現するように操作された経路を含む。１つの実施形態において、チオエステラーゼとして、ｆａｔＢ１、ＴＥ＿ＥＥＩ８２５６４、ＴＥ＿ＣＡＤ６３３１０、ｐｈａＧ、及びｔｅｓＡが挙げられるが、これらに限定されない。別の実施形態において、カルボン酸レダクターゼは、ｃａｒＢである。さらに別の実施形態において、前記１種類または複数種類の核酸配列は、外因性である。
本開示の別の態様は、単純炭素源を含む発酵ブロス中で増殖させた場合に１，３脂肪ジオールを産生させるための組換え微生物を提供し、この微生物は、チオエステラーゼ（ＥＣ３．１．２．−、ＥＣ３．１．１．５、またはＥＣ３．１．２．１４）活性、カルボン酸レダクターゼ（ＥＣ６．２．１．３またはＥＣ１．２．１．４２）活性、及びアルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．）活性を有するポリペプチドをコードする１種類または複数種類の核酸配列を発現する。１つの実施形態において、チオエステラーゼとして、ｆａｔＢ１、ＴＥ＿ＥＥＩ８２５６４、ＴＥ＿ＣＡＤ６３３１０、ｐｈａＧ、及びｔｅｓＡが挙げられるが、これらに限定されない。別の実施形態において、カルボン酸レダクターゼは、ｃａｒＢである。さらに別の実施形態において、アルコールデヒドロゲナーゼは、ａｌｒＡである。さらに別の実施形態において、前記１種類または複数種類の核酸配列は、外因性である。
本開示の別の態様は、単純炭素源を含む発酵ブロス中で増殖させた場合に１，３脂肪ジオールを産生させるための組換え微生物を提供し、この微生物は、チオエステラーゼ（ＥＣ３．１．２．−、ＥＣ３．１．１．５、またはＥＣ３．１．２．１４）活性、カルボン酸レダクターゼ（ＥＣ６．２．１．３またはＥＣ１．２．１．４２）活性、及びアルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．）活性を有するポリペプチドをコードする１種類または複数種類の核酸配列を発現するように操作された経路を含む。１つの実施形態において、チオエステラーゼとして、ｆａｔＢ１、ＴＥ＿ＥＥＩ８２５６４、ＴＥ＿ＣＡＤ６３３１０、ｐｈａＧ、及びｔｅｓＡが挙げられるが、これらに限定されない。別の実施形態において、カルボン酸レダクターゼは、ｃａｒＢである。さらに別の実施形態において、アルコールデヒドロゲナーゼは、ａｌｒＡである。さらに別の実施形態において、前記１種類または複数種類の核酸配列は、外因性である。
本開示はさらに、単純炭素源を含む発酵ブロス中で増殖させた場合に１，３脂肪ジオールを産生させるための組換え微生物を含む細胞培養物を包含する。１つの態様において、微生物は、チオエステラーゼ（ＥＣ３．１．２．−、ＥＣ３．１．１．５、またはＥＣ３．１．２．１４）活性、及びカルボン酸レダクターゼ（ＥＣ６．２．１．３またはＥＣ１．２．１．４２）活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を発現するように操作されている。別の態様において、微生物は、チオエステラーゼ（ＥＣ３．１．２．−、ＥＣ３．１．１．５、またはＥＣ３．１．２．１４）活性、カルボン酸レダクターゼ（ＥＣ６．２．１．３またはＥＣ１．２．１．４２）活性、及びアルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．−）活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を発現するように操作されている。別の態様において、細胞培養物は、１，３脂肪ジオールを産生する。別の態様において、細胞培養物は、Ｃ５ １，３脂肪ジオール、Ｃ６ １，３脂肪ジオール、Ｃ７ １，３脂肪ジオール、Ｃ８ １，３脂肪ジオール、Ｃ９ １，３脂肪ジオール、Ｃ１０ １，３脂肪ジオール、Ｃ１１ １，３脂肪ジオール、Ｃ１２ １，３脂肪ジオール、Ｃ１３ １，３脂肪ジオール、Ｃ１４ １，３脂肪ジオール、Ｃ１５ １，３脂肪ジオール、Ｃ１６ １，３脂肪ジオール、Ｃ１７ １，３脂肪ジオール、Ｃ１８ １，３脂肪ジオール、Ｃ１９ １，３脂肪ジオールなどを含む１，３脂肪ジオールを産生する。１つの実施形態において、前記核酸配列は、外因性である。別の実施形態において、前記核酸配列は、１種類または複数種類の核酸配列を含む。
本開示はさらに、上記で説明されるとおりの微生物（上記参照）を含む、１，３脂肪ジオールの産生方法を包含する。
本開示の別の態様は、１，３脂肪ジオールの産生方法を提供し、本方法は、発酵ブロス中に組換え微生物を用意する工程であって、この微生物が、チオエステラーゼ（ＥＣ３．１．２．−、ＥＣ３．１．１．５、またはＥＣ３．１．２．１４）活性、カルボン酸レダクターゼ（ＥＣ６．２．１．３またはＥＣ１．２．１．４２）活性、及び任意選択でアルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．−）活性を有するポリペプチドをコードする１種類または複数種類の核酸配列を発現する、前記工程、ならびに、この発酵ブロスから１，３脂肪ジオールを単離する工程を含む。１つの実施形態において、本方法はさらに、発酵ブロスに単純炭素源を加える工程を含む。さらに別の実施形態において、単純炭素源は、再生可能な原料に由来する。別の態様において、本開示は、１，３脂肪ジオールの産生方法を提供し、本方法は、発酵ブロス中に組換え微生物を用意する工程であって、この微生物が、チオエステラーゼ（ＥＣ３．１．２．−、ＥＣ３．１．１．５、またはＥＣ３．１．２．１４）活性、及びカルボン酸レダクターゼ（ＥＣ６．２．１．３またはＥＣ１．２．１．４２）活性を有するポリペプチドをコードする１種類または複数種類の核酸配列を発現するように操作されている、前記工程、ならびに、この発酵ブロスから１，３脂肪ジオールを単離する工程を含む。１つの態様において、１，３脂肪ジオールとして、Ｃ５ １，３脂肪ジオール、Ｃ６ １，３脂肪ジオール、Ｃ７ １，３脂肪ジオール、Ｃ８ １，３脂肪ジオール、Ｃ９ １，３脂肪ジオール、Ｃ１０ １，３脂肪ジオール、Ｃ１１ １，３脂肪ジオール、Ｃ１２ １，３脂肪ジオール、Ｃ１３ １，３脂肪ジオール、Ｃ１４ １，３脂肪ジオール、Ｃ１５ １，３脂肪ジオール、Ｃ１６ １，３脂肪ジオール、Ｃ１７ １，３脂肪ジオール、Ｃ１８ １，３脂肪ジオール、及びＣ１９ １，３脂肪ジオールが挙げられるが、これらに限定されない。１つの実施形態において、本方法はさらに、発酵ブロスに単純炭素源を加える工程を含む。さらに別の実施形態において、単純炭素源は、再生可能な原料に由来する。
本開示の別の態様は、単純炭素源を含む発酵ブロス中で増殖させた場合に１，３脂肪ジオールを産生させるための組換え微生物を提供し、この微生物は、アシル−ＡＣＰレダクターゼ（ＥＣ１．２．１．８０またはＥＣ１．２．１．４２）活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を発現する。１つの態様において、１，３脂肪ジオールは、インビボで産生される。別の態様において、脂肪ジオールとして、Ｃ５ １，３脂肪ジオール、Ｃ６ １，３脂肪ジオール、Ｃ７ １，３脂肪ジオール、Ｃ８ １，３脂肪ジオール、Ｃ９ １，３脂肪ジオール、Ｃ１０ １，３脂肪ジオール、Ｃ１１ １，３脂肪ジオール、Ｃ１２ １，３脂肪ジオール、Ｃ１３ １，３脂肪ジオール、Ｃ１４ １，３脂肪ジオール、Ｃ１５ １，３脂肪ジオール、Ｃ１６ １，３脂肪ジオール、Ｃ１７ １，３脂肪ジオール、Ｃ１８ １，３脂肪ジオール、及びＣ１９ １，３脂肪ジオールが挙げられるが、これらに限定されない。１つの実施形態において、前記核酸配列は、外因性である。
本開示のさらに別の態様は、単純炭素源を含む発酵ブロス中で増殖させた場合に１，３脂肪ジオールを産生させるための組換え微生物を提供し、この微生物は、アシル−ＡＣＰレダクターゼ（ＥＣ１．２．１．８０またはＥＣ１．２．１．４２）活性及びアルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．−）活性を有するポリペプチドをコードする１種類または複数種類の核酸配列を発現する。１つの態様において、１，３脂肪ジオールは、インビボで産生される。別の態様において、脂肪ジオールとして、Ｃ５ １，３脂肪ジオール、Ｃ６ １，３脂肪ジオール、Ｃ７ １，３脂肪ジオール、Ｃ８ １，３脂肪ジオール、Ｃ９ １，３脂肪ジオール、Ｃ１０ １，３脂肪ジオール、Ｃ１１ １，３脂肪ジオール、Ｃ１２ １，３脂肪ジオール、Ｃ１３ １，３脂肪ジオール、Ｃ１４ １，３脂肪ジオール、Ｃ１５ １，３脂肪ジオール、Ｃ１６ １，３脂肪ジオール、Ｃ１７ １，３脂肪ジオール、Ｃ１８ １，３脂肪ジオール、及びＣ１９ １，３脂肪ジオールが挙げられるが、これらに限定されない。１つの実施形態において、前記１種類または複数種類の核酸配列は、外因性である。
本開示はさらに、単純炭素源を含む発酵ブロス中で増殖させた場合に１，３脂肪ジオールを産生させるための組換え微生物を含む細胞培養物を企図し、この微生物は、アシル−ＡＣＰレダクターゼ（ＥＣ１．２．１．８０またはＥＣ１．２．１．４２）活性及び任意選択でアルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．−）活性を有するポリペプチドをコードする１種類または複数種類の核酸配列を発現するように操作されている。１つの態様において、細胞培養物は、１，３脂肪ジオールを産生する。別の態様において、脂肪ジオールとして、Ｃ５ １，３脂肪ジオール、Ｃ６ １，３脂肪ジオール、Ｃ７ １，３脂肪ジオール、Ｃ８ １，３脂肪ジオール、Ｃ９ １，３脂肪ジオール、Ｃ１０ １，３脂肪ジオール、Ｃ１１ １，３脂肪ジオール、Ｃ１２ １，３脂肪ジオール、Ｃ１３ １，３脂肪ジオール、Ｃ１４ １，３脂肪ジオール、Ｃ１５ １，３脂肪ジオール、Ｃ１６ １，３脂肪ジオール、Ｃ１７ １，３脂肪ジオール、Ｃ１８ １，３脂肪ジオール、及びＣ１９ １，３脂肪ジオールが挙げられるが、これらに限定されない。１つの実施形態において、前記１種類または複数種類の核酸配列は、外因性である。
さらに別の態様において、本開示は、１，３脂肪ジオールの産生方法を提供し、本方法は、発酵ブロス中に組換え微生物を用意する工程であって、この微生物が、アシル−ＡＣＰレダクターゼ（ＥＣ１．２．１．８０またはＥＣ１．２．１．４２）活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を発現するように操作されている、前記工程、ならびに、この発酵ブロスから１，３脂肪ジオールを単離する工程を含む。１つの実施形態において、微生物はさらに、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．−）活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を発現する。別の実施形態において、本方法はさらに、発酵ブロスに単純炭素源を加える工程を含む。さらに別の実施形態において、単純炭素源は、再生可能な原料に由来する。本方法は、Ｃ５ １，３脂肪ジオール、Ｃ６ １，３脂肪ジオール、Ｃ７ １，３脂肪ジオール、Ｃ８ １，３脂肪ジオール、Ｃ９ １，３脂肪ジオール、Ｃ１０ １，３脂肪ジオール、Ｃ１１ １，３脂肪ジオール、Ｃ１２ １，３脂肪ジオール、Ｃ１３ １，３脂肪ジオール、Ｃ１４ １，３脂肪ジオール、Ｃ１５ １，３脂肪ジオール、Ｃ１６ １，３脂肪ジオール、Ｃ１７ １，３脂肪ジオール、Ｃ１８ １，３脂肪ジオール、及びＣ１９ １，３脂肪ジオールを含む脂肪ジオールを産生するが、これらに限定されない。
さらに別の態様において、本開示はさらに、上に説明される組換え微生物（上記参照）のいずれかからの１，３脂肪ジオールの分泌及び回収を包含する。１つの実施形態において、１，３脂肪ジオールは、発酵ブロス中に分泌される。別の実施形態において、１，３脂肪ジオールは、油水分離を介して、例えば、重力沈降、遠心分離、デカンテーションなどを介して回収される。
本開示はさらに、脂肪ジオール組成物を包含する。１つの態様において、該組成物は、１，３−ジオールをはじめとして、１種類または複数種類の脂肪ジオールを含む。
本開示のさらに別の態様は、エトキシレートなどをはじめとする界面活性剤の製造における脂肪ジオールの使用を提供する。
本開示はさらに、キラル１，３脂肪ジオール、それらの鏡像異性体、及びキラル混合物を包含する。さらに企図されるのは、１，３脂肪ジオール、それらの鏡像異性体、及びキラル混合物の組成物である。
[本発明1001]
単純炭素源を含む発酵ブロスで増殖させた場合に1，3脂肪ジオールを産生させるための組換え微生物であって、
（ａ）チオエステラーゼ（ＥＣ3．1．2．−、ＥＣ3．1．1．5、またはＥＣ3．1．2．14）活性；及び
（ｂ）カルボン酸レダクターゼ（ＥＣ6．2．1．3またはＥＣ1．2．1．42）活性
を含むポリペプチドをコードする核酸配列を発現するように操作されている、
前記組換え微生物。
[本発明1002]
前記1，3脂肪ジオールがインビボで産生される、本発明1001の組換え微生物。
[本発明1003]
前記1，3脂肪ジオールが、Ｃ 5 1，3脂肪ジオール、Ｃ 6 1，3脂肪ジオール、Ｃ 7 1，3脂肪ジオール、Ｃ 8 1，3脂肪ジオール、Ｃ 9 1，3脂肪ジオール、Ｃ 10 1，3脂肪ジオール、Ｃ 11 1，3脂肪ジオール、Ｃ 12 1，3脂肪ジオール、Ｃ 13 1，3脂肪ジオール、Ｃ 14 1，3脂肪ジオール、Ｃ 15 1，3脂肪ジオール、Ｃ 16 1，3脂肪ジオール、Ｃ 17 1，3脂肪ジオール、Ｃ 18 1，3脂肪ジオール、及びＣ 19 1，3脂肪ジオールからなる群より選択される、本発明1001の組換え微生物。
[本発明1004]
アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ1．1．1．−）活性を含むポリペプチドをコードする核酸配列をさらに発現する、本発明1001の組換え微生物。
[本発明1005]
前記単純炭素源が、再生可能な原料に由来する、本発明1001の組換え微生物。
[本発明1006]
前記チオエステラーゼが、ｆａｔＢ1、ＴＥ＿ＥＥＩ82564、ＴＥ＿ＣＡＤ63310、及びｐｈａＧからなる群より選択される、本発明1001の組換え微生物。
[本発明1007]
前記カルボン酸レダクターゼが、ｃａｒＢである、本発明1001の組換え微生物。
[本発明1008]
前記アルコールデヒドロゲナーゼが、ａｌｒＡである、本発明1004の組換え微生物。
[本発明1009]
本発明1001から1008のいずれかの微生物を含む、細胞培養物。
[本発明1010]
1，3脂肪ジオールを産生する、本発明1009の細胞培養物。
[本発明1011]
前記1，3脂肪ジオールが、Ｃ 5 1，3脂肪ジオール、Ｃ 6 1，3脂肪ジオール、Ｃ 7 1，3脂肪ジオール、Ｃ 8 1，3脂肪ジオール、Ｃ 9 1，3脂肪ジオール、Ｃ 10 1，3脂肪ジオール、Ｃ 11 1，3脂肪ジオール、Ｃ 12 1，3脂肪ジオール、Ｃ 13 1，3脂肪ジオール、Ｃ 14 1，3脂肪ジオール、Ｃ 15 1，3脂肪ジオール、Ｃ 16 1，3脂肪ジオール、Ｃ 17 1，3脂肪ジオール、Ｃ 18 1，3脂肪ジオール、及びＣ 19 1，3脂肪ジオールからなる群より選択される、本発明1010の細胞培養物。
[本発明1012]
本発明1001の微生物を含む、1，3脂肪ジオールの産生方法。
[本発明1013]
（ａ）発酵ブロス中に組換え微生物を用意する工程であって、前記微生物が、チオエステラーゼ（ＥＣ3．1．2．−、ＥＣ3．1．1．5、またはＥＣ3．1．2．14）活性；カルボン酸レダクターゼ（ＥＣ6．2．1．3またはＥＣ1．2．1．42）活性；及び任意選択でアルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ1．1．1．）活性を含むポリペプチドをコードする核酸配列を発現する、前記工程；ならびに
（ｂ）前記発酵ブロスから1，3脂肪ジオールを単離する工程であって、前記発酵ブロスが単純炭素源を含む、前記工程
を含む、1，3脂肪ジオールの産生方法。
[本発明1014]
前記1，3脂肪ジオールが、Ｃ 5 1，3脂肪ジオール、Ｃ 6 1，3脂肪ジオール、Ｃ 7 1，3脂肪ジオール、Ｃ 8 1，3脂肪ジオール、Ｃ 9 1，3脂肪ジオール、Ｃ 10 1，3脂肪ジオール、Ｃ 11 1，3脂肪ジオール、Ｃ 12 1，3脂肪ジオール、Ｃ 13 1，3脂肪ジオール、Ｃ 14 1，3脂肪ジオール、Ｃ 15 1，3脂肪ジオール、Ｃ 16 1，3脂肪ジオール、Ｃ 17 1，3脂肪ジオール、Ｃ 18 1，3脂肪ジオール、及びＣ 19 1，3脂肪ジオールからなる群より選択される、本発明1013の方法。
[本発明1015]
単純炭素源を含む発酵ブロスで増殖させた場合に1，3脂肪ジオールを産生させるための組換え微生物であって、アシル−ＡＣＰレダクターゼ（ＥＣ1．2．1．80またはＥＣ1．2．1．42）活性を含むポリペプチドをコードする核酸配列を発現するように操作されている、前記組換え微生物。
[本発明1016]
アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ1．1．1．−）活性を含むポリペプチドをコードする核酸配列をさらに発現する、本発明1015の組換え微生物。
[本発明1017]
前記1，3脂肪ジオールがインビボで産生される、本発明1015の組換え微生物。
[本発明1018]
前記1，3脂肪ジオールが、Ｃ 5 1，3脂肪ジオール、Ｃ 6 1，3脂肪ジオール、Ｃ 7 1，3脂肪ジオール、Ｃ 8 1，3脂肪ジオール、Ｃ 9 1，3脂肪ジオール、Ｃ 10 1，3脂肪ジオール、Ｃ 11 1，3脂肪ジオール、Ｃ 12 1，3脂肪ジオール、Ｃ 13 1，3脂肪ジオール、Ｃ 14 1，3脂肪ジオール、Ｃ 15 1，3脂肪ジオール、Ｃ 16 1，3脂肪ジオール、Ｃ 17 1，3脂肪ジオール、Ｃ 18 1，3脂肪ジオール、及びＣ 19 1，3脂肪ジオールからなる群より選択される、本発明1017の組換え微生物。
[本発明1019]
前記1，3脂肪ジオールが、Ｃ 12 1，3脂肪ジオールである、本発明1017の組換え微生物。
[本発明1020]
前記単純炭素源が、再生可能な原料に由来する、本発明1015の組換え微生物。
[本発明1021]
本発明1015から1020のいずれかの微生物を含む、細胞培養物。
[本発明1022]
1，3脂肪ジオールを産生する、本発明1021の細胞培養物。
[本発明1023]
前記1，3脂肪ジオールが、Ｃ 5 1，3脂肪ジオール、Ｃ 6 1，3脂肪ジオール、Ｃ 7 1，3脂肪ジオール、Ｃ 8 1，3脂肪ジオール、Ｃ 9 1，3脂肪ジオール、Ｃ 10 1，3脂肪ジオール、Ｃ 11 1，3脂肪ジオール、Ｃ 12 1，3脂肪ジオール、Ｃ 13 1，3脂肪ジオール、Ｃ 14 1，3脂肪ジオール、Ｃ 15 1，3脂肪ジオール、Ｃ 16 1，3脂肪ジオール、Ｃ 17 1，3脂肪ジオール、Ｃ 18 1，3脂肪ジオール、及びＣ 19 1，3脂肪ジオールからなる群より選択される、本発明1022の細胞培養物。
[本発明1024]
本発明1015の微生物を含む、1，3脂肪ジオールの産生方法。
[本発明1025]
（ａ）発酵ブロス中に組換え微生物を用意する工程であって、前記微生物が、アシル−ＡＣＰレダクターゼ（ＥＣ1．2．1．80またはＥＣ1．2．1．42）活性を含むポリペプチドをコードする核酸配列を発現するように操作されている、前記工程；及び
（ｂ）該発酵ブロスから1，3脂肪ジオールを単離する工程であって、前記発酵ブロスが単純炭素源を含む、前記工程
を含む、1，3脂肪ジオールの産生方法。
[本発明1026]
アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ1．1．1．−）活性を含むポリペプチドをコードする核酸配列をさらに発現する、本発明1025の方法。
[本発明1027]
前記1，3脂肪ジオールが、Ｃ 5 1，3脂肪ジオール、Ｃ 6 1，3脂肪ジオール、Ｃ 7 1，3脂肪ジオール、Ｃ 8 1，3脂肪ジオール、Ｃ 9 1，3脂肪ジオール、Ｃ 10 1，3脂肪ジオール、Ｃ 11 1，3脂肪ジオール、Ｃ 12 1，3脂肪ジオール、Ｃ 13 1，3脂肪ジオール、Ｃ 14 1，3脂肪ジオール、Ｃ 15 1，3脂肪ジオール、Ｃ 16 1，3脂肪ジオール、Ｃ 17 1，3脂肪ジオール、Ｃ 18 1，3脂肪ジオール、及びＣ 19 1，3脂肪ジオールからなる群より選択される、本発明1025の方法。
本開示は、添付の図面と合わせて読むことで、最も良く理解される。図面は、好適な実施形態のいくつかを例示するためのものである。しかし、本開示は、図面に開示される具体的な実施形態に限定されないことが理解される。
１，３−ジオールの作製経路の例を、酵素機能も含めて示す。 １，３−ジオールの作製経路の例を示し、例示の目的で酵素機能の例を提供する。 １，３−ジオールの代替作製経路を、酵素機能も含めて示す。 ＴＥ＿ＥＥＩ８２５６４及びＣａｒＢを発現する組換え大腸菌株からの抽出物のＧＣ／ＭＳクロマトグラフを示す。試料はすべて、ＢＳＴＦＡ＋１％ＴＭＣＳで誘導体化した。ピーク（１）は、誘導体化された１，３−オクタノールであり、ピーク（２）は、誘導体化された１，３−デカノールである。 図４の誘導体化ピーク１及びピーク２の、質量スペクトルを示し、これらは、ＴＥ＿ＥＥＩ８２５６４及びＣａｒＢを発現する組換え大腸菌株に由来するものである。誘導体化剤は、ＢＳＴＦＡ＋１％ＴＭＣＳであった。 ＢＳＴＦＡ＋１％ＴＭＣＳで誘導体化された１，３−デカンジオールのイオンフラグメンテーションパターンを示す。 ＴＥ＿ＣＡＤ６３３１０及びＣａｒＢを発現する組換え大腸菌株により産生された１，３−ジオール（ジオール）及び脂肪アルコール（ＦＡＬＣ）の組成を示す。
以下の略語を、図８〜１１で使用する。
ＦＡＳ：脂肪酸生合成／脂肪酸シンターゼ
ＴＥ：チオエステラーゼ
ＡＣＳ：アシルＣｏＡシンターゼ
ＴＬ：３−ケトアシルＣｏＡチオラーゼ（可逆的）
（Ｓ）３ＨＡＣＳ：（Ｓ）−３−ヒドロキシ−アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ（可逆的）
（Ｓ）２ＥＣＯＨ：（Ｓ）−２−エノイルＣｏＡヒドラターゼ／（Ｓ）−３−ヒドロキシルアシルＣｏＡデヒドラターゼ
ＣＡＲ：カルボン酸レダクターゼ
ＦＡＲ：脂肪アシルＣｏＡ／ＡＣＰレダクターゼ及び脂肪アルコール形成脂肪アシルＣｏＡ／ＡＣＰレダクターゼ
ＡＣＲ：アシルＣｏＡレダクターゼ
ＡＡＲ：アシルＡＣＰ／ＣｏＡレダクターゼ
アシル−ＡＣＰから１，３脂肪ジオールに至る生化学経路を示す。経路１は、ＴＥ、ＣＡＲ、及びＡＤＨなどの酵素機能を使用して、１，３−ジオールを産生させる。経路２は、ＴＥ、ＡＣＳ、ＡＣＲ、及びＡＤＨを使用して、１，３−ジオールを産生させる。経路３は、ＡＡＲ及びＡＤＨを使用して、１，３−ジオールを産生させる。経路４は、ＦＡＲ及びＡＤＨを使用して、１，３−ジオールを産生させる。経路５は、ＦＡＲを使用して、１，３−ジオールを産生させる。 アシル−ＣｏＡから１，３脂肪ジオールに至る生化学経路を示す。経路１は、ＴＥ、ＣＡＲ、及びＡＤＨなどの酵素機能を使用して、１，３−ジオールを産生させる。経路２は、ＡＣＲ及びＡＤＨを使用して、１，３−ジオールを産生させる。経路３は、ＡＡＲ及びＡＤＨを使用して、１，３−ジオールを産生させる。経路４は、ＦＡＲ及びＡＤＨを使用して、１，３−ジオールを産生させる。経路５は、ＦＡＲを使用して、１，３−ジオールを産生させる。 （Ｒ）−１，３脂肪ジオール産生を示す。経路１は、ＴＥ、ＣＡＲ、及びＡＤＨなどの酵素機能を使用して、右手型キラル１，３−ジオールを産生させる。経路２は、ＴＥ、ＡＣＲ、及びＡＤＨを使用して、右手型キラル１，３−ジオールを産生させる。経路３は、ＡＡＲ及びＡＤＨを使用して、右手型キラル１，３−ジオールを産生させる。経路４は、ＦＡＲ及びＡＤＨを使用して、右手型キラル１，３−ジオールを産生させる。経路５は、ＦＡＲを使用して、右手型キラル１，３−ジオールを産生させる。 （Ｓ）−１，３脂肪ジオール産生を示す。経路１は、ＴＥ、ＣＡＲ、及びＡＤＨなどの酵素機能を使用して、左手型キラル１，３−ジオールを産生させる。経路２は、ＡＣＲ及びＡＤＨを使用して、左手型キラル１，３−ジオールを産生させる。経路３は、ＡＡＲ及びＡＤＨを使用して、左手型キラル１，３−ジオールを産生させる。経路４は、ＦＡＲ及びＡＤＨを使用して、左手型キラル１，３−ジオールを産生させる。経路５は、ＦＡＲを使用して、左手型キラル１，３−ジオールを産生させる。経路６は、ＴＥ、ＡＣＳ、ＦａｄＥ、及び（Ｓ）２ＥＣＯＨを使用して、左手型キラル１，３−ジオールを産生させる。経路７は、脂肪酸及びＡＣＳを使用して、左手型キラル１，３−ジオールを産生させる。経路８は、ＴＥ、ＡＣＳ、ＴＬ、及び（Ｓ）３ＨＡＣＳを使用して、左手型キラル１，３−ジオールを産生させる。
詳細な説明
総括
脂肪ジオールを産生するための新規で環境に優しい方法の開発は、産業に向上をもたらす。本方法は、再生可能な原料に由来する単純炭素源から脂肪ジオールを産生することを可能にし、再生可能な原料としては、トウモロコシ、サトウキビ、天然ガス、またはリグノセルロース系バイオマスなどの炭水化物；都市固形廃棄産物、グリセロール、排煙、合成ガス、二酸化炭素などの廃棄産物；あるいは、バイオマス、天然ガス、または他の炭素質材料などの有機材料の改質から生じる炭素流が挙げられるが、これらに限定されない。本方法はさらに、シアノ細菌及び藻類などの光合成生物により、ＣＯ２及び光から脂肪ジオールを産生することを可能にする。この方法は、環境にとってより良いものである。なぜなら、この方法は、石油化学由来のプロセスでは発生する毒性副生成物を産生しないからである。
より詳細には、本開示は、再生可能な原料に由来する単純炭素源を脂肪ジオールに変換するように操作された組換え微生物を提供する。１，３−ジオールは、無色かつ無臭の安定した化学成分である脂肪ジオールの例である。微生物産生された１，３−ジオールは、多数の産業用途があることが期待され、そのような用途として、洗浄剤、界面活性剤、乳化剤、軟化剤、溶媒、プラスチック、香味剤、香料、及び生理活性化合物の構成成分が挙げられる。微生物産生された１，３−ジオールはまた、自然食品の代用物（または添加物）として食品産業にも用途を見出すと思われる。なぜなら、それらは、容易に代謝され、無毒、無揮発性であり、高エネルギーで保存可能期間が長いからである。
