ES2251770T3 - Modificacion por ingenieria genetica de tioesterasas de plantas y descripcion de tioesterasas de plantas con especificidad de sustrato novedosa. - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a procedimientos para modificar la especificidad de sustrato de acil-ACP tioesterasas vegetales, y acil-ACP tioesterasas vegetales puestas a punto genéticamente que se producen mediante procedimientos. La partes que representa los dos tercios del extremo C de las tioesterasas vegetales se identifica como siendo deseable para estas modificaciones. La invención se refiere también a secuencias y a productos de recombinación de ADN útiles para la expresión de tioesterasas puestas a punto genéticamente, así como a nuevas tioesterasas vegetales producidas a partir de éstos. Estas secuencias de ADN pueden utilizarse para la expresión de las tioesterasas genéticamente puestas a punto en células huéspedes, en particular en células de simientes de plantas cultivadas oleaginosas, para modificar la composición de ácidos grasos. Un acil-ACP tioesterasa vegetal que presenta una preferencia para C12, descrita en la solicitud, puede modificar de manera a obtener una tioesterasa vegetal que presenta una actividad aproximadamente igual respecto de sustratos de C14 y de sustratos de C12. Una modificación suplementaria de la enzima de C12 permite obtener una tioesterasa que presenta una actividad superior sobre sustratos de C14 respecto de los sustratos de C12. Una tioesterasa 18:1 vegetal que presenta un interés particular es la de aquella cuya actividad relativa 18:1 ha aumentado. Tales tioesterasas FatA son útiles para una mayor producción de estearato en aceites de semillas vegetales.

Description

Modificación por ingeniería genética de tioesterasas de plantas y descripción de tioesterasas de plantas con especificidad de sustrato novedosa.

Campo técnico

La presente invención se refiere a acil - ACP tioesterasas modificadas por ingeniería genética derivadas de la Garm FatA1 tioesterasa de mangostán y las secuencias de ADN que las codifican.

Introducción Antecedentes

Los ácidos grasos son ácidos orgánicos que tienen una cadena de hidrocarburo de aproximadamente 4 a 24 carbonos. Se conocen muchas clases diferentes de ácidos grasos que difieren entre sí en la longitud de las cadenas, y en la presencia, número y posición de dobles enlaces. En las células, los ácidos grasos típicamente existen en formas de enlaces covalentes, la parte carboxilo refiriéndose a un grupo acilo graso. La longitud de cadena y grado de saturación de estas moléculas a menudo se muestra en al fórmula CX:Y, en la que "X" indica número de carbonos e "Y" indica el número de dobles enlaces.

La producción de ácidos grasos en plantas comienza en el plástido con la reacción entre la acetil - CoA y malonil - ACP para producir butiril - ACP catalizada por la enzima \beta-cetoacil - ACP sintasa III. La elongación de acetil
- ACP hasta ácidos grasos de 16- y 18- carbonos implica la acción cíclica de la siguiente secuencia de reacciones: condensación con dos unidades de carbono de malonil - ACP para formar una \beta-cetoacil - ACP (\beta-cetoacil - ACP sintasa), reducción de la función ceto a un alcohol (\beta-cetoacil - ACP reductasa), deshidratación para formar una enoil - ACP (\beta-hidroxiacil-ACP deshidrata), y finalmente la reducción de la enoil - ACP para formar la acil ACP alongada saturada (enoil - ACP reductasa). La \beta-cetoacil - ACP sintasa I cataliza la elongación hasta palmitoil - ACP (C16:0), mientras la \beta-cetoacil - ACP sintasa II cataliza la elongación final hasta estearoil - ACP (C18:0). Los ácidos grasos de cadena más larga producidos por el FAS son típicamente de 18 carbonos de longitud. Una etapa bioquímica de ácido graso adicional que se produce en el plástido es la desaturación de estearoil - ACP (C18:0) para formar oleoil - ACP (C18.1) en una reacción catalizada por una \Delta - 9 desaturasa, también a menudo denominada una "estearoil - ACP desaturasa" debido a su alta actividad hacia estearato la acil - ACP de 18 carbonos.

La elongación de la cadena de carbonos en los plástidos se puede terminar mediante transferencia del grupo acilo a glicerol 3-fosfato, con el glicerolípido resultante retenido en la ruta de biosíntesis de lípidos de plástidos, "procariótica". Como alternativa, las tioesterasa específicas pueden interceptar la ruta procariótica hidrolizando las acil ACP recientemente producidas en los ácidos grasos libres y ACP.

Posteriormente, los ácidos grasos libres se convierten en la acil - CoA grasa en la envuelta de plástido y se exportan al citoplasma. Allí, se incorporan en la ruta de biosíntesis de lípidos "eucariótica" en el retículo endoplásmico que es responsable de la formación de fosfolípidos, triglicéridos y otros lípidos neutros. Después del transporte de la acil CoA grasa al retículo endoplásmico, se pueden producir posteriores etapas secuenciales para la producción de triglicéridos. Por ejemplo, los grupos acilo grasos poliinsaturados tales como linoleilo y \alpha-linoleilo, se producen como el resultado de la desnaturalización secuencial de grupos aleilacilo mediante la acción de als enzimas unidas a membrana. Los triglicéridos se forman mediante al acción de las enzimas 1-, 2-, y 3 - acil - ACP transferasa glicerol-3-fosfato aciltransferasa, ácido lipofosfátidico aciltransferasa y diacilglicerol aciltransferasa. La composición de ácidos grasos de una célula vegetal es un reflejo de la combinación de ácidos grasos libres y los ácidos grasos (grupos acilo grasos) incorporados en los triglicéridos como resultado de las actividades acetiltransferasa. Las propiedades de un triglicérido dado dependerá de varias combinaciones de grupos acilo grasos en diferentes posiciones en la molécula de triglicérido. Por ejemplo, si los grupos acilo grasos son mayormente ácidos grasos saturados, entonces el triglicérido será sólido a temperatura ambiente. Sin embargo, en generillos aceites vegetales tienden a ser mezclas de diferentes triglicéridos. Las propiedades oleosas de los triglicéridos son por lo tanto resultado de la combinación de triglicéridos que componen el aceite, que están a su vez influenciados por sus respectivas composiciones de acilo
graso.

Las proteína transferasas portadoras de acil - acilo son de interés bioquímico debido a sus papeles en la síntesis de ácidos grasos y sus utilidades en la bioingeniería de semillas de aceites vegetales. Se ha aislado una acil
- ACP tiosterasa de cadena media del árbol laurel de california, Umbellularia californica, (Davies y col., (1991) Arch. Biochem. Biophys 290: 37 - 45), y su ADNc clonado y expresado en E. coli (Voelker y col., (1994) J. Bacterial 176: 7320 - 7327 y semillas de Arabidopsis thaliana y Brassica napus (Voelker y col., (1992) Science 257: 72 - 74). En todos los casos, se acumularon grandes cantidades de laurato (12:0) y pequeñas cantidades de miristato (14:0). Estos resultados demuestran el papel de la TE en la determinación de la longitud de cadena durante la biosíntesis de novo de ácidos grasos en plantas y la utilidad de estas enzimas para modificar la composición del aceite de semillas en plantas superiores.

Recientemente, se ha clonado un número de ADNc que codifica diferentes acil - ACP tioesterasas de plantas (Knutzon y col., (1992) Plant Physiol. 100: 1751 - 1758; Voelker, y col., (1992) anteriormente; Dorman y col., (1993) Planta 189: 425 - 432; Dorman y col., (1994) Biochim. Biophys. Acta 1212: 134 - 136; Jones y col., (1995) The Plant Cel 7: 359 - 371). Los análisis de secuencias de estas tioesterasas muestran alta homología, implicando similitud en estructura y función. Alguno de estos ADN de tioesterasas se han expresado en E. col, y sus especificidades de sustrato determinadas por los ensayos in vitro. El hecho de que estas enzimas comparten homología de secuencias, todavía muestran diferentes sustratos, indica que los cambios sutiles de aminoácidos pueden ser suficientes para cambiar la selectividad de sustrato.

Está disponible poca información sobre la divergencia estructural y funcional contra las tioesterasas de plantas, y la estructura terciaria de cualquier tioesterasa de plantas tiene todavía que determinarse. La ingeniería genética de proteínas puede probar que es una herramienta potente para comprender el mecanismo del reconocimiento y catálisis de sustrato de tioesterasas, y de este modo conduce al diseño racional de nuevas enzimas con especificidades de sustrato deseables. Tales nuevas enzimas encontrarían uso en la bioingeniería de plantas para proporcionar diversas modificaciones de composiciones de acilo grasos, particularmente con respecto a la producción de aceites vegetales que tienen proporciones significativas de grupos acilo grasos, incluyendo grupos acilo grasos de cadena medio (C8 a C14) y grupos acilo grasos de cadena más larga (C16 o C18). Además, es deseable controlar las proporciones relativas de diversos grupos acilo que están presentes en el aceite de almacenamiento de semillas para proporcionar una diversidad de aceites para un amplio intervalo de aplicaciones.

Bibliografía

La estrategia del uso quimérico de productos químicos se ha aplicado para estudiar la estructura y función de fosfotransferasas en levadura (Hjelmstad y col., (1994) J. Biol. Chem. 269: 20995 - 21002) y endonucleasas de restricción de Flavobacterium (Kim y col., (1994) Proc. natl. Acad. Sci. Estados Unidos. 91: 893 - 887).

El intercambio de dominios para reestructurar los dominios funcionales de proteínas se ha usado en ingeníería genética de proteínas (Hedstrom (1994) Current Opinion in Structural Biology 4: 606 - 611). Recientemente se he determinado la estructura de una miristoil - ACP tioesterasa de Vibrio harveyi (Lawson y col. (1994) Biochemistry 33: 9382 - 9388). Esta tioesterasa, como otras tioesterasas de bacterias o de mamíferos, no comparte ninguna homología de secuencia con tioesterasas de plantas (Voelker y col., (1992) anteriormente).

Descripción de las figuras

Figura 1. Se proporciona una alineación de secuencias de aminoácidos de tioesterasas representativas Clase I (FatA) y Clase II (FatB. UcFatB1 (SEQ ID Nº: 1) en una tioesterasa de C12 de laurel de California. CcFatB1 (SEQ ID Nº: 2) en una alcanfor C14 tioesterasa. CpFatB1 (SEQ ID Nº: 3) es una tioesterasa de C8 y C10 de Cuphea alustris. GarmFatA1 (SEQ ID Nº: 5) es una tioesterasa 18:1 de mangostán que también tiene considerable actividad sobre los sustratos de acil - ACP C18:0. BrFatA1 (SEQ ID Nº: 6) es una tioesterasa 18:1 de Brassica rapa (también conocida como Brassica campestris). La secuencia de aminoácidos que son idénticas en todas las tioesterasas representadas se indican en sombreado en negrita.

Figura 2. Se proporciona ácido nucleico y secuencia de aminoácidos traducida (SEQ ID Nº: 8) de un clon de la acil - ACP tioesterasa de mangostán de Clase I (GarmFat1). GarmFatA1 demuestra actividad de tioesterasa primaria sobre sustrato de acil - ACP 18:1, pero también demuestra considerable actividad sobre sustrato 18:0 (aproximadamente 10 - 20% de actividad 18:1).

Figura 3. Se proporciona ácido nucleico y secuencia de aminoácidos traducida (SEQ ID Nº: 9) de un clon de la acil - ACP tioesterasa de mangostán de Clase I GarmFat2 GarmFatA2 tiene actividad tioesterasa principalmente sobre el sustrato acil - ACP 18:1, y de la misma manera baja actividad sobre sustratos 16:0 y 18:0.

