DE69534785T3

DE69534785T3 - Pflanzen lysophosphatidesäure-acyltransferase

Info

Publication number: DE69534785T3
Application number: DE69534785T
Authority: DE
Inventors: Maelor Huw Davis DAVIES; Deborah Davis HAWKINS; Janet Davis NELSEN; Michael Davis LASSNER
Original assignee: Calgene LLC
Current assignee: Monsanto Co
Priority date: 1994-04-06
Filing date: 1995-03-31
Publication date: 2010-02-18
Anticipated expiration: 2015-04-01
Also published as: ATE317903T1; EP0754232B1; CA2186607C; EP0754232B2; CA2186607A1; EP0754232A1; DE69534785T2; JPH09511650A; US5910630A; DE69534785D1; US5968791A; WO1995027791A1

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft Proteinpräparate, Aminosäure- und Nucleinsäuresequenzen und -konstrukte und damit zusammenhängende Verfahren.
EINFÜHRUNG
Hintergrund
Es besteht ein Bedarf an verbesserten Mitteln zum Erhalt oder zur Manipulation von Fettsäure-Zusammensetzungen aus biosynthetischen oder natürlichen pflanzlichen Quellen. Zum Beispiel sind neue Ölprodukte, verbesserte Quellen für synthetische Triacylglycerine (Triglyceride), alternative Quellen für kommerzielle Öle wie tropische Öle (d. h. Palmkern- und Kokosöl) und Pflanzenöle, die in Spurenmengen in natürlichen Quellen gefunden werden, für eine Vielzahl von industriellen und Nahrungsmittel-Verwendungen erwünscht.
Dahingehend ist das Triacylglycerin-(TAG-)Biosynthesesystem in Pflanzen und Bakterien untersucht worden. In den Cytoplasmamembranen von Samengeweben von Pflanzen, in denen Speicher-Triglyceride (”Öl”) gesammelt sind, sind Fettacylgruppen an der sn-2-Position der Triglyceridmoleküle mittels der Wirkung des Enzyms 1-Acylglycerin-3-phosphatacyltransferase (E.C. 2.3.1.51), auch als Lysophosphatidsäure-Acyltransferase oder LPAAT bekannt, eingearbeitet.
Durch eine Untersuchung der LPAAT-Aktivitäten in isolierten Membranen aus Samengewebe ist gezeigt worden, dass LPAAT-Spezifitäten nach der Arten der Fettsäureacylgruppen, die in der sn-2-Position der entsprechenden Speicheröle gefunden werden, von Spezies zu Spezies variieren. Zum Beispiel ist es bei den Samen der Spezies Cuphea, die Fettsäuren mit mittleren Ketten enthaltende Öle ansammelt, möglich, eine LPAAT-Aktivität zu zeigen, bei der ein Acyl-CoA-Substrat mit mittleren Ketten und ein Lysophosphatidsäure(LPA-)Substrat genutzt werden. Im Gegensatz dazu werden bei der LPAAT-Aktivität aus den Membranen von Raps-Embryos, bei denen das Öl Fettsäuren mit einer längeren Kette enthält, diese Substrate mit mittleren Ketten viel weniger leicht verwendet und hauptsächlich ungesättigte Fettsäuren mit langen Ketten verwendet. Auf vergleichbare Weise sammelt die Sumpfblumenpflanze (Limnanthes alba) ein Öl, das Erucasäure (22:1) in allen drei sn-Positionen enthält und eine Samen-LPAAT-Aktivität hat, die zur Verwendung von 22:1-CoA und 22:1-LPA fähig ist, während Raps, der diese Fettsäure nicht ansammelt, wenig oder gar keine solche 22:1-nutzende LPAAT hat.
Ähnliche Untersuchungen mit den Enzymen, die für die sn-1- und die sn-3-Acylierungen verantwortlich sind, zeigen, dass sie mit Hinsicht auf die Kettenlängen des Substrats viel weniger selektiv sind. Somit werden für ein spezielles Speicher-Triglycerid in einer gegebenen Pflanze die Typen der Fettacylgruppen, die in der sn-2-Position des Öls gefunden werden, hauptsächlich von der Spezifität von LPAAT mit Hinblick auf ihre Acyl-Donorsubstrate, d. h. Acyl-CoA, bestimmt. Darüber hinaus wird die Selektivität der LPAAT bezüglich der Acyl-CoA auch von der Beschaffenheit der bereits an der sn-1-Position der Akzeptorsubstrate gebundenen Acylgruppe, d. h. dem 1-Acylglycerin-3-phosphat- oder dem Lysophosphatidsäure-(LPA-)Molekül, beeinflusst.
Die Charakterisierung der (auch als LPAAT bekannten) Lysophosphatidsäure-Acyltransferase ist für die weitere Untersuchung von Pflanzen-FAS-Systemen und zur Entwicklung neuer und/oder alternativer Ölquellen brauchbar. Untersuchungen von Pflanzenmechanismen können Mittel für die weitere Verstärkung, Steuerung, Modifizierung oder anderen Änderung der gesamten Fettacyl-Zusammensetzung von Triglyceriden und Ölen ergeben. Weiterhin ist eine Aufklärung des (der) für die natürliche Produktion von Triglyceriden in Pflanzen kritischen Faktors (Faktoren) einschließlich der Reinigung solcher Faktoren und der Charakterisierung des Elements (von Elementen) und/oder Cofaktoren, die die Effizienz des Systems verstärken, erwünscht. Von speziellem Interesse sind die Nucleinsäure-Sequenzen von Genen, die Proteine codieren, die für Anwendungen in der Gentechnik brauchbar sein können.
Literatur
In veröffentlichten Charakterisierungen von Acyltransferase-Spezifitäten in Raps-Membranen ist aufgeführt, dass eine Diskriminierung von Acylgruppen hauptsächlich bei der sn-2-Acylierung (Oo et al., Plant Physiol. (1989) 91: 1288–1295; Bernerth et al., Plant Sci. (1990) 67: 21–28) erfolgt.
Coleman (Mol. Gen. Genet. (1992) 232: 295–303) berichtet von der Charakterisierung eines LPAAT codierenden E.-coli-Gens (plsC). Die E.-coli-LPAAT ist dazu fähig, entweder Acyl-CoA oder Acyl-ACP als Fettacyl-Donorsubstrat zu verwenden.
Rares & Frentzen (Planta (1991) 185: 124–131) berichten von einer Löslichmachung und partiellen Reinigung einer lange Ketten bevorzugenden LPAAT aus endoplasmatischem Retikulum in Erbsenschösslingen. Die behauptete Löslichmachung basiert ausschließlich auf der Unfähigkeit zur Sedimentierung der LPAAT-Aktivität durch eine Zentrifugation mit hoher Drehzahl.
Wolter et al. (Fat Sci. Technol. (1991) 93: 288–290) berichten über vergebliche Versuche zur Reinigung einer Acyltransferase von Limnanthes douglasii, die die Acylierung von Erucasäure an der sn-2-Position des Glycerin-Rückgrats katalysiert, und schlagen hypothetische Methoden zur Genisolierung auf der Grundlage der Expression von cDNA in Mikroorganismen vor.
Nagiec et al. (J. Biol. Chem. (1993) 268: 22156–22163) berichten über das Klonen eines SLCI-(Sphingolipid-Kompensations-)Gens aus Hefe und berichten über eine Homologie des codierten Proteins mit dem LPAAT-Protein von E. coli.
Taylor et al. berichten (in ”Seed Oils for the Future”, Hrsg. Mackenzie & Taylor (1992) (AOCS Press) über Acylspezifitäten für 18:1-CoA- und 22:1-CoA-Substrate für LPAAT von mehreren Pflanzenspezies und diskutieren Versuche zur Reinigung einer LPAAT von B. napus.
Slabas et al. (Kap. 5, S. 81–95 (1993) in Seed Storage Compounds: Biosynthesis, Interactions and Manipulation, Hrsg. Shewry & Stobart, Clarendon Press) diskutieren Versuche zur Reinigung von Pflanzen-LPAAT-Proteinen und bemerken, dass alle Versuche zur Reinigung von LPAAT bis zur Homogenität misslungen sind.
Versuche zum Klonen eines Mais-LPAAT-Gens durch eine Komplementierung einer E.-coli-Mutation bei plsC werden auch diskutiert.
Oo et al. (Plant Physiol. (1989) 91: 1288–1295) berichten über die Charakterisierung von LPAAT-Spezifitäten in Membranpräparaten aus Palmen-Endosperm, Mais-Scutellum und Raps-Keimblatt.
Cao et al. (Plant Physiol. (1990) 94: 1199–1206) berichten über die Charakterisierung der LPAAT-Aktivität bei reifenden Samen der Sumpfblume, der Brunnenkresse, der Palme, des Ricinus, der Sojabohne, des Mais und des Raps. Die LPAAT-Aktivität wurde hinsichtlich der 22:1- und der 18:1-LPA- und der Acyl-COA-Substrate charakterisiert.
Laurent und Huang (Plant Physiol. (1992) 99: 1711–1715) berichten, dass LPAAT in der Palme und in der Brunnenkresse, die dazu fähig sind, 12:0- und 22:1-Acyl-CoA-Substrate auf die sn-2-Position von LPA zu übertragen, auf die ölansammelnden Samengewebe beschränkt sind.
Bafor et al. (Phytochemistry (1990) 31: 2973–2976) berichten über Substratspezifitäten von TAG-Biosynthese-Enzymen einschließlich LPAAT von Cuphea procumbens und C. wrighti.
Bafor et al. (Biochem. J. (1990) 272: 31–38) berichten über Ergebnisse von Untersuchungen zur Regulierung der TAG-Biosynthese in Embryos von Cuphea lanceolata. Ergebnisse für Assays der LPAAT-Aktivität in mikrosomalen Präparaten aus sich entwickelnden Kotyledonen werden vorgelegt.
Frentzen et al. (Eur. J. Biochem. (1990) 187: 389–402) berichten über die Charakterisierung der mitochondrialen LPAAT-Aktivität in Kartoffelknollen und Erbsenblättern.
Hanke & Frentzen berichteten beim Congress an Plant Lipides, Paris, 1. Juli 1994, über den Erhalt eines Sumpfblumen-Klons von 1030 bp, der ein potenzielles Protein von 31 kDa codiert. Es wurde keine Sequenz gezeigt, wobei sie aber auf eine ”wesentliche” Ähnlichkeit zu E. coli plsC hindeuteten und dass diese Übereinstimmung viel besser als mutmaßliche Hefe-LPAAT sei. Der Klon soll aus einer sich entwickelnden Samen-cDNA-Bank in Komplementationsuntersuchungen mit einer LPAAT-Mutante von E.-coli erhalten worden sein. Es wurde auch berichtet, dass ihr Klon eine höhere Präferenz für 22:1-CoA als für 18:1-CoA als Acyldonor aufwies und dass eine Northern-Analyse eine Expression im Sumpfblumen-Embryo und nicht in Blättern zeigte. Brown & Slabas zeigten auf dem 4th International Congress of Plant Molecular Biology, Amsterdam, 19. Juni 1994, eine partielle Aminosäuresequenz, von der berichtet wurde, dass es sich um ein Mais-LPAAT handelte, die unter Verwendung einer Maisembryo-Kultur-cDNA zur Komplementierung der Mutation der LPAAT von E. coli erhalten worden war. Es wurde berichtet, dass die Molmasse des Proteins etwa 45 kDa beträgt, wobei Homologien zu E.-coli-plsC und Hefe-AT vorliegen. Siehe auch WO 94/13814 , veröffentlicht am 23. Juni 1994, worin eine Sequenz aufgeführt ist, die als die cDNA-Sequenz von Mais-2-Acyltransferase gekennzeichnet ist.
KURZBESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 zeigt die Auswirkung der Sojabohnen-Phospholipid-Konzentration auf die Aktivität von Kokosnuss-LPAAT für mittlere Ketten (Assay des Präparats S3).
2 zeigt die Ergebnisse der Chromatographie des Lorbeer-Präparats P2 an einer Säule mit Sephacryl S400.
3 zeigt die Ergebnisse einer gemäß Frentzen et al. hergestellten Überstand-Fraktion von Lorbeer, die an einer Säule mit Sephacryl S400 chromatographiert wurde.
4 zeigt die Ergebnisse der Chromatographie des Lorbeer-Präparats S3 an einer Säule mit Superose 6.
5 ergibt eine Demonstration der Auswirkungen der Löslichmachung anhand der CHAPS-Konzentration und dem Detergens/Protein-Verhältnis (D/P), gemessen durch die Ausbeute der Aktivität von Kokosnuss-LPAAT für mittlere Ketten im Präparat S3. Wie in der Legende aufgeführt ist, ist das CHAPS jeweils konstant. Die Proteinkonzentration wird variiert. Die Daten sind für 1 mg des Proteins P2 normalisiert. Die Aktivität von unbehandeltem P2 beträgt 1635 PA kcpm/mg Protein.
6 zeigt die Chromatographie des Kokosnuss-Präparats S3 auf roter 120-Agarose.
7 zeigt die Ergebnisse der Chromatographie der Aktivität von Kokosnuss-LPAAT für mittlere Ketten aus der roten 120-Säule an einer Säule mit Hydroxylapatit.
8 zeigt die Ergebnisse partiell gereinigter Präparate von Kokosnuss-LPAAT für mittlere Ketten, die durch eine 12:0-CoA-Chromatographie-Säule geleitet wurden.
9 zeigt die Ergebnisse der Chromatographie partiell gereinigter, PL-aktivierter Präparate von Kokosnuss-LPAAT für mittlere Ketten an einer 12:0-CoA-Säule in Gegenwart von Phospholipiden.
In 10 sind die DNA-Sequenz und die translatierte Aminosäuresequenz eines Klons, 23-2 (SEQ ID Nr.: 18), der eine mittels PCR erhaltene, Kokosnuss-LPAAT codierende Sequenz enthält, aufgeführt.
In 11 sind die DNA-Sequenz und die translatierte Aminosäuresequenz eines Klons, 23-4 (SEQ ID Nr.: 19), der eine mittels PCR erhaltene, Kokosnuss-LPAAT codierende Sequenz enthält, aufgeführt.
In 12 sind die DNA-Sequenz und die translatierte Aminosäuresequenz eines Klons, 10-1 (SEQ ID Nr.: 20), der eine mittels PCR erhaltene, Kokosnuss-LPAAT codierende Sequenz enthält, aufgeführt.
In 13 sind die DNA-Sequenz und die translatierte Aminosäuresequenz eines Klons von Kokosnuss-LPAAT der vollen Länge (SEQ ID Nr.: 21), COLP4 (pCGN5503) aufgeführt.
In 14 sind die DNA-Sequenz und die translatierte Aminosäuresequenzen eines Klons, MeadLPAAT 15 (SEQ ID Nr.: 22), der eine mittels PCR erhaltene, Sumpfblumen-LPAAT codierende Sequenz enthält, aufgeführt.
In 15 sind die DNA-Sequenz und die translatierte Aminosäuresequenzen eines Klons, MeadLPAAT 20 (SEQ ID Nr.: 23), der eine mittels PCR erhaltene, Sumpfblumen-LPAAT codierende Sequenz enthält, aufgeführt.
In 16 ist ein Vergleich translatierter Aminosäuresequenzen der Klone COLP4, MeadLPAAT 15 und MeadLPAAT 20 aufgeführt.
In 17 sind die DNA-Sequenz und die translatierte Aminosäuresequenzen des Sumpfblumen-LPAAT-cDNA-Klons Melp2 (SEQ ID Nr.: 41) aufgeführt.
In 18 sind die DNA-Sequenz und die translatierte Aminosäuresequenzen des Sumpfblumen-LPAAT-cDNA-Klons Melp4 (SEQ ID Nr.: 42) aufgeführt.
KURZBESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft Pflanzenproteine, die die Erzeugung von 1,2-Diacylglycerin-3-phosphat aus 1-Acylglycerin-3-phosphat (auch als Lysophosphatidsäure oder LPA bezeichnet) und einem Acyl-CoA-Substrat katalysieren. Solche Proteine werden hier als 1-Acylglycerin-3-phosphat-Acyltransferasen (E.C. 2.3.1.51) oder LPAAT bezeichnet. Insbesondere sind die LPAAT-Proteine dieser Erfindung dadurch gekennzeichnet, dass sie:

(i) frei von Cytoplasmamembranen der Pflanze sind;
(ii) eine bevorzugte Aktivität gegenüber einem Acyl-CoA-Donorsubstrat im Vergleich zu einem Acyl-ACP-Donorsubstrat aufweisen und
(iii) eine Pflanzen-1-Acylglycerin-3-phosphat-Acyltransferase sind, die die durch die 10, 11, 12, 14 oder 15 dargestellten Aminosäuresequenzen umfasst, oder eine Pflanzen-1-Acylglycerin-3-phosphat-Acyltransferase sind, die von einer Polynucleotidsequenz codiert wird, die durch Hybridisierung mit einer Polynucleotidsequenz isolierbar ist, welche die Aminosäuresequenzen von 10, 11, 12, 14 oder 15 codiert, wobei die Pflanzen-1-Acylglycerin-3-phosphat-Acyltransferase die folgenden Peptide umfasst: (a) FPEGTRS, (b) GRLLPFKKGF, (c) LTGTHLAW und (d) PITVKY, mit der Maßgabe, dass die Sequenz nicht die folgende Sequenz ist:

Mittels dieser Erfindung kann jetzt eine neue Klasse von Pflanzen-LPAAT-Proteinen, die im Wesentlichen von den Cytoplasma-Membranen ihres nativen Pflanzenwirtes gereinigt sind, jetzt mit Hinblick auf die bevorzugte Substrataktivität charakterisiert werden. Insbesondere wird die Reinigung eines Pflanzen-LPAAT-Enzyms mit einer bevorzugten Aktivität gegenüber Acyl-CoA-Substraten mit mittleren Ketten verfügbar gemacht.
Eine mittlere Ketten bevorzugende LPAAT dieser Erfindung weist eine Präferenz für Acyl-CoA-Donorsubstrate mit mittleren Ketten unabhängig davon auf, ob der LPA-Akzeptor eine Acylgruppe mit mittlerer Kette (wie C12:0) an der sn-1-Position oder eine Acylgruppe mit langer Kette (wie C18:1) an der sn-1-Position enthält. Ein Kokosnuss-Endosperm-Acyl-CoA mit mittleren Ketten bevorzugendes LPAAT-Enzym ist hier veranschaulicht. Lauroyl-CoA ist ein bevorzugtes Donorsubstrat, wenn das Akzeptorsubstrat entweder 1-Lauroylglycerin-3-phosphat oder 1-Oleoylglycerin-3-phosphat ist. Darüber hinaus weist die Kokosnuss-LPAAT auch eine bevorzugte Aktivität an anderen Acyl-CoA-Substraten mit mittleren Ketten, insbesondere denjenigen mit C10- oder C14-Kohlenstoffketten, im Vergleich zu (C16- oder C18-)Substraten mit einer größeren Kettenlänge auf.
Die veranschaulichte Kokosnuss-LPAAT wird von den Membranen gereinigt (d. h. löslich gemacht), und dann wird das löslich gemachte LPAAT-Präparat verschiedenen chromatographischen Analysen unterzogen, um ein mit der LPAAT-Aktivität assoziiertes Protein zu identifizieren. Auf diese Weise wird ein Protein mit einer Molmasse von etwa 27–29 kDa dahingehend identifiziert, dass es mit der LPAAT-Aktivität assoziiert ist. Weitere Reinigungsverfahren wie die Säulenchromatographie und die Elektrophorese an Polyacrylamid-Gel werden verwendet, um das LPAAT-Protein in einer Reinheit zu erhalten, die für eine Aminosäure-Sequenzanalyse ausreichend ist.
Als Ergebnis werden LPAAT-Peptidsequenzen bestimmt, und ein LPAAT-Peptidfragment mit einer Sequenzhomologie zu nichtpflanzlichen LPAAT (E. coli plsC-Genprodukt und eine vermeintliche Hefe-AT) werden gefunden. Die LPAAT-Peptidsequenzen werden als Matrizen zur Konstruktion verschiedener synthetischer Oligonucleotide verwendet, die dann zum Erhalt von Nucleinsäuresequenzen verwendet werden, die das gesamte Kokosnuss-LPAAT-Protein oder einen Teil davon codieren.
In der vorliegenden Anmeldung werden LPAAT-PCR-Produktsequenzen verfügbar gemacht und zum Erhalt von cDNA-Klonen verwendet, die Kokosnuss-LPAAT codieren, deren Sequenz hier ebenfalls verfügbar gemacht wird. Unter Verwendung der so erhaltenen, Kokosnuss-LPAAT codierenden Sequenzen ist es auch möglich, andere Pflanzen-LPAAT-Gene zu isolieren, die LPAAT-Proteine mit verschiedenen Spezifitäten hinsichtlich Acyl-CoA-Donorsubstraten (z. B. 8:0, 10:0, 14:0, 22:1 etc.) codieren. Zum Beispiel werden unter Verwendung der Kokosnuss-Sequenz jetzt Sequenzen von Sumpfblumen-LPAAT-Klonen verfügbar gemacht. Ein Vergleich der Kokosnuss- und der Sumpfblumen-LPAAT-Sequenzen ergibt weitere konservierte Aminosäuresequenzen, die weiterhin bei der Identifizierung von LPAAT-Genen aus anderen Quellen brauchbar sind.
Somit umfasst diese Erfindung Pflanzen-LPAAt-Peptide und die entsprechenden Aminosäuresequenzen dieser Peptide und die Verwendung dieser Peptidsequenzen bei der Herstellung von Oligonucleotiden, die LPAAT codierende Sequenzen enthalten, zur Analyse und Isolierung von pflanzlichen und nicht pflanzlichen LPAAT-Gensequenzen. Die Pflanzen-LPAAT codierende Sequenz kann in Abhängigkeit von der vorgesehenen Verwendung eine vollständige oder partielle Sequenz codieren. Die gesamte genomische Sequenz oder ein Teil davon oder eine cDNA-Sequenz ist vorgesehen.
Von speziellem Interesse sind rekombinante DNA-Konstrukte, die eine Transkription oder eine Transkription und Translation (Expression) der Pflanzen-LPAAT-Sequenzen ergeben. Insbesondere sind Konstrukte, die zur Transkription oder Transkription und Translation in pflanzlichen Wirtszellen fähig sind, bevorzugt. Bei einigen Anwendungen kann eine Verminderung der Pflanzen-LPAAT erwünscht sein. Somit können rekombinante Konstrukte entworfen werden, die zur Expression einer Antisense-Sequenz die Pflanzen-LPAAT-Sequenz in einer umgekehrten Orientierung haben, oder die Verwendung von Cosuppressions-, auch als ”Transwitch-”Konstrukten bekannt, kann brauchbar sein. Solche Konstrukte können eine Vielzahl von Regulationsregionen einschließlich Transkriptionsinitiationsregionen enthalten, die aus Genen erhalten werden, die vorzugsweise in Samengewebe von Pflanzen exprimiert werden. Für einige Verwendungen kann es erwünscht sein, die Transkriptions- und Translations-Inititiationsregionen des LPAAT-Gens entweder mit der LPAAT codierenden Sequenz zu verwenden oder die auf Transkription und Translation einer heterologen Sequenz abzustellen. Somit macht die vorliegende Erfindung einen DNA-Konstrukt verfügbar, umfassend eine erste DNA-Sequenz, die ein Pflanzen-1-Acylglycerin-3-phosphat-Acyltransferasenenzym gemäß der obigen Definition, das mit einer zweiten, zur ersten DNA-Sequenz heterologen DNA-Sequenz verbunden ist, codiert, wobei die erste DNA-Sequenz erhältlich ist durch:

(A) eine Amplifizierungsreaktion, umfassend die Schritte des: (i) In-Kontakt-Bringens unter Bedingungen der Polymerase-Kettenreaktion (a) eines Oligonucleotids, das sechs benachbarte Aminosäuren des als SEQ-ID Nr. 1 dargestellten Peptids codiert mit (b) DNA von einer Quelle für Pflanzen-1-Acylglycerin-3-phosphat-Acyltransferase; (ii) Isolierens einer DNA-Sequenz, die ein Pflanzen-1-Acylglycerin-3-phosphat-Acyltransferasepeptid codiert, oder
(B) ein Screening einer Pflanzen-Genombank mit einer Nucleinsäure-Sonde, die wenigstens 5 aufeinanderfolgende Aminosäuren eines Pflanzen-1-Acylglycerin-3-phosphat-Acyltransferasepeptids codiert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus LLPWPY, GNLYGH, RIDRSNP, KNLSLI, LPIVPM, FPEGTRS, GRLLPFKKGF, LTGTHTLAWRK, PITVKY.

Weiterhin macht sie eine Zelle verfügbar, die einen solchen DNA-Konstrukt umfasst, und ein Verfahren zur Herstellung einer Herstellung einer 1-Acylglycerin-3-phosphat-Acyltransferase in einer Zelle, umfassend das Transformieren einer Zelle mit einem solchen DNA-Konstrukt und das Wachsenlassen der Zelle zur Erzeugung von Quantitäten der Pflanzen-1-Acylglycerin-3-phosphat-Acyltransferase.
In noch einem anderen Aspekt betrifft diese Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Pflanzen-LPAAT in einer Wirtszelle oder ihrer Nachkommenschaft über die Expression eines Konstrukts in der Zelle. Zellen, die eine Pflanzen-LPAAT als Folge der Herstellung der die Pflanzen-LPAAT codierenden Sequenz enthalten, sind hier ebenfalls vorgesehen.
Darüber hinaus betrifft diese Erfindung Verfahren zur Verwendung von Pflanzen-LPAAT codierenden DNA-Sequenzen zur Modifikation der Zusammensetzung von Fettsäureacylgruppen an der sn-2-Position der Triglycerid-Moleküle insbesondere im Samenöl von pflanzlichem Ölsaat-Erntegut. Pflanzenzellen mit einem solchen modifizierten Triglycerid sind hier ebenfalls vorgesehen. Von besonderem Interesse ist die Verwendung einer mittlere Ketten bevorzugenden LPAAT-Sequenz in Brassica-Pflanzen, die konstruiert wurden, um Fettsäuren mit mittleren Ketten im Samenöl zu erzeugen. In solchen Pflanzen werden bis zu etwa 50 mol-% Laurat in den Samen-Triglyceriden angesammelt. Der größte Teil dieses Laurats ist aufgrund der Spezifität der Brassica-LPAAT für Acyl-CoA-Substrat mit größeren Kettenlängen aber an den Positionen sn-1 und sn-3 verestert. Durch die Expression eines mittlere Ketten bevorzugenden LPAAT-Proteins in den Samen solcher Pflanzen ist es möglich, Brassica-Samenöl zu erhalten, das mehr als 67 mol-% Laurat im TAG hat.
Auch von besonderem Interesse ist die Herstellung von Trierucin in Pflanzen mit einem hohen Erucasäure-Gehalt wie Ölvarietäten von Raps mit hohem Erucasäure-Gehalt (HEAR) oder eine weitere Verminderung der Erucasäure-Zusammensetzung von Pflanzen, die Erucafettsäuren in der sn-2-Position eines Pflanzen-TAG enthalten. Zum Beispiel ist es durch die Expression eines sehr lange Ketten bevorzugenden LPAAT-Proteins in den Samen der HEAR-Öl-Varietäten möglich, Brassica-Samenöl zu erhalten, das mehr als 66 mol-% Erucin im TAG aufweist.
In dieser Erfindung ebenfalls vorgesehen sind die modifizierten Pflanzen, Samen und Öle, die durch die Expression der Pflanzen-LPAAT-Sequenzen und Proteine dieser Erfindung erhalten werden.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Ein Pflanzen-LPAAT dieser Erfindung umfasst jede beliebige, aus einer pflanzlichen Quelle erhältliche Aminosäuresequenz wie ein Protein, Polypeptid oder Peptid, die die Fähigkeit aufweist, die Erzeugung von 1,2-Diacylglycerin-3-phosphat aus 1-Acylglycerin-3-phosphat und einem Acyl-CoA-Substrat unter Bedingungen, unter denen Pflanzenenzyme reaktiv sind. Mit ”Bedingungen, unter denen Pflanzenenzyme reaktiv sind” ist gemeint, dass alle erforderlichen Bedingungen (d. h. Faktoren wie die Temperatur, der pH-Wert, ein Fehlen hemmender Substanzen) in einer Umgebung vorhanden sind, die ein Funktionieren des Enzyms ermöglichen.
Die präferentielle Aktivität einer Pflanzen-LPAAT gegenüber Fettacyl-CoA-Substraten mit einer speziellen Kettenlänge wird durch den Vergleich mit 1,2-Diacylglycerin-3-phosphat-Produktmengen bestimmt, die mittels Acyl-CoA-Donorsubstraten mit einer anderen Kettenlänge erhalten werden. In einigen Fällen kann die Kettenlänge einer Acylgruppe in der sn-1-Position die Fähigkeit der LPAAT zur Verwendung eines Acyl-CoA-Donors mit einer gegebenen Kettenlänge auch beeinflussen. Von besonderem Interesse in der vorliegenden Erfindung ist eine LPAAT in unreifem Kokosnuss-Endospermgewebe, die Acyl-CoA mit mittleren Ketten bevorzugt, und eine LPAAT in sich entwickelndem Sumpfblumen-Embryogewebe, die Acyl-CoA mit sehr langen Ketten bevorzugt.
Mit ”mittlere Ketten bevorzugende Acyl-CoA” ist gemeint, dass das Enzympräparat eine Präferenz für Donorsubstrate mit mittlerer Kette, d. h. C8-, C10-, C12- oder C14-Acyl-CoA-Donorsubstrate gegenüber Acyl-CoA-Substraten, deren Acyl eine andere Länge der Kohlenstoffkette hat, unabhängig von der Kettenlänge der Acylgruppe in der sn-1-Position des Akzeptor-LPA-Substrats aufweist. Mit dem ”Acyl-CoA mit langen Ketten” ist gemeint, dass das Enzympräparat eine Präferenz für Donorsubstrate mit langen Ketten, d. h. C16- und C18-Donorsubstrate gegenüber Acyl-CoA-Substraten, deren Acyl eine andere Länge der Kohlenstoffkette hat, aufweist. Und auf eine ähnliche Weise weist eine LPAAT, die ein Acyl-CoA mit einer sehr langen Kette bevorzugt, eine Präferenz für Donorsubstrate mit sehr langen Ketten, d. h. C20-, C22- und größere Donorsubstrate auf. Es sei darauf hingewiesen, dass eine gewisse Aktivität mit einer kleineren Größenordnung auch gegenüber Fettacylsubstraten mit einer anderen Kettenlänge beobachtet werden kann, d. h., dass die Spezifität wesentlich, aber nicht absolut ist. Zum Beispiel weist die veranschaulichte Kokosnuss-LPAAT eine starke Präferenz für C12-Acyl-CoA-Donorsubstrate auf, wenn das Akzeptorsubstrat Lauroyl-LPA ist, hat aber auch im Vergleich zu Substraten mit längeren Ketten, deren Acylgruppen 16 oder 18 Kohlenstoffatome haben, gegenüber C10- und C14-Substraten eine signifikant höhere Aktivität. Wenn das Akzeptorsubstrat 18:1-LPA ist, nutzt die Kokosnuss-LPAAT C12- und C14-Substrate mit fast gleichen Geschwindigkeiten und bevorzugt dennoch diese und C10-Substrate gegenüber verfügbaren Acyl-CoA-Substraten mit längeren Ketten.
Andere Pflanzen-LPAAT-Proteine können auch eine präferentielle Aktivität bei einem oder mehreren der Acyl-CoA-Substrate mit mittlerer Kette, langer Kette oder sehr langer Kette aufweisen, wobei die Präferenz aber nur dann vorliegt, wenn eine spezielle, z. B. eine Acylgruppe mit mittlerer Kette, in der sn-1-Position des LPA-Donorsubstrats vorhanden ist. Solche LPAAT werden dahingehend betrachtet, dass sie eine selektive Präferenz für ein solches Substrat haben.
Wie oben festgestellt wurde, weist eine Pflanzen-LPAAT dieser Erfindung eine Aktivität gegenüber Fettacyl-CoA-Substraten und eine geringe oder gar keine Aktivität gegenüber Fettacyl-ACP-Sustraten auf. Somit kann die LPAAT dieser Erfindung von Pflanzen-Chloroplasten-LPAAT unterschieden werden, die eine Aktivität sowohl gegenüber Acyl-ACP- als auch Acyl-CoA-Substraten aufweisen.
Die Acyl-CoA-LPAAT der vorliegenden Erfindung sind in Cytoplasmamembranen in verschiedenen Pflanzengeweben vorhanden. Von besonderem Interesse sind diejenigen LPAAT, die mit dem Stoffwechselweg der Biosynthese von TAG im endoplasmatischen Retikulum von unreifen Samengeweben assoziiert sind. Unreife Samengewebe, die solche LPAAT enthalten, können in Abhängigkeit vom Ort der Biosynthese von TAG in einer speziellen Pflanzenspezies Embryogewebe oder Endospermgewebe einschließen. Beispielsweise in Kokosnüssen wird die LPAAT-Aktivität primär im Endospermgewebe, dem Ort der Biosynthese von TAG, nachgewiesen. In Samen des kalifornischen Lorbeers ergeben unreife Embryo-Cotyledone eine gute Quelle für die LPAAT-Aktivität, und in Brassica-Samen wird eine wesentliche LPAAT-Aktivität auch in unreifen Embryos gefunden. Bei Sumpfblumen-Pflanzen wird die LPAAT-Aktivität in unreifen Embryos gefunden.
Es ist gefunden worden, dass die bisher untersuchten LPAAT-Enzyme im endoplasmatischen Retikulum von Pflanzen Membranproteine sind. Um die LPAAT-Aktivität weiter zu untersuchen und insbesondere Präparate eines solchen Proteins durch chromatographische Verfahren zu erzeugen, ist es daher notwendig, das Enzym in löslich gemachter Form, d. h. abgetrennt von der Umgebung der Cytoplasma-Membran, zu erhalten.
”Löslichmachung” bezieht sich auf eine Extraktion des LPAAT-Enzyms aus den Membranen so, dass es sich dann auf eine Weise verhält, die für Enzyme, die nicht membranassoziiert sind, typisch ist. Weil die Membran das LPAAT-Enzym wirksam mit anderen Proteinen, die auch darin vorhanden sind, verbindet, ist die Löslichmachung eine wesentliche Anforderung für die Identifizierung und Reinigung des LPAAT-Proteins gemäß der Beschreibung in den folgenden Beispielen. Beim Testen auf die Löslichmachung der LPAAT-Aktivität werden drei verschiedene Indikationen der Löslichmachung, die in den folgenden Beispielen ausführlicher beschrieben sind, betrachtet.

