JP2002525105A - 新規な植物アシルトランスフェラーゼ - Google Patents
新規な植物アシルトランスフェラーゼInfo
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- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
- C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
- C12N15/8247—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified lipid metabolism, e.g. seed oil composition
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Abstract
(57)【要約】
本発明によって、アシルトランスフェラーゼ様タンパク質が、脂肪酸アシル供与体から脂肪酸アシル受容体への脂肪酸基の輸送に活性であることを特徴とする、アシルトランスフェラーゼ関連タンパク質をコードする新規核酸配列が提供される。さらに、考慮されるのは、ＡＴ様核酸配列から得ることができるアミノ酸および核酸配列、および改変した脂質内容と組成物を生成する能力のあるトランスジェニック宿主細胞を推定するためのこのような配列の用途である。
Description
【０００１】 （技術分野） 本発明は核酸及びアミノ酸配列、構築物、並びにこれらに関連する方法に関す
る。
る。
【０００２】 （背景） 植物の遺伝子工学技術の発展により、新規且つ所望の特性を有する植物を提供
るために植物種のトランスジェニック変種を産生することは現在可能である。例
えば、現在、環境ストレスに対する耐性（例えば、病原体に対する耐性及び除草
剤に対する耐性）を付与し、植物の品質特性（例えば、脂肪酸組成）を改良する
ために植物を遺伝子操作することができる。しかしながら、前記特性の操作のた
めに有用なヌクレオチド配列の数はかなり限られており、新規特性を操作するた
めに新規且つ有用なヌクレオチド配列のスピードは遅い。
るために植物種のトランスジェニック変種を産生することは現在可能である。例
えば、現在、環境ストレスに対する耐性（例えば、病原体に対する耐性及び除草
剤に対する耐性）を付与し、植物の品質特性（例えば、脂肪酸組成）を改良する
ために植物を遺伝子操作することができる。しかしながら、前記特性の操作のた
めに有用なヌクレオチド配列の数はかなり限られており、新規特性を操作するた
めに新規且つ有用なヌクレオチド配列のスピードは遅い。
【０００３】 各種アシルトランスフェラーゼタンパク質のキャラクタリゼーションは、植物
脂肪酸合成システムを更に研究するために、新規及び／または代替オイル源を開
発するために有用である。植物メカニズムの研究により、トリグリセリド及びオ
イルの全脂肪アシル組成を更に強化、調節、改変もしくはその他の方法で変更す
るための手段が提供され得る。更に、植物中の脂肪酸の自然産生に対して重要な
因子の解明、例えば前記因子の純化及び前記システムの効率を高める要素及び／
または共因子のキャラクタリゼーションが望ましい。遺伝子工学における用途に
対して有用であり得る遺伝子コードタンパク質の核酸配列は特に興味深い。
脂肪酸合成システムを更に研究するために、新規及び／または代替オイル源を開
発するために有用である。植物メカニズムの研究により、トリグリセリド及びオ
イルの全脂肪アシル組成を更に強化、調節、改変もしくはその他の方法で変更す
るための手段が提供され得る。更に、植物中の脂肪酸の自然産生に対して重要な
因子の解明、例えば前記因子の純化及び前記システムの効率を高める要素及び／
または共因子のキャラクタリゼーションが望ましい。遺伝子工学における用途に
対して有用であり得る遺伝子コードタンパク質の核酸配列は特に興味深い。
【０００４】 （発明の要旨） 本発明は、アシルトランスフェラーゼタンパク質に関連するタンパク質クラス
のアミノ酸配列をコードする核酸配列を提供する。本明細書では、前記タンパク
質をアシルトランスフェラーゼ関連またはアシルトランスフェラーゼ様タンパク
質と呼ぶ。
のアミノ酸配列をコードする核酸配列を提供する。本明細書では、前記タンパク
質をアシルトランスフェラーゼ関連またはアシルトランスフェラーゼ様タンパク
質と呼ぶ。
【０００５】 本発明により、前記アシルトランスフェラーゼ関連タンパク質をコードする核
酸を酵素活性について特徴づけることができる。特に、アラビドプシス（Ａｒａ ｂｉｄｏｐｓｉｓ ）、酵母、トウモロコシ及び大豆由来のアシルトランスフェラ
ーゼ関連タンパク質をコードする核酸配列の同定及び単離を提供する。
酸を酵素活性について特徴づけることができる。特に、アラビドプシス（Ａｒａ ｂｉｄｏｐｓｉｓ ）、酵母、トウモロコシ及び大豆由来のアシルトランスフェラ
ーゼ関連タンパク質をコードする核酸配列の同定及び単離を提供する。
【０００６】 従って、本発明はアシルトランスフェラーゼ関連核酸配列及び対応するアミノ
酸配列、並びに植物アシルトランスフェラーゼ関連遺伝子配列の分析及び回収用
のアシルトランスフェラーゼ関連コード配列を含むオリゴヌクレオチドの作成に
おける前記核酸配列の使用を包含する。アシルトランスフェラーゼ関連コード配
列は、意図する用途に応じて完全または一部の配列をコードし得る。ゲノム配列
、すなわちｃＤＮＡ配列の全部または一部が意図される。
酸配列、並びに植物アシルトランスフェラーゼ関連遺伝子配列の分析及び回収用
のアシルトランスフェラーゼ関連コード配列を含むオリゴヌクレオチドの作成に
おける前記核酸配列の使用を包含する。アシルトランスフェラーゼ関連コード配
列は、意図する用途に応じて完全または一部の配列をコードし得る。ゲノム配列
、すなわちｃＤＮＡ配列の全部または一部が意図される。
【０００７】 宿主細胞においてアシルトランスフェラーゼ関連配列を転写、または転写と翻
訳（発現）する組換えＤＮＡ構築物が特に興味深い。特に、植物宿主細胞におい
て転写、または転写と翻訳を行い得る構築物が好ましい。幾つかの用途では、ア
シルトランスフェラーゼ関連配列をコードする配列を短縮することが望ましくも
ある。よって、組換え構築物はアンチセンス配列の発現のために逆方向にアシル
トランスフェラーゼ関連配列を有するように設計され得、または「トランスウィ
ッチ」構築物としても公知のコサプレッションを使用することが有用であり得る
。前記構築物は、植物種子組織において優先的に発現する遺伝子から得られる転
写開始領域を含めた各種調節領域を含み得る。幾つかの用途では、アシルトラン
スフェラーゼ関連コード配列と共にアシルトランスフェラーゼ関連遺伝子の転写
及び翻訳開始領域を使用したり、異種配列を転写及び翻訳することが望ましい。
訳（発現）する組換えＤＮＡ構築物が特に興味深い。特に、植物宿主細胞におい
て転写、または転写と翻訳を行い得る構築物が好ましい。幾つかの用途では、ア
シルトランスフェラーゼ関連配列をコードする配列を短縮することが望ましくも
ある。よって、組換え構築物はアンチセンス配列の発現のために逆方向にアシル
トランスフェラーゼ関連配列を有するように設計され得、または「トランスウィ
ッチ」構築物としても公知のコサプレッションを使用することが有用であり得る
。前記構築物は、植物種子組織において優先的に発現する遺伝子から得られる転
写開始領域を含めた各種調節領域を含み得る。幾つかの用途では、アシルトラン
スフェラーゼ関連コード配列と共にアシルトランスフェラーゼ関連遺伝子の転写
及び翻訳開始領域を使用したり、異種配列を転写及び翻訳することが望ましい。
【０００８】 本発明では、本発明の構築物及びポリヌクレオチドを含む植物及び種子も包含
される。
される。
【０００９】 （図面の簡単な説明） 図１は、グリセロール−３−ホスフェートアシルトランスフェラーゼと各種の
リソホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼのＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを用いる
比較により同定した２０４アミノ酸保存配列のプロフィールを示す。
リソホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼのＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを用いる
比較により同定した２０４アミノ酸保存配列のプロフィールを示す。
【００１０】 図２は、アシルトランスフェラーゼ配列のアミノ酸配列アラインメントを示す
。ここに示したアラインメントは、保存配列ＨＸＸＸＸＤ中の保存Ｈの前約３０
アミノ酸からアシルトランスフェラーゼ様配列の保存ＰＥＧ配列モチーフ中のＰ
の後、すなわち下流１００アミノ酸まで延びているタンパク質の領域を有する。
。ここに示したアラインメントは、保存配列ＨＸＸＸＸＤ中の保存Ｈの前約３０
アミノ酸からアシルトランスフェラーゼ様配列の保存ＰＥＧ配列モチーフ中のＰ
の後、すなわち下流１００アミノ酸まで延びているタンパク質の領域を有する。
【００１１】 図３は、同定されたアシルトランスフェラーゼの関係を示す概略図である。こ
こに記載の関係は、保存配列ＨＸＸＸＸＤ中の保存Ｈの前約３０アミノ酸からア
シルトランスフェラーゼ様配列の保存ＰＥＧ配列モチーフ中のＰの後、すなわち
下流１００アミノ酸まで延びているタンパク質の領域のアラインメントから誘導
される。図３Ａは、数種のアシルトランスフェラーゼの関係を示す系統樹を示す
。図３Ｂは、ＰＡＭ２５０残基重量テーブルを用いるＣｌｕｓｔａｌ方法による
新規アシルトランスフェラーゼ及び公知アシルトランスフェラーゼの相似％及び
発散％を示す表である。
こに記載の関係は、保存配列ＨＸＸＸＸＤ中の保存Ｈの前約３０アミノ酸からア
シルトランスフェラーゼ様配列の保存ＰＥＧ配列モチーフ中のＰの後、すなわち
下流１００アミノ酸まで延びているタンパク質の領域のアラインメントから誘導
される。図３Ａは、数種のアシルトランスフェラーゼの関係を示す系統樹を示す
。図３Ｂは、ＰＡＭ２５０残基重量テーブルを用いるＣｌｕｓｔａｌ方法による
新規アシルトランスフェラーゼ及び公知アシルトランスフェラーゼの相似％及び
発散％を示す表である。
【００１２】 （発明の詳細な説明） 本発明によれば、本明細書でアシルトランスフェラーゼ様またはアシルトラン
スフェラーゼ関連と称する、アシルトランスフェラーゼタンパク質をコードする
核酸配列に関連するアミノ酸の配列をコードし得るヌクレオチド配列、例えばタ
ンパク質、ポリペプチドまたはペプチドが提供される。この新規な核酸配列は、
宿主細胞において該配列を発現させるための構築物の作成において有用である。
更に、前記した新規な核酸配列は、植物細胞の脂肪酸組成を変更するための植物
発現構築物の作成において有用であり得る。
スフェラーゼ関連と称する、アシルトランスフェラーゼタンパク質をコードする
核酸配列に関連するアミノ酸の配列をコードし得るヌクレオチド配列、例えばタ
ンパク質、ポリペプチドまたはペプチドが提供される。この新規な核酸配列は、
宿主細胞において該配列を発現させるための構築物の作成において有用である。
更に、前記した新規な核酸配列は、植物細胞の脂肪酸組成を変更するための植物
発現構築物の作成において有用であり得る。
【００１３】 本発明の１実施態様において、本明細書ではポリヌクレオチドとも称される核
酸配列はアシルトランスフェラーゼ関連データベースから同定される。
酸配列はアシルトランスフェラーゼ関連データベースから同定される。
【００１４】 単離タンパク質、ポリペプチド及びポリヌクレオチド 本発明の第１態様は、単離アシルトランスフェラーゼポリヌクレオチドに関す
る。本発明のポリヌクレオチド配列は、配列表に記載の配列の群から選択される
推定アミノ酸配列を有する本発明のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオ
チドを含み、前記配列に密接に関連する他のポリヌクレオチド配列及び及びその
変異体をも包含する。
る。本発明のポリヌクレオチド配列は、配列表に記載の配列の群から選択される
推定アミノ酸配列を有する本発明のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオ
チドを含み、前記配列に密接に関連する他のポリヌクレオチド配列及び及びその
変異体をも包含する。
【００１５】 本発明は、全長にわたって配列表に記載されている各コード配列と同一のポリ
ヌクレオチド配列を提供する。本発明はまた、成熟ポリペプチドまたはその断片
に対するコード配列、並びにリーダーまたは分泌配列をコードする配列、プレ−
、プロ−もしくはプレプロ−タンパク質配列のような他のコード配列を有するリ
ーディングフレーム内の成熟ポリペプチドまたはその断片に対するコード配列を
提供する。前記ポリヌクレオチドは非コード配列をも含み得る。この非コード配
列の例には、非コード５’及び３’配列、例えば転写・非翻訳配列、終結シグナ
ル、リボソーム結合サイト、ｍＲＮＡを安定化する配列、イントロン、ポリアデ
ニル化シグナル、及び追加のアミノ酸をコードする別のコード配列が含まれるが
、これらに限定されない。例えば、融合ポリペプチドの精製を容易にすべくマー
カー配列を含めることができる。本発明のポリヌクレオチドは、構造遺伝子及び
遺伝子発現をコントロールする本質的に関連する配列からなるポリヌクレオチド
をも含む。
ヌクレオチド配列を提供する。本発明はまた、成熟ポリペプチドまたはその断片
に対するコード配列、並びにリーダーまたは分泌配列をコードする配列、プレ−
、プロ−もしくはプレプロ−タンパク質配列のような他のコード配列を有するリ
ーディングフレーム内の成熟ポリペプチドまたはその断片に対するコード配列を
提供する。前記ポリヌクレオチドは非コード配列をも含み得る。この非コード配
列の例には、非コード５’及び３’配列、例えば転写・非翻訳配列、終結シグナ
ル、リボソーム結合サイト、ｍＲＮＡを安定化する配列、イントロン、ポリアデ
ニル化シグナル、及び追加のアミノ酸をコードする別のコード配列が含まれるが
、これらに限定されない。例えば、融合ポリペプチドの精製を容易にすべくマー
カー配列を含めることができる。本発明のポリヌクレオチドは、構造遺伝子及び
遺伝子発現をコントロールする本質的に関連する配列からなるポリヌクレオチド
をも含む。
【００１６】 本発明は、式： Ｘ−（Ｒ１）ｎ−（Ｒ２）−（Ｒ３）ｎ−Ｙ （式中、５’末端のＸは水素であり、３’末端のＹは水素または金属であり、Ｒ １ 及びＲ３は任意の核酸残基であり、ｎは１〜３，０００、好ましくは１〜１，
０００の整数であり、Ｒ２は本発明の核酸配列、特に配列表に記載の群から選択
される核酸配列、好ましくは配列番号１、３、５、７、９、１０、１２、１４、
１６、１８、２０、２２及び２２６〜２３３である） を有するポリヌクレオチドをも含む。式中、Ｒ２はその５’末端残基が左側でＲ １ に結合し、その３’末端残基が右側でＲ３に結合するように配向している。Ｒ
が１つ以上存在する場合、いずれかのＲ基で示される核酸残基のストレッチはヘ
テロポリマーであってもホモポリマーであってもよいが、好ましくはヘテロポリ
マーである。
０００の整数であり、Ｒ２は本発明の核酸配列、特に配列表に記載の群から選択
される核酸配列、好ましくは配列番号１、３、５、７、９、１０、１２、１４、
１６、１８、２０、２２及び２２６〜２３３である） を有するポリヌクレオチドをも含む。式中、Ｒ２はその５’末端残基が左側でＲ １ に結合し、その３’末端残基が右側でＲ３に結合するように配向している。Ｒ
が１つ以上存在する場合、いずれかのＲ基で示される核酸残基のストレッチはヘ
テロポリマーであってもホモポリマーであってもよいが、好ましくはヘテロポリ
マーである。
【００１７】 本発明は、本発明のポリペプチドの変異体をコードする本明細書に記載のポリ
ヌクレオチドの変異体にも関する。本発明のポリヌクレオチドの断片である変異
体は本発明の完全長ポリヌクレオチドを合成するために使用することができる。
好ましくは、本発明のポリペプチド配列の５〜１０、１〜５、１〜３、２、１ま
たは０個のアミノ酸が任意の組合せで置換、付加または欠失されているポリヌク
レオチドコードポリペプチド変異体である。ポリヌクレオチドまたはポリペプチ
ドの特性または活性に影響を与えないようにサイレントである置換、付加及び欠
失が特に好ましい。
ヌクレオチドの変異体にも関する。本発明のポリヌクレオチドの断片である変異
体は本発明の完全長ポリヌクレオチドを合成するために使用することができる。
好ましくは、本発明のポリペプチド配列の５〜１０、１〜５、１〜３、２、１ま
たは０個のアミノ酸が任意の組合せで置換、付加または欠失されているポリヌク
レオチドコードポリペプチド変異体である。ポリヌクレオチドまたはポリペプチ
ドの特性または活性に影響を与えないようにサイレントである置換、付加及び欠
失が特に好ましい。
【００１８】 アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は天然源から入手し
得るか、または部分的または完全に人工的に合成され得る。前記ヌクレオチド配
列は天然源に内在するアシルトランスフェラーゼに直接対応するか、または突然
変異、短縮、延長等の処理を受けた配列のような修飾アミノ酸配列を含み得る。
アシルトランスフェラーゼは各種方法により得ることができる。その方法には、
タンパク質抽出物の部分的または均質精製、タンパク質モデリング、核酸プロー
ブ、抗体作成及び配列比較が含まれるが、これらに限定されない。典型的には、
アシルトランスフェラーゼは完全にまたは部分的に天然源から誘導される。天然
源には、細菌、酵母、（藻類を含めた）植物等を含めた原核生物及び真核生物源
が含まれるが、これらに限定されない。
得るか、または部分的または完全に人工的に合成され得る。前記ヌクレオチド配
列は天然源に内在するアシルトランスフェラーゼに直接対応するか、または突然
変異、短縮、延長等の処理を受けた配列のような修飾アミノ酸配列を含み得る。
アシルトランスフェラーゼは各種方法により得ることができる。その方法には、
タンパク質抽出物の部分的または均質精製、タンパク質モデリング、核酸プロー
ブ、抗体作成及び配列比較が含まれるが、これらに限定されない。典型的には、
アシルトランスフェラーゼは完全にまたは部分的に天然源から誘導される。天然
源には、細菌、酵母、（藻類を含めた）植物等を含めた原核生物及び真核生物源
が含まれるが、これらに限定されない。
【００１９】 真核生物源から得られ得るもしくは得られるアシルトランスフェラーゼ、植物
から得られ得るアシルトランスフェラーゼ、またはこれらの配列を用いて得られ
得るアシルトランスフェラーゼが特に興味深い。「得られ得る」は、本発明の生
物学的に活性なタンパク質を提供すべく本明細書に記載の配列と十分に類似の配
列を有するアシルトランスフェラーゼを指す。
から得られ得るアシルトランスフェラーゼ、またはこれらの配列を用いて得られ
得るアシルトランスフェラーゼが特に興味深い。「得られ得る」は、本発明の生
物学的に活性なタンパク質を提供すべく本明細書に記載の配列と十分に類似の配
列を有するアシルトランスフェラーゼを指す。
【００２０】 本発明の更に好ましい実施態様は、全長にわたり本発明のポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチドと少なくとも５０％、６０％または７０％同一のポリヌ
クレオチド及び前記ポリペプチドに相補的なポリヌクレオチドである。その全長
にわたり本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと少なくとも８０
％同一の領域を含むポリヌクレオチド及びそれに相補的なポリヌクレオチドがよ
り好ましい。これに関連して、その全長にわたり少なくとも９０％同一のポリヌ
クレオチドが特に好ましく、少なくとも９５％同一のポリヌクレオチドが更に好
ましい。更に、少なくとも９７％の同一性を有するポリヌクレオチドが非常に好
ましく、少なくとも９８％〜９９％の同一性を有するポリヌクレオチドが特に非
常に好ましく、少なくとも９９％の同一性を有するポリヌクレオチドが最も好ま
しい。
ドするポリヌクレオチドと少なくとも５０％、６０％または７０％同一のポリヌ
クレオチド及び前記ポリペプチドに相補的なポリヌクレオチドである。その全長
にわたり本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと少なくとも８０
％同一の領域を含むポリヌクレオチド及びそれに相補的なポリヌクレオチドがよ
り好ましい。これに関連して、その全長にわたり少なくとも９０％同一のポリヌ
クレオチドが特に好ましく、少なくとも９５％同一のポリヌクレオチドが更に好
ましい。更に、少なくとも９７％の同一性を有するポリヌクレオチドが非常に好
ましく、少なくとも９８％〜９９％の同一性を有するポリヌクレオチドが特に非
常に好ましく、少なくとも９９％の同一性を有するポリヌクレオチドが最も好ま
しい。
【００２１】 好ましい実施態様は、配列表に記載のポリヌクレオチドによりコードされる成
熟ポリペプチドと実質的に同一の生物学的機能または活性を保持するポリペプチ
ドをコードするポリヌクレオチドである。
熟ポリペプチドと実質的に同一の生物学的機能または活性を保持するポリペプチ
ドをコードするポリヌクレオチドである。
【００２２】 本発明は更に、上記配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。特
に、本発明は上記ポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブ
リダイズするポリヌクレオチドに関する。本明細書中、用語「ストリンジェント
な条件」及び「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は配列間の同
一性が少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９７％であるときにハイブリダ
イゼーションが通常起こることを意味する。ストリンジェントなハイブリダイゼ
ーション条件の例は、５０％ホルムアルデヒド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ、１５ｍＭ クエン酸トリナトリウム）、５０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐ
Ｈ７．６）、５×デンハート溶液、１０％硫酸デキストラン及び２０μｇ／ｍｌ
の変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中で４２℃で一晩インキュベート後ハイブ
リダイゼーション支持体を約６５℃で０．１×ＳＳＣ中で洗浄することを含む。
他のハイブリダイゼーション及び洗浄条件は公知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，
「分子クローニング：実験マニュアル(Molecular Cloning: A Laoratory Manual
)」、第２版、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９８９年）出版、
特に１１章に例示されている。
に、本発明は上記ポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブ
リダイズするポリヌクレオチドに関する。本明細書中、用語「ストリンジェント
な条件」及び「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は配列間の同
一性が少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９７％であるときにハイブリダ
イゼーションが通常起こることを意味する。ストリンジェントなハイブリダイゼ