Figura 4. Se proporciona ácido nucleico y secuencia de aminoácidos traducida (SEQ ID Nº: 10) de un clon de la acil - ACP tioesterasa de Cuphea palustris de Clase II (CpFatB1) que tiene actividad preferencial sobre sobre sustratos de acil - ACP de C8 y C10.

Figura 5. Se proporciona ácido nucleico y secuencia de aminoácidos traducida (SEQ ID Nº: 11) de un clon de la acil - ACP tioesterasa de Cuphea palustris de Clase II (CpFatB2) que tiene actividad preferencial sobre sustratos de acil - ACO de C14.

Figura 6. Se proporcionan actividad de tioesterasa relativa de tioesterasas de Garcinia mangifera de tipo salvaje (5247) y mutante (GarmFatA1) sobre sustratos de acil - ACP 18:1, 18:0 y 16:0.

Figura 7. Se proporciona una comparación de secuencia de aminoácidos B. rapa (C18:1) (SEQ ID Nº: 6) y acil - ACP tioesterasas de Garcinia mangifera GarmFatA1 (C18:1/C18:0) (SEQ ID Nº: 5). Los restos de aminoácidos que difieren entre las tioesterasas se indica por un sombreado en negrita.

Figura 8. Intercambio de dominios cortos por PCR. El gen de longitud completa está mostrado por dos líneas paralelas largas. El área en trama representa el dominio de interés. Para cada bebedor de PCR (a, b, c y d), se apunta una cabeza de flecha para el extremo 3'. Los cebadores a y b son cebadores directos e inversos para el ADN de longitud completa. Las líneas delgadas en los cebadores c y d representan secuencias que exactamente se emparejan cadena debajo de 3' del dominio. Las colas gruesas de los cebadores c y d son los extremos protuberantes en 5' correspondientes a la nueva secuencia de dominio.

Figura 9. Intercambio de dominios largos por PCR. Dos PCR (PCR 1 y PCR 2) se llevan a cabo con el gen I como molde. Se realiza simultáneamente un tercer PCR con el gen II como molde. Los cebadores a y b son cebadores directos e inversos para gen I de longitud completa. El cebador c empareja la secuencia cadena abajo en 3' del dominio original en el gen I. La línea delgada en el cebador d representa la secuencia que se empareja cadena abajo en 3' del dominio original en el gen I, mientras la cola gruesa empareja el extremo de la secuencia 3' del dominio de de reemplazo en el gen II. El cebador e ceba el extremo 5' del dominio en el gen II, mientras que f ceba el otro extremo. La cola delgada sen el cebador f representa la secuencia que se empareja cadena debajo de 3' del dominio original en el gen I.

Figura 10. Se muestran los cambios relativos en actividad sobre sustratos 18:0 y 18:1 de las tioesterasas mutante Garm FatA1 comparadas con las tioesterasas Garm FatA1 de tipo salvaje.

Figura 11. Se proporcionan las actividades específicas de las tioesterasas Garm FatA1 mutantes sobre sustratos de acil - ACP 16:0, 18:0 y 18:1.

Figura 12. Se proporciona en general una alineación de las tioesterasas Garm FatA1 y Uc FatB1 como representantes de las tioesterasas FatA y FatB.Se indican regiones únicas, parcialmente homólogas y altamente homólogas en las dos clases de tioesterasas.

Figura 13 A. Se representan mutantes quiméricas y de tipo salvaje FatA y FatB. Se proporcionan los resultados de la actividad y análisis de especificidad. La interpretación de las líneas cruzadas está de acuerdo con la clave proporcionada en la figura 12.

Figura 13 B. Se representan los mutantes de recombinación FatA y FatB. Se proporcionan los resultados de análisis de actividad y de especificidad. La interpretación de las diversas líneas cruzadas está de acuerdo con la clave proporcionada en la figura 12.

Figura 14. Representaciones de hitogramas de análisis de ácidos grasos de semillas de plantas de B. napus Quantum transformadas con pCGN5255 y pCGN5274.

Figura 15. Los análisis de la composición de ácidos grasos de los transformantes 5255 se proporcionan en la figura 15 A. Los análisis de la composición de ácidos grasos de los transformantes 5274 se proporcionan en la figura 15 B.

Figura 16. Los análisis de la composición de ácidos grasos de los transformantes 5290 se proporcionan en la figura 16 A. Los análisis de la composición de ácidos grasos de los transformantes 5291 se proporcionan en la figura 16 B.

Los análisis de la composición de ácidos grasos de los transformantes 5255 se proporcionan en la figura 16 C.

Los análisis de la composición de ácidos grasos de los transformantes 5266 se proporcionan en la figura 16 D.

Sumario de la invención

Mediante esta invención se proporcionan acil - ACP tioesterasa de plantas modificadas por ingeniería genética que muestran especificidad de sustrato alterada con respecto a los sustratos acil - ACP hidrolizados mediante la tioesterasa de plantas comparado con la acil - ACP tioesterasa nativa, en la que dicha tioesterasa de tipo salvaje es una tioesterasa Gam FatA1 de mangostán, y en la que dicha tioesterasa modificada por ingeniería genética contiene una o más sustituciones seleccionadas entre S188A, S307A, G185A y V270A, basándose la numeración de aminoácidos de las tioesterasa Gam FatA1 de mangostán en la numeración de consenso mostrada en la figura 1. Los procedimientos para su producción comprenden las etapas de (1) modificar una secuencia de un genes que codifican una proteína de tioesterasa de plantas dirigida para modificación para producir una o más secuencias de genes de tioesterasa modificadas, en los que las secuencias modificadas codifican acil - ACP tioesterasas modificadas por ingeniería genética que tienen sustituciones de uno o más restos de aminoácidos en la porción madura de la tioesterasa de plantas diana, (2) expresar las secuencias codificadoras modificadas en una célula hospedadora, mediante la que se producen las tioesterasas de plantas modificadas por ingeniería genética y, (3) ensayar las tioesterasas de plantas modificadas por ingeniería genética para detectar las que tienen alteraciones deseables en especificidad de
sustrato.

De particular interés para las alteraciones de aminoácidos es la porción de dos tercios C-.terminal de la tioesterasa de plantas, y más particularmente, la región correspondiente a los aminoácidos 229 a 285 (numeración de consenso por encima de las secuencias) de las secuencias de tioesterasas de plantas como se representa en al alineación de secuencias de la figura 1. Adicionalmente, la región de aminoácidos 285 - 312 es de interés para la modificación de la especificidad de sustrato de tioesterasas hacia ácidos de cadena más corta tal como C8 y C10.

La información útil con relación a los sitios de modificación potencial en una tioesterasa dirigida se puede obtener mediante la comparación se secuencias de aminoácidos de acil - ACP tioesterasas de plantas relacionadas, en las que las tioesterasas comparadas demuestran actividades de hidrólisis. Las comparaciones de secuencias de aminoácidos de tioesterasas de plantas que tienen al menos un 75% de identidad de secuencia en la región de proteína madura son particularmente útiles a este respecto. De esta menara, los restos de aminoácidos o dominios de péptidos que son diferentes en las tioesterasas relacionadas se pueden seleccionar para mutagénesis.

Otros procedimientos para seleccionar dominios de aminoácidos o péptidos para modificación incluyen análisis de secuencias de proteínas de las tioesterasas para los efectos predichos de sustituciones, inserciones o supresiones sobre la flexibilidad y/o estructura secundaria de la tioesterasa diana.

Además, las mutaciones de genes de tioesterasas útiles se pueden descubrir mediante mutación aleatoria de secuencias que codifican las acil - ACP tioesterasa de plantas, seguido de análisis de actividad tioesterasa o composición de ácidos grasos para detectar alteraciones en la especificidad de sustrato.

Para producir una tioesterasa producida por ingeniería genética, una secuencia de ADN que codifica la tioesterasa se puede alterar mediante intercambio de dominio o mutagénesis, o bien al azar o dirigida al sitio, para introducir las sustituciones, inserciones o supresiones de aminoácidos. Las secuencias de ADN después se pueden expresar en células hospedadoras para la producción de tioesterasas modificadas por ingeniería genética y para análisis de composiciones de ácidos grasos resultantes. Las tioesterasas modificadas por ingeniería genética producidas de esta manera se ensayan también para determinar los efectos de las modificaciones de las secuencias de aminoácidos sobre la especificidad de sustrato de la tioesterasa. De esta manera, las tioesterasas novedosas se pueden descubrir que demuestran una diversidad de perfiles con respecto a las longitudes de las cadenas de carbono de los sustratos acil - ACP que se pueden hidrolizar o con respecto a la especificidad relativa de las tioesterasas sobre sustratos acil - ACP de longitudes de cadena diferentes.

De este modo, las secuencias de ADN y construcciones para la expresión de tioesterasas modificadas por ingeniería genética, así como las tioesterasas producidas a partir de las mismas también se consideran dentro del alcance de la invención descrita en esta memoria descriptiva. Tales secuencias de ADN se pueden usar para la expresión de las tioesterasas modificadas por ingeniería genética en células hospedadoras para la modificación de la composición de ácidos grasos. De particular interés en la presente invención son construcciones de ADN para la expresión de tioesterasas modificadas por ingeniería genética en células vegetales, especialmente en células de semillas de plantas de plantas forrajeras de semillas oleosas. Como resultado de la expresión de tales construcciones, se puede producir aceite de triglicéridos de plantas, en el que la composición de aceite refleja la especificidad de sustrato alterado de las tioesterasas modificadas por ingeniería genética. De esta manera, las células vegetales, semillas y plantas que comprenden las construcciones proporcionadas en esta memoria descriptiva están todas comprendidas por la presente invención, así como aceites vegetales que se pueden recoger de las semillas de plantas.

Por ejemplo, una acil - ACP tioesterasa de plantas preferiblemente C12 descrita en esta memoria descriptiva se puede alterar para obtener una tioesterasa de plantas que tiene aproximadamente igual actividad sobre sustratos C14 y C12. La modificación adicional de la enzima C12 produce una tioesterasa que tiene mayor actividad sobre C14 comparada con los sustratos C12.

En la presente invención también se proporcionan secuencias de acil - ACP tioesterasas de plantas de mangostán (Garcinia mangifera).

Un gen de tioesterasa de mangostán, GamFatA1, muestra actividad primaria sobre sustratos 18:1 - ACP, pero también muestra actividad sustancial sobre 18:0 - ACP. De manera importante, este clon no de muestra especificidad para los sustratos 16:0. Los procedimientos de modificación de la especificidad de esta tioesterasa de plantas C18:1/C18:0 también se proporcionan en la presente invención. En particular, se proporcionan las mutaciones que incrementan la relación de actividad 18:0/18:1 del clon de mangostán. Se proporciona el uso de tales clones de tioesterasa de mangostán mutados para la producción potenciada de ácidos grasos 18:0 en semillas de plantas transgénicas. Tales uso dan como resultado plantas, semillas y aceites mejorados.

Descripción detallada de la invención

Mediante esta invención se proporcionan tioesterasas de plantas modificadas por ingeniería genética que tienen especificidad de sustrato alterada. Una tioesterasa de planta modificada por ingeniería genética de esta invención puede incluir cualquier secuencia de aminoácidos tales como un fragmento de proteína, de polipéptido o péptido como se ha definido anteriormente obtenible a partir de una fuente vegetal que demuestra la capacidad de catalizar la producción de ácido (s) graso (s) libre (s) de sustratos de acil - ACP grasos en condiciones reactivas de enzimas de plantas. Por "condiciones reactivas de enzimas" se quiere decir que cualquier condición necesaria está disponible en un ambiente (es decir, factores tales como temperatura, pH, carencia para inhibir sustancias) que permitirá que la enzima
funcione.