1) Die LPAAT-Aktivität wird durch eine Zentrifugation bei sehr hohen Drehzahlen nicht sedimentiert.
2) Die LPAAT-Aktivität wandert auf einer Größenausschluss-Chromatographiesäule, als ob sie eine native Molmasse hat, die für nicht membranassoziierte Enzyme typisch ist.
3) Im LPAAT-Präparat vorhandene Proteine sind durch Säulenchromatographie wenigstens teilweise voneinander trennbar.

Aufgrund möglicher alternativer Interpretationen, die einzeln auf die obigen Kriterien zutreffen können, muss zur Bestätigung der Löslichmachung von LPAAT bestätigt werden, dass alle drei der Kriterien erfüllt sind. Zum Beispiel könnte das erste Kriterium, das Nicht-Sedimentieren bei sehr hohen g-Kräften, irreführend sein, wenn die Dichte der zur Löslichmachung verwendeten Lösung derjenigen der nicht löslich gemachten Membranen ähnlich ist, so dass sie nur sehr langsam sedimentieren. Diese Situation ist in den folgenden Beispielen veranschaulicht, in denen gezeigt wird, dass ein veröffentlichtes Verfahren zur Löslichmachung, das auf diesem Kriterium allein beruht, nicht ausreichend ist, um ein LPAAT zu erhalten, das von den Cytoplasmamembranen im Wesentlichen getrennt ist. Das zweite Kriterium, wonach löslich gemachte Aktivität langsamer durch eine Größenausschluss-Säule wandert als die ursprünglichen Membranen, kann beeinträchtigt sein, wenn die Membranen selbst nach der Einwirkung eines Tensids schwach an der Säule gebunden sind, so dass ihre Migration dadurch verlangsamt ist. Das dritte Kriterium, wonach die löslich gemachten Proteine chromatographisch trennbar sind, wird am wenigsten wahrscheinlich durch Artefakte oder unvorhergesehene Fälle gestört. Es ist jedoch möglich, dass Membranen durch das Verfahren zur Löslichmachung partiell dissoziieren, so dass verschiedene Proteinaggregate freigesetzt werden. Solche Aggregate können dann chromatographisch voneinander getrennt werden. Somit müssen alle drei Kriterien erfüllt sein, damit gewährleistet ist, dass eine Löslichmachung von LPAAT erreicht ist.
Die Löslichmachung von Kokosnuss-LPAAT in einer Lösung, die 1 M NaCl, 2,25% (Gew./Vol.) CHAPS-Detergens und ein Detergens/Protein-Verhältnis von 48/1 (Gew./Gew.) enthält, ist in den folgenden Beispielen beschrieben. Auf vergleichbare Weise wird die LPAAT-Aktivität aus kalifornischem Lorbeer unter Verwendung einer Lösung zur Löslichmachung, die 1 M NaCl, 4 (Gew./Vol.) CHAPS-Detergens und ein Detergens/Protein-Verhältnis von 58/1 (Gew./Gew.) enthält, löslich gemacht. Die Löslichmachung der Pflanzen-LPAAT wird durch die Demonstration eines jeden der obigen Kriterien der Löslichmachung bestätigt.
Weiterhin wurde, wie in den folgenden Beispielen ausführlich beschrieben ist, in Untersuchungen der Aktivität von löslich gemachten LPAAT bestätigt, dass löslich gemachte LPAAT nur durch die Zugabe von konzentrierten Phospholipiden zur Rekonstituierung der LPAAT-Aktivität untersucht werden könnte. Insbesondere ist die stimulierende Wirkung von Phospholipiden auf die LPAAT-Aktivität am größten, wenn die Phospholipide zu Beginn des Assayverfahrens zur Probe mit dem löslich gemachten LPAAT gegeben werden, gefolgt von einer Verdünnung der hohen CHAPS- und Salzkonzentrationen in diesem Puffer durch die Zugabe der übrigen Bestandteile des Assays. Die Zugabe des Phospholipids nach der Verdünnung der Lösung zur Löslichmachung führt zu einer geringen oder zu keiner Erhöhung der Detektion der LPAAT-Aktivität. Der Phospholipid-Stimulationseffekt ist auch zu sehen, wenn die Phospholipide zu einer Probe des Puffers zur Löslichmachung allein gegeben werden, gefolgt von einer Verdünnung mit den übrigen Assaybestandteilen und der anschließenden Zugabe der löslich gemachten LPAAT-Probe.
Löslich gemachte Präparate von Kokosnuss-Endosperm-LPAAT werden in einer Vielzahl von chromatographischen Experimenten zur Identifizierung und partiellen Reinigung des LPAAT-Proteins verwendet. Auf diese Weise wird ein Protein mit einer Molmasse von etwa 27–39 kDa als mit der LPAAT-Aktivität assoziiert identifiziert. Wie in den folgenden Beispielen ausführlicher beschrieben ist, wird das Protein mit 29 kDa durch Chromatographie an roter 120-Agarose und Hydroxylapatit-Säulen partiell gereinigt. Das Protein wird dann mittels Gelelektrophorese und Blotting des partiell gereinigten LPAAT-Präparats an Nitrocellulose in einer im Wesentlichen gereinigten Form erhalten. Das Protein mit 27–29 kDa wird durch das Herausschneiden desjenigen Teils des Nitrocellulose-Filters, der die identifizierte Bande enthält, isoliert.
Das gereinigte Protein wird dann mit verschiedenen Enzymen aufgeschlossen, wodurch Peptide zur Verwendung bei der Bestimmung der Aminosäuresequenz erzeugt werden. Für Aminosäuresequenzen eines auf diese Weise erhaltenen tryptischen Peptids wird gezeigt, dass sie mit dem vom E.-coli-plsC-Gen codierten LPAAT-Protein einen Homologiebereich teilen. Derselbe Bereich, den sich die LPAAT von E. coli und von Kokosnuss teilen, wird auch in einem Acyltransferase-Protein von Hefe gefunden, das vom SLC1-Gen codiert wird.
Somit stellt das hier beschriebene tryptische Peptid auf dem Protein mit 27–29 kDa einen Teil eines Kokosnuss-LPAAT dar, das eine Acyl-CoA mit mittleren Ketten bevorzugt. Andere Kokosnuss-LPAAT-Peptide werden auf vergleichbare Weise erhalten und die Aminosäuresequenzen verfügbar gemacht.
Die Verwendung von Aminosäuresequenzen von LPAAT-Peptiden zum Erhalt von Nucleinsäuresequenzen, die Kokosnuss- oder andere LPAAT-Gene codieren, wird hier beschrieben. Zum Beispiel werden synthetische Oligonucleotide hergestellt, die den LPAAT-Peptidsequenzen entsprechen. Die Oligonucleotide werden als Primer in Polymerase-Kettenreaktion-(PCR-)Techniken verwendet, wodurch eine partielle DNA-Sequenz von LPAAT-Genen erhalten wird. Die so erhaltenen partiellen Sequenzen werden dann als Sonden zum Erhalt von LPAAT-Klonen aus einer Genombank verwendet, die aus Kokos nuss- oder einem anderen interessierenden Gewebe hergestellt wurde. Alternativ können solche Sonden, wenn Oligonucleotide mit einer niedrigen Degeneration aus speziellen LPAAT-Peptiden hergestellt werden können, direkt verwendet werden, um Genombanken auf LPAAT-Gensequenzen zu screenen. Insbesondere ist ein Screenen von cDNA-Banken in Phagenvektoren bei solchen Verfahren aufgrund niedrigerer Grade einer Hintergrund-Hybridisierung brauchbar. DNA-Sequenzen von LPAAT-Peptiden, die Sequenzen codieren, die auf diese Weise erhalten wurden, werden in der Anmeldung verfügbar gemacht.
Eine Nucleinsäuresequenz von einer Pflanze oder eine andere LPAAT dieser Erfindung kann eine DNA- oder RNA-Sequenz sein, die von genomischer DNA, cDNA, mRNA stammt, oder sie kann vollständig oder teilweise synthetisiert sein. Die Gensequenzen können geklont sein, beispielsweise durch die Isolierung genomischer DNA aus einer zweckmäßigen Quelle und das Amplifizieren und Klonen der interessierenden Sequenz durch die Verwendung einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR).
Alternativ können die Gensequenzen entweder vollständig oder teilweise synthetisiert werden, insbesondere dann, wenn es wünschenswert ist, von Pflanzen bevorzugte Sequenzen zu erhalten. Somit kann das gesamte erwünschte Strukturgen (derjenige Teil des Gens, der das LPAAT-Protein codiert) oder ein Teil davon unter Verwendung von Codons, die von einem ausgewählten Wirt bevorzugt werden, synthetisiert werden. Vom Wirt bevorzugte Codons können beispielsweise aus den Codons bestimmt werden, die am häufigsten für die Proteine verwendet werden, die in einer gewünschten Wirtsspezies exprimiert werden.
Ein Fachmann erkennt leicht, dass Antikörperpräparate und Nucleinsäuresonden (DNA und RNA) hergestellt und verwendet werden können, um ”homologe” oder ”verwandte” LPAAT aus einer Vielzahl von Pflanzen und anderen Quellen zu screenen und zu isolieren. Homologe Sequenzen werden gefunden, wenn eine Sequenzidentität vorliegt, was beim Vergleich von Informationen zur Sequenz, Nucleinsäure oder Aminosäure, oder durch Hybridisierungsreaktionen zwischen einer bekannten LPAAT und einem Kandidaten für eine Quelle bestimmt werden kann. Konservative Änderungen wie Glu/Asp, Val/Ile, Ser/Thr, Arg/Lys und Gln/Asn können bei der Bestimmung der Sequenzhomologie auch in Betracht gezogen werden. Aminosäuresequenzen werden bei einer Sequenzidentität zwischen den beiden vollständigen, reifen Proteinen von nur 25% als homolog betrachtet. (Siehe im Allgemeinen R. F. Doolittle, OF URFS and ORFS (University Science Books, CA, 1986).
Somit können andere Pflanzen-LPAAT sie die hier beschriebene Sumpfblumen-LPAAT aus den speziellen, beispielhaft aufgeführten, hier verfügbar gemachten Kokosnuss-Proteinpräparaten und -sequenzen erhalten werden. Die Sumpfblumen-LPAAT, die von einer zweikeimblättigen Pflanze stammt, und die Kokosnuss-LPAAT-Sequenz, die von einer einkeimblättigen Pflanze stammt, können zur Identifizierung von hochgradig konservierten Aminosäuresequenzen verwendet werden, die für LPAAT im Pflanzenreich repräsentativ sind. Solche Regionen umfassen die Peptide: LLPWPY (SEQ ID Nr.: 36), GNLYGH (SEQ ID Nr.: 37), RIDRSNP {SEQ ID Nr.: 38), KNLSLI (SEQ ID Nr.: 39), LPIVPM {SEQ ID Nr.: 40), FPEGTRS (SEQ ID Nr.: 24), GRLLPFKKGF (SEQ ID Nr.: 25), LTGTHLAWRK (SEQ ID Nr.: 26) und PITVKY (SEQ ID Nr.: 127). Unter Verwendung degenerierter Oligonucleotide, die diese Sequenzen codieren, und von PCR-Techniken können die LPAAT aus jeder Pflanzenspezies und insbesondere allen Cytoplasma-Acyl-CoA-aktiven und Acyl-ACP-inaktiven LPAAT erhalten werden.
Darüber hinaus ist jetzt gefunden worden, dass LPAAT von E. coli, Kokosnuss und Sumpfblume Regionen einer konservierten Aminosäuresequenz haben, die auch in einem mutmaßlichen LPAAT-Protein von Hefe konserviert werden. Somit kann es möglich sein, Sonden aus solchen konservierten Regionen zu entwerfen, um LPAAT codierende Sequenzen aus anderen Organismen, wie aus Tieren, zu isolieren. Solche LPAAT codierenden Sequenzen können auch in hier beschriebenen Anwendungen, insbesondere für Techniken der Pflanzen-Gentechnik zur Erzeugung von TAG mit speziellen Fettacylgruppen an der sn- 2-Position, verwendet werden. Zum Beispiel kann eine tierische LPAAT Anwendungen in der Pflanzen-Gentechnik finden, um Öle mit gesättigten Fettacylgruppen mit langen Ketten, wie 18:0 in der sn-2-Position, zu erzeugen, die eine Quelle für brauchbares TAG für eine Säuglingsformel ergeben.
Weiterhin ist offenkundig, dass man natürliche und synthetische LPAAT einschließlich modifizierter Aminosäuresequenzen und Ausgangsstoffe für das Modellieren von synthetischen Proteinen aus den veranschaulichten Pflanzen-LPAAT und aus LPAAT, die unter Verwendung solcher veranschaulichter Sequenzen erhalten werden, erhalten kann. Modifizierte Aminosäuresequenzen umfassen Sequenzen, die unabhängig davon, ob sie teilweise oder vollständig synthetisiert wurden, mutiert, gestutzt und vergrößert wurden. Sequenzen, die tatsächlich aus Pflanzenpräparaten gereinigt wurden oder damit identisch sind oder identische Proteine unabhängig vom Verfahren, das angewandt wurde, um das Protein oder die Sequenz zu erhalten, codieren, werden gleichermaßen dahingehend aufgefasst, dass sie natürlicher Herkunft sind.
Typischerweise weist eine LPAAT-Sequenz, die unter Verwendung der Nucleinsäure-Sonden erhältlich ist, eine Sequenzidentität von 60–70% zwischen der Ziel-LPAAT-Sequenz und der als Sonde verwendeten codierenden Sequenz auf. Lange Sequenzen mit einer Sequenzidentität von nur 50–60% können aber auch erhalten werden. Die Nucleinsäuresonde kann ein langes Segment der Nucleinsäuresequenz sein, oder es kann auch eine kürzere Oligonucleotidsonde sein. Wenn längere Nucleinsäurefragmente als Sonden verwendet werden (mehr als etwa 100 bp), kann man mit einer geringeren Stringenz screenen, um Sequenzen aus der Zielprobe zu erhalten, die eine Abweichung von 20–50% (d. h. eine Sequenzidentität von 50–80%) zu der als Sonde verwendeten Sequenz haben. Oligonucleotid-Sonden können beträchtlich kürzer als die vollständige, ein LPAAT-Enzym codierende Nucleinsäuresequenz sein, sollten aber wenigstens etwa 10, vorzugsweise wenigstens etwa 15 und noch mehr bevorzugt wenigstens etwa 20 Nucleotide haben. Wenn im Gegensatz zu längeren Regionen kürzere Regionen verwendet werden, ist ein höherer Grad der Sequenzidentität erwünscht. Somit kann es wünschenswert sein, Regionen einer hochgradig konservierten Aminosäuresequenz zu identifizieren, um Oligonucleotid-Sonden für den Nachweis und die Isolierung anderer verwandter LPAAT-Gene zu entwerfen. Kürzere Sonden sind für Polymerase-Kettenreaktionen (PCR) insbesondere dann, wenn hochgradig konservierte Sequenzen identifiziert werden können, besonders brauchbar. (Siehe Gould et al., PNAS USA (1989) 86: 1934–1938).
Zusätzlich zur Isolation anderer Pflanzen-LPAAT wird in Erwägung gezogen, dass Gene für andere verwandte Acyltransferase-Proteine auch unter Verwendung der Sequenzinformationen von der Kokosnuss-LPAAT und verwandter Nucleinsäuresequenzen erhalten werden können. Zum Beispiel sind andere Acyltransferase-Enzyme einschließlich Plastiden-LPAAT, mitochondrialer LPAAT, Lysophosphatidylcholin-Acyltransferase (LPCAT), Lysophosphatidylserin-Acyltransferase (LPSAT), Lysophosphatidylethanolamin-Acyltransferase (LPEAT) und Lysophosphatidylinosit-Acyltransferase (LPIAT) in die Biosynthese von Pflanzenlipiden einbezogen worden. All diese Enzyme katalysieren Acyltransferase-Reaktionen, die die sn-2-Position von Lysophospholipiden betreffen, und die diese Sequenzen codierenden Gene können auch auf die Pflanzen-Acyl-CoA-LPAAT-Sequenzen der vorliegenden Erfindung bezogen werden und sind daraus erhältlich.
Um zu bestimmen, ob ein verwandtes Gen durch Hybridisierung mit einer gegebenen Sequenz isoliert werden kann, wird die Sequenz markiert, um einen Nachweis typischerweise unter Anwendung von Radioaktivität zu ermöglichen, obwohl andere Verfahren verfügbar sind. Die markierte Sonde wird zu einer Hybridisierungslösung gegeben und mit Filtern, die die gewünschten Nucleinsäuren enthalten, wie Northern oder Southern Blots, oder den Filtern, die zu screenende cDNA oder genomische Klone enthalten, inkubiert. Die Hybridisierungs- und Waschbedingungen können dahingehend variiert werden, dass die Hybridisierung der Sonde hinsichtlich der interessierenden Sequenzen optimiert wird. Niedrigere Temperaturen und höhere Salzkonzentrationen ermöglichen eine Hybridisierung entfernter verwandter Sequenzen (niedrige Stringenz). Wenn unter Bedingungen einer niedrigen Stringenz eine Hintergrund-Hybridisierung ein Problem darstellt, kann die Temperatur entweder im Hybridisierungs- oder im Waschschritt erhöht und/oder der Salzgehalt erniedrigt werden, um den Nachweis der speziellen Hybridisierungssequenz zu verbessern. Die Hybridisierungs- und die Waschtemperatur können auf der Grundlage der geschätzten Schmelztemperatur der Sonde eingestellt werden, wie in Beltz et al. (Methods in Enzymology (1983) 100: 266–285) diskutiert wird. Insbesondere können solche Screening-Verfahren verwendet werden, um mRNA-Präparate aus Samengeweben einer Vielzahl von Pflanzenspezies zu screenen, wodurch verwandte LPAAT- oder andere Acyltransferase-Gene identifiziert werden, die unter Verwendung von LPAAT-Gensequenzen als Sonden isoliert werden können. Eine brauchbare Sonde und zweckmäßige Hybridisierungs- und Waschbedingungen, die wie oben identifiziert worden sind, cDNA- oder Genombanken werden unter Verwendung der markierten Sequenzen gescreent, und zusätzliche Pflanzen-LPAAT-Gene werden erhalten. Eine Technik, von der gefunden wurde, dass sie bei der PCR als brauchbar ist, die Amplifizierung der Sumpfblumen-LPAAT, wenn eine Kombination von Kokosnuss-Primern verwendet wurde, bestand in der Denaturierung der DNA und der schnellen Erniedrigung der Temperatur auf etwa 65°C und dann einer langsamen Temperaturerniedrigung auf die Annealing-Temperatur (40°C–50°C).
Zum immunologischen Screening können Antikörper für das Kokosnuss-LPAAT-Protein hergestellt werden, indem Kaninchen oder Mäusen das gereinigte Protein injiziert wird, wobei solche Verfahren zur Herstellung von Antikörpern den Fachleuten wohlbekannt sind. Es können entweder monoklonale oder polyklonale Antikörper hergestellt werden, obwohl typischerweise polyklonale Antikörper zur Genisolierung brauchbarer sind. Um festzustellen, ob ein verwandtes Protein in einem Rohextrakt der gewünschten Pflanzenspezies vorhanden ist, kann eine Western-Analyse durchgeführt werden, wie durch eine Kreuzreaktion mit den Antikörpern des Kokosnuss-LPAAT bestimmt wird. Wenn eine Kreuzreaktivität beobachtet wird, werden die verwandten Proteine codierenden Gene isoliert, indem Expressionsbanken gescreent werden, die die gewünschte Pflanzenspezies darstellen. Expressionsbanken können in einer Vielzahl von kommerziell verfügbaren Vektoren einschließlich Lambda-gt11 konstruiert werden, wie in Maniatis et al., (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, beschrieben ist.
Alle Pflanzen benutzen LPAAT-Proteine zur Erzeugung von Membran-Phospholipiden, und somit kann jede gegebenen Pflanzenspezies als Quelle für zusätzliche LPAAT-Proteine betrachtet werden. Pflanzen mit signifikanten Fettsäuren mit mittlerer Kette in ihren Samenölen sind bevorzugte Kandidaten zum Erhalt von Pflanzen-LPAAT, die dazu fähig sind, Fettsäuren mit mittlerer Kette in die sn-2-Position von TAG einzuarbeiten. Mehrere Spezies des Genus Cuphea sammeln Triglyceride an, die Fettsäuren mit mittlerer Kette in ihren Samen enthalten, z. B. procumbens, lutea, hookeriana, hyssopifolia, wrightii und inflata. Eine andere natürliche Pflanzenquelle für Fettsäuren mit mittlerer Kette sind Samen der Lauraceae-Familie. Zusätzlich zum beispielhaft aufgeführten kalifornischen Lorbeer (Umbellularia californica) sammeln Actinodaphne hookeri, Lorbeer (Laurus nobilis) und Cinnamomum camphora (Campher) Fettsäuren mit mittlerer Kette an. Andere pflanzliche Quellen umfassen Ulmaceae (Ulme), Palmae, Myristicaceae, Simarubaceae, Vochysiaceae und Salvadoraceae.
Auch von besonderem Interesse sind LPAAT von Pflanzenspezies, die ungewöhnliche Fettsäuren mit längeren Ketten in das Speicher-TAG einbinden. Zum Beispiel enthalten Brunnenkresse und die Sumpfblume 22:1-Acylgruppen im Samen-TAG, und es ist gezeigt worden, dass die Sumpfblume eine LPAAT enthält, die dazu fähig ist, 22:1-(Eruca-)Fettacylgruppen in die sn2-Position einzuarbeiten. Eine LPAAT mit einer solchen Aktivität kann Nutzen bei der Herstellung von ”Trieruca-”Brassica-Öl finden, das bisher aufgrund der Selektivität von Brassica-Samen für ungesättigte Fettsäuren wie 18:1 und 18:2 nicht gefunden wird. Tatsächlich zeigt die Analyse der Triglyceride, dass 22:1 aus der sn-2-Position der Triglyceride ausgeschlossen ist. Dies begrenzt den theoretischen maximalen Erucasäure-Gehalt von Rapsöl auf 66 mol-%.
Darüber hinaus sind LPAAT-Enzyme von Pflanzen, die andere unübliche Fettsäuren enthalten, von Interesse und können zur Herstellung von TAG, die diese unüblichen Fettsäuren enthalten, in verschiedenen Pflanzenspezies Nutzen finden. In dieser Hinsicht von Interesse sind LPAAT, die in die Erzeugung von acetylenischen Fettsäuren einbezogen sind, wie Crepeninsäure aus Crepis foetida; Fettsäuren mit Cyclopenten-Substituenten, wie Gorlisäure aus Spezies der Familie Flacourtiaceae; Cyclopropanfettsäuren wie Vernolsäure aus Vernonia galamensis; hydroxylierte Fettsäuren wie Ricinolsäure aus Ricinus communis; furanhaltige Fettsäuren wie aus Exocarpus cupressiformis; Fettsäuren mit mehreren unüblichen funktionellen Gruppen, wie diejenigen aus Sapium sebiferum, die mehrere Doppelbindungen und eine innere Esterfunktion enthalten; Fettsäuren mit einer unüblichen Position der Doppelbindung, wie Petroselinsäure aus einigen Spezies von Umbelliferae, Araliaceae und Garryaceae, und Doppelbindungen enthaltende Fettsäuren mit mittleren Ketten, wie von Lindera-Spezies.
Es sei auch darauf hingewiesen, dass Pflanzen-LPAAT von einer Vielzahl von Quellen zur Untersuchung von Fällen der Biosynthese von TAG bei der Lipid-Biosynthese in Pflanzen in einer weiten Vielzahl von in-vivo-Anwendungen verwendet werden können. Weil alle Pflanzen Lipide über einen gemeinsamen Stoffwechselweg zu synthetisieren scheinen, kann die Untersuchung und/oder Anwendung einer Pflanzen-LPAAT bei einem heterologen Pflanzenwirt leicht bei einer Vielzahl von Spezies bewerkstelligt werden. In anderen Anwendungen kann eine Pflanzen-LPAAT außerhalb der nativen Pflanzenquelle der LPAAT verwendet werden, um die Produktion zu erhöhen und/oder die Zusammensetzung des in vitro erzeugten oder synthetisierten TAG zu modifizieren.
Die mit Pflanzen- oder anderen LPAAT-Proteinen assoziierten Nucleinsäuresequenzen finden viele Verwendungen. Zum Beispiel können rekombinante Konstrukte hergestellt werden, die als Sonden verwendet werden können oder die eine Expression des LPAAT-Proteins in Wirtszellen ergeben, wodurch eine leichte Quelle für das Enzym erzeugt wird und/oder die Zusammensetzung der darin gefundenen Triglyceride modifiziert wird. Andere brauchbare Anwendungen können entweder in vitro oder in vivo gefunden werden, wenn die Wirtzelle eine Pflanzen-Wirtzelle ist. Zum Beispiel kann durch die Erhöhung der Menge einer jeweils mittlere Ketten oder sehr lange Ketten bevorzugenden LPAAT, die dem Biosynthese-Stoffwechselweg des Pflanzen-TAG zur Verfügung stehen, ein erhöhter Prozentwert an Fettsäuren mit mittlerer Kette bzw. Fettsäuren mit sehr langer Kette im TAG erhalten werden. Auf ähnliche Weise kann es für einige Anwendungen erwünscht sein, die Menge des in einer Pflanzenzelle endogen exprimierten LPAAT durch eine Antisense-Technik zu erniedrigen. Zum Beispiel kann eine verminderte Expression einer lange Ketten bevorzugenden Brassica-LPAAT erwünscht sein, um einer insertierten Fremd-LPAAT eine bessere Gelegenheit zu geben, Fettacylgruppen mit mittleren Ketten oder unübliche Fettacylgruppen mit längeren Ketten auf die sn-2-Position zu übertragen.
Somit können die Konstrukte in Abhängigkeit von der vorgesehenen Verwendung die Sequenz enthalten, die das gesamte LPAAT-Protein oder einen Teil davon codiert. Wenn beispielsweise eine Antisense-Hemmung eines gegebenen LPAAT-Proteins erwünscht ist, ist die gesamte LPAAT-Sequenz nicht erforderlich. Weiterhin kann es, wenn LPAAT-Konstrukte zur Verwendung als Sonden vorgesehen sind, vorteilhaft sein, Konstrukte herzustellen, die nur einen speziellen Teil einer LPAAT codierenden Sequenz, zum Beispiel eine Sequenz, von der gefunden wurde, dass sie eine hochgradig konservierte LPAAT-Region codiert, enthalten.
Wie oben diskutiert wurde, kann eine eine Pflanzen- oder eine andere LPAAT codierende Nucleinsäuresequenz dieser Erfindung eine genomische, cDNA- oder mRNA-Sequenz einschließen. Mit ”codierend” ist gemeint, dass die Sequenz einer speziellen Aminosäuresequenz entweder in einer Sense- oder in einer Antisense-Orientierung entspricht. Mit ”extrachromosomal” ist gemeint, dass die Sequenz sich außerhalb des Pflanzen-Genoms, mit dem sie natürlicherweise assoziiert ist, befindet. Mit ”rekombinant” ist gemeint, dass die Sequenz durch eine Manipulation über eine Mutagenese oder Restriktionsenzyme eine gentechnische Modifikation enthält.
Eine cDNA-Sequenz kann Vorprozessierungssequenzen wie Transitpeptidsequenzen oder Zielsteuerungssequenzen enthalten oder auch nicht, um den Transport des LPAAT-Proteins (wie einer Mitochondrion-LPAAT) zu einer gegebenen Organellen- oder Membranposition zu erleichtern. Die Verwendung beliebiger solcher Vorstufen-LPAAT-DNA-Sequenzen ist für Verwendungen in der Expression in Pflanzenzellen bevorzugt. Eine genomische LPAAT-Sequenz kann die Transkriptions- und Translations-Initiierungsregionen, Introne und/oder Transkriptterminationsregionen der Pflanzen-LPAAT enthalten, wobei die Sequenzen in einer Vielzahl von DNA-Konstrukten mit oder ohne das LPAAT-Strukturgen verwendet werden können. Somit können Nucleinsäuresequenzen, die der Pflanzen-LPAAT dieser Erfindung entsprechen, auch Signalsequenzen, die brauchbar sind, um den Proteintransport zu einer speziellen Organellen- oder Membranposition zu richten, nichtcodierende, regulierende 5'-Stromaufwärts-Regionen (Promotoren) mit brauchbaren Gewebe- und Zeitgeberprofilen, nichtcodierende, regulierende 3'-Stromabwärts-Regionen, die als Transkriptions- und Translationsregelnde Regionen brauchbar sind, ergeben, und können Einblick in andere Merkmale des Gens gewähren.
Sobald die gewünschte Pflanzen- oder andere LPAAT-Nucleinsäuresequenz erhalten ist, kann sie auf eine Vielzahl von Arten manipuliert werden. Wenn die Sequenz nichtcodierende, flankierende Regionen einschließt, können die flankierenden Regionen einer Resektion oder Mutagenese unterzogen werden. Somit können an der natürlich vorkommenden Sequenz Transitionen, Transversionen, Deletionen und Insertionen durchgeführt werden. Darüber hinaus kann die gesamte Sequenz oder ein Teil davon synthetisiert sein. Ein oder mehrere Codons im Strukturgen können modifiziert sein, um eine modifizierte Aminosäuresequenz zu erhalten, oder ein oder mehrere Codonmutationen können zum Erhalt einer zweckdienlichen Restriktionsstelle oder für einen anderen Zweck im Zusammenhang mit der Konstruktion oder Expression eingeführt werden. Das Strukturgen kann weiter modifiziert werden, indem synthetische Adapter oder Linker zur Einführung einer oder mehrerer zweckdienlicher Restriktionsstellen verwendet werden.
Die Nucleinsäure- oder Aminosäuresequenzen, die eine Pflanzen- oder eine andere LPAAT dieser Erfindung codieren, können mit anderen nichtnativen oder ”heterologen” Sequenzen vielfältig kombiniert werden. Mit ”heterologen” Sequenzen ist jede Sequenz gemeint, die nicht auf natürliche Weise an die native oder Wildtyp-LPAAT gebunden gefunden wird, einschließlich beispielsweise Kombinationen von Nucleinsäuresequenzen von derselben Pflanze, die nicht auf natürliche Weise miteinander verbunden gefunden werden.
