JP6341676B2

JP6341676B2 - 改変シアノバクテリア

Info

Publication number: JP6341676B2
Application number: JP2014016524A
Authority: JP
Inventors: 彰人川原; 由香子園池
Original assignee: Kao Corp; Saitama University NUC
Current assignee: Kao Corp; Saitama University NUC
Priority date: 2014-01-31
Filing date: 2014-01-31
Publication date: 2018-06-13
Anticipated expiration: 2034-01-31
Also published as: WO2015115583A1; JP2015142517A; US10006066B2; AU2015211754A1; US20170159084A1

Description

本発明は、脂質分泌生産性が向上した改変シアノバクテリアに関する。

近年、化石燃料の将来的な枯渇が予測されており、エネルギー問題の解決のため、化石燃料に頼らない次世代エネルギー生産技術の確立が急務とされている。その一端として、シアノバクテリアや藻類などの光合成生物を利用したバイオ燃料生産研究が注目されている。上記光合成生物は、光をエネルギー源としてＣＯ₂と水から光合成で固定した炭素を原料に、バイオ燃料を生産することが可能である。さらに、上記光合成生物は、食糧原料と競合しないこと、カーボンニュートラルな燃料生産が可能なことから、次世代エネルギー生産系として期待が持たれている。

シアノバクテリア（藍色細菌）は、藍藻とも呼ばれる真正細菌の一群であり、光合成によって酸素を産生し、ＣＯ₂を固定化する能力を有する。シアノバクテリアは、外膜とペプチドグリカンの細胞壁をもち、グラム陰性菌の範疇に入るが、典型的なグラム陰性菌とは系統的に離れている。シアノバクテリアは、それらが１０数億年前に真核生物に細胞内共生（１次共生）したことが葉緑体の起源であると考えられているため、葉緑体の祖先生物として光合成研究に広く利用されている。

またシアノバクテリアは、生育が速く、高い光合成能力を有すること、さらに形質転換能を有するため、外来ＤＮＡを細胞内に導入することで微生物学的な物質生産に利用可能であることから、バイオ燃料生産用宿主として注目されている。シアノバクテリアを用いたバイオ燃料生産の例としては、水素（非特許文献１）、エタノール（非特許文献２）、イソブタノール（非特許文献３）、及び脂肪酸（非特許文献４）が報告されている。非特許文献４及び特許文献１には、外因性アシル−ＡＣＰチオエステラーゼを産生する組換えシアノバクテリアを培養することで無機炭素を脂肪酸に変換させる方法が記載されている。特許文献２には、シアノバクテリアのＡｂｒＢ型転写制御因子（ｃｙＡｂｒＢ）遺伝子の機能喪失を誘導することにより、細胞体積当たりの炭素同化量が増大することが記載されている。

一方で、非特許文献５には、シネコシスティス・エスピー（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓｓｐ．）ＰＣＣ６８０３のＡｂｒＢ型転写制御因子であるSll0822が、窒素代謝関連遺伝子の転写活性化に必須であり、その遺伝子sll0822の削除株では、脂肪酸生合成関連の遺伝子群の発現量が野生株と同等又は低下したことが報告されている。また非特許文献６には、Sll0822が、高ＣＯ₂条件下で無機炭素取り込み系遺伝子のリプレッサーとして働くことが示唆され、細胞内のＣ／Ｎバランスの調節に関わる因子として推定されている。

特表２０１１−５０５８３８号公報特表２０１１−２２９４８２号公報

Yoshino F. et al. (2007) Mar. Biotechnol. 9：101-112 Deng M. D. and Coleman J. R. (1999) Appl. Environ Microbiol. 65:523-528 Atsumi S. et al. (2009) Nat. Biotechnol. 27:1177-1180 Liu X. et al. (2011) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108: 6899-6904 Ishii A. and Hihara Y (2008) Plant Physiol. 148:660-670 Lieman-Hurwitz J. et al. (2009) Environ Microbiol. 11: 927-936

シアノバクテリアの光合成に依存した、大気ＣＯ₂の炭素を原料にした様々なバイオ燃料生産技術が開発されているが、その生産性はまだ低いレベルであり、より生産効率の高い技術の開発が望まれている。本発明は、脂質生産性が向上したシアノバクテリアを提供することに関する。

本発明者は、シアノバクテリアにおいて、ＡｂｒＢ型転写制御因子と、アシル−ＡＣＰシンテターゼとを共に機能喪失させることによって、又はさらにアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子を導入することによって、得られた改変シアノバクテリアにおいて、該シアノバクテリアの培養液あたり又は細胞あたりの脂質分泌生産量が増大することを見出した。

したがって、一態様において本発明は、シアノバクテリアにおけるＡｂｒＢ型転写制御因子と、アシル−ＡＣＰシンテターゼとを機能喪失させることを含む、改変シアノバクテリアの製造方法を提供する。

別の態様において、本発明は、ＡｂｒＢ型転写制御因子と、アシル−ＡＣＰシンテターゼとが機能喪失した改変シアノバクテリアを提供する。

さらなる態様において、本発明は、上記改変シアノバクテリア、又は上記方法で製造された改変シアノバクテリアを培養することを含む、脂質生産方法を提供する。

さらなる態様において、本発明は、シアノバクテリアにおけるＡｂｒＢ型転写制御因子と、アシル−ＡＣＰシンテターゼとを機能喪失させることを含む、シアノバクテリアの脂質分泌生産性の向上方法を提供する。

本発明によれば、脂質分泌生産性の向上した改変シアノバクテリアを製造することができる。本発明の改変シアノバクテリアを培養すれば、効率のよい微生物学的脂質生産が可能になる。

シアノバクテリア型のＡｂｒＢ型転写制御因子（ｃｙＡｂｒＢ）の無根系統樹。１２種のシアノバクテリアにおいて、Ｃ末端側にＡｂｒＢ型ＤＮＡ結合ドメインを持つ推定転写制御因子のアミノ酸配列から、ＣＬＵＳＴＡＬＷプログラムｖｅｒ１．８３を用いて近隣結合法による無根系統樹を作成した。 ΔrecJΔslr1609::sp株とΔrecJΔsll0822Δslr1609::sp株の培養液中の遊離脂肪酸量。ｎ＝３、エラーバー＝ＳＤ。 ΔrecJΔslr1609::sp株とΔrecJΔsll0822Δslr1609::sp株の菌体あたりの遊離脂肪酸量生産性。ｎ＝３、エラーバー＝ＳＤ。 ΔrecJΔslr1609::UcTE株及びΔrecJΔsll0822Δslr1609::UcTE株の培養液中の遊離脂肪酸量。ｎ＝３、エラーバー＝ＳＤ。 ΔrecJΔslr1609::UcTE株及びΔrecJΔsll0822Δslr1609::UcTE株の菌体あたりの遊離脂肪酸量生産性。ｎ＝３、エラーバー＝ＳＤ。

（１．定義）
本明細書において、ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列の同一性は、Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法（Science, 1985, 227:1435-1441）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ−Ｗｉｎのホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔｓｉｚｅｔｏｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行うことにより算出される。

シアノバクテリアは、藍藻とも呼ばれ、クロロフィルを用いた光合成を行う原核生物の一群である。シアノバクテリアは多様性に富んでおり、細胞の形状のみを見ても、シネコシスティス・エスピー（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓｓｐ．）ＰＣＣ６８０３のような単細胞性のものや、ヘテロシストを形成し窒素固定を行うアナベナ・エスピー（Ａｎａｂａｅｎａｓｐ．）ＰＣＣ７１２０のように多細胞がヒモ状に繋がっている糸状性のもの、又はらせん状や分岐状のもの等がある。生育環境についても、別府温泉から単離されたサーモシネココッカス・エロンガタス（Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓｅｌｏｎｇａｔｕｓ）ＢＰ−１のような好熱性のもの、海洋性で沿岸部に生息するシネココッカス・エスピー（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．）ＣＣ９３１１、又は外洋に生息するシネココッカス・エスピーＷＨ８１０２など、様々な条件に適応した種が見られる。また、種独自の特徴を持つものとして、ミクロシスティス・エルギノーサ（Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）のように、ガス小胞を持ち毒素を産生することのできるものや、チラコイドを持たず集光アンテナであるフィコビリソームが原形質膜に結合しているグロイオバクター・ビオラセウス（Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒｖｉｏｌａｃｅｕｓ）ＰＣＣ７４２１、又は一般的な光合成生物のようにクロロフィルａでなくクロロフィルｄを主要な（＞９５％）光合成色素として持つ海洋性のアクリオクロリス・マリナ（Ａｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓｍａｒｉｎａ）なども挙げられる。