本開示の組換え微生物は、脂肪ジオール産生のための発酵プロセスにおいて使用される。本明細書中、本開示は、微生物脂肪酸代謝、及びその中間体の１，３−ジオールへの変換を包含する。本開示の１つの利点は、よりクリーンな産生方法、すなわち単純な発酵プロセスの採用である。再生可能な原料の使用は、環境を保護する。なぜなら、そのような原料は、天然資源を枯渇させない再生可能かつ持続可能な原材料に依存するからである。原料として産業廃棄産物（例えば、グリセロール）を使用することは、より良い廃棄産物管理及びリサイクルを支援する。別の利点は、新たな産業目的となる製品、すなわち、選択的な鎖長、キラリティ、及び特定比の混合物としてまたは誘導体との混合物としての脂肪ジオール組成物を製造するための選択肢になるということである。
定義
本明細書中で使用される場合、「１，３脂肪ジオール」または「１，３−ジオール」または「１，３−ジアルコール」または「３−ＯＨ脂肪アルコール」または「３−ヒドロキシ脂肪アルコール」または「１，３−ジヒドロキシアルコール」または「１，３−脂肪族ジオール」という用語は、本明細書中同義で使用され、少なくとも炭素５個の鎖長を有し、かつ脂肪アシルチオエステル中間体を介して微生物脂肪酸代謝から生じ、かつ少なくとも２つのＯＨ基、すなわち炭素鎖の１位に１つのＯＨ基及び３位に１つのＯＨ基を有する、化学成分を指す。
「１，３−ジオール」は、本明細書中で使用される場合、組換え微生物または組換え微生物宿主細胞により産生される。
「１，３−ジオール組成物」は、典型的には、少なくとも１，３−ジオールを別の成分と一緒に含む。
「酵素分類（ＥＣ）番号」という用語は、特定のポリペプチド配列または酵素を指定する番号を指す。ＥＣ番号は、酵素を、それらが触媒する反応によって分類する。ＥＣ番号は、国際生化学分子生物学連合（ＩＵＢＭＢ）の命名委員会により制定されており、その説明は、ワールドワイドウェブのＩＵＢＭＢ酵素命名ウェブサイトで入手可能である。
「チオエステラーゼ」という用語は、ＥＣ番号３．１．２．１４．またはＥＣ番号３．１．１．５またはＥＣ番号３．１．２．−により特性決定される酵素活性を指す。
「カルボン酸レダクターゼ（ＣＡＲ）」という用語は、ＥＣ番号６．２．１．３またはＥＣ番号１．２．１．４２またはＥＣ番号１．２．９９．６により特性決定される酵素活性を指す。
「アルデヒドレダクターゼ」及び「アルコールデヒドロゲナーゼ」という用語は、本明細書中同義で使用され、ＥＣ番号１．１．−．−により特性決定される酵素活性を指す。
「アシル−ＡＣＰレダクターゼ（ＡＡＲ）」という用語は、ＥＣ番号１．２．１．８０またはＥＣ番号１．２．１．４２により特性決定される酵素活性を指す。
「アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ」という用語は、ＥＣ番号６．４．１．２により特性決定される酵素活性を指す。
「アクセッション番号」及び「ＮＣＢＩアクセッション番号」及び「ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号」という用語は、本明細書中同義で使用され、特定の核酸配列を指定する番号を指す。本説明において記載される配列アクセッション番号は、米国国立衛生研究所により維持されているＮＣＢＩ（国立バイオテクノロジー情報センター）により提供されるデータベースから入手したもの、ならびにスイスバイオインフォマティクス研究所により提供されるＵｎｉＰｒｏｔ Ｋｎｏｗｌｅｄｇｅｂａｓｅ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ）及びＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔデータベースから入手したもの（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号とも称する）である。
本明細書中で使用される場合、「ヌクレオチド」という用語は、複素環塩基、糖、及び１つまたは複数のリン酸基からなるポリヌクレオチドの単量体単位を指す。天然の塩基（グアニン（Ｇ）、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、及びウラシル（Ｕ））は、典型的なプリンまたはピリミジン誘導体であるが、天然及び非天然の塩基類似体もまた含まれることが理解されるべきである。天然の糖は、ペントース（五炭糖）デオキシリボース（ＤＮＡを形成する）またはリボース（ＲＮＡを形成する）であるが、天然及び非天然の糖類似体もまた含まれることが理解されるべきである。核酸は、典型的には、リン酸結合を介して連結することにより、核酸またはポリヌクレオチドを形成するが、他にも多くの連結が当該分野で知られている（例えば、ホスホロチオエート、ボラノリン酸など）。
本明細書中で使用される場合、「ポリヌクレオチド」という用語は、リボヌクレオチド（ＲＮＡ）またはデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）の重合体を指し、この重合体は一本鎖でも二本鎖でも可能であり、非天然または改変されたヌクレオチドを含むことが可能である。「ポリヌクレオチド」、「核酸配列」、及び「ヌクレオチド配列」という用語は、本明細書中同義で使用され、ＲＮＡまたはＤＮＡいずれかである、任意の長さの重合体型ヌクレオチドを指す。これらの用語は、分子の一次構造を指し、したがって、二本鎖及び一本鎖ＤＮＡ、ならびに二本鎖及び一本鎖ＲＮＡを含む。この用語は、等価物として、ヌクレオチド類似体から作られたＲＮＡまたはＤＮＡいずれかの類似体、及び修飾されたポリヌクレオチドを含み、そのような修飾として、メチル化及び／またはキャップ化ポリヌクレオチドなどがあるが、これらに限定されない。ポリヌクレオチドは、任意の形態をしていてよく、そのような形態として、プラスミド、ウイルス性、染色体性、ＥＳＴ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、及びｒＲＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。
「内因性ポリヌクレオチド」及び「内因性ＤＮＡ」及び「内因性核酸配列」という用語は、本明細書中同義で使用され、宿主細胞内に起源を有するＤＮＡを指す。
「外因性ポリヌクレオチド」及び「外因性ＤＮＡ」及び「外因性核酸配列」という用語は、本明細書中同義で使用され、宿主細胞の外部に起源を有するＤＮＡを指す。例えば、宿主細胞Ａからの遺伝子を、宿主細胞Ｂに挿入することが可能である。しかしながら、宿主細胞Ａに起源を有する遺伝子を、操作または修飾し（宿主細胞Ａの内部または外部で）そして同じ宿主細胞Ａに再挿入することができる。
「修飾ポリヌクレオチド」及び「修飾ＤＮＡ」及び「修飾核酸配列」という用語は、本明細書中同義で使用され、何らかの形で本来のまたは自然な状態から改変されたＤＮＡを指す。この改変は、ＤＮＡの安定性、発現、活性、または機能に、あるいはそのＤＮＡがコードする遺伝子産物（例えば、ポリペプチドまたはタンパク質）に影響を及ぼす場合がある。１つの実施形態において、コードされるポリペプチドの発現が増加する。別の実施形態において、コードされるポリペプチドの発現が減少する。別の実施形態において、コードされるポリペプチドが発現しない。
本明細書中で使用される場合、「ポリペプチド」及び「タンパク質」及び「ポリペプチド配列」及び「タンパク質配列」という用語は、本明細書中同義で使用され、アミノ酸残基の重合体を指す。「組換えポリペプチド」という用語は、遺伝子組換え技法により作り出されたポリペプチドを示し、この技法では一般に、発現させるタンパク質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡを、適切な発現ベクターに挿入し、次いでこのベクターを使用して宿主細胞を形質転換して、ポリペプチドを産生させる。
本明細書中で使用される場合、「相同体」及び「相同な」という用語は、対応するポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列に対して少なくとも約５０％同一である配列を含むポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指す。好ましくは、相同ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、対応するアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または少なくとも約９９％の相同性を有するポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を有する。本明細書中で使用される場合、配列「相同性」及び配列「同一性」という用語は、同義で使用される。当業者は、２つ以上の配列間の相同性を決定する方法について十分承知している。手短に述べると、２つの配列間の「相同性」の計算は、以下のとおり行うことができる。配列を、比較の目的に最適なように整列させる（例えば、最適に整列させるため、ギャップを第一及び第二のアミノ酸または核酸配列の一方または両方に導入することができ、比較の目的で非相同配列を無視することができる）。好適な実施形態において、比較の目的で整列させる第一配列の長さは、第二配列の長さの少なくとも約３０％、好ましくは少なくとも約４０％、より好ましくは少なくとも約５０％、さらにより好ましくは少なくとも約６０％、さらにより好ましくは少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％である。次いで、第一配列及び第二配列の対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置でアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第一配列のある位置が、第二配列の対応する位置にあるアミノ酸残基またはヌクレオチドと同じもので占有されていたら、これらの分子は、その位置において同一である。２つの配列間の相同性パーセントは、２つの配列の最適な整列のための導入する必要があったギャップの個数及び各ギャップの長さを考慮に入れた上での、配列が共有する同一位置の個数の関数である。２つの配列間の配列比較及び相同性パーセントの決定は、ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５（３）： ４０３−４１０）などの数学アルゴリズムを使用して達成することができる。２つのアミノ酸配列間の相同性パーセントは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈのアルゴリズムを使用しても決定することができ、このアルゴリズムは、ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラムに組み込まれていて、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２行列またはＰＡＭ２５０行列いずれか、ならびに１６、１４、１２、１０、８、６、もしくは４のギャップ重み及び１、２、３、４、５、もしくは６の長さ重みを使用する（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ， （１９７０） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８：４４４−４５３）。２つのヌクレオチド配列間の相同性パーセントもまた、ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラムを使用して決定することができ、ＮＷＳｇａｐｄｎａを使用する。ＣＭＰ行列ならびに４０、５０、６０、７０、または８０のギャップ重み及び１、２、３、４、５、または６の長さ重み。当業者は、初期相同性計算を行い、それにしたがってアルゴリズムパラメーターを調整することができる。パラメーターの好適な組み合わせ（及び分子が要求される相同性の制限内にあるかどうかを決定するためにどのパラメーターを使用すべきかが計算者にとって不明である場合に使用すべきもの）は、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２スコア行列にギャップペナルティ１２、ギャップ伸長ペナルティ４、及びフレームシフトギャップペナルティ５を組み合わせたものである。配列アラインメントのさらなる方法は、バイオテクノロジー分野で既知である（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ （２００５） ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ６：２７８）；Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ． （２００５） ＦＥＢＳ Ｊ． ２７２（２０）： ５１０１−５１０９を参照）。
「内因性」ポリペプチドは、組換え細胞の操作元であるまたは組換え細胞の起源である宿主細胞（例えば、親微生物細胞）のゲノムによりコードされるポリペプチドを指す。
「外因性」ポリペプチドは、親または宿主微生物細胞（例えば、宿主細胞）のゲノムにより本来コードされたものではないポリペプチドを指す。変異（すなわち、突然変異）ポリペプチドは、外因性ポリペプチドの例である。外因性ポリペプチドの別の例は、生来の細胞中で生じてはいるが、改変された発現、例えば、外因性ポリヌクレオチド（例えば、生来の遺伝子と同一であるが宿主細胞で過剰発現するように操作された遺伝子を含有するベクターまたはプラスミド；そのような遺伝子は、任意選択で、宿主ＤＮＡに挿入されてもよい）の発現の結果であるタンパク質である。
「異種」という用語は、一般に、異なる種に由来する、または異なる生物に由来する、または異なる提供源に由来することを意味する。本明細書中で使用される場合、この用語は、特定の生物中に天然では存在しない、ヌクレオチド配列またはポリペプチド配列を指す。異種発現は、あるタンパク質またはポリペプチドが、そのタンパク質を通常発現しない細胞で発現することを意味する。したがって、異種は、移入されたタンパク質が、レシピエントとは異なる（ｔｈｅｎ）細胞型または異なる種または異なる提供源に元々は由来したということを意味する。例えば、植物細胞とって内因性であるポリヌクレオチド配列を、遺伝子組換え方法により細菌宿主細胞に導入することができ、そうすると、植物ポリヌクレオチドは、組換え細菌宿主細胞における異種ポリヌクレオチドである。異種ポリペプチドの別の例は、生来の細胞中で生じてはいるが、改変された発現、例えば、異種ポリヌクレオチド（例えば、生来の遺伝子と同一であるが宿主細胞で過剰発現するように操作された遺伝子を含有するベクターまたはプラスミド；そのような遺伝子は、任意選択で、宿主ＤＮＡに挿入されてもよい）の発現の結果であるタンパク質である。
本明細書中で使用される場合、ポリペプチドの「断片」という用語は、全長ポリペプチドまたはタンパク質のより短い部分を指し、その大きさの範囲は、アミノ酸残基４個から、全アミノ酸配列からアミノ酸残基１個を差し引いた大きさまでである。本開示のある特定の実施形態において、断片は、ポリペプチドまたはタンパク質のあるドメイン（例えば、基質結合ドメインまたは触媒ドメイン）の全アミノ酸配列を指す。
本明細書中で使用される場合、「変異誘発」という用語は、生物の遺伝情報が安定した様式で変化する過程を指す。核酸配列をコードするタンパク質の変異誘発は、突然変異タンパク質を生み出す。変異誘発はまた、タンパク質活性の変化をもたらす非翻訳領域核酸配列の変化も指す。
本明細書中で使用される場合、「遺伝子」という用語は、ＲＮＡ産物またはタンパク質産物いずれかをコードする核酸配列、ならびに、そのＲＮＡもしくはタンパク質の発現に影響を及ぼす作動可能に連結された核酸配列（例えば、そのような配列として、プロモーター配列またはエンハンサー配列が挙げられるが、これらに限定されない）またはそのＲＮＡもしくはタンパク質の発現に影響を及ぼす配列をコードする作動可能に連結された核酸配列（例えば、そのような配列として、リボソーム結合部位または翻訳制御配列が挙げられるが、これらに限定されない）を指す。
発現制御配列は、当該分野で既知であり、そのような配列として、例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、転写終結因子、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）などが挙げられ、これらは宿主細胞でのポリヌクレオチド配列の発現をもたらす。発現制御配列は、転写に関与する細胞タンパク質と特異的に相互作用する（Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ． （１９８７） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３６：１２３７−１２４５）。発現制御配列の例は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ， Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． １８５， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆ． （１９９０）に記載されている。
「複数」という用語は、数が少なくとも２であることを指す（例えば、複数のポリヌクレオチド配列は、少なくとも２つのポリヌクレオチド配列を意味する）。
本開示の方法において、発現制御配列は、ポリヌクレオチド配列と作動可能に連結されている。「作動可能に連結された」という用語は、適切な分子（例えば、転写活性化タンパク質）が発現制御配列に結合した時に遺伝子発現が可能になるような様式で、ポリヌクレオチド配列と発現制御配列が接続されていることを意味する。作動可能に連結されたプロモーターは、転写及び翻訳の方向に関して、選択されたポリヌクレオチド配列の上流に位置する。作動可能に連結されたエンハンサーは、選択されたポリヌクレオチドの上流、内部、または下流に位置することができる。
本明細書中で使用される場合、「ベクター」という用語は、それに連結された別の核酸、すなわちポリヌクレオチド配列を輸送することができる核酸分子を指す。有用なベクターの一種は、エピソーム（すなわち、染色体外での複製が可能な核酸）である。有用なベクターとは、それらに連結された核酸の自律複製及び／または発現を可能にするものである。作動可能に連結された遺伝子の発現を導くことができるベクターを、本明細書中、「発現ベクター」と称する。一般に、組換えＤＮＡ技法において有用な発現ベクターは、「プラスミド」の形態にあることが多く、プラスミドは、一般に、そのベクター形態において染色体と結合していない環状二本鎖ＤＮＡループを指す。プラスミドはベクターの最も一般的に用いられる形態であることから、「プラスミド」及び「ベクター」という用語は、本明細書中同義に使用される。しかしながら、同等の機能を果たす他の形態の発現ベクター、及び当技術分野において今後既知となる他の形態の発現ベクターも同じく含まれる。いくつかの実施形態において、組換えベクターは、ポリヌクレオチド配列と作動可能に連結されたプロモーターをさらに含む。いくつかの実施形態において、プロモーターは、発生段階により調節されるプロモーター、オルガネラ特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、または細胞特異的プロモーターである。組換えベクターは、典型的には、（ａ）ポリヌクレオチド配列と作動可能に連結した発現制御配列；（ｂ）ポリヌクレオチド配列と作動可能に連結した選択マーカー；（ｃ）ポリヌクレオチド配列と作動可能に連結したマーカー配列；（ｄ）ポリヌクレオチド配列と作動可能に連結した精製部分；（ｅ）ポリヌクレオチド配列と作動可能に連結した分泌配列；及び（ｆ）ポリヌクレオチド配列と作動可能に連結したターゲティング配列、を含む少なくとも１つの配列を含む。ある特定の実施形態において、ヌクレオチド配列は宿主細胞のゲノムＤＮＡに安定的に組み込まれており、ヌクレオチド配列の発現は、調節されたプロモーター領域の制御下にある。本明細書中に記載される発現ベクターは、本明細書中に記載されるポリヌクレオチド配列を、宿主細胞でのポリヌクレオチド配列の発現に適した形態で含む。発現ベクターの設計は、形質転換させようとする宿主細胞の選択、所望のポリペプチドの発現レベルなどの要因に依存し得ることが当業者には理解される。本明細書中に記載される発現ベクターは、宿主細胞に導入されることにより、本明細書中に記載されるとおりのポリヌクレオチド配列によってコードされる、融合ポリペプチドを含むポリペプチドを産生することができる。原核生物、例えば大腸菌における、ポリペプチドをコードする遺伝子の発現は、融合または非融合ポリペプチドいずれかの発現を導く構成的または誘導性プロモーターを含有するベクターを用いて行われることが最も多い。融合ベクターは、その中にコードされているポリペプチドに、通常は組換えポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端に、いくつかのアミノ酸を付加する。そのような融合ベクターは、典型的には、以下の３つの目的の１つまたは複数に役立つ：（１）組換えポリペプチドの発現を増大させること；（２）組換えポリペプチドの溶解性を高めること；及び（３）アフィニティー精製におけるリガンドとして作用することにより、組換えポリペプチドの精製を助けること。多くの場合、融合発現ベクターでは、融合部分と組換えポリペプチドの接続部にタンパク質分解切断部位が導入されている。これにより、融合ポリペプチドの精製後に、融合部分から組換えポリペプチドを分離することができる。ある特定の実施形態において、本開示のポリヌクレオチド配列は、バクテリオファージＴ５由来のプロモーターと作動可能に連結されている。ある特定の実施形態において、宿主細胞は酵母菌細胞であり、発現ベクターは酵母菌発現ベクターである。酵母菌Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）での発現用ベクターの例として、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉ ｅｔ ａｌ． （１９８７） ＥＭＢＯ Ｊ． ６：２２９−２３４）、ｐＭＦａ（Ｋｕｒｊａｎ ｅｔ ａｌ． （１９８２） Ｃｅｌｌ ３０： ９３３−９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚ ｅｔ ａｌ． （１９８７） Ｇｅｎｅ ５４： １１３−１２３）、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、及びｐｉｃＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）が挙げられる。他の実施形態において、宿主細胞は昆虫細胞であり、発現ベクターはバキュロウイルス発現ベクターである。培養昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）でのタンパク質の発現用に利用可能なバキュロウイルスベクターとして、例えば、ｐＡｃ系列（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ． （１９８３） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ３：２１５６−２１６５）及びｐＶＬ系列（Ｌｕｃｋｌｏｗ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７０：３１−３９）が挙げられる。さらに別の実施形態において、本明細書中に記載されるポリヌクレオチド配列を、哺乳類発現ベクターを用いて哺乳類細胞で発現させることもできる。原核細胞及び真核細胞両方について他にも適切な発現系が当該分野において周知である；例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， ‘‘Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，’’ ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， （１９８９）を参照。
本明細書中で使用される場合、「アシル−ＣｏＡ」は、アルキル鎖のカルボニル炭素と補酵素Ａ（ＣｏＡ）の４’−ホスホパンテチオニル部分のスルフヒドリル基との間に形成されるアシルチオエステルを指し、このエステルは、式Ｒ−Ｃ（Ｏ）Ｓ−ＣｏＡを有し、式中、Ｒは、少なくとも４個の炭素原子を有する任意のアルキル基である。
本明細書中で使用される場合、「アシル−ＡＣＰ」は、アルキル鎖のカルボニル炭素とアシルキャリアータンパク質（ＡＣＰ）のホスホパンテテイニル部分のスルフヒドリル基との間で形成されるアシルチオエステルを指す。ホスホパンテテイニル部分は、基質として補酵素Ａを使用するホスホパンテテイニルトランスフェラーゼの１種であるホロ−アシルキャリアータンパク質シンターゼ（ＡＣＰＳ）及びホスホパンテテイニルドナーの作用により、ＡＣＰ上の保存されたセリン残基に、翻訳後に連結される。いくつかの実施形態において、アシル−ＡＣＰは、完全飽和アシル−ＡＣＰの合成における中間体である。他の実施形態において、アシル−ＡＣＰは不飽和アシル−ＡＣＰの合成における中間体である。いくつかの実施形態において、炭素鎖は約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または２６個の炭素を有する。これらのアシル−ＡＣＰはそれぞれ、それらを脂肪酸誘導体に変換する酵素の基質である。当業者には明らかなように、ホロＡＣＰの４’−ホスホパンテチオニル部分は、補酵素Ａに由来する。すなわち、基質としてアシルＡＣＰを利用する酵素は、アシルＣｏＡに対する活性を何かしら有することが多く、基質としてアシルＣｏＡを利用する酵素は、アシルＡＣＰの活性を何かしら有する。
