EP1285077A2 - Triacylglycerin-lipasen aus arabidopsis thaliana - Google Patents

Triacylglycerin-lipasen aus arabidopsis thaliana

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Publication number
EP1285077A2
EP1285077A2 EP01957812A EP01957812A EP1285077A2 EP 1285077 A2 EP1285077 A2 EP 1285077A2 EP 01957812 A EP01957812 A EP 01957812A EP 01957812 A EP01957812 A EP 01957812A EP 1285077 A2 EP1285077 A2 EP 1285077A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
plants
nucleic acid
fatty acids
sequences
dna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP01957812A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Martina Körner
Ekkehart Berndt
Kathrin Fritsche
Ivo Feussner
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institut fuer Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung
Original Assignee
Institut fuer Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung
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Filing date
Publication date
Application filed by Institut fuer Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung filed Critical Institut fuer Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung
Priority to EP05025035A priority Critical patent/EP1637606A3/de
Publication of EP1285077A2 publication Critical patent/EP1285077A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8247—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified lipid metabolism, e.g. seed oil composition
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12N9/20—Triglyceride splitting, e.g. by means of lipase

Definitions

  • the invention relates to nucleic acid molecules which code for proteins with the enzymatic activity of an acyl hydrolase, in particular a triacylglycerol lipase (TAG lipase), methods for producing transgenic plants which contain these nucleic acid molecules and their content of acyl hydrolase, in particular TAG lipase compared to Wild type plants is changing, these new plants, their parts and products and plant cells, as well as the use of the TAG lipase
  • Nucleic acid molecules to influence the content of polyunsaturated fatty acids in transgenic plants are provided.
  • TAG lipases catalyze a large number of reactions, many of which have industrial potential.
  • TAG lipases catalyze the conversion of triacylglycerol and water to diacylglycerol and a fatty acid anion.
  • amino acid sequences of lipases from the human stomach, from the rat tongue and from the human hepatic lysosome are homologous, but apart from a sequence of six amino acids around the essential amino acid
  • Serine 152 of the pig pancreas lipase is not related to the lipase from the pig pancreas. These enzymes are glycosylated, contain a hydrophobic signal peptide and belong to the family of acid lipases (D. Ameis et al. (1994) Eur. J. Biochem. 219: 905-914). Lysosomal acid lipase (LAL) is a hydrolase essential for the intracellular breakdown of cholesteryl esters and triacylglycerols and plays a role in the mobilization of seed oil during germination.
  • LAL Lysosomal acid lipase
  • Neutral triacylglycerol lipases have been extensively studied in fungi, bacteria, mammals and insects. Nucleotide sequences similar to the neutral triacylglycerol lipases in Arabidopsis thaliana and Ipomea nil have been described, but their function has not been demonstrated. Furthermore, the Crystal structure of Mucor miehei triacylglycerol lipase has been reported, in which a trypsin-like catalytic triad Ser-His-Asp with an active serine residue was found below a short helical fragment of a long surface loop (L. Brady et al. (1990) Nature 343 : 767-770).
  • TAG lipases The main physiological function of plant TAG lipases is believed to be the mobilization of storage lipids during the germination process.
  • the storage lipids are the main carbon source of the growing seedling, especially for oilseeds.
  • certain plant lipoxygenases LOXs
  • LOXs plant lipoxygenases
  • They specifically transfer polyene fatty acid residues, i.e. H. polyunsaturated fatty acid residues, from triacylglycerols directly in hydroperoxy or ketodiene fatty acid derivatives.
  • the metabolites resulting from this reaction i. H.
  • Triacylglycerols whose acyl residues consist of 13 -hydro (pero) xylinolic acid, are then hydrolyzed by a TAG lipase, which is highly specific for oxidized polyene fatty acid residues. These modified fatty acids serve as an energy reserve for the growing seedling.
  • TAG lipases Isolation of vegetable TAG lipases can be useful for processing vegetable oils that contain fatty acids with unusual oxygenated structures. Such vegetable oils are problematic for use in the food industry because the oxygenated fatty acids they contain result in a shorter shelf life. With the help of specific TAG lipases, these fatty acid residues can be selectively removed from the corresponding oils. The released oxygenated fatty acids are important copolymers in the production of plastics.
  • Transgenic plants that accumulate large amounts of these oxygenated fatty acids within their seed oil need this specific lipase for germination.
  • the joint expression of a TAG-LOX and a TAG lipase in the seed can reduce the PUFA content in the seed oil.
  • the present invention thus comprises recombinant nucleic acid molecules which a) regulatory sequences of a promoter active in plant cells; b) operatively linked to it a DNA sequence which contains a protein with the enzymatic activity of an acyl hydrolase, in particular a triacylglycerol
  • TAG lipase particularly preferably encoding a TAG lipase specific for oxygenated polyene fatty acids; and c) operatively linked regulatory sequences, which can serve as transcription, termination and / or polyadenylation signals in plant cells.
  • PCT / US99 / 09280 inter alia the sequences of TAG lipase cDNA clones from maize, rice and soya.
  • nucleic acid molecules which are a protein with the enzymatic Encode activity of a TAG lipase.
  • the overexpression of a protein with TAG lipase activity encoded by the nucleic acid molecules mentioned above is described for the first time in plants.
  • the TAG lipases according to the invention show a high specificity for oxygenated polyene fatty acids, but also hydrolyze normal TAGs under certain reaction conditions.
  • the invention relates to plant DNA sequences which code for a protein with the biological activity of an acyl hydrolase, in particular a TAG lipase, or a biologically active fragment thereof from Arabidopsis.
  • the invention particularly preferably relates to the sequences given in the attached sequence listing under SEQ ID No: 1, SEQ ID No: 3 and SEQ ID No: 5, the derived amino acid sequences are under SEQ ID No: 2, SEQ ID No: 4 and SEQ ID No: 6 specified.
  • biologically active fragment means that the mediated biological activity is sufficient to influence the content of polyunsaturated fatty acids, in particular polyunsaturated oxygenated fatty acids.
  • the DNA sequence encoding a protein with the biological activity of an acyl hydrolase in particular a TAG lipase, particularly preferably a TAG lipase specific for oxygenated polyene fatty acids, can be isolated from natural sources or synthesized by conventional methods.
  • an acyl hydrolase in particular a TAG lipase, particularly preferably a TAG lipase specific for oxygenated polyene fatty acids
  • TAG lipase preferably a TAG lipase specific for oxygenated polyene fatty acids
  • suitable chimeric gene constructs be produced with the desired fusion of promoter and TAG lipase DNA sequence according to the invention and possibly further regulatory and / or signal sequences, but, if desired, the person skilled in the art can additionally, using routine techniques, use a variety of different methods Introduce mutations into the DNA sequence encoding the TAG lipase according to the invention, which results in the synthesis of proteins with possibly changed biological properties. On the one hand, it is possible to generate deletion mutants in which the synthesis of correspondingly shortened proteins can be achieved by progressive deletion from the 5 'or from the 3' end of the coding DNA sequence. Furthermore, it is possible to specifically produce enzymes that are localized in certain compartments of the plant cell by adding corresponding signal sequences.
  • the recombinant nucleic acid molecules according to the invention or parts thereof can be introduced into plasmids which permit mutagenesis or a sequence change by recombining DNA sequences.
  • Standard procedures see, for example, Sambrook et al. (1989), vide supra
  • adapters or linkers can be added to the fragments where necessary.
  • suitable manipulations can be carried out using enzymatic and other manipulations
  • Restriction sites are made available or redundant DNA or restriction sites are removed. Where insertions, deletions or substitutions are possible, in vitro mutagenesis, "primer repair", restriction or ligation can be used. Sequence analysis, restriction analysis and other biochemical-molecular biological methods are generally used as analysis methods.
  • the DNA sequence encoding a protein with the biological activity of an acyl hydrolase in particular a TAG lipase, particularly preferably a TAG lipase specific for oxygenated polyene fatty acids, is selected from the group consisting of
  • DNA sequences which the SEQ ID No. 1 nucleotide sequence specified b) DNA sequences which the SEQ ID No. 3 nucleotide sequence specified, c) DNA sequences that the SEQ ID No. 5 nucleotide sequence specified, d) DNA sequences which comprise a nucleotide sequence which the SEQ ID No. 2 encode specified amino acid sequence or fragments thereof, e) DNA sequences which the SEQ ID No. 4 encode the given amino acid sequence or fragments thereof, f) DNA sequences which contain the sequence shown in SEQ ID No.
  • DNA sequences which comprise a nucleotide sequence which hybridize with a complementary strand of the nucleotide sequence of a), b), c), d), e) or f) or fragments of this nucleotide sequence h) DNA sequences which a nucleotide sequence which is degenerate to a nucleotide sequence of g) or comprises fragments of this nucleotide sequence, i) DNA sequences which comprise a derivative, analog or fragment of a nucleotide sequence of a), b), c), d), e), f), g) or h).
  • hybridization means hybridization under conventional hybridization conditions, preferably under stringent conditions, as described, for example, in Sambrook et al. (1989, vide supra).
  • DNA sequences which hybridize with the DNA sequences which encode a vegetable protein with the biological activity of a TAG lipase, in particular a TAG lipase specific for oxygenated polyene fatty acids can be obtained, for example, from genomic or cDNA libraries of any plant which the TAG lipase DNA sequences according to the invention have naturally isolated.
  • Such DNA sequences can be identified and isolated, for example, using DNA sequences which are exactly or essentially those in SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3 or SEQ ID No. 5 indicated nucleotide sequence or parts thereof, or the reverse complement of these DNA sequences, for example by means of hybridization according to standard methods (see for example Sambrook et al. (1989), vide supra).
  • the fragments used as the hybridization probe can also be synthetic fragments which have been produced using conventional synthesis techniques and whose sequence essentially corresponds to one of the TAG lipase DNA sequences mentioned above or a part thereof.
  • the DNA sequences which encode a protein with the biological activity of an acyl hydrolase, in particular a TAG lipase, particularly preferably a TAG lipase specific for oxygenated polyene fatty acids also comprise DNA sequences whose nucleotide sequences match that of one of the DNA sequences described above is degenerate.
  • the degeneration of the genetic code offers the person skilled in the art the possibility, inter alia, of the nucleotide sequence of the DNA sequence to the codon preference (codon usage) of the target plant, that is to say the change in the content of polyunsaturated fatty acids, in particular oxygenated polyene fatty acids, due to the expression of the TAG lipase according to the invention adapting the plant or plant cell exhibiting and thereby optimizing the expression.
  • the DNA sequences described above also include fragments, derivatives and allelic variants of the DNA sequences described above, which encode a protein with the biological activity of an acyl hydrolase, in particular a TAG lipase, particularly preferably a TAG lipase specific for oxygenated polyene fatty acids.
  • Framents are understood to mean parts of the DNA sequence that are long enough to encode one of the proteins described.
  • derivative in this context means that the sequences differ from the DNA sequences described above in one or more positions, but have a high degree of homology to these sequences.
  • Homology means a sequence identity of at least 25 percent, in particular an identity of at least 40 percent, preferably at least 60, particularly preferably over 80 percent and most preferably over 90 percent.
  • the proteins encoded by these DNA sequences have a sequence identity to those in SEQ ID No. 2, 4 or 6 given amino acid sequences of at least 60 percent, in particular at least 80 percent, preferably 85 percent and particularly preferably over 90 percent, 95 percent and 98 percent.
  • the deviations from the DNA described above Sequences can be created, for example, by deletion, substitution, insertion or recombination.
  • DNA sequences which are homologous to the sequences described above and which are derivatives of these sequences are generally variations of these sequences which are modifications which have the same biological function. These can be both naturally occurring variations, for example sequences from other organisms or mutations, wherein these mutations can have occurred naturally or have been introduced by targeted mutagenesis. The variations can also be synthetically produced sequences.
  • allelic variants can be both naturally occurring variants and also synthetically produced variants or those produced by recombinant DNA techniques.
  • the DNA sequence described which codes for an acyl hydrolase, in particular for a TAG lipase, particularly preferably for a TAG lipase which is specific for oxygenated polyene fatty acids, comes from Arabidopsis thaliana.
  • the invention further relates to nucleic acid molecules which contain the nucleic acid sequences according to the invention or which have arisen from, or have been derived from, naturally occurring or by genetic engineering or chemical processes and synthesis processes.
  • This can be, for example, DNA or RNA molecules, cDNA, genomic DNA, mRNA, etc.
  • the invention also relates to those nucleic acid molecules in which the nucleic acid sequences according to the invention with regulatory elements are linked, which ensure transcription and, if desired, translation in the plant cell.
  • any promoter active in plant cells can be used for the expression of the DNA sequences contained in the recombinant nuclear acid molecules according to the invention in plant cells.
  • the DNA sequences according to the invention can be expressed in plant cells under the control of constitutive, but also inducible or tissue- or development-specific regulatory elements, in particular promoters.
  • tissue-specific, for example leaf or seed-specific, promoters offers the possibility of determining the content of oxygenated polyene fatty acids in certain tissue, e.g. in leaf or seed tissue.
  • Other suitable promoters e.g. Light-induced gene expression in transgenic plants.
  • the promoter can be homologous or heterologous with respect to the plants to be transformed.
  • Suitable promoters are e.g. the Cauliflower Mosaic Virus 35S RNA promoter and the maize ubiquitin promoter for constitutive expression.
  • Suitable seed-specific promoters are, for example, the USP (Bäumlein et al. (1991), Mol. Gen. Genet. 225: 459-467) or the Hordein promoter (Brandt et al. (1985), Carlsberg Res. Commun. 50: 333-345).