ＡｂｒＢ型転写制御因子は、ＡｂｒＢ型のＤＮＡ結合ドメインを有する蛋白質であり、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌、古細菌の間に広く分布し、遺伝子発現の制御に重要な役割を果たす転写因子として知られている。例えば、枯草菌においては、対数増殖期から定常期へと移行する間の遷移期において、胞子形成やコンピテンス、又は栄養源獲得等に関与することが報告されている。ＡｂｒＢ型転写制御因子の多くは、そのＮ末端側にＤＮＡ結合ドメインを持つが、シアノバクテリア由来のＡｂｒＢ型転写制御因子は、例外的にＣ末端側にＤＮＡ結合ドメインを持つ。このタイプのＡｂｒＢ型転写制御因子をコードする遺伝子は、これまでにゲノムの全ヌクレオチド配列が公開されているシアノバクテリア全てにおいて保存されているが、他の細菌群には全く見られない（非特許文献５）。このため、このＣ末端側にＤＮＡ結合ドメインを持つＡｂｒＢ型転写因子は、シアノバクテリアに特有のＡｂｒＢ型転写制御因子という意味で、ｃｙＡｂｒＢとも呼ばれることがある（特許文献２）。本明細書においても、シアノバクテリアの該ＡｂｒＢ型転写制御因子を「ｃｙＡｂｒＢ」又は「ｃｙＡｂｒＢファミリー」ということがある。

ゲノムの全ヌクレオチド配列が公開されているシアノバクテリアそれぞれについて、ｃｙＡｂｒＢをコードする遺伝子の数を調べたところ、多くの種が２コピー以上の遺伝子を保持しており、シネココッカス・エスピーＣＣ９９０２には４コピー、シネココッカス・エスピーＣＣ９６０５には５コピーが見つかった。特筆すべきは、最近ゲノム全配列が明らかになったアクリオクロリス・マリナで、ゲノム上とプラスミド上で合計１４コピーもの遺伝子を保持していた。ｃｙＡｂｒＢは、その構造類似性よりいくつかのグループに分類される。同じシアノバクテリアのゲノム内に存在する複数コピーは、系統学的には別のグループに属している場合が多い。例としては、シネコシスティス・エスピーＰＣＣ６８０３、クロコスファエラ・ワトソニー（Ｃｒｏｃｏｓｐｈａｅｒａｗａｔｓｏｎｉｉ）ＷＨ８５０１、アナベナ・エスピーＰＣＣ７１２０、トリコデスミウム・エリスラエウム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｓｍｉｕｍｅｒｙｔｈｒａｅｕｍ）ＩＭＳ１０１、サーモシネココッカス・エロンガタスＢＰ−１などの種が保持する２コピーは、それぞれグループＡ、グループＢに含まれ、海洋性のシネココッカス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）類やプロクロロコッカス（Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ）類の持つ２コピーは、これらとはまた別のＭａｒｉｎｅグループＡ、Ｂを形成している。また、アクリオクロリス・マリナとグロイオバクター・ビオラセウスのｃｙＡｂｒＢは、それぞれ独自のグループを形成している。

図１に、ＣＬＵＳＴＡＬＷプログラムｖｅｒ１．８３を用いた近隣結合法により作成した、１２種のシアノバクテリア由来のｃｙＡｂｒＢの無根系統樹を示す。図１中の生物名及びｃｙＡｂｒＢ名の表記は略記であり、例えば、Sll0822はシネコシスティス・エスピーＰＣＣ６８０３株のSll0822（gi16331736）を表す。図１に示すｃｙＡｂｒＢを有するシアノバクテリア種、又は個々のシアノバクテリア種が有するｃｙＡｂｒＢに関する情報は、例えば、ＣｙａｎｏＢａｓｅ（[genome.microbedb.jp/cyanobase/]）、又はＮＣＢＩデータベース（[www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/]又は[www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/]）から取得することができる。

シアノバクテリアでは、光合成により固定された二酸化炭素は多数の酵素反応プロセスを経てアセチル−ＣｏＡへと変換される。脂肪酸合成の最初の段階は、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼの作用による、アセチル−ＣｏＡとＣＯ２からのマロニル−ＣｏＡの合成である。次に、マロニル−ＣｏＡがマロニルＣｏＡ：ＡＣＰトランスアシラーゼの作用によってマロニル−ＡＣＰへと変換される。その後、脂肪酸シンテターゼ（又はアシル−ＡＣＰシンテターゼ）の進行的作用時に、炭素単位２個の連続的付加が起こり、炭素が２個ずつ増加した、アシル−ＡＣＰが合成され、膜脂質等の合成中間体として利用される。

シアノバクテリアの遺伝子やタンパク質に関する情報は、例えば上述のＣｙａｎｏＢａｓｅやＮＣＢＩデータベースにおいて公開されている。当業者は、これらのデータベースの情報に基づいて、目的のシアノバクテリアのタンパク質（例えば、ｃｙＡｂｒＢ若しくはアシル−ＡＣＰシンテターゼ）のアミノ酸配列、又はそれらをコードする遺伝子のヌクレオチド配列を取得することができる。

（２．改変シアノバクテリア）
本発明は、脂質の分泌生産性が向上した改変シアノバクテリアを提供する。本発明の改変シアノバクテリアは、そのＡｂｒＢ型転写制御因子（ｃｙＡｂｒＢ）と、アシル−ＡＣＰシンテターゼとを機能喪失させるように改変されたシアノバクテリアである。

本発明の改変シアノバクテリアの親微生物となる、ｃｙＡｂｒＢとアシル−ＡＣＰシンテターゼの機能喪失改変前のシアノバクテリア（以下、親シアノバクテリアということがある）の種類には、特に制限はなく、あらゆる種類のものが挙げられる。好ましくは、親シアノバクテリアの例としては、シネコシスティス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、シネココッカス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、サーモシネココッカス属（Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコデスミウム属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｓｍｉｕｍ）、アカリオクロリス属（Ａｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ）、クロコスファエラ属（Ｃｒｏｃｏｓｐｈａｅｒａ）、及びアナベナ属（Ａｎａｂａｅｎａ）に属するシアノバクテリアであり、より好ましくは、シネコシスティス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、シネココッカス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、サーモシネココッカス属（Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、又はアナベナ属（Ａｎａｂａｅｎａ）に属するシアノバクテリアを挙げることができ、より好ましくは、シネコシスティス・エスピーＰＣＣ６８０３、シネコシスティス・エスピーＰＣＣ７５０９、シネコシスティス・エスピーＰＣＣ６７１４、シネココッカス・エスピーＰＣＣ７９４２、サーモシネココッカス・エロンガタスＢＰ−１、トリコデスミウム・エリスラエウムＩＭＳ１０１、アカリオクロリス・マリアナＭＢＩＣ１１０１７、クロコスファエラ・ワトソニーＷＨ８５０１、及びアナベナ・エスピーＰＣＣ７１２０を挙げることができ、さらに好ましくは、シネコシスティス・エスピーＰＣＣ６８０３、シネコシスティス・エスピーＰＣＣ６７１４、及びシネコシスティス・エスピーＰＣＣ７５０９を挙げることができ、なお好ましくはシネコシスティス・エスピーＰＣＣ６８０３である。

