JP6006553B2 - 組換えクラミドモナス属及びそれを用いたラウリン酸高含有油脂の製造方法 - Google Patents
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Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
アシルACPチオエステラーゼをコードする遺伝子と、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2−4をコードする遺伝子とが導入されている組換えクラミドモナス属細胞であって、
当該アシルACPチオエステラーゼをコードする遺伝子が、以下の(a)〜(c):
(a)配列番号4に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
(b)配列番号4に示すアミノ酸配列と70%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つC12:0脂肪酸選択的アシルACPチオエステラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号4に示すアミノ酸配列において1または複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加または挿入されたアミノ酸配列を含み、且つC12:0脂肪酸選択的アシルACPチオエステラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
からなる群より選択され、且つ
当該ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2−4をコードする遺伝子が、以下の(d)〜(g):
(d)配列番号8に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド;
(e)配列番号8に示すヌクレオチド配列と70%以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
(f)配列番号8に示すヌクレオチド配列において1または複数個の塩基が欠失、置換、付加または挿入されたヌクレオチド配列からなり、且つジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;および
(g)配列番号8に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
からなる群より選択される、組換えクラミドモナス属細胞。
クラミドモナス属細胞に、アシルACPチオエステラーゼをコードする遺伝子と、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2−4をコードする遺伝子とを導入する工程を含む、組換えクラミドモナス属細胞の製造方法であって
当該アシルACPチオエステラーゼをコードする遺伝子が、以下の(a)〜(c):
(a)配列番号4に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
(b)配列番号4に示すアミノ酸配列と70%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つC12:0脂肪酸選択的アシルACPチオエステラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号4に示すアミノ酸配列において1または複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加または挿入されたアミノ酸配列を含み、且つC12:0脂肪酸選択的アシルACPチオエステラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
からなる群より選択され、且つ
当該ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2−4をコードする遺伝子が、以下の(d)〜(g):
(d)配列番号8に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド;
(e)配列番号8に示すヌクレオチド配列と70%以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
(f)配列番号8に示すヌクレオチド配列において1または複数個の塩基が欠失、置換、付加または挿入されたヌクレオチド配列からなり、且つジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;および
(g)配列番号8に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
からなる群より選択される、方法。
(a)配列番号4に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
(b)配列番号4に示すアミノ酸配列と70%以上、好ましくは80%以上、より好ましくは85%以上、さらに好ましくは90%以上、なお好ましくは95%以上、なおより好ましくは98%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つC12:0脂肪酸選択的アシルACPチオエステラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号4に示すアミノ酸配列において1または複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加または挿入されたアミノ酸配列を含み、且つC12:0脂肪酸選択的アシルACPチオエステラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
(a')配列番号4に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