Die DNA-Sequenz, die eine Pflanzen- oder eine andere LPAAT dieser Erfindung codiert, kann zusammen mit allen normalerweise mit der LPAAT assoziierten Gensequenzen oder einem Teil davon verwendet werden. Eine LPAAT codierende DNA-Sequenz wird in ihren Komponenten in einem DNA-Konstrukt kombiniert, das in der Transkriptionsrichtung 5' bis 3' eine Region zur Steuerung der Transkriptionsinitiierung, die zur Förderung der Transkription und Translation in einer Wirtszelle befähigt ist, die Pflanzen-LPAAT codierende DNA-Sequenz und eine Transkriptions- und Translationsterminierungsregion aufweist.
Potenzielle Wirtszellen umfassen sowohl prokaryotische als auch eukaryotische Zellen. Eine Wirtzelle kann in Abhängigkeit von der vorgesehenen Verwendung einzellig sein oder in einem mehrzelligen differenzierten oder undifferenzierten Organismus gefunden werden. Zellen dieser Erfindung können dadurch gekennzeichnet sein, dass sie eine LPAAT haben, die den darin vorhandenen Wildtyp-Zellen beispielsweise dadurch, dass sie einen rekombinanten Nucleinsäurekonstrukt haben, der eine für die Wirtsspezies nicht native Pflanzen-LPAAT codiert, fremd ist.
In Abhängigkeit vom Wirt variieren die Regulationsregionen einschließlich Regionen von Virus-, Plasmid- oder chromosomalen Genen. Zur Expression in prokaryotischen oder eukaryotischen Mikroorganismen, insbesondere einzelli gen Wirten, kann eine weite Vielzahl von konstitutiven oder regulierbaren Promotoren verwendet werden. Die Expression in einem Mikroorganismus kann eine bequeme Quelle für das Pflanzenenzym ergeben. Von den Transkriptionsinitiierungsregionen, die beschrieben worden sind, befinden sich Regionen von Bakterien- und Hefewirten, wie E. coli, B. subtilis, Saccharomyces cerevisiae, einschließlich Genen wie β-Galactosidase, T7-Polymerase und Tryptophan E.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die Konstrukte regulierende Regionen, die in Pflanzen funktionell sind, die eine modifizierte Erzeugung von Pflanzen-LPAAT und möglicherweise eine Modifikation der Fettsäure-Zusammensetzung ergeben. Das offene Leseraster, das für die Pflanzen-LPAAT oder ein funktionelles Fragment davon codierend ist, wird an seinem 5'-Ende mit einer die Transkriptionsinitiierung regulierenden Region verbunden. In Ausführungsformen, in denen die Expression des LPAAT-Proteins in einem pflanzlichen Wirt erwünscht ist, ist die Verwendung des gesamten Pflanzen-LPAAT-Gens oder eines Teils davon erwünscht; es können nämlich alle nichtcodierenden 5'-Stromaufwärts-Regionen (Promotor) oder ein Teil davon zusammen mit der Sequenz des Strukturgens und nichtcodierenden 3'-Stromabwärts-Regionen verwendet werden.
Wenn ein anderer Promotor erwünscht ist, wie ein Promotor, der für den pflanzliche Wirt von Interesse nativ ist, oder ein modifizierter Promotor, d. h. einer mit Transkriptionsinitiierungsregionen, die von einer anderen Genquelle stammen, sind zahlreiche Transkriptionsinitiierungsregionen verfügbar, die eine weite Vielzahl einer konstitutiven oder regulierbaren, d. h. induzierbaren Transkription der Funktionen des Strukturgens ergeben. Die Transkriptions-/Translations-Initiierungsregionen, die solchen Strukturgenen entsprechen, werden unmittelbar 5'-stromaufwärts zu den jeweiligen Startcodons gefunden. Unter den für Pflanzen verwendeten Transkriptions-Initiierungsregionen befinden sich Regionen, die mit den T-DNA-Strukturgenen wie für Nopalin- und Mannopin-Synthasen, die 19S- und 35S-Promotoren von CaMV assoziiert sind, und die 5'-Stromaufwärts-Regionen von anderen pflanzlichen Genen wie Napin, ACP, SSU, PG, Zein und Phaseolin E. Verstärkte Promotoren wie Doppel-35S sind zur Expression von LPAAT-Sequenzen ebenfalls verfügbar. Für solche Anwendungen, bei denen nichtcodierende 5'-Stromaufwärts-Regionen von anderen, während der Samenreifung regulierten Genen erhalten werden, sind diejenigen, die vorzugsweise im pflanzlichen Embryogewebe exprimiert werden, wie ACP- und von Napin stammende, die Transkriptionsinitiierung steuernde Regionen, erwünscht. Solche ”samenspezifischen Promotoren” können gemäß der Lehren der US-Ser.Nr. 07/147,781, eingereicht am 25.1.1988 (fortgesetzt als US-Ser.Nr. 07/550,804 und 07/742,834, eingereicht am 9.7.1990 und am 8.8.1991; jetzt US 5,420,034 ) und US.-Ser.Nr. 07/494,722, eingereicht am 16. März 1990 (fortgesetzt als US 07/242743 , eingereicht am 19.10.1992, jetzt US 5,530,194 ; Prioritätsdokument für WO 91/13980 ) erhalten und verwendet werden.
Transkriptionsinitiierungsregionen, die vorzugsweise in Samengewebe exprimiert werden, d. h., die in anderen Pflanzenteilen nicht nachweisbar sind, werden als wünschenswert für TAG-Modifikationen betrachtet, um disruptive oder nachteilige Auswirkungen des Genprodukts zu minimieren.
Regulatorische Transkriptterminationsregionen können ebenfalls in DNA-Konstrukten dieser Erfindung bereitgestellt werden. Transkriptterminationsregionen können von der die Pflanzen-LPAAT codierenden DNA-Sequenz oder einer zweckmäßigen, von einer anderen Genquelle stammenden Transkriptionsterminationsregion, zum Beispiel der Transkriptionsterminationsregion, die auf natürliche Weise mit der Transkriptinitiierungsregion assoziiert ist, erhalten werden. Wenn die Transkriptterminationsregion von einer anderen Genquelle stammt, enthält sie wenigstens etwa 0,5 kb, vorzugsweise etwa 1–3 kb der Sequenz 3' zum Strukturgen, von dem die Terminationsregion stammt.
Pflanzen-Expressions- oder Transkriptionskonstrukte mit einer Pflanzen-LPAAT als DNA-Sequenz von Interesse für eine erhöhte oder verminderte Expression davon können mit einer weiten Vielzahl des Pflanzenlebens, insbesondere dem Pflanzenleben, das in die Produktion von pflanzlichen Ölen für Nahrungsmittel- und industrielle Zwecke einbezogen ist, verwendet werden. Am meisten bevorzugt sind ausgeglichene Ölsaat-Erntegüter. Pflanzen von Interesse umfassen Raps (Canola-Varietät und Varietät mit hohem Erucasäure-Gehalt), Sonnenblume, Safflor, Baumwolle, Sojabohne, Erdnuss, Kokosnuss und Ölpalmen und Mais. In Abhängigkeit vom Verfahren zur Einführung der rekombinanten Konstrukte in die Wirtszelle können anderer DNA-Sequenzen erforderlich sein. Wichtigerweise ist diese Erfindung gleichermaßen auf zweikeimblättrige und einkeimblättrige Spezies anwendbar und ist auf neue und/oder verbesserte Transformations- und Regulationstechniken leicht anwendbar.
Von besonderem Interesse ist die Verwendung von Pflanzen-LPAAT-Konstrukten in gentechnisch veränderten Pflanzen zur Erzeugung einer speziellen Fettsäure im Samenöl der Pflanze, wenn das TAG in den Samen nicht gentechnisch veränderter Pflanzen der gentechnisch veränderten Spezies diese spezielle Fettsäure auf natürliche Weise nicht enthält. Zum Beispiel ist bei Brassica-Pflanzen, die dahingehend gentechnisch verändert wurden, dass sie die Fettsäuren mit mittlerer Kette und insbesondere Laurat (12:0) im Samenöl erzeugen, ein Mangel an einer sn-2-Acylierung gefunden worden. (Siehe WO 92/20236 ). Zum Beispiel beträgt in Öl von Pflanzen, bei denen 40% der Samenöl-Fettacylgruppen vom (hauptsächlich 18:1-)Typ mit langer Kette zu 12:0 geändert wurde, die 12:0-Anreicherung an den Positionen sn-1 und sn-3 (zusammen gemittelt) etwa 50%, und die 12:0-Anreicherung an der Position sn-2 beträgt etwa 12% Darüber hinaus wurde geschätzt, dass nach der Abtrennung der intakten Triglyceridspezies durch Umkehrphasen-HPLC nur 1% der Triglyceridmoleküle tri-12:0 sind, während der statistisch vorhergesagte Anteil aus einer statistischen Acylierung bei allen drei sn-Positionen 7% betragen würde. Somit ist die Expression eines Lauroyl-CoA bevorzugenden Pflanzen-LPAAT in solchen C12 erzeugenden Brassica-Pflanzen für eine verstärkte Einarbeitung von 12:0-Fettacylgruppen in die sn-2-Position wünschenswert.
Die mittlere Ketten bevorzugende Kokosnuss-LPAAT kann somit zur Verstärkung der Einarbeitung von Laurat in Speicheröl in Raps verwendet werden. Darüber hinaus ist die Erzeugung eines andere Fettacylgruppen mit mittlerer Kette enthaltenden TAG in Brassica und anderen Ölsaat-Erntegutpflanzen auch erwünscht. (Siehe beispielsweise WO 92/20236 , WO 94/10288 und die anhängige Anmeldung US Ser.Nr. 08/383,756, eingereicht am 2. Februar 1995). Weil die Kokosnuss-LPAAT eine signifikante Fähigkeit zur Verwendung anderer Ketten mit mittlerer Länge, insbesondere von C10 und C14, hat, hat sie auch das Potenzial, die Einarbeitung dieser Fettsäuren in Pflanzen-TAG zu verstärken. Weiterhin sind TAG mit Fettacylgruppen mit kürzeren Ketten in allen drei sn-Positionen für verschiedene medizinische Anwendungen wünschenswert. Solche TAG-Moleküle können durch eine Expression zweckmäßiger Acyl-TCP-Thioesterase- und LPAAT-Gene in Ölsaat-Erntegutpflanzen erhalten werden.
Gleichermaßen ist die Expression einer beliebigen LPAAT, die dazu fähig ist, eine Fettacylgruppe mit mittlerer Kette in die sn-2-Position eines LPA-Substrats zu übertragen, auch für Anwendungen in Erntegutspezies erwünscht, die dahingehend gentechnisch verändert sind, dass sie Fettsäuren mit mittlerer Kette enthalten. Eine präferentielle Aktivität ist nicht erforderlich, solange die Fähigkeit zur Verwendung mittlerer Ketten vorhanden ist.
Weitere gentechnische Anwendungen an Pflanzen für LPAAT-Proteine dieser Erfindung umfassen ihre Verwendung zur Herstellung von strukturierten Pflanzenlipiden, die TAG-Moleküle mit wünschenswerten Fettacylgruppen enthalten, die in spezielle Positionen an den TAG-Molekülen eingearbeitet sind. Zum Beispiel enthält bei Brassica-Pflanzen die sn-2-Position des TAG hauptsächlich ungesättigte Fettacylgruppen. Bei bestimmten Anwendungen kann es wünschenswert sein, gesättigte Fettsäuren an der sn-2-Position zu haben, und somit kann eine LPAAT von einer anderen pflanzlichen Quelle dahingehend gekennzeichnet sein, dass sie eine Aktivität beispielsweise an 16:0- oder 18:0-Acyl-CoA-Substraten hat und zur Transformation von Brassica verwendet wird.
Darüber hinaus wird in den Saatölen von Brassica-Pflanzen, die hohe Konzentrationen an Erucasäure (22:1) enthalten (Raps mit hohem Erucasäure-Gehalt oder HEAR) wenig oder kein 22:1 in der sn-2-Position der TAG-Moleküle gefunden. Eine ”Trieruca-”HEAR-Pflanze mit 22:1 an allen drei der sn-Positionen des TAG ist wünschenswert. Ein solches Samenöl könnte beispielsweise durch die Expression einer C22:1-aktiven LPAAT in HEAR-Pflanzen erhalten werden. Ein Gen, das eine solche LPAAT codiert, könnte aus einer Pflanze wie der Sumpfblume (Limnanthes alba) erhalten werden, deren Samen Erucasäure enthaltendes Öl (22:1) an allen drei sn-Positionen sammeln.
Das Transformationsverfahren zum Erhalt solcher transgener Pflanzen ist in der vorliegenden Erfindung nicht kritisch, und verschiedene Verfahren zur Transformation von Pflanzen sind gegenwärtig verfügbar. Weiterhin können neuere Verfahren zur Transformierung von Erntegut in demjenigen Maß, in dem sie verfügbar werden, hierunter auch direkt angewandt werden. Zum Beispiel können viele Pflanzenspezies, die gegenüber einer Infektion mit Agrobacterium auf natürliche Weise empfindlich sind, über ternäre oder binäre Vektorverfahren einer durch das Agrobacterium vermittelten Transformation erfolgreich transformiert werden. In vielen Fällen ist es wünschenswert, dass an einer oder beiden Seiten, insbesondere an der linken und der rechten Seite und noch spezieller auf der rechten Seite des Konstrukts T-DNA angrenzt. Dies ist besonders brauchbar, wenn beim Konstrukt A. tumefaciens oder A. rhizogenes als Transformationsmodus verwendet wird, obwohl die T-DNA-Ränder mit anderen Transformationsmodi verwendet werden können. Darüber hinaus sind Techniken der Mikroinjektion, des Bombardements mit DNA-Partikeln und der Elektroporation entwickelt worden, die die Transformation verschiedener einkeimblättriger und zweikeimblättriger Pflanzenspezies ermöglicht.
Normalerweise ist in den DNA-Konstrukt ein Strukturgen mit den erforderlichen Regulierungsregionen zur Expression in einem Wirt eingeschlossen, dass eine Selektion von Transformantenzellen ermöglicht. Das Gen kann eine Resistenz gegenüber einem cytotoxischen Mittel, z. B. einem Antibiotikum, Schwermetall, Toxin, oder eine einem auxotrophen Wirt Prototrophie verleihende Komplementation oder eine Virusimmunität ergeben. In Abhängigkeit von der Anzahl der verschiedenen Wirtsspezies wird das Expressionskonstrukt oder Komponenten davon eingeführt, wobei ein oder mehrere Marker verwendet werden können, wenn verschiedene Selektionsbedingungen für die verschiedenen Wirte verwendet werden.
Wenn Agrobacterium zur Transformation von Pflanzenzellen verwendet wird, kann ein Vektor verwendet werden, der zur homologen Rekombination mit T-DNA oder dem im Agrobacterium-Wirt vorhandenen Ti- oder Ri-Plasmid in den Agrobacterium-Wirt eingeführt werden kann. Das die T-DNA zur Rekombination enthaltende Ti- oder Ri-Plasmid kann funktionell (armed) (zur Gallenbildung befähigt) oder unschädlich gemacht (disarmed) (zur Gallenbildung nicht befähigt) sein, wobei Letzteres zulässig ist, solange die vir-Gene im transformierten Agrobacterium-Wirt vorhanden sind. Das funktionelle Plasmid kann eine Mischung aus normalen Pflanzenzellen und Galle ergeben.
In einigen Fällen, in denen Agrobacterium als Vehikel zur Transformation von Wirtspflanzenzellen verwendet wird, wird das Expressions- oder Transkriptionskonstrukt, das von der (den) T-DNA-Grenzregion(en) eingegrenzt wird, in einen Vektor mit einem breiten Wirtsbereich insertiert, der zur Replikation in E. coli und Agrobacterium befähigt ist, wobei Vektoren mit einem breiten Wirtsbereich in der Literatur beschrieben sind. Üblicherweise eingesetzt wird pRK2 oder ein Derivat davon. Siehe beispielsweise Ditta et al., (Proc. Nat. Acad. Sci., U.S.A. (1980) 77: 7347–7351) und EP 0 120 515 .
Alternativ kann man die in Pflanzenzellen zu exprimierenden Sequenzen in einen Vektor insertieren, der separate Replikationssequenzen enthält, wobei einer davon den Vektor in E. coli und der andere in Agrobacterium stabilisiert. Siehe beispielsweise McBride und Summerfelt (Plant Mol. Biol. (1990) 14: 269–276), wo der pRiHRI-(Jouanin et al., Mol. Gen. Genet. (1985) 201: 370– 374)Replikationsursprung verwendet wird und eine zusätzliche Stabilität der Pflanzen-Expressionsvektoren in Agrobacterium-Wirtszellen ergibt.
Eingeschlossen in den Expressions-Konstrukt und die T-DNA sind ein oder mehrere Marker, die eine Selektion des transformierten Agrobacteriums und der transformierten Pflanzenzellen ermöglichen. Eine Reihe von Markern wie eine Resistenz gegenüber Chloramphenicol, Kanamycin, Aminoglycosid-G418 oder Hygromycin, ist zur Verwendung mit Pflanzenzellen entwickelt worden. Der spezielle, verwendete Marker ist bei dieser Erfindung nicht wesentlich, wobei der eine oder andere Marker in Abhängigkeit vom speziellen Wirt und der Konstruktionsweise bevorzugt ist.
Zur Transformation von Pflanzenzellen unter Verwendung von Agrobacterium können Explantate mit dem transformierten Agrobacterium vereinigt und für einen für die Transformation ausreichenden Zeitraum inkubiert, die Bakterien abgetötet und die Pflanzenzellen in einem zweckmäßigen selektiven Medium kultiviert werden. Sobald sich ein Kallus bildet, können die Bildung eines Schößlings durch die Verwendung der zweckmäßigen Pflanzenhormone gemäß bekannter Verfahren unterstützt und die Schößlinge zur Neubildung von Pflanzen in ein Wurzelbildungsmedium übertragen werden. Die Pflanzen können dann gezogen werden, bis sie Samen bilden, und die Samen können zur Bildung repetitiver Generationen und zur Isolierung pflanzlicher Öle verwendet werden.
Die Erfindung, die jetzt allgemein beschrieben ist, wird unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele, die nur zu veranschaulichenden Zwecken eingeschlossen sind und nicht dahingehend aufgefasst werden dürfen, dass sie die vorliegende Erfindung einschränken, leichter verstanden.
BEISPIELE
Beispiel 1 Assay auf LPAAT-Aktivität
A. Assay auf LPAAT-Aktivität in zellfreien Homogenisaten und Membranpräparaten
Zur Untersuchung der LPAAT-Aktivität wird die Probe in einer gepufferten Lösung mit Lysophosphatidsäure-(LPA-) und Acyl-Coenzym-A-(Acyl-CoA)-Substraten inkubiert. Die Acylsubstituenten der beiden Substrate werden dahingehend ausgewählt, dass sie der Spezifität des gemessenen Enzyms entsprechen. Um beispielsweise die Aktivität einer LPAAT mit einer Präferenz für Substrate mit mittlerer Kette zu messen, können Lauroyl-LPA (Lauroyllysophosphatidsäure) und Lauroyl-CoA verwendet werden, um die Aktivität einer Acylgruppen mit längeren Ketten bevorzugenden LPAAT zu messen, können Oleoyl-LPA und Oleoyl-CoA verwendet werden, um die Aktivität einer Acylgruppen mit sehr langen Ketten bevorzugenden LPAAT zu messen, können Erucyl-LPA und Erucyl-CoA verwendet werden und so weiter, was vom Typ der zu testenden LPAAT abhängt. Die Acylgruppe eines Substrats ist radioaktiv markiert, um das gebildete Produkt nachzuweisen. In den folgenden Beispielen ist der Acylsubstituent des Acyl-CoA-Substrats mit ¹⁴C in der Carboxylgruppe radioaktiv markiert. Eine LPAAT-Aktivität führt zur Übertragung dieser Acylgruppe vom Acyl-CoA-”Donor-”Substrat auf das LPA-”Akzeptor-”Substrat, wobei Letzteres zum Produkt, Phosphatidsäure (PA), umgewandelt wird. Die LPAAT-Aktivität wird als die Menge an radioaktivem Produkt, das während einer gegebenen Assaydauer gebildet wird, gemessen. Als Folge der übertragenen radioaktiv markierten Acylgruppe am mittleren Kohlenstoffatom des Moleküls ist das PA-Produkt radioaktiv, und die Menge des gebildeten PA kann durch eine Messung der Radioaktivität der PA-Fraktion bestimmt werden. Für diese Messung wird PA zuerst mittels Lösungsmittelpartitionierung oder Dünnschichtchromatographie (TLC) vom Acyl-CoA-Substrat abgetrennt.
Acyl[1-¹⁴C]-CoA-Substrate können von kommerziellen Zulieferern wie Amersham (Arlington Heights, IL) erworben werden. Acyl[1-¹⁴C]-CoA-Substrate, die nicht von kommerziellen Zulieferern erworben werden können (z. B. Lauroyl[1-¹⁴C]-CoA oder Erucyl[1-¹⁴C]-CoA), können enzymatisch synthetisiert werden, wobei das Verfahren von Taylor et al. (Anal. Biochem. (1990) 184: 311–316) angewandt wird. Die in der Synthese verwendeten [1-¹⁴C]-Fettsäuren weisen typischerweise eine spezifische Radioaktivität von 20 Ci/mol auf. Vor der Verwendung wird das radioaktiv markierte Acyl-CoA-Substrat auf 12,5 μM verdünnt und in 3 mM Natriumacetat (pH-Wert 4,8) aufbewahrt. Oleoyl-LPA wird von kommerziellen Zulieferern erhalten, Lauroyl-LPA- oder Erucyl-LPA-Substrat kann unter Verwendung des Verfahrens von Ichihara et al. (Eur. J. Biochem. (1987) 167: 339–3457) oder Cao et al. (Plant Phys. (1990) 94: 1199–1206) auf der Grundlage der Verwendung von Phospholipase D zur Abspaltung von Cholin von kommerziell verfügbarem Lauroyllysophosphatidylcholin enzymatisch synthetisiert werden.
20 μl der auf die LPAAT-Aktivität zu untersuchenden Probe werden mit 217,5 μl einer Assaybestandteilmischung in einer 4-ml-Ampulle mit Schraubverschluss vermischt. Die Komponenten dieser Mischung werden so eingestellt, dass nach der unten beschriebenen Zugabe von Substrat das endgültige Assaysystem von 250 μl Folgendes enthält: 100 mM HEPES-NaOH (pH-Wert 7,5) (HEPES = N-(2-hydroxyethyl)piperazin-N'-(2-ethansulfonsäure), 200 mM NaCl, 4% Glycerin (Vol./Vol.), 10 mM EDTA (Ethylendiamintetraacetat, Dinatriumsalz), 5 mM β-ME (β-Mercaptoethanol). Dann wird das LPA-Substrat zugegeben (2,5 μl), wodurch eine Endkonzentration von 20 μM erhalten wird. Kontrollproben zur Bestimmung der nichtenzymatischen Hintergrund”aktivität” können hergestellt werden, indem die LPAAT-Probe oder das LPA weggelassen wird. Die Inkubation des Assays wird durch die Zugabe von 10 μl der radioaktiv markierten 12,5-mM-AcylCoA-Lösung so begonnen, dass die Endkonzentration 5 μM beträgt. Wenn Acyl-CoA-Konzentrationen von 12,5 mM leicht abweichen, wird das Volumen von 10 μl zweckmäßig so geändert, dass die Endkonzentration von 5 μM erreicht wird, und die Volumenänderung wird bewerkstelligt, indem der Wassergehalt der Assaymi schung so eingestellt wird, dass das Gesamtvolumen und alle Konzentrationen unverändert bleiben. Die Inkubation erfolgt 20–30 min lang in einem Wasserbad bei 30°C.
Zur Beendigung des Assays werden 0,25 ml 1 M KCl in 0,2 M H₃PO₄ zur Ampulle gegeben. Zu diesem Zeitpunkt werden 40 μl BSA (Rinderserumalbumin, Fraktion V) mit 1 mg/ml zugegeben, gefolgt von 0,75 ml einer Lösung von 67 μg/ml unmarkierter PA (die als ”Träger” zur Erleichterung des Partitionierens dient) in Chloroform/Methanol (2:1, Vol./Vol.). Die Kettenlängen der PA-Acylgruppen sind so gewählt, dass sie den in den Assaysubstraten verwendeten entsprechen. Beim gründlichen Vermischen dieser Komponenten partitioniert das radioaktiv markierte PA-Produkt der LPAAT-Reaktion in die organische Phase und von Acyl-CoA und LPA, die nicht umgesetzt sind, weg. Die Ampulle wird kurz bei langsamen Drehzahlen zentrifugiert, um die Trennung der organischen (unteren) und der wässrigen (oberen) Phase zu erleichtern. Die wässrige Phase wird dann entfernt und verworfen. Die gesamte, in die organische Phase extrahierte Radioaktivität wird mittels Flüssigkeitsszintillationszählung bestimmt; eine 100-μl-Probe der organischen Phase wird in eine 20-ml-Szintillationsampulle übertragen und trocknen gelassen, und Szintillationsflüssigkeit (3–5 ml) wird in die Ampulle gegeben. Die Radioaktivität der Probe nach Subtraktion der Radioaktivität ”ohne Enzym” oder ”ohne LPA” wird als ungefähre Angabe der Menge der in der LPAAT-katalysierten Reaktion gebildeten PA und damit für die LPAAT-Aktivität genommen.
Die Bestimmung ist aufgrund des Vorhandenseins von Nicht-PA-Radioaktivität im organischen Extrakt eine Näherung. Die Nicht-PA-Radioaktivität stammt von der Partitionierung einer kleinen Menge des radioaktiv markierten Acyl-CoA-Substrats in die organische Schicht zusammen mit bestimmten Verunreinigungen im Acyl-CoA (die von Verunreinigungen in der ursprünglichen, zu dessen Herstellung verwendeten radioaktiven Fettsäure stammen) und freier Fettsäure, die aus einer möglicherweise stattgefundenen Hydrolyse von Acyl-CoA stammt.
Eine genauere Bestimmung der LPAAT-Aktivität kann erhalten werden, indem das PA-Produkt mittels TLC von diesen Verunreinigungen abgetrennt wird. Die übrige organische Phase wird auf eine Siliciumdioxid-TLC-Platte aufgebracht. eine aufsteigende Chromatographie wird 50 min lang durchgeführt, wobei das Lösungsmittelgemisch Chloroform/Pyridin/88% Ameisensäure (50:30:7, Vol./Vol.) verwendet wird. Nach dem Trocknen der Platte wird die Verteilung der Radioaktivität sichtbar gemacht und mittels eines radioanalytischen Bilderzeugungssystems von AMBIS (AMBIS Systems Inc., San Diego, Kalifornien) quantifiziert. Aus einer vorherigen Auftragung von Standard-Lipidkomponenten ist die Rf der PA bekannt. Die mit dem PA-Fleck assoziierte Radioaktivität wird als Prozentwert der Gesamt-Radioaktivität der auf die Platte aufgebrachten Assayprobe ausgedrückt.
Dieses Verhältnis ergibt ein Anzeichen für den Anteil der Szintillationszählungen, die das PA-Produkt repräsentieren, und kann verwendet werden, um die Zählungen zu korrigieren, die für die gesamte im Assay gebildete PA-Radioaktivität erhalten wurde.
Für eine gegebene LPAAT-Enzymquelle werden die Auswirkungen der Inkubationszeit und der Probenkonzentration auf die LPAAT-Aktivität bestimmt, um die Bedingungen zu definieren, unter denen die Ergebnisse des Assays (Radioaktivität von PA) ein lineares Maß für die LPAAT-Aktivität ergeben. Nachfolgende Assays werden dann innerhalb der bestimmten Grenzwerte durchgeführt.
B. Assay auf LPAAT-Aktivität nach einer Löslichmachung
Nach der unten beschriebenen Löslichmachung des LPAAT-Proteins aus Pflanzenmembranen ist eine Modifizierung der obigen Assaybedingungen erforderlich, um die maximale LPAAT-Modifikation nachzuweisen. Dies ist insbesondere dann wichtig, nachdem die löslich gemachte LPAAT auf wenigstens einer Säule chromatographiert wurde. Die wichtige Modifikation des Assays besteht in der zu Beginn des Assayverfahrens erfolgenden Zugabe von 1 μl einer konzentrierten Phospholipid-(PE-)Lösung zu 20 μl der LPAAT enthaltenden Probe in einer Glasampulle. Die hohen CHAPS-Konzentrationen (wenigstens 1% Gew./Vol.) und NaCl (typischerweise 0,5 M oder mehr) im löslich gemachten LPAAT-Präparat unterstützen die Dispersion der Phospholipide. Die Phospholipidlösung wird erhalten, indem rohe Sojabohnen-Phospholipide (L-Phosphatidycholin aus Sojabohne, ”Type IVs”, erhalten von der Sigma Chemical Company, St. Louis) mit 50 mg/ml in 0,5% (Gew./Vol.) CHAPS (3-[3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propansulfonat) mit Ultraschall behandelt wird, bis eine gleichmäßige Suspension erhalten wird. Synthetische Phospholipide (Phosphatidylcholin, Inosit oder Ethanolamin allein oder in Kombination) und Truthahn-Eigelb-Phospholipidpräparat stellen gegenüber dem rohen Sojabohnen-Material keine signifikante Verbesserung dar.
Die übrigen (oben beschriebenen) Assaybestandteile mit Ausnahme des Acyl-CoA-Substrats werden dann als 219 μl einer Mischung zugegeben. Durch diese Zugabe werden das CHAPS und das NaCl auf Konzentrationen verdünnt, in denen sie die Enzymaktivität nicht behindern, wobei die Lösung aber auch nicht trübe wird, was darauf hindeutet, dass die Phospholipide dispergiert bleiben. Radioaktiv markiertes Acyl-CoA (10 μl oder ein oben aufgeführtes, zweckmäßig eingestelltes Volumen) wird zugegeben, um die LPAAT-katalysierte Reaktion zu starten, und der Rest des Assayverfahrens wird wie oben beschrieben vollendet.
Die Auswirkung des oben beschriebenen Zugabezeitpunkts der Phospholipide zum Assay ist in der nachfolgenden Tabelle 1 veranschaulicht: TABELLE 1