上記親シアノバクテリアのｃｙＡｂｒＢのアミノ酸配列、それをコードする遺伝子、及び当該遺伝子のゲノム又はプラスミド上での位置や、そのヌクレオチド配列は、上述のＣｙａｎｏＢａｓｅやＮＣＢＩデータベースで確認することができる。ｃｙＡｂｒＢは、図１に示したように系統学的に異なるいくつかのグループに分かれており、複数の異なる系統のグループに属するｃｙＡｂｒＢが、１つのシアノバクテリア種に保有されている場合がある。あるいは、ｃｙＡｂｒＢは、シアノバクテリアのゲノム上だけでなくプラスミド上に存在する遺伝子にコードされている場合がある。本発明において機能喪失されるｃｙＡｂｒＢは、親シアノバクテリアが保有している限り、いずれのものであってもよく、その系統学的グループや、遺伝子の存在場所（ゲノム上又はプラスミド上）により制限されるものではない。

例えば、本発明において機能喪失されるｃｙＡｂｒＢとしては、図１に示したものが挙げられる。また例えば、機能喪失されるｃｙＡｂｒＢとしては、親シアノバクテリアがシネコシスティス属の場合、Sll0359、Sll0822、Syn7509DRAFT#00022930、Syn7509DRAFT#00034400、Syn7509DRAFT#00025140等が挙げられ、親シアノバクテリアがシネココッカス属の場合、SYNPCC7002#A0129、SYNPCC7002#A1095、Synpcc7942#1969、Synpcc7942#2255、Syc1843#c、Syc2126#c等が挙げられ、親シアノバクテリアがサーモシネココッカス属の場合、Tll2172、Tll1150等が挙げられ、親シアノバクテリアがトリコデスミウム属の場合、Tery0216、Tery0493、Tery1859等が挙げられ、親シアノバクテリアがアカリオクロリス属の場合、AM1#3666、AM1#4418、AM1#5314等が挙げられ、親シアノバクテリアがクロコスファエラ属の場合、Cwat1519、Cwat2079等が挙げられ、親シアノバクテリアがアナベナ属の場合、Alr0946、All2080、Ava#0524、Ava#3125等が挙げられる。好ましくは、本発明において機能喪失されるｃｙＡｂｒＢとしては、ｃｙＡｂｒＢファミリーのグループＢに属するものが挙げられ、より詳細な例としては、シネコシスティス・エスピーＰＣＣ６８０３のSll0822（配列番号２４）、シネコシスティス・エスピーＰＣＣ７５０９のSyn7509DRAFT#00022930（配列番号２５）、シネココッカス・エスピーＰＣＣ７９４２のSynpcc7942#2255（配列番号２６）、サーモシネココッカス・エロンガタスＢＰ−１のTll2172（配列番号２７）、トリコデスミウム・エリスラエウムＩＭＳ１０１のTery1859、アカリオクロリス・マリアナＭＢＩＣ１１０１７のAM1#4418、クロコスファエラ・ワトソニーＷＨ８５０１のCwat2079、及びアナベナ・エスピーＰＣＣ７１２０のAll2080（配列番号２８）等を挙げることができる。あるいは、本発明において機能喪失されるｃｙＡｂｒＢとしては、上記に例示したｃｙＡｂｒＢタンパク質のいずれかのアミノ酸配列と、４０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上、さらに好ましくは７０％以上、さらにより好ましくは８０％以上、なお好ましくは９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＡｂｒＢ型転写制御機能を有するポリペプチドを挙げることができる。

シアノバクテリアのアシル−ＡＣＰシンテターゼのアミノ酸配列、それをコードする遺伝子、及び該遺伝子の位置やそのヌクレオチド配列は、上述のＣｙａｎｏＢａｓｅやＮＣＢＩデータベースで確認することができる。本発明において親シアノバクテリアから機能喪失されるアシル−ＡＣＰシンテターゼの好ましい例としては、シネコシスティス・エスピーＰＣＣ６８０３のSlr1609（配列番号２９）、シネコシスティス・エスピーＰＣＣ７５０９のSyn7509DRAFT#00010940（配列番号３０）、シネココッカス・エスピーＰＣＣ７９４２のSynpcc7942#0918（配列番号３１）、サーモシネココッカス・エロンガタスＢＰ−１のTll1301（配列番号３２）、トリコデスミウム・エリスラエウムＩＭＳ１０１のTery#1829、アカリオクロリス・マリアナＭＢＩＣ１１０１７のAM1#5562、AM1#2147、クロコスファエラ・ワトソニーＷＨ８５０１のCwat#5663、アナベナ・エスピーＰＣＣ７１２０のAlr3602（配列番号３３）等を挙げることができる。あるいは、本発明において機能喪失されるアシル−ＡＣＰシンテターゼとしては、上記に例示したアシル−ＡＣＰシンテターゼタンパク質のいずれかのアミノ酸配列と、４０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上、さらに好ましくは７０％以上、さらにより好ましくは８０％以上、なお好ましくは９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアシル−ＡＣＰを合成する機能を有するポリペプチドを挙げることができる。

本明細書において、ｃｙＡｂｒＢの機能喪失とは、このタンパク質のＡｂｒＢ型転写制御機能を喪失させることである。また本明細書において、アシル−ＡＣＰシンテターゼの機能喪失とは、そのアシル−ＡＣＰ合成機能を喪失させることである。機能喪失の手段としては、タンパク質の機能喪失に通常使用される手段であれば特に限定されないが、例えば、ｃｙＡｂｒＢ又はアシル−ＡＣＰシンテターゼをコードする遺伝子を欠失又は不活性化させること、該遺伝子の転写を阻害する変異を導入すること、該遺伝子の転写産物の翻訳を阻害すること、又は発現した目的のタンパク質を特異的に阻害する阻害剤を投与することなどが挙げられる。本発明では、シアノバクテリアにおけるＡｂｒＢ型転写制御因子と、アシル−ＡＣＰシンテターゼとを機能喪失させるために、シアノバクテリアにおけるＡｂｒＢ型転写制御因子をコードする遺伝子と、アシル−ＡＣＰシンテターゼをコードする遺伝子とを欠失又は不活性化させることがより好ましい。

本発明で、機能喪失させるために欠失又は不活性化させるべきｃｙＡｂｒＢをコードする遺伝子の例としては、ｃｙＡｂｒＢファミリーのグループＢに属する遺伝子が好ましく、図１に示したｃｙＡｂｒＢをコードするポリヌクレオチド、及び上述したシネコシスティス・エスピーＰＣＣ６８０３のSll0822、シネコシスティス・エスピーＰＣＣ７５０９のSyn7509DRAFT_00022930、シネココッカス・エスピーＰＣＣ７９４２のSynpcc7942_2255、サーモシネココッカス・エロンガタスＢＰ−１のTll2172、トリコデスミウム・エリスラエウムＩＭＳ１０１のTery1859、アカリオクロリス・マリアナＭＢＩＣ１１０１７のAM1_4418、クロコスファエラ・ワトソニーＷＨ８５０１のCwat2079、又はアナベナ・エスピーＰＣＣ７１２０のAll2080をコードするポリヌクレオチドが挙げられる。これらの遺伝子及びそのヌクレオチド配列は、上述したＣｙａｎｏＢａｓｅ又はＮＣＢＩデータベース上で確認することができ、例えば、シネコシスティス・エスピーＰＣＣ６８０３のSll0822をコードするポリヌクレオチドは、sll0822遺伝子（NCBI Gene ID: 953185）として、またシネコシスティス・エスピーＰＣＣ７５０９のSyn7509DRAFT_00022930をコードするポリヌクレオチドは、syn7509DRAFT_00022930遺伝子（GenBank ID: ELR88577.1）として同定することができる。本発明で、機能喪失させるために欠失又は不活性化させるべきｃｙＡｂｒＢをコードする遺伝子は、s110822遺伝子又はsyn7509DRAFT_00022930遺伝子が好ましく、s110822遺伝子がより好ましい。さらに、これらのポリヌクレオチドのいずれかのヌクレオチド配列と、４０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上、さらに好ましくは７０％以上、さらにより好ましくは８０％以上、なお好ましくは９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつＡｂｒＢ型転写制御機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明で欠失又は不活性化させるべきｃｙＡｂｒＢをコードする遺伝子の例として挙げることができる。