  • transcription or termination sequence which serves to correctly terminate the transcription and can also be used to add a polyA tail to the transcript, which is assigned a function in stabilizing the transcripts.
  • Such elements are described in the literature (e.g. Gielen (1989) EMBO J. 8: 23-29) and are interchangeable, e.g. the terminator of the octopine synthase gene from Agrobacteri m tumefaciens.
  • the invention further relates to proteins with the biological activity of an acyl hydrolase, in particular a TAG lipase, particularly preferably a TAG lipase specific for oxygenated polyene fatty acids, or biologically active fragments thereof, which are encoded by a nucleic acid sequence according to the invention or a nucleic acid molecule according to the invention.
  • a plant TAG lipase from Arabidopsis thaliana particularly preferably a protein with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 6 or an active fragment thereof.
  • Another object of the invention is to provide vectors, the use of which makes it possible to produce new plants in which an altered content of polyunsaturated oxygenated fatty acids can be achieved.
  • This object is achieved by the provision of the vectors according to the invention which, for enzymes with the activity of an acyl hydrolase, in particular a TAG lipase, particularly preferably contain a nucleic acid sequence coding for oxygenated polyene fatty acids.
  • the present invention thus also relates to vectors, in particular plasmids, cosmids, viruses, bacteriophages and other vectors which are common in genetic engineering and which comprise the nucleic acid molecules according to the invention described above contain and possibly plant for the transfer of the nucleic acid molecules according to the invention or plant cells can be used.
  • nucleic acid molecules contained in the vectors are linked to regulatory elements that the
  • nucleic acid sequences of the invention can be supplemented by enhancer sequences or other regulatory sequences.
  • regulatory sequences also contain, for example, signal sequences which ensure that the gene product is transported to a specific compartment.
  • nucleic acid molecules and their expression solved in plants By providing the nucleic acid molecules according to the invention, it is now possible to use genetic engineering methods to change plant cells to the extent that they have a new or modified TAG lipase activity compared to wild-type cells and, as a result, to a change in the content of polyene fatty acids, in particular of oxygenated polyene fatty acids in seed oil.
  • the invention relates to plants or their cells and parts in which the content of polyene fatty acids, in particular oxygenated Polyene fatty acids in seed oil due to the presence and expression of the nucleic acid molecules according to the invention compared to wild type plants is reduced.
  • the invention also relates to those plants in which the transfer of the nucleic acid molecules according to the invention leads to an increase in the content of polyene fatty acids, in particular of oxygenated polyene fatty acids in the seed oil.
  • a reduction can be achieved, for example, by the transfer of antisense constructs or by other suppression mechanisms, such as, for example, cosuppression.
  • the invention further relates to transgenic plant cells or plants comprising such plant cells and their parts and products in which the nucleic acid molecules according to the invention are present integrated into the plant genome.
  • the invention also relates to plants in whose cells the nucleic acid sequence according to the invention is present in self-replicating form, i.e. the plant cell contains the foreign DNA on an independent nucleic acid molecule (transient expression).
  • Polyene fatty acids are synthesized in seed oil, it can in principle be any plant. It is preferably a monocot or dicot
  • Examples of monocotyledonous plants are the plants belonging to the Avena genera
  • Panicum, Pennisetum, Setaria, Sorghum (millet), Zea (corn) belong.
  • legumes such as legumes and in particular alfalfa, soybean, rapeseed, tomato, sugar beet, potatoes, ornamental plants or trees are to be mentioned.
  • Other useful plants can include fruit (especially apples, Pears, cherries, grapes, citrus, pineapple and bananas), oil palms, tea, cocoa and coffee bushes, tobacco, sisal, cotton, flax, sunflower and medicinal plants and pasture grasses and fodder plants.
  • the cereals wheat, rye, oats, barley, rice, corn and millet, feed grain, sugar beet, rapeseed, soybean, tomato, potato, sweet grasses, feed grasses and clover are particularly preferred. It is self-evident that the invention relates in particular to conventional food or fodder plants. In addition to the plants already mentioned, peanut, lentil, broad bean, black beet, buckwheat, carrot, sunflower, Jerusalem artichoke, turnip, white mustard, turnip and stubble are worth mentioning.
  • Oilseeds are particularly preferred.
  • the invention further relates to propagation material and harvest products of plants according to the invention, for example seeds, fruits, cuttings, tubers, rhizomes, etc., and parts of these plants, such as protoplasts, plant cells and calli.
  • the invention relates to host cells, in particular prokaryotic and eukaryotic cells, which have been transformed or infected with a nucleic acid molecule or a vector described above, and cells which are derived from such host cells and contain the nucleic acid molecules or vectors described.
  • the host cells can be bacteria, viruses, algae, yeast and fungal cells as well as plant or animal cells.
  • the invention also relates to those host cells which, in addition to the nucleic acid molecules according to the invention, contain one or more nucleic acid molecules which are transmitted by genetic engineering or natural means and which carry the genetic information for enzymes involved in the LOX-dependent catabolism of polyunsaturated fatty acids in plants.
  • the present invention is also based on the object, methods for
  • polyene fatty acids in particular oxygenated polyene fatty acids in the seed oil.
  • acyl hydrolase in particular TAG lipase
  • Various methods are available for producing such new plant cells and plants.
  • plants or plant cells can be modified using conventional genetic engineering transformation methods in such a way that the new nucleic acid molecules are integrated into the plant genome, i.e. stable transformants are generated.
  • an inventive methods in such a way that the new nucleic acid molecules are integrated into the plant genome, i.e. stable transformants are generated.
  • an inventive transformants are generated.
  • Nucleic acid molecules the presence and possibly expression of which in the plant cell brings about an altered biosynthetic performance, can be contained in the plant cell or the plant as a self-replicating system.
  • the nucleic acid molecules according to the invention can be contained in a virus with which the plant or plant cell comes into contact.
  • plant cells and plants which, owing to the expression of a nucleic acid sequence according to the invention, have a changed content of polyene fatty acids, in particular of oxygenated polyene fatty acids in seed oil, are produced by a process which comprises the following steps:
  • a) Production of a recombinant nucleic acid molecule comprising the following components in a 5 '->3' orientation: regulatory sequences of a promoter active in plant cells, operatively linked to it a nucleic acid sequence which codes for a protein with the biological activity of an acyl hydrolase, in particular a TAG lipase, particularly preferably a TAG lipase specific for oxygenated polyene fatty acids, and - optionally operatively linked sequences which act as transcription,
  • Termination and / or polyadenylation signals can serve in plant cells, b) transfer of the nucleic acid molecule from a) to plant cells.
  • one or more nucleic acid sequences according to the invention can be introduced into the plant cell or the plant as a self-replicating system.
  • step a) of the above method can be modified such that the nucleic acid sequence according to the invention which codes for a protein with the biological activity of an acyl hydrolase, in particular a TAG lipase, particularly preferably a TAG lipase specific for oxygenated polyene fatty acids, in antisense Orientation is coupled to the 3 'end of the promoter.
  • an acyl hydrolase in particular a TAG lipase, particularly preferably a TAG lipase specific for oxygenated polyene fatty acids, in antisense Orientation
  • one or more additional nucleic acid molecules can be introduced which code for proteins which catalyze the transfer of fatty acids to glycerides (transacylases).
  • TAG lipase glycerides
  • lipids whose oxygenated polyene fatty acids have been split off by the TAG lipase according to the invention can be substituted with non-oxygenated polyunsaturated fatty acids which are suitable, for example, for the use of the resulting vegetable oil in the food industry.
  • a large number of cloning vectors are available, which contain a replication signal for E. coli and a marker gene for the selection of transformed bacterial cells.
  • Examples of such vectors are pBR322, pUC series, Ml 3mp series, pACYC 184 etc.
  • the desired sequence can be introduced into the vector at a suitable restriction site.
  • the plasmid obtained is then used for the transformation of E. coli cells.
  • Transformed E. coli cells are grown in an appropriate medium and then harvested and lysed, and the plasmid is recovered. Restriction analyzes, gel electrophoresis and other biochemical-molecular biological methods are generally used as the analytical method for characterizing the plasmid DNA obtained. After each manipulation, the plasmid DNA can be cleaved and DNA fragments obtained can be linked to other DNA sequences.
  • Nucleic acid molecules and vectors in plant cells is the availability of suitable transformation systems.
  • a wide range of transformation methods have been developed and established here over the past two decades. These techniques include the transformation of plant cells with T-DNA using Agrobacterium tumefaciens or Agrobacterium rhizogenes as a transformation agent, diffusion of protoplasts, the direct gene transfer of isolated DNA to protoplasts, the injection and electroporation of DNA into plant cells, the introduction of DNA by means of the biolistic Methods and other possibilities, whereby the person skilled in the art can easily determine the most suitable method. All transformation processes have been well established for many years and are undoubtedly part of the standard repertoire of the specialist in plant molecular biology, plant biotechnology and cell and tissue culture.
  • plasmids When injecting and electroporation of DNA into plant cells, there are no special requirements per se for the plasmids used. The same applies to direct gene transfer. Simple plasmids, such as pUC derivatives, can be used. However, if whole plants are to be regenerated from such transformed cells, the presence of a selectable marker gene is recommended.
  • the usual selection markers are known to the person skilled in the art and it is not a problem for him to select a suitable marker.
  • the plant cell uses the Ti or Ri plasmid, at least the right boundary, but often the right and left boundary of the T-DNA contained in the Ti or Ri plasmid, must be connected as a flank region to the genes to be introduced.
  • Agrobacteria are used for the transformation, the DNA to be introduced must be cloned into special plasmids, either in an intermediate or in a binary vector.
  • the intermediate vectors can be integrated into the Ti or Ri plasmid of the agrobacteria by means of sequences which are homologous to sequences in the T-DNA by homologous recombination. This also contains the vir region necessary for the transfer of the T-DNA. Intermediate vectors cannot replicate in agrobacteria.
  • the intermediate vector can be transferred to Agrobacterium tumefaciens (conjugation).
  • Binary vectors can replicate in E. coli as well as in Agrobacteria. They contain a selection marker gene and a linker or polylinker, which are framed by the right and left T-DNA border region. They can be transformed directly into the agrobacteria.
  • the agrobacterium serving as the host cell is said to contain a plasmid which carries a vir region. The vir region is necessary for the transfer of the T-DNA into the plant cell. Additional T-DNA may be present.
  • the agrobacterium transformed in this way is used to transform plant cells.
  • the use of T-DNA for the transformation of Plant cells have been intensively examined and have been adequately described in well-known overview articles and manuals on plant transformation.
  • plant explants can expediently be cultivated with Agrobacterium tumefaciens or Agrobacterium rhizogenes. Whole plants can then be regenerated from the infected plant material (e.g. leaf pieces, stem segments, roots, but also protoplasts or suspension-cultivated plant cells) in a suitable medium, which may contain antibiotics or biocides for the selection of transformed cells.
  • Agrobacterium tumefaciens e.g. leaf pieces, stem segments, roots, but also protoplasts or suspension-cultivated plant cells
  • suitable medium which may contain antibiotics or biocides for the selection of transformed cells.
  • the introduced DNA is integrated in the genome of the plant cell, it is generally stable there and is also retained in the progeny of the originally transformed cell. It normally contains a selection marker which gives the transformed plant cells resistance to a biocide or an antibiotic such as kanamycin, G 418, bleomycin, hygromycin, methotrexate, glyphosate, streptomycin, sulfonylurea, gentamycin or phosphinotricin and others.
  • the individually selected marker should therefore allow the selection of transformed cells from cells that lack the inserted DNA.
  • Alternative markers are also suitable for this, such as nutritive markers and screening markers (such as GFP, green fluorescent protein).
  • selection markers can also be dispensed with entirely, but this is accompanied by a fairly high need for screening. If the selection marker used is to be removed again after the transformation and identification of successfully transformed cells or plants has been carried out, various strategies are available to the person skilled in the art.
  • sequence-specific recombinases can be used, for example in the form of retransformation of a starting line expressing recombinase and outcrossing of the recombinase after removal of the selection marker (see, for example, Reiss et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93: 3094-3098; Bayley et al. (1992) Plant Mol. Biol.
  • the selection marker can also be removed by cotransformation followed by outcrossing.
  • the regeneration of the transgenic plants from transgenic plant cells is carried out according to customary regeneration methods using conventional nutrient media and phytohormones.
  • the plants thus obtained can then, if desired, be carried out by conventional methods, including molecular biological methods, such as PCR, blot analysis, or biochemical methods for the presence of the introduced DNA which encodes a protein with the enzymatic activity of a TAG lipase specific for oxygenated polyene fatty acids , or be examined for the presence of TAG lipase enzyme activity.
  • the detection of the enzymatic activity of the TAG lipase according to the invention can also be determined by a person skilled in the art using protocols available in the literature. Furthermore, one can, for example, lay out the seed obtained by selfing or crossings on medium which contains the selection marker transferred to the TAG lipase DNA sequence contains suitable selection agents, and based on the germination capacity and growth of the daughter generation (s) and the segregation pattern, conclusions can be drawn about the genotype of the respective plant.
  • Another object of the invention is to show uses of the nucleic acid sequences according to the invention and of the nucleic acid molecules containing them.
  • This object is achieved by the novel uses of the new DNA sequences and molecules for producing plant cells and plants which are distinguished by a change in the content of polyene fatty acids, particularly preferably of oxygenated polyene fatty acids in seed oil, in comparison with wild type cells or wild type plants.
  • the present invention further encompasses any possible form of use of the nucleic acid molecules according to the invention, the presence and expression of which, if appropriate, in plants causes a change in the content of polyene fatty acids, in particular of oxygenated polyene fatty acids in seed oil, and the use of the proteins or fragments thereof, the enzymatic activity of which brings about such a change.
