JPH11509722A

JPH11509722A - Ｖ因子遺伝子の突然変異を同定する方法

Info

Publication number: JPH11509722A
Application number: JP8529520A
Authority: JP
Inventors: ジョンエイチグリフィン; ジュディースグリーンガード; ソフィーガンリール
Original assignee: Scripps Research Institute
Current assignee: Scripps Research Institute
Priority date: 1995-03-24
Filing date: 1996-03-22
Publication date: 1999-08-31
Also published as: EP0815262A4; AU5368596A; EP0815262A1; WO1996030546A1; CA2216239A1; US20030008307A1; AU718903B2; NO974385L; NO974385D0

Abstract

(57)【要約】活性プロテインＣ耐性を引き起こすＶ因子遺伝子突然変異を同定する方法であって、ヒトから単離した核酸試料においてアルギニン５０６のグルタミンによる置換と関連があるＶ因子遺伝子のエキソン１０のヌクレオチドの位置２０５にグアニンヌクレオチドからアデニンヌクレオチドへの変化として特徴づけられた遺伝子突然変異の存在を検出し、前記突然変異を同定する工程を含む方法。

Description

【発明の詳細な説明】Ｖ因子遺伝子の突然変異を同定する方法政府援助本発明は合衆国政府の援助により行われ、合衆国政府は国立予防衛生研究所受託研究HL31950及びHL21544に従って本発明の権利を所有する。技術分野本発明は、ヒトにおいて活性プロテインＣ（ＡＰＣ）耐性を引き起こす血液凝固Ｖ因子の対立遺伝子を検出する方法に関する。その対立遺伝子は、正常なＶ因子遺伝子のエキソン１０のヌクレオチドの位置２０５にグアニンヌクレオチドからアデニンヌクレオチドへの変化として特徴づけられた点突然変異である。エキソン１０点突然変異は、Ｖ因子ｃＤＮＡ配列のヌクレオチドの位置１６９１に対応する。発明の背景血液凝固反応及び血栓は、心臓血管疾患に主要な役割を果たしている。その疾患に対する増悪因子としては、遺伝性及び後天性双方の増悪因子が含まれる。比較的若い成人における静脈血栓疾患に対する増加傾向として定義された遺伝性血栓嗜好症の研究から、血栓を調節する因子が洞察される。遺伝性血栓嗜好症は、抗トロンビンＩＩＩ、プロテインＣ及びプロテインＳを含む抗トロンビン因子の分子欠損と関連があるとされてきた。しかしながら、それらの因子に関係する分子欠損は血栓嗜好症患者のわずか１０〜１５％にしか確認できなかった。従って、分子欠損は大多数の患者には確認されなかった(Glads onら，Thromb ．Haemost．59:18，1988; Allaartら，Lancet 341:134，1993; Hor ellouら，Br ．Med．J．289:1285，1984; Pabingerら，Thromb ．Res．Suppl．VI 136a，1986; Malmら，Thromb ．Haemost．68:7，1992; Ben-Talら，Thromb ．Haem ost． 61:50，1989）。血液凝固は、チモーゲン活性化の連鎖反応がトロンビンの生成及び引き続きフィブリノーゲンのフィブリンへの転換を生じる複雑な過程である(Furieら，Cell 33:505，1988; Davieら，Biochem ．30:10363，1991)。凝固速度は、正及び負のフィードバックル−プで調節される。正のフィードバックループの例では、凝固過程はトロンビンがＶ因子及びＶＩＩＩ因子を活性化してＶａ因子及びＶＩＩＩａ因子を形成する際に非常に促進する（Mannら，Annu ．Rev．Biochem．57:915， 1988; Kaneら，Blood 71:539，1988）。Ｖａ因子及びＶＩＩＩａ因子が血小板や内皮細胞上のリン脂質又はリン脂質小胞内のリン脂質と結合した場合には、各々プロトロンビン及びＸ因子の活性化に関係する。負のフィードバックループの例では、触媒量のトロンビンの存在下にプロテインＣ(E.C.3.4.21.69)が活性化されて活性プロテインＣ（ＡＰＣ）を形成する。次に、ＡＰＣはＣａ²¹及びリン脂質の存在下にタンパク質分解切断によりＶａ因子及びＶＩＩＩａ因子を不活性化する(Marlarら，Blood 59:1067，1982; Mannら，Annu ．Rev．Biochem．57:915， 1988; Esmonら，J ．Biol．Chem．264:4743，1989)。Ｖａ因子及びＶＩＩＩａ因子のＡＰＣによる不活性化により凝固過程が阻害される。最近、分子欠損が確認されなかった静脈血栓嗜好症の患者の２０〜５０％において、活性プロテインＣ（ＡＰＣ）耐性と呼ばれる症候群が記載された(Dahlbac kら，Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 90:1004，1993; Griffinら，Blood 82:1989 ，1993; Svenssonら，N ．Engl．J．Med．330:517，1994; Kosterら，Lancet 342 :1503，1993; Faioniら，Thromb ．Haemost．70:1067，1993)。ＡＰＣ耐性は、血漿中のＡＰＣに対する抗凝血剤応答が悪いとして特徴づけられ (Dahlbackら，Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 90:1004，1993)、罹患した家族における血栓症の恐れを分ける常染色体性優性形質である(Svenssonら，New Engl．J ．Med． 330:517，1994)。ＡＰＣ耐性は、通常、血栓嗜好症患者に対するＡＰＣの有無で求めた活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）を血栓嗜好症の家族歴のない対照被検者に対する結果と比べることにより評価された(Dahlbackら，Proc ．Natl．Acad．S ci．USA 90:1004-1008，1993)。ＡＰＣは、本明細書に記載される特定のタンパク質分解切断によりＶａ因子及びＶＩＩＩａ因子を不活性化することにより正常血漿におけるＡＰＴＴを延長する。ＡＰＣ耐性分析は、ＡＰＴＴのような凝血試験にＡＰＣを加えると通常はＡＰＴＴの増加（延長）が生じるが、ＡＰＣ耐性患者の血漿ではＡＰＣによる延長が正常な血漿に見られるものと比べて著しく低下するという事実に基づくものである。ＡＰＴＴ分析では、よくＡＰＣ感受性比と呼ばれるＡＰＣ耐性比が、ＡＰＣとＣａＣｌ₂の存在下の試験血漿の凝血時間をＣａＣｌ₂の存在下の試験血漿の凝血時間で割ったものとして求められる。典型的な条件下での試験血漿の場合、正常とみなされるＡＰＣ耐性比は男性では≧２.１９は、女性では≧１.９４である。正常な範囲は、さまざまな分析可変部分に左右される。更に、ＡＰＴＴは、血栓嗜好症の患者の血漿のＡＰＣ耐性がＡＰＣ基質、Ｖ因子及びＶＩＩＩ因子のいずれかでの異常によって引き起こされるかを評価するために用いられた。その分析では、患者の血漿か正常な血漿のいずれかをＶ因子欠乏血漿かＶＩＩＩ因子欠乏血漿のいずれかと混合し、ＡＰＴＴ分析による血漿の組合わせについてＡＰＣの影響を求める。ＡＰＣ耐性がＶ因子の異常による患者では、患者の血漿とＶ因子欠乏血漿と混合すると、正常な血漿とＶ因子欠乏血漿との混合物に比べてＡＰＣに対する耐性を示す混合物が生じる。しかしながら、ＡＰＣ耐性がＶ基質の異常による患者では、患者の血漿と因子ＶＩＩＩ欠乏血漿と混合すると、ＡＰＣ耐性についてＶＩＩＩ欠乏血漿と正常な血漿と混合したものと同じ結果を得る(Sunら，Blood 83:3120，1994)。また、Ｖ因子の異常によるＡＰＣ耐性が、精製した正常なＶ因子又はＡＰＣ耐性患者のＶ因子のＶ因子欠乏血漿への添加に続いてＡＰＣ耐性試験によるＡＰＴＴ分析で評価された(Sunら，Blood 83:3120，1994)。ＡＰＴＴ分析は血液凝固時間の評価に有効であるが、一致した及び再現性のある結果を得ることは数種の可変部分によって影響される。それらの可変部分としては、患者にワルファリン又はヘパリンのような経口抗凝血剤を投与すること(S evenssonら，N ．Engl．J．Med．33:517，1994)、血小板欠乏血漿の調製での血小板の活性化（Cooperら，Br ．J．Haematol．86(suppl．1):33(abstr)，1994）及び冷凍及び解凍血漿の使用（Girolamiら，Lancet 343:1288(本文)，1994; Jones ら，Br ．J．Haematol．86(suppl．1):32(abstr)，1994）が含まれる。血栓嗜好症患者はたいてい経口抗凝血剤（例えば、ワルファリン）で治療されるので、それらの患者のＡＰＣ耐性は標準ＡＰＴＴ分析で正確に評価されない (Dahlbackら，Proc ．Natl．Acad．Sci USA 90:1004，1993)。従って、それらの患者において本発明に記載されるようなＶａ因子の欠損によって生じるＡＰＣ耐性を分析する代替的方法は非常に望ましい。Ｖ因子は、分子量（Ｍｒ）３３０キロダルトン（ｋＤａ）の糖タンパク質である。Ｖ因子タンパク質は、アミノ末端重鎖領域、連結領域及びカルボキシ末端軽鎖領域からなる単鎖ポリペプチドである。Ｖ因子が凝固過程でアミノ酸の位置７０９、１０１８及び１５４５（Kaneら，Blood 71:539，1988; Suzukiら，J ．Bio l．Chem． 257:6556，1982; Esmon，J ．Biol．Chem．254:964，1979; Mannら，An nu ．Rev．Biochem． 57:915，1988）の３個のアルギニンアミノ酸残基でトロンビンによって切断されて活性状態のＶ因子（Ｖａ）となる場合、重鎖領域と軽鎖領域間から連結領域が除去されかつ得られた重鎖及び軽鎖からなる２つのポリペプチドがＣａ²⁺イオンによって共に保持される（Kaneら，Biochem ．26:6508，1987 ）。生じたＶａ因子のＡＰＣによるタンパク質分解不活性化には、通常、Ｖａ因子の膜表面への結合及びＶａ因子ポリペプチドの連続切断が必要である。最初は重鎖内の位置５０６のアミノ酸残基アルギニンを切断し、２番目は重鎖内の位置３０６のアミノ酸残基アルギニンを切断する(Kalafatisら，Blood 82:58a，1993; Kalafatisら，J ．Biol．Chem．268:27246，1993及びJ ．Biol．Chem．269:31869 ，1994)。不活性化過程は、Ｖａ因子軽鎖内の高親和性ＡＰＣ結合部位へのＡＰＣの結合を必要とするものである(Krishnaswamyら，J ．Biol．Chem．261:9684， 1986; Walkerら，J ．Biol．Chem．265:1484，1990)。Ｖａ因子軽鎖は、Ｃａ²⁺ 非依存方式で高親和性を有するリン脂質に結合し(Kaneら，Blood 71:539，1988; Mannら，Annu ．Rev．Biochem．57:915，1988)かつリン脂質表面上のＡＰＣとしっかりと会合する。例えば、Ｖａ因子に対するウシＡＰＣ：リン脂質の解離定数（Ｋｄ）は約７ナノモル／リットルである(Krishnaswamyら，J ．Biol．Chem．26 1:9684，1986)。小胞内のリン脂質ホスホチジルエタノールアミンの存在は、ＡＰＣ抗凝血剤活性及び精製Ｖａ因子のＡＰＣ不活性化を亢進することがわかった (Smirnovら，J ．Biol．Chem．269:816，1994)。ＡＰＣのＶａ因子への高親和性結合の重要性は、アミノ酸残基セリンが位置３６０のアミノ酸残基アラニンで置き換えられ、加水分解活性がなく、血液凝固分析及びプロトロンビナーゼ分析において約２０％の抗凝血剤活性を示すプロテインＣの活性部位変異体を示した最近の研究で証明された(Sunら，Blood 82 :148a，1993)。以前の研究から、Ｖ因子の生理的活性に関する翻訳後修飾硫酸化及びリン酸化の影響が調べられた。Kalafatisらは、Ｖ因子の硫酸化がトロンビンとＶ因子間の相互作用に影響し、Ｖ因子のトロンビンによる切断に働きかけてＶａ因子となると仮定した(Kalafatisら，Blood 81:704，1993及び91:1396，1994)。しかしながら、ＡＰＣ耐性患者では、Ｖａ因子となるＶ因子のトロンビンによる切断は正常な患者のものに匹敵し、ＡＰＣ耐性の原因とならない。Hortinは、部分的リン酸化Ｖａ因子が未変性Ｖａ因子より速い速度で不活性化されることを求め、ＡＰＣに対するＶａ因子切断の感受性がＶａ因子重鎖のアミノ酸残基位置６９０のセリンのリン酸化によって変えられるであろうことを示した(Hortin，Blood 76:94 6，1990)。硫酸化及びリン酸化のような翻訳後修飾は上記のようにＶａ因子と他の血清成分の相互作用に影響することができるが、それらの修飾は本発明におけるＡＰＣ耐性の原因とならない。また、ＡＰＣ補因子２と呼ばれるＶ因子と同時精製したＡＰＣに対して特徴のない補因子の欠損がＡＰＣ耐性に関与すること及びＡＰＣ耐性がＶ因子の抗凝血剤特性の選択欠損によって引き起こされることが仮定された（Dahlbackら，Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 90:1004，1993）。実際に、Dahlbackらは、正常なＶ因子のトロンビン処理がＶａ因子のＡＰＣ補因子２活性を破壊するためにＶａ因子がＡＰＣ補因子活性がないこと及び彼らが以前にはＡＰＣ耐性患者のＶａ因子がＡＰＣ耐性である可能性を除外していたことを述べた（Dahlbackら，Proc ．Natl ．Acad．Sci．USA 91:1396，1994）。 Sunらにより、ＡＰＣ耐性症候群に罹った２人の患者からのＶａ因子の部分的精製が記載され、精製したＶａ因子タンパク質がＡＰＣによる不活性化に対して耐性があることが証明された(Sunら，Blood 83:3120-3125，1994)。それらの２件の独立した報告はＶ因子が異常な補因子として働くか或いはＡＰＣ耐性患者においてはＶａ因子が異常であることを示しているが、各報告は血漿中のＶ因子と会合する分子内の異常又はKalafatis及びHortinによって示されたようにＶａ因子の翻訳後修飾によっても説明される。そこで、本発明は、上記の分析及び患者の分析的検討の観点からこれまで解決されなかったＡＰＣ耐性を分子に基づいて解決する。本発明の方法によって求められたＡＰＣ耐性の遺伝的根拠は、Ｖ因子遺伝子内の単一点突然変異にあり、その結果としてＶａ因子のＡＰＣによる正常な不活性化が遅れる。発明の要約本発明は、ヒトにおいて活性プロテインＣ（ＡＰＣ）に対する耐性を引き起こす新規な血液凝固Ｖ因子突然変異を検出するのに有用な方法、診断系及び組成物に関する。グアニンヌクレオチドからアデニンヌクレオチドへの変化として特徴づけられた点突然変異は、Ｖ因子遺伝子のエキソン１０のヌクレオチドの位置２０５にある。Ｖ因子遺伝子に由来するｃＤＮＡの点突然変異の対応する位置は、ヌクレオチドの位置１６９１にある。従って、１実施態様においては、ヒト遺伝子スクリーニング方法が企図される。本方法は、ヒトから単離した核酸試料についてＶ因子遺伝子のエキソン１０のヌクレオチドの位置２０５のグアニンヌクレオチドのアデニンヌクレオチドへの変化として特徴づけられたＶ因子遺伝子点突然変異の存在を分析する工程を含む。本方法は、また、Ｖ因子遺伝子を含む対立遺伝子の分析によって患者の遺伝子型の分析を可能にする。好適実施態様においては、本方法は、ヒトからのゲノムＤＮＡの試料を増幅条件下に、Ｖ因子遺伝子のエキソン１０にヌクレオチドの位置２０５を含むヒトゲノムＤＮＡの領域を増幅するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマー対で処理する工程を含む。ＰＣＲ処理によってエキソン１０の必要なヌクレオチドの位置２０５を含む増幅産物が生成し、次にそのヌクレオチドの位置のグアニンヌクレオチドのアデニンヌクレオチドへの変化の存在を分析する。Ｖ因子遺伝子を含む対立遺伝子において上記点突然変異の有無を求めるために患者からのゲノムＤＮＡをスクリーニングする１態様においては、ＰＣＲ増幅においてＰＣＲプライマー対が用いられ、第１プライマーは３′の非コーディング鎖のヌクレオチドの位置２０５の点突然変異までの位置のＶ因子遺伝子の非コーディング鎖に対してハイブリッド形成し、第２プライマーは３′のコーディング鎖のその位置までの位置のＶ因子遺伝子のコーディング鎖に対してハイブリッド形成する。本方法では、ＰＣＲプライマー対は点突然変異が増幅ＤＮＡに存在しない場合には制限エンドヌクレアーゼ部位を含む増幅産物を生成する。１実施態様においては、ゲノムＤＮＡ増幅産物について点突然変異の存在しないことを分析する工程はヌクレオチド配列決定によって達成される。他の実施態様においては、得られた増幅産物を分析する工程は、制限条件下で制限部位を認識しかつ点突然変異が存在しない場合には増幅産物を切断する制限エンドヌクレアーゼで処理することを含む。結果として、Ｖ因子遺伝子の正常な対立遺伝子と罹患した対立遺伝子間の制限消化パターンは、患者においてＶ因子遺伝子対立遺伝子のエキソン１０のヌクレオチドの位置２０５の点突然変異の有無を求めることを可能にする。本発明のプライマー対によって、点突然変異のない正常な対立遺伝子のＶ因子遺伝子の好ましい増幅ヌクレオチド領域は、5′-ACAGGC G AGG- 3′（配列番号６）に対応するヌクレオチド配列又はその断片を含む。エキソン１０のヌクレオチドの位置２０５に対応するグアニンヌクレオチドの存在は、正常な対立遺伝子に存在するＭｎｌＩ制限エンドヌクレアーゼ消化部位を与える。罹患した対立遺伝子のＶ因子遺伝子の対応する好ましい増幅ヌクレオチド領域は、5′-ACAGGC A AGG- 3′（配列番号７）に対応するヌクレオチド配列又はその断片の中の下線をひいた新しい点突然変異を含む。エキソン１０のヌクレオチドの位置２０５に対応するアデニンヌクレオチドの存在は、正常な対立遺伝子に存在するＭｎｌＩ制限エンドヌクレアーゼ消化部位を破壊する。エキソン１０にヌクレオチドの位置２０５を含むヌクレオチド領域を増幅する好ましいＰＣＲプライマー対は、ヌクレオチド配列5′-CATACTACAGTGACGTGGAC- 3′（配列番号４）及び5′-TGTTCTCTTGAAGGAAATGC- 3′（配列番号５）を有する各々第１及び第２プライマーを有する。プライマー対は、正常或いは罹患した対立遺伝子からのＶ因子遺伝子の領域の増幅を与える。正常な対立遺伝子では、得られた増幅ヌクレオチド領域は、実質的にエキソン１０のヌクレオチドの位置２０５にグアニンヌクレオチドを有する配列番号２に示されたヌクレオチド配列からなる。点突然変異を含む罹患した対立遺伝子では、増幅したヌクレオチド領域は、実質的にエキソン１０のヌクレオチドの位置２０５にアデニンヌクレオチドを有する配列番号３に示されたヌクレオチド配列からなる。後者の存在は、正常なＭｎｌＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を破壊する。従って、点突然変異の存在は、増幅したヌクレオチド領域のＶ因子ＤＮＡを消化する制限エンドヌクレアーゼＭｎｌＩの能力を破壊する。結果として、正常な対立遺伝子と罹患した対立遺伝子間の微分ＭｎｌＩ制限消化パターンが、ＡＰＣ耐性をもつ患者のＶ因子遺伝子対立遺伝子において点突然変異の存在を求めることを可能にする。患者からのゲノムＤＮＡをスクリーニングする別の態様においては、別の第１及び第２プライマーのＰＣＲプライマー対を用いて点突然変異が存在する場合に制限エンドヌクレアーゼ部位を含む増幅産物を生成する。点突然変異の存在の分析としては、ヌクレオチド配列決定、制限消化分析等が含まれる。点突然変異のある罹患した対立遺伝子のＶ因子遺伝子の得られた好ましい増幅ヌクレオチド領域は、ヌクレオチド配列5′-AAGCTT- 3′（配列番号２３）を含む。点突然変異のない正常な対立遺伝子のＶ因子遺伝子の対応する好ましい増幅ヌクレオチド領域は、ヌクレオチド配列5′-GAGCTT- 3′（配列番号２５）を含む。正常及び罹患対立遺伝子の上記ヌクレオチド配列を増幅するプライマー対の好ましい第１及び第２プライマーは、各々ヌクレオチド配列5′-CATACTACAGTGACGT GGAC- 3′（配列番号４）及び5′-TTACTTCAAGGACAAAATACCTGTAAAGCT- 3′（配列番号２４）を有する。実質的に配列番号１９に示された配列からなる、エキソン１０のヌクレオチドの位置２０５にアデニンヌクレオチドを有するかかる増幅した変異体対立遺伝子のヌクレオチド領域は、ＨｉｎｄＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼ消化部位を生成する。実質的に配列番号１８に示された配列からなる、グアニンヌクレオチドを有する正常な対立遺伝子から増幅した対応するヌクレオチド領域は、必要なＨｉｎｄＩＩＩ部位を含まない。従って、配列番号４及び２４のプライマー対で増幅したゲノムＤＮＡの微分ＨｉｎｄＩＩＩ制限消化パターンは、患者のゲノムＤＮＡから点突然変異の有無を決定する別法を与える。他の実施態様においては、Ｖ因子ｃＤＮＡのヌクレオチドの位置１６９１における遺伝子突然変異を同定するヒトからのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）をスクリーニングする方法が企図される。本方法は、ヒトからｍＲＮＡを単離する工程及びＤＮＡの相補鎖（ｃＤＮＡ）の合成に続いてＶ因子ｃＤＮＡのヌクレオチドの位置１６９１を含むヒトｃＤＮＡの領域を増幅するプライマー対でＰＣＲ処理する工程を含む。次に、得られた増幅したｃＤＮＡ産物について、ｃＤＮＡヌクレオチドの位置１６９１におけるグアニンヌクレオチドからアデニンヌクレオチドへの存在を分析して突然変異を同定する。増幅ゲノムＤＮＡとのように、ｃＤＮＡを増幅するためにＰＣＲ増幅においてＰＣＲプライマー対を用い、第１プライマーは３′の非コーディング鎖のヌクレオチドの位置２０５の点突然変異までの位置のＶ因子ｃＤＮＡの非コーディング鎖に対してハイブリッド形成し、第２プライマーは３′のコーディング鎖のその位置までの位置のＶ因子ｃＤＮＡのコーディング鎖に対してハイブリッド形成する。本方法においては、点突然変異が存在しない場合にはＰＣＲプライマー対は制限エンドヌクレアーゼ部位を含むｃＤＮＡ増幅産物を生成する。１実施態様においては、得られたｃＤＮＡ増幅産物はヌクレオチド配列決定により点突然変異の存在しないことを決定するために分析される。他の実施態様においては、得られたｃＤＮＡ増幅産物は、制限部位を認識しかつ点突然変異が存在しない場合にはｃＤＮＡ増幅産物を切断する制限エンドヌクレアーゼで処理される。結果として、正常な対立遺伝子と罹患した対立遺伝子間の制限消化パターンの差異が、ｃＤＮＡにおける点突然変異の有無の決定を可能にする。