また、本発明で機能喪失させるために、欠失又は不活性化させるべきアシル−ＡＣＰシンテターゼをコードする遺伝子の例としては、上述したシネコシスティス・エスピーＰＣＣ６８０３のSlr1609、シネコシスティス・エスピーＰＣＣ７５０９のSyn7509DRAFT_00010940、シネココッカス・エスピーＰＣＣ７９４２のSynpcc7942_0918、サーモシネココッカス・エロンガタスＢＰ−１のTll1301、トリコデスミウム・エリスラエウムＩＭＳ１０１のTery_1829、アカリオクロリス・マリアナＭＢＩＣ１１０１７のAM1_5562、AM1_2147、クロコスファエラ・ワトソニーＷＨ８５０１のCwat_5663、アナベナ・エスピーＰＣＣ７１２０のAlr3602をコードするポリヌクレオチドが挙げられる。これらの遺伝子及びそのヌクレオチド配列は、上述したＣｙａｎｏＢａｓｅ又はＮＣＢＩデータベース上で確認することができ、例えば、シネコシスティス・エスピーＰＣＣ６８０３のSlr1609をコードするポリヌクレオチドは、slr1609遺伝子（NCBI Gene ID: 953643）として、またシネコシスティス・エスピーＰＣＣ７５０９のSyn7509DRAFT_00010940をコードするポリヌクレオチドは、syn7509DRAFT_00010940遺伝子（GenBank ID: ELR87398.1）として同定することができる。本発明で、機能喪失させるために欠失又は不活性化させるべきアシル−ＡＣＰシンテターゼをコードする遺伝子は、slr1609遺伝子又はsyn7509DRAFT_00010940遺伝子が好ましく、slr1609遺伝子がより好ましい。さらに、これらのポリヌクレオチドのいずれかのヌクレオチド配列と、４０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上、さらに好ましくは７０％以上、さらにより好ましくは８０％以上、なお好ましくは９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつアシル−ＡＣＰを合成する機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明で欠失又は不活性化させるべきアシル−ＡＣＰシンテターゼをコードする遺伝子の例として挙げることができる。

上記遺伝子を欠失又は不活性化させる手段としては、該遺伝子のヌクレオチド配列上の１つ以上のヌクレオチドに対する突然変異導入、又は該ヌクレオチド配列に対する別のヌクレオチド配列の置換若しくは挿入、あるいは該遺伝子の配列の一部若しくは全部の削除などが挙げられる。上記遺伝子の転写を阻害する変異を導入する手段としては、該遺伝子のプロモーター領域に対する突然変異導入や、別のヌクレオチド配列での置換若しくは挿入による、当該プロモーターの不活性化が挙げられる。上記突然変異導や、ヌクレオチド配列の置換若しくは挿入のための具体的な手法としては、紫外線照射や部位特異的変異導入、相同組換え法、ＳＯＥ（splicing by overlap extension）−ＰＣＲ法（Gene, 1989, 77:61-68）などを挙げることができる。上記転写産物の翻訳を阻害する手段としては、マイクロＲＮＡによるＲＮＡ干渉を挙げることができる。タンパク質の特異的阻害剤としては、当該タンパク質や、その受容体又はリガンドに特異的な抗体が挙げられる。

好ましい実施形態において、本発明の改変シアノバクテリアは、上述の改変に加えて、さらにアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする異種遺伝子が導入されていてもよい。言い換えると、本発明の好ましい実施形態における改変シアノバクテリアは、ｃｙＡｂｒＢとアシル−ＡＣＰシンテターゼが機能喪失されており、かつさらにアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする異種遺伝子を保有するシアノバクテリアであり得る。アシル−ＡＣＰチオエステラーゼは、脂肪酸合成経路において、アシル−ＡＣＰから脂肪酸鎖を遊離させる酵素である。シアノバクテリアへのアシル−ＡＣＰチオエステラーゼの導入により、脂肪酸合成で生成したアシル−ＡＣＰから脂肪酸が切り出されて、遊離脂肪酸が生成されることが報告されている（非特許文献４）。一方で、シアノバクテリアでアシル−ＡＣＰチオエステラーゼの働きにより生成された遊離脂肪酸を効率的に分泌させるために、内生のアシル−ＡＣＰシンテターゼ遺伝子を機能喪失させることが有効であることが報告されている（Plant Physiol, 2010, 152: 1598-1610)。したがって、本発明の改変シアノバクテリアに対して、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子を外部から導入することにより、その細胞内における脂肪酸の生成を促進し、改変シアノバクテリアの脂質の分泌生産性を一層向上させることができる。

本発明の改変シアノバクテリアに導入するアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子としては、種子油に大量の中鎖脂肪酸を含有する植物、又は脂質生産性藻類等から単離されたものを挙げることができる。例えば、以下の植物又は藻類：シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ）；ブラディリゾビウム・ジャポニクム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍｊａｐｏｎｉｃｕｍ）；セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓ）；クスノキ（Ｃｉｎｎａｍｏｎｕｍｃａｍｐｈｏｒｕｍ）；カプシカム・シネンセ（Ｃａｐｓｉｃｕｍｃｈｉｎｅｎｓｅ）；クフェア・フッケリアナ（Ｃｕｐｈｅａｈｏｏｋｅｒｉａｎａ）；クフェア・ランセオラータ（Ｃｕｐｈｅａｌａｎｃｅｏｌａｔａ）；クフェア・パルストリス（Ｃｕｐｈｅａｐａｌｕｓｔｒｉｓ）；コリアンダー（ＣｏｒｉａｎｄｒｕｍｓａｔｉｖｕｍＬ．）；ベニバナ（Ｃａｒｔｈａｍｕｓｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ）；クフェア・ライチイ（Ｃｕｐｈｅａｗｒｉｇｈｔｉｉ）；ギニアアブラヤシ（Ｅｌａｅｉｓｇｕｉｎｅｅｎｓｉｓ）；ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍｈｉｒｓｕｔｕｍ）；マンゴスチン（Ｇａｒｃｉｎｉａｍａｎｇｏｓｔａｎａ）；ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓａｎｎｕｕｓ）；ジャーマン・アイリス（Ｉｒｉｓｇｅｒｍａｎｉｃａ）；イチハツ（Ｉｒｉｓｔｅｃｔｏｒｕｍ）；ナツメグ（Ｍｙｒｉｓｔｉｃａｆｒａｇｒａｎｓ）；コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍａｅｓｔｉｖｕｍ）；アメリカニレ（ＵｌｍｕｓＡｍｅｒｉｃａｎａ）；シナモン（Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍｃａｍｐｈｏｒｕｍ）、ココヤシ（Ｃｏｃｏｓｎｕｃｉｆｅｒａ）；又はウンベルラリア・カリフォルニカ（Ｕｍｂｅｌｌｕｌａｒｉａｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）に由来するアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子が挙げられる。あるいは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子を、本発明の改変シアノバクテリアに導入することもできる。本発明の上記アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする異種遺伝子は、好ましくは、ウンベルラリア・カリフォルニカ由来のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子、シナモン（Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍｃａｍｐｈｏｒｕｍ）のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子、ココヤシ（Ｃｏｃｏｓｎｕｃｉｆｅｒａ）のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子、又は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子である。上記植物や藻類、又は大腸菌由来のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子は、ＮＣＢＩデータベース上で同定することができる。例えば、ウンベルラリア・カリフォルニカ由来のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（UcTE）の遺伝子は、ＮＣＢＩデータベースにてGI:595955として登録されている。また例えば、シナモン及びココヤシのアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子は、それぞれGenBank ID:U31813、及びGenBank ID:JF338905として登録されている。また例えば、Ｅ．ｃｏｌｉＫ−１２株のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子は、NCBI Gene ID:945127として登録されている。

アシル−ＡＣＰチオエステラーゼは、基質となるアシル−ＡＣＰの脂肪酸鎖長及び不飽和度に対して特異性を有する（米国特許第５２９８４２１号、Planta, 1993, 189:425-432）。したがって、導入するアシルＡＣＰチオエステラーゼの種類を変えることによって、シアノバクテリアに所望の鎖長や不飽和度の遊離脂肪酸を生産させることが可能である。例えば、上述のウンベリラリア・カリフォルニカ由来アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（UcTE）はＣ１２鎖長のアシル基に基質特異性を有し、生成する遊離脂肪酸は、主にラウリン酸（Ｃ１２：０）などのＣ１２鎖長の遊離脂肪酸である。また例えば、上述のシナモン及びココヤシのアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子はＣ１４鎖長のアシル基に基質特異性を有し、生成する遊離脂肪酸は、主にミリスチン酸（Ｃ１４：０）などのＣ１４鎖長の遊離脂肪酸である。また例えば、上述のＥ．ｃｏｌｉＫ−１２株のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子は、Ｃ１６又はＣ１８鎖長のアシル基に基質特異性を有し、生成する遊離脂肪酸は、主にパルミチン酸（Ｃ１６：０）、パルミトレイン酸（Ｃ１６：１）、ステアリン酸（Ｃ１８：０）、オレイン酸（Ｃ１８：１）、リノール酸（Ｃ１８：２）、リノレン酸（Ｃ１８：３）などのＣ１６又はＣ１８鎖長の遊離脂肪酸である。

本発明の改変シアノバクテリアに導入される異種アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子は、シアノバクテリアにおけるコドン使用頻度にあわせて、コドンを至適化されることが好ましい。各種生物が使用するコドンの情報は、ＣｏｄｏｎＵｓａｇｅＤａｔａｂａｓｅ（[www.kazusa.or.jp/codon/]）から入手可能である。

シアノバクテリアへの異種アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子の導入には、例えば、プラスミドベクターなどのベクターを用いることができる。ベクターは、発現ベクターが好ましい。例えば、異種アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子のＤＮＡ断片及びそれを発現させるためのプロモーターを含む発現ベクターを構築する。プロモーターとしては、ｌａｃ、ｔａｃ若しくはｔｒｃプロモーター、イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加によって誘導可能な誘導体に関するプロモーター、又はＲｕｂｉｓｃｏオペロン（rbc）、ＰＳI反応中心タンパク質（psaAB）、ＰＳIIのＤ１タンパク質（psbA）などのシアノバクテリアから単離されたプロモーター利用できるが、これらに限定されるわけではなく、シアノバクテリアにおいて機能する多様なプロモーターを利用することができる。また上記発現ベクターには、当該ベクターが適切に導入された宿主を選択するためのマーカー遺伝子、（例えば、カナマイシン、クロラムフェニコール、スペクチノマイシン、エリスロマイシンなどの薬剤の耐性遺伝子）がさらに組み込まれていてもよい。上記発現ベクターを、公知の手段で親シアノバクテリア又は本発明の改変シアノバクテリアに導入し、形質転換する。シアノバクテリアへのベクターの導入法としては、自然形質転換法、エレクトロポレーション法、接合法などの一般的な方法を用いることができる。形質転換処理後のシアノバクテリアを選択培地、例えば、抗生物質含有培地で培養すれば、所望の形質を有する形質転換体を選択することができる。

好ましい実施形態において、異種アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子は、シアノバクテリアのゲノム上の内因性アシル−ＡＣＰシンテターゼ遺伝子の領域に導入され、該シアノバクテリアにおいてアシル−ＡＣＰシンテターゼを機能喪失させるとともに、異種アシル−ＡＣＰチオエステラーゼの発現能を付与する。例えば、ＳＯＥ−ＰＣＲ法（Gene, 1989, 77:61-68）によって、両端にアシル−ＡＣＰシンテターゼ遺伝子領域のＤＮＡ断片が付加された異種アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子のＤＮＡ断片を構築し、これをベクターに挿入し、該ベクターをシアノバクテリアに導入してゲノム上アシル−ＡＣＰシンテターゼ遺伝子領域との相同組換えを起こさせることによって、ゲノム上のアシル−ＡＣＰシンテターゼ遺伝子の領域に異種アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子が導入された改変シアノバクテリアを得ることができる。別の実施形態において、異種アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子は、シアノバクテリアのゲノム上における、遺伝子導入をしてもシアノバクテリアに害を与えない領域（ニュートラルサイト）に導入されてもよい。

（３．脂質生産方法）
以上の手順で、本発明の改変シアノバクテリアを製造することができる。本発明の改変シアノバクテリアは、脂質分泌生産性が向上している。したがって、本発明の改変シアノバクテリアを適切な条件で培養し、次いで分泌された脂質を回収すれば、効率のよい微生物学的脂質生産を実施することができる。本発明の脂質生産方法でシアノバクテリアにより分泌生産される脂質としては、各種遊離脂肪酸が挙げられ、好ましくはラウリン酸（Ｃ１２：０）を豊富に含有する遊離脂肪酸であり得る。

シアノバクテリアの培養は、一般に、ＢＧ−１１培地（J Gen Microbiol., 1979, 111:1-61）を用いた液体培養又はその変法に基づいて実施することができる。脂質生産のための培養期間としては、十分に菌体が増殖した条件で脂肪酸が高濃度に蓄積するように行えばよく、例えば、７〜４５日間、好ましくは１０〜３０日間、より好ましくは１４〜２１日間通気攪拌培養又は振とう培養がすることが好適である。

上記培養により、シアノバクテリアは脂質を生産し、当該脂質を培養物中に分泌する。分泌された脂質を回収する場合、培養物からろ過、遠心分離等により細胞等の固形分を除去し、残った液体成分を回収した後、クロロホルム／メタノール抽出法、ヘキサン抽出法、エタノール抽出法等により脂質を回収又は精製すればよい。また、大規模な生産の場合は、細胞を除去した後の培養物より油分を圧搾又は抽出により回収後、脱ガム、脱酸、脱色、脱蝋、脱臭等の一般的な精製を行い、脂質を得ることができる。本発明による脂質生産方法では、脂質がシアノバクテリアの細胞外に分泌されるので、脂質回収のために細胞を破壊する必要がない。脂質回収後に残った細胞は、繰り返し脂質生産に使用することができる。

本発明の改変シアノバクテリアを用いた脂質生産方法により得られる脂肪酸は、食用として用いられ得る他、化粧品等に配合する乳化剤や、石鹸や洗剤等の洗浄剤、繊維処理剤、毛髪リンス剤、又は殺菌剤や防腐剤の原料として利用することができる。

（４．例示的実施形態）
上述した本発明の別の例示的実施形態として、さらに以下の組成物、製造方法、用途あるいは方法を本明細書に開示する。ただし、本発明はこれらの実施形態に限定されない。

＜１＞シアノバクテリアにおけるＡｂｒＢ型転写制御因子と、アシル−ＡＣＰシンテターゼとを機能喪失させることを含む、改変シアノバクテリアの製造方法。

＜２＞シアノバクテリアにおけるＡｂｒＢ型転写制御因子と、アシル−ＡＣＰシンテターゼとを機能喪失させることを含む、シアノバクテリアの脂質分泌生産性の向上方法。

＜３＞ＡｂｒＢ型転写制御因子と、アシル−ＡＣＰシンテターゼとが機能喪失した改変シアノバクテリア。

＜４＞好ましくは、シアノバクテリアにおけるＡｂｒＢ型転写制御因子をコードする遺伝子と、アシル−ＡＣＰシンテターゼをコードする遺伝子とを欠失又は不活性化することを含む、＜１＞記載の方法。

＜５＞好ましくは、シアノバクテリアにおけるＡｂｒＢ型転写制御因子をコードする遺伝子と、アシル−ＡＣＰシンテターゼをコードする遺伝子とを欠失又は不活性化することを含む、＜２＞記載の方法。