  • the invention further relates to the use of a DNA sequence according to the invention or parts thereof for the identification and isolation of homologous sequences from plants or other organisms.
  • the nucleic acid molecules according to the invention can thus be used according to the invention to generate transgenic plants in which the content of the acyl hydrolases, in particular TAG lipases, is higher or lower than natural, or in cell types or development stages in which the acyl hydrolases, in particular TAG, are present -Lipasen normally not found. This causes a change in the levels of triacylglycerol and cholesteryl esters in these cells.
  • Triacylglycerol lipases can also be useful in the processing of vegetable oils and the development of new seed oils, since the shelf life of vegetable seed oils for the food industry can be prolonged by a selective cleavage of oxidized polar fatty acid residues by the TAG lipases according to the invention.
  • the nucleic acid molecules according to the invention are modified in such a way that the nucleic acid molecules according to the invention are supplemented with suitable intracellular target sequences such as transit sequences (K. Keegstra (1989) Cell 56: 247-253), signal sequences and the like ,
  • nucleic acid molecules that code for TAG lipases especially for TAG lipases that are specific for oxygenated polyene fatty acids.
  • a nucleic acid molecule developed for the cosupression of the TAG lipase according to the invention can be linked by linking a gene or a gene fragment which is one for oxygenated
  • RNA-specific TAG lipase encoded with plant promoter sequences Polyen fatty acid-specific TAG lipase encoded with plant promoter sequences.
  • a nucleic acid molecule which has been developed for the expression of antisense RNA for all or part of the nucleic acid molecule according to the invention can be generated by linking the gene or gene fragment in a reverse orientation to plant promoter sequences. Both the Genes for cosuppression as well as the antisense genes can be introduced into the plants by means of transformation, as a result of which the expression of the corresponding endogenous genes is reduced or eliminated.
  • the invention is based on the successful isolation of cDNA clones coding for an acyl hydrolase, in particular for a TAG lipase, particularly preferably for a TAG lipase coding for oxygenated polyene fatty acids from a cDNA library from Arabidopsis thaliana.
  • the sequences of these cDNA clones which comprise a complete reading frame, are shown in SEQ ID NO: 1, SEQ ID No: 3 and SEQ ID No: 5.
  • transgenic plants which, owing to the transmission and expression of a TAG lipase, in particular a TAG lipase specific for oxygenated polyene fatty acids, have an oxygenated polyene fatty acid content in the seed oil which is different from that of wild type plants.
  • cDNA sequences coding for an Arabidopsis thaliana TAG lipase were identified by screening of Arabidopsis thaliana cDNA libraries prepared as described below in accordance with a standardized protocol also described below. Three of the annotated sequences (Lipase 1: SEQ ID No: 1, Lipase 2: SEQ ID No: 3, Lipase 3: SEQ ID No: 5) were cloned, expressed and tested for activity. I. Preparation of various cDNA banks from Arabidopsis thaliana
  • cDNA libraries were prepared from a mixture of various Arabidopsis organs and a cDNA library from Arabidopsis flowers.
  • RNA from Arabidopsis The following reagents were used to isolate RNA from Arabidopsis:
  • RNA from Arabidopsis is carried out according to the following protocol: - Mortaring 20 g of plant material in liquid nitrogen
  • RNA in the photometer at a dilution of 1: 100.
  • the ratio of A 60 to A 280 should be greater than or equal to 1.8.
  • the measured value is multiplied by the dilution factor and a factor of 40, which results in the concentration of the RNA in ⁇ g / ml.
  • a wavelength scan of 200-300 nm results in a typical RNA curve with a maximum at 260 nm.
  • the absolute amount of RNA is then calculated and an RNA agarose gel is used to determine the quality of the RNA.
  • the mRNA isolation is carried out with the mRNA isolation kit Poly-Attract from Promega (Mannheim, Germany).
  • the reverse transcriptase-PCR was carried out with 1 ⁇ g RNA, 200 pmol oligo-dT with Superscript II from Gibco (Eggenstein, Germany) according to the manufacturer's instructions.
  • the PCR amplification was carried out using the Expand TM high fidelity PCR system in accordance with the manufacturer's instructions (Boehringer Mannheim, Germany).
  • the Arabidopsis cDNA mixture was used as the template for the lipases 1 and 2 and the cDNA from the flower of Arabidopsis for the lipase 3.
  • the following sequences were used as primers:
  • Lipase 1 (3 x methionine in the beginning of the sequence) 5 ': - CCC GCATGC ATG CAG TTG TCT CCG GAA CGA TGC (AI) 5 *: - GGG GCATGC ATG TCT GAA AAC AGA GAG GCT TGG (A2) 5 ': - AAA GCATGC ATG GAG CTG CTT CAC GGC TCC AAC (A3) 3 *: - AAA GTCGAC TCAAAAAGG GCT GAC CCT GCC AGC C
  • Lipase 2 5 ': - CCC CGC ATG CAT GGC TTC TTCACT GAA GAA
  • the open reading frame for the complete unprocessed protein was determined by means of the above oligo-nucleotide primers from the DNA sequences according to the sequences SEQ ID No: 1, 3 and 5 amplified by PCR.
  • the PCR conditions were as follows: 2 minutes denaturation at 94 ° C, then for 10 cycles: 30 seconds denaturation at 94 ° C, 30 seconds annealing at 65 ° C, 3 minutes elongation at 72 ° C; then for 15 cycles: 30 seconds denaturation at 94 ° C, 30 seconds annealing at 65 ° C, 3 minutes elongation at 72 ° C plus a time increment of 5 seconds per cycle; finally another 2 minutes elongation at 72 ° C.
  • the amplified PCR fragment was ligated into the expression vector QIAexpress pQE 30 and pre-cloned with transformation in XLl-Blue cells using the p GEM R- Easy Vector System II kit (Promega, Madison, USA). The cloning was then carried out into the expression strain E. coli SG13009 [pREP4].
  • the cleaning was carried out according to the following steps: - Preparation of a membrane fraction of the E.coli SG13009 [pREP4]
  • the protein eluate obtained as described above was extracted with a lipid extract (chloroform: methanol, Bligh / Dyer 1959) from four-day-old seedlings of Cucumis sativa for 40 minutes at 25 ° C. with the addition of buffer concentrate (1 M Tris pH 8.5; 0.5 M NaCl; 50 mM CaCl 2 ) to adjust the pH to 8.0. It was then acidified with acetic acid and extracted with hexane. The analysis was carried out by means of HPLC (LiCHrosphere 100 RP-18 (MERCK, Darmstadt, Germany); mobile phase: acetonitrile: H 2 O: acetic acid 70: 30: 0.1).
  • Example 3 Transformation of Arabidopsis thaliana and Nicotiana t ⁇ bacum plants and regeneration of intact plants
  • the DNA sequences according to SIQ ID No: 1, 3 and 5 were each converted into a suitable one binary vector (e.g. pPCVOOl, pPCV002 (Koncz & Schell 1986 MGG 204: 383-396) cloned.
  • a suitable one binary vector e.g. pPCVOOl, pPCV002 (Koncz & Schell 1986 MGG 204: 383-396) cloned.
  • any vector suitable for plant transformation can be used for the production of a chimeric gene, consisting of a fusion of the CaMV 35S promoter or another constitutive, seed-specific, germination-specific or flower-specific promoter which promotes transcription and, if desired, translation guaranteed in plant cells, and DNA sequences coding for TAG lipase are used.
  • the binary vector was then transformed into Agrobacterium tumefaciens (strain GV2260; Horsch et al. (1985), Science 227, 1229-1231) and for the transformation of Arabidopsis or tobacco plants (SNN) by means of the leaf disc transformation technique (Horsch et al. , supra) used.

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Abstract

Die Erfindung betrifft Nukleinsäuremoleküle, die für Proteine mit der enzymatischen Aktivität einer Acylhydrolase, insbesondere einer Triacylglycerol-Lipase (TAG-Lipase) kodieren, Verfahren zur Erzeugung transgener Pflanzen, die diese Nukleinsäuremoleküle enthalten und deren Gehalt an Acylhydrolase, insbesondere an TAG-Lipase im Vergleich zu Wildtyppflanzen verändert ist, diese neuen Pflanzen, deren Teile und Produkte und Pflanzenzellen, sowie die Verwendung der Nukleinsäuremoleküle zur Beeinflussung des Gehalts an mehrfachungesättigten Fettsäuren in transgenen Pflanzen.

Description

Triacylglycerol-Lipasen
Die Erfindung betrifft Nukleinsauremolekule, die für Proteine mit der enzymatischen Aktivität einer Acylhydrolase, insbesondere einer Triacylglycerol-Lipase (TAG- Lipase) kodieren, Verfahren zur Erzeugung transgener Pflanzen, die diese Nukleinsauremolekule enthalten und deren Gehalt an Acylhydrolase, insbesondere TAG-Lipase im Vergleich zu Wildtyppflanzen verändert ist, diese neuen Pflanzen, deren Teile und Produkte und Pflanzenzellen, sowie die Verwendung der
Nukleinsauremolekule zur Beeinflussung des Gehalts an mehrfach ungesättigten Fettsäuren in transgenen Pflanzen.
Lipasen katalysieren eine große Anzahl an Reaktionen, von denen viele ein industrielles Potential aufweisen. TAG-Lipasen katalysieren die Umwandlung von Triacylglycerol und Wasser in Diacylglycerol und ein Fettsäureanion.
Die Aminosäuresequenzen von Lipasen aus dem menschlichen Magen, aus der Rattenzunge und aus dem menschlichen hepatischen Lysosom sind homolog, aber bis auf eine Sequenz von sechs Aminosäuren um die wesentliche Aminosäure
Serin 152 der Lipase aus dem Schweinepankreas (M. W. Bodner (1987) Biochem. Biophys. Acta 909: 237-244) nicht mit der Lipase aus dem Schweinepankreas verwandt. Diese Enzyme sind glycosyliert, enthalten ein hydrophobes Signalpeptid und gehören der Familie der sauren Lipasen an (D. Ameis et al. (1994) Eur. J. Biochem. 219: 905-914). Die lysosomale saure Lipase (lysosomal acid lipase, LAL) ist eine für den intrazellulären Abbau von Cholesterylestern und Triacylglycerolen wesentliche Hydrolase und spielt eine Rolle bei der Mobilisierung des Saatöls während der Keimung.
Neutrale Triacylglycerol-Lipasen wurden in Pilzen, Bakterien, Säugetieren und Insekten in großem Ausmaß untersucht. Es wurden Nukleotidsequenzen mit Ähnlichkeiten zu den neutralen Triacylglycerol-Lipasen in Arabidopsis thaliana und Ipomea nil beschrieben, aber ihre Funktion wurde nicht bewiesen. Ferner wurde die Kristallslruktur von Mucor miehei Triacylglycerol-Lipase berichtet, bei der eine Trypsin-artige katalytische Triade Ser-His-Asp mit einem aktiven Serinrest unterhalb eines kurzen helikalen Fragments eines langen Oberflächen-Loops gefunden wurde (L. Brady et al. (1990) Nature 343 : 767-770).
Es wird angenommen, daß die hauptsächliche physiologische Funktion der pflanzlichen TAG-Lipasen die Mobilisierung von Speicherlipiden während des Keimungsprozesses ist. Besonders für Ölsaaten stellen die Speicherlipide die Hauptkohlenstoffquelle des wachsenden Keimlings dar. Im Verlauf der Keimung lassen sich bestimmte pflanzliche Lipoxygenasen (LOXs) an der Membran der Lipidkörper verschiedener Ölsaaten nachweisen. Sie überführen spezifisch Polyenfettsäurereste, d. h. mehrfach ungesättigte Fettsäurereste, von Triacylglycerinen direkt in Hydroperoxy- oder Ketodienfettsäurederivate. Die aus dieser Reaktion resultierenden Metabolite, d. h. Triacylglycerine, deren Acylreste aus 13 -Hydro(pero)xylinolsäure bestehen, werden anschließend von einer TAG-Lipase hydrolysiert, die hochspezifisch für oxidierte Polyenfettsäurereste ist. Diese derart modifizierten Fettsäuren dienen dem wachsenden Keimling als Energiereserve.
Wie bereits vorstehend erwähnt, wird das Auftreten von LOXs von der Akkumulation von Hydro(pero)xy-Derivaten begleitet, welche im Gegensatz zu den nicht-oxygenierten mehrfach ungesättigten Fettsäureresten (PUFA-Reste) von den Speicherlipiden abgespalten werden. Aus diesen Beobachtungen wird geschlossen, daß diese durch die LOXs katalysierte Oxidationsreaktion den Katabolismus von mehrfach ungesättigten Fettsäuren (Reduktase-Weg) in Pflanzen initiiert (siehe Abb. 1). Ferner wurde die spezifische TAG-Lipase aus keimenden
Gurkenkeimlingen gereinigt, und ihre biochemischen Eigenschaften wurden bestimmt. Diese Lipidkörper-assoziierte TAG-Lipase zeigte tatsächlich eine hohe Spezifität für oxidierte mehrfach ungesättigte Fettsäuren mit den in Abbildung 2 gezeigten Stritoirrnotiven. Weiter wurde diese spezielle TAG-Lipase in der Lipidkö erfraktion von sich entwickelnden Keimlingen gefunden, was eine zumindest zweifache physiologische Funktion dieser Enzyme in Pflanzen nahelegt.