(b')配列番号4に示すアミノ酸配列と70%以上、好ましくは80%以上、より好ましくは85%以上、さらに好ましくは90%以上、なお好ましくは95%以上、なおより好ましくは98%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つC12:0脂肪酸選択的アシルACPチオエステラーゼ活性を有し、葉緑体移行シグナルペプチドを有さないポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
(c')配列番号4に示すアミノ酸配列において1または複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加または挿入されたアミノ酸配列からなり、且つC12:0脂肪酸選択的アシルACPチオエステラーゼ活性を有し、葉緑体移行シグナルペプチドを有さないポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
これらの遺伝子は、親クラミドモナス属細胞の葉緑体ゲノムに導入する遺伝子として好適である。
(a'')配列番号2に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
(b'')配列番号2に示すアミノ酸配列と70%以上、好ましくは80%以上、より好ましくは85%以上、さらに好ましくは90%以上、なお好ましくは95%以上、なおより好ましくは98%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つC12:0脂肪酸選択的アシルACPチオエステラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
(c'')配列番号2に示すアミノ酸配列において1または複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加または挿入されたアミノ酸配列からなり、且つC12:0脂肪酸選択的アシルACPチオエステラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
位置 アミノ酸残基
80位またはそれに相当する位置 トリプトファン
197位またはそれに相当する位置 アスパラギン酸
199位またはそれに相当する位置 アスパラギン
201位またはそれに相当する位置 ヒスチジン
207位またはそれに相当する位置 チロシン
位置 アミノ酸残基
30位またはそれに相当する位置 アルギニン
31位またはそれに相当する位置 セリン
33位またはそれに相当する位置 グルタミン酸
35位またはそれに相当する位置 グリシン
37位またはそれに相当する位置 アスパラギン酸
47位またはそれに相当する位置 アスパラギン
50位またはそれに相当する位置 グルタミン
55位またはそれに相当する位置 アスパラギン
61位またはそれに相当する位置 グリシン
66位またはそれに相当する位置 グリシン
68位またはそれに相当する位置 グリシン
70位またはそれに相当する位置 スレオニン
73位またはそれに相当する位置 メチオニン
78位またはそれに相当する位置 ロイシン
81位またはそれに相当する位置 バリン
92位またはそれに相当する位置 チロシン
95位またはそれに相当する位置 トリプトファン
104位またはそれに相当する位置 トリプトファン
109位またはそれに相当する位置 グリシン
133位またはそれに相当する位置 セリン
138位またはそれに相当する位置 メチオニン
143位またはそれに相当する位置 アルギニン
173位またはそれに相当する位置 リジン
188位またはそれに相当する位置 グリシン
189位またはそれに相当する位置 ロイシン
191位またはそれに相当する位置 プロリン
193位またはそれに相当する位置 トリプトファン
195位またはそれに相当する位置 アスパラギン酸
202位またはそれに相当する位置 バリン
206位またはそれに相当する位置 リジン
210位またはそれに相当する位置 トリプトファン
216位またはそれに相当する位置 プロリン
232位またはそれに相当する位置 チロシン
235位またはそれに相当する位置 グルタミン酸
244位またはそれに相当する位置 セリン
261位またはそれに相当する位置 ヒスチジン
278位またはそれに相当する位置 トリプトファン
このうち、ゲッケイジュ(またはCalifornia bay;Umbellularia californica)由来のアシルACPチオエステラーゼ(GenBank AAA34215.1)であって、中鎖脂肪酸特異的アシルACPチオエステラーゼの機能を有するものがより好ましい例として挙げられる。配列番号2で示される、Umbellularia californica由来のC12:0特異的アシルACPチオエステラーゼがさらに好ましい。
配列番号1に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド;
配列番号1に示すヌクレオチド配列と70%以上、好ましくは80%以上、より好ましくは85%以上、さらに好ましくは90%以上、なお好ましくは95%以上、なおより好ましくは98%以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つC12:0脂肪酸選択的アシルACPチオエステラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
配列番号1に示すヌクレオチド配列において1または複数個の塩基が欠失、置換、付加または挿入されたヌクレオチド配列からなり、且つC12:0脂肪酸選択的アシルACPチオエステラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;ならびに、
配列番号1に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つC12:0脂肪酸選択的アシルACPチオエステラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
配列番号3に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド;