Stufe der PL-Zugabe LPAAT-Aktivität (cpm)

Zu Beginn des Assays (Kontrolle) 914

Keine Zugabe 0

Zu Beginn der Inkubation 231

Am Ende der Inkubation 0
Diese Ergebnisse demonstrieren, dass die stimulatorische Wirkung der Phospholipide am größten ist, wenn sie zu Beginn des Assayverfahrens vor der Verdünnung der CHAS- und der NaCl-Konzentration durch die Zugabe der anderen Assaybestandteile zum LPAAT-Präparat gegeben werden. Die Zugabe von Phospholipiden nach dieser Verdünnung oder unmittelbar vor der Zugabe der Partitionierungsmischung (Chloroform/Methanol etc.) ist weniger wirksam oder unwirksam.
Um zu bestimmen, ob diese Sequenz der Phospholipid-Zugabe für das LPAAT-Enzym oder für die Phospholipide wichtiger ist, wird ein zweites Experiment durchgeführt, in dem ein gereinigtes LPAAT-Präparat (S3-Präparat, das auf Säulen mit roter 120-Agarose und Hydroxylapatit, Beispiel 5 unten, gereinigt wurde) unmittelbar vor Inkubationsbeginn zugegeben wird. Bei diesem Experiment werden die Phospholipide zuerst mit dem zur Löslichmachung dienenden Puffer vermischt und anschließend mit den Assaykomponenten verdünnt, bevor die LPAAT-Aktivität zugegeben wird.
Die Ergebnisse demonstrieren, dass die Aktivität, die dadurch erhalten wird, dass das LPAAT-Präparat unmittelbar vor der Inkubation zugegeben wird, mit derjenigen identisch ist, die erhalten wird, wenn die Phospholipide zu Beginn des Assays zugegeben werden. Daher ist die Behandlung der Phospholipide durch die Einwirkung hoher CHAPS- und NaCl-Konzentrationen darauf und die anschließende Verdünnung der Mischung kritisch, um ihre LPAAT-Aktivierung zu erhalten. Die endgültige LPAAT-Aktivität hängt von der eingesetzten Phospholipid-Konzentration, die sich bis auf 20 μg Phospholipid/Assay erhöht und von 20 bis 50 μg Phospholipid/Assay unverändert bleibt, ab. Diese Abhängigkeit von der Phospholipid-Konzentration ist von der S3-Konzentration unabhängig. Diese Beobachtungen sind in 1 zusammengefasst.
In den folgenden Beispielen, in denen löslich gemachte und einer Säulenchromatographie unterzogene Kokosnuss-LPAAT-Präparate impliziert sind, beziehen die Assaydaten sich auf dieses modifizierte Assayverfahren, das die Verwendung von Sojabohnen-Phospholipiden einschließt.
Es ist nicht möglich, die löslich gemachte Lorbeer-LPAAT für lange Ketten auf diese Weise zu aktivieren, um eine maximale Aktivität zu erhalten; wenn die Phospholipide in den Lorbeer-Assay eingeschlossen sind, erfolgt eine alternative Reaktion, die die radioaktiv markierte Acylgruppe vom 18:1-CoA zu einem anderen Produkt umleitet, das durch TLC vom LPAAT-Produkt (PA) unterscheidbar ist.
Beispiel 2 Herstellung von zellfreien Homogenisaten und Membranfraktionen mit LPAAT-Aktivität
A. Kokosnuss-LPAAT
Kokosnüsse (Cocos nucifera) werden aus örtlichen Supermarkt-Geschäften erhalten. Für eine maximale Ausbeute der LPAAT-Aktivität werden unreife, als ”grün” bezeichnete Kokosnüsse, die ein blassbraunes oder weißes Endokarp (äußere ”Schale”) haben, verwendet. Das Endokarp der Kokosnuss wird durchstochen, und die ”Milch”flüssigkeit innerhalb des hohlen Inneren wird abgelassen und entsorgt. Die Kokosnuss wird dann so in Stücke zerbrochen, dass das weiße Endosperm-Gewebe, das die Innenseite des Endokarp auskleidet, zerteilt und isoliert werden kann. Die braune Testa zwischen dem Endosperm und dem Endokarp wird entfernt und entsorgt, und das Endosperm wird durch Eintauchen in flüssigen Stickstoff gefroren und zur zukünftigen Verwendung bei –70°C aufbewahrt. Bei einem typischen, unten beschriebenen Präparat werden 24 g Gewebe verarbeitet. Weil die Reife des Endosperms einzelner Kokosnüsse und damit die Ausbeute an erhältlichem LPAAT beträchtlich variieren kann, kann eine Probe des Endosperms genommen werden, um den LPAAT-Gehalt zu bewerten, bevor ein Präparat im 24-g-Maßstab begonnen wird. Eine solche Probennahme kann bewerkstelligt werden, indem ein Loch mit einem Durchmesser von etwa 1 inch in das Endokarp geschnitten wird. Die resultierende Endosperm-Scheibe wird vom Tests und vom Endokarp abgetrennt und wie unten beschrieben verarbeitet, außer, dass 16 ml Extraktionspuffer zur Analyse einer pulverisierten 2-g-Endosperm-Probe verwendet werden.
Gefrorenes Kokosnuss-Endospermgewebe wird durch Prallbrechen in einem Stahlmörser mit Pistill in flüssigem Stickstoff pulverisiert. Das Pulver von 24 g Gewebe wird bei 0–4°C zu 144 ml Extraktionspuffer gegeben, und die Mischung wird mittels eines Gewebehomogenisator von Polytron gemischt, wodurch ein zellfreies Homogenisat erhalten wird. Der Extratkionspuffer enthält 50 mM HEPES-NaOH (pH-Wert 7,5), 3 M NaCl, 10 mM EDTA, 10 mM DIECA (Diethyldithiocarbaminsäure, Natriumsalz), 100 μM Pefabloc (von Sigma Chemical oder Boehringer Mannheim erhältlicher Proteaseinhibitor), 1 μM Leupeptin, 0,1 μM Pepstatin A, 5 mM β-ME. Alle anschließenden Schritte werden bei 4°C durchgeführt.
Das Homogenisat wird durch 4 Schichten Gaze, die mit dem Extraktionspuffer benetzt worden war, filtriert. Die verbleibenden Feststoffe werden in der Gaze zusammengefaltet, und die Gaze wird ausgewrungen, um mehr Flüssigkeit zu extrahieren. Die Gaze wird dann auseinandergefaltet, die Feststoffe werden mit 48 ml Extraktionspuffer benetzt, und die Gaze wird nochmals ausgewrungen. Das resultierende Filtrat wird 30 min lang bei 12 000 g zentrifugiert. Die resultierende Probe enthält ein aufschwimmendes Fettpolster und ein Pellet, die beide entsorgt werden, und eine überstehende Fraktion (S1). Die überstehende Fraktion wird mittels Mirachloth (Calbiochem; La Jolla, CA), das mit Extraktionspuffer benetzt worden war, filtriert, um restliche Feststoffe zu entfernen. Diese S1-Fraktion wird dann über Nacht gegen 4 l Dialysepuffer (50 mM HEPES-NaOH, pH-Wert 7,5, 1 M NaCl, 5 mM β-ME) dialysiert, wobei der Puffer einmal gewechselt wird. Es wird eine Dialysemembran mit einem Molmassen-Rückhaltevermögen von 12 000–14 000 verwendet. Das dialysierte S1-Material (DS1) wird dann 30 min lang bei 12 000 g zentrifugiert, und die überstehende Fraktion wird wiederum durch mit Puffer benetztes Miracloth filtriert.
Der DS1-Überstand wird dann 2 h lang bei 100 000 g zentrifugiert. Die resultierende Probe enthält eine granulierte Fraktion, die subzelluläre Membranen (P2) und eine überstehende Fraktion, die entsorgt wird, enthält. Restliche überstehende Flüssigkeit wird von der P2-Fraktion entfernt, indem die Zentrifugenröhrchen abgegossen und mit Papiertüchern ausgewischt werden.
Der P2-Puffer (100 mM HEPES-NaOH (pH-Wert 7,5), 200 mM NaCl, 20% Glycerin (Gew./Vol.), 10 mM EDTA, 5 mM β-ME) wird so zu den P2-Pellets gegeben, dass, wenn die Mischung ein einem Homogenisator aus gemahlenem Glas gegeben und homogenisiert wird, das Gesamtvolumen des Homogenisats 2,5 ml beträgt. Das P2-Homogenisat wird in Aliquote aufgeteilt, in flüssigem Stickstoff gefroren und zur zukünftigen Verwendung bei –70°C aufbewahrt.
B. LPAAT des kaliformischen Lorbeers
Ein P2-Membranhomogenisat von unreifen Kotyledonen sich entwickelnder Samen des kalifornischem Lorbeers (Umbellularia californica) wird mit Ausnahme der untenstehenden Angaben im Wesentlichen gemäß der obigen Beschreibung hergestellt. Die Samen werden zerschnitten, und die blassgrünen Kotyledone werden entfernt, in flüssigem Stickstoff gefroren und bei –70°C aufbewahrt. Das gefrorene Lorbeergewebe wird gemäß der Beschreibung oben in flüssigem Stockstoff pulverisiert. Typischerweise werden 20 g pulverisiertes Embryogewebe mit modifiziertem Extraktionspuffer (100 mM HEPES-NaOH, pH-Wert 7,5, 3 M NaCl, 10 mM DIECA, 100 μM PMSF (Phenylmethylsulfonylfluorid), 1 μM Leupeptin, 0,1 μM Pepstatin A) in einem Endvolumen von 200 ml homogenisiert. Das Homogenisat wird 15 min lang bei 10 000 g zentrifugiert, wodurch ein schwebendes Fettpolster und ein Pellet, die beide entsorgt werden, und eine überstehende Fraktion (S1) erhalten werden.
Die S1-Fraktion wird 90 min lang bei 100 000 g zentrifugiert, wodurch eine überstehende Fraktion und ein Pellet (P2) erhalten werden. Das P2-Pellet, das subzelluläre Membranen enthält, wird in etwa 30 ml des modifizierten Extraktionspuffers resuspendiert und nochmals 90 min lang bei 100 000 g zentrifugiert. Das resultierende Pellet (P3) wird in etwa 2 ml modifiziertem Puffer P2 (100 mM HEPES-NaOH (pH-Wert 7,5), 200 mM NaCl, 5% Glycerin (Gew./Vol.), 10 mM EDTA) resuspendiert. Die Suspension wird dann in Aliquote aufgeteilt, in flüssigem Stickstoff gefroren und bei –70°C zur zukünftigen Verwendung aufbewahrt.
C. Raps-LPAAT
Ein P2-Membranhomogenisat aus unreifen Embryos von sich entwickelnden Rapssamen (Brassica napus) wird mit Ausnahme der untenstehenden Angaben im Wesentlichen gemäß der obigen Beschreibung hergestellt. Unreife Brassica-Samen werden von Pflanzen geerntet, die in Wachstumskammern und Gewächshäusern gezogen worden waren. Die Embryos werden von den unreifen Samen abgeschnitten und in flüssigem Stickstoff gefroren. Etwa 1,66 g Brassica-Embryos werden in 8 ml modifiziertem Extraktionspuffer gemahlen, wobei ein gekühlter Mörser und ein gekühltes Pistill verwendet werden. Weil wenig Ausgangsgewebe verwendet wird, wird das Homogenisat nicht durch Gaze filtriert, sondern 50 min lang bei 10 000 g zentrifugiert. Die überstehende Fraktion (S1) wird dann 2 h lang bei 100 000 g zentrifugiert, und das resultierende, membranhaltige P2-Pellet wird in 0,25 ml modifiziertem P2-Puffer resuspendiert, in flüssigem Stickstoff gefroren und zur zukünftigen Verwendung bei –70°C aufbewahrt.
Beispiel 3 Charakterisierung der LPAAT-Aktivität in zellfreien Homogenisaten und Membranpräparaten P2
A. Enzymaktivität
Zellfreie Kokosnuss-, Lorbeer- und Rapshomogenisate und Membranpräparate P2 weisen alle LPAAT-Aktivität auf, wie mittels des in Beispiel 1A beschriebenen Assays gemessen wird. Die LPAAT-Aktivität hängt von der Inkubationszeit des Assays ab und variiert mit den Konzentrationen der Substrate und des P2-Präparats, wie für eine Enzymkatalyse erwartet wird. Eine Bestätigung der Identität des Reaktionsprodukts als PA kann erhalten werden, indem das Produkt mit A2-Phospholipase (z. B. gereinigt aus Crotalus-atrox-Venom kommerziell erhältlich) inkubiert wird. Radioaktivität wird in eine Form konvertiert, die bei der TLC als freie Fettsäure wandert. Weil die A2-Phospholipase die Fettacylgruppe am sn-2-Hydroxylsubstituenten von PA entfernt, ist dieses Ergebnis mit dem radioaktiven LPAAT-Produkt, das an der sn-2-Position radioaktiv markiert ist, konsistent.
B. Substratspezifität
Die LPAAT-Aktivität, die in die Biosynthese von Triacylglycerin (Samenöl) einbezogen ist, ist mit den (manchmal auch als ”Mikrosomen” bezeichneten zytoplasmatischen Membranen des endoplasmatischen Retikulums assoziiert und bevorzugt Acyl-CoA gegenüber Acyl-ACP als Donorsubstrate. Ein funktionell analoges Enzym, das dazu fähig ist, sowohl Acyl-ACP- als auch Acyl-CoA-Substrate zu verwenden, ist in Pflanzenplastiden vorhanden (Harwood in Crit. Rev. Plant Sci. (1989), Band 8, S. 1–43). Das Kokosnuss-P2-Präparat nutzt nicht, wie das LPAAT-Donorsubstrat, 12:0-ACP, sondern stattdessen 12:0-CoA. Dies deutet darauf hin, dass das Kokosnuss-P2-Präparat den Zytoplasmatyp des LPAAT enthält, der für die Biosynthese von Samenöl zweckmäßig ist. Derselbe Assay zeigt, dass das 12:0-ACP vom P2-Präparat nicht hydrolysiert wird, was zeigt, dass das Fehlen der Verwendung von 12:0-ACP durch Kokosnuss-LPAAT kein Ergebnis einer Verarmung an 12:0-ACP durch Hydroly se ist. Auf vergleichbare Weise nutzt das Lorbeer-P2-Präparat 18:1-ACP nicht signifikant als LPAAT-Donorsubstrat anstelle von 18:1-CoA. Somit enthält das Lorbeer-P2-Präparat auch den LPAAT-Typ des endoplasmatischen Retikulums, der für die Biosynthese von Samenöl zweckmäßig ist.
Lysophosphatidylcholin-(LPC-)Acyltransferase (LPCAT) ist ein LPAAT analoges Enzym, das in die Biosynthese von Membranlipiden (Phosphatidylcholin und dessen Derivate) statt Speicheröl einbezogen ist. Die Möglichkeit, dass die im LPAAT-Assay gemessene Aktivität nicht eine wahre LPAAT-, sondern stattdessen eine ineffiziente Wirkung von LPCAT auf die LPAAT-Substrate ist, kann mittels eines direkten Assays für LPCAT getestet werden. Zum Beispiel ist die LPAAT-Aktivität des Kokosnuss-Präparats P2 mit der Substratkombination 12:0-CoA + 12:0-LPA leicht messbar, während die LPCAT-Aktivität desselben Präparats mit den Substraten 12:0-CoA + 12:0-LPC nicht detektierbar ist. Dies deutet darauf hin, dass die gemessene LPAAT-Aktivität für mittlere Ketten auf ein LPAAT-Enzym und nicht auf eine ineffiziente Nebenreaktion von LPCAT zurückzuführen ist. Wenn die Substrate alle 18:1-Acylgruppen haben, sind die Aktivitäten im LPAAT- und im LPCAT-Assay (P2-Präparate) von vergleichbarer Größenordnung. Die Aktivitäten an Substraten mit langen Ketten können entweder ein einziges Acyltransferase-Enzym, das dazu fähig ist, LPA- und LPC-Aktzeptorsubstrate zu nutzen, oder diskrete LPAAT- und LPCAT-Enzyme ”mit langen Ketten”, die zusammen vorhanden sind, darstellen.
C. Spezifität für lange Ketten
Die LPAAT-Aktivitäten der P2-Membranpräparate werden weiterhin mit Bezug auf die Präferenz hinsichtlich der Kettenlänge für die Donor- und die Akzeptorsubstrate charakterisiert. In Tabelle 2 unten sind Ergebnisse für die LPAAT-Aktivitätsanalyse von P2-Membranpräparaten von Kokosnuss, Lorbeer und Raps aufgeführt. Die LPAAT-Aktivität wird gemessen, indem eine Vielzahl von Acyl-CoA-Donorsubstraten verwendet wird, wobei das Akzeptorsubstrat konstant als 12:0-LPA gehalten wird. TABELLE 2 LPAAT-Aktivität von Membranpräparaten P2

Donor-(Acyl-CoA)-Substrat LPAAT-Aktivität* von

Kokosnuss Lorbeer Raps

6:0 3 1 0

8:0 6 13 2

10:0 43 10 12

12:0 238 14 79

14:0 61 5 16

16:0 21 6 27

18:0 13 6 21

18:1 9 5 218

(* gebildete pmol PA/30-min-Assay)

Die Aktivität von Kokosnuss-LPAAT demonstriert eine drastische Bevorzugung für das 12:0 enthaltende Donorsubstrat, und sie verwendet auch bereitwillig zusätzliches Donor-Acyl-CoA-Substrate mit mittlerer Kette (10:0 und 14:0 enthaltende Acyl-CoA-Substrate). Die Aktivität von Lorbeer-LPAAT demonstriert, wenn 12:0-LPA das Akzeptorsubstrat ist, eine Bevorzugung von Acyl-CoA-Substraten mit mittlerer Kette (8:0, 10:0 und 12:0 enthaltend). In Einklang mit vorherigen Charakterisierungen bevorzugt Raps-LPAAT den 18:1-Donor, wenn 12:0-LPA der Akzeptor ist.
Ähnliche Acyl-CoA-Präferenzen werden beobachtet, wenn die Aktivität von Kokosnuss-LPAAT mit 18:1-LPA als Akzeptorsubstrat untersucht wird. Aufgrund von Unterschieden der Substratkinetik für 12:0-LPA und 18:1-LPA sind direkte Vergleiche der LPAAT-Aktivität an verschiedenen Akzeptorsubstraten unter Verwendung eines einzigen Acyl-CoA-Donorsubstrats schwierig zu bewerkstelligen.
In den folgenden Beispielen bezieht sich LPAAT ”für mittlere Ketten” auf die Aktivität, die mit 12:0-CoA- und 12:0-LPA-Substraten untersucht wird, und LPAAT ”für lange Ketten” bezieht sich auf die Aktivität, die mit 18:1-CoA- und 18:1-LAP-Substraten untersucht wird.
D. Andere Eigenschaften
Bei Verwendung des Lorbeer-P2-Membranpräparats erweisen sich viele Detergenzien als hemmend, wenn sie in den Assay eingeschlossen werden. Zum Beispiel wird eine Aktivität von LPAAT für lange Ketten (18:1-CoA und 18:1-LPA als Substrate) in Lorbeer-P2-Präparaten durch 0,1% (wobei alle Konzentrationen als Gew./Vol aufgeführt sind) Octylglucosid, 0,002% SDS (Natriumdodecylsulfat), 0,005% Zwittergent 3-14 (Calbiochem), 1% Tween^® 20 oder Brij 35, 0,03% Triton^® X100 und 0,1% Natriumdesoxycholat vollständig gehemmt. Eine Einwirkung höherer Konzentrationen als dieser auf das P2-Präparat ist ohne einen permanenten Verlust der Enzymaktivität mit der Maßgabe möglich, dass die Enzym-plus-Detergens-Mischung vor dem Assay verdünnt wird, um die Detergenzkonzentration auf eine tolerable Konzentration zu verdünnen. Zum Beispiel kann das Lorbeer-P2-Präparat einer einstündigen Einwirkung von 1,25% Brij 35, 0,5% Octylglucosid, 0,1 % Triton^® X-100 oder 2,5% Tween^® 20 ausgesetzt werden, ohne dass ein vollständiger Verlust der Aktivität erfolgt, vorausgesetzt, das Präparat wird vor dem Assay so verdünnt, dass diese Detergenzkonzentrationen (bis 0,025, 0,01, 0,002 bzw. 0,05%) erreicht werden.
Das in den folgenden Beispielen zur Löslichmachung verwendete Detergens CHAPS hemmt den Kokosnuss-LPAAT-Assay für mittlere Ketten bei Konzentrationen oberhalb von 0,1% (Gew./Vol.). Folglich muss mit CHAPS löslich gemachte LPAAT nach einer Verdünnung zur Verminderung der CHAPS-Konzentration auf 0,1% oder weniger untersucht werden. Ein vorheriges Einwirkenlassen höherer CHAPS-Konzentrationen wie 0,5% (Gew./Vol.) auf das Kokosnuss-P2-Präparat ist nur mit einem partiellen Verlust an LPAAT-Aktivität (in diesem Beispiel 50%) möglich, vorausgesetzt, die Verdünnung erfolgt vor dem Assay. Dieses Phänomen der Toleranz höherer Detergens-Konzentrationen, als sie im Assay akzeptiert werden können, ergibt eine Grundlage für das Screenen auf Bedingungen zur Löslichmachung.
Die Aktivität von Kokosnuss-LPAAT für mittlere Ketten wird durch 0,1 mM CoA, 2 mM Adenosin-5'-triphosphat oder 60 μM Lysophosphatidylcholin im Assaysystem nicht beeinflusst.
Die LPAAT-Aktivität für längere Ketten des Lorbeer-P2-Präparats variiert als Funktion des pH-Wertes im Assay und ist zwischen einem pH-Wert von 6 und 10 nachweisbar, ist zwischen einem pH-Wert von 7 und 9 hoch und bei einem pH-Wert von 8 maximal. Die LPAAT-Aktivität für mittlere Ketten des Kokosnuss-Präparats P2 weist auch eine geringe Änderung auf, wenn der Assay einen pH-Bereich im Bereich von 6,5 bis 8,5 (in Inkrementen des pH-Wertes von 0,5) liegt, und es gibt eine leichte Präferenz für einen pH-Wert von 8,0.
Beispiel 4 Löslichmachung der LPAAT-Aktivität
a. Kokosnuss-LPAAT mit mittlerer Kette und Lorbeer-LPAAT mit langer Kette
Alle Schritte werden bei 0–4°C durchgeführt. Das gefrorene Kokosnuss-P2-Präparat wird aufgetaut und in einem Volumen von P2-Puffer verdünnt, um eine Proteinkonzentration von 0,94 mg/ml P2-Protein zu erreichen. Die Proteinkonzentration wird durch ein Färben mit Coomassie-Farbstoff in Bezug auf einen Standard aus Rinderserumalbumin bestimmt. Die P2-Membransuspension wird dann mit einem gleichen Volumen des zur Löslichmachung dienenden Puffers (50 mM HEPES-NaOH, pH-Wert 7,5, 1,8 M NaCl, 20% (Gew./Vol.) Glycerin, 4,5% (Gew./Vol.) CHAPS, 100 μM Pefabloc^®, 1 μM Leupeptin, 1 μM Pepstatin A und 5 mM β-ME verdünnt, was zu Endkonzentrationen von 1 M NaCl, 2,25% (Gew./Vol.) Deterenz und 0,47 mg/ml Protein führt. Diese Komponentenkonzentrationen und das resultierende Detergens/Protein-Verhältnis von 48/1 (Gew./Gew.) sind für eine optimale Löslichmachung wichtig. Das Präparat wird dann 30 min lang auf Eis unter gelegentlichem, gelindem Rühren inkubiert, gefolgt von einer zweistündigen Zentrifugation bei 252 000 g. Die resultierende überstehende Fraktion (S3) wird durch mit Puffer benetztes Miracloth filtriert und kann das gefroren (–70°C) aufbewahrt werden, wobei nur ein leichter Aktivitätsverlust erfolgt. Optimal wird sie ohne einen dazwischenliegenden Gefrier-Tau-Zyklus auf Chromatographiesäulen aufgegeben.
Die Aktivität der Lorbeer-LPAAT für lange Ketten in der Lorbeer-P2-Membranprobe wird auf dieselbe Weise löslich gemacht, wobei der zur Löslichmachung dienende Puffer CHAPS bzw. die NaCl-Konzentrationen 4 (Gew./Vol.) bzw. 1 M betrugen und das Detergens/Protein-Verhältnis 58/1 (Gew./Gew.) betrug.
Das Deterens BIGCHAP (N,N-Bis[3D-gluconamidopropyl]-cholamid) kann CHAPS auch bei der Löslichmachung entweder von Lorbeer- oder Kokosnuss-LPAAT ersetzen, vorausgesetzt, die BIGCHAP-Konzentration in der endgültigen Mischung beträgt 4% (Gew./Vol.) und ein größerer Anteil des P2-Präparats wird verwendet, so dass das Detergens/Protein-Verhältnis unverändert bleibt.
B. Nachweis der Löslichmachung
”Löslichmachung” bezieht sich auf die Extraktion des LPAAT-Enzyms aus Membranen, die im P2-Präparat vorhanden sind, auf eine solche Weise, dass es sich dann auf eine Weise verhält, die für nicht membranassoziierte Enzyme typisch ist. Beim Testen auf die Löslichmachung der LPAAT-Aktivität werden die folgenden Anzeichen auf Löslichmachung in Betracht gezogen:

1) Die LPAAT-Aktivität wird durch eine Zentrifugation bei sehr hohen Drehzahlen, die einer g-Kraft, die zur Sedimentierung der P2-Membranen angewandt wird, äquivalent ist oder größer als diese ist, nicht sedimentiert.
2) Die LPAAT-Aktivität wandert auf einer Größenausschluss-Chromatographiesäule, als ob sie eine native Molmasse hat, die für nicht membranassoziierte Enzyme typisch ist.
3) Im LPAAT-Präparat vorhandene Proteine sind durch Säulenchromatographie wenigstens teilweise voneinander trennbar.

Die Herstellung der Kokosnuss- und der Lorbeer-S3-Probe mit LPAAT-Aktivität umfasst die Zentrifugation bei einer viel höheren g-Kraft (252 000 g), als zur Herstellung des ursprünglichen P2-Materials (100 000 g) verwendet wurde. Ein wesentlicher Anteil (bis zu 79%) der LPAAT-Aktivität wird in der resultierenden überstehenden Fraktion (S3-Präparat) gefunden, wodurch das erste Anzeichen für die Löslichmachung erfüllt ist.
Die 2–4 zeigen eine Größenausschluss-Chromatographie der Lorbeer-LPAAT für lange Ketten unter Verwendung von Säulenbedingungen, die für die Zusammensetzung des aufgetragenen LPAAT-Präparats zweckmäßig sind. Wie im ersten Diagramm veranschaulicht ist (2), gelangt die LPAAT-Aktivität des Lorbeer-P2-Präparats auf die Weise eines löslichen Stoffs mit einer extrem hohen Molmasse durch eine Sephacryl-S400-Größenausschlusssäule. Die Verwendung eines Farbstoffs mit hoher Molmasse zur Kalibrierung der Säule (wobei die Spitzenfraktion durch eine gepunktete Linie mit der Bezeichnung ”Dextranblau” bezeichnet ist), deutet darauf hin, dass die P2-LPAAT-Aktivität wandert, ohne in die porösen Perlen der Säule einzudringen, d. h. im ”ausgeschlossenen” oder ”Poren-”Volumen. Dies ist für Enzymaktivitäten, die mit Membranfragmenten assoziiert sind, typisch. Das zweite Diagramm (3) zeigt das Verhalten von Lorbeer-LPAAT für lange Ketten, das aus P2-Material gemäß des zur ”Löslichmachung” dienenden Verfahrens für Erbsenschößling-LPAAT, veröffentlicht von Hares und Frentzen (Planta (1991) 185: 124–131) hergestellt wurde, an Sephacryl^® S400. Durch dieses Verfahren wird die Lorbeer-Embryo-LPAAT gemäß dem ersten Anzeichen auf der Grundlage der Zentrifugation löslich gemacht. Es führt jedoch zu einer signifikanten LPAAT-Aktivität, die als Protein mit niedriger Molmasse auf einer Größenausschlusssäule chromatographiert wird. Der größte Teil der Aktivität wird bei einer sehr hohen Molmasse aus der Säule eluiert, was für Membranfragmente charakteristisch ist. Diese Beobachtung dient dazu, zu veranschaulichen, das das Kriterium der Zentrifugation allein ein unzureichendes Anzeichen für eine Löslichmachung ist.
Im Gegensatz dazu wandet die LPAAT-Aktivität des Lorbeer-S3-Präparats langsamer durch eine Größenausschlusssäule und tritt aus, nachdem ein größeres Puffervolumen hindurchgelangt ist, wie in 4 veranschaulicht ist. (Im dargestellten Beispiel wird eine Superose^®-6-Säule verwendet, um eine feinere Auflösung von Proteinen im Bereich von 12–200 kDa zu ermöglichen). Dieses Verhalten ist für Enzyme, deren Proteinmoleküle in freier Lösung, nicht mit Membranfragmenten assoziiert, vorliegen, typisch. Aus den Elutionsvolumina verschiedener, zu Testzwecken verwendeter Enzyme (durch gepunktete Linien auf dem Diagramm veranschaulicht) kann die Säule kalibriert und geschlossen werden, dass die LPAAT-Aktivität des S3-Präparats sich so verhält, als ob es ein Kugelprotein mit einer ungefähren Molmasse von 80 kDa wäre. Weil die meisten Enzyme, die mit Membranen nicht assoziiert sind, Molmassen im Bereich von 20–100 kDa aufweisen, ist diese ”scheinbare Molmasse” mit dem Schluss, dass die LPAAT löslich gemacht wurde, konsistent. Ganz ähnliche Ergebnisse werden mit dem Kokosnuss-S3-Präparat (wobei die Aktivität für mittlere Ketten untersucht wird) erhalten, außer, dass die scheinbare Molmasse als 44–50 kDa eingeschätzt wird.
Eine Untersuchung der Proteinzusammensetzung von ablaufenden Fraktionen aus einer solchen Größenausschluss-Chromatographie des Kokosnuss-Präparats mittels SDS-PAGE (Elektrophorese an Polyacrylamid-Gel) zeigt, dass viele Proteine vorhanden sind. Die Zusammensetzung variiert aber, wenn Fraktionen von einem Ende des LPAAT-Aktivitätspeaks und dem anderen untersucht werden. Eine solche Proteinfraktionierung wäre nicht möglich, wenn die P2-Membranen nicht zu ihren einzelnen Lipid- und Proteinbestandteilen aufgetrennt, d. h. löslich gemacht worden wären. Ein zusätzlicher Beweis für die Proteinauflösung wird aus der Anwendung anderer Chromatographietypen auf das S3-Präparat erhalten, wie bei den Beispielen, die im Abschnitt zur Reinigung folgen. Weiterhin ist es mittels zusätzlicher Chromatographie möglich, einzelne Proteine als Kandidatenproteine für das LPAAT-Enzym zu erkennen. Diese Beobachtung beweist, dass das LPAAT-Protein selbst unter denjenigen ist, die beim Verfahren zur Löslichmachung von der Membran abgetrennt werden.
C. Eigenschaften von löslich gemachter Kokosnuss-LPAAT
Ein Variieren der CHAPS- und der NaCl-Konzentrationen und des Detergens/Protein-Verhältnisses (D/P, Gew./Gew.) des Verfahrens zur Löslichmachung führt zu variierenden Graden der Umwandlung der Kokosnuss-LPAAT-Aktivität für mittlere Ketten zwischen dem P2-Präparat und dem S3-Präparat (d. h. der durch das Zentrifugationskriterium definierten Löslichmachung). In 5 sind die Auswirkungen der CHAPS-Konzentration (bei 1 M NaCl) und des Detergens/Protein-Verhältnisses (D/P, Gew./Gew.) zusammengefasst. Durch ein Absenken der zur Löslichmachung dienenden NaCl-Konzentration auf weniger als 1 M wird die Bildung der S3-LPAAT-Aktivität vermindert (wobei die Daten in der Figur nicht dargestellt sind). Die routinemäßigen Bedingungen zur Löslichmachung werden ausgewählt, indem die Mindest-CHAPS-Konzentration für eine maximale Wirkung (2,25% Gew./Vol.) und das effektivste D/P-Verhältnis (48/1 Gew./Gew.) ausgewählt werden.
Eine erneute Untersuchung der Substratspezifität zeigt, dass die Kokosnuss-LPAAT (S3-Präparat) nach der Löslichmachung und der Phospholipid-Aktivierung dieselbe Präferenz für Acyl-CoA mit mittlerer Länge wie die ursprüngliche P2-Aktivität hat. Ebenfalls erhalten ist die vergleichbare Verwendung von 12:0-LPA und 18:1-LPA als Akzeptorsubstrate. Ein Assay der Kokosnuss-LPAAT-Aktivität für mittlere Ketten nach einer Löslichmachung (S3-Präparat) und Reaktivierung mit PL unter Verwendung verschiedener Acyl-CoA-Substrate ergibt die folgenden Ergebnisse (Tabelle 3). In allen diesen Assays ist das Akzeptorsubstrat 12:0-LPA. TABELLE 3 Assay von löslich gemachten Kokosnuss-LPAAT

Acyl-CoA LPAAT-Aktivität

6:0 1

8:0 16

10:0 162

12:0 205

14:0 84

16:0 18

18:1 30

* Radioaktivität (cpm) des mittels TLC getrennten PA-Produkts nach einem 30-minütigen Assay.