ｃＤＮＡを増幅するプライマー対によって、点突然変異のない正常な対立遺伝子のＶ因子遺伝子の好ましい増幅ヌクレオチド領域は、5′-ACAGGC G AGG- 3′ （配列番号６）に対応するヌクレオチド配列又はその断片を含む。ゲノムＤＮＡとのように、ｃＤＮＡのヌクレオチドの位置１６９１に対応するグアニンヌクレオチドの存在は、正常な対立遺伝子に存在するＭｎｌＩ制限エンドヌクレアーゼ消化部位を与える。ｃＤＮＡの対応する好ましい増幅ヌクレオチド領域は、5′-ACAGGC A AGG- 3 ′（配列番号７）に対応するヌクレオチド配列又はその断片を含む。ｃＤＮＡのヌクレオチドの位置１６９１に対応するアデニンヌクレオチドの存在は、正常なｃＤＮＡに存在するＭｎｌＩ制限エンドヌクレアーゼ消化部位を破壊する。Ｖ因子ｃＤＮＡのヌクレオチドの位置１６９１を含むヌクレオチド領域を増幅する好ましいＰＣＲプライマー対は、ヌクレオチド配列5′-CAGGAAAGGAAGCATGTT CC- 3′（配列番号１０）と5′-TGCCATTCTCCAGAGCTAGG- 3′（配列番号１１）を有する各々第１及び第２プライマーである。そのプライマー対は、正常或いは罹患ｃＤＮＡからのヌクレオチド領域の増幅を与える。正常なｃＤＮＡでは、実質的に配列番号２７に示されたヌクレオチド配列からなる、配列番号２７のヌクレオチド位置１６１４にグアニンヌクレオチドを有する得られた増幅ヌクレオチド領域はＶ因子ｃＤＮＡのヌクレオチドの位置１６９１に対応する。無傷Ｖ因子ｃＤＮＡの１６９１に比べて配列番号２７の１６１４にあるグアニンヌクレオチドのヌクレオチドの位置の違いの根拠は、配列番号２７に示された増幅ｃＤＮＡの番号をつける慣例から生じる。後者では、ヌクレオチドの位置１は配列番号１３及び図６Ａ及び図６Ｂの双方に示されたＶ因子ｃＤＮＡのヌクレオチドの位置７８に対応する。点突然変異を含むｃＤＮＡでは、増幅ヌクレオチド領域は、実質的にヌクレオチドの位置１６１４にアデニンを有する配列番号２８に示されたヌクレオチド配列からなり、無傷Ｖ因子ｃＤＮＡの１６９１に対応する。配列番号２７及び２８に示された各々正常及び変異体増幅ｃＤＮＡ産物は、ヌクレオチド配列決定によりグアニンのアデニンヌクレオチドへの点突然変異の有無を求めるために分析する好ましい産物である。Ｖ因子ｃＤＮＡのヌクレオチドの位置１６９１を含むヌクレオチド領域を増幅する他の好ましいＰＣＲプライマー対は、ヌクレオチド配列5′-CATACTACAGTGAC GTGGAC- 3′（配列番号４）及び5′-TGCTGTTCGATGTCTGCTGC- 3′（配列番号１２）を有する第１及び第２プライマーである。そのプライマー対は、正常或いは罹患ｃＤＮＡからの１２４塩基対の増幅を与える。正常なｃＤＮＡでは、得られた増幅ヌクレオチド領域は、ｃＤＮＡヌクレオチドの位置１６９１にグアニンヌクレオチドを有するヌクレオチドの位置１６０１からヌクレオチドの位置１７２４までの配列番号１３に示されたヌクレオチド配列からなる。点突然変異を含むｃＤＮＡでは、増幅ヌクレオチド領域は、実質的にその同じ位置にアデニンヌクレオチドを有するヌクレオチドの位置１６０１からヌクレオチドの位置１７２４までの配列番号２６に示されたヌクレオチド配列からなる。その部位のアデニンヌクレオチドの存在は、正常なＭｎｌＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を破壊する。そのように、配列番号１３及び２６に示された各々正常及び変異体増幅ｃＤＮＡ産物、共にヌクレオチドの位置１６０１〜１７２４は、ＭｎｌＩ制限消化によりグアニンからアデニンヌクレオチドへの点突然変異の有無を求めるために分析する好ましい産物である。従って、点突然変異の存在は、増幅ヌクレオチド領域のＶ因子ｃＤＮＡを消化するＭｎｌＩ制限エンドヌクレアーゼの能力を破壊する。ヌクレオチドの位置１６９１にアデニンヌクレオチドを有する本発明の方法によって生成された他の好ましいｃＤＮＡ増幅ヌクレオチド領域は、ヌクレオチドの位置９からヌクレオチドの位置６９１７までの配列番号２６に示されたＶ因子ｃＤＮＡ完全配列である。結果として、ゲノムＤＮＡをスクリーニングする本発明の方法とのように、ヌクレオチド配列分析及び正常なｃＤＮＡと罹患したｃＤＮＡ間の微分ＭｎｌＩ制限消化パターンは共に、ＡＰＣ耐性を有する患者からのｍＲＮＡにおいて点突然変異の存在を求めることを可能にする。患者のゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡの核酸試料において活性プロテインＣ耐性と関連があるエキソン１０のヌクレオチドの位置２０５におけるＶ因子遺伝子の遺伝子突然変異を検出するのに有用な診断キットも企図される。本キットは、Ｖ因子遺伝子のエキソン１０にヌクレオチドの位置２０５を含む増幅産物をＰＣＲにより生成することができる第１プライマー及び第２プライマーを含む１対のプライマーを少なくとも１回の分析を行うのに十分な量で含む。診断キットの１態様においては、プライマーは別々の容器に入っている。好ましいプライマー対としては、ゲノムＤＮＡ或いはｃＤＮＡを増幅する第１プライマー及び第２プライマーが含まれる。特に好ましいゲノムＤＮＡプライマー対は、配列番号４と５、及び配列番号４と２４に示された対のヌクレオチド配列である。特に好ましいｃＤＮＡプライマー対は、配列番号１０と１１、配列番号４と１２に示された対のヌクレオチド配列である。他の実施態様においては、診断キットは、更に、配列番号２、１８、１３（ヌクレオチドの位置１６０１〜１７２４）及び２７に示されたヌクレオチド配列を有する正常なＶ因子遺伝子に由来する対照のポリヌクレオチド配列を含む。本発明の診断キットは、更に、エキソン１０のヌクレオチドの位置２０５に遺伝子突然変異を有する変異体Ｖ因子遺伝子に由来する対照ポリヌクレオチド配列を含む。好ましい対照突然変異ポリヌクレオチド配列としては、配列番号３、１９、２６（ヌクレオチドの位置１６０１〜１７２４）及び２８に示された配列が含まれる。本発明は、また、エキソン１０のヌクレオチドの位置２０５に遺伝子突然変異を有するＶ因子遺伝子に由来する単離したポリヌクレオチド配列の組成物を提供する。好適実施態様においては、単離したポリヌクレオチド配列は長さが約１０ヌクレオチドから６９０９ヌクレオチドまでのヌクレオチド配列を含む。好ましいポリヌクレオチド配列としては、配列番号７及び２３に示されたヌクレオチド配列又はその断片を含む配列である。また、実質的に配列番号３、１９に示されたゲノムＤＮＡヌクレオチド配列からなる好ましいポリヌクレオチド配列と配列番号２８及び２６に示されたｃＤＮＡヌクレオチド配列との組成物も企図され、後者はヌクレオチドの位置９〜６９１７の大きな断片及びヌクレオチドの位置１６０１〜１７２４の小さな断片である。配列番号２６は、ヌクレオチドの位置１６９１にアデニンを有するＶ因子ｃＤＮＡ配列を含む。本発明の他の企図された組成物は、ヌクレオチドの位置２６からヌクレオチドの位置３１までの配列番号２４に示されたヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドプライマーである。好ましいプライマーは、エキソン１０のヌクレオチドの位置２０５にグアニンのアデニンへの点突然変異を有するＶ因子遺伝子にＨｉｎｄＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を含む増幅産物を生成することができる。好ましいポリヌクレオチドプライマーは、実質的に配列番号２４に示されたヌクレオチド配列からなる。図面の簡単な説明図１Ａ〜１Ｊの図１は、Ｖ因子ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号１３）及び対応するアミノ酸残基配列（配列番号１４）を示す配列である。完全ｃＤＮＡヌクレオチドとコード化アミノ酸残基配列を、実施例１Ｄに記載されたＡＰＣ耐性患者のｃＤＮＡに由来するヌクレオチド配列との比較のために示す。“１” と標識されたアミノ酸残基は、血漿タンパク質のアミノ末端アミノ酸残基に対応する。Ｖ因子の演繹アミノ酸残基配列は、２８アミノ酸残基リーダーペプチド、７０９アミノ酸残基重鎖領域、８３６アミノ酸残基連結領域及び６５０アミノ酸残基軽鎖領域を含む２２２４アミノ酸残基からなる。濃い垂直な下向きの矢印はリーダーペプチドの切断部位を示し、黒い丸は可能なＮ結合グリコシル化部位を示し、曲がった矢印はトロンビン切断部位を示す。アミノ酸配列決定により決定されたアミノ酸残基配列は、ヒトＶ因子から得られたアミノ酸残基配列の上にある実線及びウシＶ因子から得られたアミノ酸残基配列の上にあるダッシュ線で示される。ヌクレオチド配列のはじめのヌクレオチド配列5′-GAATTCCG- 3′（配列番号１３、ヌクレオチドの位置１からヌクレオチドの位置８まで）は、ｃＤＮＡライブラリーの調製で挿入されたリンカー配列に対応し、Ｖ因子ｃＤＮＡの一部ではない。しかしながら、慣例により、ヌクレオチドの位置が示される場合にリンカーのヌクレオチド配列に対応するヌクレオチドがｃＤＮＡ配列に含まれる(Jenny ら，Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 84:4846，1987)。従って、リンカー配列はヌクレオチドの位置１〜８に対応する。残りのヌクレオチドの位置の表示については配列番号１３を参照されたい。リンカーのヌクレオチド配列のすぐ次は、ヌクレオチドの位置９〜９０のＶ因子ｃＤＮＡの５′非翻訳領域の８２ヌクレオチドである。５′非翻訳領域のヌクレオチド配列の次は、ヌクレオチドの位置９１〜１７４のＶ因子ｃＤＮＡのリーダーペプチドをコード化する８４ヌクレオチドである。リーダーペプチドのヌクレオチド配列の次は、ヌクレオチドの位置１７５〜２３０１のＶ因子ｃＤＮＡの重鎖領域をコード化する２１２７ヌクレオチドである。重鎖領域のヌクレオチド配列の次は、ヌクレオチドの位置２３０２〜４８０９のＶ因子ｃＤＮＡの連結領域をコード化する２５０８ヌクレオチドである。連結領域のヌクレオチド配列の次は、ヌクレオチドの位置４８１０〜６７６２のＶ因子ｃＤＮＡの軽鎖領域をコード化する１９５０ヌクレオチドである。軽鎖領域のヌクレオチド配列の次は、ヌクレオチドの位置６７６３〜６９２５のＶ因子ｃＤＮＡの３′非翻訳領域の１６３ヌクレオチドである。３′非翻訳領域としては、ポリ（Ａ）テイルの１２ヌクレオチド上流に位置した推定ポリアデニル化シグナル配列5′-AATAAA- 3′（配列番号１３、ヌクレオチドの位置６８９３からヌクレオチドの位置６８９８まで）が含まれる。ポリ（Ａ）テイルは、ヌクレオチド配列5′-AAAAAAA-3′のヌクレオチドの位置６９１１〜６９１７（配列番号１３）によって示される。ポリ（Ａ）テイルの次は、リンカー配列5′-CGGAATTC- 3′のヌクレオチドの位置６９１８〜６９２５（配列番号１３）である。５′及び３′リンカーヌクレオチド配列は共に、ｃＤＮＡライブラリーの調製で挿入され、Ｖ因子ｃＤＮＡの一部ではない。図２Ａ及び図２Ｂは、各々Ｖ因子遺伝子のエキソン１０及びイントロン１０の正常（配列番号２）及び変異体（配列番号３）対立遺伝子のヌクレオチド配列の一部を示す配列である。Ｖ因子遺伝子のゲノムＤＮＡと実施例１Ｂに記載されたプライマーＦＶ７（配列番号４）及びＦＶＩＮＴ１０２（配列番号５）とのＰＣＲ増幅によって生成された二本鎖ＤＮＡのコーディング鎖は、図２Ａ及び２Ｂの双方に示される。上及び下の場合の文字のヌクレオチド配列は、各々エキソン１０及びイントロン１０のヌクレオチド配列を表す。上の場合のヌクレオチド配列の上の番号は、Ｖ因子遺伝子のエキソン１０のヌクレオチドの位置に対応する。下の場合のヌクレオチド配列の上の番号は、Ｖ因子遺伝子のイントロンのヌクレオチドの位置に対応する。図２Ａの２重下線のヌクレオチド配列は、Ｖ因子遺伝子のエキソン１０の２つのＭｎｌＩ制限エンドヌクレアーゼ部位の１つを表し、実施例１Ｂに記載されたようにＤＮＡ断片が制限エンドヌクレアーゼＭｎｌＩの存在下に切断されることを証明するために切断された。２重下線のＭｎｌＩ制限部位は、エキソン１０のヌクレオチドの位置２０５を含むもう一方のＭｎｌＩ部位に対してコーディング鎖上の５′に位置するので５ ′ＭｎｌＩ部位とも呼ばれる。図２Ａの１本の下線は、図１Ｈ及び配列番号１３に示されるＶ因子ｃＤＮＡ配列の位置１６９１に対応するＶ因子遺伝子のエキソン１０の位置２０５にグアニンヌクレオチドを含むＭｎｌＩ制限エンドヌクレアーゼ部位（配列番号１５）を表す。１本の下線のＭｎｌＩ制限部位は、また、５′ＭｎｌＩ部位に対してコーディング鎖上の３′に位置するので３′ＭｎｌＩ部位と呼ばれる。図２Ｂの同じヌクレオチド位置は、Ｖ因子遺伝子のエキソン１０（配列番号３）に点突然変異を示し、正常な対立遺伝子に存在するＭｎｌＩ制限部位のないアデニンヌクレオチドを含む。図３は、実施例１Ｄで求めたＶ因子ｃＤＮＡの正常及び変異体対立遺伝子のオートラジオグラフの部分的ヌクレオチド配列を表す写真である。表示試料は、同型接合の娘（ＩＩ−２）、異型接合の息子（ＩＩ−３）及び正常対照（Ｎ）である。３種類の異なる試料からのヌクレオチド配列は、左から右にアデノシン、シトシン、グアニン及びチミンとして４レーンで示される。各試料のＩＩ−２、ＩＩ−３及びＮの４レーンは実線で相互に分けられる。左の矢印は、Ｖ因子ｃＤＮＡヌクレオチド配列のヌクレオチドの位置１６９１を示す。右に示されるヌクレオチド配列は、図の下の５′から上の３′までであり、ヌクレオチドの位置１６８４〜１６９５のＶ因子ｃＤＮＡのｃＤＮＡコード配列を表す。ヌクレオチドグアニン及びアデニン（ＧＡ）の存在は、各々ｃＤＮＡヌクレオチドの位置１６９１の正常及び変異体対立遺伝子のヌクレオチドを示す。右に示されたアミノ酸残基は、下のアミノ酸末端から上のカルボキシ末端までであり、ヌクレオチドによってコード化されたアミノ酸残基配列を表す。ｃＤＮＡヌクレオチドの位置１６９０〜１６９２に対応するCGAからCAAへのコドンの変化は、アルギニン（Ａｒｇ）からグルタミン（Ｇｌｎ）へのトリプレットによってコード化されたアミノ酸残基の変化を生じる。図４は、制限エンドヌクレアーゼＭｎｌＩの存在下にインキュベートされ実施例１Ｂに記載されたように電気泳動的に分離されたＶ因子遺伝子のエキソン１０にヌクレオチドの位置２０５を含むゲノムＤＮＡの一部を表すＤＮＡを含むアガロースゲルの写真である。レーン１は、塩基対（ｂｐ）で示されたＤＮＡ分子量マーカーである。レーン２、４、５及び６は、Ｖ因子遺伝子のエキソンン１０のヌクレオチドの位置２０５の点突然変異に対して異型接合であるＡＰＣ耐性患者から単離したＤＮＡである。レーン３は、正常又は非変異体対立遺伝子に対して同型接合である正常な患者から単離したＤＮＡである。図５Ａ及び図５Ｂは、各々Ｖ因子遺伝子のエキソン１０の正常（配列番号１５）と変異体（配列番号１６）を表すヌクレオチド配列を示す図である。示された番号は、ゲノムＤＮＡのイントロン９の次のＶ因子遺伝子のエキソン１０の最初のヌクレオチドからイントロン１０の前のエキソン１０の最後のヌクレオチドまでである（Kaneら，Biochem ．26:6508，1987）。図５Ａにおいて、１本の下線の配列は、Ｖ因子遺伝子のエキソン１０の正常な対立遺伝子のＭｎｌＩ部位を表す。図５Ｂは、グアニンからアデニンへのＶ因子遺伝子のエキソン１０のヌクレオチドの位置２０５の変化のためにＭｎｌＩ部位を含まない。図６Ａ及び図６Ｂは、各々実施例１Ｄに記載されたＶ因子ｃＤＮＡとプライマーＦＶ１３（配列番号１０）及びＦＶ２（配列番号１１）との増幅産物のコーディング鎖の正常（配列番号２７）及び変異体（配列番号２８）ヌクレオチド配列である。１本の下線のヌクレオチド配列は、ＦＶ１３プライマーに対応する。２重下線のヌクレオチド配列は、ＦＶ２プライマーの逆補体に対応する。図面の左側に沿った番号は、Jennyら，Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 84:4846 ，1987に記載されたＶ因子のｃＤＮＡのヌクレオチドの位置に対応する。ｃＤＮＡＰＣＲ産物は、ヌクレオチドの位置７８〜９０の５′非翻訳配列の１３ヌクレオチド、ヌクレオチドの位置１７６〜２１３０のＶ因子重鎖をコード化するヌクレオチド配列、及びヌクレオチドの位置２１３１〜２２０４の連結配列の７３ヌクレオチドを含んでいる。増幅した正常及び変異体ｃＤＮＡヌクレオチド配列は、各々配列番号２７及び２８に示され、図６Ａ及び図６Ｂの各々の位置７８はここでは配列表のヌクレオチドの位置１として示される。結果として、ヌクレオチドの位置１６９１でのＶ因子ｃＤＮＡのグアニンからアデニンへの点突然変異は、配列番号２７及び２８ではヌクレオチドの位置１６１４にある。同様に、図６Ａ及び図６Ｂにおけるヌクレオチドの位置２３７４は、ここでは配列表のヌクレオチドの位置２２９７である。更に、配列番号１７では、Ｖ因子ｃＤＮＡヌクレオチド７８で始まる重鎖増幅ｃＤＮＡは位置１６１４（ｃＤＮＡの位置１６９１に対応する）が“Ｎ”で示され、そのＮは正常Ｖ因子ｃＤＮＡではグアニン及び変異体Ｖ因子ｃＤＮＡではアデニンである。図７Ａ及び図７Ｂは、各々実施例１Ｃに記載されたプライマーＦＶ７とＦＶ５０６ｔｓｔ２とのＰＣＲ増幅による正常（配列番号１８）又は変異体（配列番号１９）対立遺伝子のＶ因子遺伝子に由来する増幅産物のコーディング鎖のヌクレオチド配列を示す図である。双方の図において、上又は下の場合の文字のヌクレオチドは、各々エキソン１０及びイントロン１０のヌクレオチド配列を表す。上の場合のヌクレオチド配列の上の番号は、Ｖ因子遺伝子のエキソン１０のヌクレオチドの位置に対応する。下の場合のヌクレオチド配列の上の番号は、Ｖ因子遺伝子のイントロン１０のヌクレオチド配列に対応する。図７Ａ及び図７Ｂでの２重下線のヌクレオチド配列は、エキソン１０のヌクレオチドの位置２０８〜２１０において実施例１Ｃに記載されたプライマーＦＶ７とＦＶ５０６ｔｓｔ２とのＰＣＲ増幅による増幅産物に導入される点突然変異を示す。図７Ｂの１本の下線のヌクレオチド配列は、Ｖ因子遺伝子のエキソン１０のヌクレオチドの位置２０５にアデニンヌクレオチドの点突然変異を含むＨｉｎｄＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を表す（配列番号１９）。図７Ａでの同じヌクレオチドの位置は、Ｖ因子遺伝子のエキソン１０のヌクレオチドの位置２０５に点突然変異が存在しないことを示すグアニンヌクレオチドを含む（配列番号１８）。発明の詳細な説明Ａ．定義対応表コード群ヌクレオチド A A アデニン C C シトシン G G グアニン T T チミン（DNA） U U ウラシル（RNA） Y C又はT(U) ピリミジン R A又はG プリン M G又はC アミノ K G又はT(U) ケト S G又はC 強い相互作用(3水素結合) W A又はT(U) 弱い相互作用(2水素結合) H A又はC 又はT(U) Gではない B G又はT(U)又はC Aではない V G又はC 又はA TでもなくUでもない D G又はA 又はT(U) Cではない N G，A，C又はT(U) いずれでもよい対立遺伝子：特定の遺伝子のＤＮＡ配列の変異体。二倍体鎖では、染色体セットの相同染色体上の同じ相対位置又は遺伝子座の各々に最高２つの対立遺伝子が存在する。いずれか１つの遺伝子座の対立遺伝子が同じである場合、個体はその遺伝子座に対して同型接合であると言われる。対立遺伝子が異なる場合、個体はその遺伝子座に対して異型接合であると言われる。いずれか１つの遺伝子の異なる対立遺伝子は１つの塩基でのみ異なるので、いずれか１つの遺伝子に対する対立遺伝子の可能な数は非常に多い。対立遺伝子が異なる場合には、一方はたいていもう一方に対して優性である。優性でない対立遺伝子は、劣性であると言われる。優性は、表現型の形質であり、優性対立遺伝子による劣性対立遺伝子の不活性化を意味しない。多くの例では、正常に機能する（野生型）対立遺伝子は、多少とも欠損のある機能の変異体対立遺伝子全てに対して優性である。かかる場合には、一般的には、２つのうちの１つの機能対立遺伝子が生物の正常な発育を十分支持するだけ活性遺伝子産物を生じるのに十分であると説明される（即ち、通常は遺伝子産物の量に２倍の安全性の余地がある）。変異体対立遺伝子は、コード化する遺伝子の欠損のある機能をもたらすこともありもたらさないこともある。変異体対立遺伝子がコード化する遺伝子の欠損のある機能をもたらさない場合には、キャリヤー態と呼ばれる。変異体突然変異がコード化する遺伝子の欠損のある機能を引き起しかつ病態の恐れが高くなった場合には、“発症”対立遺伝子又は増悪因子対立遺伝子と呼ばれる。ヌクレオチド：糖部分（ペントース）、リン酸基及び含窒素複素環塩基からなるＤＮＡ又はＲＮＡのモノマー単位。該塩基はグリコシド炭素を介して糖部分（ペントースの１′炭素）に結合し、塩基と糖のその組合わせはヌクレオシドである。該ヌクレオシドがペントースの３′又は５′位に結合したリン酸基を有する場合には、ヌクレオチドと呼ばれる。作用上結合したヌクレオチドの配列は、本明細書では典型的には“塩基配列”又は“ヌクレオチド配列”、及びそれらの文法上の等価物と呼ばれ、左から右への向きが５′末端から３′末端への慣用の方向である配列によって表される。塩基対（ｂｐ）：二本鎖ＤＮＡ分子におけるアデニン（Ａ）とチミン（Ｔ）又はシトシン（Ｃ）とグアニン（Ｇ）の組合わせ。ＲＮＡでは、チミンがウラシル（Ｕ）に置き換えられる。核酸：一本鎖又は二本鎖のヌクレオチドのポリマー。ポリヌクレオチド：一本鎖又は二本鎖ヌクレオチドのポリマー。本明細書に用いられる“ポリヌクレオチド”及びその文法上の等価物は完全な範囲の核酸を含む。ポリヌクレオチドは、典型的には、２個以上のデオキシリボヌクレオチド及び／又はリボヌクレオチドの線状鎖から構成される核酸分子を表す。正確なサイズは、多くの要因に左右され、当該技術において周知であるように最後の使用条件に左右される。本発明のポリヌクレオチドとしては、プライマー、プローブ、ＲＮＡ／ＤＮＡセグメント、オリゴヌクレオチド又は“オリゴ”(比較的短いポリヌクレオチド)、遺伝子、ベクター、プラスミド等が挙げられる。遺伝子：ヌクレオチド配列がＲＮＡ又はポリペプチドをコードする核酸。遺伝子はＲＮＡ或いはＤＮＡである。二重らせんＤＮＡ：二重らせんの塩基対に存在する各々の相補性塩基間の１以上の水素結合によって共に維持された２本の実質的な相補的ポリヌクレオチド鎖を含む二本鎖核酸分子。塩基対を形成するヌクレオチドはリボヌクレオチド塩基或いはデオキシリボヌクレオチド塩基であるために、“二重らせん”とは２本のＤＮＡ鎖（ｄｓＤＮＡ）を含むＤＮＡ−ＤＮＡ二重らせん又は１本のＤＮＡ鎖と１本のＲＮＡ鎖を含むＲＮＡ−ＤＮＡ二重らせんを意味する。相補性塩基：ＤＮＡ又はＲＮＡが二本鎖配置をとる場合に通常対合するヌクレオチド。相補的ヌクレオチド配列：水素結合が生じることにより特異的にハイブリッド形成するもう一方の単鎖に十分相補的なＤＮＡ又はＲＮＡの一本鎖分子のヌクレオチドの配列。保存：予め選ばれた配列の正確な補体に対して非ランダムにハイブリッド形成する場合には予め選ばれた（標準）配列についてヌクレオチド配列が保存される。ハイブリッド形成：相補性塩基対間の水素結合による二重らせん又はヘテロ二重らせんを形成する実質的に相補的なヌクレオチド配列（核酸鎖）の対合。競合的に阻害される２つの相補的ポリヌクレオチド間の特異的、即ち、非ランダム相互作用である。