＜６＞好ましくは、ＡｂｒＢ型転写制御因子をコードする遺伝子と、アシル−ＡＣＰシンテターゼをコードする遺伝子とが欠失又は不活性化されている、＜３＞記載の改変シアノバクテリア。

＜７＞好ましくは、さらにアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする異種遺伝子を導入することを含む、＜１＞又は＜４＞記載の方法。

＜８＞好ましくは、さらにアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする異種遺伝子を導入することを含む、＜２＞又は＜５＞記載の方法。

＜９＞好ましくは、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする異種遺伝子を含む、＜３＞又は＜６＞記載の改変シアノバクテリア。

＜１０＞上記＜４＞〜＜９＞のいずれか１において、好ましくは、上記ＡｂｒＢ型転写制御因子をコードする遺伝子は以下より選択される：
（１）図１に示されるＡｂｒＢ型転写制御因子をコードするポリヌクレオチド；
（２）ｃｙＡｂｒＢファミリーのグループＢに属するタンパク質をコードするポリヌクレオチド：好ましくはSll0822、Syn7509DRAFT_00022930、Synpcc7942_2255、Tll2172、Tery1859、AM1_4418、Cwat2079、及びAll2080からなる群より選択されるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；ならびに
（３）上記（１）及び（２）に示されるポリヌクレオチドのいずれかのヌクレオチド配列と、４０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上、さらに好ましくは７０％以上、さらにより好ましくは８０％以上、なお好ましくは９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつＡｂｒＢ型転写制御機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。

＜１１＞上記＜１０＞において、上記ＡｂｒＢ型転写制御因子をコードする遺伝子は、好ましくはsll0822遺伝子又はsyn7509DRAFT_00022930遺伝子であり、より好ましくはsll0822遺伝子である。

＜１２＞上記＜４＞〜＜１１＞のいずれか１において、好ましくは、上記アシル−ＡＣＰシンテターゼをコードする遺伝子は以下より選択される：
（１）Slr1609、Syn7509DRAFT_00010940、Synpcc7942_0918、Tll1301、Tery_1829、AM1_5562、AM1_2147、Cwat_5663、及びAlr3602からなる群より選択されるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；ならびに
（２）上記（１）に示されるポリヌクレオチドのいずれかのヌクレオチド配列と、４０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上、さらに好ましくは７０％以上、さらにより好ましくは８０％以上、なお好ましくは９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつアシル−ＡＣＰを合成する機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。

＜１３＞上記＜１２＞において、上記アシル−ＡＣＰシンテターゼをコードする遺伝子は、好ましくはslr1609遺伝子又はsyn7509DRAFT_00010940遺伝子であり、より好ましくはslr1609遺伝子である。

＜１４＞上記＜７＞〜＜１３＞のいずれか１において、好ましくは、上記アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする異種遺伝子は、ウンベリラリア・カリフォルニカ由来アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子である。

＜１５＞上記＜７＞〜＜１３＞のいずれか１において、好ましくは、上記アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする異種遺伝子は、シナモン（Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍｃａｍｐｈｏｒｕｍ）又はココヤシ（Ｃｏｃｏｓｎｕｃｉｆｅｒａ）のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子である。

＜１６＞上記＜７＞〜＜１３＞のいずれか１において、好ましくは、上記アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする異種遺伝子は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）Ｋ−１２のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子である。

＜１７＞上記＜７＞〜＜１６＞のいずれか１において、好ましくは、上記アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする異種遺伝子は、上記シアノバクテリアのゲノム配列中における、上記アシル−ＡＣＰシンテターゼをコードする遺伝子の領域に導入されるか、又はニュートラルサイトに導入される。

＜１８＞上記＜１＞〜＜１７＞のいずれか１において、上記シアノバクテリアは、
好ましくは、シネコシスティス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、シネココッカス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、サーモシネココッカス属（Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコデスミウム属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｓｍｉｕｍ）、アカリオクロリス属（Ａｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ）、クロコスファエラ属（Ｃｒｏｃｏｓｐｈａｅｒａ）、又はアナベナ属（Ａｎａｂａｅｎａ）のシアノバクテリアであり、
より好ましくは、シネコシスティス・エスピーＰＣＣ６８０３、シネコシスティス・エスピーＰＣＣ７５０９、シネコシスティス・エスピーＰＣＣ６７１４、シネココッカス・エスピーＰＣＣ７９４２、サーモシネココッカス・エロンガタスＢＰ−１、トリコデスミウム・エリスラエウムＩＭＳ１０１、アカリオクロリス・マリアナＭＢＩＣ１１０１７、クロコスファエラ・ワトソニーＷＨ８５０１、又はアナベナ・エスピーＰＣＣ７１２０であり、
さらに好ましくは、シネコシスティス・エスピーＰＣＣ６８０３、シネコシスティス・エスピーＰＣＣ６７１４、又はシネコシスティス・エスピーＰＣＣ７５０９である。

＜１９＞上記＜１＞、＜４＞、＜７＞、＜１０＞〜＜１８＞のいずれか１に記載の方法で製造された改変シアノバクテリア、又は＜３＞、＜６＞、＜９＞、＜１０＞〜＜１８＞のいずれか１に記載の改変シアノバクテリアを培養することを含む、脂質生産方法。

＜２０＞好ましくは、上記改変シアノバクテリアに、ウンベリラリア・カリフォルニカ由来アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子が導入されており、かつＣ１２鎖長の遊離脂肪酸が主に生産される、＜１９＞記載の方法。

＜２１＞好ましくは、上記改変シアノバクテリアに、シナモン（Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍｃａｍｐｈｏｒｕｍ）又はココヤシ（Ｃｏｃｏｓｎｕｃｉｆｅｒａ）のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子が導入されており、かつＣ１４鎖長の遊離脂肪酸が主に生産される、＜１９＞記載の方法。

＜２２＞好ましくは、上記改変シアノバクテリアに、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）Ｋ−１２のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子が導入されており、かつＣ１６又はＣ１８鎖長の遊離脂肪酸が主に生産される、＜１９＞記載の方法。

以下、本発明を実施例に基づいてさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。

参考例１シアノバクテリア株の培養
以下の実施例におけるシアノバクテリア株の培養は、５０ｍＬの改良ＢＧ−１１を加えた１００ｍＬ三角フラスコ中で、一定の照明下（４０μＥ・ｍ^-2・ｓｅｃ^-1）、３０℃にてロータリーシェーカー（１２０ｒｐｍ）を用いて行った。形質転換体の選択培養時には、適切な抗生物質を以下の終濃度となるように該培地に添加した：クロラムフェニコール終濃度２５μｇ／ｍＬ、又はスペクチノマイシン若しくはカナマイシン２０μｇ／ｍＬ。改良ＢＧ−１１培地の組成を以下の表１に示す。

実施例１ｃｙＡｂｒＢ／アシル−ＡＣＰシンテターゼ二重欠損シアノバクテリア改変株の構築
（１．シネコシスティス・エスピーＰＣＣ６８０３由来ΔrecJ株の構築）
単細胞光ヘテロ栄養性シアノバクテリウムであるシネコシスティス・エスピーＰＣＣ６８０３において、エキソヌクレアーゼ遺伝子recJ（sll1354）の破壊を行い、ΔrecJ株を得た。recJは、破壊することで遺伝子組み換え効率が向上することが報告されている遺伝子である（FEMS Microbiol Lett, 2002, 206:215-219）。ΔrecJ株を親株に用いることにより、遺伝子組み換え効率が向上し、組み換え体取得が容易になる。具体的には、シネコシスティス・エスピーＰＣＣ６８０３株のゲノムＤＮＡを鋳型として、表２記載のプライマーセットrecJ-FとCm/recJ-R、又はCm/recJ-FとrecJ-Rを用いて、recJ遺伝子コード領域を２つのＤＮＡ断片に分割した。また、表２記載のプライマーセットCm-FとCm-Rを用いて、pACYC184プラスミドよりクロラムフェニコール耐性マーカー遺伝子（cat）を有する１３３３ｂｐのＤＮＡ配列をＰＣＲ増幅した。次いで、作製した２つのrecJ遺伝子断片とcat断片とを混合した溶液を鋳型として、表２記載のプライマーrecJ-F及びrecJ-Rを用いたｆｕｓｉｏｎＰＣＲによってrecJ遺伝子コード領域間にcat断片が挿入されたコンストラクトを取得した。得られたコンストラクトでシネコシスティス・エスピーＰＣＣ６８０３の野生株を形質転換することで、recJ遺伝子が破壊されたクロラムフェニコール耐性を持つΔrecJ株を取得した。