Bei einem Vergleich dieser Ergebnisse mit den P2-Membranaktivitäten ist zu sehen, dass die PL-reaktivierte, löslich gemachte (S3-)Aktivität die Präferenz für Acyl-CoA mit mittlerer Kette beibehält.
Durch eine Erhöhung der EDTA-Konzentration auf 10 mM wird die LPAAT-Aktivität des S3-Kokosnusspräparats nicht beeinflusst. Die Zugaben von 1 mM Mg² ⁺, Mn²⁺ oder Ca²⁺ sind auch ohne signifikante Auswirkung, wobei die Aktivität aber um 50% oder mehr vermindert wird, wenn diese Ionen mit 10 mM zugegeben werden. Das Weglassen von β-ME vom Assaysystem führt zu etwa 50% weniger LPAAT-Aktivität, und Konzentrationen oberhalb von 5 mM vermindern ebenfalls die Aktivität. Ein Senken des pH-Wertes des Assays von 7,7 auf 6,5 führt zu einem Verlust von etwa 20% der LPAAT-Aktivität. Ein Anheben des pH-Wertes auf 8,0 führt zu einer sehr leichten Erhöhung der Aktivität, die wiederum abnimmt, wenn der pH-Wert auf 8,5 weiter erhöht wird. Der optimale pH-Wert ist daher 8,0, wobei 7,5 aber routinemäßig verwendet wird, um die nichtenzymatische Hydrolyse von Acyl-CoA zu minimieren. Es gibt eine geringfügige Änderung der Aktivität, wenn die Assaykonzentration von NaCl zwischen 100 mM und 200 mM variiert wird, wobei die Aktivität aber steil abfällt, wenn die NaCl-Konzentration auf mehr als 200 mM erhöht wird. Die Aktivität ist für Änderungen der Glycerinkonzentration im Assay zwischen 5% und 15% (Gew./Vol.) unempfindlich.
Eine Dialyse des S3-Kokosnuss-Präparats über Nacht zur Entfernung von NaCl führt zum Verlust der Hälfte der LPAAT-Aktivität. Die äquivalente NaCl-Entfernung unter Verwendung einer Größenausschluss-Säule führt zu einem vollständigen Aktivitätsverlust. Die Stabilität des Kokosnuss-S3-Präparats während der Lagerung bei 4°C wird beträchtlich verbessert, sobald es mit Phospholipiden aktiviert wurde.
Beispiel 5 Reinigung von Kokosnuss-LPAAT für mittlere Ketten
Eine wesentliche Reinigung der LPAAT-Aktivität in Bezug auf den Gesamt-Proteingehalt des Kokosnuss-S3-Präparats kann durch eine aufeinanderfolgende Chromatographie an Säulen von roter 120-Agarose und Hydroxylapatit wie folgt erhalten werden. Für eine optimale Isolierung der LPAAT-Aktivität werden die folgenden Schritte bei 0–4°C durchgeführt.
A. Chromatographie an roter 120-Agarose
Das S3-Präparat wird verdünnt, um die CHAPS-Konzentration auf 1,125 (Gew./Vol.) und die NaCl-Konzentration auf 0,5 M zu vermindern, wobei alle anderen Bedingungen dieselben bleiben. Es wird dann mit 0,5 ml/min auf eine Säule mit roter 12-Agarose (Sigma Chemical Co., St. Louis) von 2,5 cm (Durchmesser) × 2 cm aufgebracht, die vorher mit einem Laufpuffer, der 50 mM HEPES-NaOH, pH-Wert 7,5, 20% (Gew./Vol.) Glycerin, 1% (Gew./Vol.) CHAPS, 0,5 M NaCl, 5 mM β-ME enthielt, äquilibriert worden war. Fraktionen mit einem Volumen von 3 ml wurden gesammelt. Wie in 6 veranschaulicht ist, wird die LPAAT-Aktivität von der Säule gehalten, während beträchtliches Nicht-LPAAT-Protein (wie durch das Coomassie-Farbstoff-Verfahren bestimmt wurde) durchströmt.
Die LPAAT-Aktivität wird eluiert, indem ein Laufpuffer aufgebracht wird, bei dem die NaCl-Konzentration auf 2,5 M eingestellt ist. Ein scharfer Protein-Peak begleitet die eluierte Aktivität. Die Isolierung der LPAAT-Aktivität aus diesem Verfahren beträgt typischerweise fast 100%, und typischerweise werden 85% der Proteine im Kokosnuss-LPAAT-S3-Präparat entfernt.
B. Chromatographie an Hydroxylapatit
Die LPAAT-aktiven Fraktionen aus der roten Säule im 2,5 M NaCl enthaltenden Puffer werden gepoolt und auf eine HA-(Hydroxylapatit-)Säule von 1,5 cm (Durchmesser) × 5,7 cm aufgebracht, die zuvor mit einem Laufpuffer, der 50 mM HEPES-NaOH, pH-Wert 7,5, 20% (Gew./Vol.) Glycerin, 1% (Gew./Vol.) CHAPS, 1 M NaCl, 5 mM β-ME enthielt, äquilibriert worden war. Die Fließgeschwindigkeit beträgt wiederum 0,5 ml/min, und Fraktionen mit einem Volumen von 2 ml werden gesammelt. Im Wesentlichen werden das gesamte Protein und die gesamte LPAAT-Aktivität in der Probe von der Säule gebunden. Die LPAAT-Aktivität und gebundenes Protein werden im Wesentlichen durch eine Elution mit einem linearen 0-100-mM-Phosphatkonzentrationsgradienten im Laufpuffer getrennt. Diese Ergebnisse sind in 7 veranschaulicht.
Die Isolierung der Aktivität mit dieser Säule beträgt typischerweise 60–70%. Die LPAAT-aktiven Fraktionen werden gepoolt und nach dem Einfrieren in flüssigem Stickstoff bei –70°C aufbewahrt. Dieser aktive Pool bildet das Ausgangsmaterial für zusätzliche Reinigungsexperimente. Eine Analyse dieses Präparats mittels Größenausschluss-Chromatographie zeigt, dass die LPAAT-Aktivität sich noch so verhält, als ob es sich dabei um ein Kugelprotein mit einer scheinbaren Molmasse von 44–50 kDa handelt. Dies deutet darauf hin, dass die partielle Reinigung durch die rote Säule und diejenige mit HA nicht zu einer signifikanten Aggregation des LPAAT mit sich selbst oder mit anderen Proteinen in diesem Präparat führt und den Löslichkeitszustand des LPAAT-Proteins nicht verschlechtert.
Bei einer typischen Anwendung dieses 2-Säulen-Verfahrens enthält das entgültige Kokosnuss-LPAAT-Präparat 17% der S1-Aktivität und nur 0,4 des S1-Proteins. Dies stellt eine 40-fache Reinigung von LPAAT in Bezug auf das S1-Präparat dar.
Kokosnuss-LPAAT-Aktivität aus der aus der roten und der HA-Säule bestehenden Abfolge bevorzugt immer noch 12:0-CaA gegenüber 18:1-CoA als Donorsubstrat und benutzt immer noch 12:0-LPA und 18:1-LPA als Akzeptorsubstrate. Sie nimmt immer noch ab, wenn die NaCl-Konzentration des Assays auf über 200 mM erhöht wird, und toleriert ein Gefrieren und Auftauen mit einem minimalen Verlust.
Beispiel 6 Identifikation des Kokosnuss-LPAAT-Proteins
A. SDS-PAGE-Analyse von LPAAT aus der Hydroxyapatit-Säule
Die Proteinzusammensetzung des aus der HA-Säule erhaltenen LPAAT-Präparats wird mittels SDS-PAGE analysiert. Für eine Visualisierung der Proteinzusammensetzung aus P2-, S3- oder teilweise gereinigten S3-Präparaten mittels SDS-PAGE darf die Probe vor dem Beladen mit dem Gel nicht im SDS-haltigen Puffer der PAGE-Probe gekocht werden. Die SDS-PAGE-Analyse offenbart das Vorhandensein zahlreicher Proteinspezies im angereichterten LPAAT-Präparat. Obwohl die Proteinzusammensetzung in Bezug auf diejenige des S1-Präparats vereinfacht ist, ist eine zusätzliche Chromatographie erforderlich, um das Protein (oder die Proteine), die der LPAAT-Aktivität entsprechen, zu identifizieren.
B. LPAAT-Chromatographie an einer 12:0-CoA-Matrix
Eine brauchbare Auftrennung der verbliebenen Proteine wird durch eine Chromatographie an einer Matrix, die ein immobilisiertes 12:0-CoA-Substrat (unmarkiert) umfasst, erhalten. Die Säulenmatrix wird hergestellt, indem die Aminogruppe des CoA-Restes von 12:0-CoA an die freie Carboxylgruppe von 6-Aminohexansäure-Sepharose^® 4B gebunden wird. Dieses Sepharose-Derivat, das Kopplungsverfahren und andere erforderliche Reagenzien werden von der Sigma Chemical Company (St. Louis) erhalten. Eine Dichte des gekoppelten 12:0-CoA von 3,9 mg/ml Nasskugelvolumen kann erreicht werden. Eine Säule mit einem Durchmesser von 1 cm wird mit 2 ml der 12:0-CoA-Matrix hergestellt und mit einem Laufpuffer, der 50 mM HEPES-NaOH, pH-Wert 7,5, 20% (Gew./Vol.) Glycerin, 1% (Gew./Vol.) CHAPS, 0,4 M NaCl, 5 mM β-ME enthält, mit 0,2–0,5 ml/min äquilibriert.
Das mittels Chromatographie aus der roten und der HA-Säule hergestellte LPAAT-Präparat wird mit Laufpuffer ohne NaCl verdünnt, wobei die NaCl-Konzentration auf 0,4 M vermindert wird, und auf die Säule mit 12:0-CoA aufgebracht. Es werden Fraktionen mit einem Volumen von 2 ml gesammelt. Wie in 8 gezeigt ist, tritt eine kleine Menge der LPAAT-Aktivität während der Beladungsstufe aus. Der Großteil der LPAAT-Aktivität ist aber an die Säule gebunden und kann später durch das Einwirkenlassen eines linearen NaCl-Gradienten von 0,4–2 M im Laufpuffer eluiert werden. Typischerweise werden 50–60% der beladenen Aktivität in diesem mit NaCl eluierten Peak gewonnen. Wenn das Experiment mit dem Träger aus 6-Aminohexansäure-Sepharose 4B, dem 12:0-CoA fehlt, wiederholt wird, tritt die meiste Aktivität in der ablaufenden Beladungsflüssigkeit aus.
C. SDS-PAGE-Analyse von LPAAT aus einer 12:0-CoA-Säule
Eine Analyse von Fraktionen, die aus der 12:0-CoA-Säule mittels SDS-PAGE eluiert wurden, und eine Anfärbung mit Silber zeigt, dass eine beträchtliche Auflösung von Proteinen bewerkstelligt wird. Die Beladungs- und Waschfraktionen 7 und 10 (8) enthalten eine komplexe Proteinzusammensetzung, die mit der aufgebrachten Probe vergleichbar ist. Die mit Salz eluierten Fraktionen 29–36 (8) enthalten eine viel einfachere Proteinzusammensetzung, wie durch die beiden markanten Komponentenbanden und 6–7 weniger reichliche Banden veranschaulicht wird. Mehrere sehr kleine Komponenten sind ebenfalls in dieser Probe nachweisbar. Die Proteinzusammenset zung eines solchen Materials variiert zwischen Kokosnuss-Präparaten etwas, wobei die beträchtliche, mit der 12:0-CoA-Säule erreichte Reinigung aber reproduzierbar ist. Weiterhin ist auf dem SDS-Polyacrylamidgel in den Fraktionen 32 und 33 die Intensität einer Bande oder eines Paars von Banden, das Proteinen mit einer ungefähren Molmasse von 27–29 kDa (d. h., die im Gel etwas schneller als ein Markerprotein von 31 kDa wandern) entspricht, am markantesten. Diese Fraktionen enthalten auch die maximale LPAAT-Aktivität. Die Bande mit 27–29 kDa folgt der LPAAT-Aktivität in den verschiedenen untersuchten Kokosnuss-Proben der 12:0-CoA-Säule. Dies ist auch ein starkes Anzeichen dafür, dass das Protein mit 27–29 kDa (das hiernach auch als das Protein mit oder Kandidatenprotein ”29 kDa” bezeichnet wird) dem LPAAT-Enzym entspricht. Die anderen Proteine in den Fraktionen 26–36 sind in denjenigen Fraktionen, die nicht den Peak der LPAAT-Aktivität darstellen, am häufigsten, und stellen daher mit einer geringeren Wahrscheinlichkeit LPAAT dar.
D. Chromatographie von aktivierter LPAAT an einer 12:0-CoA-Matrix
Bei einer Modifikation des obigen Chromatographieverfahrens mit 12:0-CoA wird LPAAT durch die Zugabe von Phospholipiden vor dem Aufbringen auf die Säule aktiviert. Darüber hinaus wird der Laufpuffer dahingehend modifiziert, dass er Phospholipide einschließt. Durch diese Modifikationen wird die LPAAT während des gesamten Experiments in aktivierter Form gehalten.
Zur Herstellung eines modifizierten Laufpuffers werden 380 μl einer Detergenslösung von Phospholipiden (50 mg/ml in 0,5% (Gew./Vol.) CHAPS gemäß der Beschreibung für den modifizierten Assay) mit 9,5 ml Laufpuffer für die HA-Säule vermischt, und diese Mischung wird dann durch die Zugabe von 90 ml eines CHAPS-freien Puffers, der 50 mM HEPES-NaOH, pH-Wert 7,5 20% (Gew./Vol.) Glycerin, 0,44 M NaCl, 5 mM β-ME umfasst, verdünnt. Dies führt zu Endkonzentrationen an CHAPS bzw. NaCl von 0,1 (Gew./Vol) bzw. 0,5 M und einer Phospholipid-Konzentration, die für den Assay von löslich gemachter LPAAT beschrieben ist. Enzymverdünnungspuffer wird mit Phospholipid auf dieselbe Weise, aber so, dass die Endkonzentrationen an CHAPS bzw. NaCl 0,1% (Gew./Vol.) bzw. 0,46 M betragen, hergestellt. Dieser Verdünnungspuffer wird zur 10-fachen Verdünnung der LPAAT-Probe aus der HA-Säule vor dem Aufbringen auf die 12:0-CoA-Säule verwendet.
Wenn LPAAT-Aktivität in Gegenwart von Phospholipiden nur mit einer kleinen Menge aufgebracht wird, wird sie von der Säule nicht gehalten. Die Aktivität kann dann mit einer langsamen Geschwindigkeit eluiert werden, wenn die Säule mit Laufpuffer gewaschen wird (9). Ein Aufbringen von 15 ml 0,1 mM 12:0-LPA im Laufpuffer führt zur Elution eines einzigen, großen Peaks von LPAAT-Aktivität. Bei einem anschließenden Aufbringen von 2,5 M NaCl wird kein zusätzliches detektierbares LPAAT eluiert.
Versuche, LPAAT mit 12:0-LPA oder 18:1-LPA aus der 12:0-CoA-Säule zu eluieren, sind erfolglos (oder ergeben nur einen sehr kleinen Aktivitätspeak), sofern nicht die LPAAT vor dem Beladen mit Phospholipiden aktiviert wird und die Säule mit Phospholipiden enthaltendem Puffer betrieben wird, wie gerade beschrieben wurde. Dies lässt vermuten, dass LPAAT verschieden an die Säule bindet, wenn diese mit Phospholipiden aktiviert wurde, und dass diese Bindung auf der Erkennung des 12:0-Rests der Säule durch die katalytische Stelle des LPAAT-Proteins beruht. Die Elution von 12:0-LPA würde dann von der Erkennung des 12:0-LPA-Substrats auch durch die katalytische LPAAT-Stelle stammen. Man würde erwarten, dass diese Bindungs- und Elutionsphänomene, wenn sie auf der katalytischen Stelle basieren, für LPAAT spezifisch sind und die Aussicht auf eine beträchtliche Reinigung bieten.
E. SDS-PAGE-Analyse von LPAAT aus einer aktivierten 12:0-CoA-Säule
Eine Untersuchung der eluierten Fraktionen mittels SDS-PAGE (mit Silberfärbung) zeigt, dass in der beladenen abfließenden Flüssigkeit, den LPAAT-aktiven Fraktionen und der abfließenden Flüssigkeit mit 2,5 M NaCl verschiedene Proteine vorhanden sind. Das signifikant gefärbte LPAAT-Kandidatenprotein mit 29 kDa ist in den LPAAT-aktiven Fraktionen zusammen mit mehreren schwach färbenden Proteinbanden zu sehen. Das Protein mit 29 kDa wird in den LPAAT-inaktiven Fraktionen nicht nachgewiesen. Diese Ergebnisse ergeben einen zusätzlichen Hinweis darauf, dass das Protein mit 29 kDa Kokosnuss-LPAAT darstellt.
F. Zusätzliche chromatographische Analysen
Viele andere chromatographische Säulen können auf ihre Fähigkeit zur Trennung von in aktiven LPAAT-Präparaten vorhandenen Proteinen aus der Abfolge der roten und der HA-Säule getestet werden. Säulen, die in dieser Hinsicht brauchbar sind, umfassen den Anionaustauscher ”Mono Q” von Pharmacia, thiophile Agarose von Merck, Größenausschlusssäulen und Blue-4-Agarose. Bei all diesen chromatographischen Analysen kann die LPAAT-Aktivität von der Säule gehalten und auf verschiedene Arten eluiert werden, immer begleitet von einem Protein oder einem Proteinpaar, das an SED-PAGE eine scheinbare Molmasse von etwa 39 kDa aufweist.
Somit demonstriert der chromatographische Beweis die Beziehung zwischen der LPAAT-Aktivität und dem Protein oder den Proteinen, das bzw. die mit einer scheinbaren Molmasse von etwa 29 kDa an SDS-PAGE wandert bzw. wandern. Obwohl diese Molmasse nicht der Schätzung von 44–50 kDa für das native, mittels Größenausschlusschromatographie erhaltenen Enzym entspricht, sind solche Unterschiede zwischen den Molmassen von denaturierten Proteinen an SDS-PAGE und den entsprechenden Proteinen im nativen Zustand üblich. Diese Unterschiede können aus der Assoziation der Proteinmoleküle zu Dimeren, Tetrameren etc. im nativen Fall oder der Bindung einer begrenzten Anzahl von Detergensmolekülen etc. während der Löslichmachung resultieren.
Beispiel 7 Bestimmung der Aminosäuresequenz von LPAAT
A. Übertragung von LPAAT auf Membranen
LPAAT kann zur Bestimmung der Aminosäuresequenz weiter gereinigt werden, indem das aus der Reinigung an der Red-120- und der HA-Säulenchromatographie resultierende LPAAT-Präparat nach SDS-PAGE auf Nitrocellulose- oder PVDF-Membranen übertragen wird. Beispielsweise wird das LPAAT-Protein zur weiteren Verwendung in tryptischen Aufschlüssen auf Nitrocellulose übertragen. PVDF-Membranen wie ProBlott (Applied Biosystems; Foster City, CA) und Immobilon-P (Millipore; Redford, MA) finden bei verschiedenen Verfahren eine bevorzugte Anwendung. Zum Beispiel ist die Übertragung auf ProBlott für N-terminale Sequenzierungsverfahren nützlich. Zur Erzeugung von Peptiden aus dem Cyanbromid-Aufschluss ist Immobilon-P bevorzugt.

1. Blotting an Nitrocellulose: Wenn Protein auf Nitrocellulose elektroblottiert wird, beträgt die Blottingdauer in einem Puffer wie 25 mM Tris (Tris(hydroxymethyl)aminomethan), 192 mM Glycin in 5–20% Methanol normalerweise 1–5 h. Nach dem Elektroblotting werden Membranen 2 min lang in 0,1% (Gew./Vol.) Ponceau S in 1% (Vol./Vol.) Essigsäure gefärbt und in 2–3 Änderungen aus 0,1% (Vol./Vol.) Essigsäure entfärbt, wobei jede Änderung 2 min lang dauert. Diese Membranen werden dann in heißgesiegelten Kunststoffbeuteln bei –20°C feucht aufbewahrt. Wenn die Zeit dies ermöglicht, werden Blots nicht gefroren, sondern sofort für den Aufschluss verwendet, um Peptide für die unten beschriebene Bestimmung der Aminosäuresequenz zu erzeugen.
2. Blotting an PVDF: Wenn Protein auf PVDF Immobilon P elektroblottiert wird, beträgt die Blottingdauer in einem Puffer wie 25 mM Tris/192 mM Glycin in 20% (Vol./Vol.) Methanol etwa 1–2 h. Nach dem Elektroblotting an PVDF werden Membranen 5 min lang in 0,1% (Gew./Vol.) Coomassie Blue in 50 (Vol./Vol.) Methanol/10% (Vol./Vol.) Essigsäure gefärbt und in 2–3 Ände rungen aus 50% (Vol./Vol.) Methanol/10% (Vol./Vol.) Essigsäure entfärbt, wobei jede Änderung 2 min dauert. Dann werden die PVDF-Membranen 30 min lang an Luft trocknen gelassen und dann bei –20°C in heißgesiegelten Kunststoffbeuteln trocken aufbewahrt. An PVDF-Membranen wie Pro Blott geblottetes Protein kann direkt zur Bestimmung der N-terminalen Sequenz des intakten Proteins verwendet werden. Ein Protokoll für das Elektroblotting von Proteinen an ProBlott wird unten beschrieben.

