JP6613731B2 - トリグリセリド生産性が改良された真核微細藻類遺伝子改変株及びその利用 - Google Patents
トリグリセリド生産性が改良された真核微細藻類遺伝子改変株及びその利用 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6613731B2 JP6613731B2 JP2015173161A JP2015173161A JP6613731B2 JP 6613731 B2 JP6613731 B2 JP 6613731B2 JP 2015173161 A JP2015173161 A JP 2015173161A JP 2015173161 A JP2015173161 A JP 2015173161A JP 6613731 B2 JP6613731 B2 JP 6613731B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- gene
- strain
- tag
- eukaryotic microalgae
- protein
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 title claims description 10
- UFTFJSFQGQCHQW-UHFFFAOYSA-N triformin Chemical compound O=COCC(OC=O)COC=O UFTFJSFQGQCHQW-UHFFFAOYSA-N 0.000 title description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 99
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 69
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 27
- 108010001348 Diacylglycerol O-acyltransferase Proteins 0.000 claims description 24
- 102000002148 Diacylglycerol O-acyltransferase Human genes 0.000 claims description 22
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 21
- 101150073246 AGL1 gene Proteins 0.000 claims description 19
- 241000195628 Chlorophyta Species 0.000 claims description 16
- 108700021044 acyl-ACP thioesterase Proteins 0.000 claims description 13
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 13
- 101000824318 Homo sapiens Protocadherin Fat 1 Proteins 0.000 claims description 12
- 102100022095 Protocadherin Fat 1 Human genes 0.000 claims description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 10
- DCXXMTOCNZCJGO-UHFFFAOYSA-N tristearoylglycerol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC)COC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC DCXXMTOCNZCJGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 241000134090 Coccomyxa <Trebouxiophyceae> Species 0.000 claims description 3
- 102000005744 Glycoside Hydrolases Human genes 0.000 claims description 3
- 108010031186 Glycoside Hydrolases Proteins 0.000 claims description 3
- 241000722234 Pseudococcus Species 0.000 claims description 3
- 241001140502 Pseudococcomyxa Species 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 5
- 102100035762 Diacylglycerol O-acyltransferase 2 Human genes 0.000 claims 2
- 101000930020 Homo sapiens Diacylglycerol O-acyltransferase 2 Proteins 0.000 claims 2
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 claims 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 45
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 34
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 33
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 25
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 23
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 23
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 23
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 22
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 20
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 19
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 17
- 101150041019 FAT1 gene Proteins 0.000 description 15
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 13
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 12
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 12
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 12
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 12
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 12
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 12
- 102100024295 Maltase-glucoamylase Human genes 0.000 description 11
- 108010028144 alpha-Glucosidases Proteins 0.000 description 11
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 11
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 11
- 101710146995 Acyl carrier protein Proteins 0.000 description 10
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 10
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 8
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 8
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 8
- 101150102653 Dgat2 gene Proteins 0.000 description 7
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 7
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 7
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 7
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 6
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N hexadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000003559 RNA-seq method Methods 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 5
- AWUCVROLDVIAJX-GSVOUGTGSA-N sn-glycerol 3-phosphate Chemical compound OC[C@@H](O)COP(O)(O)=O AWUCVROLDVIAJX-GSVOUGTGSA-N 0.000 description 5
- 241000195585 Chlamydomonas Species 0.000 description 4
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 4
- 241000224474 Nannochloropsis Species 0.000 description 4
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000003225 biodiesel Substances 0.000 description 4
- 239000002551 biofuel Substances 0.000 description 4
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 4
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 4
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 241000206761 Bacillariophyta Species 0.000 description 3
- -1 C10 and C12 Chemical class 0.000 description 3
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical group [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101710091951 Glycerol-3-phosphate acyltransferase Proteins 0.000 description 3
- 235000021314 Palmitic acid Nutrition 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- 108010084455 Zeocin Proteins 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 210000003763 chloroplast Anatomy 0.000 description 3
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 3
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 3
- 230000004136 fatty acid synthesis Effects 0.000 description 3
- 235000021588 free fatty acids Nutrition 0.000 description 3
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N iron Substances [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 3
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N n-Pentadecanoic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)=O WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 3
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 3
- CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N phleomycin D1 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC[C@@H](N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCCCNC(N)=N)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N 0.000 description 3
- 230000000243 photosynthetic effect Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N (E)-8-Octadecenoic acid Natural products CCCCCCCCCC=CCCCCCCC(O)=O WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PORPENFLTBBHSG-MGBGTMOVSA-N 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycerol-3-phosphate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(O)=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC PORPENFLTBBHSG-MGBGTMOVSA-N 0.000 description 2
- WRGQSWVCFNIUNZ-GDCKJWNLSA-N 1-oleoyl-sn-glycerol 3-phosphate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OC[C@@H](O)COP(O)(O)=O WRGQSWVCFNIUNZ-GDCKJWNLSA-N 0.000 description 2
- LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 20:1omega9c fatty acid Natural products CCCCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 9-Heptadecensaeure Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010016219 Acetyl-CoA carboxylase Proteins 0.000 description 2
- 102000000452 Acetyl-CoA carboxylase Human genes 0.000 description 2
- 241001467606 Bacillariophyceae Species 0.000 description 2
- 108010018763 Biotin carboxylase Proteins 0.000 description 2