本明細書中で使用される場合、「脂肪酸生合成経路」という用語は、脂肪酸、脂肪酸チオエステル、及び／またはそれらの誘導体を産生する生合成経路を意味する。脂肪酸生合成経路は、所望の特性を有する脂肪酸誘導体を産生させるために、本明細書中で考察されるものとは別の酵素活性を持つ追加の酵素またはポリペプチドを含んでもよい。
本明細書中で使用される場合、「クローン」という用語は、典型的には、単一の共通の祖先の子孫でありかつこの祖先と本質的に遺伝的に同一である、細胞または細胞群、例えば、単一の細菌細胞から生じたクローン化された細菌コロニーの細菌を指す。
本明細書中で使用される場合、「培養物」という用語は、典型的には、生細胞を含む液体培地を示す。１つの実施形態において、培養物は、制御された条件下、所定の培地中で繁殖する細胞を含み、例えば、選択された炭素源及び窒素を含む液体培地中で増殖させた組換え宿主細胞の培養物である。「培養する」または「培養」は、適切な条件下、液体培地または固体培地中で、組換え宿主細胞の集団を増殖させることを指す。特定の実施形態において、培養することは、基質から最終産物への発酵性の生物変換を指す。培養培地は周知であり、そのような培地の個々の構成成分は、例えば、Ｄｉｆｃｏ（商標）及びＢＢＬ（商標）の商標で、販売元から入手可能である。１つの非制限例において、水性栄養培地は、窒素、塩、及び炭素の複合的な供給源を含む「富栄養培地」であり、例えば、そのような培地としてＹＰ培地は、培地あたり１０ｇ／Ｌのペプトン及び１０ｇ／Ｌの酵母エキスを含む。培養物の宿主細胞は、米国特許第５，０００，０００号；同第５，０２８，５３９号；同第５，４２４，２０２号；同第５，４８２，８４６号；同第５，６０２，０３０号；ＷＯ２０１０１２７３１８に記載される方法に従って、炭素を効率的に吸収し、かつセルロース系材料を炭素源として利用するようにさらに遺伝子操作することができる。また、いくつかの実施形態において、スクロースを炭素源として利用できるように、インベルターゼを発現するように宿主細胞を遺伝子操作する。
本明細書中で使用される場合、「遺伝子操作されたポリヌクレオチド配列を発現するのに有効な条件下」という用語は、所望の脂肪酸誘導体、例えば脂肪ジオールを産生させる目的で、宿主細胞が該当する酵素機能を発現することを可能にする任意の条件を意味する。適した条件には、例えば、発酵条件が含まれる。
「組換え微生物」という用語は、宿主細胞内のある特定の酵素活性が、親細胞または天然宿主細胞と比べて改変、追加、及び／または削除されているように、遺伝子修飾または操作された宿主細胞を示す。遺伝子修飾または遺伝子操作された宿主細胞は、組換え微生物の例である。したがって、組換え宿主細胞での、例えば酵素など、「タンパク質の活性の変化したまたは改変されたレベル」は、同じ変化の存在しない親または天然宿主細胞との比較から決定される、活性における１つまたは複数の特性の差異を指す。典型的には、活性の差異は、変化した活性を持つ組換え宿主細胞と、変化した活性を持たない対応する野生型宿主細胞との間で決定される（例えば、組換え宿主細胞の培養物と対応する野生型宿主細胞との比較）。改変された活性は、例えば、組換え宿主細胞によって発現されるタンパク質の変化した量（例えば、タンパク質をコードするＤＮＡ配列の増加もしくは減少したコピー数、タンパク質をコードするｍＲＮＡ転写物の増加もしくは減少した数、及び／またはｍＲＮＡからタンパク質へのタンパク質翻訳の増加したもしくは減少した量の結果として）；タンパク質の構造の変化（例えば、一次構造に対する変化、例えば、基質特異性の変化、観察される動力学パラメーターの変化をもたらすタンパク質コード配列に対する変化など）；ならびに、タンパク質安定性の変化（例えば、タンパク質分解の増加もしくは減少）の結果であることが可能である。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、本明細書中に記載されるポリペプチドのいずれかの突然変異体または変異体である。ある特定の場合、本明細書中に記載されるポリペプチドのコード配列は、特定の宿主細胞での発現にコドン最適化されている。例えば、大腸菌での発現のために、１つまたは複数のコドンを、最適化することができる（例えば、Ｇｒｏｓｊｅａｎ ｅｔ ａｌ． （１９８２） Ｇｅｎｅ １８：１９９−２０９に記載のとおり）。１つの実施形態において、組換え微生物は、脂肪酸誘導体（例えば、脂肪酸、脂肪アルデヒド、脂肪アルコール、脂肪ジオール）などの所望の産物を産生する。１つの特定の実施形態において、組換え微生物は、１，３−ジオールを産生する。
「制御配列」という用語は、本明細書中で使用される場合、典型的には、タンパク質をコードするＤＮＡ配列と作動可能に連結された、そのタンパク質の発現を最終的に制御するＤＮＡの塩基の配列を指す。制御配列の例として、ＲＮＡプロモーター配列、転写因子結合配列、転写終結配列、転写のモジュレーター（エンハンサーエレメントなど）、ＲＮＡ安定性に影響を及ぼすヌクレオチド配列、及び翻訳制御配列（例えば、リボソーム結合部位（例えば、原核生物におけるＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列、または真核生物におけるＫｏｚａｋ配列）、開始コドン、終止コドンなど）が挙げられるが、これらに限定されない。
「改変されたレベルの発現」及び「変化したレベルの発現」という用語は、同義で使用され、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、代謝産物、または産物（例えば、脂肪酸誘導体）が、遺伝子操作された宿主細胞において、同じ条件下での対応する野生型細胞におけるその濃度と比較して異なる濃度で存在することを意味する。脂肪酸誘導体の例には、脂肪酸、３−ヒドロキシ脂肪酸、脂肪アルデヒド、３−ヒドロキシ脂肪アルデヒド、脂肪アルコール、１，３脂肪ジオールなどがある。
本明細書中で使用される場合、「力価」という用語は、宿主細胞培養物単位体積あたりの、産生される脂肪酸誘導体、例えば、脂肪ジオール（例えば、１，３−ジオール）などの量を指し、一般に、質量／体積単位、例えば、１０ｇ／Ｌで記載される。１つの実施形態において、力価は、所定の組換え宿主細胞培養物により産生される特定１，３−ジオールを指す場合もあり１，３−ジオールの組み合わせを指す場合もある。別の実施形態において、力価はまた、所定の組換え宿主細胞培養物により産生される脂肪ジオール組成物（例えば、１，３−ジオール組成物）を指し得る。
本明細書中で使用される場合、「宿主細胞により産生される脂肪ジオール（例えば、１，３−ジオール）の収率」は、宿主細胞において投入炭素源が産物（例えば、脂肪ジオール）に変換される効率を指し、「質量収率」の場合は、質量（産物）／質量（炭素源）単位のパーセントで記載される。例えば、３０％質量収率は、炭素源１００ｇから産物３０ｇが産生されることを示し；２０％質量収率は、炭素源１００ｇから産物２０ｇが産生されることを示し；１０％質量収率は、炭素源１００ｇから産物１０ｇが産生されることを示すといった具合である。収率は、所定の組換え宿主細胞培養物により産生される特定１，３−ジオールを指す場合もあり１，３−ジオールの組み合わせを指す場合もある。
本明細書中で使用される場合、「産生能」という用語は、宿主細胞培養物の単位体積あたりで単位時間あたりに産生される脂肪ジオール（例えば、１，３−ジオール）または誘導体の量を指す（例えば、ｇ／Ｌ／時間で記載される）。産生能は、所定の組換え宿主細胞培養物により産生される特定１，３−ジオールを指す場合もあり１，３−ジオールの組み合わせを指す場合もある。
本明細書中で使用される場合、「グルコース利用率」という用語は、培養物により単位時間あたりに使用されるグルコースの量を指し、グラム数／リットル／時（ｇ／Ｌ／時間）で記載される。
「原料」とは、製品の製造に使用される、または工業工程用の、原材料である。「再生可能な原料」とは、生物材料、例えば、植物体などの再生可能な材料に由来する原材料であって、天然の手段（例えば、トウモロコシ、サトウキビ、リグノセルロース系バイオマス）または廃棄物、例えば、都市固形廃棄物、グリセロール、遊離脂肪酸、排煙、もしくは合成ガス；二酸化炭素などを通じて交換可能なものである。比較として、「再生不可能な原料」とは、使用により枯渇し（例えば、原油、石炭、核燃料など）、再生することができない原材料である。
本明細書中で使用される場合、「単純炭素源」という用語は、原核細胞または単純な真核細胞の増殖用食物源として用いるのに適した基質または化合物を指す。単純炭素源として適格な供給源は様々な形態のものが可能であり、そのような形態として、重合体、炭水化物、酸、アルコール、アルデヒド、ケトン、アミノ酸、ペプチド、及び気体（例えば、ＣＯ及びＣＯ２）などが挙げられるが、これらに限定されない。単純炭素源の例として、単糖類、例えば、グルコース、フルクトース、マンノース、ガラクトース、キシロース、及びアラビノースなど；オリゴ糖類、例えば、フルクトオリゴ糖及びガラクトオリゴ糖など；多糖類、例えば、デンプン、セルロース、ペクチン、及びキシランなど；二糖類、例えば、スクロース、マルトース、セロビオース、及びツラノースなど；セルロース系材料及び変形物、例えば、ヘミセルロース、メチルセルロース、及びカルボキシメチルセルロースナトリウムなど；飽和または不飽和脂肪酸、コハク酸化合物、乳酸化合物、及び酢酸化合物；アルコール、例えば、エタノール、メタノール、及びプロパノール；グリセロールなど、またはそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。１つの実施形態において、単純炭素源は、トウモロコシ、サトウキビ、ソルガム、ビート、スイッチグラス（ｓｗｉｔｃｈ ｇｒａｓｓ）、貯蔵牧草、麦わら、木材、パルプ、下水、生ごみ、セルロース系都市廃棄産物、排煙、合成ガス、または二酸化炭素に由来するものである。単純炭素源はまた、グルコースなどの光合成産物であることも可能である。１つの実施形態において、単純炭素源は、再生可能な原料に由来する。１つの特定の実施形態において、単純炭素源は、再生可能な原料、例えば、トウモロコシ、サトウキビ、またはリグノセルロース系バイオマスなどの炭水化物；あるいは、廃棄産物、例えば、グリセロール、脂肪酸、排煙、または合成ガスなど；あるいは、有機材料、例えば、バイオマスなど；あるいは、光合成で固定された二酸化炭素に由来する。別の実施形態において、単純炭素源は、グルコース、フルクトース、マンノース、ガラクトース、キシロース、アラビノース、フルクトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、デンプン、セルロース、ペクチン、キシラン、スクロース、マルトース、セロビオース、ツラノース、ヘミセルロース、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、コハク酸化合物、乳酸化合物、酢酸化合物、エタノール、メタノール、グリセロール、及びそれらの混合物から選択される。ある特定の実施形態において、単純炭素源は、バイオマスに由来する。バイオマス源の例は、植物体または草木、例えば、トウモロコシ、サトウキビ、またはスイッチグラスなどである。バイオマス源の別の例は、代謝廃棄産物、例えば、動物性物質（例えば、牛糞肥料）などである。バイオマス源のさらなる例として、藻類及び他の海洋植物が挙げられる。バイオマスとして、また、産業、農業、林業、及び家庭からの廃棄産物が挙げられ、そのような廃棄産物として、発酵廃棄産物、貯蔵牧草、麦わら、木材、下水、生ごみ、セルロース系都市廃棄産物、及び残飯が挙げられるが、これらに限定されない。「バイオマス」という用語はまた、炭水化物（例えば、単糖類、二糖類または多糖類）などの炭素源も示す。
本明細書中で使用される場合、産物（１，３−ジオールまたは誘導体など）に関する「単離された」という用語は、細胞構成成分、細胞培養培地、または化学前駆体もしくは合成前駆体から分離された産物を指す。本明細書中に記載される方法により産生される脂肪酸（例えば、１，３−ジオール）及び関連組成物は、発酵ブロス中、ならびに細胞質中で比較的不混和性である可能性がある。したがって、脂肪ジオール組成物は、細胞内または細胞外いずれかで有機相に収集することができる。１つの実施形態において、１，３−ジオール組成物は、細胞外で収集する。
本明細書中で使用される場合、「精製する」、「精製された」、または「精製」という用語は、例えば単離または分離により、分子をその環境から取り出すまたは単離することを意味する。「実質的に精製された」分子は、それらに付随する他の構成成分を少なくとも約６０％含まない（例えば、少なくとも約７０％含まない、少なくとも約７５％含まない、少なくとも約８５％含まない、少なくとも約９０％含まない、少なくとも約９５％含まない、少なくとも約９７％含まない、少なくとも約９９％含まない）。本明細書中で使用される場合、これらの用語はまた、試料からの混入物の除去も示す。例えば、混入物の除去は、試料中の脂肪ジオールのパーセンテージの上昇をもたらすことができる。例えば、１，３−ジオールが組換え宿主細胞において産生される場合、１，３−ジオールは、宿主細胞タンパク質の除去によって精製することができる。精製後の試料中の１，３−ジオールのパーセンテージは上昇する。「精製する」、「精製された」、及び「精製」という用語は、完全に純粋であることを必要としない相対的な用語である。したがって、例えば、１，３−ジオールが組換え宿主細胞において産生される場合、精製された１，３−ジオールとは、他の細胞構成成分（例えば、核酸、ポリペプチド、脂質、炭水化物、または他の炭化水素）から実質的に分離された１，３−ジオールである。
「インビボで脂肪ジオール（例えば、１，３−ジオール）を産生する」という用語は、明細書及び特許請求の範囲の目的で使用される場合、生きた及び／または組換え及び／または遺伝子修飾された宿主細胞において、単純炭素源から脂肪ジオールを産生させることを意味し、宿主細胞が、発酵中に単純炭素源を取り込んで代謝できるように、単純炭素源が発酵ブロスに加えられる。１つの実施形態において、単純炭素源は、再生可能な原料に由来する。
スクリーニングのための宿主細胞株の操作
脂肪酸生合成は、細菌の生合成機構の中で最も保存されている系の１つである。脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳ）多酵素複合体は、全ての細菌及び真核生物に存在する。ＦＡＳ関連遺伝子の大部分が、細胞の増殖及び生存に必要とされる。真核生物及び細菌のＦＡＳは、本質的に同じ型の生化学変換を駆動する。真核生物では、ＦＡＳは、ＦＡＳＩと称され、その触媒ドメインの大部分は、１本のポリペプチド鎖によりコードされる（分離不可能）。細菌などの原核生物では、ＦＡＳは、ＦＡＳＩＩと称され、その個々の酵素及びキャリアータンパク質は、別々の（分離可能な）タンパク質をコードする別々の遺伝子によりコードされる。
アシルキャリアータンパク質（ＡＣＰ）は、ＦＡＳ経路において、酵素と一緒になって、天然生物で産生される脂肪酸の長さ、飽和度、及び分岐を制御する。この経路のステップは、脂肪酸生合成（ＦＡＢ）及びアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）遺伝子ファミリーの酵素により触媒される。例えば、操作されたＦＡＳ経路に含まれる可能性がある酵素として、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（例えば、ＡｃｃＡＢＣＤ、マロニル−ＣｏＡ：ＡＣＰトランスアシラーゼ（例えば、ＦａｂＤ）、３−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩＩ（例えば、ＦａｂＨ）、３−ケトアシル−ＡＣＰレダクターゼ（例えば、ＦａｂＧ）、３−ヒドロキシアシル−ＡＣＰデヒドラターゼ／イソメラーゼ（例えば、ＦａｂＡ）、３−ヒドロキシアシル−ＡＣＰデヒドラターゼ（例えば、ＦａｂＺ）、ｔｒａｎｓ−２−エノイル−ＡＣＰレダクターゼ（例えば、ＦａｂＩまたはｆａｂＬまたはｆａｂＫ）、ｔｒａｎｓ−２−エノイル−ＡＣＰイソメラーゼ（例えば、ＦａｂＭ）、３−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩ（例えば、ＦａｂＢ）、及び３−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩ（例えば、ＦａｂＦ）が挙げられる。所望の産物によって、これらの遺伝子の１種類または複数種類を、減弱するまたは過剰発現させることができる。したがって、宿主細胞は、単純炭素源の供給により脂肪酸誘導体（例えば、脂肪ジオール、脂肪アルコール）、ならびに脂肪酸誘導体中間体（例えば、脂肪アルデヒド）の産生を増加させるように操作されており、この単純炭素源は、再生可能な原料に由来するものであり得る。本明細書中、主要な目的は、細菌株を変換して脂肪ジオール産生の微生物工場とするために、脂肪ジオールなどの脂肪酸誘導体の産生を調節する重要な制御酵素の活性を向上させることである。１つの実施形態において、細菌株は、１，３−ジオールなどの脂肪ジオールを産生する。別の実施形態において、細菌株は、１，３−ジオールなどの脂肪ジオールを、脂肪アルコールと一緒に産生する。別の実施形態において、細菌株は、特定のケトアシル−ＡＣＰレダクターゼ活性が向上し、及び／または３−ヒドロキシアシル−ＡＣＰデヒドラターゼ活性が低下して、これにより１，３脂肪ジオール産生の増加がもたらされるように、さらに改変される。
宿主細胞は、脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）、脂肪酸エチルエステル（ＦＡＥＥ）、及び脂肪アルコール（ＦＡＬＣ）をはじめとする他の脂肪酸誘導体を増加させるようにあらかじめ操作されている（例えば、米国特許第８，２８３，１４３号を参照。これは、本明細書中、参照として援用される）。当業者には理解されるように、脂肪酸合成は、アシルＡＣＰ非依存性脂肪酸生合成を利用したアシルＣｏＡの伸長を通じても起こすことができる。該当する脂肪酸生合成反応、縮合、還元、脱水、還元などを担当するＦＡＳ酵素もまた、脂肪酸誘導体の産生用基質として使用可能なアシルチオエステルの合成に使用することができ、脂肪酸誘導体として、脂肪酸、脂肪アルデヒド、脂肪アルコール、及び１，３脂肪ジオールをはじめとするそれらの３−ヒドロキシ誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。当業者に知られているように、脂肪酸の酸化を担当する生化学反応（β酸化サイクル）は、逆に機能して、脂肪酸チオエステルの合成を支援することができる。これらのアシルチオエステルは、脂肪酸誘導体の産生用基質として使用可能であり、そのような脂肪酸誘導体として、脂肪酸、脂肪アルデヒド、脂肪アルコール、及び１，３脂肪ジオールをはじめとするそれらの３−ヒドロキシ誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、生物によっては、脂肪酸生合成を、ＡＣＰなしで、例えば、アシルＣｏＡの合成を通じて起こすことができる（例えば、米国特許出願公開第２０１４／００５１１３６（Ａ１）号；米国特許出願公開第２０１４／０２７３１１４（Ａ１）号；及びＤｅｌｌｏｍｏｎａｃｏ ｅｔ ａｌ． （２０１１） Ｎａｔｕｒｅ ４７６（７３６０）：３５５−９を参照）。１つの態様において、これらの多様に異なるＦＡＳ系の構成成分は、同一細胞内で同時発現されて、協調的に働いて脂肪アシルチオエステル及び誘導体を産生することができ、そのような脂肪アシルチオエステル及び誘導体として、脂肪酸、脂肪アルデヒド、脂肪アルコール、及び１，３脂肪ジオールをはじめとするそれらの３−ヒドロキシ誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。
キラル分子
分子は、それが互いに重ね合せることのできない鏡像である立体異性体（すなわち、鏡像異性体）として存在可能である場合に、キラルであると言われる。これは、関連性がある。なぜなら、特定分子に対する生物の反応は、その分子が生物の受容体分子の特定部位にどのように一致するかに依存する場合が多いからである。キラルアルコール及びジオールをはじめとするキラル分子は、特定の化合物、例えば、医薬品、栄養補助食品、及び他の活性化合物などの合成の基本単位である。医薬品及び栄養補助食品用途では、どちらの鏡像異性体が活性なものであり、意図する受容体に一致するのかを知る必要がある。
化合物を純粋な活性異性体として得る１つの方法は、微生物などの生物を採用することにより化学物質を産生させることである。なぜなら、生物での生体分子産生は、立体特異的であるからである（すなわち、これにより特定の立体異性体が得られる）。例えば、アミノ酸、ビタミン、及びホルモンは、酵母菌により、糖の発酵中に自然に産生され、酵母菌から収穫することができる。キラル触媒としての酵素の性質は、当業者に認識されており、高光学純度の薬物に対する需要の高まりが、精密化学合成の目的で、酵素への関心を高めてきた。生物でキラル分子を産生させるのとは対照的に、化学手順によりキラル分子を作る場合、鏡像異性体混合物（すなわち、ラセミ混合物）が得られる。
鏡像異性体分析の現在の方法として、旋光分析、核磁気共鳴、同位体希釈、熱量測定、及び酵素技法などの、非クロマトフラフィー技法が挙げられる。これらの技法は、純粋な試料を必要とし、鏡像異性体の分離は含まれていない。鏡像異性体の定量（これは純粋な試料を必要としない）及び分離は、キラルカラムを使用するキラルクロマトグラフィー、例えばガスクロマトグラフィー（ＧＣ）または高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などにより、同時に行うことができる（Ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ， Ｅｒｎｅｓｔ Ｌ． Ｅｌｉｌ ／ Ｓａｎｕｅｌ Ｈ． Ｗｉｌｅｎ， １９９４， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．を参照）。生体触媒を使用してキラル化合物を作ることが可能であり、生成物のキラル純度は、キラルクロマトグラフィー方法、例えばキラルＨＰＬＣまたはＬＣ／ＭＳなどを用いて特定することができる（米国特許出願公開第２００８／０２４８５３９（Ａ１）号及び同第２０１３／００５２６９９（Ａ１）号を参照）。
３−ヒドロキシ脂肪酸誘導体のキラリティ
３−ヒドロキシ脂肪酸誘導体（例えば、３−ヒドロキシ脂肪酸、３−ヒドロキシ脂肪エステル、３−ヒドロキシ脂肪アルデヒド、３−ヒドロキシ脂肪アルコールなど）の独特の態様として、各分子がキラルであるということがある。３−ヒドロキシ官能基は、立体中心であり、各化合物にキラル中心を与える。キラリティは、分子の用途を規定する上で有用な分子特質となり得るもので、そのような特質として、重合体性能、生体活性、医薬効力などが挙げられるが、これらに限定されない。３−ヒドロキシ脂肪酸誘導体の立体異性体は、その異性体を産生する脂肪酸生合成（ＦＡＳ）の選択性に依存する。どのＦＡＳ酵素が３−ヒドロキシ脂肪酸誘導体合成を担当するかを操作することにより、得られる３−ヒドロキシ脂肪誘導体のキラリティを制御することができる。例えば、１，３脂肪ジオール生合成に天然大腸菌ＦＡＳを利用すると、（Ｒ）−１，３脂肪ジオールが産生されると思われるが、そのキラル中心は、（Ｒ）−３−ヒドロキシルアシルＡＣＰ−形成３−ケトアシル−ＡＣＰレダクターゼの活性により作りだされ、大腸菌のＦａｂＧ（他の微生物では相同体）により触媒される。（Ｒ）−３−ヒドロキシルアシルＡＣＰは、図１０の経路１〜５に示すもの（これらに限定されない）をはじめとするアルコール生合成ポリペプチドの基質であり、経路１〜５はそれを（Ｒ）−１，３脂肪ジオールに変換する。さらに、（Ｓ）−３−ヒドロキシアシルＣｏＡは、β酸化経路を通じた脂肪酸分解の中間体である。遊離脂肪酸は、アシル−ＣｏＡシンターゼによりアシル−ＣｏＡに変換され、これは大腸菌のＦａｄＤ及び他の微生物の相同体により触媒される；アシル−ＣｏＡは、脂肪アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼにより酸化されてｔｒａｎｓ−２−エノイル−ＣｏＡになり、これは大腸菌のＦａｄＥ及び他の微生物の相同体により触媒される；次いで、ｔｒａｎｓ−２−エノイル−ＣｏＡは、２−ｔｒａｎｓ−エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ／（Ｓ）−３−ヒドロキシ−アシル−ＣｏＡデヒドラターゼにより水和されて（Ｓ）−３−ヒドロキシ−アシル−ＣｏＡになり、これは大腸菌のＦａｄＢ及び他の微生物の相同体により触媒される；次いで、（Ｓ）−３−ヒドロキシ−アシル−ＣｏＡは、３−ケト−アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼによりさらに酸化されて３−ケト−アシル−ＣｏＡになり、これも大腸菌のＦａｄＢ及び他の微生物の相同体により触媒される；最後に、３−ケト−アシル−ＣｏＡは、３−ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼによりチオール化されてアシル−ＣｏＡ及びアセチル−ＣｏＡになり、これは大腸菌のＦａｄＡ及び他の微生物の相同体により触媒される。β酸化の（Ｓ）−３−ヒドロキシ−アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ活性が、例えば、大腸菌ＦａｄＢ（または異なる微生物におけるもしくはその微生物からの機能相同体）のヒスチジン４５０の突然変異により、選択的に破壊された株は、遊離脂肪酸を提供された場合に、（Ｓ）−３−ヒドロキシ−アシルＣｏＡを蓄積することとなる（図１１の経路６及び７）。ヒスチジン４５０は、大腸菌由来の脂肪酸酸化の多酵素複合体の巨大α−サブユニットに会合したＬ−３−ヒドロキシアシル補酵素Ａデヒドロゲナーゼの触媒残基である（Ｈｅ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５（２９）：９６２５−９６３０を参照）。次いで、（Ｓ）−３−ヒドロキシ−アシルＣｏＡは、図１１の経路１〜５に記載されるものなどの脂肪アルコール形成ポリペプチドの作用を通じて、（Ｓ）−１，３−脂肪ジオールに変換され得る。遊離脂肪酸は、外部から細胞に提供することも可能であるし（図１１の経路７）、あるいは細胞内で、例えば、チオエステラーゼによるアシルＡＣＰの加水分解により生成させることも可能である（図１１の経路６）。１つの実施形態において、上記反応のアシルＣｏＡ中間体は、３−ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼにより伸長して、３−ケトアシル−ＣｏＡになり（図１１の経路８）、これは大腸菌のＦａｄＡ及び他の微生物の相同体により触媒される；次いで、３−ケトアシル−ＣｏＡを、ヒドラターゼ／デヒドラターゼ活性が選択的に破壊された（例えば、大腸菌ＦａｄＢのＧｌｕ１１９（または関連酵素のその相同体）の変異により）ＦａｄＢの突然変異体により還元する。これにより、（Ｓ）−３−ヒドロキシルアシル−ＣｏＡの蓄積がもたらされることとなり、次いで、これを、図１１の経路１〜５に記載されるものなどの脂肪ジオール形成ポリペプチドにより変換して、（Ｓ）−１，３脂肪ジオールにすることができる。巨大アルファ−サブユニットのグルタミン酸−１１９は、大腸菌由来の脂肪酸酸化の多酵素複合体により触媒される２−ｔｒａｎｓ−エノイル−補酵素Ａの水和における触媒基部である（Ｈｅ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３６（３６）：１１０４４−１１０４９を参照）。巨大アルファ−サブユニットのグルタミン酸１３９は、Ｄ−及びＬ−３−ヒドロキシアシル−補酵素Ａ両方の脱水における触媒基部であるが、大腸菌由来の脂肪酸酸化の多酵素複合体により触媒されるデルタ３、デルタ２−エノイル−補酵素Ａの異性化では、触媒基部ではない（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４（１９）：６４４１−６４４７を参照）。別の実施形態において、上記反応のアシルＣｏＡ中間体は、３−ケトアシルＣｏＡチオラーゼにより伸長されて３−ケトアシルＣｏＡになるが、これは大腸菌のＦａｄＡ及び他の微生物の相同体により触媒される。次いで、３−ケトアシルＣｏＡは、（Ｓ）−３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（例えば、ＥＣ１．１．１．３５由来）により還元される（図１１経路８）。これにより、（Ｓ）−３ヒドロキシルアシルＣｏＡの蓄積がもたらされることとなり、次いで、（Ｓ）−３ヒドロキシルアシルＣｏＡを、図１１の経路１〜５に記載されるものなどの脂肪ジオール形成ポリペプチドにより変換して、（Ｓ）−１，３脂肪ジオールにすることができる。