B. Protease-Aufschluss und Trennung von Peptiden
Auf Nitrocellulose geblottetes LPAAT-Protein kann einem Aufschluss mit Proteasen unterzogen werden, um Peptide zum Sequenzieren zu erhalten. Beim angewandten Verfahren handelt es sich um dasjenige von Aebersold et al. (PNAS (1987) 84: 6970).
Das LPAAT-Präparat wird wie oben beschrieben auf Nitrocellulose übertragen. Die Bande, die das oben identifizierte Protein mit 29 kDa darstellt, und auch eine gleiche Menge an leerer Nitrocellulose, die als Kontrolle zu verwenden ist, werden aus der Nitrocellulose-Membran ausgeschnitten. Ein 1,0-ml-Aliquot von 0,5% Polyvinylpyrrolidon (PVP-40, Aldrich, Milwaukee, WI) in 100 mM Essigsäure wird zu den Membranstücken gegeben, und die Mischung wird 30 min lang bei 37°C inkubiert. Um das PVP-40 vollständig zu entfernen, werden Nitrocellulosestücke mit Wasser mit HPLC-Qualität (6 × 3 ml) gewaschen, wobei die Extinktion der Waschflüssigkeiten bei 214 nm mit einem Spektrophotometer überprüft wird. PVP-40 kann leichter entfernt werden, wenn die Bande erst nach der Behandlung mit PVP-40 und dem Waschen in kleine Stücken geschnitten werden.
Nach der Behandlung mit PVP-40 werden die Membranstücke vor dem Aufschluss zu kleinen Schnipseln (~1 mm × 1 mm) zerhackt. Das Protein wird dann in Trypsin-Aufschlusspuffer (100 mM Natriumhydrogencarbonat, pH-Wert 8,2) suspendiert. Zur Aufschlussmischung wird Acetonitril mit einer Konzentration von 5–10% (Vol./Vol.) gegeben. Trypsin wird im Aufschluss- Puffer verdünnt und mit einem Verhältnis von 1:10 (Gew./Gew.) Protease zu Protein zur Aufschlussmischung gegeben. Aufschlüsse werden 18–24 h lang bei 37°C inkubiert.
Nach der über Nacht erfolgenden Inkubation wird die Aufschlussreaktion durch die Zugabe von 10 μl einer 10%igen (Vol./Vol.) Trifluoressigsäure (TFA) oder 1 μl von 100%igem TFA gestoppt. Die Peptide in der Aufschlussmischung werden auf einer Vydac-Umkehrphasen-C18-Säule (2,1 mm × 150 mm), die in einem Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographen (HPLC), Model 130 von Applied Biosystems (Foster City, CA), montiert ist. Die zum Eluieren von Peptiden verwendeten mobilen Phasen sind wie folgt: Puffer A: 0,1 mM Natriumphosphat, pH-Wert 2,2; Puffer B: 70% Acetonitril in 0,1 mM Natriumphosphat, pH-Wert 2,2. Es werden 2 h lang ein dreistufiger Gradient von 10–55% Puffer B, 5 min lang 55–75% Puffer B und 15 min lang isokratisch 75% Puffer B bei einer Fließgeschwindigkeit von 50 ml/min verwendet. Peptide werden bei 214 nm nachgewiesen, von Hand aufgefangen und bei –20°C aufbewahrt.
Zum Aufschließen des LPAAT-Proteins können auch andere Proteasen in zweckmäßigen Aufschlusspuffern, zum Beispiel Endoproteinase-gluC-Puffer (25 mM Ammoniumcarbonat/1 mM EDTA, pH-Wert 7,8) oder Endoproteinase Asp-N-Puffer (0,05 M Natriumhydrogencarbonat, pH-Wert 8,0) verwendet werden. Darüber hinaus können Pufferbedingungen wie die Temperatur variieren, wobei beispielsweise der Aufschluss mit Endoproteinase gluC bei Raumtemperatur durchgeführt wird. Die Protokolle für den Aufschluss, die Peptidtrennung und -reinigung sind im Wesentlichen aber oben für den Aufschluss mit Trypsin beschrieben.
C. Spaltung mit Cyanbromid und Trennung von Peptiden
Eine Spaltung mit Cyanbromid kann an LPAAT-Protein unter Anwendung der Methodologie durchgeführt werden, die im Technischen Handbuch Probe-Design Peptide Separation System von Promega, Inc. (Madison, WI) beschrie ben ist. Das LPAAT-Proteinpräparat wird gemäß der obigen Beschreibung auf eine PVDF-Membran geblottet. Derjenigen Teil der Membran, der die übertragene 29-kD-Bande enthält, wird aus dem Blot ausgeschnitten, in eine Lösung von Cyanbromid in 70%iger (Vol./Vol.) Ameisensäure gelegt und über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dieser Inkubation werden die Cyanbromid-Lösungen entfernt, gepoolt und unter einem kontinuierlichen Stickstoffstrom unter Verwendung eines Reacti-Vap Verdampfers (Pierce, Rockford, IL) getrocknet oder unter Verwendung eines Speed-Vac. eingedampft. Eine zusätzliche Elution von Cyanbromid-Peptiden vom PVDF kann durchgeführt werden, um eine vollständige Entfernung zu gewährleisten, wobei ein Peptid-Elutionslösungsmittel wie 70%iges (Vol./Vol.) Isopropanol, 0,2% (Vol./Vol.) Trifluoressigsäure, 0,1 mM Lysin und 0,1 mM Thioglycolsäure verwendet wird. Die Elutionslösungsmittel werden dann entfernt und in das Röhrchen gefüllt, das die getrocknete Cyanbromid-Lösung enthält, und gemäß der obigen Beschreibung getrocknet. Das Elutionsverfahren kann mit frischem Elutionslösungsmittel wiederholt werden. Dann werden 50 μl Wasser mit HPLC-Qualität zu den getrockneten Peptiden gegeben und das Wasser mittels Abdampfen in einem Speed-Vac (Savant, Inc., Farmingdale, NY) entfernt.
Durch Cyanbromid-Spaltung erzeugte Peptide werden unter Verwendung eines Tris/Tricine-SDS-PAGE-Systems, das dem von Schägger und von Jagow (Anal. Biochem. (1987) 166: 368–379) beschriebenen ähnlich ist, getrennt. Gele werden bei einer konstanten Spannung von 125–150 V etwa 1,5 h lang oder bis der Markierungsfarbstoff begonnen hat, an der Unterkante des Gels abzulaufen, laufen gelassen. Gele können in Übertragungspuffer (125 mM Tris, 50 mM Glycin, 10% (Vol./Vol.) Methanol) 15–30 min vor der Übertragung eingeweicht werden. Gele werden 2 h lang bei einer konstanten Spannung von 50 V auf Profilot-Sequenzierungsmembranen (Applied Biosystems, Foster City, CA) geblottet. Die Membranen werden mit Coomassie-Blau (0,1 in 50% (Vol./Vol.) Methanol/10% (Vol./Vol.) Essigsäure) gefärbt und 3 mal 2 min in 50% (Vol./Vol.) Methanol/10% (Vol./Vol.) Essigsäure entfärbt. Membranen werden 30–45 min lang an Luft getrocknet, bevor sie bei –20°C trocken aufbewahrt werden.
Auf ProBlott geblottete Peptide können direkt in die Sequenzierungskassette des Proteinsequenzers gefüllt werden, ohne einen mit Polybrene beschichteten Glasfaserfilter zuzugeben. Peptide werden unter Verwendung eines leicht modifizierten Reaktionszyklus, BLOT-1, bezogen von Applied Biosystems, sequenziert. Darüber hinaus wird die Lösung S3 (Butylchlorid) durch ein 50:50-Gemisch von S1 und S2 (n-Heptan und Ethylacetat) ersetzt. Diese beiden Modifikationen werden immer dann verwendet, wenn auf ProBlott geblottete Proben sequenziert werden.
D. N-terminales Sequenzieren von Proteinen und Peptiden
Die Sequenzierung erfolgt mittels eines Edman-Abbaus auf einem 477A Pulsed-Liquid Phase Protein Sequencer von Applied Biosystems; vom Sequenzer erzeugte Phenylthiohydantoin-(PTH-)Aminosäuren werden von einem Online-PTH-Analysator 120A von Applied Biosystems analysiert. Daten werden mit einem Datenanalysensystem 610A von Applied Biosystems für Apple-Macintosh und auch auf einem Digital Microvax unter Verwendung der Software ACCESS*CHROM von PE NELSON, Inc. (Cupertino, CA) gesammelt und gespeichert. Sequenzdaten werden von einem Schreiber gelesen, der Eingangssignale vom PTH-Analysator empfängt, und die Bestätigung erfolgt anhand von quantitativen Daten, die von der Software des Modells 610A erhalten wird.
Für Peptidproben, die als Peaks aus einem HPLC erhalten werden, wird die Probe auf einen mit Polybrene beschichteten Glasfaserfilter (Applied Biosystems, Foster City, CA) aufgebracht, der zuvor gewaschen worden war. Für reduzierte und alkylierte Peptide wird ein Teil des PTH-Aminosäureprodukt-Materials aus jedem Sequenzierungszyklus in einem Flüssigkeitsszintillationszähler gezählt. Bei Proteinproben, die auf Immobilon-P elektroblottiert wurden, wird die interessierende Bande ausgeschnitten und dann auf einen mit Polybrene beschichteten Glasfaserfilter gelegt, wie oben vorgewaschen, und die Reaktionskassette wird gemäß der Spezifikationen des Herstellers montiert. Bei Proteinproben, die auf ProBlott elektrogeblottet wurden, ist der Glasfaserfilter nicht erforderlich.
Zum Erhalt von Proteinsequenzen aus kleinen Probenmengen (5–30 pmol) werden der Umwandlungszyklus des 477A, das Lösungsmittel S4_B und das Analysenprogramm des 120A gemäß der Beschreibung von Tempst und Riviere (Anal. Biochem. (1989) 183: 290) modifiziert.
Aminosäuresequenzen von Peptiden, die aus der LPAAT mit 29 kDa mittels Trypsinaufschluss erzeugt wurden, sind wie folgt:
SQ1256 (SEQ ID NR.: 1) NLSLIIFPEGTr
SQ1262 (SEQ ID NR.: 2) YFSPIK
SQ1282 (SEQ ID NR.: 3) VRPAPITVK
Aminosäuresequenzen von Peptiden, die aus der LPAAT mit 29 kDa mittels AspN-Aufschluss erzeugt wurden, sind wie folgt:
SQ1271 (SEQ ID NR.: 4) TGTHLa
SQ1272 (SEQ ID NR.: 5) VEMIHaly
SQ1276 (SEQ ID NR.: 6) slrvrpapitvk
SQ1281 (SEQ ID NR.: 7) FSPIKT
Die Aminosäuresequenz wird unter Verwendung des Einbuchstabencodes wiedergegeben. Aminosäuren, die durch Kleinbuchstaben wiedergegeben sind, stellen Reste dar, die mit einem geringeren Konfidenzgrad identifiziert wurden.
E. Homologie des LPAAT-Peptids zu Acyltransferase-Proteinen
Die Aminosäuresequenz des oben beschriebenen tryptischen LPAAT-Peptids SQ1256 wird mit bekannten Proteinsequenzen in einer Computer-Datenbank mittels einer computerunterstützten Homologiesuche verglichen. Eine signifi kante Homologie wird zwischen dem LPAAT-Peptid und der vom E.-coli-Gen plsC codierten LPAAT gefunden. Ein Stück von 6 Aminosäuren des tryptischen Kokosnuss-LPAAT-Peptids mit 12 Aminosäuren ist eine identische Übereinstimmung mit den Aminosäuren 145–150 der LPAAT von E. coli (Coleman et al., s. o.). Darüber hinaus wird dieselbe konservierte Sequenz mit 6 Aminosäuren auch bei den Aminosäuren 154–159 eines vom Gen SLC1 codierten Hefe-Acyltransferaseproteins gefunden. Zusätzliche Homologiebereiche mit den Genprodukten plsC von E. coli und SLC1 von Hefe werden in der Kokosnuss-LPAAT-Aminosäuresequenz gefunden, wie durch eine Translation der Nucleinsäuresequenz der in Beispiel 9 beschriebenen LPAAT-PCR-Sequenzen bestimmt wird.
Beispiel 8 Herstellung einer cDNA-Bank
A. Herstellung der Gesamt-RNA
Dieses Verfahren ist eine Anpassung des Protokolls zur DNA-Isolation von Webb und Knapp (D. M. Webb und S. J. Knapp, (1990) Plant Molec. Reporter, 8, 180–185). Bei der folgenden Beschreibung wird die Verwendung von Kokosnuss-Gewebe mit einem Frischgewicht von 1 g angenommen. Gefrorenes, unreifes Endospermgewebe (von ”grünen” Kokosnüssen gemäß der Beschreibung für die LPAAT-Reinigung) wird durch Mahlen unter flüssigem Stickstoff pulverisiert. Das Pulver wird zu 10 ml REC-Puffer (50 mM Tris-HCl, pH-Wert 9, 0,8 M NaCl, 10 mM EDTA, 0,5 Gew./Vol CTAB (Cetyltrimethylammoniumbromid)) zusammen mit 0,2 g unlöslichem Polyvinylpolypyrrolidon gegeben und bei Raumtemperatur gemahlen. Das Homogenisat wird 5 min lang bei 12 000 g zentrifugiert, um unlösliches Material zu granulieren. Die resultierende überstehende Fraktion wird durch Mirachloth in 3 ml eines Phenol/Chloroform-Präparat (phenolgesättigtes Wasser/Chloroform, 1/1 Vol./Vol., mit fester Tris-Base auf einen pH-Wert von 7 eingestellt). Nach einer kurzen, wie oben durchgeführten Zentrifugation zur Erleichterung der Phasentrennung wird die obere Phase entfernt und die untere Phase entsorgt.
Die obere Phase wird nochmals mit Chloroform partitioniert, und die obere Phase wird nochmals isoliert.
Die RNA wird dann durch die Zugabe von 1 Volumen Ethanol ausgefällt und durch eine kurze, wie oben durchgeführte Zentrifugation isoliert. Das RNA-Pellet wird in 1 ml autoklaviertem 0,05%igem (Gew./Vol.) DEPC (Diethylpyrocarbonat) wieder aufgelöst und durch die Zugabe von 1 ml 4 M Kaliumacetat (pH-Wert 5), 0,05% (Gew./Vol.) DEPC und ein zweistündiges Inkubieren auf Eis wieder ausgefällt. Nach einer Isolierung durch ein kurzes Zentrifugieren wird das RNA-Pellet in 0,4 ml 0,05%igem (Gew./Vol.) DEPC wieder aufgelöst und noch einmal mit Phenol/Chloroform wie oben beschrieben extrahiert. Ausreichend 3 M Kaliumacetat (pH-Wert 5), 0,05% (Gew./Vol.) DEPC wird so zugegeben, dass die Acetatkonzentration der Mischung 0,3 M beträgt, gefolgt von der Zugabe von zwei Volumina Ethanol, um die RNA auszufällen. Dieses endgültige RNA-Präzipitat wird in 0,1 ml 0,05%igem (Gew./Vol.) DEPC gelöst und gefroren aufbewahrt.
Wenn ein Gesamt-RNA-Präparat für Sumpfblumen- oder ein anderes Gewebe erwünscht ist, wird das oben Beschriebene Protokoll nach Webb und Knapp wie folgt modifiziert. Zunächst wird gefrorenes, sich entwickelndes Samengewebe (13–20 Tage nach der Pollination) der Sumpfblume verwendet. Der REC-Puffer (10 ml) ist derselbe, der oben beschrieben wurde, wobei aber 0,1% β-Mercaptoethanol zugegeben wurden. Nach der Zentrifugation wird die resultierende überstehende Fraktion mit Chloroform extrahiert.
Die RNA wird durch die Zugabe von 1 Volumen RECP-Puffer (50 mM Tris-HCl, pH-Wert 9, 10 mM EDTA, 0,5% (Gew./Vol) CTAB, 0,1% β-Mercaptoethanol) ausgefällt und durch eine kurze, wie oben durchgeführte Zentrifugation isoliert. Das RNA-Pellet wird in 1 ml 0,4 M NaCl wieder aufgelöst, mit 0,5 ml Phenol/Chloroform (1:1) extrahiert und durch die Zugabe von 2 ml Ethanol wieder ausgefällt. Nach der Isolierung durch eine kurze Zentrifugation wird das RNA-Pellet in 0,4 ml H₂O gelöst. Gegebenenfalls können 100 mg der gesamten RNA an einer Säule mit RNeasy-Cellulose (Qiagen, Inc., Chatsworth, CA.) gemäß dem Protokoll des Herstellers gereinigt werden.
B. Konstruktion der cDNA-Bank
Eine cDNA-Bank wird unter Verwendung des ”UniZap”-Systems von Stratagene (San Diego, CA) konstruiert. Bei der Herstellung einer Kokosnuss-cDNA-Bank sind die folgenden Modifikationen nützlich. 40 μg Gesamt-RNA von Kokosnuss-Endosperm werden in einem Reaktionsvolumen von 50 μl wie folgt rückwärts transkribiert: die RNA in H₂O wird 20 min lauf auf 65°C erwärmt und auf Eis gekühlt. Die Synthese des ersten Strangs wird gemäß der Empfehlungen von Stratagene durchgeführt, wobei stattdessen die Reverse-Transkriptase 600 E ”Superscript”, der Puffer ”Superscript” für den 1. Strang und DTT, alle in der von BRL (Bethesda, MD) gelieferten Form, verwendet wurden. Die Reaktionsmischung wird 45 min lang bei 60°C inkubiert. Die übrigen Stufen der Synthese der Bank werden gemäß der Empfehlungen im ”UniZap”-Protokoll von Stratagene durchgeführt. Die durch dieses Verfahren erhaltene unamplifizierte cDNA-Bank enthält 1,4 × 10⁶ Klone mit einer mittleren Insertgröße von 1,25 kb.
Bei der Herstellung einer Sumpfblumen-cDNA-Bank werden 40 μg Gesamt-RNA aus Sumpfblumen-Endosperm in einem Reaktionsvolumen von 50 μl, wobei die DNA in H₂O 20 min lang bei 65°C erwärmt und auf Eis gekühlt wird, rückwärts transkribiert. Die Synthese des ersten Strangs wird gemäß der Empfehlungen von Stratagene durchgeführt, wobei die einzige andere Modifikation darin besteht, dass die Reaktionsmischung bei 45°C inkubiert wird.
Beispiel 9 Isolation von LPAAT codierenden Sequenzen
LPAAT-Peptide codierende DNA-Sequenzen werden aus einer interessierenden, LPAAT enthaltenden pflanzlichen Quelle unter Verwendung von synthetischen, von LPAAT-Sequenzen stammenden Oligonucleotiden erhalten. Die LPAAT-Nucleinsäuresequenzen können durch eine Amplifikation von DNA mittels einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) unter Verwendung von Oligonucleotiden als Primern oder alternativ durch das Screening einer cDNA- oder einer genomischen DNA-Bank durch radioaktives Markieren der Oligonucleotide oder zuvor isolierter Sequenzen zur Verwendung als Sonden erhalten werden.
A. Synthetische Oligonucleotide
Im Allgemeinen werden Oligonucleotide, die die Sequenz in Sense-Orientierung, die den das LPAAT-Peptid codierenden Sequenzen entsprechen, enthalten, zur Verwendung als PCR-Primer aus einsträngigen, aus mRNA rückwärts transkribierten DNA-Matrizen hergestellt. Diese Oligonucleotide werden als Primer für die ”Vorwärts-”Amplifizierungsreaktion zur Erzeugung der Sense-Strang-DNA verwendet.
Für die ”Rückwärts-”Reaktion zur Amplifizierung des nichtcodierenden DNA-Strangs kann ein Oligonucleotid so konstruiert werden, dass es mit einem Teil eines Primers, der zur Herstellung der DNA-Matrize für die PCR verwendet wird, identisch ist. Alternativ können Oligonucleotide, die eine Sequenz enthalten, die zu den das LPAAT-Peptid codierenden Sequenzen komplementär ist, in Kombination mit einem oben beschriebenen ”Vorwärts-”LPAAT-Oligonucleotid-Primer verwendet werden.
Wenn die LPAAT-Peptidsequenzen Aminosäuren enthalten, die durch eine Anzahl verschiedener Codons codiert werden können, können die Vorwärts- oder Rückwärts-Primer ”degenerierte” Oligonucleotide sein, d. h. solche, die eine Mischung aller oder einiger der möglichen codierenden Sequenzen für einen speziellen Peptidbereich enthalten. Um die Anzahl der möglichen, in einer solchen Mischung vorhandenen Oligonucleotide zu vermindern, ist es bei der Herstellung des synthetischen Oligonucleotids für PCR-Primer bevorzugt, Peptidbereiche auszuwählen, die die geringste Anzahl möglicher codierender Sequenzen haben. Auf vergleichbare Weise sind, wenn das synthetische Oligonucleotid für ein direktes Screening einer Bank für LPAAT-Sequenzen verwendet wird, Oligonucleotide mit einer geringeren Degeneration bevorzugt.
Zusätzlich zur LPAAT codierenden Sequenz enthalten Oligonucleotide für Primer in der PCR zusätzliche Nicht-LPAAT-Sequenzen zur Unterstützung des Klonens der PCR-Produkte zu zweckmäßigen Plasmidvektoren. Die Nicht-LPAAT-Sequenzen können für Restriktions-Abbaustellen sein, die zum Klonen der PCR-Fragmente zu verschiedenen Plasmiden verwendet werden können, oder sie können so konstruiert sein, dass sie Sequenzen enthalten, die zum Klonen in einen speziellen, kommerziell verfügbaren Vektor brauchbar sind. Zum Beispiel enthalten die unten beschriebenen synthetischen Oligonucleotide Sequenzen, die zum Klonen unter Verwendung des CloneAmp^TM-Systems (GIBCO BRL; Gaithersburg, MD) brauchbar sind, bei dem UDG (Uracil-DNA-Glycosylase) für ein richtungsabhängiges Klonen von PCR-Produkten verwendet wird (Nisson et al. (1991) PCR Meth. and Appl. 1: 120–123).
Nachfolgend sind Sequenzen von synthetischen Oligonucleotiden aufgeführt, die zum Erhalt von LPAAT-Sequenzen verwendet werden können. Die Bezeichnungen der Oligonucleotide spiegeln die speziellen Fragmentnummern der LPAAT-Peptide gemäß der Liste in Beispiel 7D wider. Der Buchstabe ”F” in der Bezeichnung des Oligonucleotids bezeichnet einen Primer der PCR-Vorwärtsreaktion. Der Buchstabe ”R” bezeichnet einen Primer der PCR-Rückwärtsreaktion. Der Buchstabe ”P” bezeichnet ein Oligonucleotid, das zur Verwendung als Sonde beim Screenen der cDNA- oder der Genombank radioaktiv zu markieren ist. Der unterstrichene Teil der PCR-Primer bedeutet die das LPAAT-Peptid codierende Sequenz.
Ein Oligonucleotid, TSYN, dient zur reversen Transkription von Poly(A)+- oder Gesamt-RNA zur Herstellung einer einsträngigen DNA zur Verwendung als PCR-Matrize. Zusätzlich zu einem Poly(T)-Bereich zur Bindung an das mRNA-Poly(A)-Ende enthält das Oligonucleotid Restriktions-Abbausequenzen für HindIII, PstI und SstI. Die Sequenz von TSYN ist wie folgt:
TSYN (SEQ ID NR.: 16) 5' CCAAGCTTCTGCAGGAGCTCTTTTTTTTTTTTTTT 3'
Ein Oligonucleotid, 5' RACEAMP, ist bei der Rückwärtsreaktion von PCR zur Amplifizierung des Antisense-Strangs einer LPAAT codierenden Sequenz brauchbar. Es sei darauf hingewiesen, dass, wenn die Matrize für PCR einsträngige DNA ist, die von mRNA rückwärts transkribiert ist, die Rückwärtsreaktion erst nach Abschluss der ersten Vorwärtsreaktion erfolgt. Die Reaktion des ersten Strangs führt zur Erzeugung einer Sense-Strang-DNA-Matrize, die dann zur Amplifikation des Antisense-DNA-Strangs aus dem Rückwärts-Primer verwendet werden kann. Zusätzlich zu einem Identitätsbereich mit TSYN (Restriktions-Abbauregion) enthält 5' RACEAMP das Stück 5' CAU, das im CloneAmp^TM-System verwendet wird. Die Sequenz von 5' RACEAMP ist wie folgt:
5' RACEAMP (SEQ ID Nr.: 17) 5' CAUCAUCAUCAUAAGCTTCTGCAGGAGCTC 3'
Zusätzliche Sequenzen, die zum Erhalt von LPAAT-Sequenzen brauchbar sein können, sind unten aufgeführt. Diese Primer wurden im Verlauf der Isolierung der Sumpfblumen-LPAAT-Sequenz auf der Grundlage von beobachteten Sequenzhomologien zwischen Kokosnuss-, E.-Coli- und Hefe-LPAAT entwickelt:
Ein Vergleich zwischen den Kokosnuss- und den Sumpfblumen-LPAAT-Klonen zeigt mehrere Bereiche, die Stücke von 6 oder mehr Aminosäuren enthalten, die für beide Proteine identisch sind und zur Konstruktion von degenerierten Oligonucleotiden, die zur PCR-Amplifizierung von LPAAT codierenden cDNA-Klonen aus anderen Pflanzenspezies verwendet werden, geeignet sind. Weil die Kokosnuss und die Sumpfblume von verschiedenen Pflanzenspezies (einkeimblättrig bzw. zweikeimblättrig) der Blütenpflanzen stammen, besteht eine Wahrscheinlichkeit dafür, dass Peptidsequenzen, die zwischen diesen Spezies konserviert werden, in allen Pflanzen konserviert werden. Die Oligonucleotide, die diese konservierten Regionen codieren, ermöglichen eine PCR-Amplifizierung von LPAAT codierenden DNA-Sequenzen in denjenigen Fällen, in denen die E.-coli-, Hefe- und Kokosnuss-Homologien versagen. In der C-terminalen Region des bereits sequenzierten Proteins sind die folgenden Peptidsequenzen zur Konstruktion von degenerierten Oligonucleotiden geeignet:
FPEGTRS (Aminosäuren 202–208 des beiliegenden Alignments)
GRLLPFKKGF (Aminosäuren 211–220 des beiliegenden Alignments)
LTGTHLAWRK (Aminosäuren 236–245 des beiliegenden Alignments)
PITVKY (Aminosäuren 254–269 des beiliegenden Alignments)
Beliebige 6 oder mehr benachbarte Aminosäuren können zur Konstruktion von Oligonucleotiden mit 17 oder mehr Nucleotiden verwendet werden. Wenn die Proteinsequenz des n-terminalen Teils der Sumpfblumen-LPAAT bestimmt wird, werden mehr zur Konstruktion von degenerierten Oligonucleotiden geeignete Peptidsequenzen bestimmt. DNA-Sequenzen wie CAUCAUCAUCAUGAATCAAGCTT (SEQ ID NR.: 33) können am 5'-Ende der Vorwärts-Primer hinzugefügt werden, und CUACUACUACUAGGATCCGTCGAC (SEQ ID NR.: 34) kann am 5'-Ende der Rückwärts-Primer hinzugefügt werden, um das Klonen der PCR-Produkte zu erleichtern.

Die Nucleotidbasen-Codes für die obigen Oligonucleotide sind wie folgt:

A = Adenin	T = Thymin	Y = Cytosin oder Thymin
C = Cytosin	U = Uracil	R = Adenin oder Guanin
G = Guanin	I = Inosin	O = Inosin oder Cytosin
H = Adenin, Cytosin oder Thymin
N = Adenin, Cytosin, Guanin oder Thymin
W = Adenin oder Thymin
S = Guanin oder Cytosin
B = Guanin, Cytosin oder Thymin
K = Guanin oder Thymin
M = Adenin oder Cytosin

B. PCR-Reaktionen
Poly(A)+-RNA wird aus der Gesamt-RNA isoliert, die gemäß der Beschreibung in Beispiel 8 aus Kokosnuss-Gewebe hergestellt ist. Einsträngige cDNA wird aus Poly(A)+ oder der Gesamt-RNA durch reverse Transkription unter Verwendung von reverser Superscript-Transkriptase (BRL) und TSYN als Oligonucleotid-Primer hergestellt. Die Reaktion wird gemäß den Anleitungen des Herstellers mit der Ausnahme durchgeführt, dass die Reaktion bei 45°C statt bei 37°C durchgeführt wird. Die einsträngige Kokosnuss-cDNA wird in den PCR-Reaktionen 1–9 gemäß der Angaben unten verwendet.

Die PCR wird in einer Maschine des Cetus GeneAmp PCR-Systems 9600 von Perkin Elmer unter Verwendung von rückwärts transkribierter, einsträngiger cDNA als Matrize durchgeführt. Die kommerziell verfügbare PCR-Reaktion und die Optimierungsreagenzien werden gemäß der Spezifikationen der Hersteller eingesetzt. Die folgenden Reaktionen werden unter Verwendung der oben beschriebenen synthetischen Oligonucleotide durchgeführt:

Reaktion	Vorwärts-Primer	Rückwärts-Primer
1	SQ1256-1	5'RACEAMP
2	SQ1262-F1	5'RACEAMP
3	SQ1272-F1	5'RACEAMP
4	SQ1262-F1	SQ1256-R1
5	SQ1262-F1	SQ1272-R1
6	SQ1256-1	SQ1262-R1
7	SQ1256-1	SQ1272-R1
8	SQ1272-F1	SQ1256-R1
9	SQ1272-F1	SQ1262-R1
10	F1	R3
11	F1	R5
12	F2	F5
13	F4	5' RACEAMP

In PCR-Reaktionen erzeugte DNA-Fragmente werden in pAMP1 (ConeAmp^TM-System; GIBCO BRL) geklont. Die DNA-Sequenz der geklonten Fragmente wird bestimmt, um zu bestätigen, dass die geklonten Fragmente LPAAT-Peptide codieren.
Für die Sequenz von zwei Kokosnuss-PCR-Produkten, 23-2 und 23-4 aus Reaktion 7, und ein Kokosnuss-PCR-Produkt, 10-1 aus Reaktion 6, wird durch die Analyse der DNA-Sequenz und der translatierten Aminosäuresequenz bestätigt, dass sie LPAAT-Peptide codieren. Die Sequenzen dieser Reaktionen sind in den 10–12 aufgeführt. Für Sequenzen von zwei anderen PCR-Produkten, MeadLPAAT 15 und MeadLPAAT 20 aus Reaktion 13, wird durch die Analyse der DNA-Sequenz (14 und 15) und der translatierten Aminosäuresequenz (16) bestätigt, dass sie LPAAT-Peptide codieren.
In 10 sind die DNA-Sequenz und die translatierte Aminosäuresequenz von Klon 23-2, erhalten mittels PCR mit den Oligonucleotiden SQ1256-1 und SQ1272-R1, dargestellt. Die Translation der DNA-Sequenz in Teilen von zwei verschiedenen Leserastern ist erforderlich, um die erwarteten, in dem PCR-Primern codierten Kokosnuss-LPAAT-Peptidregionen zu lokalisieren. Die translatierte Sequenz der Nucleotide 13–30 entspricht den Aminosäuren 5–10 des tryptischen Peptids SQ1256 (SEQ ID NR.: 1), die vom Vorwärts-Primer codiert wurden. Die Nucleotide 245–259 entsprechen den Aminosäuren 1–5 des vom Rückwärts-Primer codierten AspN-Peptids SQ1272 (SEQ ID NR.: 5). Die Translation der Nucleotide 32–259 entspricht zusätzlichen LPAAT-Peptidsequenzen. Zum Beispiel codieren die Nucleotide 32–37 die Aminosäuren 11–12 von SQ1256, dies aber in einem Translationsraster, das von der die Aminosäuren 5–10 von SQ1256 codierenden Sequenz verschieden ist. Aus dieser Information sowie aus einem Vergleich mit dem Klon 23-4 (11) scheint hervorzugehen, dass während der Polymerasekettenreaktion ein zusätzliches, in der LPAAT codierenden Sequenz nicht vorhandenes Nucleotid (am wahrscheinlichsten ein zusätzliches Guanin in den Nucleotiden 27–30) eingearbeitet wurde.
Zusätzlich zu den erwarteten LPAAT-Aminosäuresequenzen aus dem Vorwärts- und dem Rückwärts-Primer entspricht die 23-2-translatierte Sequenz anderen LPAAT-Peptidsequenzen. Die Nucleotide 125–142 codieren das AspN-Peptid SQ1271 (SEQ ID NR.: 4), die Nucleotide 155–1490 codieren das AspN-Peptid SQ1276 (SEQ ID NR.: 6) sowie das tryptische Peptid SQ1282 (SEQ ID NR.: 3) (SQ1282 ist mit den Aminosäuren 4–12 von SQ1276 identisch), und die Nucleotide 191–211 codieren das AspN-Peptid SQ1281 (SEQ ID NR.: 7) und das tryptische Peptid SQ1262 (SQ ID NR.: 2).
Die DNA-Sequenz eines zweiten Kokosnuss-Klons, 23-4, eines größeren PCR-Produkts von Reaktion 7 ist in 11 veranschaulicht. In dieser Sequenz werden die letzten beiden Aminosäuren des Peptids SQ1256 mit den (vom PCR-Primer codierten) Aminosäuren 5–10 im Raster codiert. Der Größenunterschied zwischen dem Insert 23-4 (etwa 360 bp) und dem Produkt 23-2 (etwa 270 bp) ist offensichtlich auf das Vorhandensein eines unprozessierten Introns in der Sequenz 23-4 (untranslatierte Sequenz bei den Nucleotiden 70–157 von 11) zurückzuführen. Das Vorhandensein des Introns ist wahrscheinlich auf eine unprozessierte LPAAT-RNA in der Gesamt-RNA (im Gegensatz zum Poly(A)+), die zur Erzeugung der einsträngigen cDNA-PCR-Matrize verwendet wurde, zurückzuführen.
Mit Ausnahme der Intron- und der PCR-Primer-Region stimmen die LPAAT-Sequenzen der Inserts in 23-2 und 23-4 mit Ausnahme eines einzigen Nucleotids, nämlich des Nucleotids 90 von 23-2, bei dem es sich um Thymin handelt, und des entsprechenden Nucleotids 177 von 23-4, bei dem es sich um Cytosin handelt, überein. Diese Nucleotid-Differenz führt auch zu einem Unterschied in der translatierten Aminosäuresequenz von 23-2 und 23-4. Ein Leucin wird von den Nucleotiden 89–91 in 23-2 codiert, und ein Prolin wird von den entsprechenden Nucleotiden 176–178 von 23-4 codiert.
Die DNA-Sequenz des Inserts von etwa 220 bp im geklonten PCR-Produkt von Reaktion 6, 10-1, ist in 12 aufgeführt. Die LPAAT codierende Sequenz dieses Klons ist mit Ausnahme der PCR-Primerregionen mit derjenigen von 23-4 in der gemeinsamen Region identisch.
Für die Reaktionen 10–13 wurden die folgenden Verfahren befolgt:
RNA von Sumpfblume, Nasturtium und Brassica wurden an RNeasy-Säulen (Qiagen Inc., Chatsworth, CA) gereinigt. 2,5 μg der gereinigten RNA wurden unter Verwendung von reverser Superscript-Transkriptase (Gibco/BRL, Bethesda, MD) gemäß dem Protokoll des Herstellers in 20 μl von cDNA-Reaktionen des ersten Strangs verwendet. Nach der cDNA-Synthese des ersten Strangs wurde das Volumen der Reaktion durch die Zugabe von 20 μl Wasser auf 40 μl erhöht, und nicht eingearbeitete Nucleotide und kleine cDNA-Syntheseprodukte wurden entfernt, indem das Produkt an Spin-Säulen MicroSpin S-400 (Pharmacia Inc., Piscataway, NJ) gereinigt wurde. Eine PCR wurde in 50-μl-Reaktionen durchgeführt, die 1 μl der cDNA des ersten Strangs, mehrere der oben aufgeführten Primer-Kombinationen und andere standardmäßige, vom Hersteller (Perkin Elmer, Foster City, CA) aufgeführte Reaktionskomponenten enthielt. PCR-Reaktionen wurden in einem PCR-Thermal-Cycler von Perkin Elmer (Modell 9600) durchgeführt. Die Reaktionen wurden 5 min lang bei 96°C erwärmt, die Temperatur wurde 5 min lang auf 72°C gesenkt (wobei die Taq-Polymerase in diesem Zeitraum zugegeben wurde), die Reaktionstemperatur wurde für einen Zeitraum von 10 min auf 50°C vermindert und 5 min lang auf 72°C erhöht. Dem folgten 35 Zyklen wie folgt: 15 s lang 94°C, schnelle Verminderung der Temperatur auf 65°C, langsame Verminderung der Temperatur auf 50°C mit einer Erniedrigungszeit von 3 min und 60 s lang 72°C. Die PCR-Produkte wurden mittels Elektrophorese an Agarosegel analysiert. Verschmierungen waren in allen Reaktionen sichtbar, wobei Banden mit diskreter Größe gegen die Verschmierung sichtbar waren. Bei Verwendung der Primer F4 und 5'RACEamp hatten die Brassica, Nasturtium und Sumpfblume enthaltenden cDNA sichtbare Banden von etwa 350 Nucleotiden und 550 Nucleotiden. Dies deutet darauf hin, dass die PCR-Reaktionen PCR-Produkte mit mehreren Größen ergaben.
In den 14 bzw. 15 sind die DNA und die translatierten Aminosäuresequenzen des Klons MeadLPAAT 15 und des Klons MeadLPAAT 20, die mittels PCR mit den Oligonucleotiden F4 und 5' RACEAMP erhalten wurden, veranschaulicht. Die translatierte Sequenz der Nucleotide 11–18 entspricht den vom Vorwärts-Primer codierten Aminosäuren. Die Nucleotide 489–517 entsprechen dem Rückwärts-Primer des Klons MeadLPAAT 15 und den Nucleotiden 485–508 des Klons MeadPLAAT 20. Die Translation der Nucleotide 11–313 entspricht den LPAAT codierenden Sequenzen.
C. Screening von Banken

1. Synthetisches Oligonucleotid als Sonde: Brauchbare Hybridisierungslösungen für das Screening von Banken mit Oligonucleotid-Sonden wie SQ1272-P1 oder SQ1272-P2 umfassen Tetraalkylammoniumsalz-Lösungen wie die von Jacobs et al. (Nucl. Acids Res. (1988) 16: 4637–4650) beschriebenen. Zweckmäßige Hybridisierungsbedingungen wie die Hybridisierungs- und die Waschtemperatur können auch durch eine Northern-Analyse von RNA-Blots, die RNA aus der Enzymquelle, d. h. Kokosnuss-Endosperm, enthalten. Das Oligonucleotid kann dann radioaktiv markiert und mit Klonen aus der oben beschriebenen Kokosnuss-DNA-Bank hybridisiert werden, um Klone zu identifizieren, die LPAAT-Peptide codierende Sequenzen enthalten.
2. PCR-Produkt als Sonde: LPAAT-DNA-Fragmente, die gemäß der obigen Beschreibung mittels PCR erhalten wurden, können auch radioaktiv markiert und als Sonden für Kokosnuss- oder andere Pflanzen-LPAAT-Klone (Maniatis, s. o.) verwendet werden. Um beispielsweise Kokosnuss-LPAAT-Klone zu erhalten, wird ein etwa 280 bp langes Fragment des Klons 23-2, das die LPAAT codierende Region enthält, durch einen Aufschluss von 23-2 mit XbaI und SalI und die Isolation des Fragments mit etwa 280 bp erhalten. Das Fragment wird durch eine statistische Initialreaktion unter Verwendung eines Satzes zur statistischen Markierung (Stratagene; La Jolla, CA) radioaktiv markiert. Etwa 240 000 Plaques der Kokosnuss-Endosperm-cDNA-Bank im UniZap-Phagen werden plattiert, auf Nylonmembranfilter gehoben und mit dem markierten LPAAT-23-2-Fragment hybridisiert. Die Hybridisierung erfolgt bei 42°C in einer Hybridisierungslösung, die 50% Formamid, 5 × SSC (1 × SSC = 0,15 M NaCl; 0,015 M Na-Citrat), 0,1% SDS, 0,1 mg/ml Lachssperma-DNA, 10 × Denhardtsche Lösung enthielt. Die Filter werden in 1 × SSC, 0,1 SDS 30 min lang bei Raumtemperatur gewaschen, gefolgt von zwei 30-minütigen Waschvorgängen in derselben Lösung bei 37°C. Insgesamt 32 Hybridisierungsplaques werden identifiziert. Die identifizierten Plaques werden erneut plattiert, und die Hybridisierung mit dem radioaktiv markierten Plaque wird wiederholt, wodurch gereinigte Kulturen von 30 des LPAAT enthaltenden Phagen erhalten werden. Die LPAAT-cDNA-Fragmente werden gemäß der Anleitungen des Herstellers (Stratagene) aus dem UniZap-Phagenvektor herausgeschnitten. Kurz zusammengefasst wird ein Helfer-Phagen-System verwendet, das zur automatischen Exzision und Rezirkularisierung herausgeschnittener cDNA führt, wodurch Subklone in einem pBluescript SK-(Stratagene) Phagemid-Vektor erzeugt werden. Die LPAAT-Subklone werden weiter analysiert, um die Längen der verschiedenen Inserte zu bestimmen, und es werden 3'-nichtcodierende Sequenzen erhalten und analysiert, um die Anzahl der Klassen von LPAAT-Klonen zu bestimmen.