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 102000057621 Glycerol kinases Human genes 0.000 description 2
- 108700016170 Glycerol kinases Proteins 0.000 description 2
- LTYOQGRJFJAKNA-KKIMTKSISA-N Malonyl CoA Natural products S(C(=O)CC(=O)O)CCNC(=O)CCNC(=O)[C@@H](O)C(CO[P@](=O)(O[P@](=O)(OC[C@H]1[C@@H](OP(=O)(O)O)[C@@H](O)[C@@H](n2c3ncnc(N)c3nc2)O1)O)O)(C)C LTYOQGRJFJAKNA-KKIMTKSISA-N 0.000 description 2
- ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N Oleic acid Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000005642 Oleic acid Substances 0.000 description 2
- 102000001107 Phosphatidate Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108010069394 Phosphatidate Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 108030002650 Phospholipid:diacylglycerol acyltransferases Proteins 0.000 description 2
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 2
- 244000025271 Umbellularia californica Species 0.000 description 2
- 230000035508 accumulation Effects 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N acetyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N 0.000 description 2
- AWUCVROLDVIAJX-UHFFFAOYSA-N alpha-glycerophosphate Natural products OCC(O)COP(O)(O)=O AWUCVROLDVIAJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LFYJSSARVMHQJB-QIXNEVBVSA-N bakuchiol Chemical compound CC(C)=CCC[C@@](C)(C=C)\C=C\C1=CC=C(O)C=C1 LFYJSSARVMHQJB-QIXNEVBVSA-N 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 125000001721 carboxyacetyl group Chemical group 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 2
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 2
- 150000001982 diacylglycerols Chemical class 0.000 description 2
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N isooleic acid Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCCC(O)=O QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000037356 lipid metabolism Effects 0.000 description 2
- LTYOQGRJFJAKNA-DVVLENMVSA-N malonyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)CC(O)=O)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 LTYOQGRJFJAKNA-DVVLENMVSA-N 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N oleic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 2
- MNBKLUUYKPBKDU-TZIIWEFPSA-N palmityl-coa Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 MNBKLUUYKPBKDU-TZIIWEFPSA-N 0.000 description 2
- 230000029553 photosynthesis Effects 0.000 description 2
- 238000010672 photosynthesis Methods 0.000 description 2
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 2
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 102100031251 1-acylglycerol-3-phosphate O-acyltransferase PNPLA3 Human genes 0.000 description 1
- 108010054662 2-acylglycerophosphate acyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 108020003589 5' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 108700037654 Acyl carrier protein (ACP) Proteins 0.000 description 1
- 102000048456 Acyl carrier protein (ACP) Human genes 0.000 description 1
- 241000196169 Ankistrodesmus Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M Bicarbonate Chemical compound OC([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010006654 Bleomycin Proteins 0.000 description 1
- 241001536324 Botryococcus Species 0.000 description 1
- 241000195597 Chlamydomonas reinhardtii Species 0.000 description 1
- 241000195649 Chlorella <Chlorellales> Species 0.000 description 1
- 241000131978 Choricystis Species 0.000 description 1
- 241000192700 Cyanobacteria Species 0.000 description 1
- 241001147476 Cyclotella Species 0.000 description 1
- 101150042222 DGAT1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100036869 Diacylglycerol O-acyltransferase 1 Human genes 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L EDTA disodium salt (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].OC(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC(O)=O)CC([O-])=O ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 101150083038 EF1A gene Proteins 0.000 description 1
- 241001369986 Eustigmataceae Species 0.000 description 1
- 241000224472 Eustigmatophyceae Species 0.000 description 1
- 108010087894 Fatty acid desaturases Proteins 0.000 description 1
- 102000009114 Fatty acid desaturases Human genes 0.000 description 1
- 241000692360 Fistulifera Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- UXDDRFCJKNROTO-UHFFFAOYSA-N Glycerol 1,2-diacetate Chemical compound CC(=O)OCC(CO)OC(C)=O UXDDRFCJKNROTO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000927974 Homo sapiens Diacylglycerol O-acyltransferase 1 Proteins 0.000 description 1
- 241001251903 Lobosphaera incisa Species 0.000 description 1
- 101000813110 Mus musculus Elongation of very long chain fatty acids protein 6 Proteins 0.000 description 1
- 241000195644 Neochloris Species 0.000 description 1
- 108010068204 Peptide Elongation Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000002508 Peptide Elongation Factors Human genes 0.000 description 1
- 241000206744 Phaeodactylum tricornutum Species 0.000 description 1
- 108050001185 Pleckstrin homology domains Proteins 0.000 description 1
- 102000010995 Pleckstrin homology domains Human genes 0.000 description 1
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 1
- 108010003581 Ribulose-bisphosphate carboxylase Proteins 0.000 description 1
- 241000195663 Scenedesmus Species 0.000 description 1
- 241000206733 Skeletonema Species 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 241000192707 Synechococcus Species 0.000 description 1
- 241000192589 Synechococcus elongatus PCC 7942 Species 0.000 description 1
- 241000196321 Tetraselmis Species 0.000 description 1
- 241001491691 Thalassiosira Species 0.000 description 1
- 241000736687 Trebouxia Species 0.000 description 1
- 241001293481 Trebouxiophyceae Species 0.000 description 1
- 241000162833 Trebouxiophyceae sp. MBIC11204 Species 0.000 description 1
- 108090000704 Tubulin Proteins 0.000 description 1
- 235000008674 Umbellularia californica Nutrition 0.000 description 1
- 241001464837 Viridiplantae Species 0.000 description 1
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 108010064926 acyl-CoA carboxylase Proteins 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- FRHBOQMZUOWXQL-UHFFFAOYSA-L ammonium ferric citrate Chemical compound [NH4+].[Fe+3].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O FRHBOQMZUOWXQL-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- PLKYGPRDCKGEJH-UHFFFAOYSA-N azane;2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid;iron Chemical compound N.[Fe].OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O PLKYGPRDCKGEJH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001561 bleomycin Drugs 0.000 description 1
- OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O bleomycin A2 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC=C(N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCC[S+](C)C)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O 0.000 description 1
- 125000004063 butyryl group Chemical group O=C([*])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 210000001726 chromosome structure Anatomy 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 239000012212 insulator Substances 0.000 description 1
- 239000004313 iron ammonium citrate Substances 0.000 description 1
- 235000000011 iron ammonium citrate Nutrition 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 235000021281 monounsaturated fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 125000001117 oleyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])/C([H])=C([H])\C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000004006 olive oil Substances 0.000 description 1