ある特定の酵素機能を発現するように宿主細胞を操作する目的で（以下の表１を参照）、宿主細胞に遺伝子修飾を行うことができる。いくつかの実施形態において、組換えベクターという方法で、宿主細胞にポリヌクレオチド（または遺伝子）配列を提供する。組換えベクターは、ポリヌクレオチド配列と作動可能に連結したプロモーターを含む。ある特定の実施形態において、プロモーターは、発生段階により調節されるプロモーター、オルガネラ特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、または細胞特異的プロモーターである。いくつかの実施形態において、組換えベクターは、ポリヌクレオチド配列と作動可能に連結した発現制御配列；ポリヌクレオチド配列と作動可能に連結した選択マーカー；ポリヌクレオチド配列と作動可能に連結したマーカー配列；ポリヌクレオチド配列と作動可能に連結した精製部分；ポリヌクレオチド配列と作動可能に連結した分泌配列；及びポリヌクレオチド配列と作動可能に連結したターゲティング配列、から選択される少なくとも１つの配列を含む。本明細書中に記載される発現ベクターは、ポリヌクレオチド配列を、宿主細胞でのポリヌクレオチド配列の発現に適した形態で含む。発現ベクターの設計は、形質転換させようとする宿主細胞の選択、所望のポリペプチドの発現レベルなどの要因に依存し得ることが当業者により理解される。本明細書中に記載される発現ベクターは、宿主細胞に導入されることにより、上記のとおりのポリヌクレオチド配列（上記参照）によりコードされる、融合ポリペプチドを含むポリペプチドを産生することができる。原核生物、例えば大腸菌における、ポリペプチドをコードする遺伝子の発現は、融合または非融合ポリペプチドいずれかの発現を導く構成的または誘導性プロモーターを含有するベクターを用いて行われることが最も多い。融合ベクターは、その中にコードされているポリペプチドに、通常は組換えポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端に、いくつかのアミノ酸を付加する。そのような融合ベクターは、典型的には、以下の３つの目的の１つまたは複数に役立つ：組換えポリペプチドの発現を増大させること；組換えポリペプチドの溶解性を高めること；及びアフィニティー精製におけるリガンドとして作用することにより、組換えポリペプチドの精製を助けること。多くの場合、融合発現ベクターでは、融合部分と組換えポリペプチドとの接続部にタンパク質分解切断部位が導入されている。これにより、融合ポリペプチドの精製後に、融合部分から組換えポリペプチドを分離することができる。そのような酵素、及びそれらの同族認識配列の例として、第Ｘａ因子、トロンビン、及びエンテロキナーゼが挙げられる。融合発現ベクターの例として、ｐＧＥＸベクター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．；Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｇｅｎｅ ６７：３１−４０）、ｐＭＡＬベクター（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）、及びｐＲＩＴＳベクター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）が挙げられ、これらは、標的組換えポリペプチドに対して、それぞれ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、またはタンパク質Ａを融合させる。
誘導性非融合大腸菌発現ベクターの例として、ｐＴｒｃベクター（Ａｍａｎｎ ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｇｅｎｅ ６９：３０１−３１５）及びｐＥＴ １１ｄベクター（Ｓｔｕｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆ． （１９９０） ６０−８９）が挙げられる。ｐＴｒｃベクターからの標的遺伝子発現は、ハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃ融合プロモーターからの宿主ＲＮＡポリメラーゼ転写に依存する。ｐＥＴ １１ｄベクターからの標的遺伝子発現は、同時発現したウイルスＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７ ｇｎ１）が介在するＴ７ ｇｎ１０−ｌａｃ融合プロモーターからの転写に依存する。このウイルスポリメラーゼは、ＢＬ２１（ＤＥ３）またはＨＭＳ１７４（ＤＥ３）などの宿主株により、ｌａｃＵＶ５プロモーターの転写制御下にあるＴ７ ｇｎ１遺伝子を保有する常在性λプロファージから供給される。原核生物細胞及び真核生物細胞の両方に適した発現系は、当該分野で周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙを参照）。誘導性非融合大腸菌発現ベクターの例として、ｐＴｒｃベクター（Ａｍａｎｎ ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｇｅｎｅ ６９：３０１−３１５）及びｐＥＴ １１ｄベクター（Ｓｔｕｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆ． （１９９０） ６０−８９）が挙げられる。ある特定の実施形態において、本開示のポリヌクレオチド配列は、バクテリオファージＴ５に由来するプロモーターと作動可能に連結している。１つの実施形態において、宿主細胞は、酵母菌細胞である。この実施形態において、発現ベクターは、酵母菌発現ベクターである。ベクターは、外来性核酸（例えば、ＤＮＡ）を宿主細胞に導入するための、当該分野で認知された種々の技法を介して原核生物細胞または真核生物細胞に導入することができる。宿主細胞を形質転換または形質移入するのに適した方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（上記参照）に見いだすことができる。細菌細胞の安定的な形質転換に関しては、（用いる発現ベクター及び形質転換技法に応じて）、発現ベクターを取り込んで複製する細胞の割合はわずかに過ぎないことが知られている。これらの形質転換体を特定及び選択する目的で、選択マーカー（例えば、抗生物質耐性）をコードする遺伝子を、関心対象の遺伝子とともに宿主細胞に導入することができる。選択マーカーとして、アンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール、またはテトラサイクリンなど、これらに限定されないがこうした薬物に対する耐性を付与するものが挙げられる。選択マーカーをコードする核酸は、本明細書中に記載されるポリペプチドをコードするベクターと同一ベクター上で宿主細胞中に導入することもできるし、別個のベクター上で導入することもできる。導入された核酸によって安定的に形質転換された細胞は、適切な選択薬の存在下での増殖により特定することができる。本明細書中に記載される操作されたまたは組換え宿主細胞は、脂肪ジオール組成物などの脂肪酸誘導体組成物を産生させるのに用いられる細胞である。本明細書中に記載される本開示の態様のいずれにおいても、宿主細胞は、真核植物、細菌、藻類、シアノバクテリア、緑色硫黄細菌、緑色非硫黄細菌、紅色硫黄細菌、紅色非硫黄細菌、好極限性細菌、酵母、真菌、それらを操作した生物、または合成生物から選択することができる。いくつかの実施形態において、宿主細胞は光依存性であるかまたは炭素を固定する。いくつかの実施形態において、宿主細胞は独立栄養活性を有する。本明細書中に記載されるとおり、様々な宿主細胞を用いて脂肪ジオールを産生させることができる。
本開示の宿主細胞または微生物には、特定の酵素活性の効率を試験する目的で、改変を有するように遺伝子操作することができるまたは修飾することができる宿主株または宿主細胞が含まれる。様々な任意選択の遺伝子操作及び改変を、元来の宿主細胞にどの天然酵素経路が存在するかに応じて、宿主細胞ごとに相互交換可能に用いることができる。宿主株は、特定の可変項目を試験する目的でいくつかの遺伝子改変を包含してもよく、そのような可変項目として、発酵成分、炭素源（例えば、原料）、温度、圧、培養物混入低減条件、及び酸素レベルを含む培養条件が挙げられるが、これらに限定されない。
１つの実施形態において、宿主株は、任意選択で、脂肪酸β酸化及び／またはファージ結合部位に関与する１種類または複数種類の酵素の減弱または欠失を包含する。これらの遺伝子修飾は、脂肪酸の細胞内分解を減少させるように、またはバクテリオファージに対する耐性を増強させるように設計される。１つの実施形態において、宿主株は、大腸菌であり、遺伝子修飾は、ｆａｄＥ及び／またはｆｈｕＡの減弱または欠失である。アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（大腸菌のＦａｄＥ）は、脂肪酸を代謝するのに重要な酵素である。この酵素は、脂肪酸分解（β酸化）の第二段階を触媒し、この段階は、脂肪酸チオエステル（アシル−ＣｏＡ）を代謝してアセチル−ＣｏＡ分子及びＮＡＤ（Ｐ）Ｈにするプロセスである。より詳細には、細菌における脂肪酸分解のβ酸化サイクルの第二ステップは、アシル−ＣｏＡから２−エノイル−ＣｏＡへの酸化であり、この酸化はＦａｄＥにより触媒される。大腸菌または他の細菌において、ＦａｄＥまたは脂肪アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼが欠失しているまたは減弱している場合、それらの菌は、炭素源として脂肪酸で増殖することがあまりまたは全くできない。どのような鎖長の脂肪酸であっても利用できないことは、報告されているｆａｄＥ株表現型、すなわち、ＦａｄＥ機能が破壊されたｆａｄＥ突然変異株と一致する。ｆａｄＥ遺伝子は、任意選択でノックアウトまたは減弱することができ、そうすることで脂肪酸誘導体経路での中間体となる可能性があるアシル−ＣｏＡを確実に細胞中に蓄積させて、アシル−ＣｏＡが全て効率的に脂肪酸誘導体へと変換され得るようにすることができる。しかしながら、ｆａｄＥ減弱は、制限のない条件下で炭素源として糖を使用する場合には、任意選択であってよい。なぜなら、そのような条件下では、ＦａｄＥの発現は抑制される場合があり、したがってＦａｄＥは、少量でしか存在いない可能性があり、アシル−ＣｏＡ基質に関してエステルシンターゼまたは他の酵素と効率的に競合することができないからである。これらの状況下では、ＦａｄＥは、異化代謝産物抑制により抑制されていると見なすことができると思われる。大腸菌及び他の多くの微生物は、脂肪酸よりも糖を優先的に消費し、そのため、両方の炭素源が利用可能な場合、ｆａｄレギュロンの抑制の結果として、糖が最初に消費されることとなると予想される（Ｄ． Ｃｌａｒｋ， Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． （１９８１） １４８（２）：５２１−６を参照）。さらに、糖が存在せず脂肪酸が存在することで、ＦａｄＥ発現が誘導される。アシル−ＣｏＡ中間体は、β酸化経路で失われる可能性がある。なぜなら、ｆａｄレギュロン（ＦａｄＥを含む）により発現されるタンパク質は、上方制御されることとなり、アシル−ＣｏＡに関して効率的に競合することとなるからである。したがって、ノックアウトされたまたは減弱されたｆａｄＥ遺伝子を持つことは有益となる可能性がある。炭素源は、糖質の場合があるため、任意選択でＦａｄＥを減弱させる。
例えば、大腸菌では、ｆａｄＥ遺伝子（アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼをコードする）またはｆａｄＤ遺伝子（アシル−ＣｏＡシンセターゼをコードする）のいずれかを欠失させることができる。そのような株は、脂肪酸を分解することができないか、またはほとんどできず、したがって、細胞内に利用可能な脂肪酸を増加させる。そうすると、そのような脂肪酸は、脂肪酸誘導体などの産物への変換に、より多く利用することができるようになる。脂肪酸はまた、他の脂肪酸分解酵素、例えばｆａｄＡまたはｆａｄＢなどを欠失させることによっても利用可能になる。これらの遺伝子のいずれかの欠失は任意選択であり、遊離脂肪酸が、外部から補給されるまたは産物への経路の中間体である場合に実施することができる。表１（以下）は、代謝経路内の酵素活性の包括的な一覧を提示し、この表には、宿主株での脂肪酸の利用可能度を増大させるために減弱可能な様々な脂肪酸分解酵素が含まれる。
大腸菌では、遺伝子ｆｈｕＡは、大腸菌外膜のエネルギー共役型輸送体かつ受容体であるＴｏｎＡタンパク質をコードする（Ｖ． Ｂｒａｕｎ （２００９） Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １９１（１１）：３４３１−３４３６）。ｆｈｕＡの欠失は、任意選択である。ｆｈｕＡ欠失により、細胞はファージの攻撃に対する耐性をより高めることができる。ファージの攻撃は、商業用発酵では有害であり得る。したがって、発酵実行中に可能性のある汚染の対象となりそうな宿主細胞においてｆｈｕＡを欠失させることは望ましい場合がある。同様に、他の生物の相同タンパク質ならびにファージ結合部位は、ファージ耐性を改善するための欠失の候補となる可能性がある。
別の実施形態において、宿主株（上記参照）はまた、ｆａｄＲ、ｆａｂＡ、ｆａｂＤ、ｆａｂＧ、ｆａｂＨ、ｆａｂＶ、及び／またはｆａｂＦを含む遺伝子の１種類または複数種類の過剰発現を任意選択で包含する。そのような遺伝子の例としては、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のｆａｄＲ、サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）のｆａｂＡ（ＮＰ＿４６００４１）、サルモネラ・チフィムリウムのｆａｂＤ（ＮＰ＿４６０１６４）、サルモネラ・チフィムリウムのｆａｂＧ（ＮＰ＿４６０１６５）、サルモネラ・チフィムリウムのｆａｂＨ（ＮＰ＿４６０１６３）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａ）のｆａｂＶ（ＹＰ＿００１２１７２８３）、及びクロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）のｆａｂＦがある（ＮＰ＿３５０１５６）。脂肪酸生合成の酵素及び調節因子をコードするこれらの遺伝子の１種類または複数種類の過剰発現は、様々な培養条件下で、脂肪アルデヒドをはじめとする脂肪酸誘導体中間体ならびに脂肪ジオールなどの最終産物の力価を上昇させるのに役立つ可能性がある。
１つの実施形態において、大腸菌株は、脂肪ジオール産生用の宿主細胞として使用される。これらの宿主細胞は、様々な培養条件下で、脂肪酸誘導体中間体（例えば、脂肪アルデヒド）及び最終産物（例えば、脂肪ジオール、脂肪アルコール）などの脂肪酸誘導体化合物の力価をさらに増大または向上させることができる生合成遺伝子（すなわち、脂肪酸生合成の酵素及び調節因子をコードする遺伝子）の１種類または複数種類の過剰発現を任意選択で含むことができ、そのような遺伝子として、ｆａｄＲ、ｆａｂＡ、ｆａｂＤ、ｆａｂＧ、ｆａｂＨ、ｆａｂＶ、及び／またはｆａｂＦが挙げられるが、これらに限定されない。遺伝子改変の例として、大腸菌のｆａｄＲ、サルモネラ・チフィムリウムのｆａｂＡ（ＮＰ＿４６００４１）、サルモネラ・チフィムリウムのｆａｂＤ（ＮＰ＿４６０１６４）、サルモネラ・チフィムリウムのｆａｂＧ（ＮＰ＿４６０１６５）、サルモネラ・チフィムリウムのｆａｂＨ（ＮＰ＿４６０１６３）、コレラ菌のｆａｂＶ（ＹＰ＿００１２１７２８３）、及びクロストリジウム・アセトブチリカムのｆａｂＦ（ＮＰ＿３５０１５６）が挙げられる。いくつかの実施形態において、様々な培養条件下で脂肪酸誘導体中間体過剰発現を試験する、及び／または脂肪ジオール産生をさらに向上させる目的で、これらの生合成遺伝子を保有する合成オペロンを操作して、細胞中で発現させることができる。そうした合成オペロンは、１種類または複数種類の生合成遺伝子を含有する。例えば、ｉｆａｂ１３８オペロンは、特定の培養条件を試験する目的で、脂肪酸誘導体及び中間体の過剰発現を促進するのに使用可能な、コレラ菌のｆａｂＶ、サルモネラ・チフィムリウムのｆａｂＨ、Ｓ．チフィムリウムのｆａｂＤ、Ｓ．チフィムリウムのｆａｂＧ、Ｓ．チフィムリウムのｆａｂＡ、及び／またはクロストリジウム・アセトブチリカムのｆａｂＦを含む、任意選択の脂肪酸生合成遺伝子を含有する操作されたオペロンである。そのような合成オペロンの１つの利点は、それらを含有する細胞において、脂肪酸誘導体（例えば、脂肪酸、脂肪アルデヒド、脂肪アルコール、脂肪ジオールなど）産生の速度をさらに上昇または向上させることができるということである。
いくつかの実施形態において、アシルチオエステル（アシル−ＣｏＡまたはアシル−ＡＣＰなど）及び生合成酵素（例えば、ＴＥ、ＣＡＲ、ＡＲ、ＡＤＨ、ＡＣＣ、ＡＡＲ、ＦＡＲ、ＡＣＲ；図１〜３ならびに図８〜１１を参照）を産生させるのに使用される宿主細胞または微生物は、脂肪酸、３−ヒドロキシ脂肪酸、脂肪アルコール、１，３脂肪ジオール、脂肪アルデヒド、３−ヒドロキシ脂肪アルデヒドなどの１種類または複数種類の特定の脂肪酸誘導体の産生を増加させることができるある特定の酵素活性を包含する遺伝子をさらに発現する。１つの実施形態において、宿主細胞は、脂肪酸及び３−ヒドロキシ脂肪酸の産生のため、チオエステラーゼ（ＴＥ）活性（ＥＣ３．１．２．−またはＥＣ３．１．２．１４またはＥＣ３．１．１．５）を有するが、この産生は遺伝子の過剰発現により増加させることができる。別の実施形態において、宿主細胞は、脂肪アルデヒド及び／または３−ヒドロキシ脂肪アルデヒドの産生のため、チオエステラーゼ（ＴＥ）活性（ＥＣ３．１．２．−またはＥＣ３．１．２．１４またはＥＣ３．１．１．５）及びカルボン酸レダクターゼ（ＣＡＲ）（ＥＣ６．２．１．３またはＥＣ１．２．１．４２またはＥＣ１．２．９９．６）活性を有する。別の実施形態において、宿主細胞は、脂肪アルコール及び／または脂肪ジオールの産生のため、チオエステラーゼ（ＴＥ）活性（ＥＣ３．１．２．−またはＥＣ３．１．２．１４またはＥＣ３．１．１．５）及びカルボン酸レダクターゼ（ＣＡＲ）活性（ＥＣ６．２．１．３またはＥＣ１．２．１．４２またはＥＣ１．２．９９．６）及びアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）／アルデヒドレダクターゼ（ＡＲ）活性（ＥＣ１．１．１．−）を有する。別の実施形態において、宿主細胞は、脂肪アルデヒド及び／または３−ヒドロキシ−脂肪アルデヒドの産生のため、アシル−ＡＣＰレダクターゼ（ＡＡＲ）活性（ＥＣ１．２．１．８０またはＥＣ１．２．１．４２）を有する。別の実施形態において、宿主細胞は、脂肪アルコール及び／または脂肪ジオールの産生のため、アシル−ＡＣＰレダクターゼ（ＡＡＲ）活性（ＥＣ１．２．１．８０またはＥＣ１．２．１．４２）及びアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）／アルデヒドレダクターゼ（ＡＲ）活性（ＥＣ１．１．１．−）を有する。遺伝子の組み合わせは、微生物を適宜操作することにより、過剰発現または過少発現させることができる。１つの実施形態において、１種類または複数種類の過剰発現した遺伝子は内因性である。別の実施形態において、１種類または複数種類の過剰発現した遺伝子は外因性である。
代替実施形態において、宿主細胞は、脂肪アルコールの産生のため、アシル−ＡＣＰレダクターゼ（ＡＡＲ）活性（ＥＣ１．２．１．８０またはＥＣ１．２．１．４２）及び／またはアシルＡＣＰ／アシルＣｏＡレダクターゼ（ＡＡＲ／ＡＣＲ）活性（ＥＣ１．２．１．８０またはＥＣ１．２．１．４２またはＥＣ１．２．１．５０）及び／またはアルコールデヒドロゲナーゼ活性（Ｅ．Ｃ．１．１．−．−．）及び／または脂肪アルコール形成アシル−ＣｏＡ／アシルＡＣＰレダクターゼ（ＦＡＲ）活性（ＥＣ１．１．１．−）及び／またはカルボン酸レダクターゼ（ＣＡＲ）活性（ＥＣ６．２．１．３またはＥＣ１．２．１．４２またはＥＣ１．２．９９．６）及び／またはチオエステラーゼ（ＴＥ）活性（ＥＣ３．１．２．−またはＥＣ３．１．２．１４またはＥＣ３．１．１．５）を有する。他の代替実施形態において、宿主細胞は、脂肪アルコールの産生のため、アシル−ＣｏＡレダクターゼ活性（ＥＣ１．２．１．５０）及びアシル−ＣｏＡシンターゼ（ＦａｄＤ）活性（ＥＣ２．３．１．８６）及びチオエステラーゼ（ＴＥ）活性（ＥＣ３．１．２．−またはＥＣ３．１．２．１４またはＥＣ３．１．１．５）を有する。微生物及び微生物細胞におけるこれら代替酵素活性の発現は、米国特許第８，０９７，４３９号；同第８，１１０，０９３号；同第８，１１０，６７０号；同第８，１８３，０２８号；同第８，２６８，５９９号；同第８，２８３，１４３号；同第８，２３２，９２４号；同第８，３７２，６１０号；及び同第８，５３０，２２１号に教示されており、これらの特許は本明細書中参照として援用される。他の実施形態において、アシル−ＡＣＰ及び／またはアシル−ＣｏＡ及び他の生合成酵素を産生させるのに使用される宿主細胞または微生物は、脂肪アルデヒド及び／または脂肪アルコール及び／または脂肪ジオールなどの１種類または複数種類の特定脂肪酸誘導体を産生させる目的で、上方制御されるまたは過剰発現されるある特定の天然酵素活性を含む。１つの実施形態において、宿主細胞は、チオエステラーゼ遺伝子を過剰発現させることにより増加させることができる脂肪酸の産生のため、天然チオエステラーゼ（ＴＥ）活性を有する。
本開示は、生合成酵素（上記参照）をコードする遺伝子を発現する宿主株または微生物を含む。組換え宿主細胞は、脂肪アルデヒドなどの脂肪酸誘導体中間体及び脂肪アルコール及び／または脂肪ジオールなどの脂肪酸誘導体最終産物、ならびにそれらの組成物及びブレンドを産生する。脂肪酸誘導体最終産物は、典型的には、培養培地から回収される、及び／または宿主細胞から単離される。１つの実施形態において、脂肪ジオール及び／または脂肪アルコールは、培養培地（細胞外）から回収される。別の実施形態において、脂肪ジオール及び／または脂肪アルコールは、宿主細胞（細胞内）から単離される。別の実施形態において、脂肪ジオール及び／または脂肪アルコールは、培養培地から回収されるとともに宿主細胞から単離される。別の実施形態において、脂肪ジオール及び／または脂肪アルコールは、細胞外にあって、宿主細胞と会合しており、宿主細胞から単離される。宿主細胞により産生された脂肪ジオール組成物は、特定の脂肪ジオールの分布、ならびに脂肪ジオール組成物の構成成分の鎖長及び飽和度を求める目的で、当該分野で既知の方法、例えば、ＧＣ−ＦＩＤを用いて分析することができる。