配列番号3に示すヌクレオチド配列と70%以上、好ましくは80%以上、より好ましくは85%以上、さらに好ましくは90%以上、なお好ましくは95%以上、なおより好ましくは98%以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つC12:0脂肪酸選択的アシルACPチオエステラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
配列番号3に示すヌクレオチド配列において1または複数個の塩基が欠失、置換、付加または挿入されたヌクレオチド配列からなり、且つC12:0脂肪酸選択的アシルACPチオエステラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;ならびに、
配列番号3に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つC12:0脂肪酸選択的アシルACPチオエステラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
位置 アミノ酸残基
109位またはそれに相当する位置 プロリン
110位またはそれに相当する位置 ヒスチジン
148位またはそれに相当する位置 プロリン
151位またはそれに相当する位置 アルギニン
182位またはそれに相当する位置 グリシン
183位またはそれに相当する位置 グリシン
202位またはそれに相当する位置 アルギニン
204位またはそれに相当する位置 グリシン
205位またはそれに相当する位置 フェニルアラニン
209位またはそれに相当する位置 アラニン
217位またはそれに相当する位置 バリン
218位またはそれに相当する位置 プロリン
222位またはそれに相当する位置 フェニルアラニン
223位またはそれに相当する位置 グリシン
276位またはそれに相当する位置 グリシン
位置 アミノ酸残基
15位またはそれに相当する位置 アラニン
23位またはそれに相当する位置 イソロイシン
27位またはそれに相当する位置 バリン
29位またはそれに相当する位置 ロイシン
84位またはそれに相当する位置 チロシン
85位またはそれに相当する位置 フェニルアラニン
86位またはそれに相当する位置 プロリン
90位またはそれに相当する位置 バリン
101位またはそれに相当する位置 アルギニン
103位またはそれに相当する位置 チロシン
105位またはそれに相当する位置 フェニルアラニン
106位またはそれに相当する位置 グリシン
113位またはそれに相当する位置 ロイシン
114位またはそれに相当する位置 プロリン
115位またはそれに相当する位置 イソロイシン
139位またはそれに相当する位置 ロイシン
145位またはそれに相当する位置 フェニルアラニン
157位またはそれに相当する位置 ロイシン
158位またはそれに相当する位置 グリシン
161位またはそれに相当する位置 プロリン
164位またはそれに相当する位置 アルギニン
166位またはそれに相当する位置 セリン
170位またはそれに相当する位置 ロイシン
171位またはそれに相当する位置 ロイシン
180位またはそれに相当する位置 バリン
181位またはそれに相当する位置 プロリン
186位またはそれに相当する位置 グルタミン酸
188位またはそれに相当する位置 ロイシン
193位またはそれに相当する位置 グリシン
199位またはそれに相当する位置 ロイシン
206位またはそれに相当する位置 バリン
208位またはそれに相当する位置 ロイシン
213位またはそれに相当する位置 グリシン
214位またはそれに相当する位置 アラニン
216位またはそれに相当する位置 ロイシン
219位またはそれに相当する位置 バリン
228位またはそれに相当する位置 チロシン
266位またはそれに相当する位置 プロリン
268位またはそれに相当する位置 アルギニン
270位またはそれに相当する位置 プロリン
274位またはそれに相当する位置 バリン
275位またはそれに相当する位置 バリン
278位またはそれに相当する位置 プロリン
279位またはそれに相当する位置 イソロイシン
281位またはそれに相当する位置 バリン
324位またはそれに相当する位置 ロイシン
当該アシルACPチオエステラーゼをコードする遺伝子が、以下の(a)〜(c):
(a)配列番号4に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
(b)配列番号4に示すアミノ酸配列と70%以上、好ましくは80%以上、より好ましくは85%以上、さらに好ましくは90%以上、なお好ましくは95%以上、なおより好ましくは98%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つC12:0脂肪酸選択的アシルACPチオエステラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号4に示すアミノ酸配列において1または複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加または挿入されたアミノ酸配列を含み、且つC12:0脂肪酸選択的アシルACPチオエステラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
からなる群より選択され、且つ
当該ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2−4をコードする遺伝子が、以下の(d)〜(g):
(d)配列番号8に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド;
(e)配列番号8に示すヌクレオチド配列と70%以上、好ましくは80%以上、より好ましくは85%以上、さらに好ましくは90%以上、なお好ましくは95%以上、なおより好ましくは98%以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
(f)配列番号8に示すヌクレオチド配列において1または複数個の塩基が欠失、置換、付加または挿入されたヌクレオチド配列からなり、且つジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;および