- 235000008390 olive oil Nutrition 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- GUUBJKMBDULZTE-UHFFFAOYSA-M potassium;2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid;hydroxide Chemical compound [OH-].[K+].OCCN1CCN(CCS(O)(=O)=O)CC1 GUUBJKMBDULZTE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 239000007320 rich medium Substances 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 235000021391 short chain fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 239000011232 storage material Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000011222 transcriptome analysis Methods 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 150000004669 very long chain fatty acids Chemical class 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
- C12P7/6436—Fatty acid esters
- C12P7/6445—Glycerides
- C12P7/6463—Glycerides obtained from glyceride producing microorganisms, e.g. single cell oil
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
- C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
- C12P7/6436—Fatty acid esters
- C12P7/6445—Glycerides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
- C12Y203/01—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
- C12Y203/0102—Diacylglycerol O-acyltransferase (2.3.1.20)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
- C12Y301/02—Thioester hydrolases (3.1.2)
- C12Y301/02014—Oleoyl-[acyl-carrier-protein] hydrolase (3.1.2.14), i.e. ACP-thioesterase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/0102—Alpha-glucosidase (3.2.1.20)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
本発明は、光合成によって生産された同化産物がより多くトリグリセリド(=トリアシルグリセロール(triacylglycerol): 以下、「TAG」と呼ぶ)合成に向かうように遺伝子操作された真核微細藻類及びその利用に関する。
単細胞性の光合成生物(以下、「微細藻類」と呼ぶ)が生産する脂肪酸、あるいは加水分解により脂肪酸を遊離するTAG等の化合物(以下、これらを総称して「脂質」と呼ぶ)を原料として、バイオディーゼル燃料をはじめとする工業・食品製品を生産する研究が、世界的に行われている。しかしながら現状では、脂質生産コストが高く、商業ベースでのバイオディーゼル燃料等の生産は困難である(非特許文献１）。そのため、バイオディーゼル燃料等の生産コスト削減のための更なる技術開発が続けられており、その1つに、微細藻類のTAG生産性の改良研究がある。
微細藻類の多くは、光合成によって生じる同化産物の一部をデンプンあるいはTAGとして蓄積する。デンプン及びTAGの蓄積量は微細藻類の種類によって異なり、また、同じ生物でも培養条件によって異なっている。光合成同化産物がデンプン及びTAGに変換される速度と、一旦合成された貯蔵物質が分解される速度とは、生物種及び培養条件によって異なっており、それがデンプン及びTAGの蓄積量の差異となって現れると考えられる。
TAGの原料は、グリセロール-3-リン酸と脂肪酸である。グリセロール-3-リン酸は、グリセロールとATPとを基質として、グリセロール・キナーゼ(glycerol kinase)によって合成される。一方、脂肪酸は、葉緑体内で生合成される。
脂肪酸生合成の最初の反応は、アシルCoAカルボキシラーゼ(acyl-CoA carboxylase)によって触媒され、アセチルCoAからマロニルCoAが作られる。マロニルCoAはアシルキャリアー・タンパク質(acyl carrier protein: ACP)と反応し、マロニルACPが作られる。マロニルACPは、アシル基がACPに結合したアシルACP(C = 2：アセチルACP、C = 4：ブチリルACP、等)と反応し、アシルACPの炭素鎖を2つ延長する。この延長反応を繰り返してアシル基の炭素鎖の長さが(最も一般的には)16になると、アシルACPチオエステラーゼ(acyl-ACP thioesterase)によってパルミチン酸(C16:0)とACPとに加水分解される。パルミチン酸はCoAと結合しパルミチルCoAとなって、葉緑体から小胞体に移動する。パルミチルCoAはさらに長鎖脂肪酸伸長酵素(very long chain fatty acid elongase)及びデサチュレース(fatty acid desaturase)の働きで、一価不飽和脂肪酸であるオレイン酸のCoAエステル(オレイルCoA：C18:1)が作られる。パルミチン酸とオレイン酸は、多くの生物で、最も含量が高い脂肪酸である。
TAGの生合成は小胞体膜上で行われる。先ず、グリセロール-3-リン酸アシル転移酵素(glycerol-3-phosphate acyltransferase)によって、グリセロール-3-リン酸のsn-1の位置にアシルCoAのアシル基が付加され、リゾフォスファチジン酸が生成する。次に、リゾフォスファチジン酸アシル転移酵素(acylglycerophosphate acyltransferase)によって、リゾフォスファチジン酸のsn-2の位置にアシルCoAのアシル基が付加されてホスファチジン酸が生成する。ホスファチジン酸はホスファチジン酸フォスファターゼ(phosphatidate phosphatase)によって脱リン酸化され、ジアシルグリセロールに変換された後、ジアシルグリセロールアシル転移酵素(diacylglycerol acyltransferase: DGAT)によってTAGが合成される。DGATは、進化的起源が異なる2つのファミリーに分類され、それぞれ、DGAT1及びDGAT2と呼ばれている。グリセロール-3-リン酸とアシルCoAからTAGが合成されるこの経路は、TGA合成のためのケネディー経路と称される。
このケネディー経路以外でもTAGは合成され、その一例がリン脂質：ジアシルグリセロールアシル転移酵素(phospholipid:diacylglycerol acyltransferase)による以下の反応である：
リン脂質＋1,2-ジアシルグリセロール＝リゾリン脂質＋TAG
遺伝子組換え技術を用いて、このTAG合成に関わる酵素活性を上昇させることにより、微細藻類の単位時間当たり及び単位受光面積当たりのTAG生産量(以降、「TAG生産性」と呼ぶ)を改良し、バイオディーゼル生産コストの削減に貢献しようという研究が既に幾つか行われている。
リン脂質＋1,2-ジアシルグリセロール＝リゾリン脂質＋TAG
遺伝子組換え技術を用いて、このTAG合成に関わる酵素活性を上昇させることにより、微細藻類の単位時間当たり及び単位受光面積当たりのTAG生産量(以降、「TAG生産性」と呼ぶ)を改良し、バイオディーゼル生産コストの削減に貢献しようという研究が既に幾つか行われている。
上記のケネディー経路の最後の酵素であるDGATをコードする遺伝子を高発現させることによってTAG生産性が上昇するという報告は数多く出されている。例えば、シアノバクテリア（Cyanobacteria）に属するシネココッカス・エロンガタス（Synechococcus elongatus）PCC 7942株にグラム陰性細菌アシネトバクター(Acinetobacler)由来のDGAT遺伝子を導入することにより、シネココッカスが約2倍のTAGを蓄積するようになった(特許文献１）。
特許文献２は、不等毛植物門(Heterokontophyta）・真正眼点藻綱(Eustigmataceae)に属するナンノクロロプシス(Nannochloropsis)に、DGAT、リン脂質：ジアシルグリセロールアシル転移酵素あるいはフォスファチジン酸フォスファターゼをコードする遺伝子を導入しTGA含量を上昇させることを開示する。しかしながら、当該特許文献では、これらの遺伝子導入の効果の詳細が実施例には示されていない。
プレクストリン相同(Pleckstrin-homology)ドメインを持つ様々な生物由来のDGAT1遺伝子をナンノクロロプシスに導入したところ、形質転換体の脂質含量は野生株よりも増加した(特許文献３)。
ナンノクロロプシスにマウス由来のDGATを導入したところ、TAG含量が増加した(特許文献４)。
緑色植物亜界・緑藻植物門(Chlorophyta：以下、「緑藻」と呼ぶ)に属するクラミドモナス(Chlamydomonas reinhardtii)には、上記DGAT2の遺伝子が複数存在するが(相同遺伝子)、これら相同遺伝子をクラミドモナス中で高発現させても、脂質含量の増加は認められなかった。一方、クラミドモナスのDGAT2相同遺伝子の1つを酵母で発現させると、酵母の形質転換体は、野生株酵母よりも高いTAG生産性を示した(非特許文献２）。
不等毛植物門・珪藻綱(Bacillariophyceae)のフェオダクチラム(Phaeodactylum tricornutum)のDGAT2をクローン化し、同じ株内で高発現させると、この株のTAG生産性が上昇した（非特許文献３及び４）。
TGA合成のためのケネディー経路の最初の酵素であるグリセロール-3-リン酸アシル転移酵素をコードする遺伝子を、緑藻であるロボスフェラ(Lobosphaera incisa)より分離し、クラミドモナスに導入・発現させたところ、TAG生産性は顕著に上昇した（非特許文献５）。
また、上記のグリセロール-3-リン酸アシル転移酵素の基質であるグリセロール-3-リン酸を合成するグリセロール・キナーゼを、珪藻フィツリフェラ(Fistulifera solaris)JPCC DA0580株内で高発現させることにより、TAG生産性がわずかであるが増加した(非特許文献６）。
一方、大腸菌において、脂肪酸合成の初発酵素であるアセチルCoAカルボキシラーゼ(Acetyl-CoA carboxylase)遺伝子とアシルACPチオエステラーゼ遺伝子とを高発現させると、遊離脂肪酸含量が増加することが報告されている(非特許文献７）。
しかし、多くの研究において、アシルACPチオエステラーゼ遺伝子は、一般的な長さの炭素鎖を持つ脂肪酸(C16とC18)ではなく、やや短い脂肪酸(C10、C12とC14)の合成を促進するために使用されている。クスノキ科の植物であるUmbellularia californicaの種子には、C10やC12等の脂肪酸を含む脂質が蓄積され、それは、この植物の持つC12の炭素鎖を持つアシルACPを加水分解するアシルACPチオエステラーゼによることが明らかになっている。この、やや短い脂肪酸を加水分解するという基質特異性を持つU. californicaのアシルACPチオエステラーゼ遺伝子のcDNAを大腸菌に導入し、高発現させたところ、C12及びC14の遊離脂肪酸が合成され、細胞外に排出された(非特許文献８）。
緑藻クラミドモナスに、アシルACPチオエステラーゼをコードする遺伝子と、ジアシルグリセロールアシル転移酵素(DGAT2)をコードする遺伝子を導入することにより、C12脂肪酸の割合を増加させる研究が開示されている(特許文献５）。しかし、この組換え体における乾燥重量当たりのTAGの蓄積は最大で2％程度、遊離脂肪酸を含めても7％以下であった。
ところで、緑藻・トレボキシア藻(Trebouxiophyceae)綱に属するシュードココミクサ(Pseudococcomyxa)sp. KJ株(以下、「KJ株」と呼ぶ)は、温泉水より分離されたTAG生産性が非常に高い単細胞性緑藻であり(特許文献６）、特許文献７に示された開放系培養システムで培養できる。
Quinn JC, Davis R.（2015）The potentials and challenges of algae based biofuels: a review of the techno-economic, life cycle, and resource assessment modeling. Bioresour Technol. 184: 444-452.
Hung C-H, Ho M-Y, Kanehara K,Nakamura Y. (2013) Functional study of diacylglycerol acyltransferase type 2 family in Chlamydomonas reinhardtii. FEBS Lett. 587: 2364-2370.
Niu Y-F, Zhang M-H, Li D-W, Yang W-D, Liu J-S, Bai W-B,Li H-Y. (2013) Improvement of neutral lipid and polyunsaturated fatty acid biosynthesis by overexpressing a type 2 diacylglycerol acyltransferase in marine diatom Phaeodactylum tricornutum. Mar. Drugs 11: 4558-4569.
Xue J, Niu YF, Huang T, Yang WD, Liu JS, Li HY. (2015) Genetic improvement of the microalga Phaeodactylum tricornutum for boosting neutral lipid accumulation. Metab Eng. 27: 1-9.
Iskandarov U, Sitnik S, Shtaida N, Didi-Cohen S. Leu S, Khozin-Goldberg I, Cohen Z, Boussiba S. (2015) Cloning and characterization of a GPAT-like gene from the microalga Lobosphaera incisa (Trebouxiophyceae): overexpression in Chlamydomonas reinhardtii enhances TAG production. J Appl Phycol DOI 10.1007/s10811-015-0634-1.
Muto M, Tanaka M, Liang Y, Yoshino T, Matsumoto M, Tanaka T. (2015) Enhancement of glycerol metabolism in the oleaginous marine diatom Fistulifera solaris JPCC DA0580 to improve triacylglycerol productivity. Biotechnol Biofuels.8(1):4. doi: 10.1186/s13068-014-0184-9.
Davis MS, Solbiati J, Cronan JE Jr. (2000) Overproduction of acetyl-CoA carboxylase activity increases the rate of fatty acid biosynthesis in Escherichia coli. J Biol Chem. 275:28593-28598.
Voelker TA, Davies HM. Alteration of the specificity and regulation of fatty acid synthesis of Escherichia coli by expression of a plant medium-chain acylacyl Carrier protein thioesterase. J Bacteriol 1994;176:7320-737.