Die Isolierung von pflanzlichen TAG-Lipasen kann für die Verarbeitung von Pflanzenölen nützlich sein, die Fettsäuren mit unüblichen oxygenierten Strukturen enthalten. Derartige pflanzliche Öle sind für die Verwendung in der Lebensmittelindustrie problematisch, da die in ihnen enthaltenen oxygenierten Fettsäuren zu einer geringeren Haltbarkeit führen. Mit Hilfe von spezifischen TAG- Lipasen können diese Fettsäurereste aus den entsprechenden Ölen selektiv entfernt werden. Die freigesetzten oxygenierten Fettsäuren stellen wiederum wichtige Copolymere bei der Herstellung von Kunststoffen dar.
Damit können die definiert strukturierten Lipide mit oxygenierten Fettsäureresten an bestimmten Positionen des Glycerol-Rückgrats nach der Erzeugung der mehrfach ungesättigten Fettsäuren, die in Tnacylglycerolen verestert sind, durch Entfernen der kontaminierenden Lipidperoxide gereinigt werden. Umgekehrt können bestimmte oxygenierte Fettsäuren in bestimmte Positionen von TAGs eingeführt werden.
Transgene Pflanzen, die große Mengen an diesen oxygenierten Fettsäuren innerhalb ihres Samenöls akkumulieren, benötigen diese spezifische Lipase für die Keimung. Darüber hinaus kann durch die gemeinsame Expression einer TAG-LOX und einer TAG-Lipase im Samen der Gehalt an PUFAs im Samenöl verringert werden.
Demzufolge ist es eine wesentliche Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren bereitzustellen, mit dem der Gehalt an mehrfach ungesättigten Fettsäuren, insbesondere an oxygenierten, mehrfach ungesättigten Fettsäuren in Pflanzen vermindert oder erhöht werden kann. Ferner ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Nukleinsauremolekule bereitzustellen, die auf Pflanzenzellen oder Pflanzensamen übertragen werden können, um den Gehalt an Polyenfettsäuren, insbesondere an oxidierten Polyenfettsäureresten zu beeinflussen. Weitere Aufgaben der Erfindung ergeben sich aus der folgenden Beschreibung.
Diese Aufgaben werden durch die Gegenstände der unabhängigen Ansprüche, insbesondere basierend auf der Bereitstellung der erfindungsgemäßen DNA- Sequenzen, deren Genprodukte unmittelbar an der Hydrolyse von Triacylglycerinen mit oxygenierten, ungesättigten Fettsäureresten beteiligt sind, und der in einem modifizierten Gehalt an derartigen Fettsäuren resultierenden Übertragung der DNA- Sequenzen aufpflanzen, gelöst.
Vorteilhafte Ausgestaltungen sind in den Unteransprüchen definiert.
Die vorliegende Erfindung umfaßt somit rekombinante Nukleinsauremolekule, die a) regulatorische Sequenzen eines in Pflanzenzellen aktiven Promotors; b) operativ daran gebunden eine DNA-Sequenz, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Acylhydrolase, insbesondere einer Triacylglycerol-
Lipase (TAG-Lipase), besonders bevorzugt einer für oxygenierte Polyenfettsäuren spezifischen TAG-Lipase kodiert; und c) operativ daran gebunden regulatorische Sequenzen, die als Transkriptions-, Terminations- und/oder Polyadenylierungssignale in Pflanzenzellen dienen können, umfassen.
Sequenzen, die eine TAG-Lipase kodieren, sind im Stand der Technik beschrieben worden, ohne daß allerdings deren Funktion nachgewiesen wurde. So offenbart
PCT/US99/09280 unter anderem die Sequenzen von TAG-Lipase-cDNA-Klons aus Mais, Reis und Soya.
Es ist bei der vorliegenden Erfindung überraschenderweise erstmals gelungen, Nukleinsauremolekule bereitzustellen, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer TAG-Lipase kodieren. Femer wird erfindungsgemäß erstmals die Überexpression eines durch die vorstehend genannten Nukleinsauremolekule kodierten Proteins mit TAG-Lipase- Aktivität in Pflanzen beschrieben. Die erfindungsgemäßen TAG-Lipasen zeigen eine hohe Spezifität für oxygenierte Polyenfettsäuren, hydrolysieren aber unter bestimmten Reaktionsbedingungen auch normale TAGs.
Insbesondere betrifft die Erfindung pflanzliche DNA-Sequenzen, die für ein Protein mit der biologischen Aktivität einer Acylhydrolase, insbesondere einer TAG-Lipase oder ein biologisch aktives Fragment davon aus Arabidopsis kodieren. Besonders bevorzugt betrifft die Erfindung die im beigefügten Sequenzprotokoll unter SEQ ID No:l, SEQ ID No:3 und SEQ ID No:5 angegebenen Sequenzen, die abgeleiteten Aminosäuresequenzen sind unter SEQ ID No:2 , SEQ ID No:4 bzw. SEQ ID No: 6 angegeben.
Biologisch aktives Fragment bedeutet im Rahmen dieser Erfindung, daß die vermittelte biologische Aktivität zu einer Beeinflussung des Gehalts an mehrfach ungesättigten Fettsäuren, insbesondere an mehrfach ungesättigten oxygenierten Fettsäuren ausreicht.
Die DNA-Sequenz, die ein Protein mit der biologischen Aktivität einer Acylhydrolase, insbesondere einer TAG-Lipase, besonders bevorzugt einer für oxygenierte Polyenfettsäuren spezifischen TAG-Lipase kodiert, kann aus natürlichen Quellen isoliert oder nach herkömmlichen Verfahren synthetisiert werden. Mittels gängiger molekularbiologischer Techniken (siehe beispielsweise Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York) ist es möglich, gewünschte Konstrukte für die Transformation von Pflanzenzellen vorzubereiten bzw. herzustellen. Die für die gentechnische Manipulation in prokaryontischen Zellen üblicherweise eingesetzten Klonierungs-, Mutagenisierungs-, Sequenzanalyse-, Restriktionsanalyse- und weitere biochemisch-molekularbiologischen Methoden sind dem Durchschnittsfachmann wohl bekannt. So können nicht nur geeignete chimäre Genkonstrukte mit der gewünschten Fusion von Promotor und erfindungsgemäßer TAG-Lipase-DNA-Sequenz und ggf. weiteren Regulations- und/oder Signalse- quenzen hergestellt werden, vielmehr kann der Fachmann, falls erwünscht, zusätzlich mittels Routinetechniken, verschiedenartige Mutationen in die die erfindungsgemäße TAG-Lipase kodierende DNA-Sequenz einführen, wodurch es zur Synthese von Proteinen mit eventuell veränderten biologischen Eigenschaften kommt. Hierbei ist zum einen die Erzeugung von Deletionsmutanten möglich, bei denen durch fortschreitende Deletion vom 5'- oder vom 3'-Ende der kodierenden DNA-Sequenz die Synthese entsprechend verkürzter Proteine erreicht werden kann. Ferner ist es möglich, gezielt Enzyme herzustellen, die durch Addition entsprechender Signalsequenzen in bestimmten Kompartimenten der Pflanzenzelle lokalisiert sind. Derartige Sequenzen sind in der Literatur beschrieben und dem Durch- schnittsfachmann wohl bekannt (siehe z.B. Braun et al (1992) EMBO J. 11:3219- 3227; Wolter F. et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:846-850; Sonnewald U. et al (1991) Plant J. 1:95-106). Weiterhin ist auch die Einführung von Punktmutationen an Positionen denkbar, bei denen eine Veränderung der Aminosäuresequenz einen Einfluss beispielsweise auf die Enzymaktivität oder die Regulierung des Enzyms hat. Auf diese Weise können z.B. Mutanten hergestellt werden, die nicht mehr den normalerweise in der Zelle herrschenden Regulationsmechanismen über allosterische Regulation oder kovalente Modifizierung unterliegen. Des weiteren können Mutanten hergestellt werden, die eine veränderte Substrat- oder Produktspezifität aufweisen. Weiterhin können Mutanten hergestellt werden, die ein verändertes Aktivitäts-, Temperatur- und/oder pH-Profil aufweisen.
Für die gentechnische Manipulation in prokaryontischen Zellen können die erfindungsgemäßen rekombinanten Nukleinsauremolekule oder Teile davon in Plasmide eingebracht werden, die eine Mutagenese oder eine Sequenzveränderung durch Rekombination von DNA-Sequenzen erlauben. Mit Hilfe von Standardverfahren (siehe z.B. Sambrook et al. (1989), vide supra) können Basenaustausche vorgenommen oder natürliche oder synthetische Sequenzen hinzugefügt werden. Für die Verbindung der DNA-Fragmente untereinander können an die Fragmente, wo erforderlich, Adapter oder Linker angefügt werden. Ferner können mittels enzymatischer und anderer Manipulationen passende
Restriktionsschnittstellen zur Verfügung gestellt oder überflüssige DNA oder Restriktionsschnittstellen entfernt werden. Wo Insertionen, Deletionen oder Substitutionen in Frage kommen, können in vitro-Mutagenese, „primer repair", Restriktion oder Ligation verwendet werden. Als Analysemethoden werden im allgemeinen Sequenzanalyse, Restriktionsanalyse und weitere biochemisch- molekularbiologische Methoden durchgeführt.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die DNA-Sequenz, die ein Protein mit der biologischen Aktivität einer Acylhydrolase, insbesondere einer TAG-Lipase, besonders bevorzugt einer für oxygenierte Polyenfettsäuren spezifischen TAG- Lipase, kodiert, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus
a) DNA-Sequenzen, die die in SEQ ID No. 1 angegebene Nukleotidsequenz umfassen, b) DNA-Sequenzen, die die in SEQ ID No. 3 angegebene Nukleotidsequenz umfassen, c) DNA-Sequenzen, die die in SEQ ID No. 5 angegebene Nukleotidsequenz umfassen, d) DNA-Sequenzen, die eine Nukleotidsequenz umfassen, die die in SEQ ID No. 2 angegebene Aminosäuresequenz oder Fragmente davon kodieren, e) DNA-Sequenzen, die die in SEQ ID No. 4 angegebene Aminosäuresequenz oder Fragmente davon kodieren, f) DNA-Sequenzen, die die in SEQ ID No. 6 angegebene Aminosäuresequenz oder Fragmente davon kodieren, g) DNA-Sequenzen, die eine Nukleotidsequenz, die mit einem komplementären Strang der Nukleotidsequenz von a), b), c), d), e) oder f) hybridisieren, oder Fragmente dieser Nukleotidsequenz umfassen, h) DNA-Sequenzen, die eine Nukleotidsequenz, die zu einer Nukleotidsequenz von g) degeneriert ist, oder Fragmente dieser Nukleotidsequenz umfassen, i) DNA-Sequenzen, die ein Derivat, Analog oder Fragment einer Nukleotidsequenz von a), b), c), d), e), f), g) oder h) darstellen.
Der Begriff "Hybridisierung" bedeutet im Rahmen dieser Erfindung eine Hybridisierung unter konventionellen Hybridisierungsbedingungen, vorzugsweise unter stringenten Bedingungen, wie sie beispielsweise in Sambrook et al. (1989, vide supra) beschrieben sind.
DNA-Sequenzen, die mit den DNA-Sequenzen hybridisieren, welche ein pflanzliches Protein mit der biologischen Aktivität einer TAG-Lipase, insbesondere einer für oxygenierte Polyenfettsäuren spezifischen TAG-Lipase, kodieren, können z.B. aus genomischen oder cDNA-Bibliotheken einer beliebigen Pflanze, die die erfindungsgemäßen TAG-Lipase-DNA-Sequenzen natürlicherweise besitzt, isoliert werden. Die Identifizierung und Isolierung derartiger DNA-Sequenzen kann dabei z.B. unter Verwendung von DNA-Sequenzen erfolgen, die exakt oder im wesentlichen die in SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3 oder SEQ ID No. 5 angegebene Nukleotidsequenz oder Teile davon aufweisen, bzw. der reversen Komplemente dieser DNA-Sequenzen, z.B. mittels Hybridisierung nach Standardverfahren (siehe z.B. Sambrook et al. (1989), vide supra). Bei den als Hybridisierungssonde ver- wendeten Fragmenten kann es sich auch um synthetische Fragmente handeln, die mit Hilfe üblicher Synthesetechniken hergestellt wurden und deren Sequenz im wesentlichen mit einer der oben erwähnten TAG-Lipase-DNA-Sequenzen oder einem Teil davon übereinstimmt. Die DNA-Sequenzen, die ein Protein mit der biologischen Aktivität einer Acylhydrolase, insbesondere einer TAG-Lipase, besonders bevorzugt einer für oxygenierte Polyenfettsäuren spezifischen TAG-Lipase kodieren, umfassen auch DNA-Sequenzen, deren Nukleotidsequenzen zu der einer der vorstehend beschriebenen DNA-Sequenzen degeneriert ist. Die Degeneration des genetischen Codes bietet dem Fachmann u.a. die Möglichkeit, die Nukleotidsequenz der DNA- Sequenz an die Codonpräferenz (codon usage) der Zielpflanze, also der aufgrund der Expression der erfindungsgemäßen TAG-Lipase einen veränderten Gehalt an mehrfach ungesättigten Fettsäuren, insbesondere an oxygenierten Polyenfettsäuren aufweisenden Pflanze bzw. Pflanzenzelle anzupassen und die Expression dadurch zu optimieren.