ヌクレオチド類縁体：構造的にＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃ又はＵと異なるが核酸分子内の正常ヌクレオチドを置き換えるのに十分類似しているプリン又はピリミジンヌクレオチド。上流：ＤＮＡ転写の方向と反対の方向で非コーディング鎖については５′から３′へ進みＲＮＡ転写物については３′から５′に進む方向。下流：ＤＮＡ配列に沿った配列転写又は読み出しの方向。即ち、ＤＮＡの非コーディング鎖に沿っては３′→５′方向に又はＲＮＡ転写物に沿っては５′→ ３′方向に進む方向。停止コドン：アミノ酸をコードしないが代わりにタンパク質合成の終結をもたらす任意の３種のコドン。ＵＡＧ、ＵＡＡ及びＵＧＡであり、ナンセンスコドン、終止コドン又は転写停止コドンとも呼ばれる。読み枠：翻訳に用いられる連続ヌクレオチドトリプレット（コドン）の個々の配列。読み枠は翻訳開始コドンの位置に左右される。Ｂ．診断法本発明は、ＡＰＣ耐性に対する患者の遺伝子根拠を求めるためにヒトについてＶ因子遺伝子を含むＶ因子対立遺伝子をスクリーニングする新規な方法を提供する。本発明は、ＡＰＣ耐性がＶ因子遺伝子のＤＮＡ配列における突然変異によって引き起こされ、Ｖ因子遺伝子のエキソン１０の位置２０５のグアニンヌクレオチドがアデニンヌクレオチドによって置き換えられたという発見によって生まれた。正常な野生型のＶ因子遺伝子のゲノム配列部分が決定された。その遺伝子は、２５エキソンと２４イントロンから構成され、８０キロベースより大きいゲノムＤＮＡに及ぶ(Cripeら，Biochem ．31:3777，1992)。２１５塩基対を有する正常なエキソン１０配列のヌクレオチドは、図５Ａに示され、配列番号１５に示される。転写及び翻訳されたように、正常なＶ因子遺伝子においてヌクレオチドの位置２０５のグアニンヌクレオチドを含むヌクレオチドの位置２０４〜２０６のトリプレットコドン、CGAは、アルギニンアミノ酸残甚をコード化する。エキソン１０のヌクレオチドの位置２０５は、Jennyら，Proc ．Natl．Acad．S ci．USA 84:4846，(1987)に記載され図１Ａ〜図１Ｊ及び配列番号１３の双方に示された相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）ヌクレオチド配列のヌクレオチドの位置１６９１に対応することが求められた。Ｖ因子のｃＤＮＡ配列（配列番号１３）は、６６７２塩基対（ｂｐ）コード領域、９０ｂｐ５′非翻訳領域及び１６３ｂｐ３′非翻訳領域を含む(Jennyら，Pr oc ．Natl．Acad．Sci．USA 84:4846，1987; 図１Ａ〜図１Ｊ)。コード化アミノ酸残基配列は、２８アミノ酸残基のリーダーペプチドを含む２２２４アミノ酸（配列番号１４）を有する。本明細書に示されたＶ因子のヌクレオチドとアミノ酸残基の数字は、Jennyら，Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 84:4846，1987に示された数字に従うものである。 Jennyらに示されたｃＤＮＡヌクレオチド配列としては、５′８量体ヌクレオチド配列、5′-GAATTCCG- 3′（ヌクレオチドの位置１からヌクレオチドの位置８までの配列番号１３）及び３′端の第２の８量体、5′-CGGAATTC- 3′（ヌクレオチドの位置６９１８からヌクレオチドの位置６９２５までの配列番号１３）が含まれ、その両者共遺伝子配列に存在しない。その８量体配列は、ｃＤＮＡライブラリーを構築するために用いられるＥｃｏＲＩリンカーである。従って、ｃＤＮＡ配列の実際の長さは、図１Ａ〜図１Ｊ及び配列番号１３に示された６９２５ではなくて６９０９塩基対の長さである。本発明で使用するために定義される正常な或いは罹患していない（野生型）Ｖ因子遺伝子は、エキソン１０のヌクレオチドの位置２０５に点突然変異がない。言い換えると、本発明の正常なＶ因子遺伝子はエキソン１０のヌクレオチドの位置２０５にグアニンヌクレオチドを有する。本発明で使用するために定義される正常なＶ因子遺伝子に相対する遺伝子は、エキソン１０のヌクレオチドの位置２０５に点突然変異がある変異体又は罹患Ｖ因子遺伝子である。言い換えると、本発明の変異体Ｖ因子遺伝子はエキソン１０のヌクレオチドの位置２０５に正常なグアニンヌクレオチドではなくてアデニンヌクレオチドを有する。２１５塩基対を有する記載した変異体エキソン１０配列のヌクレオチド配列は図５Ｂに示され、配列番号１６に示される。転写及び翻訳されたように、変異体Ｖ因子遺伝子におけるヌクレオチドの位置２０５のアデニンヌクレオチドを含むヌクレオチドの位置２０４〜２０６のトリプレットコドン、CAAはグルタミンアミノ酸残基をコード化する。従って、グアニンからアデニンへの点突然変異として特徴づけられたＶ因子遺伝子に存在する遺伝子突然変異はＶ因子突然変異と呼ばれる。Ｖ因子遺伝子は、ヌクレオチド配列が正常なＶ因子タンパク質或いは変異体Ｖ因子タンパク質をコード化する核酸である。その核酸は、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ或いはｃＤＮＡの形であり、１本鎖或いは２本鎖の形である。本発明の分析法は、ＡＰＣ耐性と関連があるエキソン１０のヌクレオチドの位置２０５の点突然変異の有無を求めるために患者の核酸をスクリーニングするのに有用である。本方法は、同型接合正常、同型接合変異体又は異型接合であるＶ因子対立遺伝子間の識別能力を与える。言い換えると、本明細書に記載された方法は、Ｖ因子遺伝子を含む２つの突然変異対立遺伝子を有する患者、一方だけが突然変異対立遺伝子を有し他方が正常である患者、及び２つの正常な対立遺伝子を有する患者間の区別を可能にする。従って、下記のＢ２及びＢ３項で更に十分に述べられるように、本発明の方法は、一般的には、スクリーニングする核酸試料を調製する工程、次に、増幅した産物についてＶ因子遺伝子を含む対立遺伝子におけるグアニンのアデニンへの点突然変異を分析する工程を含む。好適実施態様においては、核酸試料はＶ因子対立遺伝物質の存在が強化される。強化は、典型的には、本明細書に記載されたポリヌクレオチド合成プライマーを用いてゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡをプライマー拡張反応に供することにより行われる。分析されるべき試料をつくる特に好ましい方法は、プライマーとして予め選ばれたポリヌクレオチドを使用し、その一般的説明は下記のＢ１項に示される。プライマーは、増幅（ＰＣＲ）産物を生成するためにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に用いられ、その一般的説明は下記のＢ１ｂ項に示される。本発明の診断法は、下記のＢ２及びＢ３項に更に詳しく記載される。１．ＰＣＲの一般態様ａ．ポリヌクレオチドプライマーの調製プライマー拡張によって合成されるべきプライマー、プローブ及び核酸断片又はセグメントに関して本明細書に用いられる“ポリヌクレオチド”とは、２個以上の、好ましくは３を超えるデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドを含む分子として定義される。その正確なサイズは、多くの要因に左右され、最後の使用条件に左右される。本明細書に用いられる“プライマー”とは、核酸制限消化物から精製された或いは合成で製造されたポリヌクレオチドを意味する。プライマーは、核酸鎖に相補的なプライマー拡張産物の合成が誘導される条件下に置かれる場合に核酸合成の開始点として作用することができる。誘導条件としては、ヌクレオチドとＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素等の重合用試薬の存在、及び適切な温度とｐＨが含まれる。プライマーは、最高効率のためには一本鎖が好ましいが二本鎖の形でもよい。二本鎖の場合には、まず、プライマーを相補鎖から分離するために処理し、その後、拡張産物を調製するために用いられる。好ましくは、プライマーはポリデオキリボヌクレオチドである。プライマーは、重合用試薬の存在下に拡張産物の合成を開始するのに十分に長くなければならない。プライマーの正確な長さは、温度及びプライマー源を含む多くの要因に左右される。例えば、標的配列の複雑さによって、ポリヌクレオチドプライマーは典型的には１５〜２５個以上のヌクレオチドを有するがそれより数の少ないヌクレオチドであることもできる。短いプライマー分子は、一般的には、鋳型と十分に安定なハイブリッド複合体を形成するために低い温度を必要とする。本明細書に用いられるプライマーは、合成又は増幅されるべき各特定配列の異なる鎖に“実質的に”相補的であるように選ばれる。これは、プライマーが各々の鋳型鎖とランダムにでなくハイブリッド形成するのに十分に相補的でなければならないことを意味する。従って、プライマー配列は、鋳型の正確な配列を反映してもしなくてもよい。例えば、非相補的ヌクレオチド断片がプライマーの５′ 端に結合され、プライマー配列の残りが鎖に実質的に相補的である。かかる非相補的断片は、典型的には、エンドヌクレアーゼ制限部位をコードしている。また、プライマー配列がランダムにでなくハイブリッド形成してポリヌクレオチド合成条件下に拡張産物を形成するのに合成又は増幅されるべき鎖の配列と十分な相補性を有するならば、非相補的塩基又は長い配列がプライマーの中に点在することができる。本発明のプライマーは、また、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列又はその補体を含むことができる。例えば、Kriegら，Nucl ．Acids Res．12 :7057(1984); Studierら，J ．Mol．Biol．189:113(1986); Molecular Cloning: A Laboratory Manual ，sec．edit. ，Maniatisら，eds.，Cold Spring Harbor，N Y（1989）参照。ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むプライマーが用いられる場合、そのプライマーは増幅されるべきポリヌクレオチド鎖に対してハイブリッド形成され、該ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの第２ポリヌクレオチド鎖は大腸菌（Escherichia coli）ＤＮＡポリメラーゼＩ、又はE ．coli ＤＮＡポリメラーゼのクレノウフラグメントのような誘導剤を用いて完了する。出発ポリヌクレオチドは、ＲＮＡポリヌクレオチドとＤＮＡポリヌクレオチドの生成間で交互にすることにより増幅される。プライマーは、また、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼに対する鋳型配列又は複製開始部位を含むことができる。典型的なＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼとしては、Lizardiら，Biotech ．6:1197(1988)に記載されたＱＢレプリカーゼが含まれる。ＲＮＡ依存性ポリメラーゼは、鋳型配列又は複製開始部位を含む少数の鋳型ＲＮＡ鎖から多数のＲＮＡ鎖を生成する。それらのポリメラーゼは、典型的には、Kramerら，J ．Mol．Biol．89:719（1974）に記載されたように鋳型鎖の１００万倍の増幅を与える。ポリヌクレオチドプライマーは、ホスホトリエステル又はホスホジエスエル法のような適切な方法を用いて調製される。Narangら，Meth ．Enzymol．68:90(197 9); 米国特許第4,356,270号，同第4,458,066号，同第4,416,988号，同第4,293, 652号; Brownら，Meth ．Enzymol．68:109(1979)参照。プライマーのヌクレオチド配列の選択は、ハイブリッド形成点から検出されるべき突然変異をコードする領域までの核酸上の距離、使用されるべき第２プライマーに相対する核酸上のハイブリッド部位等の要因に左右される。核酸試料がＰＣＲ増幅によってＶ因子遺伝物質を強化するべきである場合には、２つのプライマー、即ち、ＰＣＲプライマー対は増幅されるべき核酸の各コーディング鎖に対して用いなければならない。コーディング鎖又はセンス鎖に由来する配列をもつ第１プライマーは非コーディング（アンチセンス又はマイナス）鎖上のヌクレオチド配列に対してハイブリッド形成する。ＰＣＲによって、第１プライマーはその後はコーディング（センス又はプラス）鎖の一部になる。非コーディング鎖に由来する配列をもつ第２プライマーは、コーディング鎖又はセンス鎖のヌクレオチド配列に対してハイブリッド形成し、ＰＣＲによって、その後は非コーディング鎖の一部になる。１実施態様においては、本発明は、プライマーの３′末端に位置する開始領域をもつプライマーを形成する一組のポリヌクレオチドを用いる。開始領域は、典型的には、３′端（３′末端）の１５〜２５ヌクレオチド塩基である。各プライマーの３′末端開始部分は、核酸合成を触媒する、即ち、３′末端からプライマー拡張反応を開始するプライマーとして作用することができる。プライマーの一方又は双方は、更に５′末端（５′端）非開始部分、即ち、好ましい鋳型に対するハイブリッド形成に関与しない領域を含むことができる。プライマーの一方又は双方は、また、非開始部分である開始領域、即ち、好ましい鋳型に対するハイブリッド形成に関与しない領域に１個以上のヌクレオチドを含むことができる。かかるヌクレオチドは、好ましい鋳型に存在しない制限エンドヌクレアーゼ部位の全部又は一部を導入することができる。制限エンドヌクレアーゼ部位の一部を導入する第２プライマーとして用いられる好ましいプライマーは、本発明の突然変異Ｖ因子対立遺伝子のＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を導入する配列番号２４に示される。ＰＣＲにおいては、各プライマーは標的核酸配列を増幅する第２プライマーと組合わせて作用する。ＰＣＲで有用なＰＣＲプライマー対の選択は、Ｖ因子遺伝子領域をつくるために本明細書で述べた配慮によって支配される。患者の試料からのＶ因子ゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡの双方を増幅する有用な開始配列は、下記のＢ２項及び実施例１に記載される。ｂ．ポリメラーゼ連鎖反応Ｖ因子遺伝子は、ｍＲＮＡ及び／又はゲノムＤＮＡのセンス鎖のようなポリヌクレオチドコーディング鎖から構成される。分析されるべき遺伝物質が二本鎖ゲノムＤＮＡの形である場合には、通常はまず一本鎖に、典型的には溶融により変性される。試料をＰＣＲプライマー対で処理（接触）することにより核酸をＰＣＲ増幅に供し、該対の各々は上記のＢｌａ項に述べられた設計の必要性に基づいて予め選ばれたヌクレオチド配列を有する。プライマー対を含むプライマーは、Ｖ因子対立遺伝子鋳型の中に存在する、好ましくは保存される長さが好ましくは少なくとも約１０個のヌクレオチド、更に好ましくは少なくとも約１５個のヌクレオチド、最も好ましくは２０個のヌクレオチドの鋳型ヌクレオチド配列に対してハイブリッド形成することによりプライマー拡張反応を開始することができる。ＰＣＲプライマー対の第１プライマーは、センス鎖又はコーディング鎖に由来しかつ核酸のアンチセンス（非コーディング又はマイナス）鎖、即ち、コーディング鎖に相補的な鎖に対してハイブリッド形成するために本明細書ではよく“センスプライマー”と呼ばれる。従って、ＰＣＲプライマー対の第２プライマーは、アンチセンス鎖に由来しかつ核酸のセンス（コーディング又はプラス）鎖に対してハイブリッド形成するために本明細書ではよく“アンチセンスプライマー” と呼ばれる。ＰＣＲによって、アンチセンスプライマーは増幅したアンチセンス鎖の一部となる。ＰＣＲ反応は、ＰＣＲプライマー対、好ましくは所定量と試料の核酸、好ましくは所定量とをＰＣＲバッファー中で混合してＰＣＲ反応混合物を形成することにより行われる。該混合物は、ＰＣＲ増幅産物の形成に十分な典型的には所定の多くのサイクルにサーモサイクリングされ、Ｖ因子遺伝物質が分析されるべき試料を強化する。従って、本明細書に定義される本発明の増幅産物は個々のプライマー対によってゲノムＤＮＡ或いはｃＤＮＡのＶ因子核酸の増幅から生じる。ＰＣＲは、典型的には、サーモサイクリングすることにより、即ち、ＰＣＲ反応混合物の温度を下限が約３０〜約７０℃で上限が約９０〜約１００℃の温度範囲内を繰り返し上昇及び降下させることにより行われる。上昇及び下降は、連続することができるが、好ましくは相であり、各々の温度の相対的温度安定の時間がポリヌクレオチド合成、変性及びハイブリッド形成を援助する。複数の第１プライマー及び／又は複数の第２プライマーが各増幅に用いられる。例えば、１種類の第１プライマーは多数の異なる第２プライマーと対合されていくつかの異なるプライマー対となる。また、個々の対の第１プライマーと第２プライマーも用いられる。例えば、実施例１Ｂ及び１Ｃに記載されるＶ因子ゲノムＤＮＡを増幅するに当たっては、配列番号４に示されるヌクレオチド配列を有する第１プライマーは配列番号５及び２４に示される各配列を有する第２プライマーのいずれかと別個に対合される。個々の増幅に用いられるべきである対合の決定は、突然変異の有無をスクリーニングするために使用される分析法、即ち、分析法が下記のＢ３項に述べられるＭｎｌＩ制限エンドヌクレアーゼかＨｉｎｄＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼによる増幅産物の制限消化に基づくかに左右される。いずれにしても、第１及び第２プライマーの同じか又は異なる組合わせを用いる増幅の増幅産物が本発明のＶ因子のグアニンのアデニンへの点突然変異を分析するのに組合わせられる。ＰＣＲ反応は、適切ないずれの方法を用いても行われる。通常は、緩衝化水溶液、即ち、ＰＣＲバッファー、好ましくはｐＨ７〜９、最も好ましくは約８で起こる。好ましくは、モル過剰（ゲノム核酸に対して、通常はプライマー：鋳型約１０⁶：１）のプライマーが鋳型鎖を含有するバッファーに混合される。大きなモル過剰は、工程の効率を改善するために好ましい。ＰＣＲバッファーは、また、デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ポリヌクレオチド合成基質）ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ及び典型的には耐熱性のポリメラーゼ全てをプライマー拡張（ポリヌクレオチド合成）反応に十分な量で含有する。得られた溶液（ＰＣＲ混合物）は、約９０〜１００℃に約１〜１０分間、好ましくは１〜５分間加熱される。その加熱時間後、溶液はプライマーハイブリッド形成に好ましい５６℃まで冷却される。より好ましいプライマーハイブリッド形成温度は６０℃である。ハイブリッド形成条件及び必要条件の他の態様はＢ３Ｃ項に記載される。合成反応は、室温からポリメラーゼ（試薬を含む）が効率よく作用しなくなる温度までで起こることができる。従って、例えば、E ．coli ＤＮＡポリメラーゼＩが誘導剤として用いられる場合には、温度は通常約４０℃より高くない。サーモサイクリングは、所望量のＰＣＲ産物が生成されるまでサーモサイクリングが繰り返される。具体的なＰＣＲバッファーは、バッファー１００マイクロリットルあたり５０mMＫＣｌ；１０mMトリス−ＨＣｌ；ｐＨ８.３；１.５mMＭｇＣｌ₂ ；０.００１％(wt/vol)ゼラチン、２００μM ｄＡＴＰ；２００μM ｄＴＴＰ；２００μM ｄＣＴＰ；２００μM ｄＧＴＰ；及び２.５単位サーマス・アクアチクス(Thermus aquaticus)ＤＮＡポリメラーゼ（米国特許第4,889,818号）を含む。誘導剤は、酵素を含むプライマー拡張産物の合成を達成するために機能する化合物又は系とすることができる。それのために適切な酵素としては、各核酸鎖に相補的なプライマー拡張産物を形成するのに適切な方法でヌクレオチドの組合わせを容易にする例えば、E ．coli ＤＮＡポリメラーゼＩ、E ．coli ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、他の有効なＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、及び熱安定酵素を含む他の酵素が挙げられる。熱安定酵素の例としては、とくにサーマス・アクアチクスＤＮＡポリメラーゼ、ピロコッカス・フリオサス(Pyrococcus furiosus)ＤＮＡポリメラーゼ及びサーモトガ・マラチマ(Thermatoga maratima)ＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。通常、合成は各プライマーの３′端で開始し、合成が終結して異なる長さ又は同じ長さの分子を生成するまで鋳型鎖に沿って５′方向に進行する。しかしながら、誘導剤が合成を５′端で開始させかつ上記と同じ方法を用いて上記の方向に進行させることがある。誘導剤は、また、酵素を含むＲＮＡプライマー拡張産物の合成を達成するために機能する化合物又は系とすることができる。好適実施態様においては、誘導剤はＴ７ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼ又はＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼのようなＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼとすることができる。それらのポリメラーゼは、相補的ＲＮＡポリヌクレオチドを生成する。ＲＮＡポリメラーゼの高代謝回転数は、Chamberlinら，The Enzymes ，ed．P．Boyer，PP．87-108，A cademic Press，ニューヨーク(1982)に記載された出発ポリヌクレオチドを増幅する。転写に基づく増幅系は、Gingerasら，PCR Protocols ，A Guide to Method s and Applications ，pp．245-252，Academic Press，Inc.,カリフォルニア州サンディエゴ(1990)に記載されている。誘導剤がＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼであってリボヌクレオチド三リン酸を取り込む場合には、十分量のＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ及びＵＴＰがプライマー拡張反応混合物に混合され、得られた溶液は上記のように処理される。新たに合成した鎖及びその相補的核酸鎖は、後に続く本方法の工程に用いられる二本鎖分子を形成する。ＰＣＲ増幅法は米国特許第4,683,192号、同第4,683,202号、同第4,800,159号及び同第4,965,188号に詳細に及び“PCR Technology: Principles and Applicat ions for DNA Amplification”，H．Erlich，ed.