上述のように、KJ株は屋外での大量培養に適した株であり、脂質の商業生産の原料として最も有望な株の1つであると言える。しかしながら、そのTAG生産性を更に改良し、TAG生産コストを削減することが望まれていた。
そこで、本発明は、TAG生産性が改良された、KJ株を含む真核微細藻類を遺伝子操作によって作製し、当該真核微細藻類遺伝子改変株を利用したTAG生産方法を提供することを目的とする。
上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、KJ株において、3つの遺伝子、すなわち、(i)デンプンの分解に関与しているアルファ・グリコシダーゼ(alpha-glucosidase: AGL1)をコードする遺伝子、(ii)葉緑体内でアシルACPとして合成される脂肪酸を加水分解し、小胞体上でのTAG合成経路に脂肪酸を供給するアシルACPチオエステラーゼ(acyl-ACP thioesterase: FAT1)をコードする遺伝子、及び(iii)TAG合成経路の最終段階の酵素であるDGAT2をコードする相同遺伝子の1つ（DGAT2d）、の発現が、TAG合成時に最も強く誘導されることを明らかにした。更に、これらの3つの遺伝子を適当なプロモーターの下流にクローン化し、KJ株に導入したところ、形質転換体のTAG生産性が有意に改良され、本発明を完成するに至った。これらの3つの遺伝子は微細藻類の光合成同化産物の代謝に広く関わる酵素であり、KJ株で得られたこの結果は、他の多くの真核微細藻類でも同様に再現できると考えられる。
すなわち、本発明は以下を包含する。
（１）AGL1タンパク質をコードする遺伝子を高発現させた真核微細藻類遺伝子改変株であって、親株と比較してTAG生産性が向上しており、前記AGL1タンパク質が配列番号４に示すアミノ酸配列と少なくとも50％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つアルファ・グリコシダーゼ活性を有するタンパク質である、前記真核微細藻類遺伝子改変株。
（２）さらに、FAT1タンパク質をコードする遺伝子及び/又はDGAT2タンパク質をコードする遺伝子を高発現させた、（１）記載の真核微細藻類遺伝子改変株であって、前記FAT1タンパク質が配列番号８に示すアミノ酸配列と少なくとも50％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つアシルACPチオエステラーゼ活性を有するタンパク質であり、前記DGAT2タンパク質が配列番号１２に示すアミノ酸配列と少なくとも50％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つジアシルグリセロールアシル転移酵素活性を有するタンパク質である、前記真核微細藻類遺伝子改変株。
（３）前記遺伝子が、遺伝子高発現を担保するプロモーターに機能的に連結されている、（１）又は（２）記載の真核微細藻類遺伝子改変株。
（４）トレボキシア藻網に属する、（１）〜（３）のいずれか１記載の真核微細藻類遺伝子改変株。
（５）コッコミクサ(Coccomyxa)属又はシュードコッコミクサ(Pseudococcomyxa)属に属する、（４）記載の真核微細藻類遺伝子改変株。
（６）前記遺伝子が、緑藻に属する株に由来する、（１）〜（５）のいずれか１記載の真核微細藻類遺伝子改変株。
（７）前記遺伝子が、トレボキシア藻網に属する株に由来する、（６）記載の真核微細藻類遺伝子改変株。
（８）前記遺伝子が、コッコミクサ属又はシュードコッコミクサ属に属する株に由来する、（７）記載の真核微細藻類遺伝子改変株。
（９）（１）〜（８）のいずれか１記載の真核微細藻類遺伝子改変株を培養する工程を含む、TAG生産方法。
（１）AGL1タンパク質をコードする遺伝子を高発現させた真核微細藻類遺伝子改変株であって、親株と比較してTAG生産性が向上しており、前記AGL1タンパク質が配列番号４に示すアミノ酸配列と少なくとも50％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つアルファ・グリコシダーゼ活性を有するタンパク質である、前記真核微細藻類遺伝子改変株。
（２）さらに、FAT1タンパク質をコードする遺伝子及び/又はDGAT2タンパク質をコードする遺伝子を高発現させた、（１）記載の真核微細藻類遺伝子改変株であって、前記FAT1タンパク質が配列番号８に示すアミノ酸配列と少なくとも50％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つアシルACPチオエステラーゼ活性を有するタンパク質であり、前記DGAT2タンパク質が配列番号１２に示すアミノ酸配列と少なくとも50％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つジアシルグリセロールアシル転移酵素活性を有するタンパク質である、前記真核微細藻類遺伝子改変株。
（３）前記遺伝子が、遺伝子高発現を担保するプロモーターに機能的に連結されている、（１）又は（２）記載の真核微細藻類遺伝子改変株。
（４）トレボキシア藻網に属する、（１）〜（３）のいずれか１記載の真核微細藻類遺伝子改変株。
（５）コッコミクサ(Coccomyxa)属又はシュードコッコミクサ(Pseudococcomyxa)属に属する、（４）記載の真核微細藻類遺伝子改変株。
（６）前記遺伝子が、緑藻に属する株に由来する、（１）〜（５）のいずれか１記載の真核微細藻類遺伝子改変株。
（７）前記遺伝子が、トレボキシア藻網に属する株に由来する、（６）記載の真核微細藻類遺伝子改変株。
（８）前記遺伝子が、コッコミクサ属又はシュードコッコミクサ属に属する株に由来する、（７）記載の真核微細藻類遺伝子改変株。
（９）（１）〜（８）のいずれか１記載の真核微細藻類遺伝子改変株を培養する工程を含む、TAG生産方法。
本発明により、TAG生産性が向上した真核微細藻類遺伝子改変株を作出することが可能となる。また、本発明に係る真核微細藻類遺伝子改変株を培養することにより、バイオ燃料等に供する脂質の生産コストを大幅に削減することが可能となる。
本発明は、AGL1遺伝子、又はAGL1遺伝子に加えてさらにFAT1遺伝子及び/若しくはDGAT2遺伝子を、真核微細藻類野生株又は当該野生株に由来する変異株に導入(以下、遺伝子導入される株を「親株」と呼ぶ)した結果、TAG生産性が親株よりも有意に(例えば15％以上、好ましくは30％以上、特に好ましくは45％以上)向上した真核微細藻類遺伝子改変株に関する。
真核微細藻類由来のTAGを原料としたバイオ燃料等の生産コストを削減するための最重要課題の一つは、真核微細藻類のTAG生産性の大幅向上である。本発明者等は、KJ株由来のAGL1タンパク質、FAT1タンパク質及び/又はDGAT2タンパク質をコードする遺伝子をKJ株で高発現させることにより、この緑藻のTAG生産性を大幅に改善できることを見出し、本発明を完成するに至った。
上記知見から、遺伝子操作によって、AGL1遺伝子、又はAGL1遺伝子に加えてさらにFAT1遺伝子及び/若しくはDGAT2遺伝子(以下、これらの遺伝子を合わせて「本発明に係る遺伝子」と呼ぶ場合がある)を高発現させることによって真核微細藻類のTAG生産性を向上させること、及び、TAG生産性向上株を培養することにより、バイオ燃料等に供するTAGの生産コストを大幅に削減することが可能となる。
本発明において、真核微細藻類としては、緑藻、珪藻(diatom又はBacillariophyceae)、真正眼点藻綱(Eustigmatophyceae)等に属する真核微細藻類を挙げることができる。
緑藻としては、例えばトレボキシア藻網に属する緑藻が挙げられる。トレボキシア藻網に属する緑藻としては、例えば、トレボキシア(Trebouxia)属、クロレラ(Chlorella)属、ボトリオコッカス(Botryococcus)属、コリシスチス(Choricystis)属、コッコミクサ(Coccomyxa)属、シュードコッコミクサ(Pseudococcomyxa)属に属する緑藻が挙げられる。トレボキシア藻綱に属する具体的な菌株としては、KJ株が挙げられる。KJ株は、平成25年(2013年)6月4日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許生物寄託センター(NITE-IPOD)(千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 120号室）に受託番号FERM P-22254として寄託され、さらに平成27年(2015年)6月2日付けで受託番号FERM BP-22254としてブダペスト条約に基づく国際寄託へ移管されている。
トレボキシア藻網に属する緑藻以外の緑藻としては、例えばテトラセルミス(Tetraselmis)属、アンキストロデスムス(Ankistrodesmus)属、ドラニエラ(Dunalliella)属、ネオクロリス(Neochloris)属、クラミドモナス属、イカダモ(=セネデスムス：Scenedesmus)属等に属する緑藻が挙げられる。
更に珪藻としては、フィストゥリフェラ(Fistulifera)属、フェオダクチラム属、タラシオシラ(Thalassiosira)属、シクロテラ(Cyclotella)属、シリンドロティカ(Cylindrotheca)属、スケレトネマ(Skeletonema)属等に属する真核微細藻類を挙げることができる。さらに、真正眼点藻綱としては、ナンノクロロプシス属が挙げられる。
本発明においては、上述の真核微細藻類を親株として、本発明に係る遺伝子を高発現させることで、本発明に係る真核微細藻類遺伝子改変株を得ることができる。
本発明において、AGL1遺伝子としては、例えばKJ株由来のAGL1遺伝子(遺伝子塩基配列：配列番号１、mRNA塩基配列：配列番号２、アミノ酸配列：配列番号３)又はその相同体が挙げられる。具体的には、AGL1遺伝子としては、配列番号４に示すアミノ酸配列(すなわち、配列番号３における215番目〜783番目のアミノ酸配列に相当する保存性の高いアミノ酸配列)と少なくとも50％、好ましくは、少なくとも65％、特に好ましくは、少なくとも80％、最も好ましくは、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、100％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つアルファ・グリコシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。また、AGL1遺伝子としては、配列番号３に示すアミノ酸配列と少なくとも50％、好ましくは、少なくとも65％、特に好ましくは、少なくとも80％、最も好ましくは、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、100％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つアルファ・グリコシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。ここで、アルファ・グリコシダーゼ活性とは、デンプンを非還元末端から加水分解し、D-グルコースを切り出す酵素活性を意味する。