Die oben beschriebenen DNA-Sequenzen umfassen auch Fragmente, Derivate und allelische Varianten der oben beschriebenen DNA-Sequenzen, die ein Protein mit der biologischen Aktivität einer Acylhydrolase, insbesondere einer TAG-Lipase, besonders bevorzugt einer für oxygenierte Polyenfettsäuren spezifischen TAG- Lipase, kodieren. Unter "Fragmenten" werden dabei Teile der DNA-Sequenz verstanden, die lang genug sind, um eines der beschriebenen Proteine zu kodieren. Der Ausdruck "Derivat" bedeutet in diesem Zusammenhang, dass die Sequenzen sich von den oben beschriebenen DNA-Sequenzen an einer oder mehreren Positionen unterscheiden, aber einen hohen Grad an Homologie zu diesen Sequenzen aufweisen. Homologie bedeutet dabei eine Sequenzidentität von mindestens 25 Prozent, insbesondere eine Identität von mindestens 40 Prozent, vorzugsweise von mindestens 60, besonders bevorzugt von über 80 Prozent und am meisten bevorzugt von über 90 Prozent. Dabei weisen die durch diese DNA-Sequenzen kodierten Proteine eine Sequenzidentität zu den in SEQ ID No. 2, 4 respektive 6 angegebenen Aminosäuresequenzen von mindestens 60 Prozent, insbesondere mindestens 80 Prozent, vorzugsweise 85 Prozent und besonders bevorzugt über 90 Prozent, 95 Prozent und 98 Prozent auf. Die Abweichungen zu den oben beschriebenen DNA- Sequenzen können dabei beispielsweise durch Deletion, Substitution, Insertion oder Rekombination entstanden sein.
Bei den DNA-Sequenzen, die homolog zu den oben beschriebenen Sequenzen sind und Derivate dieser Sequenzen darstellen, handelt es sich in der Regel um Variationen dieser Sequenzen, die Modifikationen darstellen, die dieselbe biologische Funktion ausüben. Es kann sich dabei sowohl um natürlicherweise auftretende Variationen handeln, beispielsweise um Sequenzen aus anderen Organismen oder um Mutationen, wobei diese Mutationen auf natürliche Weise aufgetreten sein können oder durch gezielte Mutagenese eingeführt wurden. Femer kann es sich bei den Variationen um synthetisch hergestellte Sequenzen handeln. Bei den allelischen Varianten kann es sich sowohl um natürlich auftretende Varianten handeln, als auch um synthetisch hergestellte oder durch rekombinante DNA- Techniken erzeugte Varianten.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform stammt die beschriebene, für eine Acylhydrolase, insbesondere für eine TAG-Lipase, besonders bevorzugt für eine für oxygenierte Polyenfettsäuren spezifische TAG-Lipase kodierende DNA-Sequenz aus Arabidopsis thaliana.
Weiter betrifft die Erfindung Nukleinsauremolekule, die die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen enthalten oder durch natürlich vorkommende oder durch gentechnische oder chemische Prozesse und Syntheseverfahren aus diesen entstanden sind bzw. von diesen abgeleitet wurden. Hierbei kann es sich beispielsweise um DNA- oder RNA-Moleküle, cDNA, genomische DNA, mRNA usw. handeln.
Die Erfindung betrifft ebenfalls solche Nukleinsauremolekule, in denen die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen mit regulatorischen Elementen verknüpft sind, die die Transkription und, falls erwünscht, die Translation in der Pflanzenzelle gewährleisten.
Für die Expression der in den erfindungsgemäßen rekombinanten Nuklemsäuremolekülen enthaltenen DNA-Sequenzen in pflanzlichen Zellen kommt grundsätzlich jeder in pflanzenlichen Zellen aktive Promotor in Frage. So können die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen beispielsweise unter Kontrolle konstitutiver, aber auch induzierbarer oder gewebe- bzw. entwicklungsspezifischer Regulationselemente, insbesondere Promotoren, in Pflanzenzellen exprimiert werden. Während beispielsweise die Verwendung eines induzierbaren Promotors die gezielt ausgelöste Expression der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen in Pflanzenzellen ermöglicht, bietet beispielsweise der Einsatz von gewebespezifischen, beispielsweise blatt- oder samenspezifischen, Promotoren die Möglichkeit, den Gehalt an oxygenierten Polyenfettsäuren in bestimmtem Gewebe, z.B. in Blatt- bzw. Samengewebe, zu verändern. Andere geeignete Promotoren vermitteln z.B. Lichtinduzierte Genexpression in transgenen Pflanzen. In Bezug auf die zu transformierende Pflanzen kann der Promotor homolog oder heterolog sein.
Geeignete Promotoren sind z.B. der 35S RNA-Promotor des Cauliflower Mosaic Virus und der Ubiquitin-Promotor aus Mais für eine konstitutive Expression. Als samenspezifische Promotoren bieten sich bspw. der USP- (Bäumlein et al. (1991), Mol. Gen. Genet. 225: 459-467) oder dem Hordein-Promotor (Brandt et al. (1985), Carlsberg Res. Commun. 50: 333-345).
Konstitutive keimungsspezifische und samenspezifische Promotoren werden im
Rahmen dieser Erfindung bevorzugt, da sie sich besonders für die gezielte Erhöhung des Gehalts an oxygenierten Polyenfettsäuren in transgenen Samen eignen, u.a. auch im Zusammenhang mit der Antisense- oder Cosuppressions-Technik. In jedem Fall kann der Fachmann geeignete Promotoren der Literatur entnehmen oder mittels Routineverfahren selbst aus beliebigen Pflanzen isolieren.
Ferner sind Transkriptions- bzw. Terminationssequenz vorhanden, die der korrekten Beendigung der Transkription dient, sowie der Addition eines polyA-Schwanzes an das Transkript dienen kann, dem eine Funktion bei der Stabilisierung der Transkripte beigemessen wird. Derartige Elemente sind in der Literatur beschrieben (z.B. Gielen (1989) EMBO J. 8:23-29) und beliebig austauschbar, z.B. der Terminator des Octopinsynthasegens aus Agrobacteri m tumefaciens.
Die Erfindung betrifft weiterhin Proteine mit der biologischen Aktivität einer Acylhydrolase, insbesondere einer TAG-Lipase, besonders bevorzugt einer für oxygenierte Polyenfettsäuren spezifischen TAG-Lipase oder biologisch aktive Fragmente davon, die durch eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz oder ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül kodiert werden. Vorzugsweise handelt es sich um eine pflanzliche TAG-Lipase aus Arabidopsis thaliana, besonders bevorzugt um ein Protein mit der in SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 oder SEQ ID NO:6 gezeigten Aminosäuresequenz oder einem aktiven Fragment davon.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht darin, Vektoren bereitzustellen, deren Verwendung die Herstellung neuer Pflanzen, in denen ein veränderter Gehalt an mehrfach ungesättigten oxygenierten Fettsäuren erzielt werden kann, ermöglicht. Diese Aufgabe wird durch die Bereitstellung der erfindungsgemäßen Vektoren gelöst, die für Enzyme mit der Aktivität einer Acylhydrolase, insbesondere einer TAG-Lipase, besonders bevorzugt einer für oxygenierte Polyenfettsäuren spezifischen TAG-Lipase kodierende Nukleinsäuresequenzen enthalten.
Die vorliegende Erfindung betrifft somit auch Vektoren, insbesondere Plasmide, Kosmide, Viren, Bakteriophagen und andere in der Gentechnik gängige Vektoren, die die vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen Nukleinsauremolekule enthalten und ggf. für den Transfer der erfindungsgemäßen Nukleinsauremolekule aufpflanzen bzw. Pflanzenzellen eingesetzt werden können.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die in den Vektoren enthaltenen Nukleinsauremolekule mit regulatorischen Elementen verknüpft, die die
Transkription und ggf. Translation in prokaryontischen und eukaryontischen Zellen gewährleisten.
Gegegebenfalls können die Nukleinsäuresequenzen der Erfindung durch Enhancer- Sequenzen oder andere regulatorische Sequenzen ergänzt sein. Diese regulatorischen Sequenzen beinhalten beispielsweise auch Signalsequenzen, die für den Transport des Genprodukts zu einem bestimmten Kompartiment sorgen.
Es ist ebenso eine Aufgabe der Erfindung, neue transgene Pflanzen, Pflanzenzellen, Pflanzenteile, transgenes Vermehrungsmaterial und transgene Ernteprodukte bereitzustellen, die sich durch eine gegenüber Wildtyppflanzen bzw. -zellen veränderten Gehalt an Polyenfettsäuren, insbesondere an oxygenierten Polyenfettsäuren im Saatöl auszeichnen.
Diese Aufgabe wird durch die Übertragung der erfindungsgemäßen
Nukleinsauremolekule und ihre Expression in Pflanzen gelöst. Durch die Bereitstellung der erfindungsgemäßen Nukleinsauremolekule besteht nun die Möglichkeit, pflanzliche Zellen mittels gentechnischer Methoden dahingehend zu verändern, daß sie im Vergleich zu Wildtypzellen eine neue oder veränderte TAG- Lipase- Aktivität aufweisen und es als Folge davon zu einer Veränderung des Gehalts an Polyenfettsäuren, insbesondere an oxygenierten Polyenfettsäuren im Saatöl kommt.
So betrifft die Erfindung in einer Ausführungsform Pflanzen bzw. deren Zellen und Teile, in denen der Gehalt an Polyenfettsäuren, insbesondere an oxygenierten Polyenfettsäuren im Saatöl aufgrund der Gegenwart und Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsauremolekule gegenüber Wildtyppflanzen verringert ist.
Die Erfindung betrifft aber auch solche Pflanzen, in denen die Übertragung der erfindungsgemäßen Nukleinsauremolekule zu einer Erhöhung des Gehalts an Polyenfettsäuren, insbesondere an oxygenierten Polyenfettsäuren im Saatöl führt. Eine derartige Reduktion kann beispielsweise durch den Transfer von Antisense- Konstrukten oder durch andere Suppressionsmechanismen, wie beispielsweise Cosuppressionen, erreicht werden.
Gegenstand der Erfindung sind weiterhin transgene Pflanzenzellen bzw. solche Pflanzenzellen umfassende Pflanzen und deren Teile und Produkte, in denen die erfindungsgemäßen Nukleinsauremolekule integriert in das pflanzliche Genom vorliegen. Ebenfalls Gegenstand der Erfindung sind Pflanzen, in deren Zellen die erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz in selbstreplizierender Form vorliegt, d.h. die Pflanzenzelle enthält die fremde DNA auf einem eigenständigen Nukleinsäuremolekül (transiente Expression).
Bei den Pflanzen, die mit den erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekülen transformiert sind und in denen aufgrund der Einführung eines solchen Moleküls eine veränderte Menge an Polyenfettsäuren, insbesondere an oxygenierten
Polyenfettsäuren im Saatöl synthetisiert wird, kann es sich im Prinzip um jede beliebige Pflanze handeln. Vorzugsweise ist es eine monokotyle oder dikotyle
Nutzpflanze.
Beispiele für monokotyle Pflanzen sind die Pflanzen, die zu den Gattungen Avena
(Hafer), Triticum (Weizen), Seeale (Roggen), Hordeum (Gerste), Oryza (Reis),
Panicum, Pennisetum, Setaria, Sorghum (Hirse), Zea (Mais) gehören. Bei den dikotylen Nutzpflanzen sind u.a. zu nennen Leguminosen, wie Hülsenfrüchte und insbesondere Alfalfa, Sojabohne, Raps, Tomate, Zuckerrübe, Kartoffel, Zierpflanzen oder Bäume. Weitere Nutzpflanzen können beispielsweise Obst (insbesondere Äpfel, Birnen, Kirschen, Weintrauben, Citrus, Ananas und Bananen), Ölpalmen, Tee-, Kakao- und Kaffeesträucher, Tabak, Sisal, Baumwolle, Lein, Sonnenblume sowie Heilpflanzen und Weidegräser sowie Futterpflanzen sein. Besonders bevorzugt sind die Getreide Weizen, Roggen, Hafer, Gerste, Reis, Mais und Hirse, Futtergetreide, Zuckerrübe, Raps, Soja, Tomate, Kartoffel, Süßgräser, Futtergräser und Klee. Es ergibt sich von selbst, daß die Erfindung insbesondere übliche Nahrungs- bzw. Futterpflanzen betrifft. Hier sind neben den bereits erwähnten Pflanzen zusätzlich Erdnuß, Linse, Ackerbohne, Runkelrübe, Buchweizen, Möhre, Sonnenblume, Topinambur, Rübsen, Weißer Senf, Kohlrübe und Stoppelrübe zu nennen.
Besonders bevorzugt werden Ölsaaten.
Gegenstand der Erfindung sind ferner Vermehrungsmaterial und Ernteprodukte von erfindungsgemäßen Pflanzen, beispielsweise Samen, Früchte, Stecklinge, Knollen, Wurzelstöcke usw., sowie Teile dieser Pflanzen, wie Protoplasten, Pflanzenzellen und Kalli.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung Wirtszellen, insbesondere prokaryontische und eukaryontische Zellen, die mit einem oben beschriebenen Nukleinsäuremolekül oder einem Vektor transformiert bzw. infiziert wurden, sowie Zellen, die von derartigen Wirtszellen abstammen und die beschriebenen Nukleinsauremolekule oder Vektoren enthalten. Die Wirtszellen können Bakterien, Viren, Algen, Hefe- und Pilzzellen sowie pflanzliche oder tierische Zellen sein.
Gegenstand der Erfindung sind auch solche Wirtszellen, die neben den erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekülen ein oder mehrere, auf gentechnologischem oder natürlichem Weg übertragene Nukleinsauremolekule enthalten, die die genetische Information für am LOX-abhängigen Katabolismus von mehrfach ungesättigten Fettsäuren in Pflanzen beteiligte Enzyme tragen. Der vorliegenden Erfindung liegt außerdem die Aufgabe zugrunde, Verfahren zur
Herstellung von Pfϊanzenzellen und Pflanzen, die sich durch einen veränderten
Gehalt an Polyenfettsäuren, insbesondere an oxygenierten Polyenfettsäuren im Saatöl auszeichnen, bereitzustellen.