(g)配列番号8に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
からなる群より選択される、組換えクラミドモナス属細胞。
(h)配列番号3に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド;
(i)配列番号3に示すヌクレオチド配列と70%以上、好ましくは80%以上、より好ましくは85%以上、さらに好ましくは90%以上、なお好ましくは95%以上、なおより好ましくは98%以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つC12:0脂肪酸選択的アシルACPチオエステラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
(j)配列番号3に示すヌクレオチド配列において1または複数個の塩基が欠失、置換、付加または挿入されたヌクレオチド配列からなり、且つC12:0脂肪酸選択的アシルACPチオエステラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;ならびに、
(k)配列番号3に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つC12:0脂肪酸選択的アシルACPチオエステラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
からなる群より選択される、<2>記載の組換えクラミドモナス属細胞。
当該アシルACPチオエステラーゼをコードする遺伝子が、以下の(a)〜(c):
(a)配列番号4に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
(b)配列番号4に示すアミノ酸配列と70%以上、好ましくは80%以上、より好ましくは85%以上、さらに好ましくは90%以上、なお好ましくは95%以上、なおより好ましくは98%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つC12:0脂肪酸選択的アシルACPチオエステラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号4に示すアミノ酸配列において1または複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加または挿入されたアミノ酸配列を含み、且つC12:0脂肪酸選択的アシルACPチオエステラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
からなる群より選択され、且つ
当該ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2−4をコードする遺伝子が、以下の(d)〜(g):
(d)配列番号8に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド;
(e)配列番号8に示すヌクレオチド配列と70%以上、好ましくは80%以上、より好ましくは85%以上、さらに好ましくは90%以上、なお好ましくは95%以上、なおより好ましくは98%以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
(f)配列番号8に示すヌクレオチド配列において1または複数個の塩基が欠失、置換、付加または挿入されたヌクレオチド配列からなり、且つジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;および
(g)配列番号8に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
からなる群より選択される、方法。
(h)配列番号3に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド;
(i)配列番号3に示すヌクレオチド配列と70%以上、好ましくは80%以上、より好ましくは85%以上、さらに好ましくは90%以上、なお好ましくは95%以上、なおより好ましくは98%以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つC12:0脂肪酸選択的アシルACPチオエステラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
(j)配列番号3に示すヌクレオチド配列において1または複数個の塩基が欠失、置換、付加または挿入されたヌクレオチド配列からなり、且つC12:0脂肪酸選択的アシルACPチオエステラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;ならびに、
(k)配列番号3に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つC12:0脂肪酸選択的アシルACPチオエステラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
からなる群より選択される、<7>記載の方法。
1)ゲッケイジュ(California bay:Umbellularia californica)由来アシルACPチオエステラーゼ遺伝子導入用ベクターの構築
ゲッケイジュ(California bay:Umbellularia californica)由来Acyl−ACPチオエステラーゼをコードする遺伝子(以下、BTE遺伝子)のポリヌクレオチド(配列番号3)を、GenScript社(Piscataway,New Jersey)の提供する受託合成サービスを利用して人工的に合成した。このポリヌクレオチドは、BTE遺伝子の全ヌクレオチド配列から葉緑体移行シグナルペプチドをコードする領域を除いたヌクレオチド配列を有する。人工合成する際に、配列番号3のポリヌクレオチド配列の塩基は、Chlamydomonas reinhardtiiのコドン使用頻度にあわせて本来のBTE遺伝子の塩基から変更された。