Obwohl cDNA-Klone mit verschiedenen Größen erhalten werden, deutet die DNA-Sequenzanalyse der 3'-Teile von 26 der Klone darauf hin, dass sie vom selben Gen stammen. Die Klone variieren hinsichtlich der Sequenzlänge sowohl am 5'- als auch am 3'-Ende. Die Variation an den 3'-Enden deutet darauf hin, dass mehr als eine Polyadenylierungsstelle verwendet wird. Die DNA-Sequenz und die translatierte Aminosäuresequenz des Klons COLP4 mit voller Länge (pCGN5503) ist in 13 aufgeführt.
Die berechnete Molmasse des translatierten LPAAT-Proteins von COLP4 beträgt etwa 34,8 kD, und der geschätzte isoelektrische Punkt beträgt 9,79. Die berechnete Molmasse ist mit dem aus SDS-PAGE beobachteten Wert von 27–29 kD nicht inkonsistent.
Zwei zusätzliche Klone mit derselben 5'-Sequenz wie COLP4 wurden ebenfalls untersucht. Jeder dieser Klone enthielt eine Deletion in der LPAAT codierenden Region. Im Klon COLP25 ist eine Region von 99 bp (Basen 721–819 von 13) deletiert. Das richtige Raster für die Translation wird beibehalten, was zu einem translatierten Protein führt, dem eine LPAAT-Peptidregion von 33 Aminosäuren fehlt. Beim Klon COLP10 ist eine Region von 49 bp (Basen 820–868 von 13) deletiert, und das LPAAT-Leseraster wird nicht beibehalten.
Zum Erhalt von Sumpfblumen-Klonen wird ein ähnliches Verfahren wie das oben beschriebene verwendet.
Ein Fragment mit etwa 510 bp der Klone MeadLPAAT 15 und MeadLPAAT 20, die die LPAAT codierende Region enthalten, wird durch einen Aufschluss der Klone mit EcoRI und PstI und eine Isolierung des resultierenden Fragments mit etwa 510 bp erhalten. Das Fragment wird durch ein statistisches Priming unter Verwendung eines Satzes zur statistischen Markierung (Pharmacia, Piscataway, N.J.) radioaktiv markiert. Etwa 240 000 Plaques der Sumpfblumen-Endosperm-cDNA-Bank im UniZap-Phagen werden plattiert, auf Nylon-Membranfilter gehoben und an das markierte LPAAT-Fragment hybridisiert. Die Hybridisierung wird bei 37°C in einer Hybridisierungslösung durchgeführt, die 30% Formamid, 5 × SSC (1 × SSC = 0,15 M NaCl; 0,015 M Na-Citrat), 0,1 SDS, 0,1 mg/ml Lachssperma-DNA, 10 × Denhardtsche Lösung enthält. Die Filter werden in 1 × SSC, 0,5% SDS bei 55°C gründlich gewaschen. Insgesamt 41 Hybridisierungsplaques werden identifiziert. Wie oben beschrieben ist, werden die identifizierten Plaques wieder plattiert, und die Hybridisierung mit der radioaktiv markierten Plaque werden wiederholt, um gereinigte Kulturen des LPAAT enthaltenden Phagen zu erhalten. Die LPAAT-cDNA-Fragmente werden gemäß der Anleitungen des Herstellers (Stratagene) aus dem UniZap-Phagen ausgeschnitten und weiter analysiert, um die Längen der verschiedenen Inserte zu bestimmen. Es werden nichtcodierende 5'- und 3'-Sequenzen erhalten und analysiert, um die Anzahl der Klassen von LPAAT-Klonen zu bestimmen. Die Sequenz an den 5'-Enden von 14 cDNA deutete auf wenige Nucleotidunterschiede hin. Ein Klon voller Länge, Melp2, wurde zur Herstellung eines Konstrukts ausgewählt. Melp4 war der Klon mit den meisten Unterschieden zu Melp2, und der gesamte Klon wurde sequenziert. Er ist am 3'-Ende 43 ntps kürzer (weist eine andere Polyadenylierungsstelle auf) und ist nicht ganz ein Klon voller Länge. Innerhalb der Regionen, die in beiden Klonen gefunden werden, gibt es 21 Nucleotidunterschiede, was zu 4 Aminosäureänderungen führt.
Die DNA-Sequenzierung zeigte, dass zwei Klone, die mittels PCR aus Sumpfblumen-cDNA isoliert wurden, ein Protein mit einer Homologie zur Kokosnuss-LPAAT codieren. Die Klone sind etwa 510 Nucleotide lang und enthalten eine DNA-Sequenz, die die C-terminalen 102 Aminosäuren der Sumpfblumen-LPAAT codiert. Leichte Unterschiede der Längen der beiden Klone sind auf verschiedene Längen der in die Klone eingeschlossenen Poly-A-Enden zurückzuführen. Unterschiede zwischen den beiden Klonen in den ersten 27 Nucleotiden der DNA-Sequenz resultieren aus der degenerativen Beschaffenheit der bei der PCR-Reaktion verwendeten Primer und stellen keine realen Unterschiede in den Sequenzen der geklonten Gene dar. MEADLPAAT20 unterscheidet sich von MEADLPAAT15 auch hinsichtlich des Vorhandenseins eines G im Poly-A-Ende (Nucleotid 494 von MEADLPAAT20). Dieses G ist am wahrscheinlichsten ein Artefakt der PCR-Amplifizierung, weil es ein Teil des 5'-RACEAMP-Primers ist, der ein A ist. Neben den oben erwähnten Unterschieden zwischen den Klonen gibt es 10 Nucleotidunterschiede zwischen den beiden Klonen, was darauf hindeutet, dass die Sequenzen um etwa 2% divergieren. Die von den beiden Klonen codierten Aminosäuresequenzen unterscheiden sich durch zwei Aminosäuren, was auch darauf hindeutet, dass die Proteine sich um etwa 2 unterscheiden. Ein Vergleich des Kokosnuss-Klons und der Sumpfblumen-LPAAT-PCR-Klone zeigt, dass 71/102 Aminosäuren zwischen Sumpfblume und Kokosnuss identisch sind (eine Identität von 70%, siehe das beiliegende Alignment). Dies gibt einen starken Hinweis darauf, dass die Sumpfblumen-Klone LPAAT codieren.
Die DNA-Sequenz und die translatierte Aminosäuresequenz der Sumpfblumen-LPAAT-cDNA-Klone MELP2 und MELP4 sind in den 17 und 18 aufgeführt. Die translatierte Aminosäuresequenz von Melp2 weist eine Identität der Aminosäuresequenz zur Kokosnuss-LPAAT von etwa 63% auf (105 Unterschiede in 281 Aminosäuren). Eine Anzahl von Aminosäureregionen mit einer Sequenzidentität von 100%, die wenigstens 6 benachbarte Aminosäuren umfasst, wird durch Vergleich der gesamten codierenden Sequenzen für die Kokosnuss- und die Sumpfblumen-LPAAT gefunden. Diese Regionen umfassen LLPWPY, GNLYGH, RIDRSNP, KNLSLI, LPIVPM, FPEGTRS, GRLLPFKKGF, LTGTHLAWRK und PITVKY. Diese Aminosäuresequenzen können zur Herstellung von zusätzlichen Sonden und/oder PCR-Primern zur Isolation von LPAAT codierenden Sequenzen aus zusätzlichen Pflanzenspezies verwendet werden.
Zur Erleichterung der Herstellung von Konstrukten wird die codierende Region des LPAAT-cDNA-Klons MELP2 mittels PCR amplifiziert, wobei die folgenden Oligonucleotid-Primer verwendet werden:
5867 (SEQ ID NR.: 43)
5' CAUCAUCAUCAUGTCGACAATGGCCAAAACTAGAACTAGCT 3
5868 (SEQ ID NR.: 44)
5' CAUCAUCAUCAUGTCGACGGATCCTCACTTTGAGCGATTTGTGCT 3
Der Primer 5867 führt eine SalI-Klonierungsstelle unmittelbar stromaufwärts vom ATG-Translations-Startcodon ein, und der Primer 5868 führt BamHI- und SalI-Klonierungsstellen unmittelbar 3' zum Translations-Stoppcodon der MELP2-cDNA ein. Das PCR-Produkt wird in pAMP1 (BRL/GIBCO) geklont, wodurch pCGN7685 erhalten wird, und sequenziert, um zu verifizieren, dass durch die PCR nicht Mutationen eingeführt wurden.
Beispiel 10 Expression von LPAAT in E. coli
Ein LPAAT-Klon kann in E. coli exprimiert werden, um eine zweckmäßige Quelle für das Protein zur Antikörper-Herstellung und zur Bestätigung der Expression der LPAAT-Aktivität zu erzeugen. Zum Beispiel wird der Kokosnuss-LPAAT-cDNA-Insert von pCGN5503 (COLP4) mittels PCR dahingehend mutagenisiert, dass eine SalI-Restriktionsstelle unmittelbar stromaufwärts vom ATG-Startcodon an den Nucleotiden 259–261 der in 13 veranschaulichten Sequenz und eine BamHI-Stelle unmittelbar stromabwärts vom TAA-Stopp-Codon an den Nucleotiden 1183–1185 der in 13 veranschaulichten Sequenz insertiert wird. Die LPAAT codierende Sequenz wird als SalI/BamHI-Fragment in einen kommerziellen Klonierungsvektor, CloneAmp (BRL), geklont, und der resultierende Konstrukt wird als pCGN5504 bezeichnet.
Die LPAAT codierende Region in pCGN5504 wird als SalI/BamHI-Fragment in den E.-Coli-Expressionsvektor pCGN7645 übertragen, was in pCGN5505 zur Expression von LPAAT von einem T7-Promotor führt. pCGN7645 wurde konstruiert, indem ein synthetischer Oligonucleotid-Linker, der eine Shine-Delgarno-Sequenz und SalI-, BamHI-, und PstI-Restriktionsstellen enthielt, in ein mit XbaI/BamHI aufgeschlossenes pET3A geklont wurde (Rosenberg et al. (1987) Gene 56: 125–135). Die Sequenz des Oligonucleotid-Linkers (SEQ ID NR.: 35) ist wie folgt:
5' CTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGGTCGACGGATCCCTGCAGATC 3'.
E.-Coli-Zellen BL21(DE3), die den LPAAT-Konstrukt pCGN5505 enthalten, werden bei 37°C gezogen, granuliert und in 50 mM HEPES, 1 M NaCl, 10 mM EDTA, 100 μM Pefabloc^® (Boehringer Mannheim), 1 μM Leupeptin, 0,1 μM Pepstatin A, 5 mM β-Mercaptoethanol, pH-Wert 7,5, resuspendiert und mittels Ultraschallbehandlung zerbrochen. Die Proben werden 15 min lang bei 12 000 g zentrifugiert. Die resultierenden überstehenden Fraktionen werden 2 h lang bei 134 000 g zentrifugiert, und die granulierten Membranen werden in 50 mM HEPES, 200 mM NaCl, 20% (Gew./Vol.) Glycerin, 5 mM β-Mercaptoethanol, pH-Wert 7,5, suspendiert. Membranfraktionen werden mit 12:0-LPA und verschiedenen, in Beispiel 1 beschriebenen Acyl-CoA-Spezies auf Acyl-CoA-Substratspezifitäten untersucht. Membranpräparate von Kulturen von E. coli und von unreifem Kokosnuss-Endosperm werden mit Sojabohnen-Phospholipiden vereinigt und in 1 M NaCl in Puffer A verdünnt, um die Preassay-Bedingungen des löslich gemachten Enzyms zu simulieren.
Die Kokosnuss-cDNA exprimierende Zellen wiesen eine höhere Aktivität an Substraten mit mittleren Ketten, insbesondere 12:0-CoA, als die Kontrolle E. coli, die 18:1-CoA bevorzugte, auf. Es wurde auch gezeigt, dass die LPAAT- Aktivität des von E. coli exprimierten Enzyms im Vergleich zu Acyl-ACP- für Acyl-CoA-Substrate spezifisch war. Die Kokosnuss-LPAAT war mit 10:0-, 12:0- und 14:0-CoA-Substraten am aktivsten, wurde mit 18:0-CoA weniger gut verwendet und war mit einer etwas geringeren Aktivität bei 8:0-CoA nachweisbar. Wenn der E.-Coli-Hintergrund von pCGN5505-Kulturen subtrahiert wird, ist das resultierende Profil demjenigen, das von Membranfunktionen unreifen Kokosnuss-Endosperms erhalten wird, sehr ähnlich.
Die oben beschriebenen Techniken können auch zur Expression eines Sumpfblumen-Klons verwendet werden. Klone mit voller Länge, die aus einer Bank gemäß Beispiel 8B isoliert sind, können direkt auf ihre Aktivität untersucht werden, weil die LPAAT als Fusionsprotein mit lacZ exprimiert oder alternativ in einem E.-coli-Stamm mit LPAAT-Mangel gemäß der Beschreibung von Coleman (Mol. Gen. Genet. (1992) 232: 295–303) exprimiert wird.
Beispiel 11 Konstrukte für die Pflanzentransformation
DNA-Konstrukte zur Verwendung in der Pflanzentransformation werden hergestellt. Für Verwendungen bei der Expression in Erntegütern von Pflanzen-Ölsaat zur Modifikation von TAG können LPAAT codierende Sequenzen in Expressionskassetten insertiert werden, die regulatorische Regionen enthalten, die eine präferentielle Expression in pflanzlichen Samengeweben ergeben. Beispiele für Gene, aus denen solche Expressionskassetten hergestellt werden können, umfassen Samen-ACP, ein Bce4-Gen von Brassica-Samen und ein Brassica-Napingen. Siehe beispielsweise Kridl et al. (in Control of Plant Gene Expression (1993) Kapitel 30, S. 481–498, Hrsg. D. P. S. Verma, CRC Press) für eine Diskussion von Expressionskassetten zur Verwendung für eine Expression von Genen in Pflanzensamengeweben.
A. Napin-Expressionskonstrukte
Eine Napin-Expressionskassette, pCGN1808, die zur Expression von Wachssynthase- oder Reduktasegenkonstrukten verwendet werden kann, ist in Kridl et al. (Seed Science Research (1991) 1: 209–219), worauf hier ausdrücklich als Literaturstelle Bezug genommen wird, beschrieben.
Alternativ kann pCGN1808 dahingehend modifiziert werden, dass es flankierende Restriktionsstellen enthält, die die Bewegung nur der Expressionssequenzen und nicht des Markers für die Antibiotikaresistenz zu binären Vektoren wie pCGN1557 erlauben (McBride und Sommerfelt, s. o.). Synthetische, die Restriktionsstellen KpnI, NotI und HindIII enthaltende Oligonucleotide werden hybridisiert und so an die einzigartige HindIII-Stelle von pCGN1808 ligasiert, dass nur eine HindIII-Stelle gewonnen wird. Das resultierende Plasmid, pCGN3200, enthält einzigartige HindIII-, NotI- und KpnI-Restriktionsstellen am 3'-Ende der 3'-regulatorischen Napinsequenzen, wie durch eine Sequenzanalyse bestätigt wird.
Der Hauptteil der Napin-Expressionskassette wird durch Aufschluss mit HindIII und SacI und eine Ligasierung an mit HindIII und SacI aufgeschlossenes pIC19R von pCGN3200 subkloniert (Marsh et al. (1984) Gene 32: 481–485), wodurch pCGN3212 erzeugt wird. Die äußerste 5'-Sequenz der Napin-Promotorregion wird mittels PCR rekonstruiert, wobei pCGN3200 als Matrize und zwei Primer, die die SacI-Stelle und die Verbindung des Napin-5'-Promotors mit dem pUC-Rückgrat von pCGN3200 vom pCGN1808-Konstrukt flankieren, verwendet werden. Der Vorwärts-Primer enthält ClaI-, HindIII-, NotI- und KpnI-Restriktionsstellen sowie die Nucleotide 408–423 der Napin-5'-Sequenz (von der EcoRV-Stelle), und der Rückwärts-Primer enthält die Ergänzung zu den Napinsequenzen 718–739, die die einzigartige SacI-Stelle im 5'-Promotor einschließt. Die PCR wurde unter Verwendung eines Cetus-Thermocyclers von Perkin Elmer gemäß der Spezifikationen des Herstellers durchgeführt. Das PCR-Fragment wird als Fragment mit glattem Ende in pUC8 (Vieeira und Messing (1982) Gene 19: 259–268) subkloniert und mit HincII aufgeschlossen, wodurch pCGN3217 erhalten wird. Die Sequenz von pCGN3217 über den Napin-Insert verifiziert, dass durch die PCR keine falschen Nucleotide eingeführt wurden. Die Napin-5-Sequenzen in pCGN3217 werden durch einen Aufschluss mit ClaI und SacI und eine Ligasierung an mit ClaI und SacI aufgeschlossenes pCGN3212 an den Rest der Napin-Expressionskassette ligasiert. Die resultierende Expressionskassette, pCGN3221, wird mit HindIII aufgeschlossen, und die Napin-Expressionssequenzen werden mittels Gelreinigung entfernt und an mit HindIII aufgeschlossenes pIC20H (Marsh, s. o.) ligasiert. Die endgültige Expressionskassette ist pCGN3223, die in einem gegenüber Ampicillin resistenten Hintergrund im Wesentlichen die identischen 1725-Napin-5'- und 1265-3'-regulatorischen Sequenzen enthält, die in pCGN1808 gefunden werden. Die regulatorischen Regionen werden mit den Restriktionsstellen HindIII, NotI und KpnI flankiert, und die einzigartigen SalI-, BglII-, PstI- und XhoI-Klonierungsstellen befinden sich zwischen den nichtcodierenden 5'- und 3'-Regionen und können zum Insertieren des LPAAT-Gens von Interesse verwendet werden.
Zum Beispiel wird das SalI/BamHI-Fragment von pCGN5504, das die gesamte Kokosnuss-LPAAT-codierende Region enthält, in mit SalI/BglII aufgeschlossenes pCGN3223 ligasiert, wodurch ein Expressionskonstrukt pCGN5509 erhalten wird, bei dem die Kokosnuss-LPAAT-codierende Sequenz zur Transkription der Sense-Sequenz unter Regulierung des Napin-Promotors positioniert ist.
Zur Expression von Sumpfblumen-LPAAT in Pflanzensamen wurde pCGN7685 mit SalI und BamHI aufgeschlossen, und das resultierende, LPAAT codierende Fragment wurde in mit SalI und BglII aufgeschlossenes pCGN3223 geklont, wodurch pCGN7692 erhalten wurde.
B. Oleosin-Expressionskonstrukte
Eine Kassette zum Klonen von Sequenzen zur Transkription unter der Kontrolle von 5'- und 3'-Regionen aus einem Oleosin-Gen kann wie folgt hergestellt werden. Die Sequenz eines Oleosin-Gens von Brassica napus wurde von Lee und Huang berichtet (Plant Phys. (1991) 96: 1395–1397). Primer für die veröffentlichte Sequenz werden in PCR-Reaktionen verwendet, wodurch die 5'- und 3'-regulatorischen Regionen eines Oleosin-Gens von Brassica napus cv. Westar erhalten werden. Zwei PCR-Reaktionen wurden durchgeführt, eine zur Amplifizierung von etwa 950 Nucleotiden unmittelbar stromaufwärts vom ATG-Startcodon für das Oleosin-Gen und eine, um mittels PCR etwa 600 bp einschließlich des TAA-Stoppcodons für das Oleosin-Gen und stromabwärts davon zu amplifizieren. Die PCR-Produkte wurden gemäß der Protokolle des Herstellers in den Plasmidvektor pAMP1 (BRL) geklont, wodurch das Plasmid pCGN7629, das die flankierende Oleosin-5'-Region enthält, und pCGN7630, das die flankierende 3'-Region enthält, erhalten wurden. Die PCR-Primer umfassen zweckmäßige Restriktionsstellen zum gemeinsamen Klonen der 5'- und 3'-flankierenden Regionen in eine Expressionskassette. Ein PstI-Fragment, das die 5'-flankierende Region von pCGN7629 enthielt, wurde in mit PstI aufgeschlossenes pCGN7630 geklont, wodurch das Plasmid pCGN7634 erhalten wurde. Das Fragment BssHII (New England BioLabs) von pCGN7634, das die gesamte Oleosin-Expressionskassette enthielt, wurde in mit BssHII aufgeschlossenes pBCSK+ (Stratagene) geklont, wodurch die Oleosin-Kassette als Plasmid pCGN7636 erhalten wurde. Die Oleosinkassette ist von BssHII-, KpnI- und XbaI-Restriktionsstellen flankiert und enthält SalI-, BamHI- und PstI-Stellen zur Insertion von interessierenden DNA-Sequenzen zwischen die 5'- und die 3'-Oleosinregion.
Zum Beispiel wird das SalI/BamHI-Fragment von pCGN5504, das die gesamte LPAAT codierende Region enthält, in mit SalI/BamHI aufgeschlossenes pCGN7636 ligasiert, wodurch ein Expressionskonstrukt, pCGN5508, erhalten wird, bei dem die Kokosnuss-LPAAT codierende Sequenz zur Transkription der Sense-Sequenz unter Regulierung des Oleosin-Promotors aufweist.
C. Binäre Konstrukte für eine vom Pflanzen-Agrobacterium vermittelte Pflanzentransformation
Konstrukte für die Pflanzentransformation werden durch eine Übertragung der LPAAT-Sequenzen enthaltenden Expressionskassetten in zweckmäßige Klonierungsstellen auf einem binären Vektor wie den von McBride et al. (s. o.) beschriebenen hergestellt.
Zusätzliche binäre Vektoren werden aus pCGN1578, pCGN1559 und anderen von McBride et al. (s. o.) hergestellten Vektoren durch Substitution der Linkerregionen pCGN1578 und pCGN1559 mit einer Linkerregion hergestellt, die die folgenden Restriktions-Aufschlussstellen enthält: Asp718/AscI/PacI/XbaI/BamHI/SwaI/Sse8387 (PstI)/HindIII. Dies führt zu pCGN1578PASS oder pCGN1559PASS und anderen modifizierten Vektoren mit ähnlichen Bezeichnungen. AscI, PacI, SwaI und Sse8387 haben Restriktions-Erkennungsstellen für 8 Basen. Diese Enzyme sind wie folgt erhältlich: von New England BioLabs: AscI, PacI; Boehringer Mannheim: SwaI und Takara (Japan): Sse8387.
Die binären Konstrukte werden dann gemäß dem Verfahren von Holsters et al. (Mol. Gen. Genet. (1978) 163: 181–187) in Zellen eines zweckmäßigen Agrobacterium-Stamms wie EHA101 (Hood et al. (1986) J. Bacteriol. 168: 1291–1301) zur Verwendung bei der Herstellung von transgenen Pflanzen transformiert.
Ein binärer Konstrukt zur Transformation mit dem Napin-5'/Kokosnuss-LPAAT/Napin-3'-Konstrukt wird hergestellt, indem das HindIII-Fragment mit etwa 3,9 kb von pCGN5509 in mit HindIII aufgeschlossenes pCGN1578PASS geklont wird, was zu pCGN5511 führt.
Ein binärer Konstrukt zur Transformation mit dem Oleosin-5'/Kokosnuss-LPAAT/Oleosin-3'-Konstrukt wird durch das Klonen des BssHII-Fragments mit etwa 2,6 kb in mit AscI aufgeschlossenes pCGN1578 geklont wird, was zu pCGN5510 führt.
Ein binärer Konstrukt zur Transformation mit dem Napin-5'/Sumpfblumen-LPAAT/Napin-3'-Konstrukt wird hergestellt, indem das HindIII-Fragment von pCGN7692, das die Napin/Sumpfblumen-LPAAT-Genfusion enthält, in mit HindIII aufgeschlossenes pCGN1559PASS geklont wird, wodurch pCGN7695 erhalten wird.
Beispiel 12 Transformation mit LPAAT-Konstrukten
Eine Vielzahl von Verfahren ist entwickelt worden, um eine interessierende DNA-Sequenz unter Erhalt der Transkription oder Transkription und Translation der Sequenz in das Genom eines Pflanzenwirtes zu insertieren, um phänotypische Änderungen zu bewirken.
Transgene Brassica-Pflanzen (Varietät 212/86 oder Varietäten mit einem niedrigen Linolen-Gehalt wie beispielsweise) werden durch eine vom Agrobacterium vermittelte Transformation gemäß der Beschreibung von Radke et al. (Theor. Appl Genet. (1988) 75: 685–694; Plant Cell Reports (1992) 11: 499–505) erhalten. Transgene Arabidopsis-thaliana-Pflanzen können durch eine vom Agrobacterium vermittelte Transformation gemäß der Beschreibung von Valverkens et al. (Proc. Nat. Acad. Sci. (1988) 85: 5536–5540) erhalten werden. Andere Pflanzenspezies können auf vergleichbare Weise unter Verwendung verwandter Techniken transformiert werden. Wenn Fettsäuren mit sehr langen Ketten enthaltende Triglyceride von Interesse sind, ist die Verwendung von Rapsvarietäten mit hohem Erucasäure-Gehalt (HEAR) besonders nützlich. Ein Beispiel für eine solche HEAR-Ölvarietät ist Resten.
Alternativ können auch Verfahren des Beschusses mit Mikroprojektilen wie diejenigen, die von Klein et al. beschrieben sind (Bio/Technology 10: 286–291) verwendet werden, um nuklear transformierte Pflanzen zu erhalten, die die hier beschriebenen viralen RNA-Polymerase-Expressionskonstrukte mit einer einzelnen Untereinheit umfassen.
Zur Modifikation des TAG durch eine Einarbeitung von Fettsäuren mit mittlerer Ketten in die sn-2-Position ist eine Transformation von Pflanzen, die signifikante Konzentrationen an Fettsäuren mit mittlerer Kette enthalten, erwünscht. Solche Pflanzen können durch eine Transformation mit Acyl-ACP- Thioesterasen mit einer präferentiellen Aktivität für Fettacyl-ACP mit Fettsäureestern mit mittleren Ketten haben, erhalten werden. (Siehe WO 92/20236 und WO 94/10288 ).
Zur Modifikation von TAG durch die Einarbeitung von Fettsäuren mit sehr langer Kette in die sn-2-Position ist eine Transformation von Pflanzen mit signifikanten Konzentrationen an Fettsäuren mit sehr langer Kette erwünscht. Solche Pflanzen umfassen Rapsvarietäten mit hohem Erucasäure-Gehalt (HEAR) oder Pflanzen, die mit einer Acyl-CoA-Synthase für sehr lange Ketten transformiert wurden, die die Erzeugung von Fettsäuren mit sehr langen Ketten gewährleistet. (Siehe die anhängige US-Ser.Nr. 08/265,047, als US 5,679,881 patentiert, und WO 95/15387 , eingereicht am 30.11.1994).
Beispiel 13 Analyse von transgenen Pflanzen
Samen von transgenen, die LPAAT-Konstrukte enthaltenden Pflanzen werden gemäß der Beschreibung in Beispiel 1 auf die LPAAT-Aktivität untersucht. Pflanzen, die als positiv für eine LPAAT-Expression identifiziert sind, können mit Pflanzen, die hohe Konzentrationen der gewünschten Fettsäuren enthalten, ausgekreuzt werden. Wenn beispielsweise ein Trilaurinöl erwünscht ist, kann man die LPAAT exprimierenden Pflanzen mit einer Pflanze kreuzen, die hohe Konzentrationen an C12-Fettsäuren enthält. Erhöhte C12-Konzentrationen können als Folge der Expression einer C12 bevorzugenden Acyl-ACP-Thioesterase von kalifornischem Lorbeer erzeugt werden ( WO 92/20236 und WO 94/10288 ). Auf diese Weise wird eine leicht verfügbare Quelle des C12-Acyl-CoA-Donorsubstrats für eine LPAAT-Aktivität erhalten.
A. LPAAT-Aktivität in transgenen Pflanzen
Membranfraktionen werden wie folgt aus unreifen Samen transgener Pflanzen hergestellt, die Konstrukte zur Samenexpression von LPAAT enthalten. Etwa 0,5–1 g (Frischgewicht) unreife Samen werden in einem eiskalten Mörser mit 5 ml Extraktionspuffer, der 0,1 M HEPES-HCl, pH-Wert 7,5, 3 M NaCl, 10 mM DIECA, 0,1 mM Pefabloc^®, 1 μM Leupeptin, 1 μM Pepstatin ”A” (wobei die letzten vier Bestandteile unmittelbar vor der Verwendung zugegeben werden), gemahlen. Zum Mahlen kann eine kleine Menge Sand eingeschlossen sein. Die Probe wird dann etwa 50 min lang bei 10 000 U./min zentrifugiert.
Das aus der Zentrifugation resultierende Fettkissen wird entsorgt, und die überstehende Fraktion wird nochmals 2 h lang bei 36 000 U./min zentrifugiert. Das resultierende Pellet wird in 250 μl ”P2-”Puffer (50 mM HEPES-HCl, pH-Wert 7,5, 1 M NaCl, 20% (Vol./Vol.) Glycerin, 5 mM 2-Mercaptoethanol (ME)) resuspendiert. Resuspendierte P2-Präparate werden entweder sofort untersucht oder zur Aufbewahrung und zur späteren Untersuchung in flüssigem Stickstoff bei –70°C gefroren.
Wenn P2-Präparate zuvor gefroren wurden, werden sie rehomogenisiert und auf Eis gehalten. In jede Assay-Glasampulle werden 50 μl eines ”5X-”Assaypuffers (0,5 M HEPES-HCL, pH-Wert 7,5, 25% (Vol./Vol.) Glycerin, 50 mM EDTA, 10 μl 5 M NaCl, 122 μl H₂O, 2,5 μl 2 mM 12:0-LPA bzw. 18:1-LPA) und 5 μl am Acyl radioaktiv markiertes (siehe Beispiel 1) 12:0-CoA bzw. 18:1-CoA gegeben. Reaktionen werden durch die Zugabe von 50 μl einer verdünnten P2-Präparat-Probe gestartet.
Für anfängliche Assays wurde eine 10-fache P2-Verdünnung verwendet, und die Reaktion wurde 30 min lang bei 30°C laufen gelassen. Reaktionen werden durch die Zugabe von 250 μl 1 M KCl in 0,2 M H₃PO₄ gestoppt. Dann wird Folgendes zur Reaktionsmischung gegeben: 40 μl 1 mg/ml BSA, 750 μl CHCl₃/CH₃OH (2/1 (Vol./Vol.)) und 50 μg nicht markierter Phosphatidinsäure-Träger (1 mg/ml in CHCl₃/CH₃OH (2/1 (Vol./Vol.)). (Die Phosphatidinsäure hat idealerweise passend zu den im Assay verwendeten Substraten 12:0- oder 18:1-Acylgruppen, wobei zufriedenstellende Ergebnisse aber auch erhalten werden können, wenn sie verschieden sind). Die Proben werden gründlich vermischt und kurz zentrifugiert, um Schichten zu trennen. Die obere Schicht wird verworfen, und 100-μl-Proben der unteren Schicht werden auf Dünnschichtchromatographie-(TLC-)Platten (Siliciuimdioxid ”G”) aufgetragen oder in Szintillationsampullen gefüllt. Zur Szintillationszählung wird das Lösungsmittel mit einem warmen Luftstrom vor der Zugabe des Szintillationsmittels abgedampft.
Die TLC wird mit Chloroform/Pyridin/Ameisensäure (50/30/7 oder 50/25/7, Vol./Vol.) als aufsteigendes Lösungsmittel durchgeführt. Radioaktive Zonen werden visualisiert und auf den getrockneten Platten mittels eines Radiochromatogramm-Scanners (Ambis Inc.) quantifiziert. Die Radioaktivität des Phosphatidatprodukts auf TLC ist als Prozentwert der Radioaktivität der gesamten Bahn ausgedrückt, und dieses Verhältnis wird dann verwendet, um die tatsächliche Radioaktivität des Produkts aus den Szintillations-Zähldaten zu berechnen.

Ergebnisse dieser Assays sind in Tabelle 4 unten aufgeführt. TABELLE 4 Aktivitätsverhältnisse für 12:0/18:1-LPAAT in transgener Brassica

Pflanzenlinie	Aktivitätsverhältnis	Pflanzenlinie	Aktivitätsverhältnis
Kontrolle-1	0,48	5511-1	2,8
Kontrolle-2	0,68	5511-2	1,8
Kontrolle-3	0,79	5511-3	2,6
Kontrolle-4	0,93	5511-4	0,84
Kontrolle-5	0,50	5511-5	2,4
		5511-6	2,2
		5511-7	2,5
		5511-8	2,4
		5511-9	2,8
		5511-10	2,6

Die Assays auf LPAAT-Aktivität wurden mit den Substratkombinationen 12:0-LPA + 12:0-CoA und 18:1-LPA + 18:1-CoA durchgeführt. Es wurde gezeigt, dass beide Aktivitätstypen vom Vorhandensein des LPA-Substrats abhängen. Die Aktivität mit den 12:0-Substratpaar wurde in Bezug auf die Aktivität mit dem 18:1-Substratpaar ausgedrückt. Dieses Verhältnis betrug normalerweise 0,5 für die Kontrollsamen (ohne eingeführtes Kokosnuss-LPAAT-Gen) und war für Samen von Pflanzen, die mit dem Kokosnuss-LPAAT-Gen transformiert waren, wesentlich höher (oft > 2,0). Die Erhöhung dieses Verhältnisses ist ein Anzeichen für eine erhöhte Präferenz der LPAAT-Aktivität für 12:0-Substrate gegenüber 18:1-Substraten und daher für die Expression der 12:0-bevorzugenden Kokosnuss-LPAAT-Aktivität in den transgenen Pflanzen.