Diese Aufgabe wird durch Verfahren gelöst, mit deren Hilfe die Erzeugung neuer
Pflanzenzellen und Pflanzen, die aufgrund der Übertragung der erfindungsgemäßen, für Acylhydrolase, insbesondere TAG-Lipase kodierenden Nukleinsäuremolekülen einen veränderten Gehalt an Polyenfettsäuren, insbesondere an oxygenierten Polyenfettsäuren im Saatöl aufweisen, möglich ist. Zur Erzeugung solcher neuer Pflanzenzellen und Pflanzen bieten sich verschiedene Methoden an. Zum einen können Pflanzen bzw. Pflanzenzellen mit Hilfe herkömmlicher gentechnologischer Transformationsmethoden derart verändert werden, daß die neuen Nukleinsauremolekule in das pflanzliche Genom integriert werden, d.h., es werden stabile Transformanten erzeugt. Zum anderen kann ein erfindungsgemäßes
Nukleinsäuremolekül, dessen Anwesenheit und ggf. Expression in der Pflanzenzelle eine veränderte Biosyntheseleistung bewirkt, in der Pflanzenzelle bzw. der Pflanze als selbstreplizierendes System enthalten sein. So können die erfindungsgemäßen Nukleinsauremolekule beispielsweise in einem Virus enthalten sein, mit dem die Pflanze bzw. Pflanzenzelle in Kontakt kommt.
Erfindungsgemäß werden Pflanzenzellen und Pflanzen, die aufgrund der Expression einer erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz einen veränderten Gehalt an Polyenfettsäuren, insbesondere an oxygenierten Polyenfettsäuren in Saatöl aufweisen, durch ein Verfahren hergestellt, das folgende Schritte umfaßt:
a) Herstellung eines rekombinanten Nukleinsäuremoleküls, umfassend die folgenden Bestandteilen in 5' -> 3 '-Orientierung: regulatorische Sequenzen eines in Pflanzenzellen aktiven Promotors, operativ daran gebunden eine Nukleinsäuresequenz, die für ein Protein mit der biologischen Aktivität einer Acylhydrolase, insbesondere einer TAG-Lipase, besonders bevorzugt einer für oxygenierte Polyenfettsäuren spezifischen TAG-Lipase kodiert, und - ggf. operativ daran gebunden Sequenzen, die als Transkriptions-,
Termination- und/oder Polyadenylierungssignale in Pflanzenzellen dienen können, b) Übertragung des Nukleinsäuremoleküls aus a) auf pflanzliche Zellen.
Alternativ können eine oder mehrere erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenzen als selbstreplizierendes System in die Pflanzenzelle bzw. die Pflanze eingebracht werden.
Als weitere Alternative kann Schritt a) des obigen Verfahrens dahingehend abgewandelt werden, daß die erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz, die für ein Protein mit der biologischen Aktivität einer Acylhydrolase, insbesondere einer TAG- Lipase, besonders bevorzugt einer für oxygenierte Polyenfettsäuren spezifischen TAG-Lipase kodiert, in Antisense-Orientierung an das 3 '-Ende des Promotors gekoppelt ist.
Bei einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung können ein oder mehrere zusätzliche Nukleinsauremolekule eingeführt werden, die für Proteine kodieren, die die Übertragung von Fettsäuren auf Glyceride katalysieren (Transacylasen). Auf diese Weise können Lipide, deren oxygenierte Polyenfettsäuren durch die erfindungsgemäße TAG-Lipase abgepalten wurden, mit nicht oxygenierten polyungesättigten Fettsäuren substituiert werden, die beispielsweise für die Verwendung des resultierenden Pflanzenöls in der Lebensmittelindustrie geeignet sind. Zur Vorbereitung der Einführung fremder Gene in höhere Pflanzen bzw. deren Zellen stehen eine große Anzahl von Klonierungsvektoren zur Verfügung, die ein Replikationssignal für E. coli und ein Markergen zur Selektion transformierter Bakterienzellen enthalten. Beispiele für derartige Vektoren sind pBR322, pUC- Serien, Ml 3mp-Serien, pACYC 184 usw. Die gewünschte Sequenz kann an einer passenden Restriktionsschnittstelle in den Vektor eingeführt werden. Das erhaltene Plasmid wird dann für die Transformation von E. coli-Zellen verwendet. Transformierte E. coli-Zellen werden in einem geeigneten Medium gezüchtet und anschließend geerntet und lysiert, und das Plasmid wird wiedergewonnen. Als Analysenmethode zur Charakterisierung der gewonnenen Plasmid-DNA werden im allgemeinen Restriktionsanalysen, Gelelektrophoresen und weitere biochemisch- molekularbiologische Methoden eingesetzt. Nach jeder Manipulation kann die Plasmid-DNA gespalten und gewonnene DNA-Fragmente mit anderen DNA- Sequenzen verknüpft werden.
Voraussetzung für die EiriTührung der erfindungsgemäßen rekombinanten
Nukleinsauremolekule und Vektoren in Pflanzenzellen ist die Verfügbarkeit geeigneter Transformationssysteme. Hier wurde während der letzten zwei Jahrzehnte ein breites Spektrum an Transformationsmethoden entwickelt und etabliert. Diese Techniken umfassen die Transformation pflanzlicher Zellen mit T-DNA unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes als Transformationsmittel, Diffusion von Protoplasten, den direkten Gentransfer isolierter DNA in Protoplasten, die Injektion und Elektroporation von DNA in Pflanzenzellen, die Einbringung von DNA mittels der biolistischen Methoden sowie weitere Möglichkeiten, wobei der Fachmann die jeweils geeignete Methode problemlos ermitteln kann. Sämtliche Transformationsverfahren sind seit vielen Jahren gut etabliert und gehören zweifelsohne zum Standardrepertoire des Fachmanns in der pflanzlichen Molekularbiologie, Pflanzenbiotechnologie und Zell- und Gewebekultur. Bei der Injektion und Elektroporation von DNA in Pflanzenzellen werden per se keine speziellen Anforderungen an die verwendeten Plasmide gestellt. Ahnliches gilt für den direkten Gentransfer. Es können einfache Plasmide, wie z.B. pUC-Derivate, verwendet werden. Sollen aber aus derartig transformierten Zellen ganze Pflanzen regeneriert werden, ist die Anwesenheit eines selektierbaren Markergens empfehlenswert. Dem Fachmann sind die gängigen Selektionsmarker bekannt, und es stellt für ihn kein Problem dar, einen geeigneten Marker auszuwählen.
Je nach Einführungsmethode gewünschter Gene in die Pflanzenzelle können weitere DNA-Sequenzen erforderlich sein. Werden z.B. für die Transformation der
Pflanzenzelle das Ti- oder Ri-Plasmid verwendet, so muss mindestens die rechte Begrenzung, häufig jedoch die rechte und linke Begrenzung der im Ti- bzw. Ri- Plasmid enthaltenen T-DNA als Flankenbereich mit den einzuführenden Genen verbunden werden. Werden für die Transformation Agrobakterien verwendet, muss die einzuführende DNA in spezielle Plasmide kloniert werden, und zwar entweder in einen intermediären oder in einen binären Vektor. Die intermediären Vektoren können aufgrund von Sequenzen, die homolog zu Sequenzen in der T-DNA sind, durch homologe Rekombination in das Ti- oder Ri-Plasmid der Agrobakterien integriert werden. Dieses enthält außerdem die für den Transfer der T-DNA notwendige vir-Region. Intermediäre Vektoren können nicht in Agrobakterien replizieren. Mittels eines Helferplasmids kann der intermediäre Vektor auf Agrobacterium tumefaciens übertragen werden (Konjugation). Binäre Vektoren können sowohl in E. coli als auch in Agrobakterien replizieren. Sie enthalten ein Selektionsmarkergen und einen Linker oder Polylinker, welche von der rechten und linken T-DNA-Grenzregion eingerahmt werden. Sie können direkt in die Agrobakterien transformiert werden. Das als Wirtszelle dienende Agrobakterium soll ein Plasmid, das eine vir-Region trägt, enthalten. Die vir-Region ist für den Transfer der T-DNA in die Pflanzenzelle notwendig. Zusätzliche T-DNA kann vorhanden sein. Das derartig transformierte Agrobakterium wird zur Transformation von Pflanzenzellen verwendet. Die Verwendung von T-DNA für die Transformation von Pflanzenzellen ist intensiv untersucht und ausreichend in allseits bekannten Übersichtsartikeln und Handbüchern zur Pflanzentransformation beschrieben worden.
Für den Transfer der DNA in die Pflanzenzelle können Pflanzen-Explantate zweckmäßigerweise mit Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes kultiviert werden. Aus dem infizierten Pflanzenmaterial (z.B. Blattstücke, Stengelsegmente, Wurzeln, aber auch Protoplasten oder Suspensions-kultivierte Pflanzenzellen) können dann in einem geeigneten Medium, welches Antibiotika oder Biozide zur Selektion transformierter Zellen enthalten kann, wieder ganze Pflanzen regeneriert werden.
Ist die eingeführte DNA einmal im Genom der Pflanzenzelle integriert, so ist sie dort in der Regel stabil und bleibt auch in den Nachkommen der ursprünglich transformierten Zelle erhalten. Sie enthält normalerweise einen Selektionsmarker, der den transformierten Pflanzenzellen Resistenz gegenüber einem Biozid oder einem Antibiotikum wie Kanamycin, G 418, Bleomycin, Hygromycin, Methotrexat, Glyphosat, Streptomycin, Sulfonylharnstoff, Gentamycin oder Phosphinotricin u.a. vermittelt. Der individuell gewählte Marker sollte daher die Selektion transformierter Zellen gegenüber Zellen, denen die eingeführte DNA fehlt, gestatten. Hierzu sind auch alternative Marker geeignet, wie nutritive Marker, Screeningmarker (wie GFP, green fluorescent protein). Selbstverständlich kann auch vollkommen auf Selektionsmarker verzichtet werden, was allerdings mit einem ziemlich hohen Screening- bedarf einhergeht. Falls der eingesetzte Selektionsmarker nach erfolgter Transformation und Identifizierung erfolgreich transformierter Zellen bzw. Pflanzen wieder entfernt werden soll, stehen dem Fachmann hierfür verschiedene Strategien zur Verfügung. So können z.B. sequenzspezifische Rekombinasen verwendet werden, z.B. in Form der Retransformation einer Rekombinase-exprimierenden Ausgangslinie und Auskreuzung der Rekombinase nach erfolgter Entfernung des Selektionsmarkers (siehe z.B. Reiss et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93:3094-3098; Bayley et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18:353-361; Lloyd et al. (1994) Mol. Gen. Genet. 242:653-657; Maser et al (1991) Mol. Gen. Genet. 230:170-176; Onouchi et al. (1991) Nucl. Acids Res. 19:6373-6378). Der Selektionsmarker kann auch durch Cotransformation mit anschließender Auskreuzung entfernt werden.
Die Regeneration der transgenen Pflanzen aus transgenen Pflanzenzellen erfolgt nach üblichen Regenerationsmethoden unter Verwendung üblicher Nährmedien und Phytohormone. Die so erhaltenen Pflanzen können dann, falls erwünscht, mittels üblicher Verfahren, einschließlich molekularbiologischer Methoden, wie PCR, Blot- Analysen, oder biochemischer Verfahren auf Anwesenheit der eingeführten DNA, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer für oxygenierte Polyenfettsäuren spezifischen TAG-Lipase kodiert, bzw. auf Anwesenheit von TAG- Lipase-Enzymaktivität untersucht werden.
Unabhängig von den verwendeten regulatorischen Sequenzen, unter deren Kontrolle die Expression der erfindungsgemäßen Acylhydrolase-, insbesondere TAG-Lipase- DNA-Sequenzen steht, steht dem Fachmann ein breites Spektrum an molekularbiologischen und/oder biochemischen Verfahren für die Analyse der transformierten Pflanzenzellen, transgenen Pflanzen, Pflanzenteile, Ernteprodukte und Vermehrungsmaterial zur Verfügung, z.B. PCR, Northern Blot-Analyse zum Nachweis von für die erfindungsgemäße TAG-Lipase spezifischer RNA bzw. zur Bestimmung der Höhe der Akkumulation von TAG-Lipase-spezifischer RNA, Southern Blot-Analyse zur Identifizierung von erfindungsgemäßen TAG-Lipase- kodierenden DNA-Sequenzen oder Western Blot-Analyse zum Nachweis des durch die erfindungsgemäßen Nukleinsauremolekule kodierten TAG-Lipase. Selbstverständlich kann der Nachweis der enzymatischen Aktivität der erfindungsgemäßen TAG-Lipase auch vom Fachmann mittels in der Literatur erhältlicher Protokolle bestimmt werden. Weiter kann man z.B. den durch Selbstung oder Kreuzungen erhaltenen Samen auf Medium auslegen, das das zu dem zusammen mit der TAG-Lipase-DNA-Sequenz übertragenen Selektionsmarker passende Selektionsmittel enthält, und anhand der Keimfähigkeit und des Wachstums der Tochtergeneration(en) und des Segregationsmusters Rückschlüsse auf den Genotyp der jeweiligen Pflanze schließen.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht darin, Verwendungen der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen sowie der sie enthaltenden Nukleinsauremolekule aufzuzeigen.