配列番号3のポリヌクレオチドをP−484プラスミド(Duke UniversityのChlamydomonas Centerより入手)のaadA遺伝子と置き換えることにより、プラスミドP−484+BTEを作製した。P−484−BTEを配列番号10および配列番号11のプライマー(表1)でPCR増幅し、増幅断片を、P−322(Chlamydomonas Center)のBamHIサイトに連結し、プラスミドP−322+BTEを作製した。P−322+BTEのEcoRIサイトにP−66(Chlamydomonas Center)よりEcoRIで切断したインサートを導入することにより、P−322+66+BTEを作製した。
Chlamydomonas reinhardtii(CC-125株、Duke UniversityのChlamydomonas Centerより入手)を、Tris−Acetate−Phosphate培地(TAP培地)を用いて、20℃、4000lux、明暗12時間周期、120rpmで旋回培養を行った。培養液50mLを遠心して細胞を回収し、液体窒素で凍結させた後、Total RNAを抽出した。RNA抽出には、RNeasy Plant mini kit(QIAGEN社製)を用いて抽出を行った。抽出したRNAからQuantiTect Rev. Transcription Kit(QIAGEN社製)を用いてcDNAの調製を行った。調製したcDNAを、表2に示すプライマーを用いたPCRにて増幅させてジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ(DGAT2−1〜2−4)遺伝子をクローニングした。PCR増幅では、DGAT2−1(配列番号5)には配列番号12および13のプライマー、DGAT2−2(配列番号6)には配列番号14および15のプライマー、DGAT2−3(配列番号7)には配列番号16および17のプライマー、DGAT2−4(配列番号8)には配列番号18および19のプライマーを使用した。
葉緑体ゲノムに存在するpsbA遺伝子(光化学系II反応中心コアタンパク質D1をコードする遺伝子)の欠損株であるChlamydomonas reinhardtii FUD7株(Chlamydomonas Center)を用いた。培養には、表3に記載のTris−Acetate−Phosphate培地(TAP培地)を用いた。液体培養する場合は20℃、明暗12時間周期、120rpmで旋回培養を行った。また、固体培養する場合は、TAP培地に終濃度2%になるようBacto寒天(日本ベクトン・ディッキンソン社製)を加えて調製したTAPプレート培地を用いて、20℃、明暗12時間周期にて静置培養を行った。
FUD7株をTAP培地にて培養して2〜6×106cells/mLまで増殖させた。細胞を遠心して回収し、1×108cells/mLになるように調製した。TAPプレート培地に懸濁した細胞500μLを均一に塗布した。上記1)で構築したプラスミドP−322+66+BTEを、タングステン粒子(B10、粒径1μm、株式会社アライドマテリアル)に結合させ、パーティクルガン(Bio−Rad社製)を用いて1100psiにて細胞に導入した。細胞をTAP寒天培地にて回復培養を行った後、細胞を表4に記載のHSM寒天培地にて培養した。目的の遺伝子が導入された細胞は、psbA遺伝子を有することにより光合成機能を回復し、HSM寒天培地にて生育可能になる。HSM寒天培地にて増殖した細胞を回収することにより、目的のアシルACPチオエステラーゼ遺伝子が導入された形質転換体を得た。
上記4)で得られた形質転換体を、TAP培地200mL、20℃、明暗12時間周期で、対数増殖期まで培養を行った。培養液25mLを遠心し、50mM Sucroseを含むTAP培地で細胞を洗浄し、250μLになるように濃縮した。細胞懸濁液250μLをキュベット(4mm gap)に入れ、熱変性した10mg/mL salmon spermDNA(5μL)と、線形化した2μgの上記2)で構築したプラスミド(pAphVIII+DGAT2−1〜4)のいずれかを混合し、15℃で10分間以上静置した。GenePulserII(BioRad社製)を用いて1550V/cm(620V)、500Ω、50μFの条件でパルスをかけ、キュベットごと15℃で1時間静置した。静置している間は、15分おきに混合し、遠心により細胞を回収し、細胞懸濁液を2枚の選択寒天培地(50μg/mLのパロモマイシンを含むTAPプレート培地)の上に広げた。光照射下で1〜2週間培養し、コロニーを取得した。これらのコロニーよりDNAを取得し、ゲノムPCRを行うことによってHsp70A/Rbcs2プロモーターおよびDGAT2遺伝子が形質転換体の核遺伝子に導入されているコロニーを選択することにより、アシルACPチオエステラーゼ遺伝子とDGAT2遺伝子とが導入された組換えクラミドモナス属株を取得した。
1)組換えクラミドモナス属からの脂質抽出とメチルエステル化
実施例1で作製した組換えC.reinhardtii株をTAP培地にて20℃、4000lux程度の光照射下、明暗12時間周期、120rpmで旋回培養した。定常期に達した後に、窒素成分を取り除いたTAP培地にて同条件にて培養を行った。培養液を遠心して得た沈殿画分を80℃にて約3時間乾燥させ、固形分を乾燥藻体として取得した。乾燥藻体の乾燥重量を測定後、0.5mLの1%食塩水に懸濁し、内部標準として5mg/mLの7−ペンタデカノンを10μL添加後、1mLのクロロホルムおよび1mLのメタノールを培養液に添加して激しく攪拌後30分間静置し、その後さらに0.5mLの1.5%KClを添加して攪拌後、遠心し、クロロホルム層を回収した。窒素にて乾固後、0.7mLの0.5M KOH−メタノール溶液を添加して70℃にて30分間恒温し、さらに1mLの14%三フッ化ホウ素溶液を添加し、80℃にて10分間恒温し、その後、ヘキサン、飽和食塩水を各1mL添加し、室温にて30分間静置後、ヘキサン層を回収し、後述するガスクロマトグラフィ(GC)分析用のサンプルとした。