，Stockton Press,ニューヨーク(1989);“PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications”，I nnisら，eds.，Academic Press，カリフォルニア州サンディエゴ（1990）を含むいくつかの論文に少し記載されている。本発明に有用な具体的なＰＣＲ法は、実施例１に記載される。他の実施態様においては、２対の第１及び第２プライマーが増幅反応によって用いられる。次に、各々が複数の異なるプライマー対を用いる複数の異なる増幅から得られた増幅反応産物が混合されるか別個に分析される。２．Ｖ因子核酸標品のＰＣＲ増幅ａ．ゲノムＤＮＡ上記のことから、本発明は、ヒトから単離したゲノムＤＮＡの試料を増幅条件下に、Ｖ因子遺伝子のエキソン１０にヌクレオチドの位置２０５を含むヒトゲノムＤＮＡの領域を増幅するＰＣＲプライマー対で処理する工程を含むスクリーニング法を企図する。ゲノムＤＮＡ試料は、細胞、典型的には末梢血白血球から得られる。増幅条件としては、ＰＣＲバッファーの存在及びサーモサイクリング温度がポリペプチド合成に有効な量で含まれる。そのようにして生成されたＰＣＲ増幅産物について、下記のＢ３項に述べられるようにＶ因子遺伝子のエキソン１０のヌクレオチドの位置２０５のグアニンヌクレオチドからアデニンヌクレオチドへの変化として特徴づけられた点突然変異の存在を分析する。好適実施態様においては、正常な対立遺伝子が存在する場合にはＰＣＲプライマー対は制限エンドヌクレアーゼ部位を含む増幅産物を生成する。しかしながら、グアニンのアデニンへの点突然変異を含む変異体対立遺伝子が増幅される場合には、同じＰＣＲプライマー対は制限エンドヌクレアーゼ部位を含まない増幅産物を生成する。好ましくは、上記ＰＣＲプライマー対は、３′の非コーディング鎖のエキソン１０のヌクレオチドの位置２０５までの位置（相補的コーディング鎖上の５′の突然変異に等価な位置）のエキソン１０の非コーディング鎖に対してハイブリッド形成する第１プライマー、及び３′のコーディング鎖のエキソン１０のヌクレオチドの位置２０５までの位置のイントロン１０のコーディング鎖に対してハイブリッド形成する第２プライマーを含む。好ましい第１プライマー、ＦＶ７は、配列、5′-CATACTACAGTGACGTGGAC- 3′（配列番号４）で表され、好ましい第２プライマー、ＦＶＩＮＴ１０２は配列、5′-TGTTCTCTTGAAGGAAATGC- 3′（配列番号５）で表される。本発明の実施態様においては、上記ＰＣＲプライマー対から得られたＰＣＲ増幅産物は、配列、5′-GACAGGCNAGG- 3′(配列番号１)(Ｎは正常なＶ因子遺伝子でのようにＧ、変異体遺伝子でのようにＡである)で表される５′から３′への方向に書かれた連続ヌクレオチド配列、又はＶ因子ゲノムＤＮＡのエキソン１０のヌクレオチドの位置２０５を含むその断片である。配列番号１の好ましいヌクレオチド配列を含むＶ因子ゲノムＤＮＡの具体的なヌクレオチド配列は、図２Ａ（配列番号２）及び図２Ｂ（配列番号３）に示され、各々ＰＣＲプライマー対ＦＶ７及びＦＶＩＮＴ１０２でつくられた正常及び突然変異ＰＣＲ増幅ゲノムＤＮＡ断片である。正常な対立遺伝子が増幅される場合には、得られた増幅産物はＶ因子遺伝子のエキソン１０のヌクレオチドの位置２０５にヌクレオチドグアニンを含む。対照的に、変異体対立遺伝子の増幅は、Ｖ因子遺伝子のエキソン１０のヌクレオチドの位置２０５にヌクレオチドアデニンを含む増幅産物を生成する。異型接合態でのように正常及び変異体対立遺伝子が共に存在する場合には、ＰＣＲプライマー対は正常対立遺伝子におけるＶ因子遺伝子のエキソン１０のヌクレオチドの位置２０５にグアニン及び変異体対立遺伝子におけるＶ因子遺伝子のエキソン１０のヌクレオチドの位置２０５にアデニンを含む増幅産物を生成する。本発明のプライマー対によって、点突然変異のない正常な対立遺伝子のＶ因子遺伝子の好ましいヌクレオチド増幅領域は、5′-ACAGGCG AGG- 3′（配列番号６）に対応するヌクレオチド配列又はその断片である。領域とは、予め選ばれたプライマー対を用いることにより実際に増幅された増幅産物におけるヌクレオチドを意味する。“その断片”とは、増幅産物を形成する増幅したヌクレオチドの領域が言及した配列の一部であることを意味する。エキソン１０のヌクレオチドの位置２０５に対応するグアニンヌクレオチドの存在は、正常な対立遺伝子に存在するＭｎｌＩ制限エンドヌクレアーゼ消化部位を与える。罹患対立遺伝子のＶ因子遺伝子の対応する好ましいヌクレオチド増幅領域は、 5′-ACAGGCA AGG- 3′（配列番号７）に対応するヌクレオチド配列、又はその断片の中に下線をひいた新しい点突然変異を含む。エキソン１０のヌクレオチドの位置２０５に対応するアデニンヌクレオチドの存在は、正常な対立遺伝子に存在するＭｎｌＩ制限エンドヌクレアーゼ消化部位を破壊する。従って、点突然変異の存在は、増幅ヌクレオチド領域においてＶ因子ＤＮＡを消化する制限エンドヌクレアーゼＭｎｌＩの能力を破壊する。結果として、正常な対立遺伝子と罹患した対立遺伝子間の微分ＭｎｌＩ制限消化パターンは、ＡＰＣ耐性を有する患者のＶ因子遺伝子対立遺伝子における点突然変異の存在の決定を可能にする。従って、Ｂ３項に記載されるＶ因子遺伝子のエキソン１０にヌクレオチドの位置２０５を含む増幅産物の制限消化及びヌクレオチド配列双方の分析は、同型接合正常、同型接合変異体又は異型接合態間の決定を与える。かかる分析は、実施例１Ａ〜１Ｂに記載される。患者からのゲノムＤＮＡをスクリーニングする他の態様においては、点突然変異が存在する場合には制限エンドヌクレアーゼ部位を含む増幅産物を生成するために上記のものと別のＰＣＲプライマーが用いられる。言い換えれば、エキソン１０のヌクレオチドの位置２０５におけるグアニンのアデニンへの点突然変異の存在に依存する増幅産物において制限エンドヌクレアーゼ部位がつくられる。その位置に正常なグアニンヌクレオチドを有する正常なＰＣＲ増幅対立遺伝子に生じるアデニンヌクレオチドの存在がないときには、制限部位は消失してその位置に制限消化産物をつくることができないことになる。従って、その代替的態様は、ＭｎｌＩ制限分析に用いられたＰＣＲプライマー対、ＦＶ７及びＦＶＩＮＴ１０２で得られたものと異なる制限パターンを生じる。両者の方法による患者のゲノムＤＮＡの分析は、２つの依存しないが相補的手段による遺伝子診断の確認を可能にする。正常及び罹患対立遺伝子を増幅するプライマー対のＦＶ７と称する好ましい第１プライマー及び制限部位を生じるＦＶ５０６ｔｓｔ２と称する第２プライマーは、各々ヌクレオチド5′-CATACTACAGTGACGTGGAC- 3′（配列番号４）及び 5′-TTACTTCAAGGACAAAATACCTGTAAAGCT- 3′（配列番号２４）を有する。第２プライマーは、アデニン点突然変異を有するエキソン１０のヌクレオチドの位置２０５を用いて制限エンドヌクレアーゼ部位をつくるように設計される。アデニン点突然変異を用いる予め選ばれた制限エンドヌクレアーゼ部位をつくるために、第２プライマーＦＶ５０６ｔｓｔ２は、更に、得られた鋳型ゲノムＤＮＡから増幅されたヌクレオチド配列に３個の点突然変異を導入するように設計された。これらの追加の突然変異は、ヌクレオチドの位置２１０まで伸長するヌクレオチドの位置２０８に対応する増幅産物につくられる（コーディング鎖又はセンス鎖の5′-CTT- 3′は5′-GAA- 3′に変わる）。上記のプライマー対による増幅の結果として、制限エンドヌクレアーゼ、詳しくはＨｉｎｄＩＩＩ部位が、正常或いは変異体対立遺伝子に天然には存在しなかったエキソン１０のヌクレオチドの位置２０５を用いてつくられる。ヌクレオチドの位置２０５のグアニンヌクレオチドを用いてエキソン１０に天然にのみ存在する制限部位は、ヌクレオチドの位置２０５のグアニンヌクレオチドの存在に依存する前に述べた正常な対立遺伝子のＭｎｌＩ制限部位である。プライマー対ＦＶ７及びＦＶ５０６ｔｓｔ２によるゲノムＤＮＡの増幅によって、点突然変異のある罹患対立遺伝子のＶ因子遺伝子の得られた好ましい増幅ヌクレオチド領域は、ヌクレオチド配列5′-AAGCTT- 3′（配列番号２３）又はその断片であり、その配列はＨｉｎｄＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼ部位である。点突然変異のない正常な対立遺伝子のＶ因子遺伝子の対応する好ましい増幅ヌクレオチド領域は、ヌクレオチド配列5′-GAGCTT- 3′（配列番号２５）又はその断片である。従って、配列番号２３を有しかつ実質的に配列番号１９に示された配列からなる増幅変異体対立遺伝子ヌクレオチド領域は、ＨｉｎｄＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼ消化部位を含む。実質的に配列番号１８に示された配列からなるグアニンヌクレオチドをもつ正常な対立遺伝子からの対応する増幅ヌクレオチド領域は、必要なＨｉｎｄＩＩＩ部位を含まない。従って、配列番号４及び２４のプライマー対で増幅したゲノムＤＮＡの微分ＨｉｎｄＩＩＩ制限消化パターンは、患者のゲノムＤＮＡから点突然変異の有無を求める能力の別法を与える。かかる分析は、実施例１Ｃに記載される。また、本発明の方法を実施するのに有用な本発明の増幅産物を生成するように設計される他の第１及び第２プライマーが企図される。かかるプライマーは、正常な及び変異体でない対立遺伝子における制限エンドヌクレアーゼを用いる正常及び変異体ゲノム対立遺伝子を増幅する前に記載されたＭｎｌＩプライマー対を含む種類からのものであることができる。更に、それらのプライマーは、突然変異を更に導入せずに正常或いは変異体の鋳型ＤＮＡの天然に存在するヌクレオチド配列に依存するように設計される。それらの種類のプライマーは、下記のＢ３項に述べられる方法の１つによって後続の分析の増幅産物を与える本発明のグアニンのアデニンへの点突然変異を含む又は前後のヌクレオチド配列の領域を選ぶことにより設計される。しかしながら、Ｖ因子核酸の領域を増幅するプライマー対のプライマーの設計は、本発明の点突然変異の位置にある制限部位をもつことを限定しない。正常及び変異体増幅産物が微分制限消化パターンを生じるように消化されさえすれば、いずれのプライマー対も増幅産物を形成するために用いられる。他のプライマーは、また、グアニンのアデニンへの点突然変異を用いてその部位に本来は存在しない制限エンドヌクレアーゼ部位をつくる前に記載されたＨｉｎｄＩＩＩ非コーディングプライマー、ＦＶ５０６ｔｓｔ２を含むプライマーの種類に同様に設計される。同様に、増幅産物に追加の突然変異を導入するプライマーは、グアニン又はアデニンヌクレオチドがエキソン１０のヌクレオチドの位置２０５に存在するかに無関係に企図される。更に、本発明で使用するのに企図されるプライマーの設計は制限エンドヌクレアーゼ消化分析法がグアニンのアデニンへの点突然変異の有無を求めるのに必要とされるものに限定されない。そのようなものとして、プライマーは、実施例１Ａに記載されたヌクレオチド配列分析のみのために、実施例１Ｂ及び１Ｃに記載された制限消化分析のために又は下記のＢ３項に述べられる核酸ハイブリッド形成法による分析のためにＶ因子遺伝物質の領域を増幅するように設計される。ｂ．ｃＤＮＡ他の好適実施態様においては、本発明は、患者から単離されたメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）から合成されたｃＤＮＡ試料を増幅条件下に、Ｖ因子ｃＤＮＡのヌクレオチドの位置１６９１を含むヒトｃＤＮＡの領域を増幅するＰＣＲプライマー対で処理する工程を含むスクリーニング法を企図する。ｍＲＮＡが用いられる場合、細胞はＲＮａｓｅ阻害条件下で溶解される。実施態様においては、第１工程は全細胞ｍＲＮＡを単離する工程である。次に、オリゴ−ｄＴセルロースに対するハイブリッド形成によってポリＡ＋ｍＲＮＡが選ばれる。その後、ｃＤＮＡと呼ばれるＤＮＡの相補鎖は、当業者に周知の方法及び実施例１Ｄに記載された方法で合成される。合成ｃＤＮＡ鎖がｍＲＮＡからつくられるので、非コーディング鎖又はアンチセンス鎖である。得られたｃＤＮＡを増幅する増幅条件としては、ＰＣＲバッファーの存在及びサーモサイクリング温度がポリペプチド合成に有効な量で含まれる。好ましくは、ｃＤＮＡを増幅するＰＣＲプライマー対は、３′の非コーディングｃＤＮＡ鎖のヌクレオチド１６９１までの位置のｃＤＮＡの非コーディング鎖に対してハイブリッド形成する第１プライマー及び３′のコーディングｃＤＮＡ鎖のヌクレオチドの位置１６９１までの位置のｃＤＮＡのコーディング鎖に対してハイブリッド形成する第２プライマーを含む。好適実施態様においては、ＰＣＲプライマー対は、正常なｃＤＮＡを増幅する場合には制限エンドヌクレアーゼ部位を含む増幅産物を生成する。しかしながら、変異体ｃＤＮＡにおいては、ＰＣＲプライマー対は制限エンドヌクレアーゼ部位を含まない増幅産物を生成する。しかしながら、上記でゲノムＤＮＡ増幅について述べたように、他のプライマー対は、制限エンドヌクレアーゼ部位の存在に無関係に本発明のＶ因子突然変異を検出する増幅ｃＤＮＡを調製するのに使用するために企図される。ＰＣＲ増幅産物を生成するためにＶ因子ｃＤＮＡを増幅するのに好ましいプライマー対は、配列、5′-CAGGAAAGGAAGCATGTTCC- 3′（配列番号１０）で表される第１プライマー、ＦＶ１３、及び5′-TGCCATTCTCCAGAGCTAGG- 3′（配列番号１１）で表される好ましい第２プライマー、ＦＶ２を含んでいる。次に、ＦＶ１３／ＦＶ２プライマー対からこのように生成されたサイズが２２９７塩基対のＰＣＲ増幅産物について、好ましくは下記のＢ３ｂで述べられるヌクレオチド配列分析によりＶ因子ｃＤＮＡのヌクレオチドの位置１６９１のグアニンヌクレオチドからアデニンヌクレオチドへの変化として特徴づけられた点突然変異の存在が分析される。ＰＣＲ増幅産物を生成するＶ因子ｃＤＮＡを増幅する他の好ましいプライマー対は、配列、5′-CATACTACAGTGACGTGGAC- 3′（配列番号４）で表される第１プライマー、ＦＶ７及びヌクレオチド配列、5′-TGCTGTTCGATGTCTGCTGC- 3′（配列番号１２）で表される第２プライマー、ＦＶ８Ａを含んでいる。得られた増幅産物は、サイズが１２４塩基対である。好適実施態様においては、ＦＶ７とＦＶ８Ａのプライマー対は、鋳型として用いられるプライマー対ＦＶ１３及びＦＶ２によるＰＣＲからのｃＤＮＡ増幅産物によるＰＣＲ増幅に用いられる。その手順は、次に第１配列の増幅産物が第２反応の鋳型として用いられ別のＰＣＲプライマー対が後者の反応に用いられるので２工程又は連続ＰＣＲとも呼ばれる。２工程ＰＣＲ方法は、個々の開始部位として企図されない鋳型の領域に対してＰＣＲプライマーによる偽の及び非特異的開始の可能性を減少させるという利点がある。言い換えれば、約６９００塩基対Ｖ因子ｃＤＮＡヌクレオチド配列のように鋳型が大きい場合には１工程ＰＣＲ増幅で好ましい小さなＰＣＲ増幅産物を生成することにより、所望の産物及び予想されない鋳型ｃＤＮＡの領域からのものを含む増幅産物の不均一な混合物が得られる。従って、開始反応の特異性を高めかつ好ましい増幅産物の収率を高めるために、特に増幅用鋳型が大きい場合に２工程又は連続ＰＣＲ法が好ましい。しかしながら、ｃＤＮＡ特異的プライマー対、好ましくはプライマー対ＦＶ７及びＦＶ８ＡでｃＤＮＡ増幅産物を生成する代替的実施態様においては、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）から合成された無傷Ｖ因子ｃＤＮＡ鋳型の使用で行われる。このようにＦＶ７／ＦＶＢプライマー対から生成されたＰＣＲ増幅産物について、次に好ましくは下記のＢ３ｂで述べられるヌクレオチド配列分析により、更に好ましくはＢ３ａで述べられるＭｎｌＩ制限消化分析によりＶ因子ｃＤＮＡのヌクレオチドの位置１６９１にグアニンヌクレオチドからアデニンヌクレオチドへの変化として特徴づけられた点突然変異の存在が分析される。好ましくは、ＰＣＲ産物は、配列、5′-GACAGGCNAGG- ３′(配列番号１)(Ｎは正常なＶ因子遺伝子でのようにグアニン（Ｇ）或いは変異体遺伝子でのようにアデニン（Ａ）である)で表される５′から３′の方向に書かれた連続ヌクレオチド配列、又はＶ因子ｃＤＮＡのヌクレオチド１６９１を含むその断片である。従って、ＰＣＲプライマー対は、正常なＶ因子ｃＤＮＡのヌクレオチド１６９１にヌクレオチドグアニンを含む増幅産物を生成するが、変異体ｃＤＮＡヌクレオチドにおいてはグアニンがアデニンヌクレオチドに置き換えられる。ｃＤＮＡを増幅することについて本明細書で記載された好ましいプライマー対により、点突然変異のない正常な対立遺伝子のＶ因子遺伝子の好ましい増幅ヌクレオチド領域は、5′-ACAGGCG AGG- 3′（配列番号６）に対応するヌクレオチド配列又はその断片である。ゲノムＤＮＡとのように、ｃＤＮＡのヌクレオチドの位置１６９１に対応するグアニンヌクレオチドの存在は、正常な対立遺伝子に存在するＭｎｌＩ制限エンドヌクレアーゼ消化部位を与える。ｃＤＮＡの対応する好ましいヌクレオチド増幅変異体ヌクレオチド領域は、5 ′-ACAGGCA AGG- 3′（配列番号７）に対応するヌクレオチド配列又はその断片である。ｃＤＮＡのヌクレオチドの位置１６９１に対応するアデニンヌクレオチドの存在は、正常なｃＤＮＡに存在するＭｎｌＩ制限エンドヌクレアーゼ消化部位を破壊する。正常なｃＤＮＡでは、上記のプライマー対ＦＶ１３及びＦＶ２による増幅から得られた増幅ヌクレオチド領域は、実質的に無傷Ｖ因子ｃＤＮＡのヌクレオチドの位置１６９１に対応するｃＤＮＡヌクレオチドの位置１６１４にグアニンヌクレオチドを有する配列番号２７に示された２２９７塩基対ヌクレオチド配列からなる。無傷Ｖ因子ｃＤＮＡの１６９１と比べて配列番号２７の１６１４であるグアニンヌクレオチドのヌクレオチドの位置の違いの根拠は、配列番号２７に示された増幅ｃＤＮＡの番号をつける慣例から生じるものである。後者では、ヌクレオチドの位置１は、配列番号１３並びに図６Ａ及び図６Ｂの双方に示されたＶ因子ｃＤＮＡのヌクレオチドの位置７８に対応する。点突然変異を含むｃＤＮＡでは、対応する増幅ヌクレオチド領域は、実質的に上記の無傷Ｖ因子ｃＤＮＡのヌクレオチドの位置１６９１に対応するヌクレオチドの位置１６１４にアデニンヌクレオチドを有する配列番号２８に示される２２９７塩基対ヌクレオチド配列からなる。後者の存在は、正常なＭｎｌＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を破壊する。正常及び変異体双方の増幅ｃＤＮＡヌクレオチド配列は、位置１６１４のヌクレオチド（前に述べた無傷ｃＤＮＡのヌクレオチドの位置１６９１に対応する）が“ｎ”として示される配列番号１７の配列に示され、“ｎ”は正常なＶ因子ｃＤＮＡではグアニンヌクレオチド或いは変異体Ｖ因子ｃＤＮＡでは点突然変異を示すアデニンヌクレオチドである。正常なｃＤＮＡでは、上記プライマー対ＦＶ７及びＦＶ８Ａによる増幅から得られた増幅ヌクレオチド領域は、実質的にｃＤＮＡヌクレオチドの位置１６９１にグアニンヌクレオチドを有するヌクレオチドの位置１６０１〜１７２４の配列番号１３に示される１２４塩基対ヌクレオチド配列からなる。点突然変異を含むｃＤＮＡでは、対応する増幅ヌクレオチド領域は、実質的に１６９１ヌクレオチドの位置にアデニンヌクレオチドを有するヌクレオチドの位置１６０１〜１７２４の配列番号２６に示されたヌクレオチド配列からなる。後者の存在は、正常なＭｎｌＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を破壊する。従って、Ｖ因子ｃＤＮＡにおいてＶ因子遺伝子突然変異を同定する方法では、ＭｎｌＩ部位が正常なＶ因子核酸に本質的に存在するので、点突然変異が存在しない場合にはＰＣＲプライマー対は制限エンドヌクレアーゼ部位を含むｃＤＮＡ増幅産物を作製する。１実施態様においては、得られた増幅産物は、次に、点突然変異が存在しない場合には制限部位を認識しかつｃＤＮＡ増幅産物を切断する制限エンドヌクレアーゼ、好ましくはＭｎｌＩで制限条件下に処理される。結果として、正常対立遺伝子と罹患対立遺伝子間の制限消化パターンは、ｍＲＮＡ試料からつくられたｃＤＮＡ中の点突然変異の有無の決定を可能にする。他の実施態様においては、同様の増幅産物は、点突然変異の有無を求めるためにヌクレオチド配列分析又は核酸配列技術により分析される。また、ヌクレオチドの位置１６９１にグアニンのアデニンへの点突然変異を有する全長Ｖ因子ｃＤＮＡがかかる産物を増幅するように設計されたプライマー対によって生成された本発明の増幅産物であるように企図される。その増幅ｃＤＮＡ産物のヌクレオチド配列は、ヌクレオチドの位置９からヌクレオチドの位置６９１７までの配列番号２６に示される。前に述べた及びその配列に示された５′ 及び３′末端８量体ＥｃｏＲＩクローニングリンカーは、Ｖ因子ｃＤＮＡを含まない。従って、Ｂ３ａ及びＢ３ｂ項に各々記載される制限分析及びヌクレオチド配列は共にｃＤＮＡ増幅産物における本発明のグアニンのアデニンへの点突然変異の有無の決定を与える。かかるヌクレオチド配列決定及び制限消化分析は、各々実施例１Ｄと１Ｅに記載される。３．Ｖ因子核酸標品の分析方法本発明の方法によって生成された増幅産物を分析するのに使用するために企図される下記に述べられるさまざまな分析法は、患者についてＡＰＣ耐性と関連があるＶ因子遺伝子突然変異をスクリーニングする手段を与える。特に、本分析法は、エキソン１０のヌクレオチドの位置２０５及び対応するｃＤＮＡのヌクレオチドの位置１６９１のＶ因子のグアニンのアデニンへの点突然変異の有無の決定を可能にする。ａ．制限エンドヌクレアーゼ消化分析好適実施態様においては、分析は、増幅産物を制限条件下に、産物中の制限部位を認識しかつ増幅産物を特定部位で切断して制限産物を形成する制限酵素で処理する工程を含む。次に、得られた制限消化産物は下記のように検出される。同型接合態では、正常或いは変異体対立遺伝子が存在し、本明細書に記載された方法で検出される。異型接合態では、正常及び変異体双方の対立遺伝子が存在し、本明細書に記載された方法で検出される。本発明の方法で使用するために企図される増幅産物の制限消化は、使用される制限エンドヌクレアーゼの種類及び特異性によって必要とされる最適制限条件下で行われる。一般的には、制限エンドヌクレアーゼ、制限バッファー、消化温度及び消化時間等が含まれ、個々の制限エンドヌクレアーゼに最適である制限条件は、産物材料に製造業者の使用説明書によって示される。制限エンドヌクレアーゼの異なる製造業者は、同じエンドヌクレアーゼに対してでさえ非常に異なる消化条件を推奨する。結果として、たいていの製造業者は個々の産物について反応条件を最適化したので、使用制限条件は制限エンドヌクレアーゼの選択及び製造業者の使用説明書によって支配される。ＭｎｌＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼの具体的な制限条件は、各々時間１Ｂ及び１Ｃに示される。制限エンドヌクレアーゼ消化分析による分析の関係において、本発明は更に生成した制限消化産物を検出する手段を必要とする。