Diese Aufgabe wird durch die erfindungsgemäßen Verwendungen der neuen DNA- Sequenzen und -Moleküle zur Erzeugung von Pflanzenzellen und Pflanzen, die sich durch einen im Vergleich zu Wildtypzellen bzw. Wildtyppflanzen veränderten Gehalt insbesondere an Polyenfettsäuren, besonders bevorzugt an oxygenierten Polyenfettsäuren im Saatöl auszeichnen, gelöst.
Die vorliegende Erfindung umfaßt ferner jede mögliche Form des Einsatzes der erfindungsgemäßen Nukleinsauremolekule, deren Gegenwart und ggf. Expression in Pflanzen eine Veränderung des Gehalts an Polyenfettsäuren, insbesondere an oxygenierten Polyenfettsäuren im Saatöl bewirkt, sowie des Einsatzes der erfindungsgemäßen Proteine oder Fragmente davon, deren enzymatische Aktivität eine solche Veränderung herbeiführt.
Weiter betrifft die Erfindung die Verwendung einer erfindungsgemäßen DNA- Sequenz oder Teile davon zur Identifizierung und Isolierung homologer Sequenzen aus Pflanzen oder anderen Organismen.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsauremolekule können somit erfindungsgemäß verwendet werden, um transgene Pflanzen zu erzeugen, in denen der Gehalt an den erfindungsgemäßen Acylhydrolasen, insbesondere TAG-Lipasen höher oder geringer ist als natürlicherweise, oder in Zelltypen oder Entwicklungsstufen vorliegt, bei denen die erfindungsgemäßen Acylhydrolasen, insbesondere TAG-Lipasen normalerweise nicht gefunden werden. Dies bewirkt eine Änderung des Gehalts an Triacylglycerol und Cholesterylestern in diesen Zellen.
Die Akkumulierung von Fettsäuren mit ungewöhnlichen Strukturen kann ein vorteilhafter Phenotyp in Pflanzen sein, die für Lebensmittel verwendet werden. Triacylglycerol-Lipasen können ebenfalls nützlich bei der Verarbeitung von Pflanzenölen und der Entwicklung von neuen Saatölen sein, da durch eine selektive Abspaltung von oxidierten Poleinfettsäureresten durch die erfindungsgemäßen TAG- Lipasen die Haltbarkeit von Pflanzensaatölen für die Lebensmittelindustrie verlängert werden kann.
Für manche Anwendungen kann es nützlich sein, die erfindungsgemäßen TAG- Lipasen in unterschiedliche zelluläre Kompartimente einzuführen oder deren Sekretion aus der Zelle zu erleichtern. Es ist somit möglich, daß die erfindungsgemäßen Nukleinsauremolekule derart modifiziert sind, daß die erfindungsgemäßen Nukleinsauremolekule mit geeigneten intrazellulären Target- Sequenzen, wie Transit-Sequenzen (K. Keegstra (1989) Cell 56: 247-253), Signal- Sequenzen und dergleichen ergänzt werden.
Für manche Anwendungen kann es auch erwünscht sein, die Expression von
Nukleinsäuremolekülen zu vermindern oder zu eliminieren, die für TAG-Lipasen, insbesondere für TAG-Lipasen, die für oxygenierte Polyenfettsäuren spezifisch sind, kodieren. Um dies zu erreichen, kann ein für die Cosupression der erfindungsgemäßen TAG-Lipase entwickeltes Nukleinsäuremolekül durch Verknüpfen eines Gens oder Genfragments, das eine für oxygenierte
Polyenfettsäuren spezifische TAG-Lipase kodiert, mit Pflanzenpromotersequenzen, erzeugt werden. Alternativ kann ein Nukleinsäuremolekül, das für die Expression von Antisense-RNA für das gesamte oder einen Teil des erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküls entwickelt ist, durch Verbinden des Gens oder Genfragments in reverser Orientierung zu Pflanzenpromotersequenzen erzeugt werden. Sowohl die Gene für die Cosuppression als auch die Antisense-Gene können mittels Transformation in die Pflanzen eingeführt werden, wodurch die Expression der entsprechenden endogenen Gene vermindert oder eliminiert ist.
Die Erfindung basiert auf der erfolgreichen Isolierung von für eine Acylhydrolase, insbesondere für eine TAG-Lipase, besonders bevorzugt für eine für oxygenierte Polyenfettsäuren spezifischen TAG-Lipase kodierenden cDNA-Klonen aus einer cDNA-Bibliothek aus Arabidopsis thaliana. Die Sequenzen dieser cDNA-Klone, die ein vollständiges Leseraster umfassen, sind in SEQ ID NO: 1, SEQ ID No:3 und SEQ ID No:5 dargestellt. Unter Verwendung dieser Sequenzen gelang erstmals die Erzeugung transgener Pflanzen, die aufgrund der Übertragung und Expression einer TAG-Lipase, insbesondere einer für oxygenierte Polyenfettsäuren spezifischen TAG- Lipase einen gegenüber Wildtyppflanzen veränderten Gehalt an oxygenierten Polyenfettsäuren im Saatöl aufweisen.
Die nachfolgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung, ohne diese in irgendeiner Weise einzuschränken.
Beispiele
Beispiel 1:
Klonierung und Expression einer für die TAG-Lipase kodierenden cDNA aus
Arabidopsis thaliana
cDNA-Sequenzen, die für eine TAG-Lipase aus Arabidopsis thaliana kodieren, wurde mit Hilfe einer Durchmusterung von wie im folgenden beschrieben hergestellten cDNA-Bibliotheken aus Arabidopsis thaliana gemäß eines ebenfalls im folgenden beschriebenen standardisierten Protokolls identifiziert. Drei der annotierten Sequenzen (Lipase 1: SEQ ID No:l, Lipase 2: SEQ ID No:3, Lipase 3: SEQ ID No:5) wurden kloniert, exprimiert und auf Aktivität getestet. I. Herstellung von verschiedenen cDNA-Banken aus Arabidopsis thaliana
Nach dem im folgenden beschriebenen Protokoll wurde cDNA-Banken aus einem Gemisch verschiedener Organe von Arabidopsis sowie eine cDNA-Bank aus Blüten von Arabidopsis hergestellt.
a) Isolation von RNA aus Arabidopsis
Zur Isolation von RNA aus Arabidopsis wurden die folgenden Reagenzien verwendet:
- Extraktionspuffer I:
100 mM Tris/HCl pH 7,5
25 mM EDTA
2 % Laurylsarkosyl 4 M Guanidiniumthiocyanat
5 % (w/v) PVP (Polyklar) (wird als unlösliche Substanz erst bei Versuchsanfang in die fertige Lösung gegeben)
1 ml/100 ml ß-Mercaptoethanol (wird kurz vor der Benutzung des
Extraktionspuffers zugegeben) - PCI:
20 ml Phenol
20 ml Chloroform
1 ml Isoamylalkohol (mit H O gesättigt)
- Chloroform - 70 % Ethanol, 100 % Ethanol
- DEPC-behandeltes H2O
- Extraktionspuffer II (mit DEPC behandeltem Wasser angesetzt):
100 ml Tris/HCl pH 8,8 lOO mMNaCl 5 mM EDTA 2 % SDS
Die Durchführung der Isolation von RNA aus Arabidopsis wird nach dem folgenden Protokoll durchgeführt: - Zermörsern von 20 g Pflanzenmaterial in flüssigem Stickstoff
- Vorbereitung von 100 ml Extraktionspuffer I mit PVP und Mercaptoethanol, Zugabe des zermörserten Pflanzenmaterials und sofortige Mischung.
- Nach der Homogenisierung Überführung der Lösung in Falcon-Tubes und Schütteln für ca. 15 Minuten - Abzentrifugieren für 10 bis 15 Minuten bei 4.500 bis 5.500 rpm in Falcon-Tubes in einer Sigmazentrifuge
- Kippen des Überstandes in frische Falcons und Verwerfen des Pellets
- Versetzen mit 1 vol. PCI und Schütteln für 15 Minuten, 15 Minuten Stehenlassen auf Eis und abzentrifugieren, Abnehmen des Überstandes und Überführung in neue Falcons
- Abnehmen des Überstandes und Versetzten mit 1 vol. Chloroform, Schütteln für 15 Minuten und abzentrifugieren
- Abnehmen des Überstandes und Versetzen mit 1 vol. Isopropanol, Fällen über Nacht bei -20°C
- Abzentrifugieren für 30 Minuten bei 9.000 rpm
- Lösen der Pellets in je 20 ml Extraktionspuffer II und Versetzen mit 1 vol. Isopropanol
- Inkubieren für eine Stunde bei -20°C - Abzentrifugieren für 30 Minuten bei 9.000 rpm
- Zweimaliges Waschen der Pellets mit 1 ml 70 % Ethanol
- Trocknen der Pellets in einer Speed-Vac
- Aufnehmen der Pellets in 1.500 ml H2O, Stehenlassen auf Eis zum Lösen für 30 Minuten, Abnehmen des Überstandes und Überführung in frische Eppendorf-Caps, kalt stehenlassen - Vermessen der RNA im Photometer bei einer Verdünnung von 1:100, Bei der Messung sollte das Verhältnis von A 60 zu A280 größer/gleich 1,8 sein. Der Meßwert wird mit dem Verdünnungsfaktor und einem Faktor 40 multipliziert, wodurch sich die Konzentration der RNA in μg/ml ergibt. Die Durchführung eines Wavelength-Scans von 200 - 300 nm ergibt eine typische RNA-Kurve mit einem Maximum bei 260 nm. Anschließend wird die Absolutmenge an RNA berechnet und zur Ermittlung der Qualität der RNA ein RNA-Agarosegel durchgeführt.
b) mRNA-Isolation
Die mRNA-Isolierung wird mit dem mRNA-Isolierungskit Poly-Attract von Promega (Mannheim, Deutschland) drαrchgeführt.
c) RT-PCR
Die reverse Transkriptase-PCR wurde mit 1 μg RNA, 200 pmol oligo-dT mit Superscript II von Gibco (Eggenstein, Deutschland) gemäß der Vorschrift des Herstellers durchgeführt.
II. PCR-Amplifikation
Die PCR-Amplifikation wurde mit dem Expand™ High Fidelity PCR-System gemäß der Vorschrift des Herstellers (Boehringer Mannheim, Deutschland) durchgeführt. Als Template wurden für die Lipasen lund 2 das Arabidopsis cDNA-Gemisch und für die Lipase 3 die cDNA aus der Blüte von Arabidopsis verwendet. Als Primer wurden die folgenden Sequenzen verwendet:
Lipase 1 : (3 x Methionin im Anfangsbereich der Sequenz) 5':-CCC GCATGC ATG CAG TTG TCT CCG GAA CGA TGC (AI) 5*:-GGG GCATGC ATG TCT GAA AAC AGA GAG GCT TGG (A2) 5':-AAA GCATGC ATG GAG CTG CTT CAC GGC TCC AAC (A3) 3*:-AAA GTCGAC TCAAAAAGG GCT GAC CCT GCC AGC C
Lipase 2: 5':-CCC CGC ATG CAT GGC TTC TTCACT GAA GAA
3':-AAA CTG CAG TTA TGT ATC CAC TGT ACC AGA GCC AAG
Lipase 3:
5':-GGG GCATGC ATG TGTAGA AGA TATTTC GTG CATAGT 3':-TTT CTGCAGTGA CAG ATGAGG TTT GCC TGT TTC C
Für die Herstellung von Expressionsklonen, die die rekombinante TAG-Lipase in E. coli überexprimieren, wurde das offene Leseraster für das vollständige unprozessierte Protein mittels der vorstehenden Oligo-Nukleotidprimer von den DNA-Sequenzen gemäß den Sequenzen SEQ ID No:l, 3 und 5 mittels PCR amplifiziert. Die PCR-Bedingungen waren wie folgt: 2 Minuten Denaturierung bei 94°C, dann für 10 Zyklen: 30 Sekunden Denaturierung bei 94°C, 30 Sekunden Annealing bei 65°C, 3 Minuten Elongation bei 72°C; dann für 15 Zyklen: 30 Sekunden Denaturierung bei 94°C, 30 Sekunden Annealing bei 65°C, 3 Minuten Elongation bei 72°C plus einem Zeitinkrement von 5 Sekunden pro Zyklus; zum Schluß weitere 2 Minuten Elongation bei 72°C.
Das amplifizierte PCR-Fragment wurde in den Expressionsvektor QIAexpress pQE 30 hineinligiert und mit Transformation in XLl-Blue-Zellen unter Nutzung des p GEMR-T Easy Vector System II Kits (Promega, Madison, USA) vorkloniert. Anschließend erfolgte die Umklonierung in den Expressionsstamm E.coli SG13009[pREP4].
IV. Für die Expression der pflanzlichen TAG-Lipase wurde der E.coli-Stamm in LB- Medium bei 10°C für eine Dauer von 72 Stunden angezogen. V. Reinigung für membranassoziierte Proteine
Die Reinigung erfolgte nach den folgenden Schritten: - Herstellung einer Membranfraktion der E.coli SG13009[pREP4]
- Solubilisierung in Natriumphosphat bei pH 8,0, 1 M NaCl, 0,5 % Triton - 1 h Zentrifugieren bei 4°C und 37.000 rpm
- Reinigung des Überstands mittels eines Talon etal affinity resins (Clontech, Palo Alto, USA) gemäß den Instruktionen des Herstellers - Eluierung des Proteins mit Natriumphosphat, 1 M NaCl bei pH 5,0
Beispiel 2: Bestimmung der TAG-Lipase- Aktivität
Zur Bestimmung der TAG-Lipase- Aktivität wurde das wie vorstehend beschrieben erhaltene Proteineluat mit einem Lipidextrakt (Chloroform:Methanol, Bligh/Dyer 1959) aus vier Tage alten Keimlingen von Cucumis sativa 40 Minuten bei 25°C unter Zugabe von Pufferkonzentrat (1 M Tris pH 8,5; 0,5 M NaCl; 50 mM CaCl2) zur Einstellung des pH- Wertes auf 8,0 inkubiert. Anschließend wurde mit Essigsäure angesäuert und mit Hexan extrahiert. Die Analyse erfolgte mittels HPLC (LiCHrosphere 100 RP-18 (MERCK, Darmstadt, Deutschland); Laufmittel: Acetonitril:H2O:Essigsäure 70:30:0,1).