微生物として機能する宿主細胞（例えば、微生物細胞）の例として、エシェリヒア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、ニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、フサリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、フミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、リゾムコール属（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ）、ミセリオフトラ属（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｏｒａ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ファネロケーテ属（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）、プレウロツス属（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ）、トラメテス属（Ｔｒａｍｅｔｅｓ）、シネココッカス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、シネコシスティス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、クリソスポリウム属（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ステノトロホモナス属（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈａｍｏｎａｓ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、またはストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、グラム陽性細菌細胞である。他の実施形態において、宿主細胞は、グラム陰性細菌細胞である。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、大腸菌細胞である。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、大腸菌Ｂ細胞、大腸菌Ｃ細胞、大腸菌Ｋ細胞、または大腸菌Ｗ細胞である。他の実施形態において、宿主細胞は、バチルス・レンタス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓ）細胞、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）細胞、バチルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）細胞、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｏｆｏｒｍｉｓ）細胞、バチルス・アルカロフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）細胞、バチルス・コアギュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）細胞、バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）細胞、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｉｓ）細胞、バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）細胞、バチルス・クラウジイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｌａｕｓｉｉ）細胞、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）細胞、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞、またはバチルス・アミロリクエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）細胞である。さらに他の実施形態において、宿主細胞は、トリコデルマ・コニンギイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｋｏｎｉｎｇｉｉ）細胞、トリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ）細胞、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）細胞、トリコデルマ・ロンギブラキアタム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）細胞、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）細胞、アスペルギルス・フミガータス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｅｓ）細胞、アスペルギルス・フォエチダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｏｅｔｉｄｕｓ）細胞、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）細胞、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）細胞、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）細胞、フミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）細胞、フミコラ・ラヌギノサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｅ）細胞、ロドコッカス・オパカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｏｐａｃｕｓ）細胞、リゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）細胞、またはムコール・ミエヘイ（Ｍｕｃｏｒ ｍｉｃｈｅｉ）細胞である。さらに他の実施形態において、宿主細胞は、ストレプトミセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）細胞またはストレプトミセス・ムリナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍｕｒｉｎｕｓ）細胞である。さらに他の実施形態において、宿主細胞は放線菌細胞である。いくつかの実施形態において、宿主細胞はサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞である。他の実施形態において、宿主細胞は、真核植物、藻類、シアノバクテリア、緑色硫黄細菌、緑色非硫黄細菌、紅色硫黄細菌、紅色非硫黄細菌、好極限性細菌、酵母菌、真菌、それらを操作した生物、または合成生物に由来する細胞である。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、光依存性であるかまたは炭素を固定する。いくつかの実施形態において、宿主細胞は独立栄養活性を有する。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、光の存在下などにおいて光独立栄養活性を有する。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、光の不在下において従属栄養性または混合栄養性である。ある特定の実施形態において、宿主細胞は、アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）、パニカム・ヴィルガタム（Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍ）、ミスカンサス・ギガンテウス（Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ ｇｉｇａｎｔｅｕｓ）、ゼア・マイズ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）、ボツリオコッカス・ブラウニー（Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓｅ ｂｒａｕｎｉｉ）、クラミドモナス・レインハルディ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）、ドナリエラ・サリナ（Ｄｕｎａｌｉｅｌａ ｓａｌｉｎａ）、シネココッカス属種ＰＣＣ７００２、シネココッカス属種ＰＣＣ７９４２、シネコシスティス属種ＰＣＣ６８０３、サーモシネココッカス・エロンガタス（Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｅｓ）ＢＰ−１、クロロビウム・テピダム（Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ ｔｅｐｉｄｕｍ）、クロロフレクサス・オーランティアカス（Ｃｈｌｏｒｏｊｌｅｘｕｓ ａｕｒａｎｔｉｃｕｓ）、クロマチウム・ビノサム（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍｍ ｖｉｎｏｓｕｍ）、ロドスピリラム・ラブラム（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍ）、ロドバクター・カプスラタス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）、ロドシュードモナス・パルストリス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｕｓｒｉｓ）、クロストリジウム・リュングダリイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ）、クロストリジウム・サーモセラム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）、ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、サッカロミセス・セレビシエ、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、シュードモナス・フルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）、またはザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）に由来する細胞である。１つの特定の実施形態において、微生物細胞は、シアノバクテリアに由来するものであり、シアノバクテリアとして、プロクロロコッカス属（Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ）、シネココッカス属、シネコシスティス属、シアノセイス属（Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ）、及びノストック・パンクチフォルメ（Ｎｏｓｔｏｃ ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ）が挙げられるが、これらに限定されない。別の実施形態において、微生物細胞は、特定のシアノバクテリア種に由来するものであり、そのような種として、シネココッカス・エロンガタス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｕｓ）ＰＣＣ７９４２、シネコシスティス属種ＰＣＣ６８０３、及びシネココッカス属種ＰＣＣ７００１が挙げられるが、これらに限定されない。
１，３−ジオールを産生するように操作された組換え宿主細胞
本開示は、脂肪ジオール（例えば、１，３−ジオール）などの所望の化合物の産生のため酵素経路を変化させる目的で、酵素機能を持つポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを特定する。これらのポリペプチドは、本明細書中、酵素アクセッション番号（ＥＣ番号、以下の表１を参照）により特定され、脂肪ジオールの産生を導く脂肪酸経路を操作するのに有用である。より詳細には、図１〜３及び８〜１１は、１，３−ジオールを産生するように操作された経路を示す。図に示すとおり、アシル中間体を保有する３’ヒドロキシアシルキャリアータンパク質（ＡＣＰ）（アシル−ＡＣＰまたは３−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ）は、中間体に３’ヒドロキシ脂肪酸（３’ＯＨＦＡ）及び３’ヒドロキシ脂肪アルデヒド（３’ＯＨ脂肪アルデヒド）を採用することで、１，３−ジオールへと変換することができる。１つの実施形態において、操作された経路は、図１〜３及び８〜１１に示されるものであり、１，３−ジオールを産生する。本明細書中、グルコースなどの単純炭素源は、微生物（例えば、エシェリヒア属、バチルス属、ラクトバチルス属、ロドコッカス属、シネココッカス属、シネコシスティス属、シュードモナス属、アスペルギルス属、トリコデルマ属、ニューロスポラ属、フサリウム属、フミコラ属、リゾムコール属、クルイベロミセス属、ピキア属、ムコール属、ミセリオフトラ属、ペニシリウム属、ファネロケーテ属、プレウロツス属、トラメテス属、クリソスポリウム属、サッカロミセス属、ステノトロホモナス属、シゾサッカロミセス属、ヤロウィア属、またはストレプトミセス属）により、最初に、３’ヒドロキシアシル−ＡＣＰへと変換される。いくつかの実施形態において、普遍的かつ高度に保存されたアシル−ＡＣＰまたは３’ヒドロキシアシル−ＡＣＰが、微生物の天然経路により産生される。１つの実施形態において、３’ヒドロキシアシル−ＡＣＰを使用して、操作された経路を開始させることができる。例えば、３’ヒドロキシアシル−ＡＣＰは、チオエステラーゼ（ＴＥ）活性を有する酵素（以下の表２を参照）により、３’ＯＨ ＦＡなどの中間体へと変換することができる。次いで、中間体３’ＯＨ ＦＡは、カルボン酸レダクターゼ（ＣＡＲ）活性を有する酵素（以下の表３を参照）により、３’ＯＨアルデヒドなどの別の中間体へと変換することができる。次いで、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）またはアルデヒドレダクターゼ（ＡＲ）活性を有する酵素（以下の表４を参照）が、３’ＯＨアルデヒドを１，３−ジオールへと変換することができる。そのような経路をさらに図示する目的で、図２は、チオエステラーゼ活性（例えば、ｆａｔＢ１、ｔｅｓＡ、ｐｈａＧ）；ＣＡＲ活性（例えば、ｃａｒＢ）；及びＡＤＨ／ＡＲ活性（例えば、ａｌｒＡ）を有する特定の酵素の例を提示する。３’ＯＨアシル−ＡＣＰを３’ＯＨ ＦＡへと変換する反応を行うことができるチオエステラーゼ（ＴＥ）酵素のさらなる例を、表２に示す。１つの実施形態において、これらのチオエステラーゼをコードする遺伝子は、ｔｅｓＡ、ｔｅｓＢ、ｆａｔＢ、ｆａｔＢ１、ｆａｔＢ２、ｆａｔＢ３、ＴＥ＿ＥＥＩ８２５６４、ＴＥ＿ＣＡＤ６３３１０、及びｐｈａＧである。別の実施形態において、これらのチオエステラーゼをコードする遺伝子は、ＴＥ＿ＥＥＩ８２５６４及び／またはＴＥ＿ＣＡＤ６３３１０であるが、これらは、以前は、３’ＯＨアシル−ＡＣＰを３’ＯＨ ＦＡへと変換する能力と関係ないとされていた（例えば、Ｊｉｎｇ ｅｔ ａｌ． （２０１１） ＢＭＣ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １２（４４）：１４７１−２０９１を参照）。３’ＯＨ ＦＡを３’ＯＨアルデヒドへと変換する反応を行うことができるＣＡＲ酵素のさらなる例を、表３に示す。１つの実施形態において、ＣＡＲ酵素をコードする遺伝子は、ｃａｒＢである。３’ＯＨアルデヒドを１，３−ジオールへと変換する反応を行うことができるＡＤＨ／ＡＲ酵素のさらなる例を、表４に示す。１つの実施形態において、これらのＡＤＨ／ＡＲ酵素をコードする遺伝子は、ａｌｒＡ及び／またはｙｑｈＤである。
別の実施形態において、同じく１，３−ジオールを産生する操作された経路を図３に示す。同様に、グルコースなどの単純炭素源は、微生物（例えば、エシェリヒア属、バチルス属、ラクトバチルス属、ロドコッカス属、シネココッカス属、シネコシスティス属、シュードモナス属、アスペルギルス属、トリコデルマ属、ニューロスポラ属、フサリウム属、フミコラ属、リゾムコール属、クルイベロミセス属、ピキア属、ムコール属、ミセリオフトラ属、ペニシリウム属、ファネロケーテ属、プレウロツス属、トラメテス属、クリソスポリウム属、サッカロミセス属、ステノトロホモナス属、シゾサッカロミセス属、ヤロウィア属、またはストレプトミセス属）により、最初に、３’ヒドロキシルアシル−ＡＣＰへと変換される。いくつかの実施形態において、普遍的かつ高度に保存された３’ヒドロキシルアシル−ＡＣＰが、微生物の天然経路により産生される。上記のとおり、３’ヒドロキシルアシル−ＡＣＰを使用して、操作された経路を開始させることができる。例えば、３’ヒドロキシルアシル−ＡＣＰは、アシル−ＡＣＰレダクターゼ（ＡＡＲ）活性を有する酵素（表１を参照）により、３’ＯＨ脂肪アルデヒドなどの中間体へと変換される。ＡＡＲによる脂肪アルコール及び／または脂肪アルデヒドの産生は、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼをコードするａｃｃＡＢＣＤと呼ばれる遺伝子の異種発現を通じて向上する場合がある。３’ＯＨアシル−ＡＣＰを３’ＯＨアルデヒドへと変換する反応を行うことができるＡＡＲ酵素の例として、シネココッカス・エロンガタス、シアノセイス属種、シネコシスティス属種、及びプロクロロコッカス・マリナス（Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｉｎｕｓ）の酵素が挙げられるが、これらに限定されない。次いで、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）またはアルデヒドレダクターゼ（ＡＲ）活性を有する酵素（表４を参照）が、３’ＯＨアルデヒドを１，３−ジオールなどの脂肪ジオールへと変換することができる。したがって、本開示は、インビボで、１，３−ジオールをはじめとする脂肪ジオールを効率的かつ選択的に産生することができる組換え微生物を提供する。なお、大部分の細胞は、アルデヒドが細胞障害性となり得ることから、それらを還元することができる酵素を、天然に産生する。したがって、ＡＲ及びＡＤＨの異種発現は、脂肪アルコール及びジオールの産生には必要ないかもしれないが、脂肪アルコール及びジオールの産生効率を改善する場合がある。
また、脂肪酸分解酵素活性を持つポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、任意選択で、宿主細胞において減弱することができる。そのようなポリペプチドの非限定的な例として、アシル−ＣｏＡシンセターゼ（大腸菌ＦａｄＤなど）及びアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（大腸菌ＦａｄＥなど）がある。表１は、例示の代謝経路における酵素活性の包括的一覧を提示し、この表には、当該分野で既知の方法にしたがって任意選択で減弱可能な様々な脂肪酸分解酵素が含まれる（例えば、米国特許第８，２８３，１４３号、上記、を参照）。例えば、ＦａｄＲ（表１を参照）は、大腸菌における脂肪酸分解及び脂肪酸生合成経路に関与する重要な調節因子である（Ｃｒｏｎａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ２９（４）： ９３７−９４３（１９９８））。大腸菌酵素ＦａｄＤ（表１を参照）及び脂肪酸輸送タンパク質ＦａｄＬは、脂肪酸取り込み系の構成要素である。ＦａｄＬ及びその相同体は、細菌細胞内への脂肪酸の輸送を仲介し、ＦａｄＤ及びその相同体は、アシル−ＣｏＡエステルの形成を仲介する。脂肪酸及び脂肪酸誘導体の代替異種取り込み系は、シュードモナス属の外膜タンパク質ＡｌｋＬである（Ｊｕｌｓｉｎｇ ｅｔ ａｌ． （２０１２） Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ７８：５７２４−５７３３）。他の炭素源が利用できないとき、外因性脂肪酸が、細菌により取り込まれて、アシル−ＣｏＡエステルへと変換され、このエステルは、転写因子ＦａｄＲと結合して、脂肪酸輸送（ＦａｄＬ）、活性化（ＦａｄＤ）、及びβ酸化（ＦａｄＡ、ＦａｄＢ、及びＦａｄＥ）を担当するタンパク質をコードするｆａｄ遺伝子の発現を抑制することができる。代替炭素源が利用可能な場合、細菌は、アシル−ＡＣＰとして脂肪酸を合成するが、これは、リン脂質合成に使用されるものの、β酸化の基質とはならない。したがって、アシル−ＣｏＡ及びアシル−ＡＣＰは、どちらも、異なる最終産物をもたらすことができる独立した脂肪酸源である（Ｃａｖｉｇｌｉａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７９（１２）： １１６３−１１６９（２００４））。ＦａｄＲ及び／またはＦａｂＢならびにそれらの機能相同体は、宿主細胞（例えば、大腸菌）において脂肪酸誘導体の産生を向上させることができるが、それらの過剰発現は任意選択である。本明細書中、ＦａｂＢ過剰発現が伸長速度（脂肪酸鎖合成）を向上させる場合があり、ＦａｄＲ過剰発現がＦａｂＡ及びＦａｂＢの発現を増加させる場合があることが、企図されている。後者が可能であるのは、ＦａｄＲが、ＦａｂＡ及びＦａｂＢの陽性調節因子であると考えられるからである。
（表１）酵素活性
Figure 0006925258
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（表２）チオエステラーゼ活性
Figure 0006925258
（表３）カルボン酸レダクターゼ（ＣＡＲ）活性
Figure 0006925258
（表４）アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）またはアルデヒドレダクターゼ（ＡＲ）活性
Figure 0006925258
本開示は、組換え宿主細胞及び産生方法において有用な酵素活性を持つポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを特定する。酵素活性を持つポリペプチドは、脂肪ジオール化合物を含む組成物の産生に寄与する。そのようなポリヌクレオチドに対する完全な配列同一性は必要ないことが一般に認識される。例えば、特定のポリヌクレオチド配列（例えば、酵素機能を持つポリペプチドをコードするポリヌクレオチド）に変更を加えることができ、コードされたポリペプチドを活性についてスクリーニングすることができる。そのような変更は、典型的には、保存的変異及びサイレント変異（例えば、コドン最適化）を含む。遺伝子操作されたまたは修飾されたポリヌクレオチド及びコードされた変異ポリペプチドは、当該分野で既知の方法を用いて所望の機能についてスクリーニングすることができ、そのような機能として、向上した触媒活性、向上した安定性、または低減した阻害（例えば、低減したフィードバック阻害）が挙げられるが、これらに限定されない。
また、本開示は、本明細書中に記載されるとおりの脂肪ジオール産生（上記参照）に関与する操作された経路の様々なステップ（すなわち、反応）に関与する酵素活性を、酵素分類（ＥＣ）番号によって特定し、そのようなＥＣ番号に分類されるポリペプチド（例えば、酵素）の例及びそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの例を提示する。そのような例示ポリペプチド及びポリヌクレオチドは、本明細書中、アクセッション番号及び／または配列特定番号（配列番号）により特定されるが、それらは、親宿主細胞において１，３−脂肪ジオールをはじめとする脂肪ジオールの産生を導く脂肪酸経路を操作して、本明細書中に記載される組換えまたは遺伝子修飾された宿主細胞を得るのに有用である。本明細書中に記載されるポリペプチド及びポリヌクレオチドは、例示であって、限定するものではない。本明細書中に記載される例示ポリペプチドの相同体の配列は、様々なデータベースを通じて当業者に利用可能である（例えば、国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）が提供するＥｎｔｒｅｚデータベース、スイスバイオインフォマティクス研究所が提供するＥｘＰａｓｙデータベース、ブラウンシュバイク工科大学が提供するＢＲＥＮＤＡデータベース、ならびに京都大学化学研究所バイオインフォマティクスセンター及び東京大学が提供するＫＥＧＧデータベース、これらはすべてワールドワイドウェブで利用可能である）。
発酵及び脂肪ジオール産生
本明細書中で使用される場合、発酵は、広義には、組換え宿主細胞による、有機材料の標的物質への変換を指す。例えば、発酵として、炭素源を含む培地で組換え宿主細胞の培養物を増殖させることによる、組換え宿主細胞による炭素源から脂肪ジオールなどの脂肪酸誘導体への変換が挙げられる。脂肪ジオール及び／または脂肪アルコールなどの標的物質の産生を許容する条件は、宿主細胞が脂肪ジオール組成物などの所望の産物を産生することを可能にする任意の条件である。同様に、この条件として、宿主細胞で発現するベクターのポリヌクレオチド配列が、宿主細胞が標的ポリペプチドを合成することを可能にする任意の条件が挙げられる。適切な条件として、例えば、典型的発酵条件が挙げられる。発酵条件は、多くのパラメーターを含むことができ、そのようなパラメーターとして、温度範囲、ｐＨレベル、曝気レベル、供給速度、及び培地組成が挙げられるが、これらに限定されない。これらの条件はそれぞれ、個別にまたは組み合わせで、宿主細胞の増殖を可能にする。発酵は、好気性、嫌気性、またはそれらの改変型（微好気性など）が可能である。培養培地の例として、ブロス（液体）またはゲル（固体）が挙げられる。一般に、培地は、宿主細胞による直接代謝が可能な炭素源（例えば、再生可能な原料に由来する単純炭素源）を含む。また、培地に酵素を使用して、流動化（例えば、デンプンまたはセルロースを解重合して発酵性糖にする）及びそれに続く炭素源の代謝を促進することができる。