Las tioesterasas de plantas vegetales modificadas por ingeniería genética se pueden preparar mediante mutagénesis aleatoria o específica de una secuencia que codifica una tioesterasa para proporcionar una o más sustituciones de aminoácidos en al secuencia de aminoácidos traducida. Como alternativa, una tioesterasa de plantas modificada por ingeniería genética se puede preparar mediante intercambio de dominios entre tioesterasas de plantas relacionadas, en las que las regiones extensivas de la secuencia que codifica la tioesterasa nativa se remplazan con la región correspondiente de una tioesterasa de plantas diferentes.

Las dianas para intercambios de dominios pueden incluir péptidos que varían entre cinco o seis a decenas de aminoácidos en longitud. En un caso ideal, este tipo de intercambio se puede llevar cabo mediante la presencia de sitios de restricción únicos, conservados en los puntos exactos de cambio en los genes que codifican ambas proteínas. La mutagénesis basada en oligo (formación de bucles) se puede aplicar cuando los sitios de restricción convenientes no están disponibles, aunque este procedimiento puede requerir tiempo largo cuando las secuencias de dominios grandes se van a intercambiar. Como alternativa, como se describe en los siguientes ejemplos, se puede emplear un procedimiento rápido para intercambio de dominios que es una modificación de una técnica de extensión de superposición que usa reacción en cadena de polimerasa (PCR) descrita por Horton y col., (BioTechiques (1990) 8: 528 - 535). El procedimiento completo se puede hacer dentro de seis horas (tiempo para dos ensayos de PCR) sin manipulación in vivo. La base para el procedimiento de extensión de superposición es que en una PCR los cebadores deben emparejar su secuencia completa lo suficiente para cebar, pero no necesitan emparejarse exactamente, especialmente hacia el extremo 5'. De hecho, los cebadores de PCR con extremos protuberantes en 51 (secuencias no emparejadas) se usan de manera rutinaria. El intercambio de dominios basados en PCR se diseña para aplicaciones en los que el dominio contiene aproximadamente seis aminoácidos o menos (intercambio de dominios cortos), o en los que los dominios que contienen números muchos mayores de aminoácidos que se van a intercambiar (intercambio de dominios
largos).

Las especificidades de sustrato alterada de una tioesterasa modificada por ingeniería genética se puede reflejar mediante la presencia de actividad de hidrólisis sobre un sustrato de acil - ACP de una longitud de cadena particular que no está hidrolizada por la enzima tioesterasa nativa. El sustrato de acil - ACP recientemente reconocido puede diferir de los sustratos nativos de la enzima en diversas formas, tal como por tener una longitud de cadena de carbono más corta o más corta (usualmente reflejada por la adición o supresión de una o más unidades de 2 carbonos), por tener un mayor o menor grado de saturación, o mediante la presencia de un grupo metilo, tal como en ciertos ácidos grasos que no están comúnmente presentes en células de plantas, es decir, ácidos grasos iso- y anti - iso-. Como alternativa, la especificidad de sustrato alterado se puede reflejar mediante una modificación de las actividades de hidrólisis relativas sobre dos o más sustratos de acil - ACP de diferente longitud de cadena y/o grado de saturación.

La información de secuencias de aminoácidos y ADN para más que treinta acil - ACP tioesterasa de plantas está ahora disponible, y estas secuencias se pueden usar para identificar regiones deseables para la modificación con objeto de producir secuencias para la expresión de tioesterasas modificadas por ingeniería genética.

Las tioesterasas de plantas se pueden clasificar en dos clases por homología de secuencias. Todas estas tioesterasas de plantas contienen un péptido transitorio, de 60 a 80 aminoácidos de longitud, para la dirección de plástidos. Los péptidos transitorios tienen poca homología entre especies mientras que las regiones de proteínas maduras (menos péptido transitorio) muestran identidad de secuencias de aminoácidos significativa.

La primera clase, clase I (o FatA) incluye acil - ACO tioesterasas de cadena larga que tienen actividad principalmente sobre 18:1 - ACP. 18:1 - ACP es el precursor inmediato de la mayoría de los ácidos grasos encontrados en fosfolípidos y triglicéridos sintetizados por la ruta eucariótica. Esta clase de tioesterasa se ha encontrado en esencialmente todas las fuentes vegetales examinadas hasta la fecha, y se sugiere que es una enzima "de faenas domésticas" esencial (Jones y col., (anteriormente) requerida para la biosíntesis de membranas. Se han descritos los ejemplos de las tioesterasas de clase I de cártamo, Cuphea hookeriana y Brassica rapa (campestris), que tienen actividad principalmente sobre sustrato 18:1 - ACP, (documento WO 92/20236 y documentos Wo 94/10288). Se han reseñado otras tioesterasas 108:1 en Arabidopsis thaliana (Dormann y col., (1995) Arch. Biochem. Biophys. 336: 612 - 618), Brassica napus (Loader y col., (1993) Plant Mol. Biol. 23: 769 - 778) y cilantro (Dormann y col., (1994) Biochem. Biophys. Acta (1212: 134 - 136). Una tioesterasa similar de clase I específica 18:1 - ACP (garmFatA2) se ha descubiertos en el desarrollo de embriones de mangostán (Garcinia mangifera) y se describe en esta memoria descriptiva. Una tioesterasa de clase I de soja (documento WO 92/11373) se reseñó para proporcionar incrementos de 10- y 96- veces en actividad 16:0 - ACP y 18:1 - ACP tras la expresión en E. coli, y un incremento más pequeño (3 - 4 veces) en la actividad 18:0 - ACP. Las regiones de proteína madura de las tioesterasas de plantas de clase I son altamente homólogas, demostrando una identidad de secuencia mayor que 80%.

Además, otra tioesterasa de clase I de mangostán (GarmFatA1), también se describe en esta memoria descriptiva, se ha descubierto que muestra actividad tioesterasa principalmente en los sustratos 18:1 - ACP (incremento de 100 veces tras la expresión en E. coli), pero también muestra actividad selectiva en 18:0 - ACP frente 16:0 - ACP. La actividad 18:0 de GarmFatA1 es aproximadamente 25% de la actividad 18:1, mientras que en la mayoría de las tioesterasas de clase I analizadas hasta la fecha la actividad 18:1 es la altamente predominante, con actividad sobre los sustratos 16:0 y 18:0 detectables en menos que 5% de los niveles de actividad 18:1.

Una segunda clase de tioesterasas de plantas, tioesterasas de clase II (o FatB), incluye enzimas que utilizan ácidos grasos con longitudes de cadena más cortas, entre C8:0 a C14:0 (ácidos grasos de cadena media) así como C16:0. Las tioesterasas de clase II preferiblemente catalizan la hidrólisis de sustratos que contienen ácidos grasos saturados. Las tioesterasas de clase II (o FatB) se han aislado de laurel de California, olmo, Cuphea hookeriana, Cuphea palustres, Cuphea lanceolata, nuez moscada, Arabidopsis thaliana, mango, puerro y alcanfor. Las regiones de proteínas maduras de las tioesterasas de plantas de clase II son también altamente homólogas, demostrando un 70 - 80% de identidad de secuencia.

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Una de las características de las tioesterasas de clase II es al presencia de una región relativamente hidrófoba de aproximadamente 40 aminoácidos en la región N-terminal de as proteínas maduras. Esta región hidrófoba no se encuentra en las tioesterasas 18:1 - ACP, y no tiene efecto aparente sobre la actividad enzimática. La expresión recombinante de una tioesterasa de clase II de laurel con o sin esta región que muestra perfiles de actividad idénticos in vitro (Jones y col., (anteriormente)).

Como se ha demostrado más completamente en los siguientes ejemplos, la especificidad de sustrato acil - ACP de tioesterasas de plantas se puede modificar mediante diversos cambios de aminoácidos a la secuencia de proteínas, tales sustituciones de aminoácidos en la porción de proteína madura de las tioesterasas de plantas. La especificidad de sustrato modificada se puede detectar mediante la expresión de las tioesterasas de plantas modificadas genéticamente en E. coli y ensayando para detectar actividad enzimática.

La especificidad de sustrato modificada se puede indicar por un desplazamiento en preferencia de sustrato acil - ACP de manera que la tioesterasa modificada por ingeniería genética es capaz de nuevo de hidrolizar un sustrato no reconocido por la tioesterasa nativa. El sustrato recientemente reconocido puede variar entre sustratos de al enzima nativa por longitud de cadena de carbono y/o grado de saturación de la porción acilo graso del sustrato.. Como alternativa, la especificidad de sustrato modificada se puede reflejar mediante un desplazamiento e la actividad tioesterasa relativa sobre dos o más sustratos de la tioesterasa nativa de manera que una tioesterasa modificada por ingeniería genética muestra un orden diferente de preferencia para los sustratos acil - ACP.

Por ejemplo, una tioesterasa de plantas que tiene actividad de hidrólisis primaria sobre el sustrato C12 y alguna actividad menor sobre el sustrato C14 se puede modificar para producir una tioesterasa modificada por ingeniería genética que muestra un incremento de actividad sobre C14, por ejemplo de manera que la tioesterasa modificada por ingeniería genética tiene aproximadamente igual actividad sobre sustratos C12 y C14. De manera similar, tales tioesterasas de C12 de plantas se puede modificar adicionalmente para producir una tioesterasa modificada por ingeniería genética sobre sustratos C14 y poca o ninguna actividad sobre sustratos C12. Como alternativa, una tioesterasa de plantas se puede modificar de manera altere la actividad relativa hacia un sustrato que tienen un grado mayor o menor de saturación. Por ejemplo, una tioesterasa de clase I (18:1) se puede modificar para incrementar la actividad relativa sobre sustratos C18:0 comparada con la actividad sobre otras sustancias de la enzima, tal como C18:1 y C16:0. Los ejemplos de estos tipos de modificaciones de tioesterasas se proporcionan en los siguientes ejemplos. La modificación adicional de las tioesterasas de plantas son también deseables y se pueden obtener usando los procedimientos y secuencias proporcionadas en esta memoria descriptiva. Por ejemplo, las tioesterasas de plantas se pueden modificar para desplazar la actividad enzimática hacia la hidrólisis de ácidos de cadena más corta, tal como C8 y C10. La comparación de las secuencias de tioesterasas estrechamente relacionadas, tal como la las secuencias de tioesterasas C8/10 de C. palustris, la C14 de C. palustris y la C8/10 de C. hookeriana proporcionadas en esta memoria descriptiva, se pueden usar para identificar los restos de aminoácidos diana para la alteración de especificidad
tioesterasa.

Las predicciones de estructura secundarias se pueden usar para identificar las sustituciones de aminoácidos probablemente para tener efectos sobre la estructura secundaria de la proteína de tioesterasa.

La expresión de tioesterasas modificadas por ingeniería genética que tienen alteradas especificidades de sustrato en células hospedadoras en células hospedadoras y análisis de composiciones de ácidos grasos resultantes demuestra que las especificidades de sustrato alteradas de las tioesterasas modificadas por ingeniería genética y reflejadas en los perfiles de la composición de ácidos grasos de las células hospedadoras. Esto es significante debido a que al actividad enzimática in vivo podría haber implicado interacciones secuenciales o parámetros tales como duración de vida y tasas plegamiento7no plegamiento que no se podrían reflejar en los ensayos de actividad in vitro. Los componentes de lípidos principales de membranas de E. coli son fosfatidil - etanolamina y fosfatidilglicerol, que contienen predominantemente restos acilo de ácidos de cadena larga. La expresión recombinante de ADNc de tioesterasa de laurel nativo en células faD redirige el sistema sintasa de ácidos grasos de tipo II bacteriano de la producción de cadena larga a cadena media, y resultados similares se obtienen tras la expresión de tioesterasas de laurel nativas en semillas de plantas transgénicas (Voelker y col., (1994) anteriormente; Voelker y col., (1992) anteriormente). De este modo, los datos in vivo de E. coli se pueden usar para predecir los efectos de expresión de tioesterasas modificadas por ingeniería genética en plantas transgénicas.