ーション条件の例は、５０％ホルムアルデヒド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ、１５ｍＭ クエン酸トリナトリウム）、５０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐ
Ｈ７．６）、５×デンハート溶液、１０％硫酸デキストラン及び２０μｇ／ｍｌ
の変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中で４２℃で一晩インキュベート後ハイブ
リダイゼーション支持体を約６５℃で０．１×ＳＳＣ中で洗浄することを含む。
他のハイブリダイゼーション及び洗浄条件は公知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，
「分子クローニング：実験マニュアル(Molecular Cloning: A Laoratory Manual
)」、第２版、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９８９年）出版、
特に１１章に例示されている。
【００２３】 本発明はまた、配列表に記載のポリヌクレオチド配列に対する完全遺伝子を含
む適当なライブラリーを前記ポリヌクレオチド配列またはその断片の配列を有す
るプローブを用いてストリージェントなハイブリダイゼーション条件下でスクリ
ーニングし、前記ポリヌクレオチド配列を単離することにより得られ得るポリヌ
クレオチド配列から本質的に構成されるポリヌクレオチドを提供する。前記ポリ
ヌクレオチドを得るために有用な断片には、例えば本明細書に記載されているプ
ローブ及びプライマーが含まれる。
む適当なライブラリーを前記ポリヌクレオチド配列またはその断片の配列を有す
るプローブを用いてストリージェントなハイブリダイゼーション条件下でスクリ
ーニングし、前記ポリヌクレオチド配列を単離することにより得られ得るポリヌ
クレオチド配列から本質的に構成されるポリヌクレオチドを提供する。前記ポリ
ヌクレオチドを得るために有用な断片には、例えば本明細書に記載されているプ
ローブ及びプライマーが含まれる。
【００２４】 本発明のポリヌクレオチドアッセイに関して本明細書で検討したように、例え
ば本発明のポリヌクレオチドは、ポリペプチドをコードする完全長ｃＤＮＡまた
はゲノムクローンを単離するために、また配列表に記載されているポリヌクレオ
チドに対して高い配列類似性を有する他の遺伝子のｃＤＮＡまたはゲノムクロー
ンを単離するためにＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡに対するハイブリダイ
ゼーションプローブとして使用することができる。前記プローブは通常少なくと
も１５塩基を含む。好ましくは、前記プローブは少なくとも３０塩基を有し、少
なくとも５０塩基を有し得る。特に好ましいプローブは３０〜５０塩基を有する
。
ば本発明のポリヌクレオチドは、ポリペプチドをコードする完全長ｃＤＮＡまた
はゲノムクローンを単離するために、また配列表に記載されているポリヌクレオ
チドに対して高い配列類似性を有する他の遺伝子のｃＤＮＡまたはゲノムクロー
ンを単離するためにＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡに対するハイブリダイ
ゼーションプローブとして使用することができる。前記プローブは通常少なくと
も１５塩基を含む。好ましくは、前記プローブは少なくとも３０塩基を有し、少
なくとも５０塩基を有し得る。特に好ましいプローブは３０〜５０塩基を有する
。
【００２５】 配列表に記載されているポリヌクレオチド配列を含むかまたは該配列により構
成される各遺伝子のコード領域は、オリゴヌクレオチドプローブを合成するため
に配列表に記載のＤＮＡ配列を用いてスクリーニングすることにより単離され得
る。その後、本発明の遺伝子の配列に相補的な配列を有する標識オリゴヌクレオ
チドを、プローブにハイブリダイズするライブラリーのメンバーを同定すべくｃ
ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡのライブラリーをスクリーニングするため
に使用する。例えば、ポリペプチドのＮ−末端配列に相当する合成オリゴヌクレ
オチドを作成する。こうして作成した部分配列は、その後当該細胞ソースから作
成した遺伝子ライブラリーからアシルトランスフェラーゼクローンを得るために
プローブとして使用することができる。或いは、低縮重を有するオリゴヌクレオ
チドを部分ペプチドから作成するときには、プローブを遺伝子配列について遺伝
子ライブラリーをスクリーニングするために直接使用することができる。特に、
ファージベクターにおいてｃＤＮＡライブラリースクリーニングすることはバッ
クグラウンドハイブリダイゼーションが低レベルであるために前記方法において
有用である。
成される各遺伝子のコード領域は、オリゴヌクレオチドプローブを合成するため
に配列表に記載のＤＮＡ配列を用いてスクリーニングすることにより単離され得
る。その後、本発明の遺伝子の配列に相補的な配列を有する標識オリゴヌクレオ
チドを、プローブにハイブリダイズするライブラリーのメンバーを同定すべくｃ
ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡのライブラリーをスクリーニングするため
に使用する。例えば、ポリペプチドのＮ−末端配列に相当する合成オリゴヌクレ
オチドを作成する。こうして作成した部分配列は、その後当該細胞ソースから作
成した遺伝子ライブラリーからアシルトランスフェラーゼクローンを得るために
プローブとして使用することができる。或いは、低縮重を有するオリゴヌクレオ
チドを部分ペプチドから作成するときには、プローブを遺伝子配列について遺伝
子ライブラリーをスクリーニングするために直接使用することができる。特に、
ファージベクターにおいてｃＤＮＡライブラリースクリーニングすることはバッ
クグラウンドハイブリダイゼーションが低レベルであるために前記方法において
有用である。
【００２６】 典型的には、核酸プローブを使用して得ることができる配列は標的アシルトラ
ンスフェラーゼ配列とプローブとして使用したコード配列の間で６０〜７０％の
配列同一性を示す。しかしながら、５０〜６０％程の低い配列同一性を有する長
い配列も得られる。核酸プローブは核酸配列の長い断片であってもよく、またよ
り短いオリゴヌクレオチドプローブであってもよい。より長い（約１００ｂｐ以
上）核酸断片をプローブとして使用すると、低ストリンジェントでスクリーニン
グして、プローブとして使用した配列から２０〜５０％の偏差（すなわち、５０
〜８０％の配列相同性）を有する標的サンプルからの配列を得ることができる。
オリゴヌクレオチドプローブはアシルトランスフェラーゼ酵素をコードする全核
酸配列よりもかなり短くてもよいが、少なくとも約１０個のヌクレオチド、好ま
しくは少なくとも約１５個のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約２０個
のヌクレオチドでなければならない。長い領域とは反対により短い領域を使用す
るときには高度の配列同一性が望ましい。従って、他の関連遺伝子を検出し、回
収するためのオリゴヌクレオチドプローブを設計するためには高度に保存された
アミノ酸配列の領域を同定することが望ましい。より短いプローブはしばしば、
高度に保存された配列が同定され得るときにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の
ために特に有用である（Ｇｏｕｌｄら，ＰＮＡＳ ＵＳＡ，８６：１９３４−１
９３８（１９８９）参照）。
ンスフェラーゼ配列とプローブとして使用したコード配列の間で６０〜７０％の
配列同一性を示す。しかしながら、５０〜６０％程の低い配列同一性を有する長
い配列も得られる。核酸プローブは核酸配列の長い断片であってもよく、またよ
り短いオリゴヌクレオチドプローブであってもよい。より長い（約１００ｂｐ以
上）核酸断片をプローブとして使用すると、低ストリンジェントでスクリーニン
グして、プローブとして使用した配列から２０〜５０％の偏差（すなわち、５０
〜８０％の配列相同性）を有する標的サンプルからの配列を得ることができる。
オリゴヌクレオチドプローブはアシルトランスフェラーゼ酵素をコードする全核
酸配列よりもかなり短くてもよいが、少なくとも約１０個のヌクレオチド、好ま
しくは少なくとも約１５個のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約２０個
のヌクレオチドでなければならない。長い領域とは反対により短い領域を使用す
るときには高度の配列同一性が望ましい。従って、他の関連遺伝子を検出し、回
収するためのオリゴヌクレオチドプローブを設計するためには高度に保存された
アミノ酸配列の領域を同定することが望ましい。より短いプローブはしばしば、
高度に保存された配列が同定され得るときにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の
ために特に有用である（Ｇｏｕｌｄら，ＰＮＡＳ ＵＳＡ，８６：１９３４−１
９３８（１９８９）参照）。
【００２７】 多くの場合、ポリペプチドをコードする領域がｃＤＮＡの５’末端に対して短
縮されている点で単離ｃＤＮＡ配列が不完全であることは当業者には自明である
。これは、第１鎖ｃＤＮＡ合成の過程で使用される低「プロセシビティー」（酵
素が重合反応中にテンプレートに結合して残り得る能力の尺度）を有する酵素で
ある逆転写酵素の結果である。
縮されている点で単離ｃＤＮＡ配列が不完全であることは当業者には自明である
。これは、第１鎖ｃＤＮＡ合成の過程で使用される低「プロセシビティー」（酵
素が重合反応中にテンプレートに結合して残り得る能力の尺度）を有する酵素で
ある逆転写酵素の結果である。
【００２８】 完全長ｃＤＮＡを得るかまたは短ｃＤＮＡを延長させる方法としては幾つかの
方法が利用でき、公知である。例えばｃＤＮＡ末端の迅速増幅方法に基づく方法
が挙げられる（例えば、Ｆｒｏｂｍａｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ，８５：８９９８−９００２（１９８８）参照）。例えばＭａｒａ
ｔｈｏｎ（登録商標）テクノロジー（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｉｅｓ， Ｉｎｃ．）に例示されている方法の最近の改変は完全長ｃＤＮＡ配列
を得るためにかなり簡素化されている。
方法が利用でき、公知である。例えばｃＤＮＡ末端の迅速増幅方法に基づく方法
が挙げられる（例えば、Ｆｒｏｂｍａｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ，８５：８９９８−９００２（１９８８）参照）。例えばＭａｒａ
ｔｈｏｎ（登録商標）テクノロジー（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｉｅｓ， Ｉｎｃ．）に例示されている方法の最近の改変は完全長ｃＤＮＡ配列
を得るためにかなり簡素化されている。
【００２９】 本発明の別の態様は、単離アシルトランスフェラーゼポリペプチドに関する。
前記ポリペプチドには、配列表に記載されている単離ポリペプチド、及びポリペ
プチド及びその断片、特にアシルトランスフェラーゼ活性を示す前記ポリペプチ
ド及び配列表に記載されている配列の群から選択されるポリペプチドに対して少
なくとも５０％、６０％または７０％の同一性、好ましくは少なくとも８０％の
同一性、より好ましくは少なくとも９０％の同一性、最も好ましくは少なくとも
９５％の同一性を有するポリペプチドが含まれ、また好ましくは少なくとも３０
個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも５０個のアミノ酸を含む前記ポリペプ
チドの一部も含まれる。
前記ポリペプチドには、配列表に記載されている単離ポリペプチド、及びポリペ
プチド及びその断片、特にアシルトランスフェラーゼ活性を示す前記ポリペプチ
ド及び配列表に記載されている配列の群から選択されるポリペプチドに対して少
なくとも５０％、６０％または７０％の同一性、好ましくは少なくとも８０％の
同一性、より好ましくは少なくとも９０％の同一性、最も好ましくは少なくとも
９５％の同一性を有するポリペプチドが含まれ、また好ましくは少なくとも３０
個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも５０個のアミノ酸を含む前記ポリペプ
チドの一部も含まれる。
【００３０】 「同一性」は、当業界で理解されているように、配列を比較して決定される２
つ以上のポリペプチド配列間または２つ以上のポリヌクレオチド配列間の関係で
ある。当業界で、「同一性」は配列のストリング間の整合により測定されるポリ
ペプチドまたはポリヌクレオチド配列間の配列の相関度をも意味する。「同一性
」は公知の方法により容易に求められ得るが、その方法にはＬｅｓｋ，Ａ．Ｍ．
編，Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ニュ
ーヨークに所在のＯｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８８
年）発行、Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編，Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍ
ａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，ニューヨークに所在の
Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９３年）発行、Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．
及びＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編，Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｉ部，ニュージャージーに所在のＨｕｍａｎａ
Ｐｒｅｓｓ（１９９４年）発行、ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ｓｅｑｕｅｎ
ｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａ
ｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９８７年）発行、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．及びＤｃ
ｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ，
ニューヨークに所在のＳｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ（１９９１年）発行、及び
Ｃａｒｉｌｌｏ，Ｈ．及びＬｉｐｍａｎ，Ｄ．，ＳＩＡＭ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍ
ａｔｈ．，４８：１０７３（１９８８）に記載されている方法が含まれるが、こ
れらに限定されない。同定性の測定方法は、試験すべき配列間の最大の整合を与
えるように設計される。更に、同定性の測定方法は公に入手可能なプログラムで
分類される。２つの配列間の同一性を測定するために使用され得るコンピュータ
ープログラムには、ＧＣＧ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ
ｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１２（１）：３８７（１９８４））、１組５つのＢ
ＬＡＳＴプログラム［このうち、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ及びＴＢＬＡＳＴ
Ｘの３つのプログラムはヌクレオチド配列照会用に設計されており、ＢＬＡＳＴ
Ｐ及びＴＢＬＡＳＴＮの２つのプログラムはタンパク質配列照会用に設計されて
いる］（Ｃｏｕｌｓｏｎ，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，
１２：７６−８０（１９９４）、Ｂｉｒｒｅｎら，Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓ
ｉｓ，１：５４３−５５９（１９９７））が含まれるが、これらに限定されない
。ＢＬＡＳＴ ＸプログラムはＮＣＢＩ及び他のソースから公に入手可能である
（ＢＬＡＳＴマニュアル，Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．ら，ＮＣＢＩ ＮＬＭ ＮＩ
Ｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ ２０８９４、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．ら，Ｊ．Ｍ
ｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０（１９９０））。公知のＳｍｉｔｈ
Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムも同定性を調べるために使用され得る。
つ以上のポリペプチド配列間または２つ以上のポリヌクレオチド配列間の関係で
ある。当業界で、「同一性」は配列のストリング間の整合により測定されるポリ
ペプチドまたはポリヌクレオチド配列間の配列の相関度をも意味する。「同一性
」は公知の方法により容易に求められ得るが、その方法にはＬｅｓｋ，Ａ．Ｍ．
編，Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ニュ
ーヨークに所在のＯｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８８
年）発行、Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編，Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍ
ａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，ニューヨークに所在の
Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９３年）発行、Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．
及びＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編，Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｉ部，ニュージャージーに所在のＨｕｍａｎａ
Ｐｒｅｓｓ（１９９４年）発行、ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ｓｅｑｕｅｎ
ｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａ
ｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９８７年）発行、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．及びＤｃ
ｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ，
ニューヨークに所在のＳｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ（１９９１年）発行、及び
Ｃａｒｉｌｌｏ，Ｈ．及びＬｉｐｍａｎ，Ｄ．，ＳＩＡＭ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍ
ａｔｈ．，４８：１０７３（１９８８）に記載されている方法が含まれるが、こ
れらに限定されない。同定性の測定方法は、試験すべき配列間の最大の整合を与
えるように設計される。更に、同定性の測定方法は公に入手可能なプログラムで
分類される。２つの配列間の同一性を測定するために使用され得るコンピュータ
ープログラムには、ＧＣＧ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ
ｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１２（１）：３８７（１９８４））、１組５つのＢ
ＬＡＳＴプログラム［このうち、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ及びＴＢＬＡＳＴ
Ｘの３つのプログラムはヌクレオチド配列照会用に設計されており、ＢＬＡＳＴ
Ｐ及びＴＢＬＡＳＴＮの２つのプログラムはタンパク質配列照会用に設計されて
いる］（Ｃｏｕｌｓｏｎ，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，
１２：７６−８０（１９９４）、Ｂｉｒｒｅｎら，Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓ
ｉｓ，１：５４３−５５９（１９９７））が含まれるが、これらに限定されない
。ＢＬＡＳＴ ＸプログラムはＮＣＢＩ及び他のソースから公に入手可能である
（ＢＬＡＳＴマニュアル，Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．ら，ＮＣＢＩ ＮＬＭ ＮＩ
Ｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ ２０８９４、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．ら，Ｊ．Ｍ
ｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０（１９９０））。公知のＳｍｉｔｈ
Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムも同定性を調べるために使用され得る。
【００３１】 ポリペプチド配列の比較用パラメータは、通常 アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．
，４８：４４３−４５３（１９７０）、 比較マトリックス：Ｈｅｎｔｉｋｏｆｆ及びＨｅｎｔｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：１０９１５−１０９１９（１９９２
）からのＢＬＯＳＳＵＭ６２、 ギャップペナルティー：１２ ギャップ長さペナルティー：４ を含む。
，４８：４４３−４５３（１９７０）、 比較マトリックス：Ｈｅｎｔｉｋｏｆｆ及びＨｅｎｔｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：１０９１５−１０９１９（１９９２
）からのＢＬＯＳＳＵＭ６２、 ギャップペナルティー：１２ ギャップ長さペナルティー：４ を含む。
【００３２】 これらのパラメータと共に使用され得るプログラムは、ウィスコンシン州マジ
ソンに所在のＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐから「ギャツプ
」プログラムとして市販されている。末端ギャップに対してペナルティーを持た
ない上記パラメータはペプチド比較用のデフォルトパラメータである。
ソンに所在のＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐから「ギャツプ
」プログラムとして市販されている。末端ギャップに対してペナルティーを持た
ない上記パラメータはペプチド比較用のデフォルトパラメータである。
【００３３】 ポリヌクレオチド配列の比較のためのパラメータは、 アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．
，４８：４４３−４５３（１９７０）、 比較マトリックス：整合＝＋１０，非整合＝０、 ギャップペナルティー：５０ ギャップ長さペナルティー：３ を含む。
，４８：４４３−４５３（１９７０）、 比較マトリックス：整合＝＋１０，非整合＝０、 ギャップペナルティー：５０ ギャップ長さペナルティー：３ を含む。
【００３４】 上記パラメータと共に使用され得るプログラムは、ウィスコンシン州マジソン
に所在のＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐから「ギャツプ」プ
ログラムとして市販されている。上記パラメータは核酸比較のためのデフォルト
パラメータである。
に所在のＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐから「ギャツプ」プ
ログラムとして市販されている。上記パラメータは核酸比較のためのデフォルト
パラメータである。
【００３５】 本発明は、式： Ｘ−（Ｒ１）ｎ−（Ｒ２）−（Ｒ３）ｎ−Ｙ （式中、アミノ末端のＸは水素であり、カルボキシル末端のＹは水素または金属
であり、Ｒ１及びＲ３は任意のアミノ酸残基であり、ｎは１〜１，０００の整数
であり、Ｒ２は本発明のアミノ酸配列、特に配列表に記載の群から選択されるア
ミノ酸配列、好ましくは配列番号２、４、６、８、１１、１３、１５、１７、１
９、２１、２３及び２１８〜２２５である） を有するポリペプチドをも含む。式中、Ｒ２はそのアミノ末端残基が左側でＲ１ に結合し、そのカルボキシル末端残基が右側でＲ３に結合するように配向してい
る。Ｒが１つ以上存在する場合、いずれかのＲ基で示されるアミノ酸残基のスト
レッチはヘテロポリマーであってもホモポリマーであってもよいが、好ましくは
ヘテロポリマーである。
であり、Ｒ１及びＲ３は任意のアミノ酸残基であり、ｎは１〜１，０００の整数
であり、Ｒ２は本発明のアミノ酸配列、特に配列表に記載の群から選択されるア
ミノ酸配列、好ましくは配列番号２、４、６、８、１１、１３、１５、１７、１
９、２１、２３及び２１８〜２２５である） を有するポリペプチドをも含む。式中、Ｒ２はそのアミノ末端残基が左側でＲ１ に結合し、そのカルボキシル末端残基が右側でＲ３に結合するように配向してい
る。Ｒが１つ以上存在する場合、いずれかのＲ基で示されるアミノ酸残基のスト
レッチはヘテロポリマーであってもホモポリマーであってもよいが、好ましくは
ヘテロポリマーである。
【００３６】 本発明のポリペプチドには、配列番号１、３、５、７、９、１０、１２、１４
、１６、１８、２０、２２及び２２６〜２２３に含まれる配列の群から選択され
る配列を含むポリヌクレオタドによりコードされる単離ポリペプチドが含まれる
。
、１６、１８、２０、２２及び２２６〜２２３に含まれる配列の群から選択され
る配列を含むポリヌクレオタドによりコードされる単離ポリペプチドが含まれる
。
【００３７】 本発明のポリペプチドは成熟タンパク質であり得、または融合タンパク質の一
部であり得る。
部であり得る。
【００３８】 ポリペプチドの断片及び変異体も本発明の一部と見做され得る。断片は、上記
したポリペプチドのアミノ酸配列の全部ではないが一部と全く同一のアミノ酸配
列を有する変異ポリペプチドである。断片は「独立(free-standing)」している
か、または断片が一部または一領域を、好ましくは１つの連続領域として形成す
る大きなポリペプチド内に含まれ得る。好ましい断片は、本発明のポリペプチド
の活性をもたらす断片である生物学的に活性な断片であり、この中には同等、向
上または低下した活性を有するものも含まれる。また、動物、特にヒトにおいて
抗原性または免疫原性である断片も含まれる。
したポリペプチドのアミノ酸配列の全部ではないが一部と全く同一のアミノ酸配
列を有する変異ポリペプチドである。断片は「独立(free-standing)」している
か、または断片が一部または一領域を、好ましくは１つの連続領域として形成す
る大きなポリペプチド内に含まれ得る。好ましい断片は、本発明のポリペプチド
の活性をもたらす断片である生物学的に活性な断片であり、この中には同等、向
上または低下した活性を有するものも含まれる。また、動物、特にヒトにおいて
抗原性または免疫原性である断片も含まれる。
【００３９】 ポリペプチドの変異体には、配列表に記載されている配列とは保存アミノ酸の
置換（残基の同様の特性を有する別のものによる置換）の点で異なるポリペプチ
ドが含まれる。通常、置換は、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ及びＩｌｅの中、Ｓｅｒ
とＴｈｒの間、ＡｓｐとＧｌｕの間、ＡｓｎとＧｌｎの間、ＬｙｓとＡｒｇの間
、またはＰｈｅとＴｙｒの間である。５〜１０、１〜５、１〜３または１個のア
ミノ酸が任意の組合せで置換、欠失または付加されている変異体が特に好ましい
。
置換（残基の同様の特性を有する別のものによる置換）の点で異なるポリペプチ
ドが含まれる。通常、置換は、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ及びＩｌｅの中、Ｓｅｒ
とＴｈｒの間、ＡｓｐとＧｌｕの間、ＡｓｎとＧｌｎの間、ＬｙｓとＡｒｇの間
、またはＰｈｅとＴｙｒの間である。５〜１０、１〜５、１〜３または１個のア
ミノ酸が任意の組合せで置換、欠失または付加されている変異体が特に好ましい
。
【００４０】 本発明のポリペプチドの断片である変異体は、ペプチド合成により対応する完
全長ポリペプチドを作成するために使用され得る。従って、これらの変異体は本
発明の完全長ポリペプチドを作成するための中間体として使用され得る。
全長ポリペプチドを作成するために使用され得る。従って、これらの変異体は本
発明の完全長ポリペプチドを作成するための中間体として使用され得る。
【００４１】 本発明のポリヌクレオチド及びポリペプチドは、例えば本明細書に詳記されて
いる各種宿主細胞の形質転換において使用され得る。
いる各種宿主細胞の形質転換において使用され得る。
【００４２】 また、本発明は、成熟タンパク質と追加のアミノ−またはカルボキシル末端ア
ミノ酸、または（例えば、タンパク質の成熟形態が１つ以上のポリペプチド鎖を
有する場合には）該成熟ポリペプチド内にアミノ酸を含むポリペプチドをコード
するポリヌクレオチドを提供する。前記配列は、例えば前駆体から成熟形態への
タンパク質のプロセッシングの際に働き、タンパク質を輸送したり、タンパク質
の半減期を短縮もしくは延長したり、またはアッセイまたは産生におけるタンパ
ク質の操作を容易にする。成熟タンパク質から追加アミノ酸を除去するために細
胞酵素を使用できることが考えられる。
ミノ酸、または（例えば、タンパク質の成熟形態が１つ以上のポリペプチド鎖を
有する場合には）該成熟ポリペプチド内にアミノ酸を含むポリペプチドをコード
するポリヌクレオチドを提供する。前記配列は、例えば前駆体から成熟形態への
タンパク質のプロセッシングの際に働き、タンパク質を輸送したり、タンパク質
の半減期を短縮もしくは延長したり、またはアッセイまたは産生におけるタンパ
ク質の操作を容易にする。成熟タンパク質から追加アミノ酸を除去するために細
胞酵素を使用できることが考えられる。
【００４３】 １つ以上のプロ配列に融合したポリペプチドの成熟形態を有する前駆体タンパ
ク質はポリペプチドの不活性形態であり得る。プロ配列を除去すると不活性前駆
体は通常活性化される。プロ配列の一部または全部が活性化前に除去され得る。
前駆体タンパク質は通常プロタンパク質と呼ばれる。
ク質はポリペプチドの不活性形態であり得る。プロ配列を除去すると不活性前駆
体は通常活性化される。プロ配列の一部または全部が活性化前に除去され得る。
前駆体タンパク質は通常プロタンパク質と呼ばれる。
【００４４】 ポリヌクレオチド及びポリペプチド配列は、本発明の配列に相同の別の配列を
同定するためにも使用され得る。最も好ましく便利な方法は、フロッピー（登録 商標）ディスク、ＣＤ ＲＯＭ、ハードディスクドライブ、外部ディスクドライ ブやＤＶＤのようなコンピューターの読取り可能メディアに配列を保存し、その 後保存した配列を使用して公知の検索手段で配列データベースを検索することで ある。公知のデータベースの例には、日本のＤＮＡデータベース（ＤＤＢＪ）（ ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ／ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／）、Ｇｅｎｅｂａｎｋ （ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｊｍ．ｎｉｂ．ｇｏｖ／ｗｅｂ／Ｇｅｎ ｂａｎｋ／（ｎdｅｘ．ｈｔｍｌ）、及びＥｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａ ｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅ ｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａｂａｓｅ（ＥＭＢＬ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ ．ａｃ．ｕｋ／ｅｂｉ ｄｏｅｓ／ｅｍｂｌ．ｄｂ．ｈｔｍｌ）が含まれる。当 業者は多種多様の検索アルゴリズムを利用することができ、その１例はＢＬＡＳ Ｔプログラムと呼ばれる１組のプログラムである。ＢＬＡＳＴには５つの実行プ ログラムがあり、すなわちヌクレオチド配列照会用に設計されたＢＬＡＳＴＮ、 ＢＬＡＳＴＸ及びＴＢＬＡＳＴＸの３つのプログラム及びタンパク質配列照会用 に設計されたＢＬＡＳＴＰ及びＴＢＬＡＳＴＮの２つのプログラムである（Ｃｏ ｕｌｓｏｎ，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１２：７６− ８０（１９９４）、Ｂｉｒｒｅｎら，Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ，１：５ ４３−５５９（１９９７））。同定した配列を分析するための追加のプログラム 、例えば配列アラインメントプログラム、より離れて関連する配列を同定するた めのプログラム等は当業界で利用可能であり、当業者に公知である。
同定するためにも使用され得る。最も好ましく便利な方法は、フロッピー（登録 商標）ディスク、ＣＤ ＲＯＭ、ハードディスクドライブ、外部ディスクドライ ブやＤＶＤのようなコンピューターの読取り可能メディアに配列を保存し、その 後保存した配列を使用して公知の検索手段で配列データベースを検索することで ある。公知のデータベースの例には、日本のＤＮＡデータベース（ＤＤＢＪ）（ ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ／ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／）、Ｇｅｎｅｂａｎｋ （ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｊｍ．ｎｉｂ．ｇｏｖ／ｗｅｂ／Ｇｅｎ ｂａｎｋ／（ｎdｅｘ．ｈｔｍｌ）、及びＥｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａ ｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅ ｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａｂａｓｅ（ＥＭＢＬ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ ．ａｃ．ｕｋ／ｅｂｉ ｄｏｅｓ／ｅｍｂｌ．ｄｂ．ｈｔｍｌ）が含まれる。当 業者は多種多様の検索アルゴリズムを利用することができ、その１例はＢＬＡＳ Ｔプログラムと呼ばれる１組のプログラムである。ＢＬＡＳＴには５つの実行プ ログラムがあり、すなわちヌクレオチド配列照会用に設計されたＢＬＡＳＴＮ、 ＢＬＡＳＴＸ及びＴＢＬＡＳＴＸの３つのプログラム及びタンパク質配列照会用 に設計されたＢＬＡＳＴＰ及びＴＢＬＡＳＴＮの２つのプログラムである（Ｃｏ ｕｌｓｏｎ，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１２：７６− ８０（１９９４）、Ｂｉｒｒｅｎら，Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ，１：５ ４３−５５９（１９９７））。同定した配列を分析するための追加のプログラム 、例えば配列アラインメントプログラム、より離れて関連する配列を同定するた めのプログラム等は当業界で利用可能であり、当業者に公知である。
【００４５】 植物構築物及び使用方法 本発明の重要な特徴は、宿主細胞中で本発明のアシルトランスフェラーゼ配列
の転写を指令するかまたは転写と翻訳（発現）とを指令するヌクレオチド配列ま
たはポリヌクレオチドが組換え構築物中で使用されることである。
の転写を指令するかまたは転写と翻訳（発現）とを指令するヌクレオチド配列ま
たはポリヌクレオチドが組換え構築物中で使用されることである。
【００４６】 特に重要な特徴は、宿主細胞中で本発明のアシルトランスフェラーゼ配列の転
写を指令するかまたは転写と翻訳（発現）とを指令するヌクレオチド配列または
ポリヌクレオチドが組換えＤＮＡ構築物中で使用されることである。発現構築物
は一般に、本発明のアシルトランスフェラーゼをコードする核酸配列に作動的に
連結された宿主細胞中で機能性のプロモーターと宿主細胞中で機能性の転写終結
領域とを含む。
写を指令するかまたは転写と翻訳（発現）とを指令するヌクレオチド配列または
ポリヌクレオチドが組換えＤＮＡ構築物中で使用されることである。発現構築物
は一般に、本発明のアシルトランスフェラーゼをコードする核酸配列に作動的に
連結された宿主細胞中で機能性のプロモーターと宿主細胞中で機能性の転写終結
領域とを含む。
【００４７】 “宿主細胞”なる用語は、ベクターを含有しており且つ発現構築物の複製、及
び／または転写、または、転写と翻訳（発現）を支援する細胞を意味する。本発
明で使用される宿主細胞は、大腸菌のような原核細胞でもよく、または、酵母、
植物、昆虫、両生類もしくは哺乳類の細胞のような真核細胞でもよい。好ましく
は宿主細胞が単子葉または双子葉の植物細胞である。
び／または転写、または、転写と翻訳（発現）を支援する細胞を意味する。本発
明で使用される宿主細胞は、大腸菌のような原核細胞でもよく、または、酵母、
植物、昆虫、両生類もしくは哺乳類の細胞のような真核細胞でもよい。好ましく
は宿主細胞が単子葉または双子葉の植物細胞である。
【００４８】 本発明の特に重要な特徴は、宿主植物細胞中でアシルトランスフェラーゼをコ
ードするヌクレオチド配列の転写を指令するかまたは転写と翻訳（発現）とを指
令する構築物を作製するために本発明のポリヌクレオチドを使用することである
。植物発現構築物は一般に、本発明の核酸配列に作動的に連結された植物宿主細
胞中で機能性のプロモーターと宿主植物細胞中で機能性の転写終結領域とを含む
。
ードするヌクレオチド配列の転写を指令するかまたは転写と翻訳（発現）とを指
令する構築物を作製するために本発明のポリヌクレオチドを使用することである
。植物発現構築物は一般に、本発明の核酸配列に作動的に連結された植物宿主細
胞中で機能性のプロモーターと宿主植物細胞中で機能性の転写終結領域とを含む
。
【００４９】 植物細胞中で機能性の多くのプロモーターが存在することは当業者に公知であ
り、文献にも記載されている。プロトプラスト（葉緑体）及びプラスチド特異的
なプロモーター、プロトプラストもしくはプラスチド機能性のプロモーター、及
び、プロトプラストもしくはプラスチド作動性のプロモーターなどでもよい。
り、文献にも記載されている。プロトプラスト（葉緑体）及びプラスチド特異的
なプロモーター、プロトプラストもしくはプラスチド機能性のプロモーター、及
び、プロトプラストもしくはプラスチド作動性のプロモーターなどでもよい。
【００５０】 プロモーターのセットは、大抵の植物器官中で高レベル発現を生じさせるＣａ
ＭＶ３５ＳまたはＦＭＢ３５Ｓプロモーターのような構成的プロモーターである
。ＣａＭＶ３５Ｓ及びＦＭＶ３５Ｓプロモーターを増強または複製した改良形態
が本発明の実施に有用である（Ｏｄｅｌｌら，（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１
３：８１０−８１２；Ｒｏｇｅｒｓ，米国特許第５，３７８，６１９号）。更に
、葉、幹、根、塊茎、種子、果実などの植物の特定組織中で有益なタンパク質の
発現を惹起するのが好ましく、選択されるプロモーターは所望の組織特異性及び
発生特異性を有していなければならない。
ＭＶ３５ＳまたはＦＭＢ３５Ｓプロモーターのような構成的プロモーターである
。ＣａＭＶ３５Ｓ及びＦＭＶ３５Ｓプロモーターを増強または複製した改良形態
が本発明の実施に有用である（Ｏｄｅｌｌら，（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１
３：８１０−８１２；Ｒｏｇｅｒｓ，米国特許第５，３７８，６１９号）。更に
、葉、幹、根、塊茎、種子、果実などの植物の特定組織中で有益なタンパク質の
発現を惹起するのが好ましく、選択されるプロモーターは所望の組織特異性及び
発生特異性を有していなければならない。
【００５１】 特に重要な特徴は、本発明の核酸配列の発現が植物種子組織中で優先的に発現
される転写開始領域から開始されることである。このような種子優先的転写開始
配列の例は、植物貯蔵タンパク質遺伝子をコードする配列に由来の配列、または
、油料種子中の脂肪酸生合成に関与する遺伝子に由来の配列である。このような
プロモーターの例は、ナピン（ｎａｐｉｎ）（Ｋｒｉｄｌら，Ｓｅｅｄ Ｓｃｉ
．Ｒｅｓ．１：２０９：２１９（１９９１））、ファセオリン（ｐｈａｓｅｏｌ
ｉｎ）、ゼイン、ダイズトリプシンインヒビター、ＡＣＰ、ステアロイル−ＡＣ
Ｐデサチュラーゼ、ダイズβ−コングリシニン（ｃｏｎｇｌｙｃｉｎｉｎ）のα
−サブユニット（ｓｏｙ ７ｓ，（Ｃｈｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．８３：８５６０−８５６４（１９８６）））及びオレオシン（ｏｌｅ
ｏｓｉｎ）などの遺伝子に由来の５’調節領域である。
される転写開始領域から開始されることである。このような種子優先的転写開始
配列の例は、植物貯蔵タンパク質遺伝子をコードする配列に由来の配列、または
、油料種子中の脂肪酸生合成に関与する遺伝子に由来の配列である。このような
プロモーターの例は、ナピン（ｎａｐｉｎ）（Ｋｒｉｄｌら，Ｓｅｅｄ Ｓｃｉ
．Ｒｅｓ．１：２０９：２１９（１９９１））、ファセオリン（ｐｈａｓｅｏｌ
ｉｎ）、ゼイン、ダイズトリプシンインヒビター、ＡＣＰ、ステアロイル−ＡＣ
Ｐデサチュラーゼ、ダイズβ−コングリシニン（ｃｏｎｇｌｙｃｉｎｉｎ）のα
−サブユニット（ｓｏｙ ７ｓ，（Ｃｈｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．８３：８５６０−８５６４（１９８６）））及びオレオシン（ｏｌｅ
ｏｓｉｎ）などの遺伝子に由来の５’調節領域である。
【００５２】 アシルトランスフェラーゼを与えるタンパク質が特定の亜細胞区画、例えばミ
トコンドリア、小胞体、液胞、プロトプラストまたはその他のプラスチド区画に
局在化するように指令されるのが有利であろう。例えば、本発明の有益な遺伝子
がプロトプラストのようなプラスチドを発現のターゲットとする場合、構築物で
は遺伝子にプラスチドを指向させる配列も使用されるであろう。本文中ではこの
ような配列をプロトプラストトランジットペプチド（ＣＴＰ）またはプラスチド
トランジットペプチド（ＰＴＰ）と呼ぶ。このとき、有益な遺伝子がプラスチド
に直接挿入されない場合には、発現構築物が更に、有益な遺伝子にプラスチドを
指向させるトランジットペプチドをコードする遺伝子を含むであろう。プロトプ
ラストトランジットペプチドは有益な遺伝子に由来してもよくまたはＣＴＰを有
するヘテロロガス配列に由来してもよい。このようなトランジットペプチドは当
業界で公知である。例えば、Ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅら，（１９９１）Ｐｌａｎｔ
Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．９：１０４−１２６；Ｃｌａｒｋら，（１９８９
）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１７５４４−１７５５０；ｄｅｌｌａ−Ｃ
ｉｏｐｐａら，（１９８７）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．８４：９６５−９６
８；Ｒｏｍｅｒら，（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ Ｃ
ｏｍｍｕｎ．１９６：１４１４−１４２１；及び、Ｓｈａｈら，（１９８６）Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ ２３３：４７８−４８１参照。タンパク質を小胞体（ＥＲ）また
は液胞に転位させる付加的なトランジットペプチドを本発明の構築物中に使用し
てもよい。
トコンドリア、小胞体、液胞、プロトプラストまたはその他のプラスチド区画に
局在化するように指令されるのが有利であろう。例えば、本発明の有益な遺伝子
がプロトプラストのようなプラスチドを発現のターゲットとする場合、構築物で
は遺伝子にプラスチドを指向させる配列も使用されるであろう。本文中ではこの
ような配列をプロトプラストトランジットペプチド（ＣＴＰ）またはプラスチド
トランジットペプチド（ＰＴＰ）と呼ぶ。このとき、有益な遺伝子がプラスチド
に直接挿入されない場合には、発現構築物が更に、有益な遺伝子にプラスチドを
指向させるトランジットペプチドをコードする遺伝子を含むであろう。プロトプ
ラストトランジットペプチドは有益な遺伝子に由来してもよくまたはＣＴＰを有
するヘテロロガス配列に由来してもよい。このようなトランジットペプチドは当
業界で公知である。例えば、Ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅら，（１９９１）Ｐｌａｎｔ
Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．９：１０４−１２６；Ｃｌａｒｋら，（１９８９
）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１７５４４−１７５５０；ｄｅｌｌａ−Ｃ
ｉｏｐｐａら，（１９８７）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．８４：９６５−９６
８；Ｒｏｍｅｒら，（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ Ｃ
ｏｍｍｕｎ．１９６：１４１４−１４２１；及び、Ｓｈａｈら，（１９８６）Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ ２３３：４７８−４８１参照。タンパク質を小胞体（ＥＲ）また
は液胞に転位させる付加的なトランジットペプチドを本発明の構築物中に使用し
てもよい。
【００５３】 予定の用途次第で構築物は、アシルトランスフェラーゼの完全タンパク質また
はその一部分をコードする核酸配列を含み得る。例えば、所与のアシルトランス
フェラーゼタンパク質のアンチセンス阻害が望まれる場合、完全配列は不要であ
る。更に、構築物中に使用されたアシルトランスフェラーゼ配列をプローブとし
て使用する予定の場合、アシルトランスフェラーゼのコーディング配列の特定部
分、例えば、アシルトランスフェラーゼの高度に保存された領域をコードするこ
とが知見された配列だけを含む構築物を作製するのが有利であろう。
はその一部分をコードする核酸配列を含み得る。例えば、所与のアシルトランス
フェラーゼタンパク質のアンチセンス阻害が望まれる場合、完全配列は不要であ
る。更に、構築物中に使用されたアシルトランスフェラーゼ配列をプローブとし
て使用する予定の場合、アシルトランスフェラーゼのコーディング配列の特定部
分、例えば、アシルトランスフェラーゼの高度に保存された領域をコードするこ
とが知見された配列だけを含む構築物を作製するのが有利であろう。
【００５４】 宿主細胞中の内在性配列の発現を阻害する種々の方法が存在することは当業者
に明らかであろう。このような方法の非限定例としては、アンチセンス抑圧（Ｓ
ｍｉｔｈら，（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３４：７２４−７２６）、同時抑圧
（Ｎａｐｏｌｉら，（１９８９）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２：２７９−２８９）
、リボザイム（国際公開ＷＯ９７／１０３２８）、及び、Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ
ら，（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：１３
９５９−１３９６４に記載のようなセンスとアンチセンスとの組合せがある。宿
主細胞中の内在性配列の抑圧方法は典型的には、抑圧すべき配列の少なくとも一
部分の転写を使用するかまたは転写と翻訳とを使用する。このような配列は内在
性配列のコーディング領域及び非コーディング領域に相同的でもよい。
に明らかであろう。このような方法の非限定例としては、アンチセンス抑圧（Ｓ
ｍｉｔｈら，（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３４：７２４−７２６）、同時抑圧
（Ｎａｐｏｌｉら，（１９８９）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２：２７９−２８９）
、リボザイム（国際公開ＷＯ９７／１０３２８）、及び、Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ
ら，（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：１３
９５９−１３９６４に記載のようなセンスとアンチセンスとの組合せがある。宿
主細胞中の内在性配列の抑圧方法は典型的には、抑圧すべき配列の少なくとも一
部分の転写を使用するかまたは転写と翻訳とを使用する。このような配列は内在
性配列のコーディング領域及び非コーディング領域に相同的でもよい。
【００５５】 また、本発明の植物発現構築物中に調節的転写終結領域を配備してもよい。転
写終結領域は、アシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ配列、または、異
なる遺伝子ソースに由来の好適な転写終結領域、例えば、本来的に転写開始領域
に連携している転写終結領域によって提供され得る。植物細胞中で転写を終結さ
せ得る任意の好適な転写終結領域を本発明の構築物中に使用し得ることは当業者
に明らかであろう。
写終結領域は、アシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ配列、または、異
なる遺伝子ソースに由来の好適な転写終結領域、例えば、本来的に転写開始領域
に連携している転写終結領域によって提供され得る。植物細胞中で転写を終結さ
せ得る任意の好適な転写終結領域を本発明の構築物中に使用し得ることは当業者
に明らかであろう。
【００５６】 あるいは、宿主植物細胞プラスチドから直接にアシルトランスフェラーゼ配列
の発現を指令するような構築物を作製してもよい。このような構築物及び方法は
当業界で公知であり、例えば、Ｓｖａｂら，（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：８５２６−８５３０及びＳｖａｂ ａｎｄ
Ｍａｌｉｇａ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９
０：９１３−９１７及び米国特許第５，６９３，５０７号に概説されている。
の発現を指令するような構築物を作製してもよい。このような構築物及び方法は
当業界で公知であり、例えば、Ｓｖａｂら，（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：８５２６−８５３０及びＳｖａｂ ａｎｄ
Ｍａｌｉｇａ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９
０：９１３−９１７及び米国特許第５，６９３，５０７号に概説されている。
【００５７】 発現構築物を含む組換えＤＮＡ構築物が導入された植物の細胞、組織、器官ま
たは株は形質転換されたか、トランスフェクトされたかまたはトランスジェニッ
クであると考えられる。トランスジェニックであるかまたは形質転換された細胞
または植物は、当該細胞または植物の後代、及び、このようなトランスジェニッ
ク植物を親として用いる交雑育種プログラムから産生された後代を包含する。後
者は、導入されたアシルトランスフェラーゼ核酸配列の存在に起因する変異遺伝
子型を示す。
たは株は形質転換されたか、トランスフェクトされたかまたはトランスジェニッ
クであると考えられる。トランスジェニックであるかまたは形質転換された細胞
または植物は、当該細胞または植物の後代、及び、このようなトランスジェニッ
ク植物を親として用いる交雑育種プログラムから産生された後代を包含する。後
者は、導入されたアシルトランスフェラーゼ核酸配列の存在に起因する変異遺伝
子型を示す。
【００５８】 核酸配列を細胞に挿入する文脈で使用した“導入された”という用語は、“ト
ランスフェクション”、“形質転換”または“形質導入”を意味しており、真核
細胞または原核細胞に核酸配列が取込まれることを意味する。核酸配列は細胞の
ゲノム（例えば染色体、プラスミド、プラスチドまたはミトコンドリアＤＮＡ）
に取込まれてもよく、自律的レプリコンに変換されてもよくまたは一過性に発現
されてもよい（例えば、トランスフェクトされたｍＲＮＡ）。
ランスフェクション”、“形質転換”または“形質導入”を意味しており、真核
細胞または原核細胞に核酸配列が取込まれることを意味する。核酸配列は細胞の
ゲノム（例えば染色体、プラスミド、プラスチドまたはミトコンドリアＤＮＡ）
に取込まれてもよく、自律的レプリコンに変換されてもよくまたは一過性に発現
されてもよい（例えば、トランスフェクトされたｍＲＮＡ）。
【００５９】 有益なＤＮＡ配列としてアシルトランスフェラーゼを有しており該ＤＮＡ配列
の発現を増減させるための植物の発現用または転写用構築物は、多様な種類の植
物生命、特に、食用及び工業用の植物油の生産に関与する植物生命に使用され得
る。本発明の有益な植物としては単子葉植物及び双子葉植物がある。温帯の油料
種子作物が特に好ましい。有益な植物の非限定例は、セイヨウアブラナ（キャノ
ーラ及び高級エルカ酸の品種）、ヒマワリ、ベニバナ、綿、ダイズ、落花生、コ
コヤシ、ギネアアブラヤシ及びトウモロコシである。宿主細胞への組換え構築物
の導入方法次第では、別のＤＮＡ配列が必要であろう。重要な利点は、本発明が
双子葉植物種及び単子葉植物種の双方に等しく適用できること、並びに、新しい
及び／または改良された形質転換及び調節の技術に容易に応用できることである
。
の発現を増減させるための植物の発現用または転写用構築物は、多様な種類の植
物生命、特に、食用及び工業用の植物油の生産に関与する植物生命に使用され得
る。本発明の有益な植物としては単子葉植物及び双子葉植物がある。温帯の油料
種子作物が特に好ましい。有益な植物の非限定例は、セイヨウアブラナ（キャノ
ーラ及び高級エルカ酸の品種）、ヒマワリ、ベニバナ、綿、ダイズ、落花生、コ
コヤシ、ギネアアブラヤシ及びトウモロコシである。宿主細胞への組換え構築物
の導入方法次第では、別のＤＮＡ配列が必要であろう。重要な利点は、本発明が
双子葉植物種及び単子葉植物種の双方に等しく適用できること、並びに、新しい
及び／または改良された形質転換及び調節の技術に容易に応用できることである
。
【００６０】 本文中に使用された“植物”という用語は、全植物、植物器官（例えば、葉、
幹、根など）、種子、植物細胞、及びこれらの後代を包含する。本文中で使用さ
れた植物細胞なる用語は非限定的に、種子懸濁培養物、胚芽、分裂組織領域、カ
ルス組織、葉根苗条、配偶体、胞子体、花粉及び小胞子を包含する。本発明の方
法に使用できる植物のクラスは、単子葉植物及び双子葉植物の双方を包含し形質
転換技術で処理可能な高等植物のクラスとほぼ同じ範囲である。特に好ましい有
益な植物の非限定例は、セイヨウアブラナ（キャノーラ及び高級エルカ酸の品種
）、ヒマワリ、ベニバナ、綿、ダイズ、落花生、ココヤシ、ギネアアブラヤシ及
びトウモロコシである。特に好ましい植物はアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）、ダ
イズ及びトウモロコシである。
幹、根など）、種子、植物細胞、及びこれらの後代を包含する。本文中で使用さ
れた植物細胞なる用語は非限定的に、種子懸濁培養物、胚芽、分裂組織領域、カ
ルス組織、葉根苗条、配偶体、胞子体、花粉及び小胞子を包含する。本発明の方
法に使用できる植物のクラスは、単子葉植物及び双子葉植物の双方を包含し形質
転換技術で処理可能な高等植物のクラスとほぼ同じ範囲である。特に好ましい有
益な植物の非限定例は、セイヨウアブラナ（キャノーラ及び高級エルカ酸の品種
）、ヒマワリ、ベニバナ、綿、ダイズ、落花生、ココヤシ、ギネアアブラヤシ及
びトウモロコシである。特に好ましい植物はアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）、ダ
イズ及びトウモロコシである。
【００６１】 本文中で使用された“トランスジェニック植物”なる用語は、ヘテロロガスな
ポリヌクレオチドをそのゲノム内部に含む植物を意味する。一般的に、ヘテロロ
ガスなポリヌクレオチドは、該ポリヌクレオチドが継続世代に伝えられるように
ゲノム内部に安定に組込まれる。ヘテロロガスなポリヌクレオチドは単独でゲノ
ムに組込まれてもよくまたは組換え発現カセットの一部としてゲノムに組込まれ
てもよい。本文中で使用された“トランスジェニック”なる用語は、その遺伝子
型がヘテロロガスな核酸の存在によって変異した任意の細胞、細胞系、カルス、
組織、植物の部分または株を包含し、初めてこのように変異したトランスジェニ
ック、及び、これらの最初のトランスジェニックから有性交雑または無性生殖に
よって生じたトランスジェニックの双方を包含する。
ポリヌクレオチドをそのゲノム内部に含む植物を意味する。一般的に、ヘテロロ
ガスなポリヌクレオチドは、該ポリヌクレオチドが継続世代に伝えられるように
ゲノム内部に安定に組込まれる。ヘテロロガスなポリヌクレオチドは単独でゲノ
ムに組込まれてもよくまたは組換え発現カセットの一部としてゲノムに組込まれ
てもよい。本文中で使用された“トランスジェニック”なる用語は、その遺伝子
型がヘテロロガスな核酸の存在によって変異した任意の細胞、細胞系、カルス、
組織、植物の部分または株を包含し、初めてこのように変異したトランスジェニ
ック、及び、これらの最初のトランスジェニックから有性交雑または無性生殖に
よって生じたトランスジェニックの双方を包含する。
【００６２】 従って、その細胞内部にヘテロロガスなポリヌクレオチドを有している植物を
本文中でトランスジェニック植物と呼ぶ。ヘテロロガスなポリヌクレオチドは、
ゲノムに安定に組込まれてもよく、または、染色体外に存在してもよい。好まし
くは、本発明のポリヌクレオチドは、該ポリヌクレオチドが継続世代に伝えられ
るようにゲノム内部に安定に組込まれる。ポリヌクレオチドは単独でゲノムに組
込まれてもよくまたは組換え発現カセットの一部としてゲノムに組込まれてもよ
い。本文中で使用された“トランスジェニック”なる用語は、その遺伝子型がヘ
テロロガスな核酸の存在によって変異した任意の細胞、細胞系、カルス、組織、
植物の部分または株を包含し、初めてこのように変異したトランスジェニック、
及び、これらの最初のトランスジェニックから有性交雑または無性生殖によって
生じたトランスジェニックの双方を包含する。
本文中でトランスジェニック植物と呼ぶ。ヘテロロガスなポリヌクレオチドは、
ゲノムに安定に組込まれてもよく、または、染色体外に存在してもよい。好まし
くは、本発明のポリヌクレオチドは、該ポリヌクレオチドが継続世代に伝えられ
るようにゲノム内部に安定に組込まれる。ポリヌクレオチドは単独でゲノムに組
込まれてもよくまたは組換え発現カセットの一部としてゲノムに組込まれてもよ
い。本文中で使用された“トランスジェニック”なる用語は、その遺伝子型がヘ
テロロガスな核酸の存在によって変異した任意の細胞、細胞系、カルス、組織、
植物の部分または株を包含し、初めてこのように変異したトランスジェニック、
及び、これらの最初のトランスジェニックから有性交雑または無性生殖によって
生じたトランスジェニックの双方を包含する。
【００６３】 核酸の形容詞として本文中に使用された“ヘテロロガス”なる用語は、外来種
に由来の核酸、または、同じ種に由来するときは計画的な人為介入によって組成
及び／またはゲノム遺伝子座が在来の形態から実質的に修飾された核酸を意味す
る。例えば、ヘテロロガス構造遺伝子に作動的に連結されたプロモーターは、構
造遺伝子とは異なる種に由来しているか、または、同じ種に由来するときはプロ
モーター及び構造遺伝子の一方もしくは双方がその初期形態から実質的に修飾さ
れている。ヘテロロガスなタンパク質は、外来種に由来してもよく、または、同
じ種に由来するときは計画的な人為介入によって初期形態から実質的に修飾され
ている。
に由来の核酸、または、同じ種に由来するときは計画的な人為介入によって組成
及び／またはゲノム遺伝子座が在来の形態から実質的に修飾された核酸を意味す
る。例えば、ヘテロロガス構造遺伝子に作動的に連結されたプロモーターは、構
造遺伝子とは異なる種に由来しているか、または、同じ種に由来するときはプロ
モーター及び構造遺伝子の一方もしくは双方がその初期形態から実質的に修飾さ
れている。ヘテロロガスなタンパク質は、外来種に由来してもよく、または、同
じ種に由来するときは計画的な人為介入によって初期形態から実質的に修飾され
ている。
【００６４】 本文中で使用された“組換え発現カセット”なる表現は、ターゲット細胞中の
特定の核酸配列を転写し得る一連の特定核酸要素によって組換え的にまたは合成
的に産生される核酸構築物を意味する。組換え発現カセットはプラスミド、染色
体、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスチドＤＮＡ、ウイルスまたは核酸フラグメン
トに取込まれることができる。典型的には、発現ベクターの組換え発現カセット
部分は、他の配列のなかでも特に、転写されるべき核酸配列とプロモーターとを
含む。
特定の核酸配列を転写し得る一連の特定核酸要素によって組換え的にまたは合成
的に産生される核酸構築物を意味する。組換え発現カセットはプラスミド、染色
体、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスチドＤＮＡ、ウイルスまたは核酸フラグメン
トに取込まれることができる。典型的には、発現ベクターの組換え発現カセット
部分は、他の配列のなかでも特に、転写されるべき核酸配列とプロモーターとを
含む。
【００６５】 完全遺伝子配列を合成してもよく、または、植物に好適な配列を与えるのが特
に望ましい場合には部分的遺伝子配列を合成してもよい。従って、所望の構造遺
伝子の全部または一部（アシルトランスフェラーゼタンパク質をコードする遺伝
子部分）を、選択された宿主に好適なコドンを使用して合成し得る。宿主に好適
なコドンは、例えば所望の宿主種中で発現されるタンパク質中で最も頻用される
コドンから決定され得る。
に望ましい場合には部分的遺伝子配列を合成してもよい。従って、所望の構造遺
伝子の全部または一部（アシルトランスフェラーゼタンパク質をコードする遺伝
子部分）を、選択された宿主に好適なコドンを使用して合成し得る。宿主に好適
なコドンは、例えば所望の宿主種中で発現されるタンパク質中で最も頻用される
コドンから決定され得る。
【００６６】 多様な植物ソースから“相同的”または“近縁”アシルトランスフェラーゼを
スクリーニングして回収するために、抗体調製物、核酸プローブ（ＤＮＡ及びＲ
ＮＡ）などを作製して使用し得ることは当業者に容易に理解されよう。相同的配
列は、核酸もしくはアミノ酸の配列情報の比較に基づいて判定され得る配列一致
の存在、または、既知のアシルトランスフェラーゼと候補ソースとの間のハイブ
リダイゼーション反応を介して見出される。配列相同性を判定するためにＧｌｕ
／Ａｓｐ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ｓｅｒ／Ｔｈｒ，Ａｒｇ／Ｌｙｓ及びＧｌｎ／Ａｓ
ｎのような保存性変異を考察してもよい。２個の完全成熟タンパク質の配列一致
が２５％という低い値でも、アミノ酸配列は相同的であると考えられる。（Ｄｏ
ｏｌｉｔｔｌｅ，Ｒ．Ｆ．，ＯＦ ＵＲＦＳ ａｎｄ ＯＲＦＳ（Ｕｎｉｖｅｒ
ｓｉｔｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｂｏｏｋｓ，ＣＡ，１９８６全文参照）。
スクリーニングして回収するために、抗体調製物、核酸プローブ（ＤＮＡ及びＲ
ＮＡ）などを作製して使用し得ることは当業者に容易に理解されよう。相同的配
列は、核酸もしくはアミノ酸の配列情報の比較に基づいて判定され得る配列一致
の存在、または、既知のアシルトランスフェラーゼと候補ソースとの間のハイブ
リダイゼーション反応を介して見出される。配列相同性を判定するためにＧｌｕ
／Ａｓｐ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ｓｅｒ／Ｔｈｒ，Ａｒｇ／Ｌｙｓ及びＧｌｎ／Ａｓ
ｎのような保存性変異を考察してもよい。２個の完全成熟タンパク質の配列一致
が２５％という低い値でも、アミノ酸配列は相同的であると考えられる。（Ｄｏ
ｏｌｉｔｔｌｅ，Ｒ．Ｆ．，ＯＦ ＵＲＦＳ ａｎｄ ＯＲＦＳ（Ｕｎｉｖｅｒ
ｓｉｔｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｂｏｏｋｓ，ＣＡ，１９８６全文参照）。
【００６７】 従って、本文中に特定例として示した配列から別のアシルトランスフェラーゼ
配列を得ることができる。更に、例示した配列から及びこのような例示配列の使
用によって得られるアシルトランスフェラーゼから、修飾アミノ酸配列を含む天
然及び合成の配列並びに合成タンパク質モデル作製用の出発材料が得られること
も明らかであろう。修飾アミノ酸配列は、該配列が部分合成配列であるか完全合
成配列であるかにかかわりなく、突然変異、欠失、付加などを生じた配列を包含
する。実際に植物調製物から精製される配列または同等の配列または同等のタン
パク質をコードする配列は、タンパク質または配列を得るために使用した方法に
かかわりなく、同等に在来配列であると考えられる。
配列を得ることができる。更に、例示した配列から及びこのような例示配列の使
用によって得られるアシルトランスフェラーゼから、修飾アミノ酸配列を含む天
然及び合成の配列並びに合成タンパク質モデル作製用の出発材料が得られること
も明らかであろう。修飾アミノ酸配列は、該配列が部分合成配列であるか完全合
成配列であるかにかかわりなく、突然変異、欠失、付加などを生じた配列を包含
する。実際に植物調製物から精製される配列または同等の配列または同等のタン
パク質をコードする配列は、タンパク質または配列を得るために使用した方法に
かかわりなく、同等に在来配列であると考えられる。
【００６８】 免疫学的スクリーニングのためには、ウサギまたはマウスに精製タンパク質ま
たはその一部分を注入することによってアシルトランスフェラーゼに対する抗体
を調製する。このような抗体調製方法は当業界で公知である。遺伝子単離には典
型的にはポリクローナル抗体のほうが有効であるが、モノクローナル抗体または
ポリクローナル抗体のいずれも調製できる。ウェスタン分析を行って、アシルト
ランスフェラーゼタンパク質に対する抗体との交差反応によって測定される近縁
タンパク質が所望の植物種の粗抽出物中に存在するか否かを判断し得る。交差反
応性が観察されるとき、近縁タンパク質をコードする遺伝子は、所望の植物種を
表す発現ライブラリーをスクリーニングすることによって単離される。発現ライ
ブラリーは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９
８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌ
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に記載されているように
、ラムダｇｔ１１などの種々の市販ベクター中で構築できる。
たはその一部分を注入することによってアシルトランスフェラーゼに対する抗体
を調製する。このような抗体調製方法は当業界で公知である。遺伝子単離には典
型的にはポリクローナル抗体のほうが有効であるが、モノクローナル抗体または
ポリクローナル抗体のいずれも調製できる。ウェスタン分析を行って、アシルト
ランスフェラーゼタンパク質に対する抗体との交差反応によって測定される近縁
タンパク質が所望の植物種の粗抽出物中に存在するか否かを判断し得る。交差反
応性が観察されるとき、近縁タンパク質をコードする遺伝子は、所望の植物種を
表す発現ライブラリーをスクリーニングすることによって単離される。発現ライ
ブラリーは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９
８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌ
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に記載されているように
、ラムダｇｔ１１などの種々の市販ベクター中で構築できる。
【００６９】 アシルトランスフェラーゼタンパク質に関連した核酸配列には多くの用途が見
出される。例えば、使用し易い酵素ソースを調製するため及び／または酵素中の
トリグリセリドの組成を修飾するために組換え構築物を作製し、プローブとして
使用してもよくまたは宿主細胞中でアシルトランスフェラーゼを発現させてもよ
い。宿主がｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏの植物宿主細胞であるときは
別の有効な用途を見つけることもできよう。
出される。例えば、使用し易い酵素ソースを調製するため及び／または酵素中の
トリグリセリドの組成を修飾するために組換え構築物を作製し、プローブとして
使用してもよくまたは宿主細胞中でアシルトランスフェラーゼを発現させてもよ
い。宿主がｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏの植物宿主細胞であるときは
別の有効な用途を見つけることもできよう。
【００７０】 脂肪酸組成物の修飾はまた植物膜の流動性にも影響を及ぼすであろう。例えば
、耐寒性植物中では種々の脂質濃度が観察された。本発明によって耐寒性を与え
る形質を導入することが可能であろう。構成的または温度誘発的な転写開始調節
性調節領域はこのように用途に特に好適である。
、耐寒性植物中では種々の脂質濃度が観察された。本発明によって耐寒性を与え
る形質を導入することが可能であろう。構成的または温度誘発的な転写開始調節
性調節領域はこのように用途に特に好適である。
【００７１】 上記に論議したように、本発明のアシルトランスフェラーゼをコードする核酸
配列は、ゲノム、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡ配列を包含し得る。“コードする”と
いう用語は、配列が特定のアミノ酸配列にセンス方向またはアンチセンス方向で
対応することを意味する。“染色体外”という用語は、配列が、本来は該配列に
結合される植物ゲノムの外側にあることを意味する。“組換え”という用語は、
配列が突然変異誘発、制限酵素などを介して操作される遺伝子工学的な修飾を含
むことを意味する。
配列は、ゲノム、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡ配列を包含し得る。“コードする”と
いう用語は、配列が特定のアミノ酸配列にセンス方向またはアンチセンス方向で
対応することを意味する。“染色体外”という用語は、配列が、本来は該配列に
結合される植物ゲノムの外側にあることを意味する。“組換え”という用語は、
配列が突然変異誘発、制限酵素などを介して操作される遺伝子工学的な修飾を含
むことを意味する。
【００７２】 所望のアシルトランスフェラーゼ核酸配列がいったん得られると、この配列を
多様な方法で操作し得る。配列が非コーディングフランキング領域を含む場合、
フランキング領域を切除、突然変異誘発、などによって処理し得る。天然に産生
する配列に、例えばトランジション（転位）、トランスバージョン（転換）、欠
失及び挿入などの処理を加えてもよい。更に、配列の全部または一部を合成して
もよい。構造遺伝子中では、修飾アミノ酸配列を与えるように１つまたは複数の
コドンを修飾してもよく、または、適当な制限部位を与える目的または構築もし
くは発現に関与する別の目的で１つまたは複数のコドンの突然変異を導入しても
よい。１つまたは複数の適当な制限部位を導入するために合成アダプター、リン
カーなどを使用することによって構造遺伝子を更に修飾してもよい。
多様な方法で操作し得る。配列が非コーディングフランキング領域を含む場合、
フランキング領域を切除、突然変異誘発、などによって処理し得る。天然に産生
する配列に、例えばトランジション（転位）、トランスバージョン（転換）、欠
失及び挿入などの処理を加えてもよい。更に、配列の全部または一部を合成して
もよい。構造遺伝子中では、修飾アミノ酸配列を与えるように１つまたは複数の
コドンを修飾してもよく、または、適当な制限部位を与える目的または構築もし
くは発現に関与する別の目的で１つまたは複数のコドンの突然変異を導入しても
よい。１つまたは複数の適当な制限部位を導入するために合成アダプター、リン
カーなどを使用することによって構造遺伝子を更に修飾してもよい。
【００７３】 本発明のアシルトランスフェラーゼをコードする核酸またはアミノ酸の配列を
別の非在来配列、即ち“ヘテロロガス”配列に種々の方法で組合せてもよい。“
ヘテロロガス”配列という用語は、天然にはアシルトランスフェラーゼに接合し
た状態で見出されることはない任意の配列を意味しており、例えば、天然には互
いに接合した状態で見出されることはない同一植物に由来の核酸配列の組合せを
包含する。
別の非在来配列、即ち“ヘテロロガス”配列に種々の方法で組合せてもよい。“
ヘテロロガス”配列という用語は、天然にはアシルトランスフェラーゼに接合し
た状態で見出されることはない任意の配列を意味しており、例えば、天然には互
いに接合した状態で見出されることはない同一植物に由来の核酸配列の組合せを
包含する。
【００７４】 本発明のアシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ配列は、正常にはアシ
ルトランスフェラーゼに結合する遺伝子配列の全部または一部と共に使用され得
る。構成要素中でアシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ配列は、ＤＮＡ
構築物が５’から３’への転写方向で宿主細胞中の転写及び翻訳を促進し得る転
写開始調節領域と、植物アシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ配列と、
転写及び翻訳の終結領域とを有するように組合せられる。
ルトランスフェラーゼに結合する遺伝子配列の全部または一部と共に使用され得
る。構成要素中でアシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ配列は、ＤＮＡ
構築物が５’から３’への転写方向で宿主細胞中の転写及び翻訳を促進し得る転
写開始調節領域と、植物アシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ配列と、
転写及び翻訳の終結領域とを有するように組合せられる。
【００７５】 有力な宿主細胞は、大腸菌のような原核細胞、酵母、昆虫、両生類または哺乳
類の細胞のような真核細胞を包含する。予定の用途次第で、宿主細胞は単細胞で
もよくまたは分化もしくは未分化の多細胞生物から見出されてもよい。好ましく
は本発明の宿主細胞は、単子葉及び双子葉の植物細胞である。本発明の細胞は内
在する野生型細胞に対して外来の配列を内包することによって、例えば、アシル
トランスフェラーゼをコードする組換え核酸構築物を内包することによって識別
される。
類の細胞のような真核細胞を包含する。予定の用途次第で、宿主細胞は単細胞で
もよくまたは分化もしくは未分化の多細胞生物から見出されてもよい。好ましく
は本発明の宿主細胞は、単子葉及び双子葉の植物細胞である。本発明の細胞は内
在する野生型細胞に対して外来の配列を内包することによって、例えば、アシル
トランスフェラーゼをコードする組換え核酸構築物を内包することによって識別
される。
【００７６】 宿主植物細胞の形質転換に使用される方法は本発明の重大要素ではない。植物
の形質転換は好ましくは持続性である。即ち、導入された発現構築物が宿主植物
ゲノムに組込まれ、その結果として導入された構築物が継続植物世代に伝えられ
る。当業界に多様な形質転換技術が存在すること、また、新しい技術の可能性が
絶えず拡大されていることは当業者に明らかであろう。ターゲット宿主植物に適
した任意の技術を本発明の範囲内で使用できる。例えば、非限定的にＤＮＡ鎖の
ような多様な形態で構築物をプラスミドまたは人工染色体に導入し得る。ターゲ
ット植物細胞への構築物の導入は、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈、電気穿孔、
マイクロインジェクション、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ感染、リポソームまた
はマイクロプロジェクティルによる形質転換、などを非限定例とする種々の技術
によって達成される。当業者は文献を詳細に検討し本発明の方法に使用するため
の適当な技術を選択し得る。
の形質転換は好ましくは持続性である。即ち、導入された発現構築物が宿主植物
ゲノムに組込まれ、その結果として導入された構築物が継続植物世代に伝えられ
る。当業界に多様な形質転換技術が存在すること、また、新しい技術の可能性が
絶えず拡大されていることは当業者に明らかであろう。ターゲット宿主植物に適
した任意の技術を本発明の範囲内で使用できる。例えば、非限定的にＤＮＡ鎖の
ような多様な形態で構築物をプラスミドまたは人工染色体に導入し得る。ターゲ
ット植物細胞への構築物の導入は、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈、電気穿孔、
マイクロインジェクション、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ感染、リポソームまた
はマイクロプロジェクティルによる形質転換、などを非限定例とする種々の技術
によって達成される。当業者は文献を詳細に検討し本発明の方法に使用するため
の適当な技術を選択し得る。
【００７７】 通常はＤＮＡ構築物と共に、宿主中の発現及び形質転換細胞の選択に必要な調
節領域を有している構造遺伝子が含まれているであろう。遺伝子は、細胞毒性物
質、例えば抗生物質、重金属、毒素、などに対する耐性、原栄養宿主を栄養要求
宿主にする相補性、ウイルス免疫性、などを与えるであろう。発現構築物または
その構成要素が、異なる宿主に異なる選択条件を使用する場合には、導入される
異なる宿主の数次第で１つまたは複数のマーカーを使用してもよい。
節領域を有している構造遺伝子が含まれているであろう。遺伝子は、細胞毒性物
質、例えば抗生物質、重金属、毒素、などに対する耐性、原栄養宿主を栄養要求
宿主にする相補性、ウイルス免疫性、などを与えるであろう。発現構築物または
その構成要素が、異なる宿主に異なる選択条件を使用する場合には、導入される
異なる宿主の数次第で１つまたは複数のマーカーを使用してもよい。
【００７８】 植物細胞の形質転換にＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを使用する場合、Ａｇｒｏ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ宿主中に存在するＴ−ＤＮＡまたはＴｉ−もしくはＲｉ−プ
ラスミドと相同的組換えを生じさせるためにＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ宿主に
導入され得るベクターを使用してもよい。組換え用のＴ−ＤＮＡを含有するＴｉ
−またはＲｉ−プラスミドは有アームでもよく（瘤形成を惹起し得る）または無
アームでもよい（瘤形成を惹起し得ない）。形質転換されたＡｇｒｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ宿主中にｖｉｒ遺伝子が存在する限り、無アームのプラスミドが許容さ
れる。有アームのプラスミドは正常植物細胞と瘤との混合物を与え得る。
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ宿主中に存在するＴ−ＤＮＡまたはＴｉ−もしくはＲｉ−プ
ラスミドと相同的組換えを生じさせるためにＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ宿主に
導入され得るベクターを使用してもよい。組換え用のＴ−ＤＮＡを含有するＴｉ
−またはＲｉ−プラスミドは有アームでもよく（瘤形成を惹起し得る）または無
アームでもよい（瘤形成を惹起し得ない）。形質転換されたＡｇｒｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ宿主中にｖｉｒ遺伝子が存在する限り、無アームのプラスミドが許容さ
れる。有アームのプラスミドは正常植物細胞と瘤との混合物を与え得る。
【００７９】 宿主植物細胞を形質転換するビヒクルとしてＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍが使
用されるいくつかの場合には、（１つまたは複数の）Ｔ−ＤＮＡボーダー領域で
縁取られた発現または転写構築物を、大腸菌及びＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの
体内で複製し得る広い宿主域のベクターに挿入する。広い宿主域のベクターは文
献に記載されている。ｐＲＫ２またはその誘導体が常用されている。例えば、Ｄ
ｉｔｔａら，（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８
０）７７：７３４７−７３５１）及び欧州特許公開ＥＰＡ０１２０５１５参照。
これらの文献の記載内容は参照によって本発明に含まれるものとする。あるいは
、植物細胞中で発現させるべき配列を、一方が大腸菌中でベクターを安定させ他
方がＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ中でベクターを安定させる別々の複製配列を含
むベクターに挿入してもよい。例えば、ＭｃＢｒｉｄｅ ａｎｄ Ｓｕｍｍｅｒ
ｆｅｌｔ（Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９０）１４：２６９−２７６
）参照。この場合、ｐＲｉＨＲＩ（Ｊｏｕａｎｉｎら，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎ
ｅｔ．（１９８５）２０１：３７０−３７４）複製起点を使用して宿主Ａｇｒｏ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ細胞中の植物発現ベクターの安定性を更に強化する。
用されるいくつかの場合には、（１つまたは複数の）Ｔ−ＤＮＡボーダー領域で
縁取られた発現または転写構築物を、大腸菌及びＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの
体内で複製し得る広い宿主域のベクターに挿入する。広い宿主域のベクターは文
献に記載されている。ｐＲＫ２またはその誘導体が常用されている。例えば、Ｄ
ｉｔｔａら，（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８
０）７７：７３４７−７３５１）及び欧州特許公開ＥＰＡ０１２０５１５参照。
これらの文献の記載内容は参照によって本発明に含まれるものとする。あるいは
、植物細胞中で発現させるべき配列を、一方が大腸菌中でベクターを安定させ他
方がＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ中でベクターを安定させる別々の複製配列を含
むベクターに挿入してもよい。例えば、ＭｃＢｒｉｄｅ ａｎｄ Ｓｕｍｍｅｒ
ｆｅｌｔ（Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９０）１４：２６９−２７６
）参照。この場合、ｐＲｉＨＲＩ（Ｊｏｕａｎｉｎら，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎ
ｅｔ．（１９８５）２０１：３７０−３７４）複製起点を使用して宿主Ａｇｒｏ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ細胞中の植物発現ベクターの安定性を更に強化する。
【００８０】 形質転換されたＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ及び形質転換された植物細胞を選
択できるような１つまたは複数のマーカーが発現構築物及びＴ−ＤＮＡと共に含
まれるであろう。クロラムフェニコール、カナマイシン、アミノグリコシドＧ４
１８、ヒグロマイシン、などに耐性の多くのマーカーが植物細胞に使用するため
に開発されている。特定マーカーの使用が本発明の必須要素ではなく、個々の宿
主及び構築方法次第で好ましいマーカーが異なる。
択できるような１つまたは複数のマーカーが発現構築物及びＴ−ＤＮＡと共に含
まれるであろう。クロラムフェニコール、カナマイシン、アミノグリコシドＧ４
１８、ヒグロマイシン、などに耐性の多くのマーカーが植物細胞に使用するため
に開発されている。特定マーカーの使用が本発明の必須要素ではなく、個々の宿
主及び構築方法次第で好ましいマーカーが異なる。
【００８１】 Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを使用して植物細胞を形質転換するために、形質
転換されたＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍと外植とを組合せて形質転換に十分な時
間インキュベートし、細菌を死滅させ、植物細胞を適当な選択培地で培養する。
カルスが形成されたあと、適当な植物ホルモンを公知の方法に従って使用して苗
条の形成を促進し、苗条を植物再生用の発根培地に移植する。次に植物を種子ま
で成長させ、反復発生を確立しかつ植物油を単離するために種子を使用する。
転換されたＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍと外植とを組合せて形質転換に十分な時
間インキュベートし、細菌を死滅させ、植物細胞を適当な選択培地で培養する。
カルスが形成されたあと、適当な植物ホルモンを公知の方法に従って使用して苗
条の形成を促進し、苗条を植物再生用の発根培地に移植する。次に植物を種子ま
で成長させ、反復発生を確立しかつ植物油を単離するために種子を使用する。
【００８２】 多重発現構築物を含有する本発明の植物細胞は幾つかの方法によって得られる
。本発明の核酸配列を有する構築物と、酵素をコードする別のＤＮＡ配列を有す
る少なくとも１つの別の構築物とを含む植物を産生する任意の手段は本発明に包
含される。例えば、双方の発現構築物を単一の形質転換用ベクターに混在させる
ことによって、または、各々が所望の遺伝子を発現させる別々のベクターを使用
することによって、植物を形質転換させる発現構築物を第二の構築物と同時に使
用し得る。第二の構築物は、第一の発現構築物で既に形質転換された植物に導入
されてもよく、あるいは、一方が第一の構築物を有しており他方が第二の構築物
を有している形質転換植物を交配して同一植物中に双方の構築物を共存させても
よい。
。本発明の核酸配列を有する構築物と、酵素をコードする別のＤＮＡ配列を有す
る少なくとも１つの別の構築物とを含む植物を産生する任意の手段は本発明に包
含される。例えば、双方の発現構築物を単一の形質転換用ベクターに混在させる
ことによって、または、各々が所望の遺伝子を発現させる別々のベクターを使用
することによって、植物を形質転換させる発現構築物を第二の構築物と同時に使
用し得る。第二の構築物は、第一の発現構築物で既に形質転換された植物に導入
されてもよく、あるいは、一方が第一の構築物を有しており他方が第二の構築物
を有している形質転換植物を交配して同一植物中に双方の構築物を共存させても
よい。
【００８３】 一般に、アシルトランスフェラーゼタンパク質はアシル基をドナーから多様な
異なる基質に転移させる活性を有している。例えば、ジアシルグリセロールアシ
ルトランスフェラーゼは、アシル基をジアシルグリセロールに付加してトリアシ
ルグリセロール（ＴＡＧ）を形成する。または、アシル：ＣｏＡ：コレステロー
ルアシルトランスフェラーゼはアシル−ＣｏＡをドナーとして使用してアシル基
をステロールに転移させ、ステロールエステルを形成する。典型的な基質の非限
定例は、モノ及びジグリセリドのようなグリセリド、ステロール、スタノール（
ｓｔａｎｏｌ）、ホスファチド（リン脂質）、などである。ドナーの非限定例は
、アシル−ＣｏＡ及びアシル−ＡＣＰ分子である。
異なる基質に転移させる活性を有している。例えば、ジアシルグリセロールアシ
ルトランスフェラーゼは、アシル基をジアシルグリセロールに付加してトリアシ
ルグリセロール（ＴＡＧ）を形成する。または、アシル：ＣｏＡ：コレステロー
ルアシルトランスフェラーゼはアシル−ＣｏＡをドナーとして使用してアシル基
をステロールに転移させ、ステロールエステルを形成する。典型的な基質の非限
定例は、モノ及びジグリセリドのようなグリセリド、ステロール、スタノール（
ｓｔａｎｏｌ）、ホスファチド（リン脂質）、などである。ドナーの非限定例は
、アシル−ＣｏＡ及びアシル−ＡＣＰ分子である。
【００８４】 上記では本発明を一般概念的に説明した。本発明の例示だけを目的とし本発明
を限定する意図はない以下の実施例の記載から本発明がより容易に理解されるで
あろう。
を限定する意図はない以下の実施例の記載から本発明がより容易に理解されるで
あろう。
【００８５】 実施例 実施例１：ＲＮＡ単離 アラビドプシス・サリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）の
内部蛍光および発育中の種子の総ＲＮＡを、相補性（ｃＤＮＡ）ライブラリーの
構築に使用するために単離する。その手順は、ＷｅｂｂおよびＫｎａｐｐ（Ｄ．
Ｍ．ＷｅｂｂおよびＳ．Ｊ．Ｋｎａｐｐ、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃ．Ｒｅｐｏｒ
ｔｅｒ、８巻、１８０−１８５頁（１９９０年））のＤＮＡ単離プロトコールの
適応である。以下の説明は、１ｇの生の重量の組織の使用を仮定する。凍結種子
組織は、液体窒素下で粉砕することによって粉末にされる。その粉末を、０．２
ｇ不溶性ポリビニルポリプロリドンと共に１０ｍｌＲＥＣ緩衝液（５０ｍＭトリ
ス−ＨＣｌ（ｐＨ９）、０．８Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ｗ
／ｖＣＴＡＢ（アセチルトリメチル−臭化アンモニウム））に添加し、そして室
温で粉砕する。ホモジネートを、１２，０００×ｇで５分間、ペレット不溶性物
質になるまで遠心分離する。生じた上清分画を、クロロホルムで抽出し、そして
上相を回収する。
内部蛍光および発育中の種子の総ＲＮＡを、相補性（ｃＤＮＡ）ライブラリーの
構築に使用するために単離する。その手順は、ＷｅｂｂおよびＫｎａｐｐ（Ｄ．
Ｍ．ＷｅｂｂおよびＳ．Ｊ．Ｋｎａｐｐ、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃ．Ｒｅｐｏｒ
ｔｅｒ、８巻、１８０−１８５頁（１９９０年））のＤＮＡ単離プロトコールの
適応である。以下の説明は、１ｇの生の重量の組織の使用を仮定する。凍結種子
組織は、液体窒素下で粉砕することによって粉末にされる。その粉末を、０．２
ｇ不溶性ポリビニルポリプロリドンと共に１０ｍｌＲＥＣ緩衝液（５０ｍＭトリ
ス−ＨＣｌ（ｐＨ９）、０．８Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ｗ
／ｖＣＴＡＢ（アセチルトリメチル−臭化アンモニウム））に添加し、そして室
温で粉砕する。ホモジネートを、１２，０００×ｇで５分間、ペレット不溶性物
質になるまで遠心分離する。生じた上清分画を、クロロホルムで抽出し、そして
上相を回収する。
【００８６】 その後、ＲＮＡを、１容積のＲｅｃＰ（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ９）、
１０ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．５％（ｗ／ｖ）ＣＴＡＢ）を添加することによっ
て沈殿させ、そして前と同様に簡潔な遠心分離によって収集する。ＲＮＡペレッ
トを、０．４ｍｌの１Ｍ ＮａＣｌ中に再溶解させる。ＲＮＡペレットを、水に
再溶解し、そしてフェノール／クロロホルムで抽出する。十分な３Ｍ酢酸カリウ
ム（ｐＨ５）を添加して、酢酸中に０．３Ｍの混合液を作製し、続いて２容積の
エタノールを添加して、ＲＮＡを沈殿させる。エタノールで洗浄した後、この最
終ＲＮＡ沈殿物を、水に溶解し、そして凍結保存する。
１０ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．５％（ｗ／ｖ）ＣＴＡＢ）を添加することによっ
て沈殿させ、そして前と同様に簡潔な遠心分離によって収集する。ＲＮＡペレッ
トを、０．４ｍｌの１Ｍ ＮａＣｌ中に再溶解させる。ＲＮＡペレットを、水に
再溶解し、そしてフェノール／クロロホルムで抽出する。十分な３Ｍ酢酸カリウ
ム（ｐＨ５）を添加して、酢酸中に０．３Ｍの混合液を作製し、続いて２容積の
エタノールを添加して、ＲＮＡを沈殿させる。エタノールで洗浄した後、この最
終ＲＮＡ沈殿物を、水に溶解し、そして凍結保存する。
【００８７】 代替的に、総ＲＮＡは、製造業者のプロトコールにしたがって、ＴＲＩｚｏ１
試薬（ＢＲＬ−ライフテクノロジーズ、メリーランド州ゲーサーズバーグ（Ｇａ
ｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ））を使用して得られる。ＲＮＡ沈殿物を、水に溶
解させ、そして凍結保存する。
試薬（ＢＲＬ−ライフテクノロジーズ、メリーランド州ゲーサーズバーグ（Ｇａ
ｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ））を使用して得られる。ＲＮＡ沈殿物を、水に溶
解させ、そして凍結保存する。
【００８８】 実施例２：アクリルトランスフェラーゼ相同性配列の同定 検索はＣｏｍｐｕｇｅｎ Ｌｔｄ．によって供給される追加のバイオアクセル
レーターのハードウエアおよびジーン・ウエブソフトウエアを使用して、シリコ
ン・グラグラフィックス・ユニックス・コンピュータで行う。このソフトウエア
とハードウエアは、ＤＮＡおよびタンパク質データベース照会としてプロファイ
ルを検索する上でスミス−ワットマンのアルゴリズムの使用を可能にする。タン
パク質データベースを照会するのに使用されるプログラムは、プロファイルサー
チである。これは、照会が、単独セグメントでなく、アミノ酸または核酸配列の
複数配列に基づいたプロファイルであるサーチ法である。そのプロファイルは、
配列データの組、すなわち配列データベースを照会するのに使用される。プロフ
ァイルは、標準照会調査法に使用される「点取りマトリックス」を有効に置換す
る上で、配列における各位置の記録を取る全ての適当な情報を含む。ヌクレオチ
ドデータベースを照会するのに使用されるプログラムは、トポロファイルサーチ
である。トプロファイルサーチは、アミノ酸プロファイル照会を使用して核酸デ
ータベースを検索する。検索を行っているとき、データベース中の配列は、６つ
の読取枠でアミノ酸配列に翻訳される。トプロファイルサーチについての出力フ
ァイルは、最大の配列が生じる枠を示す追加のカラム以外はプロファイルサーチ
についての出力ファイルと同一である。
レーターのハードウエアおよびジーン・ウエブソフトウエアを使用して、シリコ
ン・グラグラフィックス・ユニックス・コンピュータで行う。このソフトウエア
とハードウエアは、ＤＮＡおよびタンパク質データベース照会としてプロファイ
ルを検索する上でスミス−ワットマンのアルゴリズムの使用を可能にする。タン
パク質データベースを照会するのに使用されるプログラムは、プロファイルサー
チである。これは、照会が、単独セグメントでなく、アミノ酸または核酸配列の
複数配列に基づいたプロファイルであるサーチ法である。そのプロファイルは、
配列データの組、すなわち配列データベースを照会するのに使用される。プロフ
ァイルは、標準照会調査法に使用される「点取りマトリックス」を有効に置換す
る上で、配列における各位置の記録を取る全ての適当な情報を含む。ヌクレオチ
ドデータベースを照会するのに使用されるプログラムは、トポロファイルサーチ
である。トプロファイルサーチは、アミノ酸プロファイル照会を使用して核酸デ
ータベースを検索する。検索を行っているとき、データベース中の配列は、６つ
の読取枠でアミノ酸配列に翻訳される。トプロファイルサーチについての出力フ
ァイルは、最大の配列が生じる枠を示す追加のカラム以外はプロファイルサーチ
についての出力ファイルと同一である。
【００８９】 スミス−ウォーターマンのアルゴリズム（ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ
（１９８１）、上述）を、照会から得られる１つの配列と、データベース中に含
まれる配列の群との類似性についての検索に使用する。Ｅスコア値、並びにＨＸ
ＸＸＸＤ保存ペプチド配列およびＰＥＧのような他の配列情報は、関連版列を同
定するのに使用される。保存ペプチド配列情報を使用することによって、Ｅ−１
２およびＥ−８より大きなＥスコア値が考えられる。例えば、元来ＡＴＡＴ２を
同定するのに使用されるＥＳＴ配列は、０．００９４のＥスコアを示した一方で
、元来ＡＴＬＰＡＡＴ１を同定するのに使用されるＥＳＴ配列は、０．０８６８
のＥスコアを示した。
（１９８１）、上述）を、照会から得られる１つの配列と、データベース中に含
まれる配列の群との類似性についての検索に使用する。Ｅスコア値、並びにＨＸ
ＸＸＸＤ保存ペプチド配列およびＰＥＧのような他の配列情報は、関連版列を同
定するのに使用される。保存ペプチド配列情報を使用することによって、Ｅ−１
２およびＥ−８より大きなＥスコア値が考えられる。例えば、元来ＡＴＡＴ２を
同定するのに使用されるＥＳＴ配列は、０．００９４のＥスコアを示した一方で
、元来ＡＴＬＰＡＡＴ１を同定するのに使用されるＥＳＴ配列は、０．０８６８
のＥスコアを示した。
【００９０】 イー．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）から得られるグリセロール−３−ホスフェートの
タンパク質配列（スイス・プロット受託Ｐ００４８２）が、ＢＬＡＳＴを使用し
てＮＣＢＩ非余分タンパク質データベースを検索するために使用される。調査の
最初の周期では、Ｇ３ＰＡＡＴの他の膜形態は同一である。連続ＰＳＩ−ＢＬＡ
ＳＴ検索（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２５巻
：３３８９−３４０２頁（１９９７年））で、ＬＰＡＡＴおよび他のアシルトラ
ンスフェラーゼを同定する。配列順ソフトウエア・プログラムを使用して、Ｇ３
ＰＡＡＴおよび異なるＬＰＡＡＴアミノ酸配列を並べ、そしてイー．コリ配列の
プロファイルをアミノ酸２５６および４５９の間の相同性配列領域を使用して作
られる。
タンパク質配列（スイス・プロット受託Ｐ００４８２）が、ＢＬＡＳＴを使用し
てＮＣＢＩ非余分タンパク質データベースを検索するために使用される。調査の
最初の周期では、Ｇ３ＰＡＡＴの他の膜形態は同一である。連続ＰＳＩ−ＢＬＡ
ＳＴ検索（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２５巻
：３３８９−３４０２頁（１９９７年））で、ＬＰＡＡＴおよび他のアシルトラ
ンスフェラーゼを同定する。配列順ソフトウエア・プログラムを使用して、Ｇ３
ＰＡＡＴおよび異なるＬＰＡＡＴアミノ酸配列を並べ、そしてイー．コリ配列の
プロファイルをアミノ酸２５６および４５９の間の相同性配列領域を使用して作
られる。
【００９１】 同定された２０４アミノ酸は、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを用いてタンパク質データ
ベースを照会するのに使用される。ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴの５回反復後、この新た
な照会（図１）から発生したプロファイルは、Ｇ３ＰＡＡＴの可溶性形態を同定
した。この同定の前に、膜と可溶性形態のＧ３ＰＡＡＴの間で配列相同性は、同
定されなかった。
ベースを照会するのに使用される。ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴの５回反復後、この新た
な照会（図１）から発生したプロファイルは、Ｇ３ＰＡＡＴの可溶性形態を同定
した。この同定の前に、膜と可溶性形態のＧ３ＰＡＡＴの間で配列相同性は、同
定されなかった。
【００９２】 実施例３：ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴプロファイルの削除 ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを使用して照会から得られたプロファイルは、ハイパーテ
キスト記述言語（ｈｔｍｌ）ファイルから削除される。ｎｅｂｉでｐｓｉｂｌａ
ｓｔに対するワールドワイドウエブ（ｗｗｗ）ｈｔｍｌインターフェースは、ｐ
ｓｉｂｌａｓｔの各反復の後に戻されるｈｔｍｌファイルで隠されたフィールド
で最近生成されたプロファイルマトリックスを保存する。しかし、このマトリッ
クスは、ｈｔｍｌを通しての変換の容易さのためのストリング６２（ｓ６２）フ
ォーマットにコードされた。ストリング６２フォーマットは、ｈｔｍｌ法定アス
キー文字にマトリックスへの値の簡便な変換である。
キスト記述言語（ｈｔｍｌ）ファイルから削除される。ｎｅｂｉでｐｓｉｂｌａ
ｓｔに対するワールドワイドウエブ（ｗｗｗ）ｈｔｍｌインターフェースは、ｐ
ｓｉｂｌａｓｔの各反復の後に戻されるｈｔｍｌファイルで隠されたフィールド
で最近生成されたプロファイルマトリックスを保存する。しかし、このマトリッ
クスは、ｈｔｍｌを通しての変換の容易さのためのストリング６２（ｓ６２）フ
ォーマットにコードされた。ストリング６２フォーマットは、ｈｔｍｌ法定アス
キー文字にマトリックスへの値の簡便な変換である。
【００９３】 コード化マトリックスの幅（ｘ軸）は、２６文字であり、そして共通文字を包
含する。Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、
Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｘ、Ｙ、Ｚの順の（ＢがＤおよびＮを表し、そしてＺは、Ｑお
よびＥを表し、そしてＸは、任意のアミノ酸を表す）アミノ酸、ｇａｐ作製値、
およびｇａｐ伸長値の可能性である。
含する。Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、
Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｘ、Ｙ、Ｚの順の（ＢがＤおよびＮを表し、そしてＺは、Ｑお
よびＥを表し、そしてＸは、任意のアミノ酸を表す）アミノ酸、ｇａｐ作製値、
およびｇａｐ伸長値の可能性である。
【００９４】 マトリックスの長さ（ｙ軸）は、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴによって同定された配列
の長さに対応する。アミノ酸の順は、マトリックスの頂上にＮ末端で、ＰＳＩ−
ＢＬＡＳＴによって同定された保存アミノ酸配列に対応する。その位置で他のア
ミノ酸の可能性は、個々の単独の文字アミノ酸略号の下に、ｘ軸にそって各アミ
ノ酸について表される。
の長さに対応する。アミノ酸の順は、マトリックスの頂上にＮ末端で、ＰＳＩ−
ＢＬＡＳＴによって同定された保存アミノ酸配列に対応する。その位置で他のア
ミノ酸の可能性は、個々の単独の文字アミノ酸略号の下に、ｘ軸にそって各アミ
ノ酸について表される。
【００９５】 したがって、プロファイルの各列は、配列マトリックスでその位置に最高スコ
ア（共通）アミノ酸、続いて各々の可能なアミノ酸についてのスコア、その位置
でｇａｐを開放するスコア、およびその位置でｇａｐを継続するスコアから構成
される。
ア（共通）アミノ酸、続いて各々の可能なアミノ酸についてのスコア、その位置
でｇａｐを開放するスコア、およびその位置でｇａｐを継続するスコアから構成
される。
【００９６】 ストリング６２ファイルは、連続調査にしようするためのプロファイルに戻っ
て変換される。ｇａｐ開放フィールドは、１１に設定され、そしてｇａｐ延長フ
ィールドはｘ軸に沿って１に設定される。ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴアルゴリズムに付
与された設定に基づいたｇａｐ作製およびｇａｐ削除の値が、知られている。マ
トリックスは、標準ＧＣＧプロファイル形態に変換される。このフォーマットは
、ジーンウエブ（ＧｅｎＷｅｂ）によって読み取ることができる。
て変換される。ｇａｐ開放フィールドは、１１に設定され、そしてｇａｐ延長フ
ィールドはｘ軸に沿って１に設定される。ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴアルゴリズムに付
与された設定に基づいたｇａｐ作製およびｇａｐ削除の値が、知られている。マ
トリックスは、標準ＧＣＧプロファイル形態に変換される。このフォーマットは
、ジーンウエブ（ＧｅｎＷｅｂ）によって読み取ることができる。
【００９７】 ストリング６２フォーマットしたファイルを、マトリックスに変換するために
使用されたアルゴリズムは、表１に概略される。
使用されたアルゴリズムは、表１に概略される。
【００９８】
【表１】
【００９９】 実施例４：新規アシルトランスフェラーゼ関連アミノ酸配列の同定 プロファイル（図１）は、新規アシルトランスフェラーゼとして酵母から多数
の今までに未同定のタンパク質を同定する別の照合に使用される。タンパク質は
、アラビドプシスタンパク質配列データベース（ＡＴＡＴ１）（配列番号２）か
ら同定される。配列は、核酸データベースからも同定される（表２）。
の今までに未同定のタンパク質を同定する別の照合に使用される。タンパク質は
、アラビドプシスタンパク質配列データベース（ＡＴＡＴ１）（配列番号２）か
ら同定される。配列は、核酸データベースからも同定される（表２）。
【０１００】
【表２】
【０１０１】 表２では、ｇｉ番号は、データベースの識別子であり、中段は、ＮＣＢＩ Ｎ
Ｒタンパク質データベースのＢＬＡＳＴ検索の結果を示し、そしてログ可能性の
数は、任意選択によって引き起こされるこのようなマッチの可能性のログを表す
ことが示される。ＡＴＡＴ１タンパク質配列を含めたこれらのタンパク質は、Ｎ
ＣＢＩ ＮＲタンパク質データベースの本来のＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ調査を用いて
同定される。したがって、これらのタンパク質は、未同定活性を示す新規アシル
トランスフェラーゼ関連タンパク質である。
Ｒタンパク質データベースのＢＬＡＳＴ検索の結果を示し、そしてログ可能性の
数は、任意選択によって引き起こされるこのようなマッチの可能性のログを表す
ことが示される。ＡＴＡＴ１タンパク質配列を含めたこれらのタンパク質は、Ｎ
ＣＢＩ ＮＲタンパク質データベースの本来のＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ調査を用いて
同定される。したがって、これらのタンパク質は、未同定活性を示す新規アシル
トランスフェラーゼ関連タンパク質である。
【０１０２】 ここでＡＴＡＴ１と称されるアラビドプシス（シロイヌナズナ）のアシルトラ
ンスフェラーゼ配列も、ＮＣＢＩ ＮＲタンパク質データベースの本来のＰＳＩ
−ＢＬＡＳＴ調査を用いて同定され、そして注釈付き機能を示さなかった。
ンスフェラーゼ配列も、ＮＣＢＩ ＮＲタンパク質データベースの本来のＰＳＩ
−ＢＬＡＳＴ調査を用いて同定され、そして注釈付き機能を示さなかった。
【０１０３】 アシルトランスフェラーゼに関連した別のアラビドプシスのアミノ酸配列は、
データベースから同定され、そしてＡＴＡＴ２ｅｓｔ、ＡＴＡＴ３ｅｓｔ、ＡＴ
ＡＴ４ｅｓｔ、ＡＴＡＴ５ｅｓｔ、ＡＴＡＴ６ｅｓｔ、ＡＴＡＴ７ｅｓｔ、ＡＴ
ＡＴ８ｅｓｔ、ＡＴＡＴ９、ＡＴＡＴ１０、およびＡＴＡＴ１１ｅｓｔに該当す
る。さらに、公知リソホスアチジル酸に配列類似性を示すアラビドプシスのアミ
ノ酸配列が同定され、ＡＴＬＰＡＡＴ１に該当する。ＡＴＡＴ９およびＡＴＡＴ
１０の配列は、ゲノム配列としてデータベースから同定される。全ての他のアラ
ビドプシス配列がＥＳＴとして同定される。
データベースから同定され、そしてＡＴＡＴ２ｅｓｔ、ＡＴＡＴ３ｅｓｔ、ＡＴ
ＡＴ４ｅｓｔ、ＡＴＡＴ５ｅｓｔ、ＡＴＡＴ６ｅｓｔ、ＡＴＡＴ７ｅｓｔ、ＡＴ
ＡＴ８ｅｓｔ、ＡＴＡＴ９、ＡＴＡＴ１０、およびＡＴＡＴ１１ｅｓｔに該当す
る。さらに、公知リソホスアチジル酸に配列類似性を示すアラビドプシスのアミ
ノ酸配列が同定され、ＡＴＬＰＡＡＴ１に該当する。ＡＴＡＴ９およびＡＴＡＴ
１０の配列は、ゲノム配列としてデータベースから同定される。全ての他のアラ
ビドプシス配列がＥＳＴとして同定される。
【０１０４】 実施例５：新規アシルトランスフェラーゼの配列分析 アラビドプシスのアシルトランスフェラーゼ配列に対応する全コーディング領
域を得るために、合成オリゴヌクレオチドタンパク質を、アシルトランスフェラ
ーゼ関連配列を含む部分的ｃＤＮＡクローンの５’および３’末端を増幅するよ
うに設計する。プライマーを、個々のアラビドプシスのアシルトランスフェラー
ゼ関連配列（表３）に従って設計し、そしてマラソンのｃＤＮＡ増幅キット（ク
ローンテック・ラボラトリーズ・インク．、カリフォルニア州パロアルト）を用
いて、ｃＤＮＡ末端（ＲＡＣＥ）反応の高速増幅に使用する（Ｆｒｏｈｍａｎら
、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５巻：８９９８−９００
２（１９８８年））。Ｒ指定を示すプライマーを、５’ＲＡＣＥ反応に使用し、
そしてＦ指定を示すプライマーを、３’ＲＡＣＥ反応に使用する。
域を得るために、合成オリゴヌクレオチドタンパク質を、アシルトランスフェラ
ーゼ関連配列を含む部分的ｃＤＮＡクローンの５’および３’末端を増幅するよ
うに設計する。プライマーを、個々のアラビドプシスのアシルトランスフェラー
ゼ関連配列（表３）に従って設計し、そしてマラソンのｃＤＮＡ増幅キット（ク
ローンテック・ラボラトリーズ・インク．、カリフォルニア州パロアルト）を用
いて、ｃＤＮＡ末端（ＲＡＣＥ）反応の高速増幅に使用する（Ｆｒｏｈｍａｎら
、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５巻：８９９８−９００
２（１９８８年））。Ｒ指定を示すプライマーを、５’ＲＡＣＥ反応に使用し、
そしてＦ指定を示すプライマーを、３’ＲＡＣＥ反応に使用する。
【０１０５】
【表３】
【０１０６】 ＲＡＣＥ反応から得られる核酸配列から、タンパク質配列が、マックベクター
ソフトウエアを用いて各核酸配列について推定される。核酸配列に、それぞれ、
ＡＴＡＴ１（配列番号１）、ＡＴＡＴ２（配列番号３）、ＡＴＡＴ３（配列番号
５）、ＡＴＡＴ４（配列番号７）、ＡＴＡＴ５（配列番号９）、ＡＴＡＴ６（配
列番号１０）、ＡＴＡＴ７（配列番号１２）、ＡＴＡＴ８（配列番号１４）、Ａ
ＴＡＴ９（配列番号１６）、ＡＴＡＴ１０（配列番号１８）、ＡＴＡＴ１１（配
列番号２０）、およびＡＴＬＰＡＡＴ１（配列番号２２）が提供される。
ソフトウエアを用いて各核酸配列について推定される。核酸配列に、それぞれ、
ＡＴＡＴ１（配列番号１）、ＡＴＡＴ２（配列番号３）、ＡＴＡＴ３（配列番号
５）、ＡＴＡＴ４（配列番号７）、ＡＴＡＴ５（配列番号９）、ＡＴＡＴ６（配
列番号１０）、ＡＴＡＴ７（配列番号１２）、ＡＴＡＴ８（配列番号１４）、Ａ
ＴＡＴ９（配列番号１６）、ＡＴＡＴ１０（配列番号１８）、ＡＴＡＴ１１（配
列番号２０）、およびＡＴＬＰＡＡＴ１（配列番号２２）が提供される。
【０１０７】 アラビドプシスから得られるＡＴＡＴ１（配列番号２）核酸配列に由来するタ
ンパク質配列は、３２．ｋＤａの推定分子質量、そして９．７４のＰＩを示す。
数種のＬＰＡＡＴおよびＧ３ＰＡＡＴを有するアラビドプシスのアシルトランス
フェラーゼの配列は、ＬＰＡＡＴおよびＧ３ＰＡＡＴの間で観察される数種のド
メインが、新たなアラビドプシスのアシルトランスフェラーゼタンパク質で保存
されることを示す。
ンパク質配列は、３２．ｋＤａの推定分子質量、そして９．７４のＰＩを示す。
数種のＬＰＡＡＴおよびＧ３ＰＡＡＴを有するアラビドプシスのアシルトランス
フェラーゼの配列は、ＬＰＡＡＴおよびＧ３ＰＡＡＴの間で観察される数種のド
メインが、新たなアラビドプシスのアシルトランスフェラーゼタンパク質で保存
されることを示す。
【０１０８】 ＡＴＡＴ２核酸配列は、３４．６ｋＤの分子量および９．９９のｐＩを示す３
１２アミノ酸タンパク質（配列番号４）をコードすることが推定される。ＡＴＡ
Ｔ２タンパク質は、２から３個の膜貫通ドメインをも含みうる。しかし、ＡＴＡ
Ｔ２核酸配列によってコードされるタンパク質は、使用されたＡＴＧ開始コドン
の上流に枠内の停止コドンの不在のため、推定されたものより長くなりうる。
１２アミノ酸タンパク質（配列番号４）をコードすることが推定される。ＡＴＡ
Ｔ２タンパク質は、２から３個の膜貫通ドメインをも含みうる。しかし、ＡＴＡ
Ｔ２核酸配列によってコードされるタンパク質は、使用されたＡＴＧ開始コドン
の上流に枠内の停止コドンの不在のため、推定されたものより長くなりうる。
【０１０９】 ＡＴＡＴ３核酸配列は、４４．７ｋＤの分子量および５．６２のｐＩを示す３
９８アミノ酸タンパク質（配列番号６）をコードすることが推定される。ＡＴＡ
Ｔ３タンパク質は、１から４個の膜貫通ドメインをも含みうる。ＡＴＡＴ４核酸
配列は、３６．５ｋＤの分子量および９．６７のｐＩを示す３１７アミノ酸タン
パク質（配列番号８）をコードすることが推定される。ＡＴＡＴ４タンパク質は
、２から５個の膜貫通ドメインを有することが推定される。
９８アミノ酸タンパク質（配列番号６）をコードすることが推定される。ＡＴＡ
Ｔ３タンパク質は、１から４個の膜貫通ドメインをも含みうる。ＡＴＡＴ４核酸
配列は、３６．５ｋＤの分子量および９．６７のｐＩを示す３１７アミノ酸タン
パク質（配列番号８）をコードすることが推定される。ＡＴＡＴ４タンパク質は
、２から５個の膜貫通ドメインを有することが推定される。
【０１１０】 ＡＴＬＰＡＡＴ１核酸配列は、４３．７ｋＤの分子量および９．５２のｐＩを
示す３８９アミノ酸タンパク質（配列番号２３）をコードすることが推定される
。ＡＴＬＰＡＡＴ１タンパク質は、３個までの膜貫通ドメインを含むと推定され
る。ＡＴＬＰＡＡＴ１核酸配列から推定されたタンパク質は、ブラシカ（Ｂｒａ
ｓｓｉｃａ）、トウモロコシおよびメドウフォーム（ｍｅａｄｏｗｆｏａｍ）（
ＰＣＴ公報ＷＯ９４／１３８１４号に記述）について報告されたＬＰＡＡＴに類
似する。ＡＴＡＴ１１核酸配列は、４３．５ｋＤの分子量および９．４５のｐＩ
を示す３７５アミノ酸タンパク質（配列番号２１）をコードすることが推定され
る。ＡＴＡＴ６（配列番号１１）、ＡＴＡＴ７（配列番号１３）、ＡＴＡＴ８（
配列番号１５）、ＡＴＡＴ９（配列番号１７）、およびＡＴＡＴ１０（配列番号
１９）の推定アミノ酸配列も提供される。
示す３８９アミノ酸タンパク質（配列番号２３）をコードすることが推定される
。ＡＴＬＰＡＡＴ１タンパク質は、３個までの膜貫通ドメインを含むと推定され
る。ＡＴＬＰＡＡＴ１核酸配列から推定されたタンパク質は、ブラシカ（Ｂｒａ
ｓｓｉｃａ）、トウモロコシおよびメドウフォーム（ｍｅａｄｏｗｆｏａｍ）（
ＰＣＴ公報ＷＯ９４／１３８１４号に記述）について報告されたＬＰＡＡＴに類
似する。ＡＴＡＴ１１核酸配列は、４３．５ｋＤの分子量および９．４５のｐＩ
を示す３７５アミノ酸タンパク質（配列番号２１）をコードすることが推定され
る。ＡＴＡＴ６（配列番号１１）、ＡＴＡＴ７（配列番号１３）、ＡＴＡＴ８（
配列番号１５）、ＡＴＡＴ９（配列番号１７）、およびＡＴＡＴ１０（配列番号
１９）の推定アミノ酸配列も提供される。
【０１１１】 ＡＴＡＴ１、ＡＴＡＴ２、ＡＴＡＴ３、ＡＴＡＴ４、ＡＴＡＴ６、ＡＴＡＴ７
、ＡＴＡＴ８、ＡＴＡＴ９、ＡＴＡＴ１０、ＡＴＬＰＡＡＴ１、およびＡＴＡＴ
１１の核酸配列から誘導された推定保存アミノ酸配列の保存アミノ酸配列ＨＸＸ
ＸＸＤ（ＨｅａｔｈおよびＲｏｃｋ、（１９９８年）、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ
．１８０巻（６）：１４２５−１４３０頁））、およびＰＥＧ（Ｎｅｕｗａｌｄ
（１９９７年）Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ．７巻：Ｒ４６５−Ｒ４６６頁）のおよそ３
０アミノ酸上流からおよそ１００アミノ酸下流までの配列領域は、リソホスチジ
ル酸アクリルタランスフェラーゼ（ボホバＡＴ（配列番号１６２、核酸配列は、
配列番号１６１で提供される）、トウモロコシＡＴ（ＰＣＴ公報ＷＯ９４／１３
８１４号）、ＰＬＳＣココ（ジーンバンク受託番号第１０９８６０５号）、ＰＬ