（２．ΔrecJ株への脂肪酸分泌能付与）
シネコシスティス・エスピーＰＣＣ６８０３での脂肪酸の培養液中への分泌生産は、内生のアシル−ＡＣＰシンテターゼ（slr1609）の機能喪失によって達成できる（Plant Physiol, 2010, 152:1598-1610）。また、ＰＣＣ６８０３株にアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ酵素をコードする遺伝子を導入することで、脂肪酸生産量が促進されることが報告されている（非特許文献４）。本実施例では、シネコシスティス・エスピーＰＣＣ６８０３のゲノム上のアシル−ＡＣＰシンテターゼをコードする遺伝子であるslr1609のコード領域間に、スペクチノマイシン耐性遺伝子を挿入してslr1609遺伝子を不活性化させることで、アシル−ＡＣＰシンテターゼを機能喪失し、脂肪酸生産性が向上した改変株を作製した。さらに、該slr1609コード領域にシネコシスティス・エスピーＰＣＣ６８０３にあわせてコドンを最適化したウンベリラリア・カリフォルニカ（Ｕｍｂｅｌｌｕｌａｒｉａｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）由来のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（UcTE）遺伝子を挿入することで、脂肪酸生産性がさらに向上した改変株を作製した。以下に改変株の作製手順を詳細に説明する。

シネコシスティス・エスピーＰＣＣ６８０３株のゲノムＤＮＡより、表２記載のプライマーslr1609f-F及びslr1609r-Rを用いてslr1609遺伝子の部分断片（2049bp）を増幅し、pUC118プラスミド（タカラバイオ株式会社）のHincIIサイト間にクローニングし、pUC118-slr1609プラスミドを取得した。

pDG1726プラスミド（Guerout-Fleury et al., Gene, 1995, 167:335-336）を鋳型として、表２記載のプライマーslr1609/sp-F及びslr1609/sp-Rを用いたＰＣＲにより、スペクチノマイシン耐性マーカー遺伝子断片（sp断片：配列番号１）を取得した。次に、上記pUC118-slr1609プラスミドを鋳型として、表２記載のプライマーslr1609f-R及びslr1609r-Fを用いたＰＣＲにより、slr1609遺伝子コード領域間の２４２ｂｐ領域が削除された直鎖ＤＮＡ断片を取得し、該断片とsp断片をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＰＣＲクローニング法（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて結合し、間にsp断片が挿入されたslr1609遺伝子コード領域のＤＮＡ配列を含むpUC118-slr1609::spプラスミドを得た。

上記pUC118-slr1609::spプラスミドを鋳型とし、表２記載のプライマーslr1609-R及びSp-Fを用いたＰＣＲにより、該プラスミドを線状化した。表２記載のプライマーslr1609/psbA2-F及びpsbA2/UcTE-Rを用いてシネコシスティス・エスピーＰＣＣ６８０３由来psbA2遺伝子のプロモーター領域断片（配列番号２）をＰＣＲ増幅した。ウンベリラリア・カリフォルニカ由来のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（UcTE）遺伝子断片（UcTE断片：配列番号３）は、非特許文献４に記載されているシネコシスティス・エスピーＰＣＣ６８０３にあわせてコドンを最適化した配列を人工合成により作製し、これを表２記載のプライマーUcTE-F及びUcTE/sp-Rを用いてＰＣＲ増幅した。上記線状化したプラスミドに、上記psbA2のプロモーター領域断片、及びUcTE断片を加えてＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＰＣＲクローニング法（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）によりクローニングし、slr1609遺伝子コード領域間にpsbA2プロモーター領域断片、UcTE断片、及びsp断片の順序に並んで挿入されたpUC118-slr1609::psbA2-UcTE-spプラスミドを得た。

得られたpUC118-slr1609::spプラスミドで上記１．で作製したΔrecJ株を形質転換し、スペクチノマイシン耐性により選抜することで、ゲノム上のアシル−ＡＣＰシンテターゼ遺伝子slr1609を不活性化させたΔrecJΔslr1609::sp株を取得した。また、pUC118-slr1609::psbA2-UcTE-spプラスミドで別のΔrecJ株を形質転換し、スペクチノマイシン耐性により選抜することで、ゲノム上のアシル−ＡＣＰシンテターゼslr1609遺伝子コード領域間にコドンを最適化したアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（UcTE）遺伝子を導入することにより、アシル−ＡＣＰシンテターゼ遺伝子slr1609が不活性化するとともにアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ発現能が付与されたΔrecJΔslr1609::UcTE株を取得した。

（３．ｃｙＡｂｒＢ欠損株の構築）
ＡｂｒＢ型転写制御因子をコードする遺伝子sll0822を含む、シネコシスティス・エスピーＰＣＣ６８０３のゲノム領域９００ｂｐ（ＣｙａｎｏＢａｓｅでのゲノム塩基番号２８６２７３９〜２８６１８４０に該当する領域）を、シネコシスティス・エスピーＰＣＣ６８０３株のゲノムＤＮＡを鋳型として、表２記載のプライマー0822delF及び0822delRを用いて増幅した。

得られたＰＣＲ産物をｐＴ７ＢｌｕｅＴ−ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローニングし、sll0822遺伝子上のStyIサイトに、カナマイシン耐性マーカー遺伝子（pRL161プラスミドからHincII処理により切り出したもの）を挿入した。得られたコンストラクトを上記２．で作製したΔrecJΔslr1609::sp株及びΔrecJΔslr1609::UcTE株にそれぞれ導入し、カナマイシン耐性選抜により、二重遺伝子破壊株であるΔrecJΔsll0822Δslr1609::sp株及びΔrecJΔsll0822Δslr1609::UcTE株欠損株を取得した。

実施例２シアノバクテリア改変株における脂肪酸分泌生産性向上
（１．改変株の培養）
初発菌体濃度ＯＤ７３０＝０．２とし、参考例１に記載の条件で、実施例１で作製したΔrecJΔslr1609::sp株、ΔrecJΔsll0822Δslr1609::sp株、ΔrecJΔslr1609::UcTE株、及びΔrecJΔsll0822Δslr1609::UcTE株を２週間液体培養した。

（２．脂肪酸組成分析）
培養終了後、各培養液５０ｍＬに、ＮａＨＰＯ₄ １ｇ、及び内部標準としてトルエンに溶解したＣ１５脂肪酸（７−ペンタデカノン；５ｎｍｏｌ／μＬ）１０μＬを添加した。この液にヘキサン１０ｍＬを添加し、十分に攪拌した後１０分間静置し、次いで室温、２５００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行った後、ヘキサン層の上層部分をナス型フラスコに採取した。また、遠心分離した下層から、上記と同様にヘキサン（５ｍＬ）添加、攪拌、静置、遠心分離する操作をさらに２回繰り返した。得られた上層部分をまとめて減圧濃縮することで乾燥サンプルを得た。ナス型フラスコ中に５％塩酸メタノール溶液を３ｍＬ添加して乾燥サンプルを溶解し、本溶液全量をねじ口試験管に移し、８０度で３時間高温処理することにより脂肪酸のメチルエステル化処理を行った。得られた試料にヘキサン３ｍＬをさらに添加し、十分に攪拌し、５分間静置した後、上層部分を採取し、適宜濃縮を行い、ガスクロマトグラフィー解析に供した。ガスクロマトグラフィー装置はＧＣ−２０１４（ＳＨＩＭＡＤＺＵ）を用い以下の条件で解析を実施した。
［キャピラリーカラム：ＵＬＢＯＮＨＲ−ＳＳ−１０２５ｍ×０．２５ｍｍφ（ＳＨＩＭＡＤＺＵ）、移動層：高純度ヘリウム、カラム内流量：１．９８ｍＬ／ｍｉｎ、昇温プログラム：１７０℃（３０分間）→１０℃／ｍｉｎで昇温→２２０℃（５分間）、平衡化時間：３分間、注入口：スプリット注入（スプリット比：１０：１），圧力２７８ｋＰａ，２４．８ｍＬ／ｍｉｎ、注入量：２μＬ、洗浄バイアル：ヘキサン、検出器温度：２５０℃］

ガスクロマトグラフィー解析で取得した波形データのピーク面積に基づいて、培養液中に分泌された各脂肪酸のメチルエステルの量を定量した。測定した各ピーク面積を、内部標準である７−ペンタデカノンについてのピーク面積と比較することで試料間の補正を行った。培養液１リットルあたりの遊離脂肪酸量を算出し、さらに算出した値を、事前に計測した培養液中に含まれるシアノバクテリア菌体量（ＯＤ７３０）で標準化して菌体あたりの脂肪酸分泌量を算出した。各改変株について独立した３回の培養とクロマトグラフィー解析を実施し、算出した脂肪酸分泌量の平均値を求めた。

結果を図２〜５に示す。ｃｙＡｂｒＢとアシル−ＡＣＰシンテターゼが二重に欠損したシアノバクテリア改変株ΔrecJΔsll0822Δslr1609::spでは、アシル−ＡＣＰシンテターゼ単独欠損株ΔrecJΔslr1609::spと比較して、脂肪酸分泌量が培養液あたりで２．４０倍（図２）、菌体あたりで２．３５倍向上していた（図３）。
上記二重欠損株にさらにアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子を導入したΔrecJΔsll0822Δslr1609::UcTE株の脂肪酸分泌量は、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子導入単独欠損株ΔrecJΔslr1609::UcTEと比較して、培養液あたりで２．２６倍（図４）、菌体あたりで約２．１３倍向上していた（図５）。さらに、当該アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子導入二重欠損株ΔrecJΔsll0822Δslr1609::UcTEの脂肪酸分泌量は、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子未導入株ΔrecJΔsll0822Δslr1609::spと比較して、培養液あたりで１．６５倍、菌体あたりで１．８４倍に増加した。

上記の結果より、シアノバクテリアにおけるＡｂｒＢ型転写因子とアシル−ＡＣＰシンテターゼの機能喪失が、菌体による脂肪酸の分泌生産を促進し、かつ培養液あたりの脂肪酸分泌生産量を大きく向上させることが見出された。

Claims

シアノバクテリアにおけるＡｂｒＢ型転写制御因子と、アシル−ＡＣＰシンテターゼとを機能喪失させることを含む、改変シアノバクテリアの製造方法。
シアノバクテリアにおけるＡｂｒＢ型転写制御因子と、アシル−ＡＣＰシンテターゼとを機能喪失させることを含む、シアノバクテリアの脂質分泌生産性の向上方法。
シアノバクテリアにおけるＡｂｒＢ型転写制御因子をコードする遺伝子と、アシル−ＡＣＰシンテターゼをコードする遺伝子とを欠失又は不活性化することを含む、請求項１又は２記載の方法。
前記ＡｂｒＢ型転写制御因子をコードする遺伝子がｃｙＡｂｒＢファミリーのグループＢに属する遺伝子である、請求項３記載の方法。
前記ＡｂｒＢ型転写制御因子をコードする遺伝子が、以下：
配列番号２４で示されるアミノ酸配列からなるSll0822、
配列番号２５で示されるアミノ酸配列からなるSyn7509DRAFT#00022930、
配列番号２６で示されるアミノ酸配列からなるSynpcc7942#2255、
配列番号２７で示されるアミノ酸配列からなるTll2172、
配列番号２８で示されるアミノ酸配列からなるAll2080、又は
これらとアミノ酸配列が９０％以上同一かつＡｂｒＢ型転写制御機能を有するポリペプチド、
をコードする遺伝子である、請求項３又は４記載の方法。
前記アシル−ＡＣＰシンテターゼをコードする遺伝子が、以下：
配列番号２９で示されるアミノ酸配列からなるSlr1609、
配列番号３０で示されるアミノ酸配列からなるSyn7509DRAFT#00010940、
配列番号３１で示されるアミノ酸配列からなるSynpcc7942#0918、
配列番号３２で示されるアミノ酸配列からなるTll1301、
配列番号３３で示されるアミノ酸配列からなるAlr3602、又は
これらとアミノ酸配列が９０％以上同一かつアシル−ＡＣＰを合成する機能を有するポリペプチド、
をコードする遺伝子である、請求項３〜５のいずれか１項記載の方法。
さらにアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする異種遺伝子を導入することを含む、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
前記アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子が、ウンベルラリア・カリフォルニカ由来アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子である、請求項７記載の方法。
前記アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子が、前記アシル−ＡＣＰシンテターゼをコードする遺伝子の領域に導入される、請求項７又は８記載の方法。
前記シアノバクテリアが、シネコシスティス属、シネココッカス属、サーモシネココッカス属、又はアナベナ属に属する、請求項１〜９のいずれか１項記載の方法。
ＡｂｒＢ型転写制御因子と、アシル−ＡＣＰシンテターゼとが機能喪失した改変シアノバクテリア。
ＡｂｒＢ型転写制御因子をコードする遺伝子と、アシル−ＡＣＰシンテターゼをコードする遺伝子とが欠失又は不活性化されている、請求項１１記載の改変シアノバクテリア。
前記ＡｂｒＢ型転写制御因子をコードする遺伝子がｃｙＡｂｒＢファミリーのグループＢに属する遺伝子である、請求項１２記載の改変シアノバクテリア。
前記ＡｂｒＢ型転写制御因子をコードする遺伝子が、以下：
配列番号２４で示されるアミノ酸配列からなるSll0822、
配列番号２５で示されるアミノ酸配列からなるSyn7509DRAFT#00022930、
配列番号２６で示されるアミノ酸配列からなるSynpcc7942#2255、
配列番号２７で示されるアミノ酸配列からなるTll2172、
配列番号２８で示されるアミノ酸配列からなるAll2080、又は
これらとアミノ酸配列が９０％以上同一かつＡｂｒＢ型転写制御機能を有するポリペプチド、
をコードする遺伝子である、請求項１２又は１３記載の改変シアノバクテリア。
前記アシル−ＡＣＰシンテターゼをコードする遺伝子が、以下：
配列番号２９で示されるアミノ酸配列からなるSlr1609、
配列番号３０で示されるアミノ酸配列からなるSyn7509DRAFT#00010940、
配列番号３１で示されるアミノ酸配列からなるSynpcc7942#0918、
配列番号３２で示されるアミノ酸配列からなるTll1301、
配列番号３３で示されるアミノ酸配列からなるAlr3602、又は
これらとアミノ酸配列が９０％以上同一かつアシル−ＡＣＰを合成する機能を有するポリペプチド、
をコードする遺伝子である、請求項１２〜１４のいずれか１項記載の改変シアノバクテリア。
アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする異種遺伝子を含む請求項１１〜１５のいずれか１項記載の改変シアノバクテリア。
前記アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする異種遺伝子が、ウンベルラリア・カリフォルニカ由来アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子である、請求項１６記載の改変シアノバクテリア。
前記アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子が、前記アシル−ＡＣＰシンテターゼをコードする遺伝子の領域に導入されている、請求項１６又は１７記載の改変シアノバクテリア。
シネコシスティス属、シネココッカス属、サーモシネココッカス属、又はアナベナ属に属する、請求項１１〜１８のいずれか１項記載の改変シアノバクテリア。
請求項１及び３〜１０のいずれか１項記載の方法で製造された改変シアノバクテリア又は請求項１１〜１９のいずれか１項記載の改変シアノバクテリアを培養することを含む、脂質生産方法。