La ingeniería genética de tioesterasas FatA de plantas también se describe en esta memoria descriptiva. En particular, las mutaciones se descubre que proporcionan tioesterasas Garm FatA1 mutantes que tienen tanto una mayor actividad específica como una actividad relativa más deseable en sustratos 18:0 frente a sustratos 18:1. Por ejemplo, un mutante D261K de Garm FatA1, que tiene un resto lisina (K) sustituido por el residuo aspartato presente en el clon de tipo salvaje en una posición 261 (numeración como se indica en la línea de consenso sobre las secuencias en la comparación de secuencias de la figura 1), tiene una actividad incrementada sobre los sustratos 18:0 frente 18:1. Los mutantes dobles y triples que contienen la mutación D216K tiene incluso una actividad mayor sobre
18:0.

Otras mutaciones que incrementan la actividad de 18:0 de la tiosterasa Garm FatA1 de magostán se describen en esta memoria descriptiva e incluyen S188A, S370A, G185A y V270A. Estas tiosterasas mutantes así como los mutantes que tienen diversas combinaciones de estas mutaciones son de particular interés para uso en aplicaciones de ingeniería genética de plantas para incrementar el contenido de ácidos grasos estearatos (18:0) en plantas forrajeras de semillas oleaginosas. Por ejemplo, como se describe en más detalle en los ejemplos más adelante, las plantas transformadas que expresan un mutante doble Garm FatA1, S188A/V270A, que tiene un resto alanina sustituido por tanto el resto serina en la posición 188 como para el resto valina en la posición 270 (numeración como se indica en la línea de consenso sobre las secuencias en la comparación de secuencias de la figura 1), tienen niveles incrementados significativamente de estearato. Las plantas transgénicas con niveles incrementados de ácido graso C10:0 como el resultado de expresión de tioesterasa Garm FatA1 en semillas de Brassica napus se reseñan en el documento WO 97/12047.

Las tioesterasas mutantes en la presente invención se pueden usar para proporcionar incluso incremento mayores en contenido de estearato en semillas de plantas transgénicas como se describe en mas detalle en los siguientes ejemplos. Los aceites vegetales ricos en estearato son deseables para uso en aplicaciones tales como sustitutos de margarinas no hidrogenadas ("trans - libre") y de manteca de cacao, como se describe el documento WO 97/12047 o en aplicaciones de grasas hidrogenadas para productos horneados fluidos, tal como se describe en la solicitud en tramitación con la presente USSN 08/843.400, titulada "Productos alimenticios que contienen triglicéridos estructurados" presentada el 15 de abril de 1997.

De este modo, como resultado de las modificaciones a la especificidad de sustrato de tioesterasas de plantas, se puede observar que las cantidades relativas de los ácidos grasos producidos en una célula en la que diversos sustratos están disponibles para la hidrólisis de pueden alterar. Además, las moléculas que se forman de ácidos grasos libres disponibles, tales como triglicéridos de semillas de plantas, también se pueden alterar como resultado de expresión de tioesterasas modificadas por ingeniería genética que tienen especificidades de sustrato alteradas.

Las secuencias de ácido nucleico o aminoácidos que codifican una acil - ACP tioesterasa de plantas modificada por ingeniería genética de esta invención se pueden combinar con otras secuencias no nativas, o "heterólogas" en una diversidad de formas. Por secuencias "heterólogas" se quiere decir cualquier secuencia que no ese encuentra unida de manera natural unida a la acil - ACP tioesterasa de plantas, incluyendo, por ejemplo, combinaciones de secuencias de ácido nucleico de la misma planta que no se encuentran unidas de manera natural unidas juntas.

Para la expresión en células hospedadoras, la secuencia que codifica una tioesterasa de plantas modificada por ingeniería genética se combina en una construcción de ADN que tiene, en la dirección 5' a 3' de transcripción, una región de control de inicio de la transcripción y traducción en una célula hospedadora, la secuencia de ADN que codifica la acil - ACP tioesterasa de plantas modificadas por ingeniería genética y una región de terminación de transcripción y traducción.

Las construcciones de ADN pueden o no pueden contener secuencias de per - procesamiento, tales como secuencias de péptidos transitorias. Las secuencias de péptidos transitorias facilitan la distribución de la proteína para proporcionar un orgánulo dado y se escinden a partir del resto aminoácido tras entrar en el orgánulo, liberando la secuencia "madura". El uso de la secuencia precursora de ADN de acil - ACP tioesterasa de plantas se prefiere en módulos de expresión de células de plantas. Otras secuencias de péptidos transitorios de plástidos, tales como un péptido transitorio de ACP de semilla, también se puede emplear para trastocar las acil - ACP tioesterasas de plantas a diversos orgánulos de interés.

De este modo, las secuencias de tioesterasas se pueden usar en diversas construcciones, tales como para la expresión de la tioesterasa de interés en una célula hospedadora para la recuperación o estudio de la enzima in vitro o in vivo. Las células hospedadoras potenciales incluyen tanto células procarióticas como eucarióticas. Una célula hospedadora puede ser unicelular o encontrarse en un organismo diferenciado o indiferenciado multicelular dependiendo del uso propuesto. Las células de esta invención se pueden distinguir por tener una acil - - ACP tioesterasa de plantas modificada por ingeniería genética presente en esta memoria descriptiva.

Dependiendo del huésped, las regiones reguladoras variarán, incluyendo regiones de genes cromosómicos, de plásmidos o virales. Para la expresión en microorganismos procarióticos o eucarióticos, particularmente huéspedes unicelulares, se puede emplear una diversidad de promotores constitutivos o reguladores. La expresión en un microorganismo puede proporcionar una fuente disponible de la enzima de plantas modificada por ingeniería genética y es útil para identificar las características particulares de tales enzimas. Entre las regiones de inicio de la transcripción que se han descrito están las regiones de huéspedes bacterianos y de levaduras, tales como E. coli, B. subtilis, Saccharomyces cerevisiae, incluyendo genes tales como beta galactosidasa, polimerasa de T7, triptófano E.

Para la mayor parte, las construcciones implicarán regiones reguladoras funcionales en las plantas que proporcionan la expresión de la acil - ACP tioesterasas de plantas, y de este modo dan como resultado la modificación de la composición de ácidos grasos en células vegetales. La fase abierta de lectura, que codifica la acil - ACP tioesterasas de plantas se unirá en sus extremo 5' a una región reguladora de inicio de la transcripción tal como la secuencia de tipo salvaje encontrada de manera natural cadena arriba de 5' al gen estructural de la tioesterasa. Otras numerosas regiones de inicio de la transcripción están disponibles y proporcionan una amplia diversidad de transcripción constitutiva o regulable, por ejemplo inducible de las funciones génicas estructurales. Entre las regiones de inicio transcripcional usadas para plantas están las regiones tales como las asociadas con los genes estructurales tales como para las nopalina y manopina sintasas, o con promotores napin de ACP.

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Las regiones de inicio de transcripción/traducción correspondientes a tales genes estructurales se encuentran inmediatamente cadena arriba de 5' de los codones de partida respectivos. En las realizaciones en las que la expresión de la proteína de tioesterasa modificada por ingeniería genética se desea en un huésped de planta, se considera el uso de parte del gen nativo de acil - ACP tioesterasa de plantas. A saber, se puede emplear toda o una porción de las regiones no codificadoras cadena arriba de 5' (promotor) junto con las regiones no codificadoras cadena debajo de 3'. Si se desea un promotor diferente, tal como un promotor nativo al huésped de planta o un promotor modificado, es decir, que tiene regiones de inicio de transcripción derivadas de una fuente génica y regiones de inicio de traducción derivados de una fuente génica diferente (promotores potentados), tales como promotores de CaMV 35S dobles, las secuencias se pueden unir juntas usando técnicas convencionales.

Para tales aplicaciones cuando las regiones no codificadoras cadena arriba de 5' se obtienen a partir de otros genes regulados durante la maduración de las semillas, se desean las expresadas preferiblemente en tejido de embriones de plantas, tales como regiones de control de inicio de la transcripción derivadas de ACP y de napin. Tales "promotores específicos de semillas" se pueden obtener y usar de acuerdo con las enseñanzas de los documentos de Estados Unidos Nº de serie 07/147.781, presentado el 25 de enero de 1988 (ahora documento de Estados Unidos Nº de serie 07/550.804, presentado el 9 de julio de 1990), y el documento de Estados Unidos Nº de serie 07/494.722 presentado el o aproximadamente 16 de marzo de 1990 que tiene un título "Secuencias novedosas expresadas preferiblemente en el desarrollo de semillas tempranas y procedimientos relacionados en él"

Las regiones de inicio de transcripción que se expresan preferiblemente en tejido de semilla, es decir, que son indetectables en otras partes de plantas, se consideran deseables para modificaciones de ácidos grasos con el fin de minimizar cualesquiera efectos desorganizadores o adversos del producto génico.

Las regiones reguladoras de la terminación de la transcripción se pueden proporcionar en las construcciones de ADN de esta invención también. Las regiones de terminación de la transcripción se pueden proporcionar mediante la secuencia de ADN que codifican la acil - ACP tioesterasas de plantas o una región de terminación de la transcripción conveniente derivada de una fuente de genes diferente, por ejemplo, la región de terminación de transcripción que se asocia naturalmente con la región de inicio de la transcripción. Cuando la región de inicio de la transcripción es de una fuente génica diferente, contendrá al menos aproximadamente 0,5 kb, preferiblemente aproximadamente 1 - 3 kb de secuencia en 3' al gen estructural del que la región de terminación de deriva.

Las construcciones de expresión o transcripción de plantas que tienen una acil - ACP tioesterasas de plantas como la secuencia de ADN de interés se puede emplear con una amplia diversidad de plantas vivas, particularmente plantas vivas implicadas en las producciones de aceites vegetales para usos comestibles e industriales. La especialmente preferidas son plantas forrajeras de semillas oleaginosas de climas templados. Las plantas de interés incluyen, pero no se limitan a, colza (variedades canola y de alto contenido en ácido erúcico), giralosl, cártamo, algodón, Cuphea, soja, cacahuete, palma de coco y de coquito, y maíz. Dependiendo del procedimiento para introducir las construcciones recombinantes en la célula hospedadora, se pueden requerir otras secuencias de ADN. De manera importante, esta invención es aplicable a especies monocotiledóneas o dicotiledóneas del mismo modo y se aplicaran de manera fácil a las técnicas de regulación y transformación nuevas y/o mejoradas.

El procedimiento de transformación no es crítico, están actualmente disponibles diversos procedimientos más recientes para transformar cosechas, se pueden aplicar directamente conforme al presente documento. Por ejemplo, muchas especies de plantas naturalmente susceptibles a infección por Agrobacterium se pueden transformar exitosamente mediante procedimientos de vectores tripartitos o binarios de transformación mediada por Agrobacterium. Además, se han desarrollado técnicas de microinyección, de bombardeo de partículas de ADN, electroporación que permite la transformación de diversas especies de monocotiledóneas y dicotiledóneas.

Al desarrollar la construcción de ADN, los diversos componentes de la construcciñon de fragmentos de los mismos se insertará normalmente en un conveniente vector de clonación que es capaz de replicación en un huésped bacteriano, por ejemplo, E. coli. Existen numerosos vectores que se han descrito en la bibliografía. Después de cada clonación, el plásmido se puede aislar y someter a manipulación adicional, tal como restricción, inserción de nuevos fragmentos, ligación, supresión, inserción, resección, de manera que confeccione los componentes de la secuencia deseada. Una vez que la construcción se ha completado, se puede después transferir a un vector apropiado para manipulación adicional de acuerdo con la manera de transformación de la célula hospedadora.

Normalmente, incluida en la construcción de ADN estará un gen estructural que tiene las regiones reguladoras necesarias para la expresión en un huésped y que se proporciona para la selección de las células transformantes. El gen puede proporcionar resistencia a un agente citotóxico, por ejemplo, antibiótico, metal pesado, toxina, complementación que proporciona fototrofia a un huéspedes autotrófico, inmunidad viral. Dependiendo del número de diferentes especies de huésped la construcción de expresión o componentes de la misma que se introducen, se pueden emplear uno o más marcadores, donde se usan diferentes condiciones para selección para los diferentes huéspedes.

Hay que observar que la degeneración del código de ADN proporciona que algunas sustituciones de codón sean permisibles de secuencias de ADN sin cualquier modificación correspondiente de la secuencia de aminoácidos.

La manera en la que la construcción de ADN se introduce en el huésped de la planta no es crítica para esta invención. Se puede emplear cualquier procedimiento que proporciona transformación eficaz. Diversos procedimientos para la transformación de células vegetales incluyen el uso de plásmidos Ti- o Ri, microinyección, electroporación, bombardeo de partículas de ADN, fusión de liposomas, bombardeo de ADN.

En muchos casos, será deseable tener la construcción esté bordeada a uno o ambos lados por T- ADN, teniendo particularmente los bordes izquierdo y derecho., más particularmente el borde derecho.. Esto es particularmente útil cuando la construcción usa A. tumefaciens o A. rhizogenes como un modo de transformaciones, aunque los bordes de T-ADN pueden encontrar uso con otros modos de transformación.

Cuando se usa Agrobacterium para la transformación de células vegetales, se puede usar un vector que se puede introducir en el huésped Agrobacterium para recombinación homóloga con T-ADN o el plásmido Ti- o Ri presente en el huésped Agrobacterium. El plásmido Ti- o Ri que contiene el T-ADN para recombinación se puede armar (capaz de provocar formación de agalla) o desarmarse (incapaz de provocar formación de agalla), esto último siendo permisible, mientras que los genes vir estén presentes en el huésped Agrobacterium transformado. El plásmido armado puede proporcionar una mezcla de células vegetales normales y agalla.

En algunos casos cundo de usa Agrobacterium como vehículo para transformar células vegetales, la construcción de expresión bordeada por el (los) borde (s) de T-ADN se insertará en un vector de espectro de huésped amplio, estando los vectores de espectro de huésped amplio descritos en la bibliografía. Se usa comúnmente pRK2 o derivados del mismo. Véase, por ejemplo, Ditta y col., PNAS Estados Unidos, (1980) 77: 7347 - 7351 y EPA 0 120 515.

Incluido en la construcción de expresión y el T-ADN estarán uno o más marcadores, que permiten la selección de Agrobacterium transformado y células vegetales transformadas.. Se han desarrollado un número de marcadores para uso con células vegetales, tales como resistencia a cloranfenicol, el aminoglicósido G418, higromicina.

El marcador particular empleado no es esencial para esta invención, siendo uno u otro marcador preferido dependiendo del huésped particular y de la manera de construcción.

Una vez que se obtiene una planta transgénica que es capaz de producir semilla que tiene una composición de ácidos grasos modificada, técnicas de mejoras de plantas tradicionales, incluyendo procedimientos de mutagénesis, se puede emplear para manipular adicionalmente la composición de ácidos grasos. Como alternativa, la secuencia de ADN que modifican la secuencia de ADN se puede introducir mediante ingeniería genética para manipular adicionalmente la composición de ácidos grasos. Hay que observar que el procedimiento de transformación no es crítico para esta invención. Sin embargo, el uso de procedimientos de transformación de plantas por ingeniería genética, es decir, el poder de insertar una secuencia de ADN deseada individual, es crítico. Hasta ahora, la capacidad de modificar la composición de ácidos grasos de aceites vegetales se puede transferir sexualmente durante cruzamientos de plantas o caracteres viables generados mediante mutagénesis. Mediante el uso de técnicas de ingeniería genética que permite la introducción de información genética inter - especies y los medios para regular la expresión específica de tejidos de genes endógenos, un nuevo procedimiento está disponible para la producción de aceites de semillas de plantas con composiciones de ácidos grasos modificados. Además, existe el potencial para el desarrollo de aceites de semillas vegetales novedosas tras la aplicación de las herramientas descritas en esta memoria descriptiva.

Se puede elegir para proporcionar la transcripción o transcripción y traducción de una o más otras secuencias de interés en armonía con la expresión de una acil - ACP tioesterasa de plantas modificada por ingeniería genética en una célula hospedadora vegetal. En particular, la expresión de una proteína LPAAT vegetal que tiene actividad sobre ácidos grasos de cadena media o muy larga en combinación con la expresión de una acil - ACP tioesterasa de plantas modificada por ingeniería genética se puede preferir en algunas aplicaciones. Véase el documento WO 95/27791 para secuencias que codifican LPAAT de plantas.

Cuando se desea proporcionar una planta transformada para el efecto combinado de más de una secuencia de ácido nucleico de interés, típicamente se proporcionará una construcción de ácido nucleico separada para cada una. Las construcciones descritas anteriormente contienen regiones de control transcripcional o transcripcional o transcripcional y traduccional. Los expertos en la técnica serán capaces de determinar secuencias reguladoras ara proporcionar una programación deseada y especificidad de tejidos apropiada para el producto final de acuerdo con los principios anteriores establecidos para la expresión respectiva o construcciones de sentido opuesto. Cuando una o más construcciones se van a emplear, tanto si ambas están relacionadas con la misma secuencia modificadora de ácidos grasos como una secuencia modificadores de ácidos grasos diferentes, puede ser deseable que se empleen secuencias reguladoras diferentes en cada módulo para reducir la recombinación homóloga espontánea entre secuencias. Las construcciones se pueden introducir en las células hospedadoras mediante el mismo o diferentes procedimientos, que incluyen la introducción de tal carácter mediante cruzamiento de plantas transgénicas mediante procedimientos de mejora de plantas tradicionales, mientras que el producto resultante sea una planta que tiene ambas características integradas en su genoma.

La invención que se está ahora describiendo, será más fácilmente entendida mediante referencia a los siguientes ejemplos.

Ejemplos Ejemplo 1 Secuencias de acil - ACP tioesterasas de plantas

A.

Laurel de California (Umbellularia californica)

\quad

La secuencia de ADN de y la secuencia de aminoácidos traducida del clon pCGN3822 de tioesterasa de clase II de laurel de California se proporciona en la figura 1 del documento WO 92/20236.

B.

Alcanfor (Cinnamomun camphora)

\quad

La secuencia de ADN de y la secuencia de aminoácidos traducida de una tioesterasa de alcanfor de clase II que codifica la región generada por PCR se proporciona en la figura 5 B del documento WO 92/20236.

C.

Mangostán (Garcinia mangifera)

\quad

Se prepara un banco de ADNc a partir de semillas extraías de fruto de mangostán maduro usando los procedimientos como se describen en el kit de síntesis de ADNc Zap (Stratagene; La Jolla CA). Los análisis de aceite de tejidos de mangostán usados para el aislamiento de ARN revela niveles de 18:0 de aproximadamente 50%. Los análisis de aceite de semillas de fruto de mangostán menos madura revela niveles de 18:0 de 20 - 40%. Se aísla ARN total a partir de semillas de mangostán modificando el procedimiento de aislamiento de ADN de CTAB de Webb y Knapp (Plant Mol. Biol. Reporter (1990) 8: 180 - 195). Los tampones incluyen:

\quad

REC: Tris Cls 50 mM pH 9, NaCl 0,7 M, EDTA 10 mM pH 8, CTAB al 0,5%.

\quad

REC+: Añadir B-mercaptoetanol hasta 1% inmediatamente antes de uso.

\quad

RECP: TrisCl 50 mM pH 9, EDTA 10 mM pH 8 y CTAB al 0,5%.

\quad

RECP+: Añadir B-mercaptoetanol hasta 1% inmediatamente antes de uso.

Para la extracción de 1 g de tejido, 10 ml de REC+ y 0,5 g de PVPP se añade a tejido que se ha molido en nitrógeno líquido y se homogeneiza. El material homogeneizado se centrifuga durante 10 minutos a 12000 rpm. El sobrenadante se vierte a través de Miracloth en 3 ml de cloroformo frío y se homogeneiza otra vez. Después de la centrifugación, 12000 rpm durante 10 minutos, la fase superior se toma y su volumen se determina. Un volumen igual de RECP+ se añade y la mezcla de deja en reposo durante 20 minutos a temperatura ambiente. El material se centrifuga durante 20 minutos a 10.000 rpm dos veces y el sobrenadante se elimina después de cada centrifugación. El sedimento se disuelve en 0,4 ml de NaCl 1 M (DEPC) y se extrae con un volumen igual de fenol/cloroformo. Después de la precipitación en etanol, se disuelve el sedimento en 1 ml de DEPC agua.

En resumen, el procedimiento de clonación para la síntesis de ADNc es como sigue: La síntesis de la primera hebra de ADNc es de acuerdo con e manual de instrucciones de Stratagene con algunas modificaciones de acuerdo con Robinson, y col (Methods in Molecular and Cellular Biology (1992) 3: 118 - 127). En particular, aproximadamente 57 \mug de LiCl ARN total precipitado se usó en lugar de 5 \mug de poli(A) + ARN y la reacción se incubó a 45ºC en lugar de 37º durante 1 hora.

Se preparan sondas para la selección de librerías mediante PCr de ADNc de mangostán usando oligonucleótidos para las regiones de acil - ACP tioesterasa. La sonda Garm 2 y Garm 106 se preparan usando los siguientes oligonucleótidos. Los códigos a base de nucleótidos para los oligonucleótidos más adelante son como sigue:

\vskip1.000000\baselineskip

A = adenina		C = citosina
T = timina		U = uracilo
G = guanina		S = guanina o citosina
K = guanina o timina		W = adenina o timina
M = adenina o citosina		R = adenina o guanina
Y = citosina o timina
B = guanina, citosina o timina
H = adenina, citosina o timina
N = adenina, citosina guanina o timina

\newpage

Garm 2

4874: 5' CUACUACUACUASYNTVNGYNATGATGAA 3' (SEQ ID Nº: 12)

4875: 5' CAUCAUCAUCAURCAYTCNCKNCKRTANTC 3' (SEQ ID Nº: 13)

El cebador 4874 es un cebador de sentido diseñado que corresponde a las secuencias posibles que codifican péptido conservado V/L/A W/S/Y V/A M M N, donde se usa el código de aminoácidos de una letra y una raya entre los aminoácidos indica que más de un aminoácido es posible para esa posición. El cebador 4875 es un cebador de sentido opuesto diseñado que corresponde a secuencias posibles que codifican el péptido D/E Y R R E C.

Garm 106

5424: 5' AUGGAGAUCUCUGAWCRBTAYCCTAMHTGGGGWGA 3' (SEQ ID Nº: 14)

5577: 5' ACGCGUACUAGUTTNKKNCKCCAYTCNGT 3' (SEQ ID Nº: 15)

El cebador 5424 es un cebador de sentido diseñado que corresponde a las secuencias posibles que codifican péptido E/D H/R Y P K/T W G D.

El cebador 5577 es un cebador de sentido diseñado que corresponde a las secuencias posibles que codifican péptido T E W R K/P K.

Los fragmentos de ADN que se producen por las reacciones anteriores se amplifican para uso como sondas mediante clonación o mediante PCR adicional y se marcan radiactivamente mediante cebado aleatorio o específico.

Aproximadamente 800.000 placas se siembran de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para la selección, los filtros de placa se prehibridizan a temperatura ambiente en formamida al 50%, SCS 5 X, Denhardt's 10 X, SDS al 0,1% (p/v), Na_{2}EDTA 5 mM, 0,1 mg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado. La hibridación con una mezcla de las sondas Garm 2 y Garm 106 se lleva a cabo a temperatura ambiente en el mismo tampón que antes con sulfato de dextrano al 10% (p/v) y sonda. La purificación en placas y escisión de fagémidos. se llevaron acabo como se describe en las instrucciones del kit de síntesis de ADNc de Stratagen Zap.

Aproximadamente 90 clones de acil - ACP tioesterasa se identificaron y se clasificaron como de tipo tioesterasa mediante secuenciación de ADN y/o análisis de PCR. De los clones analizados, al menos 28 eran de de los tipos de clase I (FatA), y 59 eran tipos de clase II (FatB). Se observaron dos subclases de clones de tipo Fat, el tipo más prominente se denomina GarmFatA1 y el clon individual de la segunda subclase se denomina GarmFatA2. La secuencia de ADN y aminoácidos traducidos del clon C14 - 4 de GarmFatA1 (pCGN5252) (SEC ID Nº 8) se presenta en la figura en la figura 2. La secuencia de ADN y secuencia de aminoácidos traducida del clon C14 - E (SEQ ID Nº: 9) se presenta en la figura 3.

Las construcciones para la expresión del clon de Garm FatA1 de la figura 2 en E. coli se preparan como sigue. Los sitios de restricción se insertan mediante mutagénesis de PCR en el aminoácido 49 (SacI), que está cerca del extremo amino de la proteína madura supuesta, y después del codón de parada para la región que codifica la proteína (BamHI). La región que codifica la proteína madura se inserta como un fragmento SacI/BamHI en pBC SK (Stratagene; La Jolla, CA) dando como resultado pCGN5247, que se puede usar para proporcionar la expresión de la tioesterasa de mangostán como una proteína de fusión lacZ.

Los resultados de los ensayos de actividad tioesterasa sobre el clon GarmFatA1 de la tioesterasa de clase I usando sustratos acil - ACP de 16:0 y 18:1 se muestran más adelante.

Actividad de acil - ACP tioesterasa (cpm/min)

	16:0	18:0	18:1
Control	1400	3100	1733
GarmFatA1	4366	23916	87366

El clon GarmFatA1 demuestra actividad preferencial sobre sustrajo acil - ACP C18:0, y también demuestra actividad sustancial (aproximadamente 25% de la actividad de 18:1) sobre sustratos de acil - ACP de C18:0. Solamente un pequeño incremento en la actividad de C16:0 sobre la actividad en las células control se observa, y la actividad de 16:0 = representa solamente aproximadamente el 3% de la actividad de 18:1.

La expresión de la tioesterasa GarmFatA2 en E. coli y el ensayo de la actividad de la tioesterasa resultante demuestra que C18:1 es altamente preferida como el acil - ACP sustrato. La actividad tioesterasa sobre sustratos acil - ACP de 16:0 y 18:0 son aproximadamente iguales y representan menos del 5% de la actividad de 18:1 observada.

D.

Brassica campestres (rapa)

\quad

La secuencia de ADN de y la secuencia de aminoácidos traducida de una acil - ACP tioesterasa de Brassica campestris de clase I se proporciona en el documento WO 92/20236 (Figura 6).

E.

Cuphea palustris C8/C10

\quad

Se aísla ARN total de semillas en desarrollo de C. palustris usando el procedimiento de CTAB modificado descrito anteriormente. Una librería de ADN c Ziplox lambda (BRL; Gaithersburg, MD) que contiene aproximadamente 6 x 10^{6} u f c se construye a partir de ARN total. Aproximadamente 500.000 placas dr la librería no amplificada se seleccionan usando una sonda mixta que contiene las regiones codificadoras de tioesterasa. a partir de los clones de tioesterasa de clase II de Cuphea hookeriana CUPH-1 (CMT - 9), CUPH - 2 (CMT - 7) y CUPH - 5 (CMT - 10) (Secuencias de clones de estos clones se proporcionan en el documento WO 94/10288). Las condiciones de hibridación de rigurosidad se usan como sigue: la hibridación se lleva acabo a temperatura ambiente en una solución de formamida al 30% y SSC 2 X (SSC 1 X = NaCl 0,15 M; citrato de Na 0,015 M). Se identificaron ochenta clones positivos supuestos, treinta de los cuales se purificaron en placa. La secuencia de ácidos nucleicos y secuencia de aminoácidos traducida de un clon designado MCT29 (CpFatB1) (SEC ID Nº: 10) se proporciona en la figura 4. La secuencia de aminoácidos traducida de este clon es aproximadamente 83% idéntica a la secuencia del clon CUPH - de Cuphea hookeriana (CMT - 7 en la figura 7 del documento WO 94/10288) que tiene actividad tioesterasa primaria sobre los sustratos acil - ACP de C8: y C10:0.

Se preparan las construcciones para la expresión de MCT29 en E. coli. Los sitios SphI y StuI se insertan en 5' en el extremo N de la proteína madura supuesta localizada en el aminoácido 114 mediante PCR. El extremo N maduro predicho por la correspondencia a Leu 84 originalmente identificado como extremo N de proteína madura de tioesterasa de laurel. La región que codifica la proteína madura se clona como un fragmento StuI/XbaI en pUC118, dando como resultado el clon MCT29LZ, para proporcionar la expresión de la tioesterasa de C. palustris en E. coli como una proteína de fusión lacZ. Los lisados de células de E. coli transformadas que expresan la proteína MCT29 de tioesterasa se ensayan para evaluar la actividad de la acil - ACP tioesterasa. Los resultados demuestran que CpFatB1 codifica una enzima tioesterasa que tiene actividad principalmente sobre los sustratos C8- y C10 - ACP, con un 50% de actividad mayor sobre C8 - ACP que sobre C10 - ACP. La baja actividad sobre el sustrato C14 - ACP también se observa a niveles de aproximadamente 10% de la actividad C8 - ACP.

MCT29LZ también se transforma en E. coli fadD, un mutante de E. coli que carece de la acil - CoA sintasa específica de cadena media (Overath y col., Eur. J. Biochem (1969) 7: 559 - 574) para análisis de composición de lípidos. Los resultados de estos análisis demuestran un incremento sustancial en la producción de ácidos grasos 8:0 y 10:0 en células transformadas con el clon MCT29LZ de C. palustris.

El clon ChFatB2 de C. hookeriana estrechamente relacionado también demuestra actividad preferencial sobre los substratos acil - ACP de C8:0 y de C10:0, con un 50% de actividad superior sobre sustratos C10:0 opuestos a C8:0. La expresión del clon ChFatB2 en semillas de plantas de Brassica transgénicas da como resultado la producción aumentada de ácidos grasos C8 y C10 en las semillas, con niveles de C10 más altos que los niveles de C8. (Véase la solicitud en tramitación con la presente SN 08/261.695 presentada el 16 de junio de 1994).

F.

Cuphea palustris C14

\quad

La secuencia de ácidos nucleicos de y la secuencia de aminoácidos traducida de un clon de tioesterasa de C. palustris de clase II adicional, MCT34 (CpFatB2) (SEQ ID Nº: 11), se proporciona en la Figura 5. Las secuencia de aminoácidos traducida de este clon es aproximadamente un 80% idéntica a la secuencia de un clon CUPH - 4 de Cuphea hookeriana (CMt - 13 en la figura 8 del documento WO 94/10288).

Se preparan las construcciones para la expresión de MCT34 en E. coli. Los sitios SphI y StuI se insertan en 5' en el extremo N de la proteína madura supuesta localizada en el aminoácido 108 mediante PCR. La región que codifica la proteína madura se clona como un fragmento StuI/XbaI en pUC118, dando como resultado el clon MCT34LZ, para proporcionar la expresión de la tioesterasa de C. palustris en E. coli como una proteína de fusión lacZ. Los lisados de células de E. coli transformadas que expresan la proteína MCT34 de tioesterasa se ensayan para evaluar la actividad de la acil - ACP tioesterasa. Los resultados demuestran que CpFatB2 codifica una enzima tioesterasa que tiene actividad principalmente sobre el sustrato C14 - ACP. La actividad sobre el sustrato C16 - ACP también se observa a niveles de aproximadamente 30% de la actividad C14 - ACP.

MCT34LZ también se transforma en E. coli fadD, un mutante de E. coli que carece de la acil - CoA sintasa específica de cadena media (Overath y col., Eur. J. Biochem (1969) 7: 559 - 574) para análisis de composición de lípidos. Los resultados de estos análisis demuestran un incremento sustancial en la producción de ácidos grasos 14:0 y 14:1 en células transformadas con el clon MCT34LZ de C. palustris.

Ejemplo 2 Modificación por ingeniería genética de Tioesterasas FatA

La alteración de al especificidad de enzimas tioesterasa de un clon de Garm FatA1 de mangostán se proporciona como un ejemplo de al modificación de las tioesterasas de tipo FatA o de clase I. Las modificaciones deseables con respecto a las tioesterasas FatA incluyen la alteración en la especificidad de sustrato de manera que al actividad sobre la acil - ACP grasa de C18:0 se incrementa en relación a los sustratos acil - ACP grasos de C18:1 o
C16:0.

Por ejemplo con el fin de incrementar la actividad relativa sobre ácidos grasos saturados, tal como C18:0, las mutaciones en las regiones de las tioesterasas de clase I que difieren de las regiones correspondientes en las tioesterasas de clase II, que actúan principalmente sobre ácidos grasos saturados puede ser útil. Los datos de los experimentos que modifican por ingeniería genética las tioesterasas de laurel indican que las regiones de los aminoácidos 229 a 285 (como se numera en la secuencia de consenso de la línea superior sobre la figura 1) es importante en la unión de sustrato de tioesterasa. La comparación de secuencias de aminoácidos de esta región indica que en la región altamente conservada de los aminoácidos 250 - 265, varios aminoácidos cargados son diferentes en FatA comparado con las tioesterasas FatB. En las tioesterasas FatA, aminoácido 261 se carga negativamente con una pocas excepciones, mientras que en los clones FatB analizados hasta la fecha, el aminoácido 261 está en la mayoría de los casos cargados positivamente. También, en las tioesterasas FatA, el aminoácido 254 está positivamente cargada en todas las tioesterasas FatA estudiadas hasta la fecha, mientras que en los clones FatB analizadas hasta la fecha, el aminoácido 254 es en todos los casos un aminoácido que no tiene ninguna carga. De este modo, la alteración de la carga de aminoácidos en estas posiciones puede conducir a la alteración de preferencia de sustrato.

Un mutante TE de FatA en el aminoácido 261 (numeración de consenso de la figura 1), D261K de FatA1 de mangostán, se genera usando la mutagénesis dirigida al sitio de PCR similar a los procedimientos descritos para la modificación de secuencias de tioesterasas de laurel. El mutante D261K se mide para evaluar la actividad de tioesterasa como se ha descrito anteriormente (Davies, H. M. (1993) anteriormente).

Los resultados de estos análisis (figura 6) demuestran que la preferencia por 18:0 frente a 18:1 era un 35% (18:0/18:1) en el mutante D261K, comparado con el 25% en la Garm FatA1 de tipo salvaje. Tanto el clon de Gam FatA1 de tipo salvaje como mutante demuestran una actividad muy baja sobre 16:0 y ninguna actividad sobre los sustratos de longitud de cadena media tal como C10:0 a C10:0. Un mutante adicional Garm FatA1 se preparó teniendo la mutación D261K indicada anteriormente, así como una mutación para cambiar el aminoácido 254 de lisina a valina. Este mutante, K254V/D261K, demostró un incremento de la relación 18:0/18:1 de 40%. Estos resultados una vez más soportan la evidencia de laurel que indica que la modificación de esta región puede cambiar la actividad y especificidad de enzimas. Un triple mutante, G249T/K254V/D261K, está bajo construcción para modificar adicionalmente el clon Garm FatA1 hacia la estructura de tioesterasa FatB para la evaluación de la modificación de la especificidad
adicional.

Otras modificaciones de aminoácidos deseables de clones de Garm FatA1 de mangostán se pueden seleccionar mediante comparación de la secuencia de aminoácidos de tioesterasa Garm FatA1 enriquecida en 10:0 para un clon FatA que tiene actividad principalmente sobre sustratos 18:1, con poca o ninguna actividad sobre sustratos 18:0. Una comparación de las secuencias de aminoácidos de Garm FatA1 y un clon de tioesterasa preferente 18:1 de Brassica campestres (rapa), Br FatA1, se proporciona en la figura 7. En vista de las alteraciones de la unión a sustrato manifestadas por la tioesterasa de laurel en la región a continuación de la lámina-\beta y el giro predichos, (anclada por los aminoácidos G169 y G172 de la comparación de tioesterasa de mangostán de Brassica de la figura 7), esta región es además una diana para la alteración de la especificidad de sustrato del clon de tioesterasa de mangostán Garm FatA1. Los análisis de estructura secundarias la comparación de la secuencia de aminoácidos de las tioesterasas de clase I de Brassica rapa dan como resultado la identificación de varias mutaciones dianas para la alteración adicional de la especificidad de sustrato de la tioesterasa de mangostán, Garm FatA1. Los aminoácidos diana incluyen Y182V, Q186E, D209S, V210D y H219F.

El análisis adicional de las alineaciones de las secuencias de péptidos de las tioesterasas de plantas de tipo FatA revela un número se restos de aminoácidos que se conservan dentro de todas las tioesterasas de plantas de tipo Fat excepto que la tioesterasa GarM FatA de mangostán. Cinco de estos aminoácidos específicos d GarmFatA1 son (usando la numeración de consenso de la figura 1) G185 (consenso es D), S188 (consenso es A), V270 (consenso es D), H279 (consenso es F) y S307 (consenso es A). Estos cinco aminoácidos son de particular interés debido a que son sustituciones no conservadoras. Comparado con las sustituciones conservadoras, por ejemplo S223 T, son más probablemente la causa de cambios estructurales o bioquímicos en la enzima de mangostán y de este modo contribuye a su única especificidad hacia 18:0 - ACP y extremadamente baja actividad hacia 16:0 - ACP.

Estos cinco aminoácidos identificados se han mutagenizado en Garm FatA1 a o bien el aminoácido de consenso, a alanina. Para S188 y S307, solamente se realizaron las sustituciones de alanina ya que la alanina también es el aminoácido de consenso para estos residuos. Además, se realizaron los mutantes que contienen diversas combinaciones de las sustituciones de aminoácidos anteriores. Una purificación de expresión/proteína diana de afinidad se usa para análisis de los mutantes Garm FatA1 anteriores. Las tioesterasas GarM FatA1 de tipo salvaje y mutante se expresan en E. coli usando el vector pQE32 (Qiagen). Las proteínas recombinantes que contienen una marca de afinidad constituida por seis restos de histidina consecutivos se producen a altos niveles, y se purifican usando la resina Qiagen Ni - NTA siguiendo al s instrucciones del fabricante.

Para construir los plásmidos de expresión, la porción madura se la Garm FatA - 1 (aminoácido 65 al extremo de terminal C) se amplificó entre los sitios de restricción BamHI y SalI en el poliengarce. La secuencia de ADN se verificó mediante secuenciación, y el plásmido se transformó en células M15 E. coli (Qiagen). Las células se desarrollaron a 30ºC en medio LB que contenía 100 mg/l de ampicilina y 30 mg/l de kanamicina, y la producción de la proteína recombinante se indujo mediante la adición de IPTG 2 mM y las células se dejaron crecer durante 4 horas adicionales. Las células se centrifugaron y se lisaron y las proteínas recombinantes se purificaron con resina Ni - NTA siguiendo las instrucciones del fabricante. Las enzimas Garm FatA1 mutantes también se expresaron en E. coli d construcciones pQE, se purificaron y se ensayaron para evaluar la actividad de hidrólisis de 10:0 - ACP y 18:1 - ACP. Los resultados de estos ensayos se presentan en forma de gráfico con un cambio de pliegue en la actividad específica se muestran en la figura 10. La actividad específica de mutantes seleccionada se proporciona en la figura 11.

El mutante S188A demuestra un incremento de 4 veces en la actividad 18:0 - ACP y un incremento de 2 veces en al actividad de 18:1. S307A selectivamente incrementa la actividad de 18:0 - ACP (2 veces) sin cambiar la actividad 18:1 - ACP. Por otra parte, la modificación de ciertos restos crearon efectos negativos. Por ejemplo, G185D, V270D y H279F muestran una reducción mayor de 2 veces en las actividades. Sin embargo, en algunos casos, específicamente para la sustitución de aminoácidos pequeños, hidrófobos, de alanina (por ejemplo, G185A y V270A) invierte los efectos negativos (G185A tiene un incremento de 2 veces en actividad). Esto es probablemente debido a l efecto neutro de alanina sobre la estructura de proteína y su similitud a estos aminoácidos pequeños. Este resultado también sugiere que la exploración de alanina de aminoácidos conservados en Fat puede dar como resultado la producción de mutantes con actividad de hidrólisis aumentada.

Estos estudios también demuestran que las sustituciones con impacto positivo sobre la actividad enzimática son aditivos. Cuando las mutaciones que muestran actividad aumentada (por ejemplo S188A y V270A) se combinan para realizar un doble mutante, se observa un incremento adicional en la actividad enzimática. El mutante S188A/V270A demuestra un incremento de 13 veces de actividad 18:0 - ACP. Además, cuando una mutación positiva se combina con una mutación que muestra el incremento selectivo en un sustrato pero no el otro, el mutante resultante muestra mucha actividad global mejorada y relación 18:0 /18:1 ACP. Por ejemplo S188A/V270A/S370A muestra un incremento de 7 veces en la actividad 18:0 - ACP y una relación 18:0/18:1 de 0,8/1 comparado con una relación de 0,3/1 para la Garm FatA1 de tipo salvaje.

Ejemplo 3 Intercambio de dominios

Se proporcionan los procedimientos para preparar las construcciones de intercambio de dominios de tioesterasas en los que los sitios de restricción convenientes no están disponibles.

A. Procedimientos de dominios cortos

\quad

Un procedimiento para el intercambio de dominios cortos de ilustra en la figura 8. Dos PCR separados dan como resultado dos fragmentos (productos de cebadores a + d, y cebadores b + c), que contienen una secuencia de superposición idéntica al nuevo dominio. Los cebadores c y d se sintetizan para emparejar la secuencia exacta en los extremos 3' cadena abajo del dominio original, más un extremo protuberante correspondiente a la secuencia de dominios nuevos. La longitud de la secuencia de emparejamiento debe ser suficientemente larga para proporcionar una T_{m} de 50ºC o más (calculada asumiendo una C o G = 4ºC y una T o A = 2ºC). De manera ideal, la longitud de los extremos protuberantes no debe ser mayor que 18 bases (6 aminoácidos), aunque extremos protuberantes más largos también pueden funcionar a eficiencias inferiores. Las primeras dos PCR se llevan a cabo con aproximadamente 0,2 \muM de cebadores y 0,1 \mug de ADN de molde en condiciones de PCR descritas más adelante. El segundo desarrollo de PCR (PCR 3) se realiza mezclando 10 \mul de cada producto de PCR 1 y 2, y añadiendo cebadores a y b a la concentración final de 0,2 \muM. El producto resultante es el gen dirigido con el dominio original reemplazado por una nueva secuencia de dominio. El producto PCR se puede examinar sobre gel de agarosa antes de la precipitación y digestión de restricción para la subclonación. El fragmento de ADN modificado se debe secuenciar para verificar la mutación deseada.

B. Procedimientos de dominios largos

\quad

Para intercambiar los dominios más largos, como se ilustra en la figura 9, el cambio de un dominio del gen II al gen I se puede lograr amplificando primero tres fragmentos de PCR 1, 2, y 3. Estos fragmentos parcialmente superpuestos después se mezclan juntos para la siguiente PCR con cebadores a y b. Las condiciones PCR se describen a continuación. El producto de longitud completa resultante es el gen I con un nuevo dominio del gen II. Mediante el mismo principio, se pueden intercambiar dos dominios en el gen I simultáneamente mediante una PCR adicional en el primer desarrollo, seguido de al segunda PCR en presencia de los cuatro fragmentos (no mostrado).

\quad

Las condiciones de PCR que se han usado con éxito son como sigue: cinco ciclos se programaron con desnaturalización durante 1 minuto a 94ºC, la renaturalización durante 30 segundos a 48ºC, y elongación durante2 minutos a 72ºC. A los cinco primeros ciclos siguieron 30 ciclos usando el mismo programa excepto con la renaturalización durante 30 segundos a 60ºC. Lo racional para ara los cinco primeros ciclos a una temperatura inferior es asegurar la hibridación para los cebadores de PCR con extremos protuberantes en 5'. El incremento de temperatura para los últimos ciclos limita la amplificación adicional a secuencias amplificadas durante los cinco primeros ciclos. Las T_{m} para todos los cebadores debe ser diseñada a aproximadamente 60ºC. Para la conveniencia de la clonación posterior, los cebadores de anclaje de longitud completa (a y b, figura 8 y 9) usualmente incluyen sitios de restricción adicionales y o extremos protuberantes para diversos vectores de subclonación de PCR. Es importante usar una cantidad de ADN de molde tan pequeña como sea posible (usualmente menos que 0,1 \mug) para reducir el fondo no mutagenizado.

C. Intercambio de dominios Fat A y Fat B

\quad

Las secuencias de péptidos de tioesterasas Fat A y Fat B se pueden alinear para demostrar las similitudes claras y diferencias entre las dos clases de enzimas (Voelker (1996) Genetic Engieneering, vol 18, ed. J. K. Setlow, p. 111 - 133; figura 3). Existe una región hidrófoba cerca de extremo N que está altamente conservada en las tioesterasas FatB, y ausente en las tioesterasas FatA. Sin embargo, existen cinco regiones que están presentes en ambas clases de tioesterasas que se pueden clasificar como parcialmente homólogas, así como una región de sitio activo alrededor de los restos de histidina y cisteína que está altamente conservada entre todos los miembros de las tioesterasas FatA y FatB. Además de la sección única hidrófoba para FatA, existen tres regiones únicas adicionales que comparten poca o ninguna homología entre ellas. Una representación de estas diversas regiones péptidicas muestran las localizaciones de las únicas regiones únicas y conservadas para Garm y FatA y UC FatB1 se proporciona en la figura 12. La numeración de aminoácidos está de acuerdo con la numeración de consenso de la línea superior en la figura 1.

\quad

Mediante supresión o intercambio de estas regiones únicas y conservadas entre Garm y UC FatB1 que usan técnicas de intercambio de dominios como se ha descrito anteriormente, los mutantes se generaron y ensayaron para evaluar la actividad y especificidad enzimática.

\quad

Los resultados del análisis de estas supresión y mutantes intercambiados se proporcionan en la figura 13 A y B.

\quad

Estos resultados muestran lo siguiente. La única sección hidrófoba en FatB no afecta a la actividad o especificidad de sustrato de las tioesterasas FatB. La supresión de al única sección terminal de FatB disminuye la actividad enzimática pero no altera la especificidad del sustrato. Las regiones del sitio activo son intercambiables sin alterar la especificidad del sustrato, indicando que las secuencias fuera de las regiones de sitios activos determinan la especificidad enzimática. Intercambiando la única secuencia de los residuos 275 a 298 no altera la especificidad de sustrato pero provoca una disminución de la actividad enzimática. Una enzima quimérica formada fusionando la porción N - terminal FatB hasta el residuo 382 y la porción C - terminal de Fat A (382 a 430) es inactiva, sugiriendo que la porción terminal C de Fat B es crítica para la actividad enzimática global. Las enzimas quiméricas formadas mediante fusión de los terminales N y C de Fat A y B (residuo 275 como el punto de corte) son inactivos, indicando secuencias entre 65 y 275 están afectando la estructura global de cada enzima.

Ejemplo 4 Transformación y análisis de plantas

\quad

Plantas transgénicas con niveles aumentados de ácido graso C18:0 como el resultante de la expresión de tioesterasa Garm FatA1 en semillas de Brassica napus se reseñan en el documento WP 97/12047. Una construcción, pCGN5255, que comprende un gen de tioesterasa Garm FatA1 bajo la regulación de regiones reguladoras napin 5' y 3' se usa para la transformación de plantas. La composición de ácidos grasos en una línea de alto contenido en ácido oleico tan alto como 39%, comparado con aproximadamente 2% en plantas de control no transformadas, se reseñan en la mitad de las semillas de una planta transgénica 5255 seleccionada. Niveles similares de ácidos grasos 18:0 se reseñan en plantas transgénicas de una línea transformada de B. napus transformada con una construcción doble de Garm FatA1, pCGN5266. Los niveles de estearato en muestras de semillas combinadas de poblaciones de semillas segregantes variaban hasta 14,25 en los transformantes 5255 y 22% en los transformantes 5266.

\quad

Para el análisis de la producción de esterato en plantas transgénicas transformadas con el doble mutante de Garm FatA1 G185A/S188A, una construcción de expresión napin se prepara que es idéntica a pCGN5255, pero con la secuencia que codifica el mutante G185A/S188A sustituida por la secuencia que codifica Garm FatA1 de tipo salvaje. La construcción del doble mutante pCGN5274, se transforma en Agrobacterium tumefaciens y se usa para generar plantas de B. napus variedad Quantum. Al mismo tiempo, pCGN5255 también se usa para generar plantas de B. napus variedad Quantum como un control para las plantas 5274.

\quad

Las semillas segregantes combinadas de las plantas Quantum 5255 y 5274 se analizan para determinar la composición de ácidos grasos. Un análisis estadístico de estos resultados de muestra en la forma tabulada a continuación.

TABLA I Estadística descriptiva

	plantas 5255	plantas 5274
% media de estearato	4,59	7,31
Desviación estándar	2,17	2,69
Número de muestras	43	45
% de estearato mínimo	1,31	1,66
% de estearato máximo	10,10	12,79
Varianza	4,70	7,23
Intervalo	8,79	11,13
Mediana	4,13	7,45

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TABLA II Nivel de confianza del 95% de muestras individuales para las medias

	Media	95% inferior	95% superior
Plantas 5255	4,592	3,925	5,259
Plantas 5274	7,308	6,500	8,116

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Las representaciones en histogramas de los datos de 5255 t 5274 se proporcionan en la figura 14. Los resultados detallados de los análisis de composición se proporcionan en la figura 15.

Las construcciones adicionales se preparan con un doble mutante Garm FatA1, S188A/V270A. Una construcción expresión napin, pCGN5290, se prepara que es idéntica a pCGN5255, excepto en la región codificadora Garm FatA1, el mutante S188A/V270A (descrito anteriormente) quer codifica la secuencia se sustituye. Además, una construcción doble, pCGN5291, se prepara que es idéntica a pCGN5266 excepto que las dos secuencias que codifican Garm FatA1 de tipo salvaje se han reemplazado con dos secuencias codificadoras de los mutantes S188A/V270A. Las construcciones pCGN5290 y pCGN5291 se transforman en Agrobacterium tumefaciens y se usan para generar B. napus transgénica variedad Quantum. Aproximadamente se obtienen 25 plantas transgénicas para cada construcción. Las semillas maduras de cada planta transgénica se recogen y se analizan para evaluar als composiciones de ácidos
grasos.

Los resultados de los análisis de las composiciones de ácidos grasos de las semillas combinadas T2 muestran que las plantas que expresan la Garm FatA1 mutante S188/V270A producen significativamente cantidades mayores de estearato (c18:0) como un porcentaje de ácidos grasos totales cuando se compara con plantas transgénicas que expresan o bien Pcgn5255 O Pcgn5266 (FIGURA 16). Más específicamente, los niveles de estearato en semillas de plantas que expresan pCGN5290 y pCGN5291 son 68% y 57% más altos que los niveles obtenidos de semillas de plantas que expresan pCGN5290 y pCGN5291 son 68% y 57% mas altos que los niveles obtenidos de semillas de plantas que expresan pCGN5255y pCGN5266 respectivamente. Los niveles de estearato en semillas combinadas de poblaciones de semillas segregantes que varían hasta 16,3% en transformantes 5290 y 9,9% en los transformante de control 5255. Además, los niveles de estearato en muestras de semillas combinadas de poblaciones de semillas segregantes variaban hasta 20,9% en los transformantes 5291 comparados con el 13% en los transformantes 5266. Brassica napus de control no transformada contiene menos del 3% de estearato. Un análisis estadístico de estos resultados se muestra en la forma tabulada más adelante.

TABLA III Estadística descriptiva

	plantas 5255	plantas 5290	plantas 5266	plantas 5291
% media de estearato	5,28	8,90	6,46	10,12
Desviación estándar	1,84	2,51	2,95	4,12
Número de muestras	33	29	11	26
% de estearato mínimo	2,70	5,06	3,14	2,30
% de estearato máximo	9,86	16,30	13,00	20,89
Varianza	3,38	6,29	8,71	16,99
Intervalo	7,16	11,24	9,86	18,59
Mediana	4,49	8,85	6,10	10,01

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TABLA IV Nivel de confianza del 95% de muestras individuales para las medias

	Media	95% inferior	95% superior
Plantas 5255	5,282	4,630	5,394
Plantas 5290	8,897	7,943	9,851
Plantas 5266	6,461	4,478	8,444
Plantas 5291	10,123	8,458	11,788

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Estos resultados demuestran que se pueden obtener niveles mejorados de estearato en plantas de tioesterasa transgénicas mediante al expresión de tioesterasas mutantes que tienen actividad C18:0 incrementada con relación a la actividad de C18:1.

Los resultados anteriores demuestran la habilidad para modificar las secuencias de las acil - ASCP tioesterasas de plantas de manera que se pueden producir las tioesterasas modificadas por ingeniería genética que tienen especificidad de sustrato alterada. Tales tioesterasas se pueden expresar en células hospedadoras para proporcionar un suministro de la tioesterasa modificada por ingeniería genética y para modificar la ruta existente de síntesis de ácidos grasos de manera que se obtienen las composiciones novedosas se ácidos grasos. En particular, las tioesterasas modificadas por ingeniería genética se pueden expresar en las semillas de plantas de semillas oleaginosas para proporcionar una fuente natural de moléculas de TAG deseables.

Todas las publicaciones y solicitudes de patentes mencionadas en esta memoria descriptiva son indicativas del nivel de experiencia de los expertos en la técnica a las que esta invención pertenece.

<110> Calgene LLC

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<120> Modificación por ingeniería genética de tioesterasas de plantas y descripción de tioesterasas de plantas que tienen especificidad de sustrato novedosa

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<130> CGNE 133 - 1 WO

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<140> PCT/US98/11697

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<141> 1998 - 07 - 21

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<150> 08/868.458

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<151> 1997 - 06 - 03

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<160> 19

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<170> IBM PC; Windows NT 4.0; Microsoft Word para Windows 7.0a

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<210> 1

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<211> 382

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<212> aminoácidos

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<213> Umbellularia californica

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<400> 1

1

2

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<210> 2

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<211> 382

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<212> aminoácido

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<213> Cinnamomum camphora

\newpage

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<400> 2

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3

4

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 411

\vskip0.400000\baselineskip

<212> aminoácido

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Cuphea palustris

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

5

6

7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 411

\vskip0.400000\baselineskip

<212> aminoácido

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Cuphea palustris

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

8

9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 352

\vskip0.400000\baselineskip

<212> aminoácido

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Garcinia mangifera

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

10

11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 362

\vskip0.400000\baselineskip

<212> aminoácido

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Brassica rapa

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

12

13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1157

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Cinnamomum camphora

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

14

15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1300

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Garcinia mangifera

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

16

17

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1314

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Garcinia mangifera

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

19

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1459

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Cuphea palustris

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

21

22

23

\vskip1.000000\baselineskip

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECEUNCIA: SEQ ID Nº: 11

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1408

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Cuphea palustris

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

24

25

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Oligonucleótido sintético

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CUACUACUAC UASYNTVNGY NATGATGAA

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Oligonucleótido sintético

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAUCAUCAUC AURCAYTCNC KNCKRTANTC

\hfill

30

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Oligonucleótido sintético

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AUGGAGAUCU CUGAWCRBTA YCCTAMHTGG GGWGA

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Oligonucleótido sintético

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACGCGUACUA GUTTNKKNCK CCAYTCNGT

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Oligonucleótido sintético

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGAAATAATG GCCGACGACA TGATTTCCTT GTCC

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Oligonucleótido sintético

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGTTGTCCAA AATCCC

\hfill

16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Oligonucleótido sintético

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCGTGCTGCA GTCCCTGACC

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Oligonucleótido sintético

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAGAGAGTGC ACGATGGATA GCGTGCTGCA GTCCCTGACC

\hfill

40

Claims (6)

1. Una acil - ACP tioesterasa de plantas modificada por ingeniería genética, en la que dicha esterasa modificada por ingeniería genética demuestra una especificidad de sustrato alterada con respecto a los acil - ACP sustratos hidrolizados por dicha tioesterasa comparada con la acil - ACP tioesterasa de tipo salvaje en dicha planta, en la que la tioesterasa de tipo salvaje es una tioesterasa Garm FatA1 de magostán, y

en la que dicha tioesterasa modificada por ingeniería genética contiene una o más sustituciones seleccionadas entre S188A, S307A, G185A y V270A, la numeración de aminoácidos de la tioesterasa Garm FatA1 de mangostán basándose en la numeración de consenso mostrada en la figura 1.

2. La tioesterasa modificada por ingeniería genética de la reivindicación 1, en la que dicha tioesterasa modificada por ingeniería genética es un doble mutante.

3. La tioesterasa modificada por ingeniería genética de la reivindicación 1, en la que dicha tioesterasa modificada por ingeniería genética es un triple mutante.

4. Una secuencia de ADN que codifica una acil - ACP tioesterasa de plantas modificada por ingeniería genética, en la que dicha tioesterasa modificada por ingeniería genética demuestra una especificidad de sustrato alterada con respecto a los sustratos acil - ACP hidrolizados por dicha tioesterasa comparado con la acil - ACP tioesterasa de plantas de tipo salvaje, en la que dicha tioesterasa de tipo salvaje es una Garm FatA1 tioesterasa de mangostán, y

en al que dicha tioesterasa modificada por ingeniería genética contiene una o más de las sustituciones de aminoácidos seleccionadas entre S188A, S307A, G185A y V270A, la numeración de aminoácidos de la tioesterasa Garm FatA1 de mangostán basándose en la numeración de consenso mostrada en al figura 1.

5. La secuencia de ADN de la reivindicación 4, en la que dicha secuencia de ADN codifica una tioesterasa Garm FatA1 de mangostán mutante doble.

6. La secuencia de ADN de la reivindicación 4, en la que dicha secuencia de ADN codifica una tioesterasa Garm FatA1 de mangostán mutante triple.