Weitere Untersuchungen dieses Assays zum Vergleich der Aktivitäten an 12:0- im Vergleich zu 18:1-Substraten zeigten, dass die Abhängigkeit der gemessenen Aktivitäten von der Konzentration des ”P2-”Präparats gering war. Obwohl der Assay zur Identifizierung einer Differenz der Substratpräferenz zwischen dem Kontroll- und dem transformanten Präparat brauchbar war, konnte mit ihm nicht zwischen Samen mit einer hohen LPAAT-Aktivität für mittlere Ketten und derjenigen mit niedrigeren Aktivitätsgraden unterschieden werden, weil die Reaktion in einer viel kürzeren Zeit als der Inkubationsdauer von 30 min bis zur Vervollständigung abgelaufen war. Der zeitliche Ablauf und die Präparateabhängigkeit des Assays wurden detailliert untersucht und der Assay wie folgt modifiziert. Das P2-Präparat wurde 20-fach und 40-fach verdünnt, und die Reaktionsdauer wurde auf 10 min verkürzt. Die Reaktion ist hinsichtlich der Zeit und der Enzymkonzentration bei Aktivitäten, die 1500 cpm nicht übersteigen, etwa linear, und somit werden die Ergebnisse aus der Verdünnung, die ein PA-Produkt mit 1500 oder < 1500 cpm ergibt (TLC-korrigierte Szintillationszählung) dahingehend aufgefasst, dass sie die LPAAT-Aktivität repräsentieren. P2-Präparate wurden wieder aufgetaut und unter diesen Bedingungen nochmals untersucht, wobei nur die 12:0-Substrate zum Vergleich der Aktivität von LPAAT-Enzymen für mittlere Ketten in transgenen Pflanzen, Bezugsbasis Gewicht der Frischpflanzen, verwendet wurden. Die Ergebnisse dieser Assays sind in Tabelle 5 unten aufgeführt. TABELLE 5 LPAAT-Aktivität (12:0-CoA- und 12:0-LPA-Substrate)

Ereignis	Mittl. Akt. (cpm PA-Produkt)	Verdünnung (Vielfaches)	Akt. × Verd. (cpm)	Frischgew. der Samen (g)	Korrig. Aktiv./Gew. (cpm/g)
5511-1	2651*	40	106040*	0,67	158,3*
5511-2	1306	20	22120	0,73	35,8
5511-4	331	20	6620	0,23	28,8
5511-5	1191	20	23820	0,56	42,5
5511-7	1834	20	36680	0,91	40,3
5511-3	2240*	40	89600*	0,75	119,5*
5511-6	1447	20	28940	0,60	48,2
5511-8	1905	40	76200	0,65	117,2
5511-9	3227*	40	129080*	0,79	163,4*
5511-10	1379	40	55160	0,65	84,9

* Im Assay immer noch über dem Endwert

Die obigen Ergebnisse demonstrieren, dass transgene Brassica-Pflanzen mit verschiedenen Aktivitätsgraden, die durch exprimierte Kokosnuss-LPAAT für mittlere Ketten erzeugt werden, erhalten werden können.
B. Substratspezifität der LPAAT-Aktivität
Eine ausführliche Analyse der Spezifität für die Kettenlängen von Acyl-CoA wurde wie oben beschrieben an Kontroll-P2-Präparaten und der LPAAT-transformierten Linie 5511-5 bestimmt, wobei die ursprüngliche Reaktionsdauer von 30 min angewandt wurde. Die Acyl-CoA-Substrate für diese Analyse sind in Methanol vorhanden, und somit hatte der Assay auch die folgenden Modifikationen. Die erste, in der Assayampulle angeordnete Lösung war das Volumen eines jeden radioaktiv markierten Acyl-CoA, das für eine endgültige Assaykonzentration von 5 μM erforderlich war. Das Methanol wurde mit einem Stickstoffstrom abgedampft, und die verbliebenen Assaykomponenten wurden als 215 μl einer hergestellten Mischung zugegeben, die 1250 μl ”5x”-Puffer, 250 μl 5 M NaCl, 63 μl 2 mM 12:0-LPA, 3825 μl H₂O und 25 μl rohes Sojabohnen-Phospholipid als Lösung mit 125 mg/ml in 2-Methoxyethanol umfasste. Nach dem Vermischen zum Wiederauflösen des Acyl-CoA von der Ampullenwandung wird die Reaktion durch die Zugabe von 25 μl eines 5-fach verdünnten P2-Präparats gestartet und wie oben fortgesetzt. Bei dieser Analyse verwendete Acyl-CoA-Substrate waren 8:0, 10:0, 12:0, 14:0, 16:0, 18:0 und 18:1. Das Akzeptorsubstrat in diesen Assays war 12:0-LPA. Ergebnisse dieser Assays sind in Tabelle 6 unten aufgeführt. TABELLE 6 LPAAT-Acyl-CoA-Spezifitäten in transgenem Raps

Donorsubstrat Cpm-Pa-Produkt

5511-5 Kontrolle

8:0 454 149

10:0 5648 831

12:0 9337 1758

14:0 5080 1544

16:0 4569 3034

18:0 2038 1514

18:1 8430 7946
Das Spezifitätsprofil für die Transformante 5511-5 entspricht den Erwartungen für eine Kokosnuss-LPAAT-Aktivität für mittlere Ketten, das der Raps-LPAAT-Aktivität der Kontrolle überlagert ist.
C. Züchtung zur Kombination von LPAAT für mittlere Ketten und von Genen für Thioesterasen für Acyl-ACP mit mittleren Ketten
Zur Erzeugung von transgenen Brassica-Samen, die TAG mit signifikanten Graden von an der sn-2-Position eingearbeiteten 12:0-Acylgruppen enthalten, werden Kreuzungen zwischen den obigen transgenen CGNE5511-Pflanzen (weiblich) und transgenen, eine Lorbeer-12:0-Acyl-ACP-Thioesterase exprimierenden Brassica-Pflanzen (männlich) als Resultat der Transformation mit pCGN3828 (Napin-5'/Lorbeer-Thioesterase/Napin-3'; siehe WO 92/20236 ), durchgeführt. Samen von den pCGN3828-Pflanzen enthalten normalerweise etwa 50% Laurat im Samenöl, hauptsächlich an den sn-1- und den sn-3-Positionen.
D. Analyse der sn-2-Fettacyl-Zusammensetzung von TAG
Um Wirkungen der exprimierten LPAAT auf die Fettsäure-Zusammensetzungen von transgenen Samenölen zu identifizieren, wird die Fettsäure-Zusammensetzung von extrahierten Ölen durch Säuremethanolyse gemäß der Beschreibung von Browse et al. (Anal. Biochem. (1986) 152: 141–145) bestimmt. Darüber hinaus kann die Analyse einzelner Triglyceridtypen beispielsweise zur Bestimmung des Prozentwerts von Trilaurin- oder Trierucintriglyceriden durch eine HPLC-Auftrennung gemäß der Beschreibung von Jeffrey et al. (JAOC (1991) 68: 289–293) oder Nikolova-Damyanova et al. (JAOCS (1990) 67: 503–507) durchgeführt werden.
Die Analysen der Acylzusammensetzungen der sn-2- und der sn-1+3-Positionen von TAG kann unter Verwendung des Lipaseaufschlussprotokolls (Brockerhoff (1975) Meth. Enzymol. 35: 315–325) durchgeführt werden. Bei diesem Protokoll spaltet die Lipase idealerweise Fettsäuren von der sn1- und der sn-3-Position und nicht von der sn-2-Position ab. Somit wird angenommen, dass die Fettsäuren im resultierenden Monoglycerid diejenigen in der sn-2-Position sind. Es sei jedoch darauf hingewiesen, dass diejenigen, die zuvor versuchten, TAG mit Fettsäuren mit kürzeren Ketten mit dieser Methode zu untersuchen (Entressangles et al. (1964) Biochim. Biophys. Acta 84: 140–148), berichteten, dass Fettsäuren mit kürzeren Ketten, die sich an der sn-2-Position befanden, während eines solchen Aufschlusses schnell hydrolysiert wurden, wobei die Autoren berichteten, dass es sich dabei um das Ergebnis einer spontanen Migration innerer Fettsäuren mit kürzeren Ketten zu äußeren Positionen in Diglyceriden und Monoglyceriden handelt.
Somit wird aus reifen transgenen und Kontrollsamen destilliertes Öl einem modifizierten Lipase-Aufschlussprotokoll nach Brockerhoff et al. (s. o.) unterzogen, um die Acylmigration zu minimieren. Dadurch werden Acylzusammensetzungen der sn-2- von den vereinigten sn-1+3-Positionen unterschieden. Bei den Modifikationen handelt es sich kurzgefasst um folgende: der pH-Wert wird bis zur Neutralität erniedrigt, die Reaktionsdauer wird verkürzt, Proben werden danach bei einem sauren pH-Wert gehalten, und Aufschlussprodukte werden auf boratimprägnierten TLC-Platten chromatographiert. Die chromatographierten Produkte werden dann eluiert und wie zuvor als Fettsäuremethylester analysiert. Auf diese Weise wird der Prozentwert von Fettsäuren wie C12- oder C14-Fettsäuren mit mittlerer Kette oder von C22:1-Fettsäuren mit langer Kette in der sn-2-Position bestimmt. Das modifizierte Verfahren wurde unter Verwendung stereochemisch definierter, strukturierter TAG verifiziert und wird wie folgt durchgeführt.
Gewöhnlich werden beim Lipaseverfahren nur Direktverdrängerpipetten verwendet, weil Öl und organische Lösungsmittel von Luftpolsterpipetten nicht zuverlässig gespendet werden können. Darüber hinaus sollte beim Abdampfen von Lösungsmitteln sorgfältig darauf geachtet werden, dass die Probe nur gerade zur Trockene gebracht wird. Wenn C10- oder kürzere Acylgruppen vorhanden sind, ist die Trockene vollständig zu vermeiden. Kunststoffteile oder Küchen-Glasgeschirr, die Fettsäureverunreinigungen beisteuern können, sollten vermieden werden. Glasgeschirr kann bei Bedarf mit Chloroform/Methanol 2/1 (Vol./Vol.) vorgespült werden.
In einer 15-ml-Ampulle mit Schraubverschluss (Tefloneinsatz) werden 2 ml 0,1 M Tris-HCl, pH-Wert 7,0, 0,2 ml 2,2% Gew./Vol. CaCl₂, 0,5 ml 0,05% Gew./Vol Gallensalze (Sigma) und 10 μl (10 μg, wenn der Stoff fest ist) der Öl- oder TAG-Probe vereinigt. Um wenigstens einen Teil des Öls zu dispergieren, wird in einem Ultraschallbad eine kurze Ultraschallbehandlung durchgeführt. Die Suspension sollte nach einigen Minuten ein trübes Aussehen annehmen.
Eine Lipase-Verdünnung wird unter Verwendung einer aktiven Suspension von Lipase wie der Rhizopus-arrhizus-Lipase (Sigma, L4384) hergestellt und auf Eis gehalten (4°C). (Wenn die Suspension gefriert geht die Aktivität verloren). Enzymchargen können durch das Testen verschiedener Verdünnung der Suspension mit Wasser im Gesamtverfahren überprüft werden, wobei ungesättigte Fettsäuren enthaltendes Öl verwendet wird, und das Ausmaß des Aufschlusses wird mittels System-1-TLC (siehe unten) unter Iodfärbung sichtbar gemacht. Die korrekte Verdünnung sollte zu einem etwa 50%igen Aufschluss des TAG führen. (Bei einem weiteren Aufschluss besteht die steigende Gefahr, dass das MAG-Produkt angegriffen wird). Normalerweise ergibt eine Verdünnung der Rhizopus-arrhizus-Lipase-Suspension von Sigma mit Wasser auf etwa 600 000 Einheiten/ml eine zweckmäßige Konzentration.
Jede Reaktion wird einzeln durchgeführt. Um die Reaktion zu starten, werden 100 μl der wasserverdünnten Lipase zugegeben, die Ampulle wird verschlossen, und eine kontinuierliche, 1,5 min lange Vortex-Mischung wird sofort begonnen. Das Vortex-Mischen wird während dieses Mischvorgangs mehrmals aktiviert und unterbrochen, um eine Schichtbildung zu verhindern. Während der 1,5-minütigen ”Inkubation” muss sich ein weißes Präzipitat bilden. Das Präzipitat umfasst Calciumsalze freigesetzter Fettsäuren und ist ein Anzeichen dafür, dass die Reaktion abläuft.
Am Ende der 1,5-minütigen Mischinkubation wird die Reaktion durch die Zugabe von 0,5 ml 6 M HCl und kurzes Mischen gestoppt. Sofort werden 2,6 ml Chloroform/Methanol 2/1 Vol./Vol. zugegeben, es wird gut gemischt und in Eis gestellt, während die anderen Lipaseaufschlüsse durchgeführt werden. Es sei darauf hingewiesen, dass das weiße Präzipitat sich jetzt vollständig wieder auflöst.
Alle Ampullen werden aus dem Eis genommen, nochmals einmal gut gemischt und kurz gedreht, um die Schichten zu verschärfen. Die Aufschlussprodukte befinden sich in der unteren Schicht. Die untere Schicht wird unter Verwendung einer Pasteur-Pipette in eine neue 15-ml-Ampulle entfernt. Die ursprüngliche Aufschlussmischung wird mit 1,6 ml reinem Chloroform nochmals extrahiert, gut vermischt, gedreht, und diese untere Schicht wird mit der zuvor entfernten vereinigt. Die vereinigten unteren organischen Schichten werden unter einem N₂-Strom und genug Wärme, damit verhindert wird, dass die Proben sehr kalt werden, fast bis zur Trockene eingedampft.
Bei den TLC-Platten für die Acylmigration handelt es sich um 500 μm präparatives Sil-G, das mit Borsäure vorbeladen ist und keinen Fluoreszenzindikator enthält. Das Vorbeladen wird durch eine aufsteigende Migration von 5 Gew./Vol. Borsäure in 1/1 Vol./Vol. Acetonitril/Methanol mindestens 90 min lang durchgeführt. Die Platten werden getrocknet und bei Raumtemperatur aufbewahrt, bis sie zur Verwendung bereit sind. Bei feuchtem Klima kann eine Heiz”aktivierung” erforderlich sein.
Zwei Lösungsmittelsysteme sind geeignet, die sogar dann, wenn das Lösungsmittel die Oberseite der Platte nicht erreicht, beide exakt 1 h lang in den Platten aufsteigen, weil längere Durchläufe aufgrund der extremen Flüchtigkeit der Lösungsmittel zu einer verminderten Auflösung führen.

System 1 – n-Hexan/Diethylether/Essigsäure, 70/30/1 Vol./Vol
System 2 – Diethylether/Essigsäure 100/1 Vol./Vol.

System 1 wird zur Auswertung und Überwachung der Lipasereaktion verwendet, weil es die Isolierung von TAG, DAG, Fettsäure und MAG ermöglicht.
System 2 kann routinemäßig zur Verwendung und Erzielung der höchsten Reinheit des MAG-Produkts, das für die sn-2-Bestimmung erforderlich ist, verwendet werden.
Vor dem Betüpfeln der Platten wird die Mitte mit einem Bleistift eingeritzt, so dass zwei Proben (links und rechts) aufgetragen werden können. (Die Chromatographie der Proben wird in derselben Richtung wie die Boratbeladung durchgeführt). Darüber hinaus werden 0,5 cm der Schicht von jeder Seite entfernt, um Kanteneffekte zu eliminieren, und eine Linie wird 2 cm oberhalb der Unterkante als Beladungsführung eingezeichnet. Jede getrocknete Probe wird in 100 μl Chloroform/Methanol 2/1 (Vol./Vol.) wieder aufgelöst und entlang der Beladungslinie auf den Halbplatten aufgetragen. Die Ampulle wird jedes Mal zweimal mit 100 μl Chlorform/Methanol 2/1 (Vol./Vol) ausgespült und auf der Oberseite der Probe aufgetragen. Der Beladungsbereich wird an Luft getrocknet, und das Lösungsmittel wird laufen gelassen. Die Platten werden im Abzug an Luft trocknen gelassen.
Um minimale Acylumlagerungen für sn-1- und sn-3-Analysen der Produkte zu gewährleisten, sollte das Verfahren ab dem Beginn der Lipasereaktion ohne Unterbrechung durchgeführt werden.
Die TLC-Platten werden mit Rhodamin-Spray, ~1% Gew./Vol. Rhodamin 6G in Aceton, einer Visualisierung unterzogen. Die Platten werden besprüht, bis sie überall eine mittelrosa Farbe aufweisen, einige Minuten lang trocknen gelassen und unter UV-Licht betrachtet. Lipide fluoreszieren gelb auf einem orangefarbenen Untergrund. Gewünschte Zonen werden mit Bleistift markiert. Bei Verwendung von System 2 liegt die MAG-Zone routinemäßig bei 50–75% des Abstands bis zur Oberseite der Platte, und der Rest der Produkte befindet sich an der Oberseite. Der MAG-Bereich kann aufgrund einer Kettenlängen-Auflösung mehrzonig erscheinen, sollte aber als eine einzige Gesamtzone zum Ausschneiden markiert werden.
Die Zonen werden durch Abschaben auf sauberes Papier übertragen und in Teströhrchen mit einem großen Schraubverschluss (Teflon-Einlage) übertragen. 10 ml Chlorform/Methanol 2/1 (Vol./Vol.) werden zugegeben, es wird geschüttelt und wenigstens 1 h lang stehen gelassen. Es wird durch Whatman-Papier direkt in 100-ml-Kolben eines Rotationsverdampfers filtriert. Die Röhrchen werden jedes Mal durch die Filter zweimal mit 5 ml Chloroform/Methanol 2/1 (Vol./Vol.) ausgespült. (Der Rhodamin-Farbstoff wird zusammen mit den Lipiden eluiert und mit diesen bis zur endgültigen Hexanextraktion von Fettsäuremethylestern (FAMES), wobei er zurückbleibt, durch das Verfahren geschleppt. Eine Rotationsverdampfung wird bei Raumtemperatur oder bei bis zu 30°C durchgeführt, um das Volumen auf etwa 100 μl zu vermindern. Es wird in eine 15-ml-Ampulle mit Schraubverschluss zusammen mit der Spülflüssigkeit aus einem mehrfachen Ausspülen des Kolbens mit 100 μl Chloroform/Methanol 2/1 (Vol./Vol.) übertragen und unter N₂ fast bis zur Trockene eingedampft.
Zu den fast trockenen Proben werden 2 ml frisch angefertigter 5%iger (Gew./Vol.) Schwefelsäure in Methanol gegeben. Es sollte relativ neues Methanol, das noch keine Möglichkeit zur Absorption von viel Wasser hatte, verwendet werden. Zu den Proben wird auch 1 ml Toluol gegeben, das den gewünschten internen Standard, 0,5 mg/ml TAG (z. B. Tri-17:0 etc.) enthält. Es wird 2 h lang bei 90°C inkubiert, die Deckel werden nach den ersten 2 min und dann wieder nach etwa 15 min festgedreht. Nach dem Abkühlen der Ampullen werden 2 ml 0,5% Gew./Vol. NaCl und 0,5 ml n-Hexan zugegeben. Es wird gründlich gemischt, einige Minuten lang zum Trennen der Schichten stehen gelassen und die obere Schicht in die GC-Ampulle übertragen. Die Fettsäure-Zusammensetzung wird durch eine Analyse auf Fettsäuremethylester (FAME) gemäß der Beschreibung von Browse et al. (Anal. Biochem. (1986) 152: 141–145) bestimmt.
Die Zusammensetzung der MAG-Zone wird als Zusammensetzung am sn-2 des ursprünglichen Öls oder der ursprünglichen TAG-Probe genommen. Die mittlere Zusammensetzung an den primären (sn-1- und -3-)Positionen wird unter Anwendung der Formel (3 TAG – MAG)/2 für den Prozentwert einer jeden Acylgruppe berechnet. (Beispiel: ein Öl, das insgesamt 50 mol-% 12:0 und an sn-2 5 mol-% 12:0 enthält, hat einen Mittelwert von 145/2 = 72,5 mol-% 12:0 an den primären Positionen).

Die folgenden Daten (Tabelle 7A) wurden mit einem mit Hexan extrahierten Öl von 20 (gepoolten) reifen Samen, die aus Kreuzungen der aufgeführten 5511 transformierten Brassica-napus-Pflanzen mit Pollen von mit pCGN3828 transformierten Brassica-napus-Pflanzen stammten, erhalten. TABELLE 7A sn-2-Fettacyl-Zusammensetzung von Triacylglycerinen

LPAAT-Stamm	LPAAT-Aktivität des Stamms (cpm/g)	Mol-% 12:0 insgesamt	Mol-% 12:0 2-MAG
5511-4	28,8	35,0	9,1
5511-6	48,2	32,6	7,4
5511-8	117,2	39,0	24,8

TABELLE 7B sn-2-Fettacyl-Analyse von Kontrollproben

Probe	Mol-% 12:0 an:
Probe	sn-2 erwartet	sn-2 gemessen	sn-1,3 gemittelt (berechnet)	Insgesamt
OLaO (sn)	100	96,3	-	-
	100	96,3	-	-
(S)LaOO	0	2,5	-	-
	0	4,2	-	-
(R)LaOO	0	2,6	-	-
	0	2,1	-	-
Öl der Linie 23-198	-	5,2	71,8	49,6
	-	5,5	71,7	-

(O = 18:1, La = 12:0, bei der ”R”-Konfiguration befindet sich das einzigartige Acyl an sn-1, bei der ”S”-Konfiguration befindet sich das einzigartige Acyl an sn-3)

Die obigen Daten demonstrieren, dass 12:0 als Folge der Aktivität der LPAAT für mittlere Ketten in die sn-2-Position eingearbeitet ist. Das Verfahren ergibt normalerweise einen Wert von 2–5 mol-% für die Laurat erzeugende Linie 23-198 (ohne eingeführte LPAAT) oder für ein standardmäßiges TAG ohne 12:0 an sn-2 aufgrund der nicht perfekten Spezifität der Lipase. Der hohe Grad von 12:0 an sn-2 in den segregierten 5511-8-Samen ist mit der hohen Enzymaktivität des LPAAT-Stamms in Bezug auf die Stämme der Kreuzungen 5511-4 und 5511-6 und mit den geänderten 18:2- und 18:3-Gehalten des Öls, wie bei der Analyse auf Fettsäuren der Halbsamen der 5511-8-Samen beobachtet wird, konsistent. Der mittlere Lauratgehalt des Öls in dieser F1- Saat ist aufgrund der Segregation des BTE-Gens als Folge der Kreuzungen niedriger als derjenige des BTE exprimierenden Stamms.
Samen, die aus Kreuzungen zwischen anderen transgenen 5511-Pflanzen und Pflanzen, die Thioesteraseenzyme für mittlere Ketten exprimieren, können zu unterschiedlichen Graden an Fettsäuren mit mittleren Ketten an der sn-2-Position führen. Zum Beispiel weisen die transgenen Pflanzen 5511-1, 5511-3 und 5511-9 im Vergleich zu 5511-8 eine erhöhte LPAAT-Aktivität für mittlere Ketten auf und können somit zu transgenen Pflanzensamen mit höheren Anteilen an Fettsäuren mit mittleren Ketten an der sn-2-Position führen.
Weiterhin können zur verstärkten Erzeugung von C14-Fettsäuren in transgenen Pflanzensamen die LPAAT für mittlere Ketten exprimierenden Pflanzen mit Pflanzen gekreuzt werden, die Acyl-ACP-Thioesterase exprimieren, wodurch eine verstärkte Erzeugung von C14-Fettsäuren in Pflanzensamen erhalten wird. Solche Pflanzen und Konstrukte, die zur Erzeugung solcher Pflanzen verwendet werden können, sind in der anhängigen Anmeldung USSN 08/383,756, eingereicht am 2. Februar 1995, patentiert als US 5,654,495 und Prioritätsdokument für WO 96/23892 , beschrieben.
In den obigen Beispielen werden die Löslichmachung und Eigenschaften der LPAAT-Aktivität von Pflanzensamen-Geweben beschrieben. Es wird ein Protokoll zum Erhalt von im Wesentlichen gereinigten, Acyl-CoA mit mittleren Ketten bevorzugenden LPAAT aus Kokosnuss-Endosperm verfügbar gemacht. Verschiedene Eigenschaften des Proteins einschließlich Verfahren zum Erhalt und zur Verwendung von damit verwandten Aminosäuren und Nucleinsäuresequenzen werden beschrieben. Nucleinsäure- und Aminosäuresequenzen, die einem Kokosnuss- und Sumpfblumen-LPAAT-Protein entsprechen, werden bereitgestellt, und Konstrukte zur Expression von LPAAT in Wirtszellen werden beschrieben. Somit kann man mittels dieser Erfindung die Aminosäure- und Nucleinsäuresequenzen von LPAAT aus einer Vielzahl von Quellen und für eine Vielzahl von Anwendungen erhalten. Diese LPAAT-Sequenzen können dann wie beschrieben in transgenen Pflanzen exprimiert werden, wodurch veränderte Triacylglyceride erhalten werden. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Pflanzen-1-Acylglycerin-3-phosphat-Acyltransferase, dadurch gekennzeichnet, dass sie: (i) frei von Cytoplasmamembranen der Pflanze ist; (ii) eine bevorzugte Aktivität gegenüber einem Acyl-CoA-Donorsubstrat im Vergleich zu einem Acyl-ACP-Donorsubstrat aufweist und (iii) eine Pflanzen-1-Acylglycerin-3-phosphat-Acyltransferase ist, die die durch die 10, 11, 12, 14 oder 15 dargestellten Aminosäuresequenzen umfasst, oder eine Pflanzen-1-Acylglycerin-3-phosphat-Acyltransferase ist, die von einer Polynucleotidsequenz codiert wird, die durch Hybridisierung mit einer Polynucleotidsequenz isolierbar ist, welche die Aminosäuresequenzen von 10, 11, 12, 14 oder 15 codiert, wobei die Pflanzen-1-Acylglycerin-3-phosphat-Acyltransferase die folgenden Peptide umfasst: (a) FPEGTRS, (b) GRLLPFKKGF, (c) LTGTHLAW und (d) PITVKY, mit der Maßgabe, dass die Sequenz nicht die folgende Sequenz ist:
Acyltransferase nach Anspruch 1, weiterhin dadurch gekennzeichnet, dass sie: (i) dazu fähig ist, die Erzeugung von 1,2-Dilauroylglycerin-3-phosphat aus 1-Lauroylglycerin-3-phosphat und Lauroyl-CoA zu katalysieren und (ii) eine bevorzugte Aktivität gegenüber einem Lauroyl-CoA-Substrat im Vergleich zu einem Lauroyl-ACP-Substrat aufweist.
Acyltransferase nach Anspruch 2, wobei die Pflanze die Kokosnuss ist.
Acyltransferase nach Anspruch 1, wobei die Pflanze die Sumpfblume ist.
DNA-Konstrukt, umfassend eine erste DNA-Sequenz, die ein Pflanzen-1-Acylglycerin-3-phosphat-Acyltransferase-Enzym gemäß der Definition in Anspruch 1, das mit einer zweiten, zur ersten DNA-Sequenz heterologen DNA-Sequenz verbunden ist, codiert, wobei die erste DNA-Sequenz erhältlich ist durch: (A) eine Amplifizierungsreaktion, umfassend die Schritte des: (i) In-Kontakt-Bringens (a) eines Oligonucleotids, das sechs benachbarte Aminosäuren des als SEQ-ID Nr. 1 dargestellten Peptids codiert, mit (b) DNA von einer Quelle für Pflanzen-1-Acylglycerin-3-phosphat-Acyltransferase unter Bedingungen der Polymerase-Kettenreaktion; (ii) Isolierens einer DNA-Sequenz, die ein Pflanzen-1-Acylglycerin-3-phosphat-Acyltransferasepeptid codiert, oder (B) ein Screening einer Pflanzen-Genombank mit einer DNA-Sonde, die wenigstens 5 aufeinanderfolgende Aminosäuren eines Pflanzen-1-Acylglycerin-3-phosphat-Acyltransferasepeptids codiert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus LLPWPY, GNLYGH, RIDRSNP, KNLSLI, LPIVPM, FPEGTRS, GRLLPFKKGF, LTGTHLAWRK und PITVKY.
DNA-Konstrukt nach Anspruch 5, wobei eine DNA-Sequenz, die eine aktive Pflanzen-1-Acylglycerin-3-phosphat-Acyltransferase codiert, isoliert wird.
DNA-Konstrukt nach Anspruch 5, wobei die Pflanze die Kokosnuss ist und wobei die Quelle für 1-Acylglycerin-3-phosphat-Acyltransferase unreifes Endosperm ist.
DNA-Konstrukt nach Anspruch 5, bei dem es sich um ein chimäres Gen handelt, das DNA-Sequenzen in 5' → 3'-Richtung der Transkription, transkriptions- und translationsregelnde, in einer Wirtszelle funktionelle Initiationsbereiche, eine DNA-Sequenz, die ein in Anspruch 1 definiertes Pflanzen-1-Acylglycerin-3-phosphat-Acyltransferaseenzym codiert, und einen in der Zelle funktionellen, die Transkriptionstermination regelnden Bereich umfasst, wobei wenigstens einer der regelnden Bereiche zur DNA-Sequenz heterolog ist oder wenigstens eine der DNA-Sequenzen zur Zelle heterolog ist und wobei die die Pflanzen-1-Acylglycerin-3-phosphat-Acyltransferase codierende Sequenz erhältlich ist durch: (A) eine Amplifizierungsreaktion, umfassend die Schritte des: (i) In-Kontakt-Bringens (a) eines Oligonucleotids, das sechs benachbarte Aminosäuren des als SEQ-ID Nr. 1 dargestellten Peptids codiert, mit (b) DNA von einer Quelle für Pflanzen-1-Acylglycerin-3-phosphat-Acyltransferase unter Bedingungen der Polymerase-Kettenreaktion; (ii) Isolierens einer DNA-Sequenz, die ein Pflanzen-1-Acylglycerin-3-phosphat-Acyltransferasepeptid codiert, und (iii) Sondierens einer aus einer Quelle für Pflanzen-1-Acylglycerin-3-phosphat-Acyltransferase isolierten cDNA- oder Genom-DNA-Bank mit der in (ii) isolierten DNA-Sequenz oder (B) ein Screening einer Pflanzen-Genombank mit einer DNA-Sonde, die wenigstens 15 aufeinanderfolgende Nucleotide der in einer der 10–18 veranschaulichten Acyltransferase codierenden Sequenzen umfasst, wobei das Sondieren oder Screening unter Bedingungen durchgeführt wird, bei denen eine DNA-Sequenz, die eine aktive Pflanzen-1-Acylglycerin-3-phosphat-Acyltransferase codiert, isoliert wird.
DNA-Konstrukt nach Anspruch 5 oder 8, wobei sechs benachbarte Aminosäuren des als SEQ.-ID Nr. 1 dargestellten Peptids FPEGTR sind.
DNA-Konstrukt nach Anspruch 5 oder 8, wobei die erste DNA-Sequenz zur Amplifizierung durch eine Kombination von Primern fähig ist, wobei der 5' → 3'-Primer FPEGTRS codiert und der 3' → 5'-Primer 5'-RACEamp ist.
DNA-Konstrukt nach Anspruch 5 oder 8, das eine Sequenz umfasst, die wenigstens 8 aufeinanderfolgende Aminosäuren eines Pflanzen-1-Acylglycerin-3-phosphat-Acyltransferaseproteins codiert.
DNA-Konstrukt nach Anspruch 5 oder 8, wobei die Pflanze die Sumpfblume ist und die Quelle für Pflanzen-1-Acylglycerin-3-phosphat-Acyltransferase ein unreifer Keimling ist.
DNA-Konstrukt nach Anspruch 8, wobei die Wirtszelle eine Pflanzenzelle ist.
DNA-Konstrukt nach Anspruch 13, wobei der transkribierende Initiationsbereich von einem Gen stammt, das vorzugsweise in Samengewebe von Pflanzen exprimiert wird.
DNA-Konstrukt nach Anspruch 8, wobei die Quelle für Pflanzen-Acyltransferase aus der aus Kokosnuss-Endospermgewebe und Sumpfblumen-Keimgewebe bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
DNA-Konstrukt nach Anspruch 8, wobei das Pflanzen-1-Acylglycerin-3-phosphat-Acyltransferaseprotein vorzugsweise gegenüber Acyl-CoA-Substraten mit einer mittleren Kette im Vergleich zu solchen mit einer längeren Kette aktiv ist.
DNA-Konstrukt nach Anspruch 8, wobei die Acyltransferase-Sequenz in einer Antisense-Orientierung vorliegt.
Zelle, umfassend ein Konstrukt nach Anspruch 8.
Pflanzenzelle, umfassend ein Konstrukt nach Anspruch 13.
Pflanze, umfassend eine Pflanzenzelle nach Anspruch 19.
Pflanze nach Anspruch 20, wobei die Pflanze eine Brassica-Pflanze ist.
Verfahren zur Herstellung einer 1-Acylglycerin-3-phosphat-Acyltransferase in einer Zelle, umfassend das Transformieren einer Zelle mit einem DNA-Konstrukt nach Anspruch 8 und das Wachsenlassen der Zelle zur Erzeugung von Quantitäten der Pflanzen-1-Acylglycerin-3-phosphat-Acyltransferase.
Verfahren zur Modifizierung der Fettsäure-Acyl-Zusammensetzung von Triglyceriden in einem Pflanzensamen, umfassend das Wachsenlassen einer Pflanze bis zur Entstehung von Samen, wobei die Pflanze ein in Anspruch 5 definiertes DNA-Konstrukt enthält, das die Expression eines fremden Pflanzen-1-Acylglycerin-3-phosphat-Acyltransferaseproteins in Samen der Pflanze ermöglicht.
Verfahren nach Anspruch 23, wobei die Pflanze weiterhin ein DNA-Konstrukt umfasst, das die Expression einer mittlere Ketten bevorzugenden Acyl-ACP-Thioesterase in Samen der Pflanze ermöglicht.
Verfahren nach Anspruch 23, wobei die Acyl-ACP-Thioesterase für mittlere Ketten eine bevorzugte Aktivität gegenüber C12-Acyl-ACP-Substraten aufweist.
Verfahren nach Anspruch 24, wobei der Pflanzensamen einen erhöhten Anteil von Fettsäure-Acylgruppen mit mittlerer Kette in der sn-2-Position des Triglycerids im Vergleich zum Anteil von Fettsäuren mit mittlerer Kette in der Triglycerid-sn-2-Position von Kontrollpflanzen umfasst, wobei die Kontrollpflanzen ein DNA-Konstrukt zur Expression einer Acyl-ACP-Thioesterase mit mittlerer Kette in Samen der Pflanze umfassen und wobei den Kontrollpflanzen ein 1-Acylglycerin-3-phosphat-Acyltransferaseprotein mit einer bevorzugten Aktivität gegenüber Fettsäuren mit mittlerer Kette fehlt.
Verfahren nach Anspruch 26, wobei der Anteil von Fettsäuren mit mittlerer Kette in der sn-2-Position des Triglycerids in den Pflanzensamen wenigstens 10% beträgt.
Verfahren nach Anspruch 26, wobei der Anteil von Fettsäuren mit mittlerer Kette in der sn-2-Position des Triglycerids in den Pflanzensamen wenigstens 20% beträgt.
Verfahren nach Anspruch 26, wobei der Anteil von Fettsäuren mit mittlerer Kette in der sn-2-Position des Triglycerids in den Pflanzensamen wenigstens 25% beträgt.