上記でメチルエステル化したサンプルをGC分析した。使用したGCはカラム:DB1−MS(J&W scientific,Folsom,California)、分析装置:6890N(Agilent technology,SantaClara,California)を用いて、以下の条件にて行った:[カラムオーブン温度:100℃保持1分→100〜300℃(10℃/分昇温)→300℃保持5分(ポストラン2分)、注入口検出器温度:300℃、注入法:スプリットモード(スプリット比=100:1)、サンプル注入量1μL、カラム流速:0.5mL/minコンスタント、検出器:FID、キャリアガス:水素、メイクアップガス:ヘリウム]。GC解析により得られた波形データのピーク面積より、各脂肪酸のメチルエステル量を定量した。なお、各ピーク面積を内部標準である7−ペンタデカノンのピーク面積と比較することでサンプル間の補正を行い、解析に供したサンプル中に含まれる脂肪酸量を算出した。なお、各脂質に対応するGCのピークは、各脂肪酸の標準品のメチルエステルの保持時間(Retention Time、RT)、及び下記3)で述べるGC/MS解析により同定した。算出された各脂肪酸量の総脂肪酸量に占める割合を求めた。
GC分析に供したサンプルを、必要に応じてGC/マススペクトル(MS)分析にかけた。GC/マススペクトル(MS)分析は、キャピラリーカラム:DB1−MS、GC分析装置:7890A(Agilent technology)、MS分析装置:5975C(Agilent technology)を用いて、以下の条件にて行った:[カラムオーブン温度:100℃保持2分→100〜300℃(10℃/分昇温)→300℃保持5分(平衡時間2分、ポストラン320℃で5分)もしくは100℃保持2分→100〜200℃(10℃/分昇温)→200〜320℃(50℃/分昇温)→320℃保持5分(平衡時間2分、ポストラン320℃で5分)、注入口検出器温度:250℃、注入法:スプリットレスモード、サンプル注入量1μL、カラム流速:1mL/minコンスタント、検出器:FID、キャリアガス:水素、メイクアップガス:ヘリウム、溶媒待ち時間:7分もしくは3.5分、イオン化法:EI法、イオン源温度:250℃、インターフェース温度:300℃、測定モード:スキャンモード(m/z:20〜550若しくは10〜550)]。
TAGの定量はイアトロスキャン(三菱化学メディエンス)を用いて行った。上記1)で得た培養された組換えC.reinhardtii株の乾燥藻体を、乾燥重量を測定後、0.5mLの1%食塩水に懸濁し、1mLのクロロホルムおよび1mLのメタノールを添加して激しく攪拌した後30分間放置した。この溶液にさらに0.5mLの1.5%KClを添加して攪拌後、遠心し、クロロホルム層200μLを回収した。回収した液を窒素にて乾固後、クロロホルム10μLに溶解し、試料溶液を調製した。イアトロスキャンのクロマロッドの表面に1μL程度の試料溶液をスポットした。展開溶媒としてヘキサン:ジエチルエーテル:蟻酸=42:28:0.3を用いて試料溶液を分離後、クロマロッドの表面に吸着した展開溶媒を除去した。その後、イアトロスキャンにセットし、試料溶液中のTAG量を測定した。トリステアリンを1、2、4mg/mLに調製した溶液によって作成した検量線に基づき、測定したTAGの量を定量した。
各形質転換体における、総脂肪酸中のラウリン酸の割合を図1に示す。図1には、DGAT2−1、2−2、2−3または2−4を導入した形質転換体それぞれについて、最も高いC12/総脂肪酸比が得られた形質転換体の結果を示した。BTE遺伝子のみを導入した形質転換体、またはBTE遺伝子とDGAT2−1〜2−3遺伝子のいずれかとを導入した形質転換体に比べて、BTE遺伝子とDGAT2−4遺伝子を導入した形質転換体では、総脂肪酸中に占めるラウリン酸の割合が顕著に増加した。
BTE遺伝子のみを導入した形質転換体と、さらにDGAT2−4遺伝子を導入した形質転換体における、総脂肪酸に占める各種脂肪酸の割合を図2に示す。DGAT2−4遺伝子を導入した形質転換体では、BTE遺伝子のみを導入した形質転換体と比べてC12およびC14の中鎖脂肪酸の比率が増加していた。したがって、アシルACPチオエステラーゼおよびDGAT2−4の発現を強化した形質転換体では、中鎖脂肪酸(特にラウリン酸)の総脂肪酸に対する割合が高まることがわかった。
総脂肪酸量の変化、TAG量の変化を図3に示す。
Claims (12)
- アシルACPチオエステラーゼをコードする遺伝子と、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2−4をコードする遺伝子とが導入されている組換えクラミドモナス属細胞であって、
当該アシルACPチオエステラーゼをコードする遺伝子が、以下の(a)〜(c):
(a)配列番号4に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
(b)配列番号4に示すアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つC12:0脂肪酸選択的アシルACPチオエステラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号4に示すアミノ酸配列において1〜20個のアミノ酸が欠失、置換、付加または挿入されたアミノ酸配列を含み、且つC12:0脂肪酸選択的アシルACPチオエステラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
からなる群より選択され、且つ
当該ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2−4をコードする遺伝子が、以下の(d)〜(g):
(d)配列番号8に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド;
(e)配列番号8に示すヌクレオチド配列と90%以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
(f)配列番号8に示すヌクレオチド配列において1〜50個の塩基が欠失、置換、付加または挿入されたヌクレオチド配列からなり、且つジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;および
(g)配列番号8に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
からなる群より選択される、組換えクラミドモナス属細胞。 - 前記アシルACPチオエステラーゼをコードする遺伝子が、葉緑体に導入されている、請求項1記載の組換えクラミドモナス属細胞。