従って、好適実施態様においては、制限産物の存在はＤＮＡ断片を分離及び同定するために用いられる標準法であるアガロース又はポリアクリルアミドゲルによる電気泳動によって検出される（Sambrookら，Molecular Cloning ，A Laboratory Manual，2nd ed.，Cold Sp ring Harbor Press,コールドスプリングハーバー，ニューヨーク，1989）。その手法は、作業が迅速及び簡便である。アガロース又はポリアクリルアミドゲルに加えられるＤＮＡは、分子量に基づいて電気泳動で分離される。電気泳動に続いてゲルの中のＤＮＡ断片の位置が、ＤＮＡを臭化エチジウムのような蛍光挿入染料で染色すると共にゲルを紫外線のもとで試験することにより直接求められる(Sharpら，Biochem ．12:3055，1973)。従って、ＭｎｌＩとのインキュベーションに続いてＤＮＡ断片の分子量が得られたＤＮＡ断片の泳動を市販のＤＮＡ分子量標準と比べることにより求められる。好ましくは、増幅産物において本発明のグアニンのアデニンへの点特異的の有無を分析するために用いられる制限エンドヌクレアーゼは、Ｉ型制限エンドヌクレアーゼＭｎｌＩであり、制限部位は配列5′-ACAGGCG AGG- 3′（配列番号６； Brinkleyら，Gene 100:267，1991）で表され、下線をひいたグアニンヌクレオチドはＶ因子ゲノムＤＮＡのエキソン１０のヌクレオチドの位置２０５及びＶ因子ｃＤＮＡのヌクレオチドの位置１６９１に対応する。変異体対立遺伝子では、Ｖ因子遺伝子のエキソン１０の位置２０５のヌクレオチド配列は 5′-ACAGGCA AGG- 3′（配列番号７）で表され、下線のヌクレオチドはアデニン点突然変異を示す。ＭｎｌＩは、特異的二本鎖ヌクレオチド配列（制限エンドヌクレアーゼ認識部位又は認識部位）を認識し、その認識部位の中に含まれないヌクレオチド配列の中の位置の二本鎖ＤＮＡの両鎖を切断する。制限エンドヌクレアーゼによる二本鎖ヌクレオチド配列の切断により制限産物が得られる。Ｉ型制限エンドヌクレアーゼの認識部位を示すヌクレオチド配列は、パリンドロームではない。慣例により、ＭｎｌＩの認識部位は、下記の二本鎖ヌクレオチド配列で表される。 5′-CCTCNNNNNNN- 3′（配列番号２０） 3′-GGAGNNNNNN- 5′ （配列番号２１）式中、Ｎは任意のヌクレオチドである（Brinkleyら，Gene 100:267，1991）。従って、エキソン１０ではＶ因子遺伝子のヌクレオチドの位置１９９〜２０８及びｃＤＮＡではＶ因子ｃＤＮＡのヌクレオチドの位置１６８５〜１６９４のコードヌクレオチド配列5′-ACAGGCGAGG- 3′（配列番号６）は、５′から３′へ読み取った配列番号２１に示されるＭｎｌＩ配列に対応する。そのようなものとしての配列は、ＭｎｌＩ認識部位を示す二本鎖ＤＮＡの単鎖である。ＭｎｌＩによる切断パターンにより上記に示される３′の１塩基対突出部分が生じるので、本発明のＭｎｌＩ消化によって生成された断片サイズを求めることに対してとられた約束は、上記ヌクレオチド配列の特異性のいずれかをもつ増幅産物のコーディング鎖又はセンス鎖のＭｎｌＩ制限消化切断に基づいている。例えば、実施例１Ｂで述べられるように増幅ゲノム或いはＶ因子からのｃＤＮＡにおいては、５′ＭｎｌＩ部位はコーディング鎖に３′の１塩基突出部分を有し、エキソン１０にヌクレオチド２０５（ｃＤＮＡではヌクレオチド１６９１）を含む３′ＭｎｌＩ部位はちょうど逆で非コーディング鎖又はアンチセンス鎖に３′ の１塩基突出部分を有する。従って、３′ＭｎｌＩ部位のコーディング鎖は、短い切断産物である。コーディング鎖切断部位に基づいてＭｎｌＩ消化から得られる制限産物を算出すると二本鎖ＭｎｌＩ部位によって＋１塩基か或いは−１塩基である。Ｖ因子遺伝子のエキソン１０のヌクレオチドの位置１９９〜２０８にＭｎｌＩ認識部位を含む対立遺伝子は、正常な対立遺伝子である。正常な対立遺伝子のＶ因子遺伝子に由来する増幅産物は、ＭｎｌＩの存在下に切断されて制限産物を生成する。従って、ヌクレオチドの位置２０５のＶ因子遺伝子のエキソン１０及びヌクレオチドの位置１６９１のＶ因子ｃＤＮＡのグアニンからアデニンへのＭｎｌＩ認識部位を示すヌクレオチド配列の変化は、ＭｎｌＩ認識部位を消失する。結果として、Ｖ因子遺伝子のエキソン１０のヌクレオチドの位置１９９〜２０８にＭｎｌＩ認識部位を含まない対立遺伝子は変異体対立遺伝子である。従って、Ｖ因子遺伝子のエキソン１０のヌクレオチドの位置１９９〜２０８にＭｎｌＩ認識部位を含まない変異体対立遺伝子のＶ因子遺伝子に由来する増幅産物は、ＭｎｌＩの存在下に切断されずに制限産物を生成する。従って、対立遺伝子が共に変異体である同型変異体Ｖ因子遺伝子型では、制限エンドヌクレアーゼＭｎｌＩはＶ因子遺伝子のエキソン１０の位置２０５で切断しない。従って、同型変異体遺伝子型は、増幅産物にＭｎｌＩ制限エンドヌクレアーゼ部位がなくヌクレオチドの位置２０５を含むことにより検出される。異型Ｖ因子遺伝子型では、正常及び変異体双方の対立遺伝子の存在は制限エンドヌクレアーゼＭｎｌＩの存在下に正常及び変異体対立遺伝子のＶ因子遺伝子に由来する増幅産物をインキュベートした切断及び非切断ＤＮＡ両者の各々の存在により検出される。対照的に、同型接合正常Ｖ因子対立遺伝子は、エキソン１０のヌクレオチドの位置２０５を含むＭｎｌＩ部位で共に消化される。従って、電気泳動で観察可能な微分ＭｎｌＩ消化パターンは、本発明のグアニンのアデニンへの点突然変異について患者の試料の遺伝子型の決定を可能にする。ゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡ双方のＰＣＲ増幅産物の具体的なＭｎｌＩ制限消化分析は、各々実施例１Ｂ及び１Ｅに記載される。代替的実施態様においては、グアニンのアデニンへの点突然変異の存在はＨｉｎｄＩＩＩによる増幅産物の消化又は消化がないことにより検出される。ＨｉｎｄＩＩＩは、特定の二本鎖ヌクレオチド配列（制限エンドヌクレアーゼ認識部位又は認識部位）を認識すると共に認識部位の中の位置の二本鎖ＤＮＡの両鎖を切断するＩＩ型制限エンドヌクレアーゼである。ＨｉｎｄＩＩＩは、下記の配列で表される二本鎖ＤＮＡを認識する。 5′-AAGCTT- 3′（配列番号２３）ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼの特定の切断は、特定数のヌクレオチドを含む制限産物を生じる。従って、特定数のヌクレオチドを含むＨｉｎｄＩＩＩ制限産物は、ＨｉｎｄＩＩＩによる二本鎖ＤＮＡの切断により生じる。変異体対立遺伝子増幅産物におけるＨｉｎｄＩＩＩヌクレオチド配列5′-AAGC TT- 3′（配列番号２３）は、エキソン１０のヌクレオチドの位置２０５〜２１０に対応する。配列番号２３に示された配列を含む二本鎖ＤＮＡをインキュベートすることによりＤＮＡの両鎖の切断が生じ、下記の構造を生成する。 5′-A- 3′ 3′-TTCGA- 5′（配列番号２３、５′→３′方向に示されるヌクレオチドの位置２〜６）。増幅した正常対立遺伝子の相対物は、ヌクレオチド配列5′-GAGCTT- 3′（配列番号２５）である。その配列は、ＨｉｎｄＩＩＩ認識部位を示さず、制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄＩＩＩの存在下にインキュベートした場合にヌクレオチドの位置２０５で切断されない。従って、電気泳動で観察可能な微分ＨｉｎｄＩＩＩ消化パターンは、本発明のグアニンのアデニンへの点突然変異について患者の試料の遺伝子型を求めることを可能にする。ゲノムＤＮＡＰＣＲ増幅産物の具体的なＨｉｎｄＩＩＩ制限消化分析は、実施例１Ｃに記載される。新しい制限部位特異性を用いる代替的プライマーの設計で必要とされる他の制限エンドヌクレアーゼ分析法は、本発明で使用するために企図される。ｂ．Ｖ因子核酸標品の配列分析本発明の他の実施態様においては、分析は、実施例１Ａ及び１Ｄに記載される各々Ｖ因子遺伝子のエキソン１０のヌクレオチドの位置２０５及びＶ因子ｃＤＮＡのヌクレオチドの位置１６９１の増幅産物のヌクレオチド配列を決定する工程を含む。核酸配列分析は、本発明の方法に記載されるＰＣＲから得られた増幅産物を含むＶ因子核酸標品を分析する制限消化分析法に対する代替的方法である。核酸配列分析の決定は、患者から単離した非ＰＣＲ増幅核酸試料に対して企図される。上記実施態様のいずれの場合にも、使用核酸試料についてかかる分析は（ａ）プローブ鎖とその相補的標的のハイブリッド形成又は変性に基づく物理化学的手法と（ｂ）エンドヌクレアーゼ、リガーゼ及びポリメラーゼとの酵素反応とを組合わせることにより行われる。核酸は、ＤＮＡ或いはＲＮＡとして分析される。ＤＮＡにおいては個々のヒトの遺伝子の位置が分析され、ＲＮＡにおいては個々の細胞の発現情報が求められる。配列決定については、形成されるべきプライマーが既知のＶ因子配列に対してハイブリッド形成することができかつ配列決定のためにＤＮＡの領域へのプライマー拡張を開始する場合又は前の配列決定がヌクレオチド配列領域を決定しかつプライマーが新しく配列決定された領域から未知の配列の領域に拡張するように設計される場合のように鋳型ＤＮＡの配列を知ることができる。その後者の方法は、各ラウンドの配列決定が前に決定された配列に基づいて設計されたプライマーによって特定されるので“特定配列決定”と呼ばれる。本発明のＶ因子のグアニンのアデニンへの点突然変異の有無を求めるために患者の試料からのＶ因子遺伝物質を分析するのに有用な具体的な配列決定方法は、実施例１に記載される。好ましい配列決定プライマーは、ＦＶ２３と呼ばれ、その配列は配列番号２２に示される。ｃ．ハイブリッド形成分析用Ｖ因子核酸標品の検出核酸ハイブリッド形成を用いる分析において、本発明の方法におけるＤＮＡ二重らせんの存在の検出は種々の手段で達成される。ＤＮＡ二重らせんの存在を検出する方法においては、ＤＮＡ二重らせんでハイブリッド形成されるオリゴヌクレオチドとしては二重らせんを検出可能にする標識又は指示基が含まれる。かかる標識としては、典型的には放射性原子、化学的修飾ヌクレオチド塩基等が挙げられる。オリゴヌクレオチドは、指示手段又は指示基に標識、即ち、作用上結合され、標的鋳型中の個々のヌクレオチド配列の存在を検出するために用いられる。オリゴヌクレオチドプローブの一部に作用上結合されるか又はその一部として存在する放射性元素（標識オリゴヌクレオチド）は、ＤＮＡ二重らせんの検出を容易にするのに有用な手段となる。典型的な放射性元素は、β線を放出するものである。³Ｈ、¹²Ｃ、³²Ｐ及び³⁵Ｓのようなβ線を放出する元素は、β線放出放射性元素標識の１種である。放射性ポリヌクレオチドプローブは、典型的には放射性標識ヌクレオチドをＤＮＡキナーゼを用いて核酸に酵素的に取り込むことにり調製される。放射性標識オリゴヌクレオチドの別のものは、金属錯化剤、ビオチン含有基、蛍光化合物等を含むように化学的に修飾されるオリゴヌクレオチドである。有用な金属錯化剤は、ランタニドと芳香族β−ジケトンによって生成されるランタニドキレートであり、ランタニドはＥＤＴＡ類縁体のようなキレート形成化によって核酸又はオリゴヌクレオチドに結合するので蛍光ランタニド錯体が形成される。米国特許第4,374,120号、同第4,569,790号及び公開された欧州特許出願第0139675号及び国際出願第87/02708号参照。ビオチン又はアクリジンエステル標識オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドを標識するために用いられるその使用が記載された。米国特許第4,707,404号、公開された欧州特許出願第0212951号及び欧州特許出願第0087636号参照。有用な蛍光マーカーとしては、フルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド、ＮＢＤ等が挙げられる。ＤＮＡ二重らせんに存在する標識オリゴヌクレオチドは二重らせん自体を標識するので分析されるべき試料中に存在する他の核酸より区別できるようにする。二重らせんにおける標識の存在の検出、もって、二重らせんの存在の検出は、典型的にはＤＮＡ二重らせんに対してハイブリッド形成されない標識オリゴヌクレオチドプローブからＤＮＡ二重らせんを分離することを必要とする。ＤＮＡ二重らせんを形成するのに有用な好ましいオリゴヌクレオチドは、配列番号６及び７に対応するヌクレオチド配列、各々正常及び変異体Ｖ因子核酸からのコーディング鎖ＭｎｌＩ制限エンドヌクレアーゼ配列である。他の好ましいオリゴヌクレオチドは、配列番号２３及び２５に示されるもの、各々正常及び変異体Ｖ因子核酸からのコーディング鎖ＨｉｎｄＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼ配列である。非ハイブリッド形成標識オリゴヌクレオチドのような一本鎖オリゴヌクレオチドをＤＮＡ二重らせんから分離する技術は周知であり、典型的には化学的性質に基づいて二本鎖核酸から一本鎖核酸を分離することを必要とする。たいてい分離技術は、非ハイブリッド形成プローブが不溶性マトリックスに結合されるＤＮＡ二重らせんから典型的には洗浄により分離される不均一ハイブリッド形成形態の使用を必要とする。具体例はサザンブロット法であり、基質はニトロセルロース紙であり、標識は³²Ｐである（Southern，J ．Mol．Biol．98:503，1975）。オリゴヌクレオチドは、また、典型的には５′末端で又はその近傍で固体マトリックスに、即ち、水不溶性固体支持体に有利に結合される。有用な固体マトリックスは、当該技術において周知であり、Pharmacia Fine Chemicals(ニュージャージー州ピスカタウェイ)から商品名SEPHADEXとして市販されているような架橋デキストラン；アガロース、ポリスチレン又は直径約１ミクロンから約５mmまでのラテックスビーズ、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、架橋ポリアクリルアミド、ニトロセルロース又はナイロン系ウェブ、例えば、シート、ストリップ、パドル、プレートマイクロタイターウェル等が挙げられる。また、“結合”ヌクレオチドをオリゴヌクレオチド部分の５′又は３′端に付加し、その部分を固体支持体に作用上結合するためにその結合オリゴヌクレオチドを用いることが可能である。ヌクレオチドハイブリッド形成分析においては、ハイブリッド形成反応混合物は、ハイブリッド形成産物、即ち、オリゴヌクレオチドと標的核酸を含む複合体を形成する鋳型に存在する相補的核酸配列に対してハイブリッド形成する鋳型上の所定の配列に対して相補性を有するオリゴヌクレオチドに十分な時間ハイブリッド形成条件下に企図された方法で維持される。ハイブリッド形成及び“ハイブリッド形成条件”及びその文法上の等価物は、維持時間と共に用いられる場合、ハイブリッド形成反応混合物を混合物中の反応成分及び随伴試薬の関係において１個以上のオリゴヌクレオチドを標的配列とアニールして核酸二重らせんを形成するのに十分な時間、温度及びｐＨ条件に供することを意味する。ハイブリッド形成を達成するために必要とされるかかる時間、温度及びｐＨ条件は、当該技術において周知であるようにハイブリッド形成されるべきオリゴヌクレオチドの長さ、オリゴヌクレオチドと標的間の相補性の程度、オリゴヌクレオチドのグアニジンとシトシンの含量、所望のハイブリッド形成の緊縮性、及びハイブリッド形成の速度論に影響することができるハイブリッド形成反応混合物中の塩又は追加試薬の存在に左右される。あるハイブリッド形成反応混合物のハイブリッド形成条件を最適化する方法は当該技術において周知である。典型的なハイブリッド形成条件としては、ｐＨ４〜９に緩衝化した溶液の使用が含まれ、４〜３７℃、好ましくは約１２〜約３０℃、更に好ましくは約２２℃ の温度で０.５秒〜２４時間、好ましくは２分〜１時間行われる。ハイブリッド形成は、周知である均一又は不均一形態で行われる。均一なハイブリッド形成反応は、溶液中で完全に起こり、オリゴヌクレオチドとハイブリッド形成されるべき核酸配列（標的）が共に溶液に可溶な形態で存在する。不均一反応は、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドプローブ或いは標的核酸が結合される反応媒体に不溶性であるマトリックスの使用を必要とする。標的配列を含む核酸が二本鎖（ｄｓ）の形である場合、ハイブリッド形成反応を行う前に加熱又はアルカリ処理のようにｄｓＤＮＡをまず変性することが好ましい。ｄｓＤＮＡの変性は、ハイブリッド形成されるべきオリゴヌクレオチドと混合する前に行われるか又はｄｓＤＮＡとオリゴヌクレオチドとを混合した後に行われる。オリゴヌクレオチドと鋳型間の所定の相補性は、２種類の方法で達成される。生成されるべきプライマーが既知のＶ因子配列に対してハイブリッド形成することができかつ本明細書に記載された続いての分析のためにＤＮＡ領域へのプライマー拡張を開始する場合又は前の配列決定がヌクレオチド配列領域を決定しかつプライマーが新しく配列決定された領域から未知の配列領域に伸長するように設計される場合のように、鋳型ＤＮＡの配列を知ることができる。ハイブリッド形成反応混合物に存在するオリゴヌクレオチドの有効量は、通常は周知であり、典型的にはハイブリッド形成されるべきオリゴヌクレオチドと鋳型間のモル比によって示される。好ましい比率は、等モル量の標的配列とオリゴヌクレオチドを含むハイブリッド形成反応混合物である。周知のように、等モル濃度の逸脱はハイブリッド形成反応産物を生成するが効率が低い。従って、一方の成分がもう一方の成分に相対して１００倍モル過剰量の比率であることができるが、５０倍未満、好ましくは１０倍未満、更に好ましくは２倍未満の過剰量が本発明を実施するのに望ましい。（１）膜固定化標識配列の検出ＤＮＡ（サザン）ブロット法においては、標的配列を膜上に固定化することによりゲノムＤＮＡの特定領域を検出する。ゲノムＤＮＡの特定領域は、ＰＣＲ増幅、ＰＣＲ増幅に続いて制限エンドヌクレアーゼによる消化或いはＰＣＲ増幅せずに制限エンドヌクレアーゼによる消化により調製される。ゲノムＤＮＡをまず単離する。次に、ゲノムＤＮＡの特定領域をＰＣＲ増幅して標的配列をつくり、そのまま分析されるか又は制限消化に供される。また、ゲノムＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼで切断して不連続分子量のＤＮＡ断片を生成する。次に、上記の生成した標的配列（ＤＮＡ断片）をアガロースゲルでサイズに応じて分離し、ニトロセルロース又はナイロン支持体に移す（ブロットする）。慣用の電気泳動は１００〜３０,０００塩基対の範囲の断片を分離するが、パルスフィールドゲル電気泳動は長さが２千万塩基対までの断片を分割する。次に、染色ＤＮＡの直接可視化により個々の標的配列を含む膜上の位置を求める。他の態様では、特定の標識核酸プローブとハイブリッド形成することにより配列移入が求められる。代替的実施態様においては、標的配列は、ドットブロット（スロットブロット）装置を用いて固体マトリックス（ニトロセルロース膜）上に直接固定化し、プローブハイブリッド形成で分析する。米国特許第4,582,789号及び同第4,617,261 号参照。固定化標的配列は、長さが約２０ヌクレオチド、好ましくは１７ヌクレオチドの合成ＤＮＡオリゴマーである対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）プローブでプロービングすることにより分析される。それらのプローブは、ゲノム内にユニークな配列を表すのに十分な長さであるが、標的分子に対するハイブリッド形成において内部ミスマッチによって不安定にするには十分に短い。従って、単一のヌクレオチドで異なる配列は、注意して制御されたハイブリッド形成条件下にＡＳＯプローブと正常又は変異体標的間のハイブリッドの異なる変性挙動により識別される。（２）溶液中の標的配列の検出核酸精製又は固定化を必要としない数種の迅速な技術が開発された。例えば、プローブ／標的ハイブリッドは、二本鎖核酸を優先的に結合するヒドロキシルアパタイトのような固体マトリックス上で選択的に単離される。また、プローブ核酸は、固体支持体上に固定化され、溶液からの標的配列を捕捉するために用いられる。標的配列の検出は、競合型分析では標的配列によって支持体から置き換えられるか或いはサンドイッチ型分析では標的配列の架橋作用によって支持体に結合される第２標識プローブによって達成される。オリゴヌクレオチド連結反応分析（ＯＬＡ）においては、選ばれた２つの合成オリゴヌクレオチド配列を共有結合するために酵素ＤＮＡリガーゼが用いられるので正確な頭−尾並列で標的配列を塩基対合することができる。２つのオリゴマーの連結反応は、結合領域のミスマッチヌクレオチドの存在によって妨げられる。その方法は、ＤＮＡ精製を必要とせずに細胞の試料における既知の配列変異体間で区別を可能にする。２つのオリゴヌクレオチドの接合部は、２つのオリゴヌクレオチドの１つを固定化しかつ第２標識オリゴヌクレオチドが捕捉されるかを観察することによりモニターされる。（３）塩基置換の検出の走査技術３つの手法が、未知の単一ヌクレオチドの置換又は他の配列相違について長さが数百塩基対のプローブ／標的二重らせんの分析を可能にする。リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）Ａ法では、標的ＲＮＡ又はＤＮＡ配列に対してミスマッチする位置で酵素が標識ＲＮＡプローブを切断する。断片がサイズに応じて分離され、突然変異の近似する位置が同定される。米国特許第4,946,773号参照。変性勾配ゲル法では、増加強度の変性勾配の電気泳動によりプローブ−標的ＤＮＡ二重らせんを分析する。変性は、泳動速度の減少により達成される。塩基対がミスマッチした二重らせんは、完全にマッチした二重らせんより急速に変性する。３番目の方法は、ミスマッチした塩基対の化学切断による方法である。ＴとＣ、Ｇ又はＴ間のミスマッチ及びＣとＴ、Ａ又はＣ間のミスマッチは、ヘテロ二本鎖で検出される。四酸化オスミウム（Ｔ及びＣミスマッチ）又はヒドロキシルアミン（Ｃミスマッチ）との反応に続いてピペリジンによる処理は、適切なミスマッチのプローブを切断する。Ｃ．組成物本発明は、また、エキソン１０のヌクレオチドの位置２０５に遺伝子突然変異を有するＶ因子遺伝子に由来する単離したポリヌクレオチド配列の組成物を提供する。本発明の組成物について本明細書で定義されるエキソン１０の位置２０５に同定された突然変異は、ヌクレオチドの位置１６９１を含む対応するＶ因子ｃＤＮＡ配列を包含する。企図された遺伝子突然変異は、グアニンヌクレオチドをアデニンヌクレオチドに置き換えることである。ポリヌクレオチド及びポリヌクレオチド配列とは、上記Ｂ１項で定義された。本明細書に記載された組成物は、合成、単離、精製、ＰＣＲ増幅らを含む慣用の核酸手順により得られる。本明細書に記載されたポリヌクレオチド配列組成物を含む増幅産物を生成するために供給したＶ因子核酸試料のＰＣＲ増幅を含む上記本発明の方法で使用するために指定されたものを含む方法が特に好ましい。好適実施態様においては、エキソン１０のヌクレオチドの位置２０５に遺伝子突然変異を有するＶ因子遺伝子に由来する単離したポリヌクレオチド配列は、長さが約４０ヌクレオチドから６９０９ヌクレオチドまでのヌクレオチド配列を含んでいる。