Beispiel 3: Transformation von Arabidopsis thaliana- und Nicotiana tάbacum- Pflanzen und Regeneration intakter Pflanzen
Für die Herstellung transgener Pflanzen, die die TAG-Lipase-Sequenz überexprimieren und daher eine gegenüber nicht-transformierten Pflanzen erhöhte Aktivität des Enzyms TAG-Lipase aufweisen, wurden die DNA-Sequenzen gemäß SIQ ID No:l, 3 und 5 jeweils in einen geeigneten binären Vektor (z.B. pPCVOOl, pPCV002 (Koncz & Schell 1986 MGG 204:383-396) kloniert. Anstelle des genannten Vektors kann jeder beliebige, für die Pflanzentransformation geeigneter Vektor für die Herstellung eines chimären Gens, bestehend aus einer Fusion des CaMV 35S-Promotors oder eines anderen konstitutiven, samenspezifischen, keimungsspezifischen oder blütenspezifischen Promotors, der die Transkription und, falls erwünscht, Translation in Pflanzenzellen gewährleistet, und DNA-Sequenzen, die für TAG-Lipase kodieren, verwendet werden.
Der binäre Vektor wurde dann in Agrobacterium tumefaciens (Stamm GV2260; Horsch et al. (1985), Science 227, 1229-1231) transformiert und zur Transformation von Arabidopsis- bzw. Tabakpflanzen (SNN) mittels der Blattscheiben- Transformationstechnik (Horsch et al., supra) eingesetzt.
Hierzu wurde eine Übernachtkultur des entsprechenden Agrobacterium tumefaciens- Klons für 10 Minuten bei 5000 rpm abzentrifugiert, und die Bakterien wurden in
2 YT-Medium resuspendiert. Blattstücke von Sterilkulturen von Arabidopsis thaliana bzw. Nicotiana tabacum cv. Samsun NN) wurden kurzzeitig in die Bakteriensuspension gelegt. Die Blattstücke wurden anschließend auf MS-Medium (Murashige und Skoog (1962), Physiol. Plant. 15, 473; 0,7% Agar) gelegt und zwei Tage im Dunkeln inkubiert. Anschließend wurden die Blattstücke zur
Sproßinduktion auf MS-Medium (0,7% Agar) mit 1,6% Glukose, 1 mg/1 6- Benzylaminopurin, 0,2 mg/1 Naphthylessigsäure, 500 mg/1 Claforan (Cefotaxim, Hoechst, Frankfurt) und 50 mg/1 Kanamycin gelegt. Das Medium wurde alle sieben bis zehn Tage gewechselt. Wenn sich Sprosse entwickelt hatten, wurden die Blattstücke in Glasgefaße, die das selbe Medium enthielten, überführt. Entstehende Sprosse wurden abgeschnitten und auf MS-Medium mit 2% Saccharose und 250 mg/1 Claforan gegeben und zu ganzen Pflanzen regeneriert. Die Analyse der erhaltenen transgenen Arabidopsis- und Tabakpflanzen bestätigte die erfolgreiche Neränderung des Lipidgehalts durch Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsauremolekule.

Claims

Ansprüche
1. Rekombinantes Nukleinsäuremolekül, umfassend a) regulatorische Sequenzen eines in Pflanzenzellen aktiven Promotors; b) operativ daran gebunden eine DNA-Sequenz, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Acylhydrolase kodiert; und c) operativ daran gebunden regulatorische Sequenzen, die als Transkriptions-, Terminations- und/oder Polyadenylierungssignale in Pflanzenzellen dienen können.
2. Rekombinantes Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1, wobei die DNA- Sequenz ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Triacylglycerin-Lipase (TAG-Lipase) kodiert.
3. Rekombinantes Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 2, wobei die DNA- Sequenz ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer für oxygenierte Polyenfettsäuren spezifischen TAG-Lipase kodiert
4. Rekombinantes Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Sequenz für eine Acylhydrolase, insbesondere eine TAG-Lipase, aus Arabidopsis thaliana kodiert.
5. Rekombinantes Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 4, enthaltend eine DNA-Sequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus a) DNA-Sequenzen, die die in SEQ ID No. 1 angegebene Nukleotidsequenz umfassen, b) DNA-Sequenzen, die die in SEQ ID No. 3 angegebene Nukleotidsequenz umfassen, c) DNA-Sequenzen, die die in SEQ ID No. 5 angegebene Nukleotidsequenz umfassen, d) DNA-Sequenzen, die eine Nukleotidsequenz umfassen, die die in SEQ ID No. 2 angegebene Aminosäuresequenz oder Fragmente davon kodieren, e) DNA-Sequenzen, die die in SEQ ID No. 4 angegebene
Aminosäuresequenz oder Fragmente davon kodieren, f) DNA-Sequenzen, die die in SEQ ID No. 6 angegebene Aminosäuresequenz oder Fragmente davon kodieren, g) DNA-Sequenzen, die eine Nukleotidsequenz, die mit einem komplementären Strang der Nukleotidsequenz von a), b), c), d), e) oder f) hybridisieren, oder Fragmente dieser Nukleotidsequenz umfassen, h) DNA-Sequenzen, die eine Nukleotidsequenz, die zu einer
Nukleotidsequenz von g) degeneriert ist, oder Fragmente dieser
Nukleotidsequenz umfassen, i) DNA-Sequenzen, die ein Derivat, Analog oder Fragment einer
Nukleotidsequenz von a), b), c), d), e), f), g) oder h) darstellen.
6. Rekombinantes Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der Promotor ein konstitutiver Promotor, vorzugsweise der 35S RNA- Promotor von CaMV ist.
7. Vektor, umfassend ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül nach einem der vorangehenden Ansprüche.
8. Wirtszelle, enthaltend ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül oder einen
Vektor nach einem der vorangehenden Ansprüche.
9. Rekombinantes Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Acylhydrolase.
10. Rekombinantes Protein nach Anspruch 9, wobei die Acyhydrolase eine TAG-Lipase ist.
11. Rekombinantes Protein nach Anspruch 9 oder 10, wobei die Acyhydrolase eine für oxygenierte Polyenfettsäuren spezifische TAG-Lipase ist.
12. Rekombinantes Protein nach einem der Ansprüche 9 bis 11 mit der enzymatischen Aktivität einer in Arabidopsis hergestellten Acylhydrolase.
13. Protein nach einem der Ansprüche 9 bis 12, enthaltend eine
Aminosäuresequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus a) Aminosäure-Sequenzen, die die in SEQ ID No. 2 angegebene Aminosäuresequenz oder Fragmente davon umfassen; b) Aminosäure-Sequenzen, die die in SEQ ID No. 4 angegebene Aminosäuresequenz oder Fragmente davon umfassen; c) Aminosäure-Sequenzen, die die in SEQ ID No. 6 angegebene Aminosäuresequenz oder Fragmente davon umfassen.
14. Verfahren zur Herstellung von Pflanzen bzw. Pflanzenzellen, umfassend die folgenden Schritte: a) Herstellung einer Nukleinsäuresequenz, bestehend aus den folgenden Bestandteilen, die in der 5 '-3 '-Orientierung aneinandergereiht sind:
- ein in Pflanzen funktionsfähiger, insbesondere samenspezifischer, Promotor, - mindestens eine DNA-Sequenz, die ein Protein mit der enzymatischen
Aktivität einer Acylhydrolase, insbesondere einer TAG-Lipase, besonders bevorzugt einer für oxygenierte Polyenfettsäuren spezifischen Triacylglycerin-TAG-Lipase kodiert, und
- gegebenenfalls ein Terminationssignal für die Termination der Transkription und die Addition eines poly-A-Schwanzes an das entsprechende Transkript, sowie ggf. davon abgeleitete DNA- Sequenzen; b) Übertragung der Nukleinsäuresequenz aus a) auf pflanzliche Zellen und gegebenenfalls Integration der Nukleinsäuresequenz in das pflanzliche Genom.
15. Transgene Pflanzenzelle, enthaltend ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül oder einen Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 7 oder hergestellt nach einem Verfahren nach Anspruch 14.
16. Pflanzenzelle nach Anspruch 15, die mindestens ein weiteres Fremdgen enthält.
17. Pflanzenzelle nach Anspruch 15 oder 16, einschließlich Protoplasten, die einen gegenüber nicht-transformierten Pflanzenzellen veränderten, insbesondere erhöhten, Acylhydrolase, insbesondere TAG-Lipase-Gehalt aufweist.
18. Transgene Pflanzen, enthaltend eine Pflanzenzelle nach einem der Ansprüche 15 bis 17 oder hergestellt nach Anspruch 14, sowie Teile dieser Pflanzen, transgene Ernteprodukte und transgenes Vermehrungsmaterial dieser Pflanzen, wie Protoplasten, Pflanzenzellen, Kalli, Samen, Knollen, Stecklinge, sowie die transgenen Nachkommen dieser Pflanzen.
19. Pflanzen nach Anspruch 18, die einen gegenüber Wildtyppflanzen veränderten Acylhydrolase-, insbesondere TAG-Lipase-Gehalt aufweisen.
20. Pflanzen nach Anspruch 19, die einen gegenüber Wildtyppflanzen erhöhten TAG-Lipase-Gehalt aufweisen.
21. Pflanzen nach einem der Ansprüche 18 bis 20, die einen gegenüber Wildtyppflanzen veränderten Gehalt an Polyenfettsäuren, insbesondere an oxygenierten Polyenfettsäuren im Samenöl enthalten.
22. Pflanzen nach Anspruch 21, die einen gegenüber Wildtyppflanzen verminderten Gehalt an Polyenfettsäuren, insbesondere an oxygenierten Polyenfettsäuren im Samenöl enthalten.
23. Dikotyle Pflanzen nach einem der Ansprüche 18 bis 22.
24. Pflanzen nach Anspruch 23, bei denen es sich um Nutzpflanzen, Nahrungs- und/oder Futterpflanzen handelt.
25. Monokotyle Pflanzen nach einem der Ansprüche 13 bis 17.
26. Pflanzen nach Anspruch 25, bei denen es sich um Nutzpflanzen, Nahrungs- und/oder Futterpflanzen handelt.
27. Verwendung einer Pflanze nach einem der Ansprüche 18 bis 26 als Nutz-, Nahrungs- oder Futterpflanze.
28. Verwendung einer Nukleinsäuresequenz oder eines Vektors nach einem der Ansprüche 1 bis 7 zur Herstellung transgener Pflanzen bzw. Pflanzenzellen.
29. Verwendung nach Anspruch 28, wobei die Pflanzen bzw. Pflanzenzellen einen veränderten Acylhydrolase-, insbesondere TAG-Lipase-Gehalt aufweisen.
30. Verwendung nach Anspruch 28 oder 29, wobei die Pflanzen bzw. Pflanzenzellen einen veränderten Gehalt an Polyenfettsäuren, insbesondere an oxygenierten Polyenfettsäuren im Samenöl enthalten.
31. Verfahren zur Auffindung von Nukleinsäuresequenzen, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Acylhydrolase, insbesondere einer TAG- Lipase, besonders bevorzugt einer für oxygenierte Polyenfettsäuren spezifischen TAG-Lipase kodiert, umfassend a) Testen einer cDNA- oder genomischen Bank mit der Nukleinsäuresequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 6, b) Identifizierung eines DNA-Klons, der mit der Nukleinsäuresequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 6 hybridisiert, c) Isolierung des in Schritt b) identifizierten DNA-Klons, und d) Sequenzierung des cDNA- oder genomischen Fragments, das den in Schritt c) isolierten Klon umfaßt.
32. Verfahren zur Veränderung des Gehalts an Polyenfettsäureresten, insbesondere an oxidierten Polyenfettsäureresten in transgenen Pflanzen durch Beeinflussung des Lipoxygenase (LOX)-abhängigen Stoffwechsels von mehrfach ungesättigten Fettsäuren in transgenen Pflanzen.
33. Verfahren nach Anspruch 32, wobei die Veränderung des LOX- abhängigen Stoffwechsels von mehrfach ungesättigten Fettsäuren durch
Modifizierung der Expression von TAG-Lipase erfolgt.
34. Verfahren nach Anspruch 33, umfassend a) gegebenenfalls Transformieren einer Wirtszelle mit LOX; b) Transformieren einer Wirtszelle mit dem Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 6; und c) Wachstum der in Schritt a) und b) hergestellten transformierten Wirtszelle unter Bedingungen, die für die Expression des Nukleinsäuremoleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 6 geeignet sind.
35. Verwendung einer TAG-Lipase, kodiert durch ein Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 6, zur Verarbeitung von pflanzlichen Ölen, die oxidierte Polyenfettsäurereste umfassen.
36. Verwendung nach Anspruch 35 zur spezifischen Isolierung der oxidierten
Polyenfettsäurereste aus den pflanzlichen Ölen.
37. Verwendung nach Anspruch 35 oder 36 zur Verminderung des Gehalts an oxidierten Polyenfettsäureresten in Pflanzenöl.
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