FAT1遺伝子としては、例えばKJ株由来のFAT1遺伝子(遺伝子塩基配列：配列番号５、mRNA塩基配列：配列番号６、アミノ酸配列：配列番号７)又はその相同体が挙げられる。具体的には、FAT1遺伝子としては、配列番号８に示すアミノ酸配列(すなわち、配列番号７における78番目〜283番目のアミノ酸配列に相当する保存性の高いアミノ酸配列)と少なくとも50％、好ましくは、少なくとも65％、特に好ましくは、少なくとも80％、最も好ましくは、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、100％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つアシルACPチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。また、FAT1遺伝子としては、配列番号７に示すアミノ酸配列と少なくとも50％、好ましくは、少なくとも65％、特に好ましくは、少なくとも80％、最も好ましくは、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、100％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つアシルACPチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。ここで、アシルACPチオエステラーゼ活性とは、アシル-ACPのチオエステル結合を加水分解する酵素活性を意味する。
DGAT2遺伝子としては、例えばKJ株由来のDGAT2d遺伝子(遺伝子塩基配列：配列番号９、mRNA塩基配列：配列番号１０、アミノ酸配列：配列番号１１)又はその相同体が挙げられる。具体的には、DGAT2遺伝子としては、配列番号１２に示すアミノ酸配列(すなわち、配列番号１１における123番目〜322番目のアミノ酸配列に相当する保存性の高いアミノ酸配列)と少なくとも50％、好ましくは、少なくとも65％、特に好ましくは、少なくとも80％、最も好ましくは、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、100％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つジアシルグリセロールアシル転移酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。また、DGAT2遺伝子としては、配列番号１１に示すアミノ酸配列と少なくとも50％、好ましくは、少なくとも65％、特に好ましくは、少なくとも80％、最も好ましくは、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、100％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つジアシルグリセロールアシル転移酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。ここで、ジアシルグリセロールアシル転移酵素活性とは、アシルCoAに由来するアシル基がジアシルグリセロールに付加し、TAGが合成される酵素活性を意味する。
本発明に係る遺伝子は、例えば、上記で説明した緑藻に属する株、好ましくはトレボキシア藻網に属する株、特に好ましくはコッコミクサ属又はシュードコッコミクサ属に属する株に由来するものであってよい。
また、本発明においては、好ましくは、AGL1遺伝子、FAT1遺伝子及びDGAT2遺伝子のうち2つ又は3つ全てを高発現させる。
本発明に係る遺伝子によりコードされるタンパク質を真核微細藻類細胞内で高発現させるための多くの方法が存在する。最も一般的な方法は、高発現させたい遺伝子に機能的に連結させた(例えば、当該遺伝子の上流に)遺伝子高発現を担保するプロモーター(構成的に高発現するプロモーター)を配したコンストラクトを試験管内で構築し、これを宿主に導入する方法である。目的によっては、強度と特性(構成的又は誘導性)の異なるプロモーターを使用することができる。
転写後、mRNA前駆体はキャッピング、スプライシング、ポリ(A)付加等の転写後修飾を受けた後、核より細胞質に移行する。この転写後修飾の効率を上げて遺伝子を高発現させる試みは、プロモーターの利用ほどには行われていない。
一方、mRNAの翻訳効率の改良については、複数の技術が存在する。翻訳開始の効率は開始コドンより上流の配列(5'-UTR)に影響される(Kim et al., 2014, Nucleic Acids Res, 42, 485)ので、5'-UTR配列の最適化で翻訳効率を改良することが可能である。また、mRNAのコドン使用頻度を最適化することによって高発現を達成する手法は広く使われている。すなわち、コドン最適化した遺伝子を試験管内で作製し、これを宿主に導入することによって翻訳されるタンパク質の量を増加させることができる。
以下に述べるように、KJ株の本発明に係る遺伝子は、窒素欠乏又は塩ストレス等によって誘導される。当該遺伝子の発現を正又は負に制御する転写因子によって、この誘導が制御されていると考えられる。この転写因子を同定しその活性化の機構を明らかにすることで、その機構を利用した本発明に係る遺伝子の高発現を達成することができる。一般に、高発現させたい遺伝子がある転写因子によって正に制御されている場合、この転写因子を高発現させることで、目的遺伝子も高発現させることができる。一方、高発現させたい遺伝子がある転写因子によって負に制御されている場合は、逆に、この負の転写因子の発現又は活性を失くすことで、目的遺伝子の高発現を達成させることができる。あるいは、この転写因子を活性化又は不活性化するためのシグナル伝達系を操作することによっても、目的遺伝子の高発現を達成できる。
近年、遺伝子の発現が周辺の染色体構造によって正及び負に制御されることが次第に明らかになってきた。このことから、高発現させたい遺伝子周辺の染色体構造を、例えばインスレーターを導入することによって変化させ、遺伝子の高発現を達成することができる。
具体的な例として、下記の実施例に示すように、本発明に係る遺伝子を強力なプロモーター(例えば、KJ株由来のEF1α遺伝子のプロモーター(配列番号１３))の下流にクローン化し、それをKJ株等の真核微細藻類に導入することによって本発明に係る真核微細藻類遺伝子改変株を作製する方法である。
なお、本発明に係る真核微細藻類遺伝子改変株の例として、実施例に示す、KJ株に由来する本発明に係る遺伝子3つ全てをKJ株において高発現させたKJoxAFD-41417株が、平成27年(2015年)8月27日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許生物寄託センター(NITE-IPOD)(千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 120号室）に受託番号FERM P-22294として寄託され、さらに受託番号FERM BP-22294としてブダペスト条約に基づく国際寄託へ移管されている。
さらに、本発明は、以上に説明した本発明に係る真核微細藻類遺伝子改変株を大量培養し、TAGを生産する方法である。大量培養法としては、既に確立されている特許文献７に記載の培養法等を用いることができる。具体的には、尿素を窒素源とし、pHが4以下である培地を用いて、微細藻類を培養する方法である。この培養方法によれば、窒素源を尿素とすることで、窒素分消費によるpHの変動は最小限となる。また、pH4以下の培養液中にCO2を導入しても重炭酸イオンがほとんど生じないので、培養液のpHが変動しにくい特徴もある。このように培養液のpHを安定的に4以下に保つことが出来るので、他の微細藻類や原生生物の増殖を抑制することができる。
培養後、例えば培養物からヘキサン抽出等によって、TAGを含む脂質を得ることができる。
培養後、例えば培養物からヘキサン抽出等によって、TAGを含む脂質を得ることができる。
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
なお、以下の実施例において、AGL1遺伝子は、KJ株由来のAGL1遺伝子(遺伝子塩基配列：配列番号１、mRNA塩基配列：配列番号２、アミノ酸配列：配列番号３)であり、FAT1遺伝子は、KJ株由来のFAT1遺伝子(遺伝子塩基配列：配列番号５、mRNA塩基配列：配列番号６、アミノ酸配列：配列番号７)であり、且つDGAT2遺伝子は、KJ株由来のDGAT2d遺伝子(遺伝子塩基配列：配列番号９、mRNA塩基配列：配列番号１０、アミノ酸配列：配列番号１１)である。
〔実施例１〕TAG生産性に関与する遺伝子のRNA-seqによる解析
多くの微細藻類では、窒素欠乏条件で、あるいはそれに加えNaClを100 mM程度培地に添加することによって、TAG生産を促進することができる。KJ株及びKJ株に近縁のシュードコリシスティス・エリプソイディア(Pseudochoricystis ellipsoidea)Obi株（以下、「Obi株」と呼ぶ： Satoh et al., 2010, J Jpn Inst Energ, 89, 909)においても、窒素欠乏条件下での培養、及びNaCl添加後の培養の双方において、TAG含有量の増加が見られ、一方でデンプンの蓄積量は減少した。100 mM NaCl添加後のKJ株培養での増殖、TAG及びデンプン含有量の変化を図１に示す。
多くの微細藻類では、窒素欠乏条件で、あるいはそれに加えNaClを100 mM程度培地に添加することによって、TAG生産を促進することができる。KJ株及びKJ株に近縁のシュードコリシスティス・エリプソイディア(Pseudochoricystis ellipsoidea)Obi株（以下、「Obi株」と呼ぶ： Satoh et al., 2010, J Jpn Inst Energ, 89, 909)においても、窒素欠乏条件下での培養、及びNaCl添加後の培養の双方において、TAG含有量の増加が見られ、一方でデンプンの蓄積量は減少した。100 mM NaCl添加後のKJ株培養での増殖、TAG及びデンプン含有量の変化を図１に示す。
具体的には、KJ株を、A6培地［2.5 mM (NH2)2CO, 378 μM (NH4)2SO4, 405 μM MgSO4, 265 μM KH2PO4, 264 μM K2HPO4, 61.2 μM CaCl2, 1.20 μM CuSO4, 1.13 μM H3BO3, 1.04 μM ZnSO4, 0.622 μM MnSO4, 0.294 μM CoCl2, 12.4 nM Na2MoO4, 0.4% (v/v) Fe solution (3 g/L citric acid, 4.9 g/L ammonium ferric citrate, 0.5 g/L EDTA-2Na)］を滅菌水で2倍に希釈した培地（1/2 A6培地）を用いた培養液でOD750 = 3になるまで培養し、NaClを0あるいは100 mM添加してから0時間後、24時間後、72時間後のサンプルの、細胞乾燥重量(g/L)と、細胞乾燥重量当たりのTAG重量およびデンプン重量(％DW)とを測定した。図１において、黒塗りの棒グラフは、NaCl添加無し、白塗りの棒グラフは100 mM NaCl添加での結果である。油分含量測定はNMRを用いて以下の条件で行った。細胞を8,000 rpm、5分以上の遠心分離で収穫し、凍結乾燥させた後、40 mg程度を量りとり、Oxford Instrumets社製モデルMQC油分測定装置で単位細胞乾燥重量当たりの油分含量を測定した。検量線は、日本薬局方のオリーブ油を標準物質として作成した。
図１に示すように、NaCl添加によって増殖はわずかに促進された。一方、TAG含量は有意に増加し、デンプン含量は有意に減少した。
また、植物の代謝経路データベース(http://www.plantcyc.org/)を利用して、脂質代謝やデンプン代謝に関わる酵素のアミノ酸配列を得た。これらのアミノ酸配列をqueryとして、KJ株やObi株のゲノム配列あるいはトランスクリプトーム解析(RNA-seq)で得られたmRNA配列に対してtblastn検索を行い、KJ株及びObi株の脂質代謝やデンプン代謝に関わる酵素のアミノ酸配列とその遺伝子とを同定した。また、それらの遺伝子の発現量と発現変化をRNA-seq結果を用いて解析した。