本発明の好ましい組成物の範囲内で好ましいポリヌクレオチド配列としては、配列番号７及び２３に示されたヌクレオチド配列又はその断片を有するものが含まれる。個々の配列は、上記Ｂ２ａ項に記載されたものである。また、ヌクレオチドの位置９からヌクレオチドの位置６９１７までの配列番号２８及び２６に示されたｃＤＮＡヌクレオチド配列と共に実質的に配列番号３、１９に示されたゲノムＤＮＡヌクレオチド配列からなる好ましい変異体ポリヌクレオチド配列の組成物が企図される。個々の配列は、上記Ｂ２ａ及びＢ２ｂ項に記載されたものである。本発明の他の企図された組成物は、本発明の増幅産物を生成するためにＶ因子核酸を増幅するのに有用なポリヌクレオチドプライマーである。プライマーとは、上記Ｂ１項に定義されたものである。好ましいポリヌクレオチドプライマーは、ヌクレオチドの位置２５からヌクレオチドの位置３０までの配列番号２４に示されたヌクレオチド配列を有する。好ましいプライマーは、エキソン１０のヌクレオチドの位置２０５にグアニンのアデニンへの点突然変異を有するＶ因子遺伝子にＨｉｎｄＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を含む増幅産物を生成することができる。特に好ましいポリヌクレオチドプライマーは、実質的に配列番号２４に示されたヌクレオチド配列からなる。Ｄ．診断キット本発明は、また、上記の診断法及び組成物に従って患者のゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡ核酸試料において活性プロテインＣ耐性と関連があるＶ因子遺伝子中の遺伝子突然変異の検出に有用な好ましくはキット形態の診断系を企図する。従って、診断キットは、本発明の方法で行われるゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡをスクリーニングするのに有効である。キットは、Ｖ因子遺伝子のヌクレオチドの位置２０５を含む増幅産物のＰＣＲにより生成することができる第１プライマー及び第２プライマーを含む１対のプライマーを少なくとも１回の分析で行うのに十分な量で含む。本明細書で定義されるその点での突然変異は、グアニンヌクレオチドのアデニンヌクレオチドへの点突然変異を企図する。本明細書に示されるＶ因子ゲノムＤＮＡのエキソンの位置で表される突然変異の位置は、Ｖ因子ｃＤＮＡの対応する位置を包含する。診断キットの１態様では、プライマーは別々の容器に入っている。他の態様では、プライマー対は同じ容器内に保持されている。キット内に含まれるポリヌクレオチドプライマーは、供給された核酸試料からＤＮＡ産物を増幅することができる。従って、プライマーは、活性プロテインＣ耐性と関連があるＶ因子遺伝子の遺伝子点突然変異の有無を検出することを可能にする核酸配列の予め選ばれた領域の増幅用に設計される。Ｖ因子ゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡの両者を増幅するプライマー対が好ましい。ゲノムＤＮＡを増幅する特に好ましいプライマー対としては、配列番号４と５、及び配列番号４と２４の対合ヌクレオチド配列を有する第１プライマーと第２プライマーが含まれる。ｃＤＮＡを増幅する特に好ましいプライマーは、配列番号１０及び１１に示された配列を有するプライマー対である。別の実施態様においては、診断キットは、更に、配列番号２、１８及び２７に示されるヌクレオチド配列を有する正常なＶ因子遺伝子に由来する対照ポリヌクレオチド配列を含んでいる。対照とは、言及した配列を有するポリヌクレオチド断片が試験又は試料の核酸の制限消化パターンを供給された標準と比較する手段を開業医に与える標準としてキット内に供給される。結果として、増幅した試験産物がキット内に供給されたものに匹敵すること及び同じように消化されて等価な制限消化産物を生じることが開業医により証明される。従って、正常な対照ポリヌクレオチド配列は、患者の試料中本発明の点突然変異の有無を求める手段として患者の試験試料と比較するために含まれる。好ましい正常ポリヌクレオチド配列及び各制限エンドヌクレアーゼ特異性は、上記Ｂ２項で述べられたものである。本発明の診断キットは、更に、エキソン１０のヌクレオチドの位置２０５に遺伝子突然変異を有するＶ因子遺伝子に由来する対照ポリヌクレオチド配列を含む。好ましい対照突然変異ポリヌクレオチド配列としては、配列番号３、１９及び２８に示されるものが挙げられる。上記正常対照配列とのように、変異体対照ポリヌクレオチド配列は、患者試料において本発明の点突然変異の有無を求める手段として患者試験試料と比較するために含まれる。好ましい正常対照ポリヌクレオチド配列及び各制限エンドヌクレアーゼ特異性は上記Ｂ２項に記載されたものである。典型的には、包装された試薬の使用説明書も含まれる。 “使用説明書”は、典型的には試薬濃度又は混合される試薬と試料の相対量、試薬／試料混合物の維持時間、対照ポリヌクレオチド配列の使用、温度、バッファー条件等の少なくとも１種の分析法パラメーターを記載している確実な表現が含まれる。診断キットを供給する１態様では、ポリヌクレオチドプライマーは検出可能な標識で標識される。放射性元素は、有用な標識物質であり、本明細書で有効である。具体的な放射能標識物質は、α線を放出する放射性元素である。³²Ｐ、³⁵Ｓ及び³³Ｐのようなそれ自体がα線を放出する元素は、α線放出放射性元素指示基の１種である。³²Ｐが特に好ましい。¹¹¹インジウム又は³Ｈのようなβ放射体も有用である。本明細書に記載される診断系の試薬類、ポリヌクレオチド又は増幅剤は、溶液、液体分散液又は実質的に乾燥した粉末、例えば、凍結乾燥形態として供給される。診断系に関して本明細書に述べられる包装材料は、診断系に通常用いられるものである。 “包装”とは、本発明のポリヌクレオチドのような診断試薬を所定の制約内に保持することができるガラス、プラスチック（例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン及びポリカーボネート）、紙、ホイル等の固体マトリックス又は材料を意味する。従って、包装は、ビン、バイアル、プラスチック及びプラスチック−ホイルラミネートエンベロープ又は企図された診断試薬を含むように用いられる類似容器とすることができる。本発明の分析に有用な材料は、理想的には、少なくとも１回の分析を行うのに十分な量を有するキットの調製に適当であるものである。かかるキットは、バイアル、チューブ等の１個以上の容器手段を密閉した状態で与える仕切られている運搬手段を含むことができ、容器手段の各々は本方法に用いられるべき別個の要素の１つを含んでいる。例えば、容器手段の１つは検出可能に標識されるか又は又は標識することができる本発明のポリヌクレオチドを含むことができる。キットは、また、診断法を行うために用いられる任意の他の上記ポリヌクレオチド試薬を含む容器を含んでいることができる。実施例下記の実施例は、具体的に説明するものであり決して明細書及び請求の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。１．ＡＰＣ耐性患者からのゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡにおけるグアニンのアデニンへの点突然変異の検出関連しない患者及び関連した患者両者におけるＡＰＣ耐性の遺伝子の根拠を求めるために、Ｖ因子遺伝子のヌクレオチド配列を下記のように決定した。更に、患者においてＡＰＣ耐性の遺伝子の根拠を求めるために別の分析を与えるスクリーニング法を開発した。かかる決定を行うのに用いられる方法は、本明細書に記載され、ＡＰＣ耐性に関連した同型接合及び異型接合双方の遺伝子型の検出を可能にする。Ａ．ゲノムＤＮＡの調製及びヌクレオチド配列決定３人の息子が若い年齢で発症する再発静脈血栓症に罹った家族からの白血球から高分子量ＤＮＡを抽出した。深部静脈血栓症（ＤＶＴ）の診断は、ＡＰＴＴ凝固分析で測定したＡＰＣに対する抗凝血剤応答によって３人の患者において３人のうち２人がＡＰＣ耐性であるので十分に確立された。再発血栓症をもつ２人の息子及びいままでのところ無症候性の２人の娘のＡＰＣ比は、１.２未満かそれに等しい。正常なＡＰＣ比は、男性で≧２.１９及び女性で≧１.９４である。最後の妊娠と関連してＤＶＴに罹った母親と父親の各々のＡＰＣ耐性比は、１.６及び２.０であった。プロテインＣ、プロテインＳ及び抗トロンビンＩＩＩのレベルは、それらの個体において正常な範囲内であった。息子の１人は、経口抗凝血剤で慢性的に維持されたのでＡＰＣ耐性を試験しなかった。ワルファリンのような経口抗凝血剤の使用は、はじめに記載されたＡＰＴＴ試験を用いてＡＰＣ耐性の正確な決定を得る能力を妨害する。上記Ｂ項で述べ本明細書で分析したように、異型接合対立遺伝子の遺伝子型における変異体対立遺伝子はＶ因子遺伝子のエキソン１０のヌクレオチドの位置２０５のヌクレオチドがグアニンからアデニンへの変化として特徴づけられた点突然変異を有する。エキソン１０の突然変異部位がヌクレオチドの位置２０５と言われることに対してとられた約束は、Ｂ項で述べた。また、同じヌクレオチドの位置に正常なグアニンヌクレオチドをもつ正常な対立遺伝子も異型接合遺伝子型に存在する。同型変異体遺伝子型では、両者の対立遺伝子は変異体である。言い換えれば、両者の対立遺伝子は、Ｖ因子遺伝子のエキソン１０のヌクレオチドの位置２０５にグアニンからアデニンへのヌクレオチドの変化がある。同型接合正常遺伝子型では、両者の対立遺伝子は正常である。言い換えれば、両者の対立遺伝子はＶ因子遺伝子のエキソン１０のヌクレオチドの位置２０５にグアニンがある。従って、上記のヌクレオチド配列の決定に基づいてＶ因子遺伝子のエキソン１０のヌクレオチドの位置２０５の正常及び変異体対立遺伝子の有無を分析するために、ＡＰＣ耐性家族から採血し、ＡＣＤ抗凝血剤で抗凝血し、２４時間以内に処理した。静脈血栓症に罹った家族において、最も最近の血栓症エピソードの少なくとも３ヵ月後の試料を入手した。沈降した赤血球、単核細胞及び多核細胞を再懸濁し、冷却した０.１４M ＰＢＳ、ｐＨ７.４で出発血液容量と等しい容量で希釈した。低内毒素フィコール−ハイパック(Sigma，ミーズリー州セントルイス )で４００×ｇ、１８℃で１０分間遠心分離することにより希釈細胞懸濁液から末梢血白血球を回収した。次に、沈降した白血球を再懸濁し、高分子量ＤＮＡ源に用いた。本発明を行うのに用いられるプライマーは、製造業者の説明書に従って、アプライドバイオシステムス381A DNAシンセサイザーで合成した。 Lindblomら，Gene Anal ．Tech.，5:97，1988に記載されるように末梢血試料からゲノムＤＮＡを単離した。次に、５０μlのゲノムＤＮＡからの２μlを、１００ピコモルの配列5′-CATACTACAGTGACGTGGAC- 3′（配列番号４）を有する５′ センスプライマー（第１プライマーとも呼ばれる）、ＦＶ７、１００ピコモルの配列5′-TGCTGTTCGATGTCTGCTGC- 3′（配列番号１２）を有する３′アンチセンスプライマー（第２プライマーとも呼ばれる）、ＦＶ８Ａ及び最終濃度の各々２００nMのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ、１×Ｔａｑポリメラーゼバッファー(Promega，ウィスコンシン州マディソン)、２mMＭｇＣｌ₂及び０.５単位のＴａｑポリメラーゼバッファー(Promega，ウィスコンシン州マディソン) を含有する４０μlのＰＣＲ反応混合液で希釈した。５′センスプライマー、ＦＶ７は、図５Ａ（配列番号１５）に示されるＶ因子遺伝子のエキソン１０のヌクレオチドの位置１１５〜１３４に対応する。３′プライマー、ＦＶ８Ａは、Ｖ因子エキソン１１のヌクレオチドの位置４〜２３に対応する。反応混合液に鉱油を重ね、３０サイクルの増幅に供した。各増幅サイクルとしては、９４℃で１分間の変性、６０℃で２分間のアニーリング及び７２℃ で３分間の伸長に続いて２サイクルの６０℃で２分間のアニーリング及び７２℃ で３分間の伸長が含まれた。反応混合液から増幅プライマーを取り出した後、ウィザードＰＣＲプレプカラムを用いて製造業者の条件に従って(Promega，ウィスコンシン州マディソン)ヌクレオチド配列を決定した。得られた増幅産物は、Ｖ因子遺伝子のエキソン１０のヌクレオチドの位置１１５〜２１５、イントロン１０のヌクレオチドの位置１〜３１００及びエキソン１１のヌクレオチドの位置１〜２３に対応するゲノムＤＮＡの一部から構成された (Cripeら，Biochem．31:3777，1992)。増幅ゲノムＤＮＡ産物の長さは、約３２００塩基対であった。得られた増幅ＤＮＡのヌクレオチド配列を決定するために、³⁵Ｓ−ｄＡＴＰ(A mersham,イリノイ州アーリントンハイツ)を取り込む配列決定反応は、fmolサイクルシークエンシングキット(Promega，ウィスコンシン州マディソン)及びＶ因子特異的プライマーＦＶ２３(5′-ATCGCCTCTGGGCTAATAGG- 3′、配列番号２２) を用いて鋳型の精製せずに行った。ＦＶ２３プライマーは、Ｖ因子遺伝子のエキソン１０のヌクレオチドの位置１４７〜１６６に対応する（図５Ａ及び配列番号１５）。ＡＰＣ耐性をもつ２人の患者のＶ因子遺伝子に由来する増幅産物から直接決定したヌクレオチド配列は、２つの異常の１つを示した。まず、Ｖ因子遺伝子のエキソン１０のヌクレオチドの位置２０５に対応する配列決定用ゲルに２つのバンドが見られ、正常なグアニンヌクレオチドと異常なアデニンヌクレオチドの双方がＶ因子ゲノムＤＮＡのエキソンのヌクレオチドの位置２０５にあることを示した。従って、１人の患者について点突然変異の異型接合対立遺伝子状態が確認された。第２に、Ｖ因子ゲノムＤＮＡのエキソン１０のヌクレオチドの位置２０５に対応する配列決定用ゲルに１つのバンドが見られ、異常なアデニンヌクレオチドのみ見られた。従って、もう１人の患者について点突然変異の同型接合変異体対立遺伝子状態が確認された。上で調製されたＶ因子ゲノムＤＮＡ増幅産物のヌクレオチド配列決定の結果から、Ｖ因子遺伝子のエキソン１０のヌクレオチドの位置２０５にグアニンからアデニンへの点突然変異を含む変異体対立遺伝子が正常な対立遺伝子と同じであることがわかった。Ｂ．ＡＰＣ耐性点突然変異の存在を決定するために増幅したＶ因子ゲノムＤＮＡとインキュベートしたＭｎｌＩから制限消化断片の分析異なるプライマー対を用いて実施例１Ａに記載されたようにエキソン１０のヌクレオチドの位置２０５を含む長さが短い増幅産物を生成した。次に、本明細書に記載されるように、それらの短い産物をＭｎｌＩで消化してエキソン１０のヌクレオチドの位置２０５のグアニンのアデニンへの点突然変異の有無の決定を可能にした。ＡＰＣ耐性遺伝子型は、また、Ｖ因子遺伝子のエキソン１０において制限エンドヌクレアーゼ、ＭｎｌＩによる制限多形性によって確認される。Ｖ因子遺伝子のエキソン１０のヌクレオチドの位置２０５にグアニンを有する正常な対立遺伝子は、制限エンドヌクレアーゼＭｎｌＩの制限エンドヌクレアーゼ部位を含む。Ｖ因子遺伝子のエキソン１０のヌクレオチドの位置２０５のグアニンがアデニンに変化した変異体対立遺伝子は、制限エンドヌクレアーゼＭｎｌＩの制限エンドヌクレアーゼ部位を含まない。Ｖ因子遺伝子のエキソン１０のヌクレオチドの位置２０５は、ＭｎｌＩ制限部位のヌクレオチド配列の中にに含まれる。その多形性の有無は、制限エンドヌクレアーゼＭｎｌＩの存在下にＶ因子遺伝子のエキソン１０のヌクレオチドの位置２０５に隣接している領域を含むＤＮＡをインキュベートすることにより検出される。ＭｎｌＩは、特定の二本鎖ヌクレオチド配列（制限エンドヌクレアーゼ認識部位又は認識部位）を認識しかつ認識部位内に含まれないヌクレオチド配列内の位置で二本鎖ＤＮＡの両鎖を切断するＩ型制限エンドヌクレアーゼである。多くのＩ型制限エンドヌクレアーゼは、ランダムなヌクレオチドの位置で二本鎖ＤＮＡを切断し、ランダムな数のヌクレオチドを含む制限産物を生成する(Kle idら，Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 73:293，1976; Visselら，Nucl ．Acids．Re s． 16:4731，1988)。しかしながら、ＭｎｌＩは特定のヌクレオチドの位置で二本鎖ＤＮＡを切断することがわかった（Brinkleyら，Gene 100:267，1991）。従って、ＭｎｌＩ制限産物は特定の数のヌクレオチドを含んでいる。一般に用いられるＩＩ型制限エンドヌクレアーゼの認識部位は、パリンドロームでないＩ型制限エンドヌクレアーゼと対照的にパリンドロームである。慣例により、ＭｎｌＩの認識部位は次のような二本鎖ヌクレオチド配列で表される。 5′-CCTCNNNNNNN- 3′（配列番号２０） 3′-GGAGNNNNNN- 5′（配列番号２１）式中、Ｎは任意のヌクレオチドである（Brinkleyら，Gene 100:267，1991）。ＭｎｌＩの認識部位を逆にすると、次のような２本鎖ヌクレオチド配列で表される。 5′-NNNNNNGAGG- 3′（配列番号２１） 3′-NNNNNNNCTCC- 5′（配列番号２０）式中、Ｎは任意のヌクレオチドである。従って、図５Ａに示されるヌクレオチドの位置１９９〜２０８のＶ因子遺伝子のエキソン１０（配列番号１５）及びヌクレオチドの位置１６８５〜１６９４のＶ因子ｃＤＮＡのｃＤＮＡ（図１Ａ〜図１Ｊ及び配列番号１３）のコーディング鎖ヌクレオチド配列5′-ACAGGCGAGG- 3′（配列番号６）は、配列番号２１に示される逆方向ＭｎｌＩ認識配列に対応する。結果として、ＭｎｌＩによる切断パターンは上に示された３′の１塩基対突出部分を生じる。断片サイズを求めるためにとられた約束は、上記ヌクレオチド配列の特異性のいずれかをもつことができる増幅産物のコーディング鎖又はセンス鎖のＭｎｌＩ制限消化切断に基づいている。例えば、Ｖ因子からの増幅したゲノム或いはｃＤＮＡについて下記で述べられるように、５′ＭｎｌＩ部位はコーディング鎖に３ ′の１塩基突出部分を有するがエキソン１０にヌクレオチド２０５（ｃＤＮＡではヌクレオチド１６９１）を含む３′ＭｎｌＩ部位はちょうど逆で非コーディング鎖又はアンチセンス鎖に３′の１塩基突出部分を有する。従って、３′ＭｎｌＩ部位のコーディング鎖は短い切断産物である。コーディング鎖の切断部位に基づきＭｎｌＩ消化から得られた制限産物を算出すると、二本鎖ＭｎｌＩ部位によって＋１塩基か或いは−１塩基である。正常なＶ因子ＤＮＡに存在する配列は、ｃＤＮＡ配列のエキソン１０及び１６９１のヌクレオチドの位置２０５にグアニンヌクレオチドを必要とするＭｎｌＩ認識部位を示す二本鎖ＤＮＡを与える。結果として、下記に示されるように、Ｖ因子インキュベートのエキソン１０のヌクレオチドの位置１９９〜２０８にＭｎｌＩ認識部位を含む対立遺伝子は正常な対立遺伝子である。正常な対立遺伝子のＶ因子遺伝子に由来する増幅産物は、ＭｎｌＩの存在下に切断されて制限産物を生じる。従って、ヌクレオチドの位置２０５のＶ因子遺伝子のエキソン及びヌクレオチドの位置１６９１のＶ因子ｃＤＮＡのグアニンからアデニンへのＭｎｌＩ認識部位を示すヌクレオチド配列の変化は、ＭｎｌＩ認識部位を消失する。結果として、Ｖ因子遺伝子のエキソン１０のヌクレオチドの位置１９９〜２０８にＭｎｌＩ認識部位を含まない対立遺伝子は変異体対立遺伝子である。図５Ｂ（配列番号１６）は、かかる変異体対立遺伝子のエキソン１０のヌクレオチド配列を示す図である。従って、Ｖ因子遺伝子のエキソン１０のヌクレオチドの位置１９９〜２０８にＭｎｌＩ認識部位を含まない変異体対立遺伝子のＶ因子遺伝子に由来する増幅産物は、ＭｎｌＩの存在下にその部位で切断されない。異型接合遺伝子型では、正常及び変異体両者の対立遺伝子の存在は、制限エンドヌクレアーゼＭｎｌＩの存在下に正常及び変異体対立遺伝子のＶ因子遺伝子に由来する増幅産物のインキュベーションの際に切断及び非切断ＤＮＡ双方の各存在によって検出される。同様に、双方の対立遺伝子が変異体である同型接合変異体遺伝子型では、制限エンドヌクレアーゼＭｎｌＩはＶ因子遺伝子のエキソン１０の位置２０５で切断しない。従って、同型接合変異体遺伝子型は、変異体対立遺伝子のＶ因子遺伝子に由来する増幅産物のエキソン１０にヌクレオチドの位置２０５を含むＭｎｌＩ制限エンドヌクレアーゼ部位のないことにより検出される。実施例１Ａで述べられたように、前に記載したプライマー対は正常な対立遺伝子に天然に存在するＭｎｌＩ部位を有するヌクレオチド領域を増幅した。引き続き制限消化分析用に小さい増幅産物を増幅するために、実施例１Ａに記載された５′センスプライマー、ＦＶ７（配列番号４）をヌクレオチド配列5′- TGTTCTCTTGAAGGAAATGC- 3′（配列番号５）を有する３′アンチセンスプライマー、ＦＶＩＮＴ１０２と対合した。５′プライマー、ＦＶ７は、Ｖ因子遺伝子のエキソン１０のヌクレオチドの位置１１５〜１３４に対応する（図２Ａ及び２Ｂ）。３′プライマー、ＦＶＩＮＴ１０２は、Ｖ因子イントロン１０のヌクレオチドの位置８６〜１０５に対応する。ゲノムＤＮＡは、実施例１Ａに記載された家族から単離された。次に、５０μ lの単離したゲノムＤＮＡの２μlを、１００ピコモルの３′アンチセンスプライマー、ＦＶＩＮＴ１０２及び最終濃度の各々２００nMのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ、１×Ｔａｑポリメラーゼバッファー(Promega，ウィスコンシン州マディソン)、１.５mMＭｇＣｌ₂及び０.５単位のＴａｑポリメラーゼ(Pro mega，ウィスコンシン州マディソン)を含有する５０μlのＰＣＲ反応混合液で希釈した。反応混合液に鉱油を重ね、３０サイクルの増幅に供した。各増幅サイクルとしては、９４℃で１分間の変性、６０℃で２分間のアニーリング及び７２℃ で２分間の伸長が含まれた。また、２サイクルの６０℃で２分間のアニーリング及び７２℃で３分間の増幅が行われた。プライマーＦＶ７及びＦＶＩＮＴ１０２によるゲノムＰＣＲ増幅によって生成された増幅産物のコーディング鎖の正常及び変異体ヌクレオチド配列を各々図２Ａ及び２Ｂに示す。正常及び変異体対立遺伝子の増幅産物は、長さが２０６塩基対であった。次に、５０μlの正常又は変異体対立遺伝子のＶ因子遺伝子に由来する増幅産物の１０μlを、１×バッファーNo.２(New England Biolabs，マサチューセッツ州ビバリー)、１.６５×ウシ血清アルブミン(New England Biolabs，マサチューセッツ州ビバリー)及び１.７単位のＭｎｌＩ制限エンドヌクレアーゼ(New Engla nd Biolabs,マサチューセッツ州ビバリー)を含む２０μlの消化系に３７℃で２時間維持した。１０μlの消化産物をゲル充填色素バッファーと混合し、０.５％ (w/v)アガロースを含む３％(w/v)ヌーシーブアガロース（ＦＭＣ）からなるアガロースゲルによる電気泳動で分子量に応じて分離した。更に、Ｖ因子遺伝子のヌクレオチドの位置２０５を有するＤＮＡ領域を増幅するプライマーＦＶ７及びＦＶＩＮＴ１０２を、図２Ａに示されるＶ因子遺伝子のエキソン１０のヌクレオチドの位置１５２〜１６２に第２ＭｎｌＩ制限エンドヌクレアーゼを含むゲノムＤＮＡ領域を増幅するように設計した。