小規模産生の場合、操作された宿主細胞を、例えば、約１００μＬ、２００μＬ、３００μＬ、４００μＬ、５００μＬ、１ｍＬ、５ｍＬ、１０ｍＬ、１５ｍＬ、２５ｍＬ、５０ｍＬ、７５ｍＬ、１００ｍＬ、５００ｍＬ、１Ｌ、２Ｌ、５Ｌ、または１０Ｌのバッチで増殖させ；発酵させ；及び、所望のポリヌクレオチド配列、例えば特定の酵素活性（例えば、ＴＥ、ＣＡＲ、ＡＤＨ、ＦＡＲ、ＡＣＲ、ＡＣＣ及び／またはＡＡＲ酵素活性）を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドなどを発現するように誘導することができる。大規模産生の場合、操作された宿主細胞を、約１０Ｌ、１００Ｌ、１０００Ｌ、１０，０００Ｌ、１００，０００Ｌ、１，０００，０００Ｌ、またはそれ以上の大量バッチを有する培養物で増殖させ；発酵させ；及び、任意の所望のポリヌクレオチド配列を発現するように誘導することができる。本明細書中に記載される脂肪ジオール組成物は、組換え宿主細胞培養物の細胞外環境で見出すことができ、培養培地から容易に単離することができる。脂肪ジオール及び／または脂肪アルコールなどの脂肪酸誘導体は、組換え宿主細胞により分泌され、組換え宿主細胞培養物の細胞外環境へと搬出される、または組換え宿主細胞培養物の細胞外環境へと受動輸送されてもよい。脂肪ジオール組成物は、当該分野で既知の定法を使用して、組換え宿主細胞培養物から単離されてもよい。
脂肪ジオールを産生させる目的で、産生宿主細胞にいくつかの改変が行われた（上記参照）。すなわち、本開示は、無操作すなわち天然宿主細胞（例えば、対照細胞として機能する野生型宿主細胞）と比べて生合成経路を提供するように操作された組換え宿主細胞を提供し、これは、例えば、特定の株の改良により達成される。微生物、例えば、細菌、シアノバクテリア、酵母菌、藻類、または糸状菌などは、産生宿主として利用できる。産生宿主として利用可能な微生物の非限定的な例として、大腸菌、Ｓ．セレビシエなどが挙げられる。微生物株は、グルコースまたは他の再生可能な原料を、脂肪アルコール及び脂肪ジオールをはじめとする脂肪酸誘導体へと効率的に変換する。これを達成するため、株は、特定機能を持つ重要酵素を発現するように慎重に操作されたものである。様々な化合物を産生するための高密度発酵用プロトコル及び手順は、確立されている（例えば、米国特許第８，３７２，６１０号；同第８，３２３，９２４号；同第８，３１３，９３４号；同第８，２８３，１４３号；同第８，２６８，５９９号；同第８，１８３，０２８号；同第８，１１０，６７０号；同第８，１１０，０９３号；及び同第８，０９７，４３９号を参照。これらは本明細書中参照として援用される）。
注目すべきは、現在に至るまで、グルコースまたは他の再生可能な原料から１，３−ジオールをはじめとする脂肪ジオールを直接かつ効率的に産生する方法は存在していない。それでも、こうした脂肪ジオールは、洗浄剤、界面活性剤、乳化剤、軟化剤、溶媒、プラスチック、及び食品添加物の成分として用途がある。本明細書中提示される、脂肪ジオール及びその組成物を産生する発酵を利用した方法は、当該分野で採用されている化学的方法に代わる環境に優しい代替方法を提供する。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、炭素源（例えば、単純炭素源）を約２０ｇ／Ｌ〜約９００ｇ／Ｌの初期濃度で含む培養培地（例えば、発酵培地）で培養される。他の実施形態において、培養培地は、炭素源を約２ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌ；約１０ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌ；約２０ｇ／Ｌ〜約３０ｇ／Ｌ；約３０ｇ／Ｌ〜約４０ｇ／Ｌ；または約４０ｇ／Ｌ〜約５０ｇ／Ｌの初期濃度で含む。いくつかの実施形態において、培養培地中の利用可能な炭素源レベルは、発酵の進行中、観測することができる。いくつかの実施形態において、本方法はさらに、培養培地中の初期炭素源のレベルが約０．５ｇ／Ｌ未満になったときに、補充炭素源を培地に加える工程を含む。いくつかの実施形態において、補充炭素源は、培養培地中の炭素源のレベルが約０．４ｇ／Ｌ未満、約０．３ｇ／Ｌ未満、約０．２ｇ／Ｌ未満、または約０．１ｇ／Ｌ未満になったときに、培地に加えられる。いくつかの実施形態において、補充炭素源は、炭素源レベルを約１ｇ／Ｌ〜約２５ｇ／Ｌに維持するように加えられる。いくつかの実施形態において、補充炭素源は、炭素源レベルを約２ｇ／Ｌ以上（例えば、約２ｇ／Ｌ以上、約３ｇ／Ｌ以上、約４ｇ／Ｌ以上）に維持するように加えられる。ある特定の実施形態において、補充炭素源は、炭素源レベルを約５ｇ／Ｌ以下（例えば、約５ｇ／Ｌ以下、約４ｇ／Ｌ以下、約３ｇ／Ｌ以下）に維持するように加えられる。いくつかの実施形態において、補充炭素源は、炭素源レベルを約２ｇ／Ｌ〜約５ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌ、または約１０ｇ／Ｌ〜約２５ｇ／Ｌに維持するように加えられる。
１つの実施形態において、発酵用炭素源は、再生可能な原料に由来する。いくつかの実施形態において、炭素源は、グルコースである。他の実施形態において、炭素源は、グリセロールである。炭素源として他に可能なものとして、フルクトース、マンノース、ガラクトース、キシロース、アラビノース、デンプン、セルロース、ペクチン、キシラン、スクロース、マルトース、セロビオース、及びツラノース；セルロース系材料及び変形物、例えば、ヘミセルロース、メチルセルロース、及びナトリウムカルボキシメチルセルロースなど；飽和または不飽和脂肪酸、コハク酸化合物、乳酸化合物、及び酢酸化合物；アルコール、例えば、エタノール、メタノール、及びグリセロール、またはそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。１つの実施形態において、炭素源は、トウモロコシ、サトウキビ、ソルガム、ビート、スイッチグラス（ｓｗｉｔｃｈ ｇｒａｓｓ）、貯蔵牧草、麦わら、木材、パルプ、下水、生ごみ、セルロース系都市廃棄物、排煙、合成ガス、または二酸化炭素に由来する。単純炭素源はまた、光合成産物、例えば、グルコースまたはスクロースであることも可能である。１つの実施形態において、炭素源は、廃棄産物、例えば、グリセロール、排煙、または合成ガスなどに由来し；あるいは、有機材料、例えばバイオマスの改質に由来し；あるいは、天然ガスもしくはメタンに由来し、またはこれらの材料から合成ガスへの改質に由来し；あるいは、光合成により固定される二酸化炭素に由来し、例えば、１，３ジオールは、光合成により増殖し、炭素源としてＣＯ２を使用する組換えシアノバクテリアにより産生されてもよい。ある特定の実施形態において、炭素源は、バイオマスに由来する。バイオマス源の例は、植物体または草木、例えば、トウモロコシ、サトウキビ、またはスイッチグラスである。バイオマス源の別の例は、代謝廃棄産物、例えば動物性物質（例えば、牛糞肥料）などである。バイオマス源のさらなる例として、藻類及び他の海洋植物が挙げられる。バイオマスとしてまた、工業、農業、林業、及び家庭からの廃棄産物も挙げられ、そのような廃棄産物として、発酵廃棄物、貯蔵牧草、麦わら、木材、下水、生ごみ、セルロース系都市廃棄物、都市固形廃棄物、及び残飯が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、脂肪ジオール（例えば、１，３−ジオール）は、約０．５ｇ／Ｌ〜約４０ｇ／Ｌの濃度で産生される。いくつかの実施形態において、脂肪ジオールは、約１ｇ／Ｌ以上（例えば、約１ｇ／Ｌ以上、約１０ｇ／Ｌ以上、約２０ｇ／Ｌ以上、約５０ｇ／Ｌ以上、約１００ｇ／Ｌ以上）の濃度で産生される。いくつかの実施形態において、脂肪ジオールは、約１ｇ／Ｌ〜約１７０ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌ、約４０ｇ／Ｌ〜約１７０ｇ／Ｌ、約１００ｇ／Ｌ〜約１７０ｇ／Ｌ、約１０ｇ／Ｌ〜約１００ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ〜約４０ｇ／Ｌ、約４０ｇ／Ｌ〜約１００ｇ／Ｌ、または約１ｇ／Ｌ〜約１００ｇ／Ｌの濃度で産生される。
いくつかの実施形態において、脂肪ジオールは、約２５ｍｇ／Ｌ、約５０ｍｇ／Ｌ、約７５ｍｇ／Ｌ、約１００ｍｇ／Ｌ、約１２５ｍｇ／Ｌ、約１５０ｍｇ／Ｌ、約１７５ｍｇ／Ｌ、約２００ｍｇ／Ｌ、約２２５ｍｇ／Ｌ、約２５０ｍｇ／Ｌ、約２７５ｍｇ／Ｌ、約３００ｍｇ／Ｌ、約３２５ｍｇ／Ｌ、約３５０ｍｇ／Ｌ、約３７５ｍｇ／Ｌ、約４００ｍｇ／Ｌ、約４２５ｍｇ／Ｌ、約４５０ｍｇ／Ｌ、約４７５ｍｇ／Ｌ、約５００ｍｇ／Ｌ、約５２５ｍｇ／Ｌ、約５５０ｍｇ／Ｌ、約５７５ｍｇ／Ｌ、約６００ｍｇ／Ｌ、約６２５ｍｇ／Ｌ、約６５０ｍｇ／Ｌ、約６７５ｍｇ／Ｌ、約７００ｍｇ／Ｌ、約７２５ｍｇ／Ｌ、約７５０ｍｇ／Ｌ、約７７５ｍｇ／Ｌ、約８００ｍｇ／Ｌ、約８２５ｍｇ／Ｌ、約８５０ｍｇ／Ｌ、約８７５ｍｇ／Ｌ、約９００ｍｇ／Ｌ、約９２５ｍｇ／Ｌ、約９５０ｍｇ／Ｌ、約９７５ｍｇ／Ｌ、約１０００ｍｇ／Ｌ、約１０５０ｍｇ／Ｌ、約１０７５ｍｇ／Ｌ、約１１００ｍｇ／Ｌ、約１１２５ｍｇ／Ｌ、約１１５０ｍｇ／Ｌ、約１１７５ｍｇ／Ｌ、約１２００ｍｇ／Ｌ、約１２２５ｍｇ／Ｌ、約１２５０ｍｇ／Ｌ、約１２７５ｍｇ／Ｌ、約１３００ｍｇ／Ｌ、約１３２５ｍｇ／Ｌ、約１３５０ｍｇ／Ｌ、約１３７５ｍｇ／Ｌ、約１４００ｍｇ／Ｌ、約１４２５ｍｇ／Ｌ、約１４５０ｍｇ／Ｌ、約１４７５ｍｇ／Ｌ、約１５００ｍｇ／Ｌ、約１５２５ｍｇ／Ｌ、約１５５０ｍｇ／Ｌ、約１５７５ｍｇ／Ｌ、約１６００ｍｇ／Ｌ、約１６２５ｍｇ／Ｌ、約１６５０ｍｇ／Ｌ、約１６７５ｍｇ／Ｌ、約１７００ｍｇ／Ｌ、約１７２５ｍｇ／Ｌ、約１７５０ｍｇ／Ｌ、約１７７５ｍｇ／Ｌ、約１８００ｍｇ／Ｌ、約１８２５ｍｇ／Ｌ、約１８５０ｍｇ／Ｌ、約１８７５ｍｇ／Ｌ、約１９００ｍｇ／Ｌ、約１９２５ｍｇ／Ｌ、約１９５０ｍｇ／Ｌ、約１９７５ｍｇ／Ｌ、約２０００ｍｇ／Ｌ（２ｇ／Ｌ）、３ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ、７０ｇ／Ｌ、８０ｇ／Ｌ、９０ｇ／Ｌ、１００ｇ／Ｌ、またはこれらの値のうち任意の２つにより定められる範囲の力価で産生される。他の実施形態において、脂肪ジオール（例えば、１，３−ジオール）は、１００ｇ／Ｌ超、２００ｇ／Ｌ超、３００ｇ／Ｌ超、またはそれより高い値、例えば、５００ｇ／Ｌ、７００ｇ／Ｌ、１０００ｇ／Ｌ、１２００ｇ／Ｌ、１５００ｇ／Ｌ、または２０００ｇ／Ｌなどの力価で産生される。本開示の方法によって組換え宿主細胞により産生される１，３−ジオールなどの脂肪ジオールの好適な力価は、５ｇ／Ｌ〜２００ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ〜１５０ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ〜１２０ｇ／Ｌ、及び３０ｇ／Ｌ〜１００ｇ／Ｌ、１００ｇ／Ｌ〜１５０ｇ／Ｌ、及び１２０ｇ／Ｌ〜１８０ｇ／Ｌである。１つの実施形態において、本開示の方法によって組換え宿主細胞により産生される１，３−ジオールなどの脂肪ジオールの力価は、約１ｇ／Ｌ〜約２５０ｇ／Ｌであり、より具体的には、９０ｇ／Ｌ〜約１２０ｇ／Ｌである。力価は、所定の組換え宿主細胞培養物により産生される、特定の１，３−ジオールについて指すものでも、または様々な鎖長もしくは様々な機能の１，３−ジオールの組み合わせについて指すものでもよい。
他の実施形態において、本開示の方法に従って１，３−ジオールなどの脂肪ジオールを産生するように操作された宿主細胞は、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも１１％、少なくとも１２％、少なくとも１３％、少なくとも１４％、少なくとも１５％、少なくとも１６％、少なくとも１７％、少なくとも１８％、少なくとも１９％、少なくとも２０％、少なくとも２１％、少なくとも２２％、少なくとも２３％、少なくとも２４％、少なくとも２５％、少なくとも２６％、少なくとも２７％、少なくとも２８％、少なくとも２９％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、またはこれらの値のうち任意の２つにより定められる範囲の収率を有する。他の実施形態において、１，３−ジオールなどの脂肪ジオールは、３０％超、４０％超、５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超、またはそれ以上の収率で産生される。あるいは、またはそれに加えて、収率は、約３０％以下、約２７％以下、約２５％以下、または約２２％以下である。したがって、収率は、上記限界値のうち任意の２つにより定めることができる。例えば、本開示の方法に従って組換え宿主細胞により産生される１，３−ジオールなどの脂肪ジオールの収率は、５％〜１５％、１０％〜２５％、１０％〜２２％、１５％〜２７％、１８％〜２２％、２０％〜２８％、または２０％〜３０％が可能である。特定の実施形態において、組換え宿主細胞により産生される１，３−ジオールなどの脂肪ジオールの収率は、約１０％〜約４０％である。別の特定の実施形態において、組換え宿主細胞により産生される１，３−ジオールなどの脂肪ジオールの収率は、約２５％〜約３０％である。収率は、所定の組換え宿主細胞培養物により産生される、特定１，３−ジオールついて指すものでも、様々な鎖長もしくは異なる機能の１，３−ジオールの組み合わせについて指すものでもよい。また、収率は、使用した原料にも依存すると思われる。
いくつかの実施形態において、組換え宿主細胞により産生される１，３−ジオールなどの脂肪ジオールの産生能は、少なくとも１００ｍｇ／Ｌ／時間、少なくとも２００ｍｇ／Ｌ／時間、少なくとも３００ｍｇ／Ｌ／時間、少なくとも４００ｍｇ／Ｌ／時間、少なくとも５００ｍｇ／Ｌ／時間、少なくとも６００ｍｇ／Ｌ／時間、少なくとも７００ｍｇ／Ｌ／時間、少なくとも８００ｍｇ／Ｌ／時間、少なくとも９００ｍｇ／Ｌ／時間、少なくとも１０００ｍｇ／Ｌ／時間、少なくとも１１００ｍｇ／Ｌ／時間、少なくとも１２００ｍｇ／Ｌ／時間、少なくとも１３００ｍｇ／Ｌ／時間、少なくとも１４００ｍｇ／Ｌ／時間、少なくとも１５００ｍｇ／Ｌ／時間、少なくとも１６００ｍｇ／Ｌ／時間、少なくとも１７００ｍｇ／Ｌ／時間、少なくとも１８００ｍｇ／Ｌ／時間、少なくとも１９００ｍｇ／Ｌ／時間、少なくとも２０００ｍｇ／Ｌ／時間、少なくとも２１００ｍｇ／Ｌ／時間、少なくとも２２００ｍｇ／Ｌ／時間、少なくとも２３００ｍｇ／Ｌ／時間、少なくとも２４００ｍｇ／Ｌ／時間、または少なくとも２５００ｍｇ／Ｌ／時間である。例えば、本開示の方法に従って組換え宿主細胞により産生される１，３−ジオールなどの脂肪ジオールの産生能は、５００ｍｇ／Ｌ／時間〜２５００ｍｇ／Ｌ／時間、または７００ｍｇ／Ｌ／時間〜２０００ｍｇ／Ｌ／時間であってもよい。１つの特定の実施形態において、産生能は、約０．７ｍｇ／Ｌ／時間〜約３ｇ／Ｌ／時間である。産生能は、所定の組換え宿主細胞培養物により産生される１，３−ジオールなどの特定脂肪ジオールについて指すものでもよい。
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載される発酵手順（上記参照）で使用される宿主細胞は、哺乳類細胞、植物細胞、昆虫細胞、酵母菌細胞、真菌細胞、糸状菌細胞、藻類細胞、シアノバクテリア細胞、及び細菌細胞である。特定の実施形態において、宿主細胞は、エシェリヒア属、バチルス属、シュードモナス属、ラクトバチルス属、ロドコッカス属、シネココッカス属、シネコシスティス属、シュードモナス属、アスペルギルス属、トリコデルマ属、ニューロスポラ属、フサリウム属、フミコラ属、リゾムコール属、クルイベロミセス属、ピキア属、ムコール属、ミセリオフトラ属、ペニシリウム属、ファネロケーテ属、プレウロツス属、トラメテス属、クリソスポリウム属、サッカロミセス属、ステノトロホモナス属、シゾサッカロミセス属、ヤロウィア属、またはストレプトミセス属から選択される。他の実施形態において、宿主細胞は、バチルス・レンタス細胞、バチルス・ブレビス細胞、バチルス・ステアロサーモフィラス細胞、バチルス・リケニフォルミス細胞、バチルス・アルカロフィラス細胞、バチルス・コアギュランス細胞、バチルス・サーキュランス細胞、バチルス・プミルス細胞、バチルス・チューリンゲンシス細胞、バチルス・クラウジイ細胞、バチルス・メガテリウム細胞、バチルス・サブティリス細胞、またはバチルス・アミロリクエファシエンス細胞である。他の実施形態において、宿主細胞は、シュードモナス・プチダ細胞である。ある特定の実施形態において、宿主細胞は、シネココッカス属種ＰＣＣ７００２、シネココッカス・エロンガタスＰＣＣ７９４２、シネコシスティス属腫ＰＣＣ６８０３、シネココッカス・エロンガタスＰＣＣ６３０１、プロクロロコッカス・マリナスＣＣＭＰ１９８６（ＭＥＤ４）、アナベナ・バリアビリス（Ａｎａｂａｅｎａ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ２９４１３、ノストック・パンクチフォルメＡＴＣＣ２９１３３（ＰＣＣ７３１０２）、グレオバクター・ビオラセウス（Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ ｖｉｏｌａｃｅｕｓ）ＡＴＣＣ２９０８２（ＰＣＣ７４２１）、ノストック属種ＡＴＣＣ２７８９３（ＰＣＣ７１２０）、シアノセイス属種ＰＣＣ７４２５（２９１４１）、シアノセイス属種ＡＴＣＣ５１４４２、またはシネココッカス属種ＡＴＣＣ２７２６４（ＰＣＣ７００２）である。他の実施形態において、宿主細胞は、トリコデルマ・コニンギイ細胞、トリコデルマ・ビリデ細胞、トリコデルマ・リーゼイ細胞、トリコデルマ・ロンギブラキアタム細胞、アスペルギルス・アワモリ細胞、アスペルギルス・フミガータス細胞、アスペルギルス・フォエチダス細胞、アスペルギルス・ニデュランス細胞、アスペルギルス・ニガー細胞、アスペルギルス・オリゼ細胞、フミコラ・インソレンス細胞、フミコラ・ラヌギノサ細胞、ロドコッカス・オパカス細胞、リゾムコール・ミエヘイ細胞、またはムコール・ミエヘイ細胞である。他の実施形態において、宿主細胞は、放線菌細胞である。さらに他の実施形態において、宿主細胞は、ストレプトミセス・リビダンス細胞またはストレプトミセス・ムリナス細胞である。他の実施形態において、宿主細胞は、サッカロミセス・セレビシエ細胞である。
さらに他の実施形態において、宿主細胞は、真核植物、藻類、シアノバクテリア、緑色硫黄細菌、緑色非硫黄細菌、紅色硫黄細菌、紅色非硫黄細菌、好極限性細菌、酵母菌、真菌、それらを操作した生物、または合成生物に由来する細胞である。ある特定の実施形態において、宿主細胞は、アラビドプシス・タリアナ、パニカム・ヴィルガタム、ミスカンサス・ギガンテウス、ゼア・マイズ、ボツリオコッカス・ブラウニー、クラミドモナス・レインハルディ、ドナリエラ・サリナ、サーモシネココッカス・エロンガタス、シネココッカス・エロンガタス、シネココッカス属種、シネコシスティス属種、クロロビウム・テピダム、クロロフレクサス・オーランティアカス、クロマチウム・ビノサム、ロドスピリラム・ラブラム、ロドバクター・カプスラタス、ロドシュードモナス・パルストリス、クロストリジウム・リュングダリイ、クロストリジウム・サーモセラム、またはペニシリウム・クリソゲナムに由来する細胞である。ある特定の他の実施形態において、宿主細胞は、ピキア・パストリス、サッカロミセス・セレビシエ、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、シゾサッカロミセス・ポンベ、シュードモナス・フルオレセンス、シュードモナス・プチダ、またはザイモモナス・モビリスに由来する。なおさらなる実施形態において、宿主細胞は、シネココッカス属種ＰＣＣ７００２、シネココッカス属種ＰＣＣ７９４２、またはシネコシスティス属種ＰＣＣ６８０３に由来する細胞である。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｃｖ１細胞、ＭＤＣＫ細胞、２９３細胞、３Ｔ３細胞、またはＰＣ１２細胞である。特定の実施形態において、宿主細胞は、大腸菌細胞である。いくつかの実施形態において、大腸菌細胞は、Ｂ株、Ｃ株、Ｋ株、Ｗ株の大腸菌細胞である。
脂肪ジオールの組成物及び配合物
生物学的に産生された有機化合物を含むバイオ産物（例えば、本開示に従って産生された脂肪ジオール組成物）、及び特に本明細書中開示される脂肪酸生合成経路を用いて産生された脂肪ジオール組成物は、再生可能な供給源（例えば、再生可能な原料に由来する単純炭素源）から産生され、したがって、新規組成物である。これらの新規バイオ産物は、二核種炭素同位体フィンガープリント法または１４Ｃ年代測定法に基づいて、石油化学炭素に由来する有機化合物と区別することができる。さらに、生物起源炭素の具体的な供給源（例えば、グルコースとグリセロールとの対比）を、二核種炭素同位体フィンガープリント法によって決定することもできる（例えば、米国特許第７，１６９，５８８号を参照）。本開示の脂肪ジオールなどのバイオ産物を石油由来の有機化合物と区別できることは、流通でこれらの材料をトラッキングするのに有益である。例えば、生物由来の炭素同位体組成と石油由来の炭素同位体組成の両方を含む有機化合物または化学物質は、石油由来の材料だけでできた有機化合物及び化学物質と区別することができる。それ故に、本明細書において産生されるバイオ産物は、その独自の炭素同位体組成に基づいて、流通で追跡またはトラッキングすることができる。バイオ産物は、各試料中の安定炭素同位体比（１３Ｃ／１２Ｃ）を比較することにより、石油由来の有機化合物と区別することができる。所与のバイオ産物における１３Ｃ／１２Ｃ比は、二酸化炭素が固定された時点の大気中二酸化炭素における１３Ｃ／１２Ｃ比の結果である。この比はまた、代謝経路も正確に反映する。地域的変動も起こる。石油、Ｃ３植物（広葉植物）、Ｃ４植物（イネ科草本）、及び海洋炭酸塩はすべて、１３Ｃ／１２Ｃ及び対応するδ１３Ｃ値に明らかな違いを示す。Ｃ４植物及びＣ３植物は両方とも、様々な１３Ｃ／１２Ｃ同位体比を示すが、典型的な値は、Ｃ４植物について約−７〜約−１３パーミル、Ｃ３植物について約−１９〜約−２７パーミルである（例えば、Ｓｔｕｉｖｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｒａｄｉｏｃａｒｂｏｎ １９：３５５ （１９７７）を参照）。石炭及び石油などの非再生可能エネルギーは、一般に後者の範囲に含まれる。
δ１３Ｃ（‰）＝［（１３Ｃ／１２Ｃ）試料−（１３Ｃ／１２Ｃ）標準物質］／（１３Ｃ／１２Ｃ）標準物質×１０００
ＩＡＥＡ、ＵＳＧＳ、ＮＩＳＴ、及び他の選ばれた国際同位体研究所が協同して、一連の代替ＲＭを開発している。ＰＤＢからのパーミル偏位の表記がδ１３Ｃである。測定は、ＣＯ２に対して、高精度安定同位体比質量分析（ＩＲＭＳ）により、質量４４、４５及び４６の分子イオンに関して行われる。本明細書中に記載される組成物は、本明細書中に記載される方法のいずれかによって産生された脂肪ジオールの組成物及び産物を含む。具体的には、脂肪ジオール組成物または産物は、約−２８以上、約−２７以上、−２０以上、−１８以上、−１５以上、−１３以上、−１０以上、または−８以上のδ１３Ｃを有することができる。例えば、脂肪ジオール組成物または産物は、約−３０〜約−１５、約−２７〜約−１９、約−２５〜約−２１、約−１５〜約−５、約−１３〜約−７、または約−１３〜約−１０のδ１３Ｃを有することができる。別の場合には、脂肪ジオール組成物または産物は、約−１０、−１１、−１２、または−１２．３のδ１３Ｃを有することができる。本明細書中の本開示に従って産生された脂肪ジオールの組成物及び産物は、各化合物中の１４Ｃの量を比較することにより、石油由来の有機化合物とも区別することができる。１４Ｃは５７３０年という核半減期を有するので、「より古い」炭素を含有する石油系燃料を、「より新しい」炭素を含有する脂肪ジオールの組成物及びバイオ産物と区別することができる（例えば、Ｃｕｒｒｉｅ， ‘‘Ｓｏｕｒｃｅ Ａｐｐｏｒｔｉｏｎｍｅｎｔ ｏｆ Ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ， Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ， Ｊ． Ｂｕｆｆｌｅ ａｎｄ Ｈ． Ｐ． ｖａｎ Ｌｅｅｕｗｅｎ， Ｅｄｓ．， １ ｏｆ Ｖｏｌ． Ｉ ｏｆ ｔｈｅ ＩＵＰＡＣ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｓｅｒｉｅｓ （Ｌｅｗｉｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｉｎｃ．） ３−７４， （１９９２）を参照）。
放射性炭素年代測定法における基本前提は、大気中の１４Ｃ濃度の不変性が生体中の１４Ｃの不変性をもたらすというものである。しかしながら、１９５０年以降の大気圏内核実験及び１８５０年以降の化石燃料の燃焼により、１４Ｃは第二の地球化学的時間特性を獲得した。大気ＣＯ２中（したがって生体生物圏中）の１４Ｃ濃度は、１９６０年代中頃の核実験のピーク時には約２倍になった。それ以後は、７〜１０年というおよその緩和「半減期」で、約１．２×１０−１２という定常状態の宇宙線起源（大気）ベースライン同位対比（１４Ｃ／１２Ｃ）へと徐々に戻りつつある。この後者の半減期は文字通りに解釈してはならない；そうではなくて、核時代の幕開け以降の大気及び生物圏１４Ｃの変動を追跡するには、詳細な大気核投入／減衰関数を用いなければならない。近年の生物圏炭素の年次年代測定に裏づけを与えるのは、この後者の生物圏１４Ｃ時間特性である。１４Ｃは加速器質量分析（ＡＭＳ）によって測定することができ、その結果は「現代炭素分率」（ｆＭ）という単位で与えられる。その点に関して、ｆＭは、米国国立標準技術研究所（ＮＩＳＴ）標準物質（ＳＲＭ）４９９０Ｂ及び４９９０Ｃ（シュウ酸標準物質ＨＯｘＩ及びＨＯｘＩＩとして知られる）によって定義されるものと同じ意味を有する。基本定義はＨＯｘＩの１４Ｃ／１２Ｃ同位体比の０．９５倍に相当する（西暦１９５０年を基準とする）。これは、減衰補正された産業革命前の木にほぼ等しい。現在の生体生物圏（植物材料）については、ｆＭは約１．１である。本明細書中に記載される脂肪ジオールの組成物及び産物は、少なくとも約１のｆＭ１４Ｃを有し得るバイオ産物を含む。例えば、本開示のバイオ産物は、少なくとも約１．０１のｆＭ１４Ｃ、約１〜約１．５のｆＭ１４Ｃ、約１．０４〜約１．１８のｆＭ１４Ｃ、または約１．１１１〜約１．１２４のｆＭ１４Ｃを有し得る。
１４Ｃの別の測定値は、現代炭素パーセント（ｐＭＣ）として知られる。１４Ｃ年代値を用いる考古学者または地質学者にとっては、西暦１９５０年が「０年前」に相当する。これはまた、１００ｐＭＣも表す。熱核兵器のピークであった１９６３年に、大気中の「爆弾由来炭素（ｂｏｍｂ ｃａｒｂｏｎ）」は、正常レベルのほぼ２倍に達した。その出現以降、大気圏内でのその分布は概算されており、西暦１９５０年以降に生存している植物及び動物については１００ｐＭＣを上回る値を示す。この値は時間の経過とともに徐々に減少しており、現在の値は１０７．５ｐＭＣ付近である。これは、トウモロコシなどの新鮮なバイオマス材料が１０７．５ｐＭＣに近い１４Ｃ特性を与えると思われることを意味する。石油由来の化合物はｐＭＣ値がゼロであると思われる。化石炭素を現代炭素と混合すると、現代ｐＭＣ含有量の希釈が起こる。１０７．５ｐＭＣが現代バイオマス材料の１４Ｃ含有量を表し、０ｐＭＣが石油由来生成物の１４Ｃ含有量を表すと仮定すると、その材料について測定されるｐＭＣ値は、この２種類の構成成分の比率を反映することになる。例えば、現代の大豆に１００％由来する材料は、１０７．５ｐＭＣに近い放射性炭素特性を与えることとなる。この材料を石油由来生成物で５０％希釈したとすると、放射性炭素特性は約５４ｐＭＣになることとなる。生物学に基づく炭素含有量は、「１００％」を１０７．５ｐＭＣに割り当て、「０％」を０ｐＭＣに割り当てることによって導き出される。例えば、９９ｐＭＣと測定される試料は、生物学に基づく炭素含有量換算値として９３％を与える。この値は、生物学に基づく炭素結果平均値と呼ばれ、分析される材料内のすべての構成成分が現代生物材料または石油由来材料いずれかに由来すると仮定している。本明細書中に記載されるとおりの１種類または複数種類の脂肪ジオールを含むバイオ産物は、少なくとも約５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、または１００のｐＭＣを有することができる。他の場合には、本明細書中に記載される脂肪ジオール組成物は、約５０〜約１００；約６０〜約１００；約７０〜約１００；約８０〜約１００；約８５〜約１００；約８７〜約９８；または約９０〜約９５のｐＭＣを有することができる。さらに他の場合には、本明細書中に記載される脂肪ジオール組成物は、約９０、９１、９２、９３、９４、または９４．２のｐＭＣを有することができる。
１，３−ジオールなどの脂肪ジオールは、多くの産業用途で有益かつ望まれる分子である。本開示は、インビボを含む組換え微生物を通じてそのような化合物を産生し、それにより幅広い有用産物を作り出す。そのような産物として、１，３−ジオール及びその組成物が挙げられる。１，３−ジオールの例として、Ｃ５ １，３ジオール（１，３−ペンタンジオール）；Ｃ６ １，３ジオール（１，３−ヘキサンジオール）；Ｃ７ １，３ジオール（１，３−ヘプタンジオール）；Ｃ８ １，３ジオール（１，３−オクタンジオール）；Ｃ９ １，３ジオール（１，３−ノナンジオール）；Ｃ１０ １，３ジオール（１，３−デカンジオール）；Ｃ１１ １，３ジオール（１，３−ウンデカンジオール）；Ｃ１２ １，３ジオール（１，３−ドデカンジオール）；Ｃ１３ １，３ジオール（１，３−トリデカンジオール）；Ｃ１４ １，３ジオール（１，３−テトラデカンジオール）；Ｃ１５ １，３ジオール（１，３−ペンタデカンジオール）；Ｃ１６ １，３ジオール（１，３−ヘキサデカンジオール）；Ｃ１７ １，３ジオール（１，３−ヘプタデカンジオール）；Ｃ１８ １，３ジオール（１，３−オクタデカンジオール）；Ｃ１９ １，３ジオール（１，３−ノナデカンジオール）；などが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書中に記載されるのは、大部分が偶数鎖１，３−ジオールであるものの、７〜２１個の炭素、より好ましくは５〜１９個の炭素を有するものなど奇数鎖１，３−ジオールも包まれる。
本開示の１，３−ジオールは、様々な鎖長及び／または飽和度及び／または分岐特性を有する。いくつかの実施形態において、１，３−ジオール組成物に含まれているのは、ほとんど１種類の１，３−ジオールのうちの、例えば、Ｃ５ １，３ジオール（１，３−ペンタンジオール）；Ｃ６ １，３ジオール（１，３−ヘキサンジオール）；Ｃ７ １，３ジオール（１，３−ヘプタンジオール）；Ｃ８ １，３ジオール（１，３−オクタンジオール）；Ｃ９ １，３ジオール（１，３−ノナンジオール）；Ｃ１０ １，３ジオール（１，３−デカンジオール）；Ｃ１１ １，３ジオール（１，３−ウンデカンジオール）；Ｃ１２ １，３ジオール（１，３−ドデカンジオール）；Ｃ１３ １，３ジオール（１，３−トリデカンジオール）；Ｃ１４ １，３ジオール（１，３−テトラデカンジオール）；Ｃ１５ １，３ジオール（１，３−ペンタデカンジオール）；Ｃ１６ １，３ジオール（１，３−ヘキサデカンジオール）；Ｃ１７ １，３ジオール（１，３−ヘプタデカンジオール）；Ｃ１８ １，３ジオール（１，３−オクタデカンジオール）；Ｃ１９ １，３ジオール（１，３−ノナデカンジオール）；などである。別の実施形態において、１，３−ジオール組成物に含まれているのは、ほとんどが、特定の鎖長を持つ特定１，３−ジオールの特定比の混合物である。さらに別の実施形態において、１，３−ジオール組成物に含まれているのは、特定の鎖長を有する１種類または複数種類の１，３−ジオールが、洗浄剤、界面活性剤、乳化剤、軟化剤、溶媒、プラスチック、及び食品添加物を製造する目的で他の成分または構成成分と組み合わされた組み合わせである。
１つの実施形態において、脂肪ジオール組成物は、直鎖脂肪アルコールの混合物中にＣ１２ １，３−ジオールを含む。別の実施形態において、脂肪ジオール組成物は、分岐鎖脂肪アルコールの混合物中にＣ１２ １，３−ジオールを含む。別の実施形態において、脂肪ジオール組成物は、直鎖及び分岐鎖脂肪アルコールの混合物中にＣ１２ １，３−ジオールを含む。別の実施形態において、脂肪ジオール組成物は、例えば、洗浄剤または界面活性剤成分などの追加成分と組み合わせて、Ｃ１２ １，３−ジオールを含む。さらに別の実施形態において、脂肪ジオール組成物は、例えば、乳化剤または溶媒成分などの追加成分と組み合わせて、Ｃ１２ １，３−ジオールを含む。さらに別の実施形態において、脂肪ジオール組成物は、重合体と組み合わせて、Ｃ１２ １，３−ジオールを含む。本明細書中、脂肪ジオール組成物は、プラスチックの構成成分として使用することができる。別の実施形態において、脂肪ジオール組成物は、食品成分の混合物中にＣ１２ １，３−ジオールを含む。別の実施形態において、脂肪ジオール組成物は、グルコシドまたはエトキシドなど、界面活性剤または洗浄剤の合成における中間体として、あるいは香料と組み合わせて、あるいは他の化学物質を合成することができる化学基本単位として、１，３−ジオールを含む。
別の実施形態において、脂肪ジオール組成物は、直鎖脂肪アルコールの混合物中にＣ８−、Ｃ１０−、及びＣ１２ １，３−ジオールをある特定比で含む。別の実施形態において、脂肪ジオール組成物は、分岐鎖脂肪アルコールの混合物中にＣ８−、Ｃ１０−、及びＣ１２ １，３−ジオールをある特定比で含む。別の実施形態において、脂肪ジオール組成物は、直鎖及び分岐鎖脂肪アルコールの混合物中にＣ８−、Ｃ１０−、及びＣ１２ １，３−ジオールをある特定比で含む。別の実施形態において、脂肪ジオール組成物は、例えば、洗浄剤または界面活性剤成分などの追加成分と組み合わせて、Ｃ８−、Ｃ１０−、及びＣ１２ １，３−ジオールをある特定比で含む。さらに別の実施形態において、脂肪ジオール組成物は、例えば、乳化剤または溶媒成分などの追加成分と組み合わせて、Ｃ８−、Ｃ１０−、及びＣ１２ １，３−ジオールをある特定比で含む。さらに別の実施形態において、脂肪ジオール組成物は、重合体と組み合わせて、Ｃ８−、Ｃ１０−、及びＣ１２ １，３−ジオールをある特定比で含む。本明細書中、脂肪ジオール組成物は、プラスチックの構成成分として使用することができる。別の実施形態において、脂肪ジオール組成物は、食品成分の混合物中にＣ８−、Ｃ１０−、及びＣ１２ １，３−ジオールをある特定比で含む。
本開示はさらに、食品関連成分の混合物中に、Ｃ５−、Ｃ６−、Ｃ７−、Ｃ８−、Ｃ９−、Ｃ１０−、及び／またはＣ１１ １，３−ジオールを単独でまたはある特定比で含む、脂肪ジオール組成物を包含する。そのような脂肪ジオールは、食品安定剤、食品向上剤、食品添加物、または食品代用物として有用であろう。本開示の脂肪ジオールの化合物及び組成物は、洗浄剤、界面活性剤、乳化剤、軟化剤、溶媒、プラスチック、食品添加物などをはじめとする所望の製品を作ることができるように、配合することができる。１つの実施形態において、Ｃ１０−Ｃ１８ １，３−ジオールは、界面活性剤としての使用が企図される。別の実施形態において、１，３ジオールは、栄養補助食品、医薬品、農薬、及び他の生理活性分子の合成に、直接または中間体として使用される。
キラル１，３ジオールに関する考察。
以下の実施例は、本開示をさらに説明するが、いかなる方法においても、本開示の範囲を限定するとみなされることはない。
実施例１：１，３−ジオール産生用組換え大腸菌株の培養
実験はすべて、単独コロニーから、または特定微生物株の凍結貯蔵物から開始した。各株について四つ組で、９６ウェルプレートにて高処理（ＨＴＰ）プロトコルを以下のとおり行った：Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培養物４０μＬ（９６ウェルプレートで増殖しているＬＢ培養物から取得）を用いて、ＬＢ培地３６０μＬに播種し、次いでこれを、３２℃で、振盪させながら、３〜４時間インキュベートした。ＬＢ種４０μＬを用いて、Ｎｌｉｍ培地（以下を参照）３６０μＬに播種した。３２℃で２時間、３０〜３５℃で増殖させた後、培養物をＩＰＴＧ（最終濃度１ｍＭ）で誘導した。次いで、培養物を、他に特に記載がないかぎり、３０〜３５℃で、振盪させながら、２０時間インキュベートし、その後、培養物を、以下に詳細を記載する標準抽出プロトコルに従って抽出した。振盪フラスコでのプロトコルを同様に行ったが、ただし、最終産生培地体積が４００μｌではなく１５ｍｌであるように、培地体積をスケールアップした。振盪フラスコ培地は、０．２５％（ｖ／ｖ）トリトンＸ１００も含有していた。微生物株に応じて、全ての段階で適切な抗生物質を添加した。
Figure 0006925258
バイオリアクターにおけるベースラインプロセスは、以下のとおりであった：細胞バンクバイアルに入った株を、培養物のＯＤ読み値が１超になるまで、抗生物質を含むＬＢ振盪フラスコ中、３２℃で培養した。この培養物を、５％ｖ／ｖで最小播種培地（塩化アンモニウム、塩化ナトリウム、リン酸カリウム一塩基性、硫酸マグネシウム、塩化カルシウム、グルコース、微量元素溶液、クエン酸鉄（ＩＩＩ）三塩基性一水和物、緩衝液、及び抗生物質（複数可）を含む）に移して、３２℃で一晩培養した。次いで、この種培養物を用いて、用意した産生用バイオリアクターに播種した。
このプロセスのための初期バイオリアクター培地は、播種培地と同じ成分を様々な濃度で、ならびに微量ビタミン溶液、及び任意選択で少量の複合培地成分、例えばカザミノ酸、コーンスティープ粉、または酵母菌抽出などを含んでいた。滅菌後、任意選択で、バイオリアクターに添加したものとして、熱不安定性ビタミンまたはアミノ酸、グルコース、及び抗生物質が含まれた。
播種前に、バイオリアクターパラメーターを安定させて、コントローラーをオンにした（溶解酸素設定値：１０〜５０％；温度設定値：２７〜３７℃；曝気設定値：０．２５〜１ｖｖｍ；ｐＨ設定値：６．５〜７．５）。バイオリアクターに、５％ｖ／ｖの種培養物を播種し、培養物密度が所望の設定値に到達した時点で１ｍＭのＩＰＴＢで誘導した。
グルコース、スクロース、フルクトース、キシロース、またはグリセロールを、他の培地成分として可能なものと合わせてバイオリアクター基礎培地に加えることで構成された供給溶液を、１〜５０ｇ／Ｌ／時間のグルコースである最大速度で培養物に供給し（公称培養体積を基準とする）、培地がその炭素源を消費し尽くし、供給溶液の次の追加を加えるべき時点をコントローラーに示すために、ＤＯまたはｐＨトリガーを使用した。バイオリアクターは４８〜９６時間で収穫した。
実施例２：１，３−ジオールの分析
組換え大腸菌株により産生された発酵ブロス試料に、以下の手順で抽出を行った：
１．ブロスを３０００ｒｐｍで３０秒間ボルテックスしてから、秤量する
２．Ｖｏｒｔｅｘ Ｇｅｎｉｅでボルテックス後、直ちにブロス５００μＬを採取する
３．内部標準として、５００ｍｇ／Ｌの（１−ウンデカノール）を含む酢酸ブチル５ｍＬを加える
４．ブロスを、ボルテックス装置（ＤＶＸ−２５００マルチチューブボルテックス装置、ＶＷＲ）にて、２５００ｒｐｍで２０分間、抽出する
５．抽出物を、室温で１０分間遠心する（４７５０ｒｐｍにて）
６．最上層の上清１００μＬをピペットで、インサートを有するＧＣバイアルに移す
７．室温で、ＧＣバイアルに１００μＬの（ＢＳＴＦＡ＋１％ＴＭＣＳ）を加えて誘導体化する
８．抽出物とＢＳＴＦＡ試薬を３０秒間混合してから、以下に説明するＧＣ／ＭＳに注入する：
特定用の装置設定
初期温度：６０℃
初期時間：５分
平衡化時間：１分間
プログラム速度：２５℃／分
最終温度：３００℃
最終時間：１．６分
検出器：ＭＳＤ
インレット温度：３００℃
トランスファーライン温度：３００℃
ＭＳ源：２３０℃
ＭＳ四重極：１５０℃
スプリット比：２０：１
カラム流：１ｍＬ／分
試料量：１μＬ
実施例３：アネロコッカス・テトラジウスまたはラクトバチルス・プランタルム由来ＴＥ、及びｃａｒＢを含む経路を用いた１，３−ジオール産生
この実施例は、アネロコッカス・テトラジウス（Ａｎａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｔｅｔｒａｄｉｕｓ）由来の微生物チオエステラーゼ（ＴＥ＿ＥＥＩ８２５６４、ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＷＰ＿００４８３７４１６）またはラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）由来の微生物チオエステラーゼ（ＴＥ＿ＣＡＤ６３３１０、ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＷＰ＿００３６４０９６９）、及びマイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）由来のカルボン酸レダクターゼの変異体であるＣａｒＢ（ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＹＰ＿８８９９７２）を含む代謝経路を使用した、組換え大腸菌での予想外の１，３−ジオール産生を示す。
ｃａｒＢ２（配列番号６）及びＴＥ＿ＥＥＩ８２５６４をコードする遺伝子を、それら遺伝子の転写がＩＰＴＧ誘導性Ｐｔｒｃプロモーターにより制御され、かつそれら遺伝子がアルコールデヒドロゲナーゼａｌｒＡ、ならびに３−ケト−アシル−ＡＣＰシンターゼ（ｆａｂＢ）及び転写調節因子（ｆａｄＲ）の変異体をコードする遺伝子とオペロンを形成するように、ｐＣＬ１９２０誘導ベクター（ＳＣ１０１レプリコン、スペクチノマイシン耐性マーカー）にクローン導入した。ａｌｒＡは、脂肪アルコールまたは脂肪ジオール産生には必要ではないが、それらの産生速度を向上させる。プラスミドは、ｐＶＡ３６９と名付けた（表５を参照）。Ｌ．プランタルム由来のＴＥ＿ＣＡＤ６３３１０の遺伝子を、同じやり方で、ｃａｒＢ１２の遺伝子（配列番号４）とともにクローン導入し、得られるプラスミドを、ｐＪＰ２と名付けた（以下の表５を参照）。
プラスミド形質転換に使用した基礎株は、Ｖ６６８及びＤＪ８１であった。簡単に述べると、基礎株のゲノムを以下のとおり操作した：Ｖ６６８では、ｆａｄＥ（アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ）遺伝子を欠損させ、合成脂肪酸生合成オペロン及びホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ（ｅｎｔＤ）を過剰発現させた。簡単に述べると、基礎株ＤＪ８１のゲノムを以下のとおり操作した：アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ｆａｄＥ）遺伝子を欠損させ、合成脂肪酸生合成オペロン、ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ（ｅｎｔＤ）、及び変異チオエステラーゼ（ｔｅｓＡ）を過剰発現させた。
プラスミドｐＶＡ３６９及びｐＪＰ２を、それぞれ、基礎株Ｄ８４８及びＶ６６８に形質転換導入して、ＶＡ３７０株及びＪＰ−１１株を得た（以下の表６を参照）。次いで、実施例１及び２に記載されるとおりに、株を培養し、脂肪アルコールを産生するそれらの能力について、分析した。驚いたことに、株は両方とも、数個の未知のピークをもたらした。
図４は、ＴＥ＿ＥＥＩ８２５６４を発現するＶＡ３７０株の抽出物のＧＣ−ＭＳクロマトグラフを示す。ＧＣ−ＭＳクロマトグラフ中のＲＴ＝８．１９９分及びＲＴ＝９．０９４分の２つのピークは、予想される脂肪アルコール及び脂肪酸、例えば、ドデカノール及びテトラデカノールまたはドデカン酸及びテトラデカン酸の保持時間と一致しなかった。ピーク１は、ドデカノールの前に溶出し、ピーク２は、テトラデカノール後かつテトラデカン酸の前に溶出した。ピーク１及びピーク２のイオンフラグメンテーションパターン（図５を参照）は、これらの２つのピークが、それぞれ、１，３−オクタンジオール及び１，３−デカンジオールのＢＳＴＦＡによる誘導体化産物（実施例２を参照）である、１，３−トリメチルシロキシオクタン及び１，３トリメチルシロキシデカンであることを示唆した。説明のため、図６に、図５のピーク１で観測されたとおりの、１，３トリメチルシロキシデカンのイオンフラグメントの模式図を示す。誘導体化された１，３−ドデカンジオール及び１，３−テトラデカンジオールも微量で観察された。
同様に、ＴＥ＿ＣＡＤ６３３１０を発現するＪＰ−１１株の抽出物は、新たなピークを含んでおり、これらのピークは、上記のとおり、それらのイオンフラグメンテーションパターン及び保持時間に基づいて、１，３−オクタンジオール、１，３−デカンジオール、１，３−テトラデカノール、及び１，３−テトラデセノールと特定された。ＪＰ−１１は、ＨＴＰ発酵プロトコルにおいて、合計１．９±０．０５ｇ／Ｌの１，３−ジオール、ならびに、オクタノール、デカノール、ドデカノール、ドデセノール、テトラデカノール、及びテトラデセノールなどの脂肪アルコールを産生した。ＪＰ−１１株の生成物分布を図７に示す。
１，３−ジオールの産生は、２つの理由から驚くべきものであった：（ｉ）この産生には、中間体として３−ＯＨ脂肪酸が必要であり、さらに３−ＯＨ脂肪酸は、チオエステラーゼの作用により３−ＯＨアシル−ＡＣＰから由来した可能性が最も高い（図２を参照）。この実施例で使用したチオエステラーゼは両方とも、大腸菌ですでに発現されており、脂肪酸を生じさせるのみであったことが報告されていて（Ｊｉｎｇ ｅｔ ａｌ． ＢＭＣ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１１， １２：４４）、３−ＯＨ脂肪酸及びしたがって１，３−ジオールの産生には適さないことが示唆されていた。（ｉｉ）この産生には、３−ＯＨ脂肪酸中間体がカルボン酸レダクターゼＣａｒＢにより還元されて３−ＯＨ脂肪アルデヒドになることが必要であり、次いで３−ＯＨ脂肪アルデヒドは、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）によりさらに還元されて、１，３−ジオールになる。ＡＤＨはむしろ無差別であることが知られているが、ＣａｒＢは、これまで、３−ＯＨ脂肪酸を３−ＯＨ脂肪アルデヒドに変換すると示されたことがなかった。したがって、本出願人らは、ある特定の微生物チオエステラーゼ、例えば、ＴＥ＿ＥＥＩ８２５６４及びＴＥ＿ＣＡＤ６３３１０は、大腸菌宿主細胞中でＣａｒＢと同時発現させた場合に、１，３−ジオールを過剰産生することを発見した。１，３ジオールの分析から、それらが（Ｒ）鏡像異性体を非常に豊富に含むと言うことができ、天然大腸菌脂肪酸生合成機構の３−ケトアシルＡＣＰレダクターゼ（ＦａｂＧ）のエナンチオ選択性を実証する。
（表５）１，３−ジオール産生に使用したプラスミド
Figure 0006925258
（表６）１，３−ジオール産生に使用した株
Figure 0006925258
実施例４Ａ：ウンベルラリア・カリフォルニカ由来ｆａｔＢ１、及びｃａｒＢを含む経路を使用した１，３−ジオールの産生
この実施例は、ウンベルラリア・カリフォルニカ（Ｕｍｂｅｌｌｕｌａｒｉａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）由来の植物チオエステラーゼであるｆａｔＢ１（ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｑ４１６３５）及びマイコバクテリウム・スメグマチス由来の変異カルボン酸レダクターゼであるＣａｒＢを含む代謝経路を使用した、組換え大腸菌での１，３−ジオール産生を示す。
ｃａｒＢ８（配列番号８）及びｆａｔＢ１をコードする遺伝子を、それら遺伝子の転写がＩＰＴＧ誘導性Ｐｔｒｃプロモーターにより制御され、かつそれら遺伝子がアルコールデヒドロゲナーゼａｌｒＡをコードする遺伝子とオペロンを形成するように、ｐＣＬ１９２０誘導ベクター（ＳＣ１０１レプリコン、スペクチノマイシン耐性マーカー）にクローン導入した。プラスミドは、ｐＮＨ３３０と名付けた（表５を参照）。
プラスミド形質転換に使用した基礎株は、Ｄ１７８株であった。簡単に述べると、Ｄ１７８株のゲノムを以下のとおり操作した：ｆａｄＥ（アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ）遺伝子を削除し、ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ（ｅｎｔＤ）を過剰発現させた。プラスミドｐＮＨ３３０を、Ｄ１７８に形質転換導入して、ｓｔＮＨ１３７１株を得た（表６を参照）。次いで、実施例１及び２に記載されるとおりに、株を培養し、脂肪アルコール及び１，３−ジオールを産生する能力について分析した。１，３−ジオールのピークを、実施例２に記載されるとおりに特定した。
ｓｔＮＨ１３７１株は、ＨＴＰ発酵プロトコルにおいて、３９．５±３．２ｍｇ／Ｌの１，３−ジオールを産生した。１，３−ドデカンジオールは、産生された１，３−ジオールの１種であった。１，３−ジオールの他に、ドデカノールなどの脂肪アルコールも検出された。１，３ジオールの分析では、それらが（Ｒ）鏡像異性体を非常に豊富に含むことが示される可能性があり、天然大腸菌脂肪酸生合成機構の３−ケトアシルＡＣＰレダクターゼ（ＦａｂＧ）のエナンチオ選択性を実証する。
実施例４Ｂ：シュードモナス・プチダ由来のｐｈａＧ、及びｃａｒＢを含む経路を使用した１，３−ジオールの産生
この実施例は、シュードモナス・プチダ由来のチオエステラーゼ／トランスアシラーゼであるｐｈａＧ（ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＮ６７０３１）及びマイコバクテリウム・スメグマチス由来の変異カルボン酸レダクターゼであるＣａｒＢを含む代謝経路を使用した、組換え大腸菌での１，３−ジオール産生を示す。
ｃａｒＢ８（以下の本明細書に添付される配列表を参照）及びｐｈａＧをコードする遺伝子を、それら遺伝子の転写がＩＰＴＧ誘導性Ｐｔｒｃプロモーターにより制御され、かつそれら遺伝子がアルコールデヒドロゲナーゼａｌｒＡをコードする遺伝子とオペロンを形成するように、ｐＣＬ１９２０誘導ベクター（ＳＣ１０１レプリコン、スペクチノマイシン耐性マーカー）にクローン導入した。プラスミドは、ｐＮＨ３２８と名付けた（表５を参照）。
プラスミド形質転換に使用した基礎株は、Ｄ１７８株であった。簡単に述べると、Ｄ１７８株のゲノムを以下のとおり操作した：ｆａｄＥ（アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ）遺伝子を欠損させ、ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ（ｅｎｔＤ）を過剰発現させた。プラスミドｐＮＨ３２８を、Ｄ１７８に形質転換導入して、ｓｔＮＨ１３６９株を得た（上記表６を参照）。次いで、実施例１及び２に記載されるとおりに、株を培養し、脂肪アルコール及び１，３−ジオールを産生する能力について分析した。１，３−ジオールのピークを、実施例２に記載されるとおりに特定した。
ｓｔＮＨ１３６９株は、ＨＴＰ発酵プロトコルにおいて、６００±２７ｍｇ／Ｌの１，３−ジオールを産生した。産生された１，３−ジオールは、１，３−オクタンジオール、１，３−デカンジオール、１，３−ドデカンジオール、及び１，３テトラデカンジオールであった。１，３−ジオールの他に、ほんの微量の脂肪酸が検出された。１，３ジオールの分析では、それらが（Ｒ）鏡像異性体を非常に豊富に含むことが示される可能性があり、天然大腸菌脂肪酸生合成機構の３−ケトアシルＡＣＰレダクターゼ（ＦａｂＧ）のエナンチオ選択性を実証する。
実施例５：シネココッカス・エロンガタス由来のＡＡＲを含む経路を使用した、１，３−ジオールの産生
この実施例は、シネココッカス・エロンガタス由来の変異アシル−ＡＣＰレダクターゼであるＡＡＲ（ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＹＰ＿４００６１１；野生型）を含む代謝経路を使用した、組換え大腸菌での１，３−ジオール産生を示す。変異ＡＡＲ配列については、本明細書に添付される配列表を参照（以下）。
ＡＡＲ変異体（配列番号２）をコードする遺伝子を、その遺伝子の転写がＩＰＴＧ誘導性Ｐｔｒｃプロモーターにより制御され、かつその遺伝子がアルコールデヒドロゲナーゼａｌｒＡをコードする遺伝子とオペロンを形成するように、ｐＣＬ１９２０誘導ベクター（ＳＣ１０１レプリコン、スペクチノマイシン耐性マーカー）にクローン導入した。プラスミドは、ｐＮＴ１６と名付けた（表５を参照）。
プラスミド形質転換に使用した基礎株は、ＤＶ２であった。簡単に述べると、ＤＶ２株のゲノムを、ｆａｄＥ（アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ）遺伝子を欠損させることにより、操作した。プラスミドｐＮＴ１６を、ＤＶ２基礎株に形質転換導入して、Ｂｅｃｏｓ２４７株を得た（表６を参照）。次いで、実施例１及び２に記載されるとおりに、Ｂｅｃｏｓ２４７を培養し、脂肪アルコールを産生する能力について分析した。驚いたことに、この株は１，３−ジオールを産生した。１，３−ジオールのピークを、実施例２に記載されるとおりに特定した。
Ｂｅｃｏｓ２４７株は、５Ｌ発酵において、０．５７ｇ／Ｌの１，３−ジオールを産生し、これは産生された全脂肪酸種の９．１％を占めた。産生された１，３−ジオールは、１，３−ドデカンジオール、１，３テトラデセンジオール、及び１，３テトラデカンジオールであり、この他に、脂肪アルコール、デカノール、ドデセノール、ドデカノール、テトラデセノール、テトラデカノール、ヘキサデセノール、ヘキサデカノール、及びオクタデカノール、ならびに少量の脂肪酸が産生された。
この実験における、中間体として３−ＯＨ脂肪アルデヒドを介した１，３−ジオールの産生は、驚くべきものである（図３を参照）。なぜなら、この実施例で使用した、シネココッカス・エロンガタス由来の野生型ＡＡＲであるアシル−ＡＣＰレダクターゼは、大腸菌で以前に発現されており、アシル−ＡＣＰから脂肪アルコールを生じさせるのみであって、３−ＯＨアシル−ＡＣＰから１，３−ジオールを生じさせなかったことが報告されていたからである（Ｓｃｈｉｒｍｅｒ ｅｔ ａｌ． （２０１０） Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２９， ５５９）。１，３ジオールの分析では、それらが（Ｒ）鏡像異性体を非常に豊富に含むことが示される可能性があり、天然大腸菌脂肪酸生合成機構の３−ケトアシルＡＣＰレダクターゼ（ＦａｂＧ）のエナンチオ選択性を実証する。
実施例６Ａ：ウンベルラリア・カリフォルニカ由来のｆａｔＢ１、及びｃａｒＢを含む経路を使用した、１，３−ジオールの産生
この実施例は、ウンベルラリア・カリフォルニカ由来の植物チオエステラーゼｆａｔＢ１、及びマイコバクテリウム・スメグマチス由来のカルボン酸レダクターゼＣａｒＢを含む代謝経路を使用した組換え大腸菌での１，３−ジオール産生をどのように実証するかを説明する。
野生型ｃａｒＢ及びｆａｔＢ１をコードする遺伝子を、それら遺伝子の転写がＩＰＴＧ誘導性Ｐｔｒｃプロモーターにより制御され、かつそれら遺伝子がアルコールデヒドロゲナーゼａｌｒＡをコードする遺伝子とオペロンを形成するように、ｐＣＬ１９２０誘導ベクター（ＳＣ１０１レプリコン、スペクチノマイシン耐性マーカー）にクローン導入する。プラスミドを、ＤＶ２などの基礎株に形質転換導入する（実施例５を参照）。
次いで、実施例１及び２に記載されるとおりに、得られる株を培養し、脂肪アルコールを産生する能力について分析する。株は、１，３−ジオールを産生すると予想される。１，３ジオールの分析では、それらが（Ｒ）鏡像異性体を非常に豊富に含むことが示され、天然大腸菌脂肪酸生合成機構の３−ケトアシルＡＣＰレダクターゼ（ＦａｂＧ）のエナンチオ選択性を実証するであろう。
実施例６Ｂ：ウンベルラリア・カリフォルニカ由来のｆａｔＢ１、及びｃａｒＢを含む単純化された経路を使用した、１，３−ジオールの産生
この実施例は、ウンベルラリア・カリフォルニカ由来の植物チオエステラーゼｆａｔＢ１、及びマイコバクテリウム・スメグマチス由来のカルボン酸レダクターゼＣａｒＢを含む単純化された代謝経路を使用して、組換え大腸菌での１，３−ジオール産生をどのように実証するかを説明する。
野生型ｃａｒＢ及びｆａｔＢ１をコードする遺伝子を、それら遺伝子の転写がＩＰＴＧ誘導性Ｐｔｒｃプロモーターにより制御されるように、ｐＣＬ１９２０誘導ベクター（ＳＣ１０１レプリコン、スペクチノマイシン耐性マーカー）にクローン導入する。プラスミドを、ＤＶ２株などの基礎株に形質転換導入する（実施例５を参照）。
次いで、実施例１及び２に記載されるとおりに、得られる株を培養し、脂肪アルコール及びジオールを産生する能力について分析する。株は、１，３−ジオールを産生すると予想され、そのことは、チオエステラーゼ及びカルボン酸レダクターゼは、微生物細胞が１，３ジオールを産生できるようにするのに十分であることを実証する。１，３ジオールの分析から、それらが（Ｒ）鏡像異性体を非常に豊富に含むことが示され、天然大腸菌脂肪酸生合成機構の３−ケトアシルＡＣＰレダクターゼ（ＦａｂＧ）のエナンチオ選択性を実証するであろう。
実施例７：大腸菌由来のｔｅｓＡ、及びｃａｒＢを含む経路を使用した、１，３−ジオールの産生
この実施例は、チオエステラーゼｔｅｓＡ、及びマイコバクテリウム・スメグマチス由来のカルボン酸レダクターゼＣａｒＢを含む代謝経路を使用した組換え大腸菌での１，３−ジオール産生をどのように実証するかを説明する。
野生型ｃａｒＢ及び野生型ｔｅｓＡをコードする遺伝子を、それら遺伝子の転写がＩＰＴＧ誘導性Ｐｔｒｃプロモーターにより制御され、かつそれら遺伝子がアルコールデヒドロゲナーゼａｌｒＡをコードする遺伝子とオペロンを形成するように、ｐＣＬ１９２０誘導ベクター（ＳＣ１０１レプリコン、スペクチノマイシン耐性マーカー）にクローン導入する。プラスミドを、ＤＶ２株などの基礎株に形質転換導入する（実施例５を参照）。
次いで、実施例１及び２に記載されるとおりに、得られる株を培養し、脂肪アルコール及びジオールを産生する能力について分析する。株は、１，３−ジオールを産生すると予想され、そのことは、チオエステラーゼ及びカルボン酸レダクターゼは、微生物細胞が１，３ジオールを産生できるようにするのに十分であることを実証する。１，３ジオールの分析では、それらが（Ｒ）鏡像異性体を非常に豊富に含むことが示され、天然大腸菌脂肪酸生合成機構の３−ケトアシルＡＣＰレダクターゼ（ＦａｂＧ）のエナンチオ選択性を実証するであろう。
実施例８：シネココッカス・エロンガタス由来の野生型ＡＡＲを含む単純化された経路を使用した、１，３−ジオールの産生
この実施例は、シネココッカス・エロンガタス由来のアシル−ＡＣＰレダクターゼＡＡＲを含む代謝経路を使用した組換え大腸菌での１，３−ジオール産生をどのように実証するかを説明する。
野生型ＡＡＲをコードする遺伝子を、その遺伝子の転写がＩＰＴＧ誘導性Ｐｔｒｃプロモーターにより制御されるように、ｐＣＬ１９２０誘導ベクター（ＳＣ１０１レプリコン、スペクチノマイシン耐性マーカー）にクローン導入する。プラスミドを、ＤＶ２株などの基礎株に形質転換導入する（実施例５を参照）。
次いで、実施例１及び２に記載されるとおりに、得られる株を培養し、脂肪アルコール及びジオールを産生する能力について分析する。株は、１，３−ジオールを産生すると予想され、そのことは、ＡＡＲの異種産生は、微生物細胞が１，３ジオールを産生できるようにするのに十分であることを実証する。１，３ジオールの分析では、それらが（Ｒ）鏡像異性体を非常に豊富に含むことが示され、天然大腸菌脂肪酸生合成機構の３−ケトアシルＡＣＰレダクターゼ（ＦａｂＧ）のエナンチオ選択性を実証するであろう。
実施例９：シナモマム・カムフォラ由来のｆａｔＢ、及びｃａｒＢを含む経路を使用した、１，３−ジオールの産生
この実施例は、シナモマム・カムフォラ（Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍ ｃａｍｐｈｏｒａ）由来の植物チオエステラーゼｆａｔＢ、及びマイコバクテリウム・スメグマチス由来のカルボン酸レダクターゼｃａｒＢを含む代謝経路を使用した組換え大腸菌での１，３−ジオール産生をどのように実証するかを説明する。
野生型ｃａｒＢ及びシナモマム・カムフォラ由来のｆａｔＢをコードする遺伝子を、それら遺伝子の転写がＩＰＴＧ誘導性Ｐｔｒｃプロモーターにより制御され、かつそれら遺伝子がアルコールデヒドロゲナーゼａｌｒＡをコードする遺伝子とオペロンを形成するように、ｐＣＬ１９２０誘導ベクター（ＳＣ１０１レプリコン、スペクチノマイシン耐性マーカー）にクローン導入する。プラスミドを、ＤＶ２株などの基礎株に形質転換導入する（実施例５を参照）。
次いで、実施例１及び２に記載されるとおりに、得られる株を培養し、脂肪アルコール及びジオールを産生する能力について分析する。株は、１，３−ジオールを産生すると予想され、そのことは、チオエステラーゼ及びカルボン酸レダクターゼは、微生物細胞が１，３ジオールを産生できるようにするのに十分であることを実証する。１，３ジオールの分析では、それらが（Ｒ）鏡像異性体を非常に豊富に含むことが示され、天然大腸菌脂肪酸生合成機構の３−ケトアシルＡＣＰレダクターゼ（ＦａｂＧ）のエナンチオ選択性を実証するであろう。
実施例１０：アシネトバクター・バイリイ由来のａｃｒ１を含む経路を使用した、１，３−ジオールの産生
この実施例は、アシネトバクター・バイリイ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｙｌｙｉ）由来の脂肪アシル−ＣｏＡレダクターゼａｃｒ１（ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ４５２１７）を含む代謝経路を使用した組換え大腸菌での１，３−ジオール産生をどのように実証するかを説明する。
ａｃｒ１をコードする遺伝子を、その遺伝子の転写がＩＰＴＧ誘導性Ｐｔｒｃプロモーターにより制御され、かつその遺伝子がアシル−ＣｏＡシンセターゼ（ｆａｄＤ）及びチオエステラーゼをコードする遺伝子とオペロンを形成するように、ｐＣＬ１９２０誘導ベクター（ＳＣ１０１レプリコン、スペクチノマイシン耐性マーカー）にクローン導入する。プラスミドを、ＤＶ２株などの基礎株に形質転換導入する（実施例５を参照）。
次いで、実施例１及び２に記載されるとおりに、得られる株を培養し、脂肪アルコール及びジオールを産生する能力について分析する。株は、１，３−ジオールを産生すると予想される。
実施例１１：マリノバクター・アクアエオレイ由来のＦＡＲを含む経路を使用した、１，３−ジオールの産生
この実施例は、マリノバクター・アクアエオレイ（Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ ａｑｕａｅｏｌｅｉ）由来の脂肪アシル−ＡＣＰレダクターゼＦＡＲ（ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＹＰ＿９５９４８６）を含む代謝経路を使用した組換え大腸菌での１，３−ジオール産生をどのように実証するかを説明する。
野生型ＦＡＲをコードする遺伝子を、その遺伝子の転写がＩＰＴＧ誘導性Ｐｔｒｃプロモーターにより制御されるように、ｐＣＬ１９２０誘導ベクター（ＳＣ１０１レプリコン、スペクチノマイシン耐性マーカー）にクローン導入する。プラスミドを、ＤＶ２株などの基礎株に形質転換導入する（実施例５を参照）。
次いで、実施例１及び２に記載されるとおりに、得られる株を培養し、脂肪アルコール及びジオールを産生する能力について分析する。株は、１，３−ジオールを産生すると予想され、そのことは、異種産生されたＦＡＲは、細胞が１，３ジオールを産生できるようにするのに十分であることを実証する。
実施例１２：フォトラブダス・ルミネッセンス由来のＦＡＲ複合体を含む経路を使用した、１，３−ジオールの産生
この実施例は、フォトラブダス・ルミネッセンス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ）由来の、ＬｕｘＣ、ＬｕｘＤ、及びＬｕｘＥを含む脂肪アシル−ＡＣＰレダクターゼＦＡＲ複合体（ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＨＨ２５０１５〜１７）を含む代謝経路を使用した組換え大腸菌での１，３−ジオール産生をどのように実証するかを説明する。
ＬｕｘＣ、ＬｕｘＤ、及びＬｕｘＥをコードする遺伝子を、それら遺伝子の転写がＩＰＴＧ誘導性Ｐｔｒｃプロモーターにより制御され、かつそれら遺伝子がアルコールデヒドロゲナーゼａｌｒＡをコードする遺伝子とオペロンを形成するように、ｐＣＬ１９２０誘導ベクター（ＳＣ１０１レプリコン、スペクチノマイシン耐性マーカー）にクローン導入する。プラスミドを、ＤＶ２株などの基礎株に形質転換導入する（実施例５を参照）。
次いで、実施例１及び２に記載されるとおりに、得られる株を培養し、脂肪アルコール及びジオールを産生する能力について分析する。株は、１，３−ジオールを産生すると予想される。
実施例１３：ｆａｄＢ（Ｈｉｓ４５０Ｇｌｎ）を用いた３−（Ｓ）−脂肪ジオールの産生
この実施例は、アシネトバクター・バイレイ由来の、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ活性を保持しているがデヒドロゲナーゼ活性を欠いており、脂肪アシル−ＣｏＡレダクターゼａｃｒ１を発現する３−ヒドロキシ−アシル−ＡＣＰアシル−ＣｏＡトランスアシラーゼまたはチオエステラーゼｆａｄＢ（Ｈｉｓ４５０Ｇｌｎ）（ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ４５２１７）を含む代謝経路を使用した組換え大腸菌での３−（Ｓ）−脂肪ジオール産生をどのように実証するかを説明する。
‘ＴｅｓＡ、ＦａｄＤ、ＦａｄＢ（Ｈｉｓ４５０Ｇｌｎ）及びＡｃｒ１をコードする遺伝子を、それら遺伝子の転写がＩＰＴＧ誘導性Ｐｔｒｃプロモーターにより制御され、かつそれら遺伝子が脂肪アルコールの合成に十分なオペロンを完成させるように、ｐＣＬ１９２０誘導ベクター（ＳＣ１０１レプリコン、スペクチノマイシン耐性マーカー）にクローン導入する。プラスミドを、ＭＧ１６５５株などの基礎株に形質転換導入する（実施例５を参照）が、その株には、ＦａｄＥをコードする追加遺伝子を、ＩＰＴＧ誘導性Ｐｔｒｃプロモーターの制御下にあるゲノムに導入しておく。
次いで、実施例１及び２に記載されるとおりに、得られる株を培養し、脂肪アルコール及びジオールを産生する能力について分析する。株は、３−（Ｓ）−脂肪ジオールを産生すると予想される。
実施例１４．ｆａｄＢ（Ｇｌｕ１１９Ｇｌｎ）を用いた３−（Ｓ）−脂肪ジオールの産生
この実施例は、アシネトバクター・バイレイ由来の、デヒドロゲナーゼ活性を保持しているがデヒドラターゼ活性を欠いており、脂肪アシル−ＣｏＡレダクターゼａｃｒ１を発現する３−ヒドロキシ−アシル−ＡＣＰアシル−ＣｏＡトランスアシラーゼまたはチオエステラーゼｆａｄＢ（Ｇｌｕ１１９Ｇｌｎ）（ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ４５２１７）を含む代謝経路を使用した組換え大腸菌での３−（Ｓ）−脂肪ジオール産生をどのように実証するかを説明する。
‘ＴｅｓＡ、ＦａｄＤ、ＦａｄＢ（Ｇｌｕ１１９Ｇｌｎ）、及びＡｃｒ１をコードする遺伝子を、それら遺伝子の転写がＩＰＴＧ誘導性Ｐｔｒｃプロモーターにより制御され、かつそれら遺伝子が脂肪アルコールの合成に十分なオペロンを完成させるように、ｐＣＬ１９２０誘導ベクター（ＳＣ１０１レプリコン、スペクチノマイシン耐性マーカー）にクローン導入する。プラスミドを、ＭＧ１６５５株などの基礎株に形質転換導入する（実施例５を参照）が、その株には、ＦａｄＡをコードする追加遺伝子を、ＩＰＴＧ誘導性Ｐｔｒｃプロモーターの制御下にあるゲノムに導入しておく。
次いで、実施例１及び２に記載されるとおりに、得られる株を培養し、脂肪アルコール及びジオールを産生する能力について分析する。株は、３−（Ｓ）−脂肪ジオールを産生すると予想される。
上記の態様及び実施形態には、本開示の精神及び範囲から逸脱することなく様々な変更及び改変を行うことができる。そのような変更及び改変は、本開示の範囲内にある。

Claims (21)

  1. 単純炭素源を含む発酵ブロスで増殖させた場合に１，３脂肪ジオールを産生させるための組換え大腸菌であって、
    前記組換え大腸菌が、
    （ａ）チオエステラーゼ（ＥＣ３．１．２．−、ＥＣ３．１．１．５、またはＥＣ３．１．２．１４）活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列；及び
    （ｂ）カルボン酸レダクターゼ（ＥＣ６．２．１．３またはＥＣ１．２．１．４２）活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列
    を発現するように操作されており、
    前記チオエステラーゼが、ｆａｔＢ１、ｆａｔＢ２、ｆａｔＢ、ｆａｔＡ１、ｆａｔＡ、ｆａｔＢ３、ＴＥ＿ＥＥＩ８２５６４、ＴＥ＿ＣＡＤ６３３１０、及びｐｈａＧからなる群より選択され、
    前記チオエステラーゼが、基質として３−ヒドロキシアシル−ＡＣＰを使用し、
    前記カルボン酸レダクターゼが、配列番号：４、配列番号：６、及び配列番号：８からなる群より選択されるマイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）由来の変異体ｃａｒＢであり、かつ
    前記１，３脂肪ジオールが、Ｃ８ １，３脂肪ジオール、Ｃ９ １，３脂肪ジオール、Ｃ１０ １，３脂肪ジオール、Ｃ１１ １，３脂肪ジオール、Ｃ１２ １，３脂肪ジオール、Ｃ１３ １，３脂肪ジオール、Ｃ１４ １，３脂肪ジオール、Ｃ１５ １，３脂肪ジオール、Ｃ１６ １，３脂肪ジオール、Ｃ１７ １，３脂肪ジオール、Ｃ１８ １，３脂肪ジオール、及びＣ１９ １，３脂肪ジオールからなる群より選択される、
    前記組換え大腸菌。
  2. 前記１，３脂肪ジオールがインビボで産生される、請求項１に記載の組換え大腸菌。
  3. アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．−）活性を含むポリペプチドをコードする核酸配列をさらに発現する、請求項１に記載の組換え大腸菌。
  4. 前記単純炭素源が、再生可能な原料に由来する、請求項１に記載の組換え大腸菌。
  5. 前記アルコールデヒドロゲナーゼが、ａｌｒＡである、請求項３に記載の組換え大腸菌。
  6. 請求項１から５のいずれか一項に記載の大腸菌を含む、細胞培養物。
  7. １，３脂肪ジオールを産生する、請求項６に記載の細胞培養物。
  8. 請求項１に記載の大腸菌を培養する工程を含む、１，３脂肪ジオールの産生方法。
  9. （ａ）発酵ブロス中に組換え大腸菌を用意する工程であって、前記組換え大腸菌が、チオエステラーゼ（ＥＣ３．１．２．−、ＥＣ３．１．１．５、またはＥＣ３．１．２．１４）活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列；及びカルボン酸レダクターゼ（ＥＣ６．２．１．３またはＥＣ１．２．１．４２）活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列；及び任意選択でアルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．−）活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を発現する、前記工程；ならびに
    （ｂ）前記発酵ブロスから１，３脂肪ジオールを単離する工程であって、前記発酵ブロスが単純炭素源を含む、前記工程
    を含む、１，３脂肪ジオールの産生方法であって、
    前記チオエステラーゼが、ｆａｔＢ１、ｆａｔＢ２、ｆａｔＢ、ｆａｔＡ１、ｆａｔＡ、ｆａｔＢ３、ＴＥ＿ＥＥＩ８２５６４、ＴＥ＿ＣＡＤ６３３１０、及びｐｈａＧからなる群より選択され、
    前記チオエステラーゼが、基質として３−ヒドロキシアシル−ＡＣＰを使用し、
    前記カルボン酸レダクターゼが、配列番号：４、配列番号：６、及び配列番号：８からなる群より選択されるマイコバクテリウム・スメグマチス由来の変異体ｃａｒＢであり、かつ
    前記１，３脂肪ジオールが、Ｃ８ １，３脂肪ジオール、Ｃ９ １，３脂肪ジオール、Ｃ１０ １，３脂肪ジオール、Ｃ１１ １，３脂肪ジオール、Ｃ１２ １，３脂肪ジオール、Ｃ１３ １，３脂肪ジオール、Ｃ１４ １，３脂肪ジオール、Ｃ１５ １，３脂肪ジオール、Ｃ１６ １，３脂肪ジオール、Ｃ１７ １，３脂肪ジオール、Ｃ１８ １，３脂肪ジオール、及びＣ１９ １，３脂肪ジオールからなる群より選択される、
    前記方法。
  10. 単純炭素源を含む発酵ブロスで増殖させた場合に１，３脂肪ジオールを産生させるための組換え大腸菌であって、
    前記組換え大腸菌が、アシル−ＡＣＰレダクターゼ（ＥＣ１．２．１．８０またはＥＣ１．２．１．４２）活性を含むポリペプチドをコードする核酸配列を発現するように操作されており、
    前記アシル−ＡＣＰレダクターゼが、配列番号：２を有するシネココッカス・エロンガタス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｕｓ）由来の変異体アシル−ＡＣＰレダクターゼであり、かつ
    前記１，３脂肪ジオールが、Ｃ８ １，３脂肪ジオール、Ｃ９ １，３脂肪ジオール、Ｃ１０ １，３脂肪ジオール、Ｃ１１ １，３脂肪ジオール、Ｃ１２ １，３脂肪ジオール、Ｃ１３ １，３脂肪ジオール、Ｃ１４ １，３脂肪ジオール、Ｃ１５ １，３脂肪ジオール、Ｃ１６ １，３脂肪ジオール、Ｃ１７ １，３脂肪ジオール、Ｃ１８ １，３脂肪ジオール、及びＣ１９ １，３脂肪ジオールからなる群より選択される、
    前記組換え大腸菌。
  11. アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．−）活性を含むポリペプチドをコードする核酸配列をさらに発現する、請求項１０に記載の組換え大腸菌。
  12. 前記１，３脂肪ジオールがインビボで産生される、請求項１０に記載の組換え大腸菌。
  13. 前記１，３脂肪ジオールが、Ｃ１２ １，３脂肪ジオールである、請求項１２に記載の組換え大腸菌。
  14. 前記単純炭素源が、再生可能な原料に由来する、請求項１０に記載の組換え大腸菌。
  15. 請求項１０から１４のいずれか一項に記載の大腸菌を含む、細胞培養物。
  16. １，３脂肪ジオールを産生する、請求項１５に記載の細胞培養物。
  17. 請求項１０に記載の大腸菌を培養する工程を含む、１，３脂肪ジオールの産生方法。
  18. （ａ）発酵ブロス中に組換え大腸菌を用意する工程であって、前記組換え大腸菌が、アシル−ＡＣＰレダクターゼ（ＥＣ１．２．１．８０またはＥＣ１．２．１．４２）活性を含むポリペプチドをコードする核酸配列を発現するように操作され、前記アシル−ＡＣＰレダクターゼが、配列番号：２を有するシネココッカス・エロンガタス由来の変異体アシル−ＡＣＰレダクターゼである、前記工程；及び
    （ｂ）前記発酵ブロスから１，３脂肪ジオールを単離する工程であって、前記発酵ブロスが単純炭素源を含み、前記１，３脂肪ジオールが、Ｃ８ １，３脂肪ジオール、Ｃ９ １，３脂肪ジオール、Ｃ１０ １，３脂肪ジオール、Ｃ１１ １，３脂肪ジオール、Ｃ１２ １，３脂肪ジオール、Ｃ１３ １，３脂肪ジオール、Ｃ１４ １，３脂肪ジオール、Ｃ１５ １，３脂肪ジオール、Ｃ１６ １，３脂肪ジオール、Ｃ１７ １，３脂肪ジオール、Ｃ１８ １，３脂肪ジオール、及びＣ１９ １，３脂肪ジオールからなる群より選択される、前記工程
    を含む、１，３脂肪ジオールの産生方法。
  19. アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．−）活性を含むポリペプチドをコードする核酸配列をさらに発現する、請求項１８に記載の方法。
  20. ｆａｔＢ１が、ウンベルラリア・カリフォルニカ（Ｕｍｂｅｌｌｕｌａｒｉａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）に由来し；ｆａｔＢ２が、クフェア・フーケリアナ（Ｃｕｐｈｅａ ｈｏｏｋｅｒｉａｎａ）に由来し；ｆａｔＢ３が、クフェア・フーケリアナに由来し；ｆａｔＢが、シナモマム・カムフォラ（Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍ ｃａｍｐｈｏｒａ）に由来し；ｆａｔＡ１が、ヘリアンタス・アヌウス（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ）に由来し；ｆａｔＡが、アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）、ブラシカ・ユンケア（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｊｕｎｃｅａ）、クフェア・フーケリアナに由来し；ｐｈａＧが、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）に由来する、請求項１に記載の組換え大腸菌。
  21. ｆａｔＢ１が、ウンベルラリア・カリフォルニカに由来し；ｆａｔＢ２が、クフェア・フーケリアナに由来し；ｆａｔＢ３が、クフェア・フーケリアナに由来し；ｆａｔＢが、シナモマム・カムフォラに由来し；ｆａｔＡ１が、ヘリアンタス・アヌウスに由来し；ｆａｔＡが、アラビドプシス・タリアナ、ブラシカ・ユンケア、クフェア・フーケリアナに由来し；ｐｈａＧが、シュードモナス・プチダに由来する、請求項９に記載の方法。
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