その結果、NaCl添加によって、デンプンの分解に関わるアルファ・グルコシダーゼ(AGL1)遺伝子が、KJ株、Obi株とで共通して強く発現誘導されることが分かった。また、脂肪酸合成の最終段階で働くアシルACPチオエステラーゼ(FAT1)遺伝子と、TAG合成のためのケネディー経路の最終段階で働くジアシルグリセロール・アシル転移酵素(DGAT)の同義遺伝子の一つであるDGAT2dの発現も、NaCl添加によって強く誘導されていた。
図２に、NaClを0及び100 mM添加した時の、KJ株のAGL1、FAT1、DGAT2d遺伝子発現を示す。具体的には、KJ株を、図１と同様に1/2 A6培地を用いた培養液でOD750 = 3になるまで培養し、NaClを0あるいは100 mM添加してから0時間後、24時間後、48時間後のサンプルのRNA-seqによる発現量を解析した。図２において、グラフの縦軸はFPKM(Fragments Per Kilobase of transcript per Million mapped reads)である。FAT1遺伝子、DGAT2d遺伝子、AGL1遺伝子の発現は、NaCl添加無しでも、培養時間が経過するにしたがって増加したが、NaClを添加した場合は、さらにその発現量が増加した。NaCl添加無しの条件での遺伝子発現増加は、おそらく培地内の窒素分濃度の減少によって起こっていると考えられる。
また、窒素欠乏条件下でも、これらの遺伝子は、同様に誘導されていた(図３)。具体的には、KJ株を窒素十分培地(MA5)で培養後、窒素欠乏培地(MA5-N)に移し、12、24、72、144時間後にサンプリングを行ってRNA-seqにより遺伝子発現量を調べた。図３において、グラフの縦軸はFPKM(Fragments Per Kilobase of transcript per Million mapped reads)の平均値(N=2)である。MA5の組成は、18 mM NaNO3, 0.4 mM MgSO4, 60 μM CaCl2, 0.26 mM KH2PO4, 0.26 mM K2HPO4, 20 mM HEPES-KOH (pH 7.0), 0.4％ (v/v) Fe solution, 0.1％ (v/v) Trace elementsである。この培地作製に用いたストック溶液の組成は、Fe solutionが、3 g /L, citric acid, 4.9 g/L ammonium iron citrate, 0.5 g /L, EDTAであり、trace elementsが、70 mg/L H3BO3, 150 mg/L MnSO4・5H2O, 300 mg/L ZnSO4・7H2O, 300 mg/L CuSO4・5H2O, 70 mg/L CoCl2・6H2O, 3 mg/L Na2MoO4である。MA5-NではNaNO3を加えず、NaClをNa+の濃度が同じになるように加えたものを使用した。
これらの遺伝子は、それぞれ、脂肪酸の合成、TAGの合成、デンプンの分解の最終段階で働く酵素をコードしているため、これらの遺伝子を高発現させることによって、TAG生産性がより向上した株が得られるのではないかと考え、高発現株を作製することとした。
〔実施例２〕AGL1遺伝子、FAT1遺伝子、DGAT2d遺伝子のcDNA高発現株の作製
KJ株内でAGL1遺伝子、FAT1遺伝子、DGAT2d遺伝子のcDNAを単独で、あるいは複数を同時に高発現させるために、KJ株の翻訳伸長因子のαサブユニットであるEF1αをコードする遺伝子(以降、「KJEF1A」と呼ぶ)のプロモーター(配列番号１３)とターミネーター(配列番号１４)とを利用した。AGL1遺伝子、FAT1遺伝子及びDGAT2d遺伝子それぞれのcDNAを、KJEF1Aのプロモーターとターミネーターとの間に挿入したpAGL1、pFAT1及びpDGAT2dプラスミドを作製した(図４)。
KJ株内でAGL1遺伝子、FAT1遺伝子、DGAT2d遺伝子のcDNAを単独で、あるいは複数を同時に高発現させるために、KJ株の翻訳伸長因子のαサブユニットであるEF1αをコードする遺伝子(以降、「KJEF1A」と呼ぶ)のプロモーター(配列番号１３)とターミネーター(配列番号１４)とを利用した。AGL1遺伝子、FAT1遺伝子及びDGAT2d遺伝子それぞれのcDNAを、KJEF1Aのプロモーターとターミネーターとの間に挿入したpAGL1、pFAT1及びpDGAT2dプラスミドを作製した(図４)。
図４において、KJEF1A pro及びKJEF1A terは、それぞれ、KJ株のEF1A遺伝子(KJEF1A)のプロモーター及びターミネーターを含む配列である。KJRBCSは、KJ株のRuBisCO小サブユニット遺伝子を示し、その最初のイントロン配列(配列番号１５)がプロモーターとcDNAとの間に挿入されている。各プラスミドの中央部分は、各遺伝子のcDNA配列を示している。FLAG-Tagは、N末端-DYKDDDDK-C末端というペプチド配列をコードするDNA断片である。ObiTub pro及びObiAct terは、それぞれ、Obi株のTubulin遺伝子プロモーター及びActin遺伝子ターミネーターを含む配列である(Imamura et al., 2012, J Gen Appl Microbiol, 58, 1)。bleは、ブレオマイシンやゼオマイシン[商品名ゼオシン(ZeocinTM)]耐性遺伝子である(Stevens et al., 1996, Mol. Gen. Genet. 251, 23-30.)。Linkerは、N末端-GGSGGR-C末端というペプチド配列をコードするDNA断片である。PeEGFPは、EGFP(enhanced GFP ：高感度GFP)のコドン使用頻度をObi株での発現のために最適化した配列である。
これらのプラスミドを、パーティクルボンバードメントを用い、G418耐性を付与するpG418-T1Aプラスミド(Kasai et al., 2015, Biotechnol Biofuels, 8, 94)と共にKJ株に共導入し、G418耐性コロニーを選抜した。
pAGL1プラスミドを導入した実験では、G418耐性コロニー106個の内6株(5.7％)で、図４に示すpAGL1プラスミドのKJEF1Aプロモーター5'末端とターミネーター3'末端との間(以降、これを「KJAGL1 cDNA発現カセット」と呼ぶ）の全長が挿入されていた。pFAT1プラスミドを導入した実験では、365個のG418耐性コロニーの内18株（5.0％）でKJFAT1 cDNA発現カセット全長が挿入されていた。pDGAT2dプラスミドを導入した実験では164個のG418耐性コロニーの内、6株(3.7％)でKJDGAT2d cDNA発現カセットの全長が挿入されていることが確認できた。
〔実施例３〕KJAGL1 cDNA高発現株のTAG生産性の評価
pAGL1プラスミドを導入して得られた6株の形質転換体におけるKJAGL1 cDNAの発現を、Real time PCRで解析した。最もKJAGL1 cDNAの発現が高かったKJoxAGL1-6060株(oxはoverexpression line：高発現株を示す)では、培養13日目のTAG生産性が野生株の約1.3倍であった(図５）。残りの株については、TAG含量が若干上昇し、デンプン含量が若干減少したが、TAG生産性は野生株とほぼ同等であった。
pAGL1プラスミドを導入して得られた6株の形質転換体におけるKJAGL1 cDNAの発現を、Real time PCRで解析した。最もKJAGL1 cDNAの発現が高かったKJoxAGL1-6060株(oxはoverexpression line：高発現株を示す)では、培養13日目のTAG生産性が野生株の約1.3倍であった(図５）。残りの株については、TAG含量が若干上昇し、デンプン含量が若干減少したが、TAG生産性は野生株とほぼ同等であった。
ここで、TAG生産性とは、野生株(KJ)のTAG生産量(g/L)を100％としたときの形質転換体のTAG生産量(％)である。また、本実施例では、各株は1/2 DENSO培地で同時に培養し、7日目(7d)と13日目(13d)にサンプリングを行った。図５において、棒グラフとエラーバーは独立な3回の実験で得られたサンプルの平均値と標準誤差(n = 3)を示す。なお、DENSO培地はA6培地とほぼ同じ組成であるが、(NH4)2SO4及び(NH2)2COの濃度がそれぞれ863 μMと2.38 mMである。1/2 DENSO培地は、DENSO培地を蒸留水で2倍に薄めたものである。
〔実施例４〕KJFAT1 cDNA高発現株のTAG生産性の評価
pFAT1プラスミドを導入して得られた形質転換体18株についてTAGの生産性を評価した。18株中12株でTAG含有率が増加し、そのうち細胞乾燥重量の減少があまり見られなかった(すなわち、増殖が悪くならなかった)6株では、培養7日目にTAG生産性が約1.2〜1.3倍に、14日目で約1.1〜1.2倍に増加していた(図６）。このとき、TAGの増加と同時にデンプンの減少が見られたため、pFAT1プラスミドの導入によるTAGの増加はデンプンの減少を伴うと考えられた(図６）。本実施例では、各株は1/2 DENSO培地で同時に培養し、7日目(7d)と14日目(14d)にサンプリングを行った。
pFAT1プラスミドを導入して得られた形質転換体18株についてTAGの生産性を評価した。18株中12株でTAG含有率が増加し、そのうち細胞乾燥重量の減少があまり見られなかった(すなわち、増殖が悪くならなかった)6株では、培養7日目にTAG生産性が約1.2〜1.3倍に、14日目で約1.1〜1.2倍に増加していた(図６）。このとき、TAGの増加と同時にデンプンの減少が見られたため、pFAT1プラスミドの導入によるTAGの増加はデンプンの減少を伴うと考えられた(図６）。本実施例では、各株は1/2 DENSO培地で同時に培養し、7日目(7d)と14日目(14d)にサンプリングを行った。
〔実施例５〕KJDGAT2d cDNA高発現株のTAG生産性の評価
pDGAT2dプラスミドの導入で得られた形質転換体6株のうち4株(KJoxDGAT2d-567, 5617, 5650, 5822)において、細胞乾燥重量当たりのTAG含有率に有意な増加が見られ(P < 0.01, Student's t-test)、培養7日目で野生株の約1.2倍、14日目で約1.1倍に増加した(図７）。このとき、TAGの増加が見られた4株においてデンプン含有率が減少していた(P < 0.05, Student's t-test)ことから、KJDGAT2d cDNAの高発現によるTAGの増加はデンプンの減少を伴うと考えられた(図７）。本実施例では、各株は1/2 DENSO培地で同時に培養し、7日目と14日目にサンプリングを行った。図７において、棒グラフとエラーバーは独立な実験で得られたサンプルの平均値と標準誤差(n = 3-6)を示す。
pDGAT2dプラスミドの導入で得られた形質転換体6株のうち4株(KJoxDGAT2d-567, 5617, 5650, 5822)において、細胞乾燥重量当たりのTAG含有率に有意な増加が見られ(P < 0.01, Student's t-test)、培養7日目で野生株の約1.2倍、14日目で約1.1倍に増加した(図７）。このとき、TAGの増加が見られた4株においてデンプン含有率が減少していた(P < 0.05, Student's t-test)ことから、KJDGAT2d cDNAの高発現によるTAGの増加はデンプンの減少を伴うと考えられた(図７）。本実施例では、各株は1/2 DENSO培地で同時に培養し、7日目と14日目にサンプリングを行った。図７において、棒グラフとエラーバーは独立な実験で得られたサンプルの平均値と標準誤差(n = 3-6)を示す。
〔実施例６〕複数cDNAを同時に高発現させた株の作製