前に定義されたように、その第２ＭｎｌＩ制限部位は５′からヌクレオチドの位置２０５を含むＭｎｌＩ部位まで位置するので５′ＭｎｌＩ部位と呼ばれる。従って、後者の部位は３′部位と呼ばれる。正常及び変異体対立遺伝子双方のＶ因子遺伝子に由来する増幅産物における第２ＭｎｌＩ制限エンドヌクレアーゼの存在は、本明細書に記載されるように調製された増幅産物がＭｎｌＩ制限酵素の存在下にインキュベートした場合に切断することができて制限産物を生じることを証明する対照を与える。ゲノムＤＮＡ増幅産物のＭｎｌＩ制限消化の結果を図４に示す。アガロースゲルの写真は、制限エンドヌクレアーゼＭｎｌＩの存在下にインキュベートし電気泳動で分離したＶ因子インキュベートのエキソン１０のヌクレオチドの位置２０５を含むゲノムＤＮＡの一部を示すＤＮＡを含むものである。レーン１は、塩基対（ｂｐ）に示されたＤＮＡ分子量マーカーである。レーン２、４、５及び６は、Ｖ因子遺伝子のエキソン１０のヌクレオチドの位置２０５の点突然変異に対して異型接合であるＡＰＣ耐性患者から単離した増幅ゲノムＤＮＡである。レーン３は、正常又は非変異体対立遺伝子に対して同型接合である正常な患者から単離した増幅ゲノムＤＮＡである。双方の対立遺伝子が正常な対立遺伝子でありかつＶ因子遺伝子のエキソン１０のヌクレオチドの位置２０５に点突然変異を含まない同型接合態では、正常な対立遺伝子のＶ因子遺伝子に由来する増幅産物はＶ因子遺伝子のエキソン１０のヌクレオチドの位置２０５を含むＭｎｌＩ制限エンドヌクレアーゼ部位で切断された。正常な対立遺伝子のＶ因子遺伝子に由来する増幅産物は、また、上記の他の未変性ＭｎｌＩ制限エンドヌクレアーゼ部位で切断された。正常な対立遺伝子のＶ因子遺伝子に由来する２０６塩基対増幅産物（図２Ａ及び配列番号２）をＭｎｌＩ制限エンドヌクレアーゼ部位の双方で切断することにより各々図４、レーン３に示される３種の制限産物３７、４７及び１２２が得られた。ＭｎｌＩによる切断パターンが前に述べたように３′の１塩基対突出部分を生じるので、断片サイズを決定するためにとられた約束は増幅産物のコーディング鎖又はセンス鎖のＭｎｌＩ制限消化切断に基づいている。従って、増幅産物の１塩基３′突出部分を有する５′ＭｎｌＩ部位で消化することにより４７塩基対断片が得られた。１塩基の３′突出部分のない３′ＭｎｌＩで消化すると５′と３′ＭｎｌＩ部位間に３７塩基対断片が生成した。残りの１２２塩基対の断片は、増幅産物の３′ＭｎｌＩ部位から３′端まで伸長する。３つの断片がいっしょになって２０６塩基対の増幅産物を生じる。２つの小さな断片は、示されるように再現した図面では明らかではない。しかしながら、３つの異なるバンドの存在は最初のゲル標品において直接可視化され、第１及び第２ＭｎｌＩ制限エンドヌクレアーゼ部位の双方がＶ因子ゲノムＤＮ増幅産物で消化されることが示され、後者は配列番号２及び図２Ａに示されたヌクレオチド配列を有した。切断されなかったヌクレオチドの位置２０５を有する５′のＭｎｌＩ部位までのＭｎｌＩ部位があれば、各々８４及び１２２塩基対である２つの制限断片産物を生じる。従って、８４塩基対は上記消化において各々がＭｎｌＩ消化の特異性を反映する３７及び４７塩基対の２つの断片に切断した。正常な対立遺伝子の増幅産物の消化と対照的に、変異体対立遺伝子からの増幅産物をＭｎｌＩ消化することにより各々４７及び１５９塩基対のみの２つの制限断片産物が得られた。前に述べたように、エキソン１０のヌクレオチドの位置２０５のＭｎｌＩ部位はグアニンのアデニンへの点突然変異が存在する場合には破壊される。従って、変異体増幅産物は５′の破壊される部位までに位置する他のＭｎｌＩ制限部位のみ有する。正常又は変異体対立遺伝子のＶ因子遺伝子に由来する増幅産物の切断及び切断の欠徐を、制限エンドヌクレアーゼＭｎｌＩの存在下に増幅産物のインキュベーションに続いて制限産物の数及び分子量を可視化することにより求めた。ＭｎｌＩ消化がないとすれば、図２Ｂ及び配列番号３に示される増幅変異体産物は合計２０６塩基対の制限産物を有する。５′ＭｎｌＩ制限部位のＭｎｌＩ消化においては、変異体増幅産物の切断により１５９及び４７塩基対の２つの制限産物を生成することがもたらされた。ゲルがこれら２つだけの断片を含む場合には、同型変異体対立遺伝子状態が確認される。上記からの別々の制限消化パターンを組合わせると図４のレーン２、４、５及び６に示される正常及び変異体両者の対立遺伝子を有する異型接合態のプロファイルが提示される。３７、４７、１２２及び１５９塩基対の各制限産物の存在は、正常及び変異体両者の対立遺伝子の予想した結果を示し、異型接合態が確認される。３７及び４７塩基対制限産物の分割はアガロースゲルの写真で可視化することが難しいが、最初のゲル標品において観察された。１２２及び１５９塩基対バンドは、図４では容易に可視化される。従って、患者のゲノムＤＮＡのＶ因子遺伝子に由来するＰＣＲ増幅産物のＭｎｌＩ制限消化分析は、同型接合正常、同型接合変異体と異型接合の対立遺伝子状態間で識別する能力を与える。Ｃ．ゲノムＤＮＡからの増幅産物の調製及びグアニンのアデニンへの点突然変異の存在を同定するＨｉｎｄＩＩＩ制限部位の検出Ｖ因子遺伝子のエキソン１０のヌクレオチドの位置２０５でグアニンヌクレオチドがアデニンヌクレオチドに変化する点突然変異の存在は、ゲノムＤＮＡから増幅産物の調製及び引き続き遺伝子操作したＨｉｎｄＩＩＩ制限部位の検出によっても検出される。Ｂ２項に記載されたように、グアニンのアデニンへの点突然変異の有無を求めるのに用いられるＨｉｎｄＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼ部位は、正常或いは変異体Ｖ因子対立遺伝子のその位置に存在しない。従って、ＨｉｎｄＩＩＩプライマーは、変異体対立遺伝子に存在するが正常な対立遺伝子に存在しないＨｉｎｄＩＩＩ部位を生じる３つの点突然変異の付随する導入により変異体対立遺伝子に存在するアデニン突然変異を利用するように設計される。ＨｉｎｄＩＩＩは、特定の二本鎖ヌクレオチド配列（制限エンドヌクレアーゼ認識部位又は認識部位）を認識しかつ認識部位の中の位置で二本鎖ＤＮＡの両鎖を切断するＩＩ型制限エンドヌクレアーゼである。ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄＩＩＩ（ＨｉｎｄＩＩＩ）は、下記の配列で表される二本鎖ＤＮＡを認識する。 5′-AAGCTT- 3′（配列番号２３）制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄＩＩＩの存在下に配列番号２３に示された配列を含む二本鎖ＤＮＡをインキュベートすると、下記の構造を生成するＤＮＡの両鎖の切断が生じる。 5′-A- 3′ 3′-TTCGA -5′（配列番号２３、５′→３′方向に示されたヌクレオチドの位置２〜６）。ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼの特定の切断は、特定数のヌクレオチドを含む制限産物を生成する。従って、特定数のヌクレオチドを含むＨｉｎｄＩＩＩ制限産物は、ＨｉｎｄＩＩＩの二本鎖ＤＮＡの切断によって生成される。変異体対立遺伝子の下記のように生成された増幅産物のコーディング鎖のヌクレオチド配列5′-AAGCTT- 3′（配列番号２３）は、図７Ｂ（配列番号１９）に示されたＶ因子遺伝子のエキソン１０のヌクレオチドの位置２０５〜２１０に対応する。従って、その配列はＨｉｎｄＩＩＩ認識部位を表す二本鎖ＤＮＡの上側又はコーディング単鎖である。変異体対立遺伝子のＶ因子遺伝子に由来する増幅産物は、制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄＩＩＩの存在下にインキュベートするとヌクレオチドの位置２０５で切断されて制限産物を生成する。しかしながら、同じ位置に存在する対応する正常な対立遺伝子増幅産物のヌクレオチド配列5′-GAGCTT- 3′（配列番号２５）は、ＨｉｎｄＩＩＩ認識部位を表さない。従って、正常な対立遺伝子のＶ因子遺伝子に由来する増幅産物は、制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄＩＩＩの存在下にインキュベートするとヌクレオチドの位置２０５で切断されない。正常な対立遺伝子のＶ因子遺伝子に由来する増幅産物の切断の欠徐は、本明細書に記載されるアクリルアミドゲル電気泳動で検出される単一のＤＮＡ断片を生じる。従って、異型接合及び同型接合遺伝子型の双方においては、変異体増幅対立遺伝子（図７Ｂ及び配列番号１９）はＨｉｎｄＩＩＩ消化して増幅した正常対立遺伝子（図７Ａ及び配列番号１８）の消化されない断片と比べて２つの異なる制限断片を生成する。点突然変異を有するＤＮＡの領域を増幅するプライマーは、Ｖ因子遺伝子のエキソン１０のヌクレオチドの位置２０５〜２１０を含むゲノムＤＮＡの領域を増幅するように設計される。第２プライマーとも呼ばれる３′アンチセンスプライマーは、正常な対立遺伝子がその領域に天然のＨｉｎｄＩＩＩ部位をもたないのでＶ因子遺伝子に由来する増幅産物にＨｉｎｄＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼ部位の一部を導入するように設計される。従って、ＨｉｎｄＩＩＩ部位を変異体対立遺伝子に導入するために、プライマー対ＦＶ７（配列番号４）及びＦＶ５０６ｔｓｔ２（配列番号２４）が前に記載されたようにＰＣＲに用いられる。５′センス又は第１プライマー、ＦＶ７は、実施例１Ａに記載され、Ｖ因子遺伝子のエキソン１０のヌクレオチドの位置１１５〜１３４に対応する（図７Ａ及び７Ｂ）。３′アンチセンス又は第２プライマー、ＦＶ５０６ｔｓｔ２はヌクレオチド配列5′-TTACTTCAAGGACAAAATACCTGTAAAGCT- 3′（配列番号２４）を有する。３′プライマーは、Ｖ因子遺伝子のエキソン１０のヌクレオチドの位置２０６〜２１５及びＶ因子遺伝子のイントロン１０のヌクレオチドの位置１〜２０に対応する（図７Ａ及び７Ｂ）。３′プライマーは、また、Ｖ因子遺伝子に由来する得られた増幅産物にヌクレオチドの位置２０８〜２１０に対応する部位に３つの点突然変異を導入する。追加の点突然変異は、正常対立遺伝子又は変異体対立遺伝子に本来は存在しない。従って、それらの点突然変異は、増幅産物に導入されてエキソン１０のヌクレオチドの位置２０５のアデニン点突然変異の存在に依存するＨｉｎｄＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼ部位の一部を生じる（図７Ｂ）。３′アンチセンスプライマーによって導入されたＨｉｎｄＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼ部位の一部と共に変異体対立遺伝子のＶ因子遺伝子のエキソン１０のヌクレオチドの位置２０５のアデニンは、ＨｉｎｄＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を生じる（図７Ｂ）。従って、ＨｉｎｄＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼの存在下にインキュベートすると変異体対立遺伝子のＶ因子遺伝子に由来する増幅産物が切断される。言い換えると、３′アンチセンスプライマーによって導入されたＨｉｎｄＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼ部位の一部と共に正常な対立遺伝子のＶ因子遺伝子のエキソン１０のヌクレオチドの位置２０５のグアニンはＨｉｎｄＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を生じない（図７Ａ）。従って、ＨｉｎｄＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼの存在下にインキュベートすると、正常な対立遺伝子のＶ因子遺伝子に由来する増幅産物が切断される。プライマーＦＶ７及びＦＶ５０６ｔｓｔ２を用いてＰＣＲ増幅によって生成された増幅産物のヌクレオチド配列を、各々図７Ａ及び７Ｂに示す。ＨｉｎｄＩＩＩ部位を変異体対立遺伝子に導入するＰＣＲ増幅については、実施例１Ａに記載された５０μlの単離したゲノムＤＮＡの２μlを、１００ピコモルの５′センスプライマー、ＦＶ７、１００ピコモルの３′アンチセンスプライマー、ＦＶ５０６ｔｓｔ２及び最終濃度の各々２００nMのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ、１×Ｔａｑポリメラーゼバッファー(Promega，ウィスコンシン州マディソン)、１.５mMＭｇＣｌ₂及び０.５単位のＴａｑポリメラーゼ(P romega，ウィスコンシン州マディソン)を含有する５０、μlのＰＣＲ反応混合液で希釈した。反応混合液に鉱油を重ね、３０サイクルの増幅に供した。各増幅サイクルとしては、９４℃で１分間の変性、６０℃で２分間のアニーリング及び７２℃で２分間の伸長が含まれる。更に、２サイクルの６０℃で２分間のアニーリング及び７２℃で３分間の増幅が行われる。プライマーＦＶ７及びＦＶ５０６ｔｓｔ２による正常又は変異体対立遺伝子のＶ因子遺伝子のＰＣＲ増幅により、長さが１２１塩基対の増幅産物が得られる。次に、得られた５０μlの正常又は変異体対立遺伝子のＶ因子遺伝子のエキソン１０及びイントロン１０に由来する増幅産物の１０μlを、１×バッファーNo. ２(New England Biolabs，マサチューセッツ州ビバリー)及び２単位のＨｉｎｄＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼ部位(New England Biolabs，マサチューセッツ州ビバリー)を含む２０μlの消化系に３７℃で２時間維持した。１０μlの消化産物をゲル充填色素バッファーと混合し、アクリルアミドゲル電気泳動で分子量に応じて分離した(Sambrookら，Molecular Cloning ，A Laboratory Manual，2nd e d.，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor,ニューヨーク，1989)。従って、Ｖ因子遺伝子に由来する変異体及び正常増幅産物の各々の切断及び切断の欠徐は、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩの存在下に増幅産物のインキュベーションに続いて制限産物の数及び分子量を可視化することにより求められる。正常対立遺伝子のＶ因子遺伝子のエキソン１０及びイントロン１０に由来する増幅産物は、制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄＩＩＩの認識部位を含まず、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩの存在下にインキュベートすると切断される。増幅産物の切断の欠徐は、１２１塩基対の単一ＤＮＡ断片をもたらす。従って、ＨｉｎｄＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼ部位がないとＶ因子遺伝子の正常な対立遺伝子を同定する手段を与える。ヌクレオチドの位置２０８〜２１０の他のＰＣＲ導入点突然変異（コーディング鎖又はセンス鎖の5′-GAA- 3′の5′-CTT- 3′）と共にＶ因子遺伝子のエキソン１０のヌクレオチドの位置２０５にアデニンヌクレオチドを有する変異体対立遺伝子のＶ因子遺伝子に由来する増幅産物を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩの存在下にインキュベートすると切断される。変異体対立遺伝子のＶ因子遺伝子に由来する増幅産物をＨｉｎｄＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼ部位で切断すると、実施例１Ｂに記載されたＭｎｌＩ消化の約束のようにコーディング鎖又はセンス鎖に生じた切断産物に基づいて長さが９１及び３０塩基対の２つの制限産物が得られる。従って、遺伝子操作したＨｉｎｄＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼ部位の存在は、変異体対立遺伝子のＶ因子遺伝子を同定する手段を与える。ＨｉｎｄＩＩＩ認識部位の一部を導入する正常又は変異体対立遺伝子のＶ因子遺伝子に由来する増幅産物を生成するＰＣＲの使用に続いてＨｉｎｄＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼの存在下の増幅産物のインキュベーションは、Ｖ因子遺伝子のエキソン１０のヌクレオチドの位置２０５の点突然変異の有無を確認するために実施例１Ｂに記載されたＭｎｌＩ消化による第１方法のほかの手段であり、ＡＰＣ耐性の患者の遺伝子根拠を同定する。Ｄ．ＰＣＲ増幅及び増幅したｃＤＮＡ産物のヌクレオチド配列の決定患者におけるＡＰＣ耐性の遺伝子根拠を求めるために、８人の関連のないＡＰＣ耐性患者からのＶ因子ｃＤＮＡのヌクレオチド配列を決定した。標準ポリメラーゼ連鎖反応技術に続いて本明細書に記載されたヌクレオチド配列決定を用いてヌクレオチドの位置１６９１にグアニンのアデニンへの点突然変異を含むＶ因子ｃＤＮＡの遺伝子突然変異を同定した。逐次同定した関連のないＡＰＣ耐性患者からの末梢血試料を入手した。８人の患者のうち６人が徴候があり、平均年齢２９歳であった。６人の患者は、前に記載された患者ＢＢＬＳが含まれた(Griffinら，Blood 82:1989，1993; Sunら，Bl ood 83:3120，1994)。２人の追加の無症候性患者の年齢は、４６歳と６２歳であった。上記の患者の各々のリンパ芽球から全細胞ＲＮＡを精製した。ＲＮＡスタット 60（TelTest“B”，テキサス州フレンズウッド）を用いて製造業者の推奨する手順に従いＡＣＤに集めた全血のバフィーコートからＲＮＡを調製した。血小板は親の巨核球に由来するＲＮＡを含むので、血小板を取り除くことを試みなかった。単離したＲＮＡを水に再懸濁した。ＰＣＲ増幅の調製において、上記のようにＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡサイクルキット(Invitrogen,カリフォルニア州サンジェエゴ）を用いてｃＤＮＡ合成の鋳型として用いた。５０μl転写反応では、まず０〜２００ナノグラム(ng)のＲＮＡを２５０ngのオリゴヌクレオチドｄ(Ｔ)(オリゴｄＴ)プライマーとアニールした。次に一本鎖ｃＤＮＡを、ｃＤＮＡサイクルを用いて製造業者の推奨する手順に従い第１鎖ｃＤＮＡ合成反応で合成した。次に、得られたｃＤＮＡの非コーディング鎖をＶ因子特異的プライマーを用いてＰＣＲ増幅の鋳型として用いた。ＰＣＲ増幅では、Ｖ因子遺伝子の３′のヌクレオチドの位置１６９１までの位置のｃＤＮＡの非コーディング鎖に対してハイブリッド形成した第１プライマー（例えば、ＦＶ７）及びプライマー拡張反応を、ｃＤＮＡのコーディング鎖に対応する増幅産物を生成するために開始した。Ｖ因子遺伝子の３′のヌクレオチドの位置１６９１までの位置のｃＤＮＡの増幅コーディング鎖に対してハイブリッド形成した第２プライマー（例えば、ＦＶ８Ａ）を、ｃＤＮＡの非コーディング鎖に対応した増幅産物を生成するために開始した。別の方法では、ｃＤＮＡの非コーディング鎖を上記第１鎖合成反応の方法で生成し、当業者に周知でありSambrookら，Molecular Cloning ，A Laboratory Manu al ，2nd ed.，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor,ニューヨーク， 1989に記載されるｃＤＮＡライブラリーを作成するために一般に用いられる方法の第２鎖合成反応でｃＤＮＡのコーディング鎖を作成する鋳型として用いた。次に、得られた第１及び第２鎖を各々引き続き増幅反応におけるｃＤＮＡの非コーティング鎖及びコーティング鎖としての鋳型として用いる。Ｖ因子軽鎖をコード化する配列は、プライマーＦＶ９(5′-TGAGATCATTCCAAAGG AAG- 3′、配列番号８)及びＦＶ１４(5′-TTGAGGTCTTAAAGAGTCTC- 3′、配列番号９)を用いて増幅した。５′センス又はコーティングプライマーは、Ｖ因子ｃＤＮＡのヌクレオチドの位置４６５９〜４６７８に対応した。３′アンチセンス又は非コーティングプライマーは、翻訳停止コドン後のＶ因子ｃＤＮＡの３′非翻訳領域の配列番号１３（正常Ｖ因子ｃＤＮＡ全ヌクレオチド配列−図１Ａから１Ｊ参照）のヌクレオチドの位置６７９２〜６８１１に対応した。連結領域をコード化するヌクレオチド配列は、軽鎖をコード化する５′のヌクレオチド配列に位置する。次に、２μlの合成ｃＤＮＡを、各々２００nMのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ、１.５mMＭｇＣｌ₂、１×Ｔａｑポリメラーゼバッファー(Prome ga，ウィスコンシン州マディソン)及び０.５UのＴａｑポリメラーゼの最終濃度中を１００ピコモル(pmol)の５′センスプライマーＦＶ９及び３′アンチセンスプライマーＦＶ１４を含有する４８μlのＰＣＲ反応混合液で希釈した。反応混合液に鉱油を重ね、３０サイクルの増幅に供した。各増幅サイクルとしては、９４℃で１分間の変性、５６℃で２分間のアニーリング及び７２℃で３分間の伸長が含まれる。得られた増幅産物は、連結領域（配列番号１３及び図１Ａ〜図１Ｊに示されたヌクレオチドの位置４６５９〜４８０８）の３′領域に対応しかつ翻訳停止コドンを含む軽鎖に対応する全ヌクレオチド配列（配列番号１３に示されたヌクレオチドの位置４８０９〜６７６５）まで伸長したｃＤＮＡの配列の一部及び３′非翻訳領域（配列番号１３のヌクレオチド配列の位置６８１１で終わる）の小部分を有した。増幅した産物は、長さが約２１５３塩基対であった。Ｖ因子重鎖をコード化する配列を、プライマー対、ＦＶ１３(5′-CAGGAAAGGAA GCATGTTCC- 3′、配列番号１０)及びＦＶ２(5′-TGCCATTCTCCAGAGCTAGG- 3′、配列番号１１)を用いて増幅した。５′センスプライマー又は第１プライマー、ＦＶ１３は、５′非翻訳領域及び重鎖領域（図１Ａ〜図１Ｊ及び図６Ａ）の開始をコード化するヌクレオチド配列の５′領域の中の図１Ａ〜図１Ｊ（配列番号１３）に示されるＶ因子ｃＤＮＡのヌクレオチドの位置７８〜９７に対応した。重鎖領域をコード化するヌクレオチド配列は、連結鎖領域をコード化する５′のヌクレオチド配列に位置する。３′アンチセンスプライマー又は第２プライマー、ＦＶ２は、Ｖ因子の重鎖領域（図１Ａ〜図１Ｊ及び図６Ａ）のヌクレオチドの位置２３５５〜２３７４に対応した。次に、２μlのｃＤＮＡを、１００ピコモル(pmol)の５′センスプライマーＦＶ１３及び３′アンチセンスプライマーＦＶ２を含む軽鎖増幅に対して記載された４８μlのＰＣＲ反応混合物で希釈した。得られたＶ因子ｃＤＮＡの重鎖領域に由来する増幅産物は、重鎖領域（ヌクレオチドの位置９１〜２３０１）に対応する全ヌクレオチド配列まで伸長したＶ因子ｃＤＮＡの３′非翻訳領域のヌクレオチドの位置７８〜９０に対応するＶ因子ｃＤＮＡの一部、及び連結領域の一部に対応するヌクレオチド配列のヌクレオチドの位置２３０２〜２３７４を有した。正常及び変異体増幅産物は、各々図６Ａ（配列番号２７）及び図６Ｂ（配列番号２８）に示されたように長さが約２２９７塩基対であった。図示されたグアニン又はアデニンヌクレオチドは、上記図面及び配列のヌクレオチドの位置１６１４に対応する。しかしながら、その位置は実際には無傷Ｖ因子ｃＤＮＡの位置１６９１である。無傷Ｖ因子ｃＤＮＡでの１６９１に比べて配列番号２７及び２８では１６１４であるグアニンのアデニンヌクレオチドのヌクレオチドの位置の違いの根拠は、配列番号２７及び２８に示された増幅ｃＤＮＡの番号をつける配列表の慣例から生じるものである。５′プライマー、ＦＶ７は無傷ｃＤＮＡではヌクレオチドの位置７８で始まるので、増幅した配列が配列表に別個に示される場合にその位置は対応してヌクレオチドの位置No.１となる。上記の配列は、また、突然変異部位に対応する“Ｎ”ヌクレオチドを有する配列番号１７に示された１配列に編集されており、Ｎはグアニン或いはアデニンであり、そのＮは無傷Ｖ因子ｃＤＮＡのヌクレオチドの位置１６９１に対応するヌクレオチドの位置１６１４に位置する。得られた増幅産物のヌクレオチド配列を決定するために、鋳型を精製せずに³⁵ Ｓ−ｄＡＴＰ（Amersham，イリノイ州アーリントンハイツ）を取り込む配列決定反応を行った。別の配列決定では配列がＶ因子ｃＤＮＡのヌクレオチド配列に基づく数種の異なるプライマーを用い、fmolサイクル配列決定キットを用いて製造業者の推奨する手順に従い(Promega，ウィスコンシン州マディソン)増幅産物のヌクレオチド配列を決定した。図１Ａ〜図１Ｊ（配列番号１３）に示された正常なＶ因子ｃＤＮＡのヌクレオチドの位置１６９１、６７２７及び５３８０に３個のヌクレオチドの相違が観察され、そのヌクレオチドの位置でコード化されるアミノ酸残基の変化の原因となった。ｃＤＮＡ配列の番号をつけるための約束は、Jennyらに記載されたものであり、図１の図面の説明文に十分に述べられている。Ｖ因子ｃＤＮＡのヌクレオチドの位置１６９１の点突然変異は、配列決定ゲルの２つのバンドの存在によって同定された。２つのバンドは、Ｖ因子ｃＤＮＡのヌクレオチドの位置１６９１の正常なグアニンヌクレオチド及び変異体アデニンヌクレオチドの双方を示した。従って、その患者のＶ因子遺伝子に対して点突然変異の異型接合対立遺伝子状態を求めた。Ｖ因子ｃＤＮＡのヌクレオチドの位置１６９１の点突然変異は、位置５０６の本来コード化されたアミノ酸残基をアルギニンからグルタミンに変化することが予想される。点突然変異は、また、コード化されたアミノ酸に影響するヌクレオチドの位置６７２７と５３８０で同定された。位置６７２７の正常ヌクレオチド、アデニンはグアニンに変化し、位置２１８５の本来コード化されたアミノ酸残基をトレオニンからアラニンに変化させた。位置５３８０の正常ヌクレオチド、グアニンは、アデニンに変化し、位置１７３６の本来コード化されたアミノ酸残基をバリンからメチオニンに変化させた。プライマー対ＦＶ１３とＦＶ２による増幅から増幅した正常及び変異体ｃＤＮＡ双方のヌクレオチド配列を、各々図６Ａ（配列番号２７）及び図６Ｂ（配列番号２８）に示す。従って、ＡＰＣ耐性をもつ患者からのＶ因子ｃＤＮＡのヌクレオチド配列を決定すると、２つの他の突然変異の中でＶ因子ｃＤＮＡのヌクレオチドの位置１６９１にグアニンヌクレオチドのアデニンヌクレオチドへの変化として特徴づけられたあるユニークな点突然変異が同定された。Ｖ因子ｃＤＮＡのヌクレオチドの位置１６９１は、Ｖ因子ゲノムＤＮＡのエキソンのヌクレオチドの位置２０５に対応する。Ｖ因子ｃＤＮＡ及び対応するゲノムＤＮＡのヌクレオチドの位置１６９１のヌクレオチドの相違は、ＡＰＣ耐性の遺伝子根拠を表すものである。ヌクレオチドの位置１６９１によって部分的にコード化された位置５０６のアミノ酸残基アルギニンと位置５０７のアミノ酸残基グリシン間のペプチド結合の最初の結合はＶａ因子の不活性化でＡＰＣにより切断した。従って、ＡＰＣで切断するアミノ酸位置５０６のアミノ酸残基アルギニンの代わりにアミノ酸残基グルタミンを含むＶａ変異体の実験耐性は、生化学レベルで容易に合理化される(Sunら，Blood 83 :3120，1994)。ＡＰＣ耐性の優性伝達も容易に理解される(Dahlbackら，Proc ．N atl．Acad．Sci．USA 90:1004，1993; SVvenssonら，N ．Engl．J．Med．330:517 ，1994)。対照的に、ヌクレオチドの位置６７２７及び５３８０のヌクレオチドの相違は、コード化されたアミノ酸残基のはっきりしない変化を表し、ＡＰＣ耐性を生じない。ＲＮＡも、関連のあるＡＰＣ耐性患者から単離され、ｃＤＮＡに変えられ、ＰＣＲで増幅してヌクレオチド配列決定の鋳型を与える。５′非翻訳及び連結領域の一部を含むＶ因子重鎖及び連結及び３′非翻訳領域の一部を含むＶ因子軽鎖領域を、別の反応で増幅した。上記実施例１Ａに述べられた家族の各人からのリンパ芽球からの全細胞ＲＮＡを上記のように精製した。上記のようにＲＮＡをｃＤＮＡに変えた。Ｖ因子軽鎖をコード化するヌクレオチド配列を、上記のプライマーＦＶ９（配列番号８）及びＦＶ１４（配列番号９）を用いて増幅した。Ｖ因子ｃＤＮＡの重鎖領域をコード化するヌクレオチド配列も、プライマーＦＶ１３（配列番号１０）及びＦＶ２（配列番号１１）を用いて上記のように増幅した。プライマー対ＦＶ１３及びＦＶ２による増幅から増幅した正常及び変異体ｃＤＮＡの双方のヌクレオチド配列は、各々上記配列番号２７及び２８に示される。ＤＶＴをもつ家族からのＶ因子ｃＤＮＡの重鎖領域に由来する得られた増幅産物から直接求めたヌクレオチド配列は、２つの異常のうちの１つを示した。ｃＤＮＡ２８のヌクレオチドの位置１６９１に対応する２つのバンドが配列決定用ゲルに見られ、正常なグアニンヌクレオチドと異常なアデニンヌクレオチドの双方が見られた（図３、試料ＩＩ−３）。従って、点突然変異の異型接合態が求められた。第２に、ｃＤＮＡのヌクレオチドの位置１６９１に対応するグアニンのアデニンへのヌクレオチドの変化が見られた（図３、試料ＩＩ−２）。従って、点突然変異の同型接合態が求められた。ＡＰＣ耐性をもつ患者のＶ因子ｃＤＮＡに由来する増幅産物のヌクレオチド配列の決定によりユニークな点突然変異の存在が確認された。その点突然変異は、Ｖ因子ｃＤＮＡのヌクレオチドの位置１６９１のグアニンヌクレオチドのアデニンヌクレオチドへの変化として確認された。Ｅ．ＰＣＲ増幅及び増幅したｃＤＮＡ産物のＭｎｌＩ制限分析増幅したｃＤＮＡのグアニンのアデニン点突然変異の有無を求めるために実施例１Ｄに記載されたヌクレオチド配列決定のほかの分析法は、上記実施例１Ｂ及び１ＣでゲノムＤＮＡに述べられた制限消化分析である。引き続いて制限エンドヌクレアーゼＭｎｌＩでの消化に適切なｃＤＮＡ増幅産物を得るために、実施例１Ｄに記載されたようにプライマー対ＦＶ１３及びＦＶ２でのＰＣＲから得られる正常（配列番号２７）或いは変異体増幅ｃＤＮＡ（配列番号２８）である２２９７塩基対重鎖ｃＤＮＡ増幅産物を記載された第２ラウンドのＰＣＲの鋳型として用いた。第２ＰＣＲについては、ＰＣＲプライマー対、共に実施例１Ａに記載されたゲノムＤＮＡを増幅するために用いた５′センス又は第１プライマーＦＶ７（配列番号４）及び３′アンチセンス又は第２プライマーＦＶ８Ａ（配列番号１２）を配列番号２７又は２８に対応する上記増幅ｃＤＮＡ鋳型でのＰＣＲに用いた。ＰＣＲ増幅は、上記第２ラウンドについて実施例１Ｄに記載されたように行った。第２ラウンドのＰＣＲから生成された正常及び変異体ｃＤＮＡ増幅産物は、共にヌクレオチドの位置１６０１〜１７２４の配列番号１３及び２６に示された各１２４塩基対ヌクレオチド配列を有する。次に、得られた生成増幅産物を上記Ｖ因子ゲノムＤＡＮについて述べたＭｎｌＩによる制限消化に供した。ゲノムＤＮＡ制限消化分析とのように、電気泳動による微分制限産物断片の分析は患者のｍＲＮＡ試料におけるグアニンのアデニンへの点突然変異の有無の確認を与えた。ヌクレオチドの位置１６９１のグアニンヌクレオチドを有する正常なｃＤＮＡにおいては、第２ラウンドの増幅産物は上記実施例１ＢでゲノムＤＮＡ制限分析について述べたように２つのＭｎｌＩ制限部位（５′及び３′の位置１６９１までを意味する位置）を有した。対照的に、対応する変異体増幅ｃＤＮＡは、点突然変異を含まない唯一の５′ＭｎｌＩ部位を有した。そのようなものとして、双方のＭｎｌＩ部位が適切に切断される場合には１２４塩基対の正常ｃＤＮＡ増幅産物の予想ＭｎｌＩ制限消化産物は、４７、３７及び４０塩基対の３つの断片である。１２４塩基対変異体ｃＤＮＡ増幅産物においては、５′ＭｎｌＩのみが存在するので、予想制限消化産物は４７及び７７塩基対の２つの断片である。従って、異型接合パターンは３７、４０、４７及び７７塩基対断片を有する。従って、ｃＤＮＡからの正常及び変異体１２４塩基対増幅産物からのＭｎｌＩ制限消化パターンの分析は、ヌクレオチドの位置１６９１のグアニンのアデニンへの点突然変異の有無の決定及び遺伝子型の決定を可能にする。更に、上記ヌクレオチド配列分析は、点突然変異の有無を確認するために１２４塩基対ｃＤＮＡ増幅産物について行った。上記１２４塩基対ｃＤＮＡ増幅産物は、また、実施例１Ｄに記載されたようにｍＲＮＡから直接合成された非増幅ｃＤＮＡ鋳型により一段ＰＣＲから生成される。短いｃＤＮＡ増幅産物を生成する無傷ｃＤＮＡ鋳型にＰＣＲプライマー対、ＦＶ７及びＦＶ８Ａを用いる。次に、制限消化分析及び／又はヌクレオチド配列決定分析が、得られたｃＤＮＡ増幅産物で上記のように行われる。増幅するｃＤＮＡに対する代替的方法では、ヌクレオチド配列決定の前に５′ 非翻訳領域、重鎖領域、連結領域、軽鎖領域及び３′非翻訳領域を含むＶ因子ｃＤＮＡの領域（ヌクレオチドの位置９〜６９１７の配列番号１３）の全部又は一部が単一反応で増幅される。Ｖ因子ｃＤＮＡの領域の増幅から得られた増幅産物は、長さが約４０〜６９０９塩基対である。更に好ましくは、増幅産物はＶ因子重鎖領域を含む。Ｖ因子ｃＤＮＡのヌクレオチドの位置１６９１に点突然変異を含む具体的な増幅産物は、ヌクレオチドの位置９からヌクレオチドの位置６９１７までの配列番号２６に示される。２．結論ここでは、分子に基づくＶ因子突然変異及び得られたＡＰＣ耐性を、本明細書に記載されるＡＰＣ耐性と関連があるＶ因子遺伝子のグアニンのアデニンへの点突然変異を検出する本発明の方法及び組成物の発見及び生成に従い他のもので記載してきた。例えば、Bertinaら，Nature 369:64，1994及びVoorbergら，Lancet 343:1535，1994は、Ｖ因子ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅に続いてヌクレオチド配列分析によりＶ因子ｃＤＮＡのヌクレオチドの位置１６９１の点突然変異を同定した。ここでは、同じ点突然変異を、オランダ(Bertinaら，Nature 369:64，1994)、米国(Greengardら，Lancet 343:1361，1994)及びフランス（Alhenc-Gelasら，La ncet 344:555，1994）のＡＰＣ耐性患者において広く記載してきた。患者においてかなりの割合のＡＰＣ耐性を引き起こすＶ因子の単一点突然変異の同定は、抗トロンビン、プロテインＣ又はプロテインＳ欠失に関与する広範囲の異なる突然変異と著しく対照的である（Laneら，Thromb ．Haemost．70:361，1993; Reitsma ら，Thromb ．Haemost．69:77，1993）。個々の実施態様及び実施例を含む上記説明は、本発明を具体的に説明するものであり限定するものとしてみなされるべきではない。本発明の真意及び範囲から逸脱することなく多くの他の変更及び修正が行われる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者グリーンガードジュディースアメリカ合衆国カリフォルニア州 92126 サンディエゴメサウッズアベニュー 9053 (72)発明者ガンリールソフィーフランスエフ−75015 パリリューヴァスコダガマ 43

Claims

【特許請求の範囲】１．Ｖ因子遺伝子のエキソン１０のヌクレオチドの位置２０５にグアニンヌクレオチドからアデニンヌクレオチドへの変化として特徴づけられた遺伝子突然変異を検出するヒト遺伝子スクリーニング方法であって、（ａ）ヒトからのゲノムＤＮＡ試料を増幅条件下に、配列番号４に示されたヌクレオチド配列を有する第１プライマー及び配列番号５に示されたヌクレオチド配列を有する第２プライマーからなる、前記ヌクレオチドの位置２０５を含むヒトゲノムＤＮＡの領域を増幅するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマー対で処理し、前記領域を含む増幅産物を生成する工程；及び（ｂ）工程（ａ）の増幅産物において前記ヌクレオチドの位置２０５のグアニンヌクレオチドからアデニンヌクレオチドへの変化の存在を分析し、前記突然変異を同定する工程：を含む方法。２．前記領域が、配列番号７に示されたヌクレオチド配列又はその断片を含む請求項１記載の方法。３．前記領域が、実質的に配列番号６に示されたヌクレオチド配列又はその断片を含む請求項１記載の方法。４．前記領域が、配列番号６に示されたヌクレオチド配列又はその断片を含む請求項１記載の方法。５．前記領域が、実質的に配列番号２に示されたヌクレオチド配列からなる請求項４記載の方法。６．前記ＰＣＲプライマー対が、前記突然変異が存在しない場合には制限エンドヌクレアーゼ部位を含む増幅産物を生成し、工程（ｂ）の前記分析が、工程（ａ）の増幅産物を制限条件下に、前記部位を認識しかつ前記増幅産物を切断して制限産物を生じる制限エンドヌクレアーゼで処理する工程、及び前記制限産物の存在を検出する工程を含む請求項１記載の方法。７．前記制限エンドヌクレアーゼがＭｎｌＩであり、前記部位がヌクレオチド配列、5′-ACAGGCGAGG- 3′（配列番号６）を有する請求項６記載の方法。８．Ｖ因子遺伝子のエキソン１０のヌクレオチドの位置２０５にグアニンヌクレオチドからアデニンヌクレオチドへの変化として特徴づけられた遺伝子突然変異を検出するヒト遺伝子スクリーニング方法であって、（ａ）ヒトからのゲノムＤＮＡ試料を増幅条件下に、配列番号４に示されたヌクレオチド配列を有する第１プライマー及び配列番号２４に示されたヌクレオチド配列を有する第２プライマーからなる、前記ヌクレオチドの位置２０５を含むヒトゲノムＤＮＡの領域を増幅するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマー対で処理し、前記領域を含む増幅産物を生成する工程；及び（ｂ）工程（ａ）の増幅産物において前記ヌクレオチドの位置２０５のグアニンヌクレオチドからアデニンヌクレオチドへの変化の存在を分析し、前記突然変異を同定する工程：を含む方法。９．前記領域が、配列番号２３に示されたヌクレオチド配列又はその断片を含む請求項８記載の方法。 10．前記領域が、実質的に配列番号１９に示されたヌクレオチド配列からなる請求項９記載の方法。 11．前記領域が、配列番号２５に示されたヌクレオチド配列又はその断片を含む請求項８記載の方法。 12．前記領域が、実質的に配列番号１８に示されたヌクレオチド配列からなる請求項11記載の方法。 13．前記ＰＣＲプライマー対が、前記突然変異が存在する場合には制限エンドヌクレアーゼ部位を含む増幅産物を生成し、工程（ｂ）の前記分析が、工程（ａ）の増幅産物を制限条件下に、前記部位を認識しかつ前記増幅産物を切断して制限産物を生じる制限エンドヌクレアーゼで処理する工程、及び前記制限産物の存在を検出する工程を含む請求項８記載の方法。 14．前記制限エンドヌクレアーゼがＨｉｎｄＩＩＩであり、前記部位がヌクレオチド配列、5′-AAGCTT- 3′（配列番号２３）を有する請求項13記載の方法。 15．Ｖ因子ｃＤＮＡのヌクレオチドの位置１６９１の遺伝子突然変異を同定するヒト遺伝子スクリーニング方法であって、（ａ）ヒトからメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を単離し、ＤＮＡの相補鎖（ｃＤＮＡ）を合成する工程；（ｂ）工程（ａ）の前記ｃＤＮＡを増幅条件下に、配列番号１０に示されたヌクレオチド配列を有する第１プライマー及び配列番号１１に示されたヌクレオチド配列を有する第２プライマーからなる、Ｖ因子ｃＤＮＡの前記ヌクレオチドの位置１６９１を含むヒトｃＤＮＡの領域を増幅するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマー対で処理し、前記領域を含む増幅産物を生成する工程；及び（ｃ）工程（ｂ）の増幅産物において前記ヌクレオチドの位置１６９１のグアニンヌクレオチドからアデニンヌクレオチドへの変化の存在を分析し、前記突然変異を同定する工程：を含む方法。 16．前記領域が、配列番号７に示されたヌクレオチド配列又はその断片を含む請求項15記載の方法。 17．前記領域が、実質的に配列番号２８に示されたヌクレオチド配列からなる請求項16記載の方法。 18．前記領域が、配列番号６に示されたヌクレオチド配列又はその断片を含む請求項15記載の方法。 19．前記領域が、実質的に配列番号２７に示されたヌクレオチド配列からなる請求項18記載の方法。 20．（ｂ２）工程（ｂ）の前記増幅産物を増幅条件下に、配列番号４に示されたヌクレオチド配列を有する第１プライマー及び配列番号１２に示されたヌクレオチド配列を有する第２プライマーからなる、Ｖ因子ｃＤＮＡの前記ヌクレオチドの位置１６９１を含むヒトｃＤＮＡの領域を増幅するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマー対で処理し、前記領域を含む増幅産物を生成する工程：を更に含む請求項15記載の方法。 21．前記領域が配列番号７に示されたヌクレオチド配列又はその断片を含む請求項20記載の方法。 22．前記領域が、実質的にヌクレオチドの位置１６０１〜１７２４の配列番号２６に示されたヌクレオチド配列からなる請求項21記載の方法。 23．前記領域が、配列番号６に示されたヌクレオチド配列又はその断片を含む請求項20記載の方法。 24．前記領域が、実質的に配列番号１３に示されたヌクレオチド配列からなる請求項23記載の方法。 25．前記増幅産物が、前記突然変異が存在しない場合には制限エンドヌクレアーゼ部位を含み、工程（ｃ）の前記分析が、工程（ｂ２）の増幅産物を制限条件下に、前記部位を認識しかつ前記増幅産物を切断して制限産物を生じる制限エンドヌクレアーゼで処理する工程、及び前記制限産物の存在を検出する工程を含む請求項20記載の方法。 26．前記制限エンドヌクレアーゼがＭｎｌＩであり、前記部位がヌクレオチド配列、5′-ACAGGCGAGG- 3′（配列番号６）を有する請求項25記載の方法。 27．Ｖ因子ｃＤＮＡのヌクレオチドの位置１６９１の遺伝子突然変異を同定するヒト遺伝子スクリーニング方法であって、（ａ）ヒトからメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を単離し、ＤＮＡの相補鎖（ｃＤＮＡ）を合成する工程：（ｂ）工程（ａ）の前記ｃＤＮＡを増幅条件下に、配列番号４に示されたヌクレオチド配列を有する第１プライマー及び配列番号１２に示されたヌクレオチド配列を有する第２プライマーからなる、Ｖ因子ｃＤＮＡの前記ヌクレオチドの位置１６９１を含むヒトｃＤＮＡの領域を増幅するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマー対で処理し、前記領域を含む増幅産物を生成する工程：及び（ｃ）工程（ｂ）の増幅産物において前記ヌクレオチドの位置１６９１のグアニンヌクレオチドからアデニンヌクレオチドへの変化の存在を分析し、前記突然変異を同定する工程：を含む方法。 28．前記領域が、配列番号７に示されたヌクレオチド配列又はその断片を含む請求項27記載の方法。 29．前記領域が、実質的にヌクレオチドの位置１６０１〜１７２４の配列番号２６に示されたヌクレオチド配列からなる請求項28記載の方法。 30．前記領域が、配列番号６に示されたヌクレオチド配列又はその断片を含む請求項27記載の方法。 31．前記領域が、実質的に配列番号13に示されたヌクレオチド配列からなる請求項30記載の方法。 32．前記増幅産物が、前記突然変異が存在しない場合には制限エンドヌクレアーゼ部位を含み、工程（ｃ）の前記分析が、工程（ｂ）の増幅産物を制限条件下に、前記部位を認識しかつ前記増幅産物を切断して制限産物を生じる制限エンドヌクレアーゼで処理する工程、及び前記制限産物の存在を検出する工程を含む請求項27記載の方法。 33．前記制限エンドヌクレアーゼがＭｎｌＩであり、前記部位がヌクレオチド配列、5′-ACAGGCGAGG- 3′（配列番号６）を有する請求項32記載の方法。 34．患者試料において活性プロテンＣ耐性と関連があるエキソン１０のヌクレオチドの位置２０５にＶ因子遺伝子の遺伝子突然変異を検出するのに有用な診断キットであって、少なくとも１回の分析で行うのに十分な量で前記Ｖ因子遺伝子の前記ヌクレオチドの位置２０５を含む増幅産物をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で生成することができる第１プライマー及び第２プライマーを含むプライマー対を含み、前記プライマー対が配列番号４／配列番号５、配列番号４／配列番号２４、配列番号１０／配列番号１１、又は配列番号４／配列番号１２である診断キット。 35．前記第１及び第２プライマーが別々の容器内にある請求項34記載の診断キット。 36．正常なＶ因子遺伝子に由来する対照ポリヌクレオチド配列を更に含み、前記配列が配列番号２、配列番号１８、ヌクレオチドの位置１６０１〜１７２４の配列番号１３、又は配列番号２７である請求項34記載の診断キット。 37．請求項38記載の対照ポリヌクレオチド配列を更に含み、Ｖ因子遺伝子に由来する前記配列がエキソン１０のヌクレオチドの位置２０５に遺伝子突然変異を有する請求項34記載の診断キット。 38．エキソン１０のヌクレオチドの位置２０５に遺伝子突然変異を有するＶ因子遺伝子に由来する単離したポリヌクレオチド配列組成物であって、前記配列が配列番号３、配列番号１９、ヌクレオチドの位置１６０１〜１７２４の配列番号２６、又は配列番号２８である組成物。 39．ヌクレオチドの位置２５からヌクレオチドの位置３０までの配列番号２４に示されたヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドプライマーであって、エキソン１０のヌクレオチドの位置２０５にグアニンのアデニンへの点突然変異を有するＶ因子遺伝子にＨｉｎｄＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を含む増幅産物をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって生成することができるポリヌクレオチドプライマー。 40．実質的に配列番号２４に示されたヌクレオチド配列からなる請求項39記載のポリヌクレオチドプライマー。