ＳＣリム（ジーンバンク受託番号第１２０９５０７号）、ＰＬＳＣイーコリ（ジ
ーンバンク受託番号第１２０９５０７号）、およびＰＬＳＣ酵母（ジーンバンク
受託番号第４６４４２２号）およびグリセロール−３−ホスフェート・アシルト
ランスフェラーゼ（ＰＬＳＢイー．コリ（ジーンバンク受託番号第１３０３２６
号）およびＰＬＳＢマウス（ジーンバンク受託番号第２４９８７８６号）（図２
）のアミノ酸配列に比較され、そして類似性が、同定される（図２および図３）
。
、ＡＴＡＴ８、ＡＴＡＴ９、ＡＴＡＴ１０、ＡＴＬＰＡＡＴ１、およびＡＴＡＴ
１１の核酸配列から誘導された推定保存アミノ酸配列の保存アミノ酸配列ＨＸＸ
ＸＸＤ（ＨｅａｔｈおよびＲｏｃｋ、（１９９８年）、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ
．１８０巻（６）：１４２５−１４３０頁））、およびＰＥＧ（Ｎｅｕｗａｌｄ
（１９９７年）Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ．７巻：Ｒ４６５−Ｒ４６６頁）のおよそ３
０アミノ酸上流からおよそ１００アミノ酸下流までの配列領域は、リソホスチジ
ル酸アクリルタランスフェラーゼ（ボホバＡＴ（配列番号１６２、核酸配列は、
配列番号１６１で提供される）、トウモロコシＡＴ（ＰＣＴ公報ＷＯ９４／１３
８１４号）、ＰＬＳＣココ（ジーンバンク受託番号第１０９８６０５号）、ＰＬ
ＳＣリム（ジーンバンク受託番号第１２０９５０７号）、ＰＬＳＣイーコリ（ジ
ーンバンク受託番号第１２０９５０７号）、およびＰＬＳＣ酵母（ジーンバンク
受託番号第４６４４２２号）およびグリセロール−３−ホスフェート・アシルト
ランスフェラーゼ（ＰＬＳＢイー．コリ（ジーンバンク受託番号第１３０３２６
号）およびＰＬＳＢマウス（ジーンバンク受託番号第２４９８７８６号）（図２
）のアミノ酸配列に比較され、そして類似性が、同定される（図２および図３）
。
【０１１２】 配列比較は、数種のクラスのアシルトランスフェラーゼが、図２での比較で同
定される保存アミノ酸配列に基づいて存在することを示す。例えば、ＡＴＡＴ１
、ＡＴＡＴ６、ＡＴＡＴ７、ＡＴＡＴ８、およびＡＴＡＴ９は、ＨＸＸＸＸＤお
よびＰＥＧ配列の間にＶＴＹＳＸＳ（配列番号１２８）、ＶＸＬＴＲＸＲ（配列
番号１２９）、ＬＸＸＧＤＬＶ（配列番号１３２）のアミノ酸配列を含む。さら
に、ＡＴＡＴ１、ＡＴＡＴ６、ＡＴＡＴ７、ＡＴＡＴ８、およびＡＴＡＴ９も、
ＰＥＧを包含するＣＰＥＧＴ（配列番号１３０）、並びにＰＥＧ配列の下流にＩ
ＶＰＶＡ（配列番号１３１）およびＶＡＮＸＸＱ（配列番号１３４）（図２）を
含む。ＡＴＡＴ１、ＡＴＡＴ７、およびＡＴＡＴ９に対応する配列は、ＡＴＡＴ
１およびＡＴＡＴ９の間に６７．０％の、ＡＴＡＴ１およびＡＴＡＴ７の間に５
８．２％の、そしてＡＴＡＴ９およびＡＴＡＴ７の間に６３．９％の類似性を示
しつつ、最も密接にこのクラスに関連する（図３Ｂ）。
定される保存アミノ酸配列に基づいて存在することを示す。例えば、ＡＴＡＴ１
、ＡＴＡＴ６、ＡＴＡＴ７、ＡＴＡＴ８、およびＡＴＡＴ９は、ＨＸＸＸＸＤお
よびＰＥＧ配列の間にＶＴＹＳＸＳ（配列番号１２８）、ＶＸＬＴＲＸＲ（配列
番号１２９）、ＬＸＸＧＤＬＶ（配列番号１３２）のアミノ酸配列を含む。さら
に、ＡＴＡＴ１、ＡＴＡＴ６、ＡＴＡＴ７、ＡＴＡＴ８、およびＡＴＡＴ９も、
ＰＥＧを包含するＣＰＥＧＴ（配列番号１３０）、並びにＰＥＧ配列の下流にＩ
ＶＰＶＡ（配列番号１３１）およびＶＡＮＸＸＱ（配列番号１３４）（図２）を
含む。ＡＴＡＴ１、ＡＴＡＴ７、およびＡＴＡＴ９に対応する配列は、ＡＴＡＴ
１およびＡＴＡＴ９の間に６７．０％の、ＡＴＡＴ１およびＡＴＡＴ７の間に５
８．２％の、そしてＡＴＡＴ９およびＡＴＡＴ７の間に６３．９％の類似性を示
しつつ、最も密接にこのクラスに関連する（図３Ｂ）。
【０１１３】 配列比較は、ＡＴＬＰＡＡＴ１の配列が、ボホバＬＰＡＡＴ（８２．３％類似
）およびトウモロコシ（７８．０％類似）に最も密接に関連することも示す。
）およびトウモロコシ（７８．０％類似）に最も密接に関連することも示す。
【０１１４】 さらに、配列分析は、ＡＴＡＴ４が、ＡＴＡＴ１０に最大の類似性（１８．５
％）を示す最高の分岐配列である。既知の配列に対する最大の類似性（１５．３
％）は、メドウフォーム（リムナンセス・ダグラシ（Ｌｉｍｎａｎｔｈｅｓ ｄ
ｏｕｇｌａｓｓｉ））ＬＰＡＡＴとのものである。しかし、ＡＴＡＴ４およびＡ
ＴＡＴ１０の配列は、ＡＴＡＴ２およびＡＴＡＴ３のアミノ酸と数種の保存ペプ
チド配列を共有し（図２）、ＶＸＮＨＸＳ（配列番号１２７）（Ｈは、ＨＸＸＸ
ＸＤ配列の保存Ｈを包含する）およびＰＥＧ配列の下流にＦＸＸＧＡＦ（配列番
号１３５）を共有する。
％）を示す最高の分岐配列である。既知の配列に対する最大の類似性（１５．３
％）は、メドウフォーム（リムナンセス・ダグラシ（Ｌｉｍｎａｎｔｈｅｓ ｄ
ｏｕｇｌａｓｓｉ））ＬＰＡＡＴとのものである。しかし、ＡＴＡＴ４およびＡ
ＴＡＴ１０の配列は、ＡＴＡＴ２およびＡＴＡＴ３のアミノ酸と数種の保存ペプ
チド配列を共有し（図２）、ＶＸＮＨＸＳ（配列番号１２７）（Ｈは、ＨＸＸＸ
ＸＤ配列の保存Ｈを包含する）およびＰＥＧ配列の下流にＦＸＸＧＡＦ（配列番
号１３５）を共有する。
【０１１５】 実施例６：別のアシルトランスフェラーゼ配列の同定 上で同定された新規アラビドプシス配列を、大豆およびトウモロコシＥＳＴ配
列を含む所有のデータベースを調査するのに使用する。この調査の結果は、アシ
ルトランスフェラーゼ関連タンパク質をコードするときに、大豆（配列番号２４
から配列番号８５）並びにコウモロコシ（配列番号８６から配列番号１２６）か
ら得たＥＳＴ配列を同定する。
列を含む所有のデータベースを調査するのに使用する。この調査の結果は、アシ
ルトランスフェラーゼ関連タンパク質をコードするときに、大豆（配列番号２４
から配列番号８５）並びにコウモロコシ（配列番号８６から配列番号１２６）か
ら得たＥＳＴ配列を同定する。
【０１１６】 種々のＥＳＴ配列と完全なアラビドプシス配列の間の配列比較は、同定したＥ
ＳＴ配列が、ＢＬＡＳＴスコアによって決定されるときに種々のアラビドプシス
配列とより高い類似性を示すことを表す。
ＳＴ配列が、ＢＬＡＳＴスコアによって決定されるときに種々のアラビドプシス
配列とより高い類似性を示すことを表す。
【０１１７】 大豆およびトウモロコシのデータベースから得られる発現配列Ｔａｇ（ＥＳＴ
）配列は、ＢＬＡＳＴスコアによってＡＴＡＴ１（それぞれ、配列番号２４−２
９および配列番号８６−８８）、ＡＴＡＴ２（それぞれ、配列番号３０および配
列番号８９）、ＡＴＡＴ３（それぞれ、配列番号３１−３５および配列番号９０
−９４）、ＡＴＡＴ４（それぞれ、配列番号３６−４４および配列番号９５−１
００）、ＡＴＡＴ６（それぞれ、配列番号４５−４９および配列番号１０１）、
ＡＴＡＴ７（それぞれ、配列番号５０−５４および配列番号１０２−１０３）、
ＡＴＡＴ８（それぞれ、配列番号５５−５６および配列番号１０４）、ＡＴＡＴ
９（それぞれ、配列番号５７−７９および配列番号１０５−１１１）、ＡＴＡＴ
１０（それぞれ、配列番号８０−８１および配列番号１１２）、ＡＴＡＴ１１（
それぞれ、配列番号８２−８５および配列番号１２３−１２６）、およびＡＴＬ
ＰＡＡＴ１（それぞれ、配列番号１１３−１２２）に最も親密に関連することが
確認される。
）配列は、ＢＬＡＳＴスコアによってＡＴＡＴ１（それぞれ、配列番号２４−２
９および配列番号８６−８８）、ＡＴＡＴ２（それぞれ、配列番号３０および配
列番号８９）、ＡＴＡＴ３（それぞれ、配列番号３１−３５および配列番号９０
−９４）、ＡＴＡＴ４（それぞれ、配列番号３６−４４および配列番号９５−１
００）、ＡＴＡＴ６（それぞれ、配列番号４５−４９および配列番号１０１）、
ＡＴＡＴ７（それぞれ、配列番号５０−５４および配列番号１０２−１０３）、
ＡＴＡＴ８（それぞれ、配列番号５５−５６および配列番号１０４）、ＡＴＡＴ
９（それぞれ、配列番号５７−７９および配列番号１０５−１１１）、ＡＴＡＴ
１０（それぞれ、配列番号８０−８１および配列番号１１２）、ＡＴＡＴ１１（
それぞれ、配列番号８２−８５および配列番号１２３−１２６）、およびＡＴＬ
ＰＡＡＴ１（それぞれ、配列番号１１３−１２２）に最も親密に関連することが
確認される。
【０１１８】 実施例７：発現構築物作製 一連の合成オリゴヌクレオチドプライマーを、上で同定された種々のアシルト
ランスフェラーゼ配列をコードする全ＤＮＡ配列を増幅するポリメラーゼ連鎖反
応（ＰＣＲ）で使用するために作製した。配列は、表３に列記される。
ランスフェラーゼ配列をコードする全ＤＮＡ配列を増幅するポリメラーゼ連鎖反
応（ＰＣＲ）で使用するために作製した。配列は、表３に列記される。
【０１１９】
【表４】
【０１２０】 上で表３に列記されたそれぞれのプライマーを使用して、各アシルトランスフ
ェラーゼ配列についての全コーディング領域を増幅させ、ベクターｐＣＲ２．１
トポ（インビトロゲン）またはｐゼロ（インビトロゲン）にクローニングし、そ
してｐＣＧＮ８５５８（ＡＴＡＴ１）、ｐＣＧＮ８５６４（ＡＴＡＴ２）、ｐＣ
ＧＢ８５６５（ＡＴＡＴ３）、ｐＣＧＮ８５６６（ＡＴＡＴ４）、ｐＣＧＮ８９
１８（ＡＴＡＴ６）、ｐＣＧＮ８９１３（ＡＴＡＴ７）、ｐＣＧＮ８９０４（Ａ
ＴＡＴ８）、ｐＣＧＮ９９７０（ＡＴＡＴ９）、ｐＣＧＮ９９４０（ＡＴＡＴ１
０）、ｐＣＧＮ８５６７（ＡＴＡＴ１１）、ｐＣＧＮ８６３２（ＡＴＬＰＡＡＴ
１）、ｐＣＧＮ９９０１（ｇｉ２１３２２９９とも呼ばれるＹＳＣＡＴ１）、ｐ
ＣＧＮ９９０２（ｇｉ１０７８５０９とも呼ばれるＹＳＣＡＴ２）、ｐＣＧＮ９
９０３（ｇｉ２１３２９３９とも呼ばれるＹＳＣＡＴ３）、ｐＣＧＮ９９０４（
ｇｉ２１３３０３１とも呼ばれるＹＳＣＡＴ４）、ｐＣＧＮ９９０５（ｇｉ３２
０７４８とも呼ばれるＹＳＣＡＴ５）、ｐＣＧＮ９９０６（ｇｉ５４９６２７と
も呼ばれるＹＳＣＡＴ６）、ｐＣＧＮ９９０７（ｇｉ５８６４８５とも呼ばれる
ＹＳＣＡＴ７）、およびｐＣＧＮ９９０８（ｇｉ４６４４２２とも呼ばれるＹＳ
ＣＡＴ８）として標識した。それぞれの酵母アシルトランスフェラーゼについて
の核酸配列に、ＹＳＣＡＴ１（配列番号２２５）、ＹＳＣＡＴ２（配列番号２２
６）、ＹＳＣＡＴ３（配列番号２２７）、ＹＳＣＡＴ４（配列番号２２８）、Ｙ
ＳＣＡＴ５（配列番号２２９）、ＹＳＣＡＴ６（配列番号２３０）、ＹＳＣＡＴ
７（配列番号２３１）、およびＹＳＣＡＴ８（配列番号２３２）を供する。
ェラーゼ配列についての全コーディング領域を増幅させ、ベクターｐＣＲ２．１
トポ（インビトロゲン）またはｐゼロ（インビトロゲン）にクローニングし、そ
してｐＣＧＮ８５５８（ＡＴＡＴ１）、ｐＣＧＮ８５６４（ＡＴＡＴ２）、ｐＣ
ＧＢ８５６５（ＡＴＡＴ３）、ｐＣＧＮ８５６６（ＡＴＡＴ４）、ｐＣＧＮ８９
１８（ＡＴＡＴ６）、ｐＣＧＮ８９１３（ＡＴＡＴ７）、ｐＣＧＮ８９０４（Ａ
ＴＡＴ８）、ｐＣＧＮ９９７０（ＡＴＡＴ９）、ｐＣＧＮ９９４０（ＡＴＡＴ１
０）、ｐＣＧＮ８５６７（ＡＴＡＴ１１）、ｐＣＧＮ８６３２（ＡＴＬＰＡＡＴ
１）、ｐＣＧＮ９９０１（ｇｉ２１３２２９９とも呼ばれるＹＳＣＡＴ１）、ｐ
ＣＧＮ９９０２（ｇｉ１０７８５０９とも呼ばれるＹＳＣＡＴ２）、ｐＣＧＮ９
９０３（ｇｉ２１３２９３９とも呼ばれるＹＳＣＡＴ３）、ｐＣＧＮ９９０４（
ｇｉ２１３３０３１とも呼ばれるＹＳＣＡＴ４）、ｐＣＧＮ９９０５（ｇｉ３２
０７４８とも呼ばれるＹＳＣＡＴ５）、ｐＣＧＮ９９０６（ｇｉ５４９６２７と
も呼ばれるＹＳＣＡＴ６）、ｐＣＧＮ９９０７（ｇｉ５８６４８５とも呼ばれる
ＹＳＣＡＴ７）、およびｐＣＧＮ９９０８（ｇｉ４６４４２２とも呼ばれるＹＳ
ＣＡＴ８）として標識した。それぞれの酵母アシルトランスフェラーゼについて
の核酸配列に、ＹＳＣＡＴ１（配列番号２２５）、ＹＳＣＡＴ２（配列番号２２
６）、ＹＳＣＡＴ３（配列番号２２７）、ＹＳＣＡＴ４（配列番号２２８）、Ｙ
ＳＣＡＴ５（配列番号２２９）、ＹＳＣＡＴ６（配列番号２３０）、ＹＳＣＡＴ
７（配列番号２３１）、およびＹＳＣＡＴ８（配列番号２３２）を供する。
【０１２１】 ７Ａ．バキュロウイルス発現構築物 培養昆虫細胞中のアラビドプシスＡＴＡＴ配列の発現をもたらす構築物を作製
する。ＡＴＡＴ１、２、３、４、６、７、８、９、１０および１１の全コーディ
ング領域は、ＮｏｔＩおよびＰｓｔＩで消化したベクターｐＦａｓｔＢａｃ１（
ギブコ−ビーアールエル（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）、メリーランド州ゲーサーズバ
ーグ）にクローニングする。それぞれのコーディング配列を、ＮｏｔＩ／Ｓｓｅ
８３８７１断片としてクローン化した。ＰＣＲ増幅によって誘導される誤差はな
いことを確認する二本鎖ＤＮＡ配列が得られた。得られたプラスミドは、ｐＣＧ
Ｎ９７２５（ＡＴＡＴ１）、ｐＣＧＮ９７２４（ＡＴＡＴ２）、ｐＣＧＢ９７２
５（ＡＴＡＴ３）、ｐＣＧＮ９７２６（ＡＴＡＴ４）、ｐＣＧＮ９７２７（ＡＴ
ＡＴ５）、ｐＣＧＮ９７２８（ＡＴＡＴ７）、ｐＣＧＮ９７２９（ＡＴＡＴ８）
、ｐＣＧＮ９９９１（ＡＴＡＴ９）、ｐＣＧＮ９７３０（ＡＴＡＴ１０）、ｐＣ
ＧＮ９７３１（ＡＴＡＴ１１）と命名された。
する。ＡＴＡＴ１、２、３、４、６、７、８、９、１０および１１の全コーディ
ング領域は、ＮｏｔＩおよびＰｓｔＩで消化したベクターｐＦａｓｔＢａｃ１（
ギブコ−ビーアールエル（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）、メリーランド州ゲーサーズバ
ーグ）にクローニングする。それぞれのコーディング配列を、ＮｏｔＩ／Ｓｓｅ
８３８７１断片としてクローン化した。ＰＣＲ増幅によって誘導される誤差はな
いことを確認する二本鎖ＤＮＡ配列が得られた。得られたプラスミドは、ｐＣＧ
Ｎ９７２５（ＡＴＡＴ１）、ｐＣＧＮ９７２４（ＡＴＡＴ２）、ｐＣＧＢ９７２
５（ＡＴＡＴ３）、ｐＣＧＮ９７２６（ＡＴＡＴ４）、ｐＣＧＮ９７２７（ＡＴ
ＡＴ５）、ｐＣＧＮ９７２８（ＡＴＡＴ７）、ｐＣＧＮ９７２９（ＡＴＡＴ８）
、ｐＣＧＮ９９９１（ＡＴＡＴ９）、ｐＣＧＮ９７３０（ＡＴＡＴ１０）、ｐＣ
ＧＮ９７３１（ＡＴＡＴ１１）と命名された。
【０１２２】 ７Ｂ．植物発現構築物作製 ｐＣＧＮ３２２３（米国特許番号第５，６３９，７９０号に記述され、その全
体は、参照してここに組込まれる）から誘導されるナピンカセットを含むプラス
ミドを、多制限部位を含む大型ＤＮＡ断片をクローニングするのにいっそう利用
し、そして植物の二つの形質転換ベクターへの多ナピン融合遺伝子のクローニン
グを可能にするように改変した。配列 ＣＧＣＧＡＴＴＴＡＡＡＴＧＧＣＧＣＧＣＣＣＴＧＣＡＧＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴ
ＧＣＡＧＧＧＣＧＣＧＣＣＡＴＴＴＡＡ（配列番号２３３）ＡＴの自己アニール
・オリゴヌクレオチドから構成されたアダプターを、制限エンドヌクレアーゼＢ
ｓｓＨＩＩで消化させた後、クローニングベクターｐＢＣＳＫ＋（ストラタジー
ン）に連結させて、ベクターｐＣＧＮ７７６５を構築した。プラスミドｐＣＧＮ
３２２３およびｐＣＧＮ７７６５を、ＮｏｔＩで消化し、そして一緒に連結した
。得られたベクターｐＣＧＮ７７７０は、ｐＣＧＮ３２２２３から得られたナピ
ン種子特異的発現カセットを有するｐＣＧＮ７７６５骨格を含む。
体は、参照してここに組込まれる）から誘導されるナピンカセットを含むプラス
ミドを、多制限部位を含む大型ＤＮＡ断片をクローニングするのにいっそう利用
し、そして植物の二つの形質転換ベクターへの多ナピン融合遺伝子のクローニン
グを可能にするように改変した。配列 ＣＧＣＧＡＴＴＴＡＡＡＴＧＧＣＧＣＧＣＣＣＴＧＣＡＧＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴ
ＧＣＡＧＧＧＣＧＣＧＣＣＡＴＴＴＡＡ（配列番号２３３）ＡＴの自己アニール
・オリゴヌクレオチドから構成されたアダプターを、制限エンドヌクレアーゼＢ
ｓｓＨＩＩで消化させた後、クローニングベクターｐＢＣＳＫ＋（ストラタジー
ン）に連結させて、ベクターｐＣＧＮ７７６５を構築した。プラスミドｐＣＧＮ
３２２３およびｐＣＧＮ７７６５を、ＮｏｔＩで消化し、そして一緒に連結した
。得られたベクターｐＣＧＮ７７７０は、ｐＣＧＮ３２２２３から得られたナピ
ン種子特異的発現カセットを有するｐＣＧＮ７７６５骨格を含む。
【０１２３】 ｐＣＧＮ７７７０のナピン制御領域以外は基本的にｐＣＧＮ７７７０と同じ制
御要素であるクローニングカセットｐＣＧＮ７７８７は、二重ＣＡＭＶ３５５プ
ロモーターおよびｔｍｌポリアデニル化および転写終止領域と置換された。
御要素であるクローニングカセットｐＣＧＮ７７８７は、二重ＣＡＭＶ３５５プ
ロモーターおよびｔｍｌポリアデニル化および転写終止領域と置換された。
【０１２４】 植物形質転換についての二重ベクターｐＣＧＮ５１３９を、ｐＣＧＮ１５５８
（ＭｃＢｒｉｄｅおよびＳｕｍｍｅｒｆｅｌｔ、（１９９０年）、Ｐｌａｎｔ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１４巻：２６９−２７６頁）から構築し
た。ｐＣＧＮ１５５８のポリリンカーを、ＨｉｎｄＩＩＩ／Ａｓｐ７１８断片と
して、特徴的制限エンドヌクレアーゼ部位、ＡｓｃＩ、ＰａｃＩ、ＸｂａＩ、Ｓ
ｗａＩ、ＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩを含むポリリンカーに置換した。Ａｓｐ７１
８およびＨｉｎｄＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼ部位は、ｐＣＧＮ５１３９で保
持される。
（ＭｃＢｒｉｄｅおよびＳｕｍｍｅｒｆｅｌｔ、（１９９０年）、Ｐｌａｎｔ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１４巻：２６９−２７６頁）から構築し
た。ｐＣＧＮ１５５８のポリリンカーを、ＨｉｎｄＩＩＩ／Ａｓｐ７１８断片と
して、特徴的制限エンドヌクレアーゼ部位、ＡｓｃＩ、ＰａｃＩ、ＸｂａＩ、Ｓ
ｗａＩ、ＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩを含むポリリンカーに置換した。Ａｓｐ７１
８およびＨｉｎｄＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼ部位は、ｐＣＧＮ５１３９で保
持される。
【０１２５】 転写性開始領域（プロモーター）および転写性終止領域を含む二重ベクターへ
のＤＮＡ配列の高速クローニングに備える一連のターボ二重ベクターを構築する
。
のＤＮＡ配列の高速クローニングに備える一連のターボ二重ベクターを構築する
。
【０１２６】
【化１】 を、ＳａｌＩ／ＸｈｏＩ消化したｐＣＧＮ７７７０に連結することによって、プ
ロモーターｐＣＧＮ８６１８を構築した。Ａｓｐ７１８Ｉで消化することによっ
て、ナピンプロモーター、ポリリンカーおよびナピン３’領域を含む断片を、ｐ
ＣＧＮ８６１８から切除した。５’オーバーハングにクレノー断片を充填するこ
とによって、断片を平滑末端にし、その後Ａｓｐ７１８ＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ
で消化しさらに５’オーバーハングにクレノー断片を充填することによって平滑
末端にしたｐＣＧＮ５１３９に連結した。ナピンプロモーターが、平滑にしたｐ
ＣＧＮ５１３９のＡｓｐ７１８Ｉ部位に最も近く、そしてナピン３’が、平滑Ｈ
ｉｎｄＩＩＩ部位に最も近い結果としてもたらされた挿入物を含むプラスミドを
、配列分析にかけて、挿入配向およびクローニング結合の取込の両方を確認した
。得られたプラスミドは、ｐＣＧＮ８６２２と命名された。
ロモーターｐＣＧＮ８６１８を構築した。Ａｓｐ７１８Ｉで消化することによっ
て、ナピンプロモーター、ポリリンカーおよびナピン３’領域を含む断片を、ｐ
ＣＧＮ８６１８から切除した。５’オーバーハングにクレノー断片を充填するこ
とによって、断片を平滑末端にし、その後Ａｓｐ７１８ＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ
で消化しさらに５’オーバーハングにクレノー断片を充填することによって平滑
末端にしたｐＣＧＮ５１３９に連結した。ナピンプロモーターが、平滑にしたｐ
ＣＧＮ５１３９のＡｓｐ７１８Ｉ部位に最も近く、そしてナピン３’が、平滑Ｈ
ｉｎｄＩＩＩ部位に最も近い結果としてもたらされた挿入物を含むプラスミドを
、配列分析にかけて、挿入配向およびクローニング結合の取込の両方を確認した
。得られたプラスミドは、ｐＣＧＮ８６２２と命名された。
【０１２７】
【化２】 をＳａｌＩ／ＸｈｏＩ消化したｐＣＧＮ７７７０に連結させることによって、プ
ラスミドｐＣＧＮ８６１９を構築した。ナピンプロモーター、ポリリンカーおよ
びナピン３’領域を含む断片を、Ａｓｐ７１８Ｉで消化することによって、ｐＣ
ＧＮ８６１９から除去した。５’オーバーハングにクレノー断片を充填すること
によって、断片を平滑末端にし、その後Ａｓｐ７１８ＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで
消化しさらに５’オーバーハングにクレノー断片を充填することによって平滑末
端にしたｐＣＧＮ５１３９に連結した。ナピンプロモーターが、ｐＣＧＮ５１３
９の平滑Ａｓｐ７１８Ｉ部位に最も近く、そしてナピン３’が、平滑ＨｉｎｄＩ
ＩＩ部位に最も近い結果としてもたらされた挿入物を含むプラスミドを、配列分
析にかけて、挿入配向およびクローニング結合の取込の両方を確認した。得られ
たプラスミドは、ｐＣＧＮ８６２３と命名された。
ラスミドｐＣＧＮ８６１９を構築した。ナピンプロモーター、ポリリンカーおよ
びナピン３’領域を含む断片を、Ａｓｐ７１８Ｉで消化することによって、ｐＣ
ＧＮ８６１９から除去した。５’オーバーハングにクレノー断片を充填すること
によって、断片を平滑末端にし、その後Ａｓｐ７１８ＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで
消化しさらに５’オーバーハングにクレノー断片を充填することによって平滑末
端にしたｐＣＧＮ５１３９に連結した。ナピンプロモーターが、ｐＣＧＮ５１３
９の平滑Ａｓｐ７１８Ｉ部位に最も近く、そしてナピン３’が、平滑ＨｉｎｄＩ
ＩＩ部位に最も近い結果としてもたらされた挿入物を含むプラスミドを、配列分
析にかけて、挿入配向およびクローニング結合の取込の両方を確認した。得られ
たプラスミドは、ｐＣＧＮ８６２３と命名された。
【０１２８】
【化３】 をＳａｌＩ／ＸｈｏＩ消化したｐＣＧＮ７７８７に連結することによって、プラ
スミドｐＣＧＮ８６２０を構築した。ｄ３５Ｓプロモーター、ポリリンカーおよ
びｔｍｌ３’領域を含む断片を、Ａｓｐ７１８Ｉでの完全消化およびＮｏｔＬで
の部分的消化によって、ｐＣＧＮ８６２０から除去した。５’オーバーハングに
クレノー断片を充填することによって、断片を平滑末端にし、その後Ａｓｐ７１
８ＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化しさらに５’オーバーハングにクレノー断片を
充填することによって平滑末端にしたｐＣＧＮ５１３９に連結した。ｄ３５Ｓプ
ロモーターが、ｐＣＧＮ５１３９の平滑Ａｓｐ７１８Ｉ部位に最も近く、そして
ｔｍｌ３’が、平滑ＨｉｎｄＩＩＩ部位に最も近い結果としてもたらされた挿入
物を含むプラスミドを、配列分析にかけて、挿入配向およびクローニング結合の
取込の両方を確認した。得られたプラスミドは、ｐＣＧＮ８６２４と命名された
。
スミドｐＣＧＮ８６２０を構築した。ｄ３５Ｓプロモーター、ポリリンカーおよ
びｔｍｌ３’領域を含む断片を、Ａｓｐ７１８Ｉでの完全消化およびＮｏｔＬで
の部分的消化によって、ｐＣＧＮ８６２０から除去した。５’オーバーハングに
クレノー断片を充填することによって、断片を平滑末端にし、その後Ａｓｐ７１
８ＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化しさらに５’オーバーハングにクレノー断片を
充填することによって平滑末端にしたｐＣＧＮ５１３９に連結した。ｄ３５Ｓプ
ロモーターが、ｐＣＧＮ５１３９の平滑Ａｓｐ７１８Ｉ部位に最も近く、そして
ｔｍｌ３’が、平滑ＨｉｎｄＩＩＩ部位に最も近い結果としてもたらされた挿入
物を含むプラスミドを、配列分析にかけて、挿入配向およびクローニング結合の
取込の両方を確認した。得られたプラスミドは、ｐＣＧＮ８６２４と命名された
。
【０１２９】
【化４】 をＳａｌＩ／ＸｈｏＩ消化したｐＣＧＮ７７８７に連結することによって、プラ
スミドｐＣＧＮ８６２１を構築した。ｄ３５Ｓプロモーター、ポリリンカーおよ
びｔｍｌ３’領域を含む断片を、Ａｓｐ７１８Ｉでの完全消化およびＮｏｔＬで
の部分的消化によって、ｐＣＧＮ８６２１から除去した。５’オーバーハングに
クレノー断片を充填することによって、断片を平滑末端にし、その後Ａｓｐ７１
８ＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化しさらに５’オーバーハングにクレノー断片を
充填することによって平滑末端にしたｐＣＧＮ５１３９に連結した。ｄ３５Ｓプ
ロモーターが、ｐＣＧＮ５１３９の平滑Ａｓｐ７１８Ｉ部位に最も近く、そして
ｔｍｌ３’が、平滑ＨｉｎｄＩＩＩ部位に最も近い結果としてもたらされた挿入
物を含むプラスミドを、配列分析にかけて、挿入配向およびクローニング結合の
取込の両方を確認した。得られたプラスミドは、ｐＣＧＮ８６２５と命名された
。
スミドｐＣＧＮ８６２１を構築した。ｄ３５Ｓプロモーター、ポリリンカーおよ
びｔｍｌ３’領域を含む断片を、Ａｓｐ７１８Ｉでの完全消化およびＮｏｔＬで
の部分的消化によって、ｐＣＧＮ８６２１から除去した。５’オーバーハングに
クレノー断片を充填することによって、断片を平滑末端にし、その後Ａｓｐ７１
８ＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化しさらに５’オーバーハングにクレノー断片を
充填することによって平滑末端にしたｐＣＧＮ５１３９に連結した。ｄ３５Ｓプ
ロモーターが、ｐＣＧＮ５１３９の平滑Ａｓｐ７１８Ｉ部位に最も近く、そして
ｔｍｌ３’が、平滑ＨｉｎｄＩＩＩ部位に最も近い結果としてもたらされた挿入
物を含むプラスミドを、配列分析にかけて、挿入配向およびクローニング結合の
取込の両方を確認した。得られたプラスミドは、ｐＣＧＮ８６２５と命名された
。
【０１３０】 種々のアシルトランスフェラーゼ配列のコーディング領域を、組織優勢プロモ
ーター、ナピンまたは３５Ｓプロモーターからセンスまたはアンチセンス配向で
の発現のために、ＮｏｔＩ／Ｓｓｅ８３８７Ｉ断片としてｐＣＧＮ８６２２、ｐ
ＣＧＮ８６２３、ｐＣＧＮ８６２４、およびｐＣＧＮ８６２５にクローン化した
。ｐＣＧＮ８６２２ベクターにクローン化した断片が、ナピンプロモーターから
のそれぞれのコーディング配列のセンス発現について構築物ｐＣＧＮ８９０１（
ＡＴＡＴ１）、ｐＣＧＮ８５７１（ＡＴＡＴ２）、ｐＣＧＮ８９０９（ＡＴＡＴ
３）、ｐＣＧＮ８５９６（ＡＴＡＴ４）、ｐＣＧＮ８９１９（ＡＴＡＴ６）、ｐ
ＣＧＮ８９１４（ＡＴＡＴ７）、ｐＣＧＮ８９０５（ＡＴＡＴ８）、ｐＣＧＮ９
９７３（ＡＴＡＴ９）、ｐＣＧＮ９９４２（ＡＴＡＴ１０）、ｐＣＧＮ８５７５
（ＡＴＡＴ１１）およびｐＣＧＮ８６３３（ＡＴＬＰＡＡＴ１）を作った。ｐＣ
ＧＮ８６２３ベクターにクローン化した断片が、ナピンプロモーターからのそれ
ぞれのコーディング配列のアンチセンス発現について構築物ｐＣＧＮ８９００（
ＡＴＡＴ１）、ｐＣＧＮ８５７２（ＡＴＡＴ２）、ｐＣＧＢ８９１０（ＡＴＡＴ
３）、ｐＣＧＮ８５９７（ＡＴＡＴ４）、ｐＣＧＮ８９２０（ＡＴＡＴ６）、ｐ
ＣＧＮ８９１５（ＡＴＡＴ７）、ｐＣＧＮ８９０６（ＡＴＡＴ８）、ｐＣＧＮ９
９７２（ＡＴＡＴ９）、ｐＣＧＮ９９４３（ＡＴＡＴ１０）、ｐＣＧＮ８５７６
（ＡＴＡＴ１１）およびｐＣＧＮ８６３４（ＡＴＬＰＡＡＴ１）を作った。ｐＣ
ＧＮ８６２４ベクターにクローン化した断片が、３５Ｓプロモーターからのそれ
ぞれのコーディング配列のセンス発現について構築物ｐＣＧＮ８９０３（ＡＴＡ
Ｔ１）、ｐＣＧＮ８５７３（ＡＴＡＴ２）、ｐＣＧＢ８９１１（ＡＴＡＴ３）、
ｐＣＧＮ８５９８（ＡＴＡＴ４）、ｐＣＧＮ８９２１（ＡＴＡＴ６）、ｐＣＧＮ
８９１６（ＡＴＡＴ７）、ｐＣＧＮ８９０７（ＡＴＡＴ８）、ｐＣＧＮ９９７１
（ＡＴＡＴ９）、ｐＣＧＮ９９４４（ＡＴＡＴ１０）、ｐＣＧＮ８５７７（ＡＴ
ＡＴ１１）およびｐＣＧＮ８６３５（ＡＴＬＰＡＡＴ１）を作った。ｐＣＧＮ８
６２５ベクターにクローン化した断片が、３５Ｓプロモーターからのそれぞれの
コーディング配列のアンチセンス発現について構築物ｐＣＧＮ８９０２（ＡＴＡ
Ｔ１）およびｐＣＧＮ９９７４（ＡＴＡＴ９）を作った。
ーター、ナピンまたは３５Ｓプロモーターからセンスまたはアンチセンス配向で
の発現のために、ＮｏｔＩ／Ｓｓｅ８３８７Ｉ断片としてｐＣＧＮ８６２２、ｐ
ＣＧＮ８６２３、ｐＣＧＮ８６２４、およびｐＣＧＮ８６２５にクローン化した
。ｐＣＧＮ８６２２ベクターにクローン化した断片が、ナピンプロモーターから
のそれぞれのコーディング配列のセンス発現について構築物ｐＣＧＮ８９０１（
ＡＴＡＴ１）、ｐＣＧＮ８５７１（ＡＴＡＴ２）、ｐＣＧＮ８９０９（ＡＴＡＴ
３）、ｐＣＧＮ８５９６（ＡＴＡＴ４）、ｐＣＧＮ８９１９（ＡＴＡＴ６）、ｐ
ＣＧＮ８９１４（ＡＴＡＴ７）、ｐＣＧＮ８９０５（ＡＴＡＴ８）、ｐＣＧＮ９
９７３（ＡＴＡＴ９）、ｐＣＧＮ９９４２（ＡＴＡＴ１０）、ｐＣＧＮ８５７５
（ＡＴＡＴ１１）およびｐＣＧＮ８６３３（ＡＴＬＰＡＡＴ１）を作った。ｐＣ
ＧＮ８６２３ベクターにクローン化した断片が、ナピンプロモーターからのそれ
ぞれのコーディング配列のアンチセンス発現について構築物ｐＣＧＮ８９００（
ＡＴＡＴ１）、ｐＣＧＮ８５７２（ＡＴＡＴ２）、ｐＣＧＢ８９１０（ＡＴＡＴ
３）、ｐＣＧＮ８５９７（ＡＴＡＴ４）、ｐＣＧＮ８９２０（ＡＴＡＴ６）、ｐ
ＣＧＮ８９１５（ＡＴＡＴ７）、ｐＣＧＮ８９０６（ＡＴＡＴ８）、ｐＣＧＮ９
９７２（ＡＴＡＴ９）、ｐＣＧＮ９９４３（ＡＴＡＴ１０）、ｐＣＧＮ８５７６
（ＡＴＡＴ１１）およびｐＣＧＮ８６３４（ＡＴＬＰＡＡＴ１）を作った。ｐＣ
ＧＮ８６２４ベクターにクローン化した断片が、３５Ｓプロモーターからのそれ
ぞれのコーディング配列のセンス発現について構築物ｐＣＧＮ８９０３（ＡＴＡ
Ｔ１）、ｐＣＧＮ８５７３（ＡＴＡＴ２）、ｐＣＧＢ８９１１（ＡＴＡＴ３）、
ｐＣＧＮ８５９８（ＡＴＡＴ４）、ｐＣＧＮ８９２１（ＡＴＡＴ６）、ｐＣＧＮ
８９１６（ＡＴＡＴ７）、ｐＣＧＮ８９０７（ＡＴＡＴ８）、ｐＣＧＮ９９７１
（ＡＴＡＴ９）、ｐＣＧＮ９９４４（ＡＴＡＴ１０）、ｐＣＧＮ８５７７（ＡＴ
ＡＴ１１）およびｐＣＧＮ８６３５（ＡＴＬＰＡＡＴ１）を作った。ｐＣＧＮ８
６２５ベクターにクローン化した断片が、３５Ｓプロモーターからのそれぞれの
コーディング配列のアンチセンス発現について構築物ｐＣＧＮ８９０２（ＡＴＡ
Ｔ１）およびｐＣＧＮ９９７４（ＡＴＡＴ９）を作った。
【０１３１】 さらに、酵母アシルトランスフェラーゼのコーディング配列を、ベクターｐＣ
ＧＮ８６２４にクローン化し、構築物ｐＣＧＮ９９２６（ＹＳＣＡＴ１）、ｐＣ
ＧＮ９９２７（ＹＳＣＡＴ２）、ｐＣＧＮ９９２８（ＹＳＣＡＴ３）、ｐＣＧＮ
９９２９（ＹＳＣＡＴ４）、ｐＣＧＮ９９３０（ＹＳＣＡＴ５）、ｐＣＧＮ９９
３１（ＹＳＣＡＴ６）、ｐＣＧＮ９９３２（ＹＳＣＡＴ７）およびｐＣＧＮ９９
３３（ＹＳＣＡＴ８）を作った。これらの構築物は、植物細胞中の３５Ｓプロモ
ーターからのそれぞれのアシルトランスフェラーゼのコーディング配列のセンス
発現に備える。
ＧＮ８６２４にクローン化し、構築物ｐＣＧＮ９９２６（ＹＳＣＡＴ１）、ｐＣ
ＧＮ９９２７（ＹＳＣＡＴ２）、ｐＣＧＮ９９２８（ＹＳＣＡＴ３）、ｐＣＧＮ
９９２９（ＹＳＣＡＴ４）、ｐＣＧＮ９９３０（ＹＳＣＡＴ５）、ｐＣＧＮ９９
３１（ＹＳＣＡＴ６）、ｐＣＧＮ９９３２（ＹＳＣＡＴ７）およびｐＣＧＮ９９
３３（ＹＳＣＡＴ８）を作った。これらの構築物は、植物細胞中の３５Ｓプロモ
ーターからのそれぞれのアシルトランスフェラーゼのコーディング配列のセンス
発現に備える。
【０１３２】 実施例８：植物形質転換 目的のＤＮＡ配列を、植物宿主のゲノムに挿入して、表現型変化を有効にする
配列の転写または転写と翻訳を得る多様な方法が、開発された。
配列の転写または転写と翻訳を得る多様な方法が、開発された。
【０１３３】 トランスジェニック・ブラシカ植物は、Ｒａｄｋｅら（Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ
．Ｇｅｎｅｔ（１９８８年）７５巻：６８５−６９４頁；Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ
Ｒｅｐｏｒｔｓ（１９９２年）１１巻：４９９−５０５頁）によって記述され
るとおりアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）依存性形質転換に
よって得られる。トランスジェニック・アラビドプシス・サリアナ植物は、Ｖａ
ｌｖｅｒｋｅｎｓら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９８８年）８
５巻：５５３６−５５４０頁）によって記述されるとおり、またはＢｅｎｔら（
（１９９４年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６５巻：１８５６−１８６０頁）によって
記述されるとおり、またはＢｅｃｈｔｏｌｄら（（１９９３年）、Ｃ．Ｒ．Ａｃ
ａｄ．Ａｃｉｄ．Ｓｃｉ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、３１６巻：１１９４−１
１９９頁）、またはＣｌｏｕｇｈら（（１９９８年）、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、１６
巻：７３５−４３頁）によって記述されるとおりにアグロバクテリウム依存性形
質転換によって得られる。他の植物種は、関連技術を使用して類似に形質転換さ
れうる。
．Ｇｅｎｅｔ（１９８８年）７５巻：６８５−６９４頁；Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ
Ｒｅｐｏｒｔｓ（１９９２年）１１巻：４９９−５０５頁）によって記述され
るとおりアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）依存性形質転換に
よって得られる。トランスジェニック・アラビドプシス・サリアナ植物は、Ｖａ
ｌｖｅｒｋｅｎｓら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９８８年）８
５巻：５５３６−５５４０頁）によって記述されるとおり、またはＢｅｎｔら（
（１９９４年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６５巻：１８５６−１８６０頁）によって
記述されるとおり、またはＢｅｃｈｔｏｌｄら（（１９９３年）、Ｃ．Ｒ．Ａｃ
ａｄ．Ａｃｉｄ．Ｓｃｉ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、３１６巻：１１９４−１
１９９頁）、またはＣｌｏｕｇｈら（（１９９８年）、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、１６
巻：７３５−４３頁）によって記述されるとおりにアグロバクテリウム依存性形
質転換によって得られる。他の植物種は、関連技術を使用して類似に形質転換さ
れうる。
【０１３４】 代替的に、Ｋｌｅｉｎら（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０巻：２８６−
２９１頁）によって記述されるとおりの微小突起起爆法も、核形質転換植物を得
るのに使用されうる。
２９１頁）によって記述されるとおりの微小突起起爆法も、核形質転換植物を得
るのに使用されうる。
【０１３５】 上の結果は、同定された核酸配列が、アシルトランスフェラーゼタンパク質を
コードするタンパク質配列に関連するタンパク質をコードすることを示す。この
ようなアシルトランスフェラーゼ配列は、植物形質転換のための発現構築物を作
成する上に用途を見出す。
コードするタンパク質配列に関連するタンパク質をコードすることを示す。この
ようなアシルトランスフェラーゼ配列は、植物形質転換のための発現構築物を作
成する上に用途を見出す。
【０１３６】 この明細書中に明記された全出版物および特許出願は、この発明が関与する業
界で当業者のレベルを示す。全出版物および特許出願は、各個別の出版物または
特許出願が、参照して組込まれるべきであると特にそして個別に示した場合と同
じ範囲まで参照してここに組込まれる。
界で当業者のレベルを示す。全出版物および特許出願は、各個別の出版物または
特許出願が、参照して組込まれるべきであると特にそして個別に示した場合と同
じ範囲まで参照してここに組込まれる。
【０１３７】 先述の発明は、明らかな理解のために例示および実施例の方法によってある程
度詳細に説明されたが、ある種の変化および改変が、付随の請求項の範囲内で実
施しうるということは明らかである。
度詳細に説明されたが、ある種の変化および改変が、付随の請求項の範囲内で実
施しうるということは明らかである。
【配列表】
【図１】 グリセロール−３−ホスフェートアシルトランスフェラーゼと各種リソホスフ
ァチジン酸アシルトランスフェラーゼのＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを用いる比較により
同定した２０４アミノ酸保存配列のプロフィールを示す。
ァチジン酸アシルトランスフェラーゼのＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを用いる比較により
同定した２０４アミノ酸保存配列のプロフィールを示す。
【図２】 アシルトランスフェラーゼ配列のアミノ酸配列アラインメントを示す。ここに
示したアラインメントは、保存配列ＨＸＸＸＸＤ中の保存Ｈの前約３０アミノ酸
からアシルトランスフェラーゼ様配列の保存ＰＥＧ配列モチーフ中のＰの後、す
なわち下流１００アミノ酸まで延びているタンパク質の領域を有する。
示したアラインメントは、保存配列ＨＸＸＸＸＤ中の保存Ｈの前約３０アミノ酸
からアシルトランスフェラーゼ様配列の保存ＰＥＧ配列モチーフ中のＰの後、す
なわち下流１００アミノ酸まで延びているタンパク質の領域を有する。
【図３】 同定されたアシルトランスフェラーゼの関係を示す概略図である。ここに記載
の関係は、保存配列ＨＸＸＸＸＤ中の保存Ｈの前約３０アミノ酸からアシルトラ
ンスフェラーゼ様配列の保存ＰＥＧ配列モチーフ中のＰの後、すなわち下流１０
０アミノ酸まで延びているタンパク質の領域のアラインメントから誘導される。
図３Ａは、数種のアシルトランスフェラーゼの関係を示す系統樹を示す。図３Ｂ
は、ＰＡＭ２５０残基量テーブルを用いるＣｌｕｓｔａｌ方法による新規アシル
トランスフェラーゼ及び公知アシルトランスフェラーゼの相似％及び発散％を示
す表である。
の関係は、保存配列ＨＸＸＸＸＤ中の保存Ｈの前約３０アミノ酸からアシルトラ
ンスフェラーゼ様配列の保存ＰＥＧ配列モチーフ中のＰの後、すなわち下流１０
０アミノ酸まで延びているタンパク質の領域のアラインメントから誘導される。
図３Ａは、数種のアシルトランスフェラーゼの関係を示す系統樹を示す。図３Ｂ
は、ＰＡＭ２５０残基量テーブルを用いるＣｌｕｓｔａｌ方法による新規アシル
トランスフェラーゼ及び公知アシルトランスフェラーゼの相似％及び発散％を示
す表である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ルージンスキー，ダイアン・エム アメリカ合衆国、カリフオルニア・95776、 ウツドランド、ボーン・ドライブ・849 (72)発明者 フアン・エーネンナーム，アリスン アメリカ合衆国、カリフオルニア・95616、 デイビス、バー・ストリート・856 Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD20 CA17 CA19 4B024 AA08 AA20 BA10 CA04 DA01 EA04 GA11 HA19 4B050 CC03 DD13 LL10 4B065 AA72Y AA88X AA88Y AB01 AC14 BA02 CA29 CA53 CA60
Claims (23)
- 【請求項１】 アシルトランスフェラーゼ様タンパク質クラスの酵素をコー
ドする単離ＤＮＡ配列であって、前記酵素は配列番号１２７（ＶｘＮＨｘＳ）（
式中、Ｈはアシルトランスフェラーゼ様タンパク質の保存ペプチド配列ＨＸＸＸ
ＸＤ中の保存ヒスチジン残基であり、ｘは任意のアミノ酸を表す）のアミノ酸配
列を含むことを特徴とする前記単離ＤＮＡ配列。 - 【請求項２】 アシルトランスフェラーゼ様タンパク質クラスの酵素をコー
ドする単離ＤＮＡ配列であって、前記酵素はアシルトランスフェラーゼ様タンパ
ク質の保存アミノ酸配列ＨＸＸＸＸＤから下流約３０アミノ酸内にある配列番号
１２８（ＶＴＹＳｘＳ）（式中、ｘは任意のアミノ酸を表す）のアミノ酸配列を
含むことを特徴とする前記単離ＤＮＡ配列。 - 【請求項３】 アシルトランスフェラーゼ様タンパク質クラスの酵素をコー
ドする単離ＤＮＡ配列であって、前記酵素はアシルトランスフェラーゼ様タンパ
ク質の保存アミノ酸配列ＨＸＸＸＸＤから下流約６０アミノ酸内にある配列番号
１２９（ＶｘＬＴＲｘＲ）（式中、ｘは任意のアミノ酸を表す）のアミノ酸配列
を含むことを特徴とする前記単離ＤＮＡ配列。 - 【請求項４】 アシルトランスフェラーゼ様タンパク質クラスの酵素をコー
ドする単離ＤＮＡ配列であって、前記酵素はアシルトランスフェラーゼ様タンパ
ク質の保存アミノ酸配列ＰＥＧから上流約２０アミノ酸内にある配列番号１３２
（ＬｘｘＧＤＬＶ）（式中、ｘは任意のアミノ酸を表す）のアミノ酸配列を含む
ことを特徴とする前記単離ＤＮＡ配列。 - 【請求項５】 アシルトランスフェラーゼ様タンパク質クラスの酵素をコー
ドする単離ＤＮＡ配列であって、前記酵素はアシルトランスフェラーゼ様タンパ
ク質の保存アミノ酸配列ＰＥＧを含む配列番号１３０（ＣＰＥＧＴ）のアミノ酸
配列を含むことを特徴とする前記単離ＤＮＡ配列。 - 【請求項６】 アシルトランスフェラーゼ様タンパク質クラスの酵素をコー
ドする単離ＤＮＡ配列であって、前記酵素はアシルトランスフェラーゼ様タンパ
ク質の保存アミノ酸配列ＰＥＧから下流約２０アミノ酸内にある配列番号１３３
（ＦｘｘＧＡＦ）（式中、ｘは任意のアミノ酸を表す）のアミノ酸配列を含むこ
とを特徴とする前記単離ＤＮＡ配列。 - 【請求項７】 アシルトランスフェラーゼ様タンパク質クラスの酵素をコー
ドする単離ＤＮＡ配列であって、前記酵素はアシルトランスフェラーゼ様タンパ
ク質の保存アミノ酸配列ＰＥＧから下流約４０アミノ酸内にある配列番号１３１
（ＩＶＰＶＡ）のアミノ酸配列を含むことを特徴とする前記単離ＤＮＡ配列。 - 【請求項８】 アシルトランスフェラーゼ様タンパク質クラスの酵素をコー
ドする単離ＤＮＡ配列であって、前記酵素はアシルトランスフェラーゼ様タンパ
ク質の保存アミノ酸配列ＰＥＧから下流約１１０アミノ酸内にある配列番号１３
４（ＶａＮｘｘＱ）（式中、ｘは任意のアミノ酸を表す）のアミノ酸配列を含む
ことを特徴とする前記単離ＤＮＡ配列。 - 【請求項９】 アシルトランスフェラーゼ様タンパク質クラスの酵素をコー
ドするＤＮＡ配列であって、前記ＤＮＡ配列は（ａ）図１のプロフィールを用い
て核酸配列データベースを検索するステップ、（ｂ）前記配列データベース中の
核酸配列の確率スコアをＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを用いて得
るステップ、及び（ｃ）約１未満の確率スコアを有する核酸配列を選択するステ
ップにより得られ得ることを特徴とする前記単離ＤＮＡ配列。 - 【請求項１０】 ＤＮＡ配列がコード配列であることを特徴とする請求の範
囲第９項に記載のＤＮＡコード配列。 - 【請求項１１】 ＤＮＡ配列がＥＳＴであることを特徴とする請求の範囲第
９項に記載のＤＮＡコード配列。 - 【請求項１２】 アシルトランスフェラーゼ様タンパク質が植物に由来する
ことを特徴とする請求の範囲第１項〜第１１項のいずれか１項に記載のＤＮＡコ
ード配列。 - 【請求項１３】 宿主細胞において機能する異種転写及び翻訳開始領域に結
合して請求の範囲第１項〜第１１項のいずれか１項に記載のＤＮＡコード配列を
含むことを特徴とする構築物。 - 【請求項１４】 宿主細胞が植物細胞であることを特徴とする請求の範囲第
１３項に記載の構築物。 - 【請求項１５】 請求の範囲第１３項に記載のＤＮＡ構築物を含むことを特
徴とする植物細胞。 - 【請求項１６】 請求の範囲第１５項に記載の細胞を含むことを特徴とする
植物。 - 【請求項１７】 アシルトランスフェラーゼ様タンパク質がシロイヌナズナ
（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）に由来することを特徴とする請
求の範囲第１項〜第１１項のいずれか１項に記載のＤＮＡコード配列。 - 【請求項１８】 アシルトランスフェラーゼ様タンパク質がトウモロコシに
由来することを特徴とする請求の範囲第１項〜第１１項のいずれか１項に記載の
ＤＮＡコード配列。 - 【請求項１９】 配列が配列番号８６〜配列番号１２６からなる群から選択
されるＥＳＴを含むことを特徴とする請求の範囲第１８項に記載のＤＮＡコード
配列。 - 【請求項２０】 アシルトランスフェラーゼ様タンパク質が大豆に由来する
ことを特徴とする請求の範囲第１項〜第１１項のいずれか１項に記載のＤＮＡコ
ード配列。 - 【請求項２１】 配列が配列番号２４〜配列番号８５からなる群から選択さ
れるＥＳＴを含むことを特徴とする請求の範囲第２０項に記載のＤＮＡコード配
列。 - 【請求項２２】 アシルトランスフェラーゼ様タンパク質が配列番号１、配
列番号１０、配列番号１２、配列番号１４及び配列番号１６からなる群から選択
されることを特徴とする請求の範囲第２項、第３項、第４項、第５項、第７項及
び第８項のいずれか１項に記載のＤＮＡコード配列。 - 【請求項２３】 アシルトランスフェラーゼ様タンパク質が配列番号３、配
列番号５、配列番号７及び配列番号１８からなる群から選択されることを特徴と
する請求の範囲第１項または第６項に記載のＤＮＡコード配列。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US10193998P | 1998-09-25 | 1998-09-25 | |
| US60/101,939 | 1998-09-25 | ||
| PCT/US1999/022231 WO2000018889A2 (en) | 1998-09-25 | 1999-09-24 | Sequenzes of putative plant acyltransferases |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002525105A true JP2002525105A (ja) | 2002-08-13 |
Family
ID=22287278
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000572337A Withdrawn JP2002525105A (ja) | 1998-09-25 | 1999-09-24 | 新規な植物アシルトランスフェラーゼ |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
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