pFAT1プラスミド形質転換体のうち、7日目におけるTAG生産性が最も高かったKJoxFAT1-325株(図６)にpDGAT2dプラスミドとpble-PeEGFP-T1Aプラスミドとを共導入し、Zeo耐性コロニーを228個選抜した。そして、KJDGAT2d cDNA発現カセットの挿入をPCRで解析したところ、13株(5.7％)でKJDGAT2d cDNA発現カセットの全長が挿入されていることが確認できた。
pFAT1プラスミド形質転換体のうち、7日目におけるTAG生産性が最も高かったKJoxFAT1-325株(図６)にpDGAT2dプラスミドとpble-PeEGFP-T1Aプラスミドとを共導入し、Zeo耐性コロニーを228個選抜した。そして、KJDGAT2d cDNA発現カセットの挿入をPCRで解析したところ、13株(5.7％)でKJDGAT2d cDNA発現カセットの全長が挿入されていることが確認できた。
複数のcDNAを同一細胞内で同時に高発現させた場合に、TAG生産性がどの程度向上するかを解析するため、3遺伝子のcDNAを4通りに組み合わせた形質転換体（AGL1 & FAT1, AGL1 & DGAT2d, FAT1 & DGAT2d, AGL1 & FAT1 & DGAT2d)を作製した。pAGL1プラスミド形質転換体のうち最もTAG生産性が高かったKJoxAGL1-6060株にpFAT1プラスミドをpble-PeEGFP-T1Aプラスミドと共にKJ株に共導入し、ゼオシン(Zeo)耐性コロニーを237個選抜した。この内の17株(7.2％)でKJFAT1 cDNA発現カセットの全長が挿入されていることを確認した。同様にKJoxAGL1-6060株にpDGAT2dプラスミドをpble-PeEGFP-T1Aプラスミドと共に導入し、Zeo耐性コロニーを130個選抜し、この内18株（13.8%）でDGAT2d cDNA発現カセットの全長が挿入されていることが確認できた。
3つの遺伝子のcDNAを一つの細胞内で高発現させるため、KJoxAGL1-6060株にpFAT1、pDGAT2d及びpble-PeEGFP-T1Aの3つのプラスミドを同時導入し、Zeo耐性コロニーを685個選抜した。この内17株(2.5％)で、KJFAT1 cDNA発現カセット及びKJDGAT2d cDNA発現カセットの両方が挿入されていた。
〔実施例７〕複数のcDNAが高発現した株のTAG生産性評価
実施例６に示すように、KJoxFAT1-325株(図６)にKJDGAT2d cDNA発現カセットを導入した株、すなわち、KJFAT1 cDNAとKJDGAT2d cDNAとを高発現させた13株のうち、最もTAG生産性が高かったKJoxFD-2643株について詳しく解析を行った。また、下記に、形質転換体の構築手順を示す：
実施例６に示すように、KJoxFAT1-325株(図６)にKJDGAT2d cDNA発現カセットを導入した株、すなわち、KJFAT1 cDNAとKJDGAT2d cDNAとを高発現させた13株のうち、最もTAG生産性が高かったKJoxFD-2643株について詳しく解析を行った。また、下記に、形質転換体の構築手順を示す：
当該構築手順では、KJ株に、カッコ内に示したcDNAの発現カセットを導入し構築した株名を示す。KJoxFAT1-325株には、再度、KJDGAT2d cDNA発現カセットを導入し、KJoxFD-2643株を作製した。KJoxAGL1-6060株にKJFAT1 cDNA発現カセットのみ、あるいはKJDGAT2d cDNA発現カセットのみを導入して作製した株の名前は示していない。KJoxAGL1-6060株にKJFAT1 cDNA発現カセット及びKJDGAT2d cDNA発現カセットを同時に導入し、KJoxAFD-41417株を作製した。
KJ株、KJoxFAT1-325株、KJoxDGAT2d-5822及びKJoxFD-2643株を、それぞれ1/2 DENSO培地で初期O.D.750 = 0.2に調整して培養を開始し、培養4日目から18日目までの細胞乾燥重量当たりのTAG含有率(％DW)を測定した。KJoxFAT1-325株とKJoxDGAT2d-5822株は野生株よりTAG含有率が増加していたが、KJoxFD-2643株はそれらの株よりさらにTAG含有率が増加していた(図８)。すなわち、FAT1とDGAT2dの高発現は、KJ株のTAG含有率を加算的に増加させた。各株は1/2 DENSO培地で同時に培養し、培養4, 8, 11, 14, 18日目にサンプリングを行った。
また、KJAGL1 cDNA発現カセット導入株であるKJoxAGL1-6060株のTAG生産性は、野生株よりも約30％高かった(図５）。KJoxAGL1-6060株にKJFAT1 cDNA発現カセットのみ、あるいはKJDGAT2d cDNA発現カセットのみを導入した株を、それぞれ17株と18株分離し、これらの株のTAG生産性を調べた。これらの発現カセット導入株の中に、親株であるKJoxAGL1-6060株のTAG生産性よりも有意に高いTAG生産性を示すものは見出されなかった。
一方、KJoxAGL1-6060株にKJFAT1 cDNA発現カセットとKJDGAT2d cDNA発現カセットとを同時に導入したKJoxAFD-41417株は、以下に述べるように、その生産性は親株よりもはるかに高かった。
KJ株、前述のKJoxFD-2643株(KJFAT1 cDNA発現カセット+KJDGAT2d発現カセット導入株)、KJAGL1 cDNA発現カセット導入株(KJoxAGL1-6060)、及びKJoxAFD-41417株を1/2 DENSO培地で初期O.D.750 = 0.2に調整して培養を開始し、培養4日目から18日目までの培養液当たりのTAG生産量(g/L)を測定した。KJoxFD-2643株では培養18日目のTAG生産量(g/L)が野生株の約1.2倍、KJoxAGL1-6060株では約1.5倍に増加していた。一方、KJoxAFD-41417株では、TAG生産量(g/L)が培養18日目で野生株の約1.7倍に増加していた(図９）。また、野生株及びKJoxFD-2643株では培養8日目から14日目でTAG生産性(g/L/d)が最大になったのに対して、KJoxAGL1-6060株、及びKJoxAGL1-6060株を親株にしたKJoxAFD-41417株では培養18日目までTAG生産性が増加していた(図９)。各株は1/2 DENSO培地で同時に培養し、培養4, 8, 11, 14, 18日目にサンプリングを行った。
以上の結果より、KJDGAT2d cDNAの高発現とKJFAT1 cDNAの高発現とは、TAG生産性において加算性が認められること、また、KJAGL1 cDNAの高発現と上記2つのcDNAの高発現とを組み合わせることにより、TAG生産性が野生株の約1.7倍に増加した株を作ることが出来ることが示された。
FERM BP-22254
FERM BP-22294
FERM BP-22294
Claims (9)
- AGL1タンパク質をコードする遺伝子を高発現させた真核微細藻類遺伝子改変株であって、親株と比較してトリアシルグリセロール(TAG)生産性が向上しており、前記AGL1タンパク質が配列番号４に示すアミノ酸配列と少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つアルファ・グリコシダーゼ活性を有するタンパク質である、前記真核微細藻類遺伝子改変株。
- さらに、FAT1タンパク質をコードする遺伝子及び/又はDGAT2タンパク質をコードする遺伝子を高発現させた、請求項１記載の真核微細藻類遺伝子改変株であって、前記FAT1タンパク質が配列番号８に示すアミノ酸配列と少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つアシルACPチオエステラーゼ活性を有するタンパク質であり、前記DGAT2タンパク質が配列番号１２に示すアミノ酸配列と少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つジアシルグリセロールアシル転移酵素活性を有するタンパク質である、前記真核微細藻類遺伝子改変株。
- 前記遺伝子が、遺伝子高発現を担保するプロモーターに機能的に連結されている、請求項１又は２記載の真核微細藻類遺伝子改変株。
- トレボキシア藻網に属する、請求項１〜３のいずれか１項記載の真核微細藻類遺伝子改変株。
- コッコミクサ(Coccomyxa)属又はシュードコッコミクサ(Pseudococcomyxa)属に属する、請求項４記載の真核微細藻類遺伝子改変株。
- 前記遺伝子が、緑藻に属する株に由来する、請求項１〜５のいずれか１項記載の真核微細藻類遺伝子改変株。
- 前記遺伝子が、トレボキシア藻網に属する株に由来する、請求項６記載の真核微細藻類遺伝子改変株。
- 前記遺伝子が、コッコミクサ属又はシュードコッコミクサ属に属する株に由来する、請求項７記載の真核微細藻類遺伝子改変株。
- 請求項１〜８のいずれか１項記載の真核微細藻類遺伝子改変株を培養する工程を含む、TAG生産方法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2015173161A JP6613731B2 (ja) | 2015-09-02 | 2015-09-02 | トリグリセリド生産性が改良された真核微細藻類遺伝子改変株及びその利用 |
| PCT/JP2016/075875 WO2017038993A1 (ja) | 2015-09-02 | 2016-09-02 | トリグリセリド生産性が改良された真核微細藻類遺伝子改変株及びその利用 |
| US15/756,233 US10370687B2 (en) | 2015-09-02 | 2016-09-02 | Genetically modified strain of eukaryotic microalga having improved triglyceride productivity, and use thereof |
| AU2016317623A AU2016317623B2 (en) | 2015-09-02 | 2016-09-02 | Genetically modified strain of eukaryotic microalga having improved triglyceride productivity, and use thereof |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2015173161A JP6613731B2 (ja) | 2015-09-02 | 2015-09-02 | トリグリセリド生産性が改良された真核微細藻類遺伝子改変株及びその利用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2017046643A JP2017046643A (ja) | 2017-03-09 |
| JP6613731B2 true JP6613731B2 (ja) | 2019-12-04 |
Family
ID=58188969
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2015173161A Active JP6613731B2 (ja) | 2015-09-02 | 2015-09-02 | トリグリセリド生産性が改良された真核微細藻類遺伝子改変株及びその利用 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US10370687B2 (ja) |
| JP (1) | JP6613731B2 (ja) |
| AU (1) | AU2016317623B2 (ja) |