- 前記アシルACPチオエステラーゼをコードする遺伝子が、以下の(h)〜(k):
(h)配列番号3に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド;
(i)配列番号3に示すヌクレオチド配列と90%以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つC12:0脂肪酸選択的アシルACPチオエステラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
(j)配列番号3に示すヌクレオチド配列において1〜50個の塩基が欠失、置換、付加または挿入されたヌクレオチド配列からなり、且つC12:0脂肪酸選択的アシルACPチオエステラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;および、
(k)配列番号3に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つC12:0脂肪酸選択的アシルACPチオエステラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
からなる群より選択される、請求項2記載の組換えクラミドモナス属細胞。 - 前記ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2−4をコードする遺伝子が、Chlamydomonas reinhardtii由来の遺伝子である、請求項1〜3のいずれか1項記載の組換えクラミドモナス属細胞。
- 前記アシルACPチオエステラーゼをコードする遺伝子が、Umbellularia californica由来の遺伝子である、請求項1〜4のいずれか1項記載の組換えクラミドモナス属細胞。
- クラミドモナス属細胞に、アシルACPチオエステラーゼをコードする遺伝子と、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2−4をコードする遺伝子とを導入する工程を含む、組換えクラミドモナス属細胞の製造方法であって
当該アシルACPチオエステラーゼをコードする遺伝子が、以下の(a)〜(c):
(a)配列番号4に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
(b)配列番号4に示すアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つC12:0脂肪酸選択的アシルACPチオエステラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号4に示すアミノ酸配列において1〜20個のアミノ酸が欠失、置換、付加または挿入されたアミノ酸配列を含み、且つC12:0脂肪酸選択的アシルACPチオエステラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
からなる群より選択され、且つ
当該ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2−4をコードする遺伝子が、以下の(d)〜(g):
(d)配列番号8に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド;
(e)配列番号8に示すヌクレオチド配列と90%以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
(f)配列番号8に示すヌクレオチド配列において1〜50個の塩基が欠失、置換、付加または挿入されたヌクレオチド配列からなり、且つジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;および
(g)配列番号8に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
からなる群より選択される、方法。 - 前記アシルACPチオエステラーゼをコードする遺伝子が、葉緑体に導入される、請求項6記載の方法。
- 前記アシルACPチオエステラーゼをコードする遺伝子が、以下の(h)〜(k):
(h)配列番号3に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド;
(i)配列番号3に示すヌクレオチド配列と90%以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つC12:0脂肪酸選択的アシルACPチオエステラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
(j)配列番号3に示すヌクレオチド配列において1〜50個の塩基が欠失、置換、付加または挿入されたヌクレオチド配列からなり、且つC12:0脂肪酸選択的アシルACPチオエステラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;および、
(k)配列番号3に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つC12:0脂肪酸選択的アシルACPチオエステラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
からなる群より選択される、請求項7記載の方法。 - 前記ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2−4をコードする遺伝子が、Chlamydomonas reinhardtii由来の遺伝子である、請求項6〜8のいずれか1項記載の方法。
- 前記アシルACPチオエステラーゼをコードする遺伝子が、Umbellularia californica由来の遺伝子である、請求項6〜9のいずれか1項記載の方法。
- 請求項1〜5のいずれか1項記載の組換えクラミドモナス属細胞を用いる、ラウリン酸含有油脂の製造方法。
- 請求項1〜5のいずれか1項記載の組換えクラミドモナス属細胞により製造された油脂を用いる、ラウリン酸の製造方法。
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