| WO (1) | WO2017038993A1 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108062602B (zh) * | 2017-12-28 | 2019-08-02 | 江苏大学 | 一种预测温室茄果类作物同化产物产量的方法 |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8394621B2 (en) | 2008-10-23 | 2013-03-12 | Matrix Genetrics, LLC | Modified photosynthetic microorganisms for producing triglycerides |
| US8722359B2 (en) | 2011-01-21 | 2014-05-13 | Aurora Algae, Inc. | Genes for enhanced lipid metabolism for accumulation of lipids |
| JP6006553B2 (ja) | 2012-07-10 | 2016-10-12 | 花王株式会社 | 組換えクラミドモナス属及びそれを用いたラウリン酸高含有油脂の製造方法 |
| US9328336B2 (en) | 2012-10-16 | 2016-05-03 | Exxonmobil Research And Engineering Company | DGAT genes and methods of use for triglyceride production in recombinant microorganisms |
| EP2929040A4 (en) | 2012-12-06 | 2016-11-09 | Exxonmobil Res & Eng Co | DGAT GENES WITH PLECKSTRIN HOMOLOGY DOMAINS AND USE IN RECOMBINANT MICROORGANISMS |
| JP6235210B2 (ja) | 2012-12-14 | 2017-11-22 | 株式会社デンソー | 微細藻類の培養方法 |
| JP6088375B2 (ja) | 2013-07-10 | 2017-03-01 | 株式会社デンソー | 新規微細藻類 |
| JP6446774B2 (ja) * | 2013-11-19 | 2019-01-09 | 株式会社デンソー | 緑藻の脂質蓄積変異体およびその利用 |
-
2015
- 2015-09-02 JP JP2015173161A patent/JP6613731B2/ja active Active
-
2016
- 2016-09-02 US US15/756,233 patent/US10370687B2/en active Active
- 2016-09-02 AU AU2016317623A patent/AU2016317623B2/en active Active
- 2016-09-02 WO PCT/JP2016/075875 patent/WO2017038993A1/ja active Application Filing
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US10370687B2 (en) | 2019-08-06 |
| WO2017038993A1 (ja) | 2017-03-09 |
| US20180245112A1 (en) | 2018-08-30 |
| JP2017046643A (ja) | 2017-03-09 |
| AU2016317623A1 (en) | 2018-03-29 |
| AU2016317623B2 (en) | 2019-06-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Li et al. | A type 2 diacylglycerol acyltransferase accelerates the triacylglycerol biosynthesis in heterokont oleaginous microalga Nannochloropsis oceanica | |
| Tan et al. | Expression of the heterologous Dunaliella tertiolecta fatty acyl-ACP thioesterase leads to increased lipid production in Chlamydomonas reinhardtii | |
| Gong et al. | Characterization of a novel thioesterase (PtTE) from Phaeodactylum tricornutum | |
| JP6310544B2 (ja) | β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼを用いた脂質の製造方法 | |
| Cui et al. | Tung tree (Vernicia fordii, Hemsl.) genome and transcriptome sequencing reveals co-ordinate up-regulation of fatty acid β-oxidation and triacylglycerol biosynthesis pathways during eleostearic acid accumulation in seeds | |
| JP2015500009A (ja) | Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ脂質経路遺伝子を含む遺伝子操作された微生物株 | |
| US9359623B2 (en) | Methods and compositions for the production of fatty acids in photosynthetic prokaryotic microorganisms | |
| Shi et al. | Δ6 fatty acid elongase is involved in eicosapentaenoic acid biosynthesis via the ω6 pathway in the marine alga Nannochloropsis oceanica | |
| US20140256927A1 (en) | Increasing the lipid content in microalgae by genetically manipulating a triacylglycerol (tag) lipase | |
| JP6613731B2 (ja) | トリグリセリド生産性が改良された真核微細藻類遺伝子改変株及びその利用 | |
| Zhang et al. | Manipulation of triacylglycerol biosynthesis in Nannochloropsis oceanica by overexpressing an Arabidopsis thaliana diacylglycerol acyltransferase gene | |
| Zheng et al. | Identification and function analysis of a type 2 diacylglycerol acyltransferase (DGAT2) from the endosperm of coconut (Cocos nucifera L.) | |
| WO2019069969A1 (ja) | 脂質の製造方法 | |
| Sitnik et al. | DGAT1 from the arachidonic-acid-producing microalga Lobosphaera incisa shows late gene expression under nitrogen starvation and substrate promiscuity in a heterologous system | |
| RU2534560C2 (ru) | Новые гены атф:цитратлиазы | |
| WO2014045793A1 (ja) | チオエステラーゼ改変体を用いた脂質の製造方法 | |
| JP6723002B2 (ja) | 油脂の製造方法 | |
| Zhang et al. | Transcriptome-based analysis of Euglena gracilis lipid metabolic pathways under light stress | |
| WO2017038995A1 (ja) | 真核微細藻類のリパーゼ突然変異体 | |
| Han et al. | Enhancing the lipid content of Nannochloropsis oceanica by introducing two type 2 diacylglycerol acyltransferase genes from Phaeodactylum tricornutum | |
| CN114615881B (zh) | 产生甘油三酯的非人类生物体 | |
| US20160264985A1 (en) | Microorganisms for fatty acid production using elongase and desaturase enzymes | |
| EP4010478A1 (en) | Non-human organism for producing triacylglycerol | |
| Kamisaka | Preparation of oleaginous yeasts by genetic modification and its potential applications | |
| Okuda | Biochemical analysis and molecular breeding of oleaginous microorganisms for ω3 polyunsaturated fatty acid production |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20180903 |
|
| A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711 Effective date: 20180903 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20180903 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20190716 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20190906 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20191008 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20191021 |
|
| R151 | Written notification of patent or utility model registration |
Ref document number: 6613731 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R151 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |