JPH08500724A

JPH08500724A - Ｄｎａ配列の解析のための化学的方法

Info

Publication number: JPH08500724A
Application number: JP5519892A
Authority: JP
Inventors: ユーレン、マチアス; ルンデバーグ、ジョアキム
Original assignee: セミュ・バイオテクニク・アーベー
Priority date: 1992-05-12
Filing date: 1993-05-12
Publication date: 1996-01-30
Anticipated expiration: 2018-06-30
Also published as: CA2135607A1; DE69307503T3; JP3421036B2; EP0641390A1; ATE147794T1; WO1993023562A1; DE69307503T2; AU669365B2; EP0641390B1; AU4068193A; CA2135607C; DE69307503D1; GB9210176D0; EP0641390B2; US5534424A

Abstract

(57)【要約】本発明は、ＤＮＡ配列のある標的位置の塩基を同定する方法にして、試料ＤＮＡを増幅処理に付し、その増幅ＤＮＡを固定化した後で二本鎖解離処理に付して、標的位置の直ぐ隣にハイブリダイズするような伸長プライマーから非固定鎖を取り除いておき、固定化された一本鎖ＤＮＡの４つのアリコートの各々を１種類のジデオキシヌクレオチド存在下でのポリメラーゼ反応に付し、その際、各アリコートについて異なるジデオキシヌクレオチドを用いて標的位置の塩基に相補的なジデオキシヌクレオチドだけが組込まれるようにしておき、次に、４つのアリコートを４種類すべてのデオキシヌクレオチドの存在下での伸長反応に付して、各アリコート中においてジデオキシヌクレオチドと反応していないＤＮＡが伸長して二本鎖ＤＮＡを形成する一方で、ジデオキシヌクレオチドでブロックされたＤＮＡは非伸長鎖ＤＮＡとして残るようにしておき、しかる後に、二本鎖及び／又は非伸長鎖ＤＮＡの同定を行なって、どのジデオキシヌクレオチドが導入されていて、したがってどの塩基が標的位置に存在しているのかを明らかにすることを特徴とする方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】ＤＮＡ配列の解析のための化学的方法本発明は、ＤＮＡ配列の標的位置にある塩基を同定するための新規方法に関する。診断又は法廷用のＤＮＡ解析では、１個の塩基の変異やミスマッチを検出すれば必要な情報が得られるような場合に標的ＤＮＡを完全に配列決定する必要はない。このような１塩基変異やミスマッチは例えば点変異によって生ずることもあるし、遺伝物質の欠失や挿入によっても生ずるが、このような場合には配列中の最初の異常塩基を検出すれば診断に必要な情報が得られるであろう。こうした点から、対立遺伝子特異的ＰＣＲ法が開発された。この方法では、標的ＤＮＡに対して一対のプライマー対を用いて試料のＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を行なうが、上記プライマー対の片方は比較的短くて標的ＤＮＡの一方の対立遺伝子座とはハイブリダイズするがもう一方の対立遺伝子配列とはハイブリダイズしない。したがって、増幅が起こらなければ、ハイブリッドを形成しない対立型のＤＮＡが存在していることの指標となるが、残念ながら、正常なＤＮＡに確実にハイブリダイズさせるために必要とされる諸条件を現実に遂行することは困難である。標的変異又は対立型変異領域から離れた位置にハイブリダイズするようなプローブを使用した後、突然変異領域又は対立型変異領域とはハイブリダイズしないような標識プローブを使用して、ＰＣＲを行なうことが提案されている。しかし、この方法も一般に偽陰性を与える。対立遺伝子特異的ＤＮＡを検出するためのリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）と呼ばれる方法が最近開発されており、バラングによって概説されている（F.Barang,P CR Methods and Applications Vol.1,5-16）。この方法では、相補ＤＮＡ上で互いに隣接してハイブリダイズするような２つの異なるオリゴヌクレオチドが必要であり、結果を判定する前にＬＣＲ生成物をポリアクリルアミドゲル上で分離する必要がある。完全に配列を決定する方法、特にＷＯ８９／０９２８２に記載されているような固相配列決定法は正確な結果を与えるが、もっと多大な労力を必要とし、そのため診断用スクリーニングには適さない場合もある。本発明は、増幅及び固定化された一本鎖形のＤＮＡの４つのアリコート（分割試料）についてポリメラーゼ連鎖反応を行なうという発想に基づくものである。各々のアリコートについて、同一の特異的伸長プライマーと異なるジデオキシヌクレオチドを用いるが、デオキシヌクレオチドは使用せず、こうして、標的位置の塩基に相補的なジデオキシヌクレオチドだけが組込まれるようにする。このとき、上記標的位置は上記ＤＮＡにハイブリダイズする特異的伸長プライマーの３ ′末端の直ぐ隣である。言い換えると、固定化鎖上での標的位置は、当該ＤＮＡに特異的伸長プライマーがハイブリダイズする場所の直ぐ５′側である。次に、通常のデオキシヌクレオチドを用いた鎖伸長反応（いわゆる追跡反応）を上記特異的プライマーを用いて行なって、ジデオキシヌクレオチドでブロックされたＤＮＡが未反応のまま残る一方で、ブロックされていないＤＮＡは二本鎖ＤＮＡを形成するようにする。次に、各種の方法を用いて二本鎖ＤＮＡを非伸長鎖（即ち、実質的に一本鎖のＤＮＡ）と区別して、標的位置の塩基の同定ができるようにする。このように、本発明は、ＤＮＡ配列のある標的位置の塩基を同定する方法にして、試料ＤＮＡを増幅処理に付し、その増幅ＤＮＡを固定化した後で二本鎖解離処理に付して、標的位置の直ぐ隣にハイブリダイズするような伸長プライマーから非固定鎖を取り除いておき、固定化された一本鎖ＤＮＡの４つのアリコートの各々を１種類のジデオキシヌクレオチド存在下でのポリメラーゼ反応に付し、その際、各アリコートについて異なるジデオキシヌクレオチドを用いて標的位置の塩基に相補的なジデオキシヌクレオチドだけが組込まれるようにしておき、次に、４つのアリコートを４種類すべてのデオキシヌクレオチドの存在下での伸長反応に付して、各アリコート中においてジデオキシヌクレオチドと反応していないＤＮＡが伸長して二本鎖ＤＮＡを形成する一方で、ジデオキシヌクレオチドでブロックされたＤＮＡは非伸長鎖ＤＮＡとして残るようにしておき、しかる後に、二本鎖及び／又は非伸長鎖ＤＮＡの同定を行なって、どのジデオキシヌクレオチドが導入されていて、したがってどの塩基が標的位置に存在しているのかを明らかにすることを特徴とする方法を提供する。本明細書中で用いるジデオキシヌクレオチドという用語は、３′-水酸基が存在しない又は３′-水酸基が修飾されている２′-デオキシヌクレオチドであって、ポリメラーゼ存在下でプライマーに付加させることはできるがそれ以降の重合反応に入ることのできない２′-デオキシヌクレオチドをすべて包含する。試料ＤＮＡはＰＣＲ法によってインヴィトロ（in itro）で増幅させるのが好ましいが、インヴィトロ自続式配列複製法（Self Sustained SequenceReplicati on;３ＳＲ法と略される）やべクター中でのインヴィボ（in vivo）増幅法のようなその他の方法も用いることができ、所望によっては、インヴィトロ及びインヴィボ増幅を併用してもよい。どのような増幅法を用いようとも、増幅されたＤＮＡが固体担体に固定化されるか或いは固体担体への結合手段を備えているのが望ましい。例えば、ＰＣＲプライマーを固体担体に固定化してもよいし、或いはＰＣＲプライマーに固体担体への結合手段を与えてもよい。また、ベクター内の試料ＤＮＡの挿入部位の隣に固体担体結合手段を含ませて、増幅試料ＤＮＡと結合手段とが一緒に切り出されるようにしてもよい。ＰＣＲ法では、標的ＤＮＡの既知配列に特異的な一対の重合用プライマーを選択する。即ち、一方のプライマーはそのＤＮＡ二本鎖の片方の鎖の５′末端もしくはその近傍にハイブリダイズし、もう一方のプライマーが相補鎖の５′末端もしくはその近傍にハイブリダイズするようにして、ポリメラーゼ存在下でそれぞれのプライマーから標的ＤＮＡ鋳型の末端に至るまで伸長したＤＮＡ配列が生ずるようにする。こうして合成されたＤＮＡを次に二本鎖解離処理（通常は約９０ ℃の温度で融解して行なう）に付すと、新たに合成された一本鎖ＤＮＡ配列が混合液中の過剰のプライマーとハイブリダイズ（通常は温度をアニーリングに適した範囲まで下げた後）するので、ポリメラーゼ存在下でさらにＤＮＡ鎖が合成されるが、このときは両プライマーの末端から末端までの部分しか伸長しない。ポリメラーゼは上記二本鎖解離段階で利用される高温に耐え得るものが好ましいが、最近、これに適した好熱性ポリメラーゼ、即ちＴａｑ、が入手できるようになった。ＤＮＡ合成に必要な上記２種類のプライマーと各種ヌクレオチドとを媒液中に過剰量維持しておくと、各々の鎖を合成し、解離し、プライマーをアニーリングし、さらに新しい鎖を合成するという循環過程の繰返しを、単にこれら各々の段階の至適温度に温度を上下させるだけで遂行することができる。このようにして、最初の標的ＤＮＡを指数関数的に増幅させることができ、比較的短時間のうちに濃度を百万倍も増大させることができる。ＰＣＲ法を用いる場合には、例えば比較的低いレベルのバックグラウンドで明確な結果を与えるような十分なＤＮＡが合成されたか否かを決定するために、そのＰＣＲ法の効率を評価するのが望ましい。各種の試験法が知られているが、本出願人の考えでは、本出願人が以前に報告した固定化増幅核酸を検出するためのＤＩＡＮＡという固相法（ＰＣＴ／ＥＰ９０／００４５４）を用いるのが好ましい。このＤＩＡＮＡ法は、例えばその好ましい具体的態様では、インヴィトロで増幅されたＤＮＡの比色検出に用いられる。このアッセイはビオチン化又はその他の手段で官能化されたＰＣＲプライマーの使用に基づくものであり、このプライマーはインヴィトロ増幅物を例えばストレプトアビジン被覆磁性ビーズ上に捕捉するために用いられる。もう一方のＰＣＲプライマーはｌａｃオペレーター配列のような「ハンドル」部を有しており、ＬａｃＩリプレッサー-β-ガラクトシダーゼ融合タンパク質を用いて捕捉ＤＮＡの比色検定を行なうことができる。（ Wahlberg,J.,Lundeberg,J.,Hultman,T.and Uhlen,M.(1990)“Generalcolorimetr ic method for DNA diagnostics allowing direct solid-phasegenomic sequenc ing of the positive samples"Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87,6569-6573参照）。この好ましい形の定性的ＤＩＡＮＡアッセイは、ＰＣＲ方法の諸々の利点と、ビオチン-ストレプトアビジン系の高い特異性及び安定性と、β-ガラクトシダーゼに基づく比色検定の簡単さとを併せ持っている。ビオチンとストレプトアビジンの強い相互作用（Ｋ_ｄ＝１０^-15Ｍ^-1）は系の効率をより一層高める。固体担体としての磁性ビーズの使用により、遠心処理、濾過処理或いは沈殿処理は全く必要なくなる（T.Hultman,S.Stahi,E.Hornes andM.Uhlen,Nucl.Acids Res.17,49 37(1989)）。ただし、本発明の方法では、同一のＰＣＲプライマーを固定化手段として用いると同時にｌａｃオペレーター配列組込み用にも用いるのが好ましい。特定のＤＮＡ配列に結合するタンパク質は多数知られており、オペロンの作動や抑制などの様々な遺伝プロセスに関与していることも多い。このようなタンパク質の一つがｌａｃリプレッサーのＬａｃＩであり、これはｌａｃオペレーター（ｌａｃＯＰ）と反応して転写を抑制する。したがって、仮に認識部位がｌａｃＯＰのＤＮＡ配列あれば、ＬａｃＩタンパク質を介して標識を結合させることができる。ＬａｃＩのようなＤＮＡ結合タンパク質ともう一つのタンパク質との融合タンパク質を工夫して、後者のタンパク質が、例えば色や蛍光や化学発光に基づく方法を用いた後段での検出に利用できるようにすると特に好ましい。このようなタンパク質の具体例はβ-ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ぺルオキシダーゼなどである。標識としては、増幅ＤＮＡの末端に導入された２１塩基対のｌａｃオペレーター配列を認識するようなＬａｃＩリプレッサー−β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質を使用するのが好ましい。このｌａｃオペレーター配列は、ＰＣＲプライマー対を使用する場合にはそのプライマー対の一方（好ましくは固定化プライマー）によって導入することもできるし、或いは、増幅べクター内の、増幅試料ＤＮＡと一緒に切り出すのに適した位置にこの配列が存在していてもよい。この融合タンパク質はＤＮＡのｌａｃＯＰ配列に結合し、ＯＮＰＧ（ｏ−ニトロフェニル−β-Ｄ-ガラクトシド）の添加によって発色するので、これを分光光度法で測定することができる。この融合タンパク質とＯＮＰＧ（ｏ-ニトロフェニル-β- Ｄ-ガラクトシド）を使用すると迅速で簡単な比色アッセイを行なうことができ、放射性標識の使用に伴う安全性の問題は生じない。例えばＩＰＴＧ（ｎ-イソプロピル−β-Ｄ-チオガラクトピラノシド）を加えると、この融合タンパク質をＤＮＡから解離させることができる。シグナル対ノイズ（Ｓ／Ｎ）比を高めるために、本出願人の係属中の出願ＰＣＴ／ＥＰ９０／００４５４に記載されているような二段階ＰＣＲ法（ネステド（ nested）プライマーを使用）を用いてもよく、そうすることによって、本発明の方法の感度を向上させることができる。このような予備増幅によって、試料中に混在している可能性のある他のＤＮＡに比して標的ＤＮＡの濃度が大幅に増加するし、また、標的ＤＮＡの別の配列に特異的な少なくとも１種類のプライマーを用いて第二段増幅を行なうと「バックグラウンドノイズ」に比して標的ＤＮＡのシグナルが顕著に増大する。適当なポリメラーゼであればどんなものを用いてもよいが、Ｔａｑポリメラーゼのような好熱性酵素を用いるのが好ましく、そうすれば、ＰＣＲの各サイクルごとに例えばクレノウフラグメントのようなポリメラーゼをわざわざ追加しなくても上述の温度サイクルを繰返すことができる。ＰＣＲを一段階法又は二段階法のいずれで行なうにしても、本発明はアリコート間のはっきりとした差異に基づくものであるのでＰＣＲの効率はさほど重要ではない。ただし、上述の通り、増幅ＤＮＡの有無をチェックするために最初に定量的ＤＩＡＮＡを行なうのが好ましい。１又はそれ以上のプライマーが担体に結合している場合のように増幅ＤＮＡの固定化がＰＣＲ増幅の一部として起こるようにしてもよいし、或いは、ＰＣＲプライマーの１つ又はそれ以上が後段での固定化を可能にするような官能基（例えばビオチン又はチオール基）を有していてもよい。プライマーの５′末端を固定化すると、そのプライマーから伸長したＤＮＡ鎖を固体担体に結合させることができ、そのＤＮＡ鎖の３′末端が担体から遠く離れるようになるので、後段でのポリメラーゼによる鎖伸長反応に利用できるようになる。本発明では特に有用なプライマーを用いるが、このプライマーは、５′から３ ′方向への読み取り配列、当該プライマーが固定化できるような手段、ＤＮＡ結合タンパク質の結合する配列、並びに標的ＤＮＡ鎖の５′末端もしくはその近傍にハイブリダイズし得る配列を含んでなる。このようなプライマーを使用すると、固定化が可能になるだけでなく、ポリペプチド段階において二本鎖ＤＮＡが実質的に固定化部位に至るまで形成されたか否かを判定することができる。固定化手段とＤＮＡ結合タンパク質の結合する配列との間、或いはＤＮＡ結合タンパク質の結合する配列と標的ＤＮＡにハイブリダイズし得る配列との間に、幾つかのヌクレオチドが介在してもよいことは明らかであろう。固定化手段はビオチンであるのが好ましいが、その他の官能基（例えばチオール基など）を使用してもよい。しかし、ストレプトアビジンとのビオチンの強い相互作用並びにビオチンはプライマーに比較的簡単に導入できることから、ビオチンを用いるのが好ましい。ＤＮＡ結合タンパク質の結合する配列は、好ましくはｌａｃオペレーターであり、これにはｌａｃＩリプレッサータンパク質が可逆的に結合する。固体担体は、好適には、マイクロタイターウェル（従来の８×１２形式のものが都合がよい）の形でもディップスティック（dipstick）の形であってもよく、これらはプライマーＤＮＡと結合するような活性化ポリスチレンで作製し得る（ K.Almer,博士論文，王立工業大学（Royal Institute of Technology），スウェーデン国ストックホルム，1988）。担体は、また、例えばアガロース、セルロース、アルギン酸塩、テフロン又はポリスチレンなどで作られた粒子や繊維やキャピラリーであってもよい。担体は、磁性粒子、例えばＤｙｎａｌＡＳ社（ノルウェー国オスロ）製の超常磁性ビーズなどであってもよい。固体担体は、プライマーを結合するための、水酸基やカルボキシル基やアルデヒド基やアミノ基のような官能基又はアビジンやストレプトアビジンのような部分を保有していてもよい。これらは一般に、かかる官能基のいずれかを有するポリマーの表面コーティングを与えるような処理を担体に施すことによって与えることができ、例えば、ポリウレタンとポリグリコールを併用して水酸基を与えたり、セルロース誘導体で水酸基を与えたり、アクリル酸又はメタクリル酸のポリマー又はコポリマーでカルボキシル基を与えたり、或いはアミノアルキル化ポリマーでアミノ基を与えたりすることができる。米国特許第４６５４２６７号には、このような表面コーティングの導入法が多数記載されている。アッセイ技術は非常に簡単で迅速であり、したがって多数の試料が迅速に分析できるようなロボット装置を用いて自動化するのは簡単である。好ましい検出及び定量は比色反応に基づいているので、視覚的な検査だけで判定できる場合も多い。標的ＤＮＡは試料中のｍＲＮＡから合成されたｃＤＮＡであってもよく、本発明の方法はこうして特徴的なｍＲＮＡに基づく診断にも応用できる。このような予備合成は逆転写酵素による予備処理によって行なうことができるが、好適には、後段でＰＣＲを行なう場合にはそのＰＣＲ段階で用いる緩衝液及び塩基の系と同じ系の中で行なう。ＰＣＲ操作は二本鎖を解離させるための加熱処理を要するので、逆転写酵素は最初のＰＣＲサイクルにおいて失活するはずである。ｍＲＮＡが試料核酸である場合には、最初の試料（例えば血清試料）を固定化ポリｄＴオリゴヌクレオチドで処理して、その末端ポリＡ配列を介してすべてのｍＲＮＡが回収できるようにするのが有利である。別法として、特異的ＲＮＡ配列を介してＲＮＡを回収するために、特異的オリゴヌクレオチド配列を用いることもできる。かかるオリゴヌクレオチドは、国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ８９／００３０４に記載されているように、後でｃＤＮＡに対するプライマーとして役立てることができる。標的ＤＮＡを最初に増幅する好ましい方法としてＰＣＲについて述べてきたが、ＰＣＲと組合わせる代わりに別の方法を用いてもよいことは当業者には明らかであろう。温度サイクリングも耐熱性ポリメラーゼも必要としない近年開発された増幅技術として、自続式配列複製（３ＳＲ）法がある。３ＳＲ法はレトロウイルスの複製をモデルにしたもので、増幅に使用することができる（Gingeras,T.R .et al,PNAS(USA)87: 1874-1878; 並びにGingeras,T.R.et al,PCRMethods and Amplifications Vol.1,pp25-33などを参照）。伸長プライマーは、標的位置の直ぐ隣で固定化鎖と適度なハイブリダイゼーションを起こす程度の十分な大きさを有している一方で、不要な化学合成を避けるためにある程度短いほうが都合がよい。Ｃ−Ｇ間の対合の方が結合に関与する水素結合の数が多いので、プライマーの大きさ並びにハイブリダイゼーションの安定性がＡ−Ｔ塩基対のＣ−Ｇ塩基対に対する比率にある程度依存していることは当業者には明らかであろう。また、当業者であれば、当然に、伸長プライマーと増幅配列のその他の部分との相同性並びにそれに応じた条件設定（ストリンジェンシー）を考慮するはずである。このようなルーチン実験についての指針は、例えばSambrook,J.,Fritsch,E.F.,and Maniatis,T.著のMolecular Cloning:a labo ratory manual (1989)などの文献に見出だすことができる。伸長プライマーは試料を４つのアリコートに分割する前に加えるのが好ましいが、各々のアリコートに個別に伸長プライマーを加えてもよい。伸長プライマーはＰＣＲプライマーと同一であってもよいが、系に追加要素を導入するために異なっているほうが好ましい。ジデオキシヌクレオチド存在下でのポリメラーゼ反応は、Ｔ７ポリメラーゼ、クレノウ又はＳｅｑｕｅｎａｓｅＶｅｒ．２．０（米国ＵＳＢ社製）などの、ジデオキシヌクレオチドの取込みを行なうポリメラーゼを使用して行なわれる。ただし、公知の通り、多くのポリメラーゼがプルーフリーディング（校正）活性、即ち、エラーチェッキング活性を有していて、鎖伸長に利用される３′末端の１個もしくはそれ以上のヌクレオチドが時により消化されることがある。本発明の方法でこのような消化が起こると、バックグラウンドノイズが増加する。この問題が起こらないように、例えばＴ７ポリメラーゼやＳｅｑｕｅｎａｓｅのような非プルーフリーディング型ポリメラーゼを使用するのが好ましい。さもなければ、ポリメラーゼによる３′消化を抑制するフッ素イオン又はヌクレオチド一リン酸を各アリコートに加えるのが望ましい。二本鎖ＤＮＡ及び／又は非伸長ＤＮＡの同定は様々な方法で行なうことができる。二本鎖ＤＮＡに関しては、鎖伸長反応の際の放射標識の導入などの慣用技術で可能であるが、ｌａｃオペレーター配列を用いるのが好ましく、このｌａｃオぺレーター配列は好ましくは上述の通り増幅時にＤＮＡに組込む。鎖全体の伸長によって二本鎖ＤＮＡ配列が生じ、これにｌａｃＩリプレッサー-β-ガラクトシダーゼ融合タンパク質が結合する。結合した融合タンパク質は上述の通り比色法で同定することができ、これによって伸長反応の起こった３つのアリコートが同定され、残りのアリコートに加えられたジデオキシ塩基が判明する。プライマーの伸長がジデオキシヌクレオチドでブロックされた非伸長ＤＮＡに関しても数多くの同定法が可能であり、当業者には容易に分かるであろう。好ましくは、伸長プライマーの３′末端の下流にハイブリダイズするプローブ、即ち、伸長プライマーのハイブリダイゼーション部位と固定化鎖の５′末端の間の固定化鎖にハイブリダイズするプローブを用いる。プローブは標識の付いているもの或いは標識を結合するための手段を有しているものが適している。このようなプローブは一本鎖ＤＮＡには結合するが、二本鎖ＤＮＡには結合しない。所望により、二本鎖ＤＮＡと一本鎖ＤＮＡの両方を同定してもよく、そうすると結果の正確性をさらにチェックすることができる。通常は、ジデオキシヌクレオチドを全く含んでいない対照実験並びに４種類すべてのジデオキシヌクレオチドの混合物を含んだ「ゼロ対照実験」を行なうのが好ましい。もう一つの同定手段は、本出願人の同一の出願日に係る係属出願（代理人参照番号：７５．５７７９９）に開示されている方法で、鎖伸長反応時に放出されるピロリン酸を検出するというものである。各ヌクレオチドが取込まれる際に、ヌクレオチド三リン酸からピロリン酸が解離して、残ったヌクレオチド一リン酸が生長核酸鎖の末端に取込まれる。終結ジデオキシヌクレオチドが鎖に取込まれていないアリコートでは、鎖伸長反応時にピロリン酸の放出が盛んに起こる。このようなピロリン酸の放出はルシフェリンとルシフェラーゼを用いて測定することができる。ルシフェリン／ルシフェラーゼ系はピロリン酸の存在量に実質的に正比例して光を発する。例えば遺伝病のキャリヤーの遺伝的検査などの診断用途においては、試料はヘテロ接合性の材料を含んでいる。即ち、ＤＮＡの半分は標的位置に一つのヌクレオチドを有しているが、もう半分は別のヌクレオチドを有している。したがって、本発明の方法に用いられる４つのアリコートのうち、２つは陽性シグナルを与え、２つは半陽性シグナルを与えるであろう。したがって、各試料中の検出標識量を定量的に決定するのが望ましい。ホモ接合性試料の場合には、４つのアリコートのうち、３つが陰性で１つが陽性シグナルを与えることは明らかであろう。好ましくは、本発明は、出願人の同一の出願日に係る係属出願（代理人参照番号：７５．５７４６６）に教示されている発明と組合わせる。この係属出願に教示された発明では、ＰＣＲを用いて、問題とするＤＮＡ鎖の３′末端側に永久に結合したプライマーを与えるようなループ構造を導入する。例えば、このような修正法では、二本鎖ＤＮＡのうちの標的位置を含んでいる鎖の標的配列上に伸長プライマーを３′ループ構造の一部として組込む。この標的配列はその３′末端側に領域Ａを有していて場合によってはその領域Ａからさらに３′側に伸びたＤＮＡ領域Ｂが存在しており、上記標的配列に相補的な配列の３′末端側にハイブリダイズする第一のプライマーであって固体担体上に固定化されているか或いは固体担体に結合させるための手段の与えられている第一のプライマー並びに上記標的配列のＡ及び／又はＢの少なくとも一部分にハイブリダイズする３′末端配列を有していてかつその５′末端にはＡと実質的に同一の配列を有する第二のプライマーを使用したポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅処理に上記二本鎖ＤＮＡを付す。この増幅処理によって、標的配列の３′末端に、領域Ａ・ループを形成し得る領域・配列Ａに相補的な領域Ａ′を以上の順序で有する二本鎖標的ＤＮＡを生じさせる。しかる後に、増幅二本鎖ＤＮＡを固定化形で二本鎖解離処理に付して、そうすることにより、固定化されていない標的鎖を遊離させ、領域Ａ′を領域Ａに自然に或いは人為的にハイブリダイズさせてループを形成させる。領域Ａ′の３′末端は標的位置の直ぐ隣にハイブリダイズする。ジデオキシ反応及び伸長反応では上記のハイブリダイズした部分をプライマーとして用いる。標的位置に組込まれた塩基はどのような方法で同定してもよいが、好ましくは、上記の係属中の出願７５．５７７９９に教示されているピロリン酸の放出による方法で同定する。本発明は、また、通常は少なくとも以下の構成成分：（ａ）その検査に特異的な伸長プライマーであって、標的位置がそのプライマーの３′末端の直ぐ隣になるように試料ＤＮＡにハイブリダイズする伸長プライマー；（ｂ）ポリメラーゼ；（ｃ）ジデオキシヌクレオチドとデオキシヌクレオチド；及び（ｄ）任意成分としての固体担体を含んだキットを包含する。このキットを一次ＰＣＲ増幅法で使用する場合には、キットは通常は少なくと以下の構成成分：（ｉ）少なくとも一方のプライマーがそのプライマーを固定化するための手段を有している一対のＰＣＲ用プライマー；（ii）ポリメラーゼ、好ましくはＴａｑ１ポリメラーゼのような耐熱性のポリメラーゼ；（iii）ＰＣＲ反応用の緩衝液；及び（iv）デオキシヌクレオチドも含んでいる。酵素標識を使用する場合には、キットはその酵素の基質と検出系のその他の成分を含んでいるのが都合がよい。好ましくは、上記プライマー対の一方はそのプライマーを固定化するための手段とタンパク質の結合する配列を共に含んでいる。好ましい形のプライマーは、（例えばストレプトアビジン被覆磁性ビーズへの）固定化用の手段として機能するビオチンと、標識用の手段としてのｌａｃオペレーターを含んでなる。上記のタイプの好ましいプライマーを用いて本発明を実施するためのキットは、ｌａｃＩリプレッサータンパク質と結合した酵素標識を含んでいるのが好ましく、好ましい酵素標識はβ−ガラクトシダーゼである。以下、図面を参照しながら非限定的な実施例により本発明を説明するが、図面について説明すると、図１は、本発明の方法を用いて１か所の標的位置の塩基を同定するためのプロトコールを示したものであり、図２は、実施例１で使用したオリゴヌクレオチドプライマーを増幅用の試料ＤＮＡと共に示したものであり、図３は、実施例で使用した別のオリゴヌクレオチドプライマーを試料ＤＮＡと共に示したものであり、かつ図４は本発明の方法の実施例で得られた結果を示すグラフである。材料と方法細菌株及び酵素．大腸菌（Escherichia coli）ＲＲＩΔＭ１５株（Ruther,U.(1982)“pUR 250wh ich allows rapid chemical sequencing of both strands of its inserts”Nuc l.Acids Res.,10,5765-5772）を細菌ホストとして使用した。使用したプラスミドベクターはｐＲＩＴ２８（Hultman,T.,Stahl,S.,Moks,T.andUhlen,M.(1988)“ Approaches to solid phase DNA sequencing”Nucleosides& Nucleotides 7,629 -638）であった。オリゴヌクレオチドの合成．ＨＩＶ逆転写酵素遺伝子（ＲＴ）の活性部位の一部をコードする領域（塩基６２５〜１１６５； Myers,G.,Korber,B.,Berkovsky,J.A.,Smith,R.F.and Pavlak is, G.N., Human Retroviruses and AIDS 1991 (Los AlamosNational Laborator y,New Mexico 1991)）に相補的な７種類のオリゴヌクレオチドプライマー：ＲＩＴ１３５、ＲＩＴ３２１、ＲＩＴ３２２、ＲＩＴ３３１、ＲＩＴ３３２及びＲＩＴ３３３（図２，図３参照）を、自動ＤＮＡ合成装置（スウェーデンのＫＡＢＩ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製のＧｅｎｅＡｓｓｅｍｂｌｅｒＰｌｕｓ）上で製造業者の説明書通りホスホルアミダイト化学により合成した。ＲＩＴ３２２はビオチンホスホルアミダイト（米国カリフォルニア州のＣｌｏｎｅｔｅｃｈ社製）を用いてビオチン化した。精製はｐｅｐＲＰＣ５／５逆相カラム（スウェーデン国のＫＡＢＩ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を用いて行なった。酵素及びヌクレオチド．各種制限酵素、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ＫＡＢＩ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製，スウェーデン）、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ（ＫＡＢＩ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製，スウェーデン）、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（米国カリフォルニア州のＣｅｔｕｓ社製）及びＳｅｑｕｅｎａｓｅｖｅｒ２．０（米国のＵＳＢ社製）は業者の忠告にしたがって使用した。デオキシヌクレオチド及びジデオキシヌクレオチドはドイツのＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｈｅｉｍ社から入手した。ＰＣＲクローニングＨＩＶ−１の患者から得られた臨床試料（スウェーデン国ストックホルムのスウェーデン細菌学研究所（Swedish Bacteriology Laboratory; ＳＢＬ））から、各５ｐｍｏｌのＲＩＴ３３１とＲＩＴ３３３（図３）を用いた増幅によってＨＩＶＲＴフラグメントをクローニングした。ＲＩＴ３３１とＲＩＴ３３３は共に、上流ＢａｍＨＩ及び下流ＥｃｏＲＩ認識部位を導入するための「ハンドル」部を含んでいた。ＰＣＲ反応混液は、２００μＭの各ｄＮＴＰ、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣ１（ｐＨ８．７）、２ｍＭのＭｇＣｌ_２、０．１％のＴｗｅｅｎ２０及び０．５ユニットのＡｍｐｌｉＴａｑを含んでいて、最終容積は５０μｌとした。温度プロフィールは、９５℃で０．５分間の変性段階、次いで５５℃で０．５分間のプライマーアニーリング段階、及び７２℃で２分間の伸長段階にセットした。これらの段階を、ＧｅｎｅＡｍｐＰＣＲＳｙｓｔｅｍＰＥ９６００（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製，米国カリフォルニア州）を用いて３０回繰り返した。こうしてＰＣＲ増幅したＨＩＶＲＴフラグメント及びべクターｐＲＩＴ２８を共にＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩで制限し、アガロースから切り出して精製した後、室温で１時間連結反応を行なった。この構築物でコンピテントＲＲＩΔＭ１５細胞を形質転換し、青／白選択（Langley,E.K.,Villarejo,M.R.,Fo wler,A.V.,Zamenhof,P.J.and Zabin,I.(1975)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.72,125 4-1257）ができるようにＩＰＴＧ（ｎ−イソプロピル-β-Ｄ-チオガラクトピラノシド）、Ｘ-ｇａｌ（5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトシド）及びアンピシリンを含んだＴＢＡＢ（前出のSambrook,J.and Maniatis,T.(1989) の文献）平板上に塗末接種した。固相配列決定法（Hultman,T.,Bergh,S.,Moks,T .and Uhlen,M.(1991)“Bidirectionalsolid-phase sequencing of in vitro-amp lified plasmid DNA”Bio Techniques10,84-93）により、５つの白色コロニーが正しいインサートをもつプラスミドであることを確認した。これらのコロニーのうちの１つをｐＲＩＴ−ＲＴと名付け、以降の研究用として選んた。このクローンはスウェーデン国ストックホルムの王立工業大学生化学科に保存してある。ＤＩＡＮＡ検出ミニシーケンシング用鋳型の調製ｐＲＩＴ２８−ＲＴのコロニーをバイアルに移して、１０μｌの２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．７）中で９９℃で５分間溶菌した。次いで１μｌの溶菌液を、５ｐｍｏｌのＲＩＴ１３５及びＲＩＴ３２２（ビオチン化）、０．２５ｐｍｏ１のＲＩＴ３２１、２００μＭの各ｄＮＴＰ、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．７）、２ｍＭのＭｇＣｌ_２、０．１％のＴｗｅｅｎ２０及び０．５ユニットのＡｍｐｌｉＴａｑのＰＣＲ混液に移して、最終容積を５０μｌとした。プライマーＲＩＴ３２２は、後段でストレプトアビジン被覆固体担体に結合させるための５′ビオチンとｌａｃＯＰ認識配列を規定する２１塩基とからなる。増幅を上記の通り行ない、得られたＰＣＲ生成物を次に、予備洗浄ストレプトアビジン被覆常磁性ビーズ（Lea,T.,Vartdal,F.,Nustad,K.,et al.(1988)“Monosi zed, magnetic polymer particles: and their use inseparation of cells and subcellular components and in the study oflymphocyte function in vitro ” Journal of Molecular Recognition 1,9-18)、即ち、製造業者の推奨する結合溶液で予備洗浄しておいたＤｙｎａｂｅａｄｓＭ２８０ストレプトアビジン（ノルウェーのＤｙｎａｌＡＳ社製）上に固定化した（Hultman,T.,Stfihl,S.,Hornes,E.and Uhlen,M. (1989)“Directsolid pha se sequencing of genomic and plasmid DNA using magnetic beadsas solid su pport”Nucl.Acids Res.17,4937-4946）。固定処理化後、ビーズを５０μｌの結合／洗浄溶液で洗って、結合ＤＮＡをアッセイした。ＤＮＡの固定化されたビーズを５０μｌの融合タンパク質ｌａｃＩ-β-ガラクトシダーゼ（ノルウェーのＤｙｎａｌＡＳ社製）と混合し、２０分間インキュベートした。ビーズをＤＩＡＮＡ緩衝液（ノルウェーのＤｙｎａｌＡＳ社製）で４回洗浄して過剰の融合タンパク質を除去し、壁の被膜によるバックグラウンドを排除するために最終段階で新しいチューブに変えた。１００μｌのｏ-ニトロフェニル-β-Ｄ-ガラクトシド（ＯＮＰＧ，１．２５ｍｇ／ｍｌ）を発色性基質として加え、そして６分後に１００μｌの１ＭＮａ_２ＣＯ_３を添加して反応を停止した。上清の４０５ｎｍの吸光度をＥＡＲ３４０ＡＴＥＬＩＳＡプレートリーダー（ＳＬＴ-Ｌａｂｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，オーストリア）で測定して分析した。２０ｐｌの０．１ＭＮａＯＨと５分間インキュベートして融解により二本鎖を解離させて、一本鎖固定化ＤＮＡ鋳型を生じさせ、これを再度５０μｌの結合溶液、５０μｌの１ ×ＴＥで洗浄した。１ｐｍｏｌのＲＩＴ３３２（図２）を用い、８ｍＭＭｇＣｌ₂ 及び２０ｍＭＴｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ７．５）中で容積を１３μｌとして、６５℃に５分間加熱して次に室温に１０分間静置することによって、プライマーのアニーリングを行なった。ミニシーケンシング反応適合ジデオキシヌクレオチドに関して、６つの別個の伸長反応（１つはｄｄＡＴＰのみで、１つはｄｄＣＴＰのみで、１つはｄｄＧＴＰのみで、１つはｄｄＴＴＰのみで、１つは４種類すべてのｄｄＮＴＰと共に、１つはｄｄＮＴＰを全く加えずに）は、２μｌのアニーリング混液、１７ｍＭＴｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、６ｍＭＭｇＣｌ₂、１ｍＭＤＴＴ、１μＭの適合ジデオキシヌクレオチド及び０．１３ユニットのＳｅｑｕｅｎａｓｅＶｅｒ．２を含んだ全量１０μｌの中で行なった。この実験の概略図を図１に示す。ジデオキシ取込み反応は室温で５分間行ない、２０μｌの０．５ＭＥＤＴＡの添加により停止させた。しかる後に、ビーズを３０μｌの１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で２回洗浄した。次の伸長段階では、２００μＭのｄＮＴＰ濃度を使用し、２５ｍＭのＴｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１２．５ｍＭのＭｇＣｌ₂、１ｍＭのＤＴＴ及び０．１３ユニットのＳｅｑｕｅｎａｓｅと共に全量を１０μｌとした。ジデオキシヌクレオチドが組込まれていないアリコートでは、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅによる鎖の伸長が起こって、完全な鎖長の二本鎖ＤＮＡがビーズに結合するようになる。室温で５分間インキュベーションした後、２０μｌの０．５ＭＥＤＴＡを加え、ビーズを４０μｌのＤＩＡＮＡ緩衝液（ノルウェーのＤｙｎａｌＡＳ社製）（０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），０．１５ＭＮａＣｌ，０．１％Ｔｗｅｅｎ２０，１ｍＭＭｇＣｌ₂及び１０ｍＭ β-メルカプトエタノール）で洗浄した。ＤＩＡＮＡによる検出結果はＤＩＡＮＡ法（Wahlberg, J., Lundeberg, J., Hultman, T. andUhlen, M. (1990) “General colorimetric method for DNA diagnosticsallowing dir ect solid-phase genomic sequencing of the positive samples”Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 6569-6573)で検出した。ＤＮＡの固定化されたビーズを５０μｌの融合タンパク質ｌａｃＩ-β-ガラクトシダーゼ（ノルウェーのＤｙｎａｌＡＳ社製）と混合し、２０分間インキュベートした。ビーズをＤＩＡＮＡ緩衝液（ノルウェーのＤｙｎａｌＡＳ社製）で４回洗浄して過剰の融合タンパク質を除去し、壁の被膜によるバックグラウンドを排除するために最終段階で新しいチューブに変えた。１００μｌのo-ニトロフェニル-β-D-ガラクトシド（ＯＮＰＧ，１．２５ｍｇ/ｍｌ）を発色性基質として加え、そして６分後に１００ μｌの１の１ＭＮａ₂ＣＯ₃を添加して反応を停止した。上清の４０５ｎｍの吸光度をＥＡＲ３４０ＡＴＥＬＩＳＡプレートリーダー（ＳＬＴ-Ｌａｂｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，オーストリア）で測定して分析した。その結果を図４に示す。このアッセイでは、４種類すべてのジデオキシヌクレオチド（ｄｄＮＴＰ）を使用した場合とｄｄＡＴＰのみを使用した場合に低いシグナルが得られた。配列決定用プライマーの３′末端の次の相補塩基はジデオキシチミジンであるので、上記の結果は、このアッセイ法を使用してある特定の場所の塩基配列を検出することができることを示している。実施例２鋳型の調製ＡＺＴ耐性を示す患者から得たＨＩＶ逆転写酵素遺伝子フラグメント（Petter son, B. et al 未発表データ）を、ＲＩＴ３３１とＲＩＴ３３３のプライマー対を用いて、べクターｐＲＩＴ２８にＰＣＲクローニングした。大腸菌ＲＲＩΔＭ１５株を形質転換して、青／白選択法（前出のLangley, E.K., etal (1975)）を用いて選択した。細菌コロニーを９９℃の２０ｍＭＴｒｉｓ-Ｃｌ（ｐＨ８．７）１０μｌ中で５分間溶菌して、ＰＣＲ増幅を行なった。次に、１μｌの溶菌液を、５ｐｍｏｌのプライマーセットＡ、２００μＭの各ｄＮＴＰ、２０ｍＭのＴｒｉｓ - Ｃｌ（ｐＨ８．７）、２ｍＭのＭｇＣｌ₂、０．１％のＴｗｅｅｎ２０及び０．５ユニットのＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（米国カリフォルニア州のＣｅｔｕｓ社製）に加えて、最終容積を５０μｌとした。温度プロフィールには、９５℃での０．５分間の変性段階、７０℃での１．５分間のアニーリング／伸長段階が含まれており、これらの段階を３０回繰り返した。上述の細菌コロニーの溶菌並びに上記反応操作には、ＧｅｎｅＡｍｐＰＣＲＳｙｓｔｅｍ９６００（Ｐｅｒｋｉｎ-Ｅｌｍｅｒ社製，米国カリフォルニア州）を用いた。ＰＣＲ生成物を、ストレプトアビジンの共有結合した常磁性ビーズ（前出のLea, T. (1988)）であるＤｙｎａｂｅａｄｓＭ２８０上に固定化した。ビーズは製造業者（ノルウェーのＤｙｎａｌＡＳ社）の使用説明書通りに使用した。固定化ＰＣＲ生成物を０．１０ＭＮａＯＨ中で１０分間インキュベートした後、上清を除去することにより、一本鎖ＤＮＡを得た。固定化一本鎖ＤＮＡを、５０μｌの１０ｍＭＴｒｉｓ-Ｃｌ（ｐＨ７．５），１ｍＭＥＤＴＡ，２ＭＮａＣｌで洗浄し、次いで５０μｌの１０ｍＭＴｒｉｓ-Ｃｌ（ｐＨ７．５）で洗浄した。洗浄後、２０ｍＭのＴｒｉｓ-Ｃｌ（ｐＨ７．５）、８ｍＭのＭｇＣｌ₂及び１ｐｍｏｌの配列決定用プライマーを加えて全量を１３μｌとした。混合液を６５℃で５分間インキュベートした後、室温に冷却した。ミニシーケンシングジデオキシヌクレオチド組込み反応は、常磁性ビーズ上に固定化された鋳型／プライマー-フラグメント１μｌ（５０μｌＰＣＲ増幅反応液の１/１３）と、０．１３ユニツトのＳｅｑｕｅｎａｓｅｖｅｒｓｉｏｎ２．０（米国のＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ社製）と、０．５μｌの１０μＭｄｄＮＴＰ（１種類）と、さらに２５ｍＭＴｒｉｓ-Ｃｌ（ｐＨ７．５），１２．５ｍＭＭｇＣｌ₂，２．５ｍＭＤＴＴを含んだ緩衝液とからなる全量で１０μｌの混合液中で行なった。室温で５分間インキュベートした後、５０μｌの１０ｍＭＴｒｉｓ-Ｃｌ（ｐＨ７．５），１ｍＭＥＤＴＡ，２ＭＮａＣｌ，１％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄し、次いで５０μｌの１０ｍＭＴｒｉｓ-Ｃｌ(ｐＨ７．５)，１ｍＭＥＤＴＡ，２ＭＮａＣｌで洗浄し、最後に５０μｌの１０ｍＭＴｒｉｓ-Ｃｌ（ｐＨ７．５）で洗浄した。１０ｍＭＴｒｉｓ-Ｃｌ(ｐＨ７．５)で容積を５μｌに調整した。対照フラグメントはｄｄＮＴＰ非存在下で、ゼロ対照フラグメントは全種類のｄｄＮＴＰ存在下で、ＤＮＡポリメラーゼとインキュベートした。これら様々な試料を次にＥＬＩＤＡで分析した。ＥＬＩＤＡ上記のミニシーケンシングの各プレインキュベーション試料が完全なプライマー伸長をするか否かについてＥＬＩＤＡ法でアッセイした。このアッセイは、ＬＫＢ１２５０ルミノメーターと電位差記録計を用いて行なった。ルミノメーターは内部標準光に対するレスポンスが１０ｍＶとなるように較正した。発光出力は既知量のＡＴＰ又はｐｐｉを添加して較正した。反応は室温で行なった。標準アッセイ容積は０．２ｍｌであり、以下の成分：０．１ＭＴｒｉｓ-酢酸（ｐＨ７．７５），２ｍＭＥＤＴＡ，１０ｍＭ酢酸マグネシウム，０．１％ＢＳＡ，１ｍＭＤＴＴ，０．４ｍｇ/ｍｌポリビニルピロリドン３６００００，２ μＭｄＮＴＰ，１００ｍｇ/ｍｌ D-ルシフェリン（ＢｉｏＯｒｂｉｔ社製，フィンランド），４μｇ/ｍｌ L-ルシフェリン（ＢｉｏＯｒｂｉｔ社製，フィンランド），０．３ユニット/ｍｌＡＴＰ依存性スルフリラーゼ（Ｓｉｇｍａ，米国）及び精製ルシフェラーゼ標品（Ｅｎｚｙｍａｔｉｘ，英国）を含んでいた。使用したルシフェラーゼの量は、容積１ｍｌで１００ｐｍｏｌのＡＴＰに対してＩＶのレスポンスを与えるものであった。５分間のプレインキュベーションの後、アデノシン５′-ホスホ硫酸とＮａＦとｄＮＭＰとをそれぞれ最終濃度が２μＭ，５ｍＭ，０．４ｍＭとなるように加えた。ジデオキシ組込み試料から分取した５ μｌの鋳型／プライマー-フラグメントを添加した後、０．１３ユニットのＳｅｑｕｅｎａｓｅを添加して反応を開始した。反応は５分以内に完了した。結果ミニシーケンシング法の原理ミニシーケンシング法の原理を図１に概略図として示す。この図では、残基Ｔの存在の有無を検査している。問題とする特定ＤＮＡフラグメントを、プライマー対の一方が５′末端がビオチン化されているようなＰＣＲ法で増幅する。ＰＣＲ増幅した問題のＤＮＡ断片をストレプトアビジンの共有結合した磁性ビーズ上に固定化し、次いでＮａＯＨで洗浄して一本鎖形に変換し、この一本鎖ＤＮＡに１種類のプライマーをアニールする。鋳型／プライマー-フラグメントを次に４つの異なるアリコートに分割し、これらをポリメラーゼ存在下にて４種類のｄｄＮＴＰの各々で別々に処理する。反応後、得られたフラグメントを洗浄して、４種類すべてのｄＮＴＰの存在するプライマー伸長反応の基質として用いる（図１参照）。ＤＮＡ特異的重合反応の進行をＥＬＩＤＡ法でモニターする。最初の反応においてジデオキシヌクレオチドが組込まれていると、次の「追跡」反応の際にピロリン酸の生成が阻害される。対照的に、ジデオキシヌクレオチドの組込みが起こっていなければ、「追跡」反応時にピロリン酸が盛んに放出されて、ＥＬＩＤＡ反応により発光する。このＥＬＩＤＡの結果から、プライマーの後に位置する最初の塩基が容易に推定される。４種類すべてのｄｄＮＴＰと共にインキュベートする陰性対照並びにｄｄＮＴＰの非存在下でＤＮＡポリメラーゼとインキュベートする陽性対照を含めてもよい。特定ＤＮＡのミニシーケンシングあるｄｄＮＴＰの組込みは、ポリメラーゼ反応時にそれと相補的なジデオキシヌクレオチド（ｄｄＮＴＰ）が存在した場合にのみ観察された。用いた条件下では、非相補塩基の組込みは全く観察されなかった。「追跡」反応の際には、非相補塩基とインキュベートした場合にのみ、ｐｐｉの生成がＥＬＩＤＡ法で検出された。相補塩基が組込まれた場合には、フリーな３′ＯＨ基を欠いているのでＤＮＡの伸長は不可能であった。ｄｄＮＴＰ３種類を含んだ混合液を４種類使ってＤＮＡフラグメント（最初の段階において）をインキュベートした場合にも同じ結果が得られた（データは示さず）。明瞭な結果を得るためにはエキソヌクレアーゼ活性を欠くＤＮＡポリメラーゼを使用しなければならない点を強調しておくが、ある種のポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性が例えばフッ素イオンなどによって抑制できることが知られている。非相補塩基の組込みを防止するために低濃度（０．０５〜５μＭ）のヌクレオチドを使用することも重要である。感度上記で紹介した実験では５０μｌのＰＣＲ増幅反応液の１/１３をＥＬＩＤＡ試験に使用した。しかし、使用量はこれより少なくても多くてもよい。１６１塩基長のＤＮＡフラグメントのプライマー伸長反応の際のｐｐｉ生成の初速度と生成量をＤＮＡ濃度の関数として求めた。ＥＬＩＤＡにおけるｐｐｉ生成の初速度と生成量は共に、（５０μｌのＰＣＲ増幅反応液の１/１３０から２/１３まで）一定間隔で試験したＤＮＡ濃度に比例する。アッセイ時のシグナルを増大させるために、ＤＮＡの量をさらに増やしてもよいし、固体担体の結合容量を増やしてもよい。このアッセイ（全量２００μｌ）の上限はｐｐｉ生成量２００ｐｍｏ１である。下限は、主として、使用したＤＮＡフラグメントの鎖長（シグナルはプライマー伸長反応時に組込まれるヌクレオチドの量に比例するため）、用いた容積、並びに異なる溶液中に混入した夾雑ｐｐｉ、によって決まる。後者の二つの因子は所望により修正することができる。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９４年５月６日【補正内容】特許協力条約第３４条(2)(b)に規定に基づく補正書における補正の対象及び補正の内容は以下の通りである。１．国際出願時における明細書第４頁の差替え（特許法第１８４条の４に規定する翻訳文第３頁１８行「ポリメラーゼ・・・」から第４頁１３行「・・・用いられる。」までの部分に該当し、具体的補正箇所は同翻訳文第４頁８行「ＰＣＴ /ＥＰ９０/００４５４」の「ＰＣＴ/ＥＰ９０/００４５４（ＷＯ９０/１１３６９）」への訂正に該当する）。２．国際出願時における明細書第６頁の差替え（特許法第１８４条の４に規定する翻訳文第５頁９行「増幅ＤＮＡ・・・」から第６頁８行「・・・好ましい。」までの部分に該当し、具体的補正箇所は同翻訳文第５頁２３行「ＰＣＴ/ＥＰ９０/００４５４」の「ＰＣＴ/ＥＰ９０/００４５４（ＷＯ９Ｏ/１１３６９）」への訂正に該当する）。３．国際出願時における明細書第８頁の差替え（特許法第１８４条の４に規定する翻訳文第７頁４行「これらは・・・」から同頁２９行「・・・核酸である場合には、」までの部分に該当し、具体的補正箇所は同翻訳文第７頁７行の「テフロン」の「テフロン（登録商標）」への訂正に該当する）。４．国際出願時における明細書第９頁の差替え（特許法第１８４条の４に規定する翻訳文第７頁２９行「最初の試料・・・」から第８頁２４行「・・・伸長プライマーは」までの部分に該当し、具体的補正箇所は同翻訳文第８頁４〜５行「ＰＣＴ/ＥＰ８９/００３０４」の「ＰＣＴ/ＥＰ８９/００３０４（ＷＯ８９/０９２８２）」への訂正に該当する）。５．国際出願時における明細書第１０頁の差替え（特許法第１８４条の４に規定する翻訳文第８頁２４行「試料を４つ・・・」から第９頁１９行「・・・数多くの」までの部分に該当し、具体的補正箇所は同翻訳文第８頁２９行「ＳｅｑｕｅｎａｓｅＶｅｒ．２．０（米国ＵＳＢ社製）」の「ＳｅｑｕｅｎａｓｅＶｅｒ．２．０（米国ＵＳＢ社製，Sequenaseは登録商標である）」への訂正に該当する）。６．国際出願時における明細書第１１頁の差替え（特許法第１８４条の４に規定する翻訳文第９頁１９行「同定法が・・・」から第１０頁１３行「・・・２つは」までの部分に該当し、具体的補正箇所は同翻訳文第９頁２９行〜第１０頁１行「代理人参照番号：７５．５７７９９」の「ＰＣＴ/ＥＰ９３/０１２０５（ＷＯ９３/２３５６４）」への訂正に該当する）。７．国際出願時における明細書第１２頁の差替え（特許法第１８４条の４に規定する翻訳文第１０頁１３行「半陽性・・・」から第１１頁５行「・・・領域Ａ ′の３′末端は」までの部分に該当し、具体的補正箇所は同翻訳文第１０頁１６〜１７行「代理人参照番号：７５．５７４６６」の「ＰＣＴ/ＥＰ９３/０１２０４（ＷＯ９３/２３５６３）」への訂正に該当する）。８．国際出願時における明細書第１３頁の差替え（特許法第１８４条の４に規定する翻訳文第１１頁５行「標的位置の・・・」から同頁２８行「・・・都合がよい。」までの部分に該当し、具体的補正箇所は同翻訳文第１１頁８行「７５．５７７９９」の「ＰＣＴ/ＥＰ９３/０１２０５（ＷＯ９３/２３５６４））」への訂正に該当する）。９．国際出願時における明細書第１５頁の差替え（特許法第１８４条の４に規定する翻訳文第１２頁２５行「ＨＩＶ・・・」から第１３頁２８行「・・・ＨＩＶＲＴ」までの部分に該当し、具体的補正箇所は同翻訳文第１３頁３行「Ｐ１ｕｓ」の「Ｐｌｕｓ（登録商業）」への訂正、同頁１２行「Ｓｅｑｕｅｎａｓｅｖｅｒ２．０（米国のＵＳＢ社製）」の「Ｓｅｑｕｅｎａｓｅｖｅｒ２．０（米国のＵＳＢ社製，Sequenaseは登録商標）」への訂正、及び同頁２２行「Ｔｗｅｅｎ２０」の「Ｔｗｅｅｎ２０（Tweenは登録商標）」への訂正に該当する）。１０．国際出願時における明細書第１７頁の差替え（特許法第１８４条の４に規定する翻訳文第１４頁２３行「予備洗浄ストレプトアビジン・・・」から第１５頁２１行「・・・１つは」までの部分に該当し、具体的補正箇所は同翻訳文第１４頁２８〜２９行「ＤｙｎａｂｅａｄｓＭ２８０ストレプトアビジン（ノルウェーのＤｙｎａ１ＡＳ社製）」の「ＤｙｎａｂｅａｄｓＭ２８０ストレプトアビジン（ノルウェーのＤｙｎａｌＡＳ社製，Dynabeadsは登録商標）」への訂正に該当する）。１１．国際出願時における明細書第１８頁の差替え（特許法第１８４条の４に規定する翻訳文第１５頁２２行「ｄｄＡＴＰ・・・」から第１６頁２０行「・・・変えた。」までの部分に該当し、具体的補正箇所は同翻訳文第１５頁２６行「Ｓｅｑｕｅｎａｓｅｖｅｒ２.０」の「Ｓｅｑｕｅｎａｓｅｖｅｒ２．０（Se quenaseは登録商標）」への訂正、同翻訳文第１６頁３行「Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ」の「Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（登録商標）」への訂正、及び同翻訳文第１６頁４行「Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ」の「Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（登録商標）」への訂正に該当する）。１２．国際出願時における明細書第１９頁の差替え（特許法第１８４条の４に規定する翻訳文第１６頁２０行「１００μ１のｏ−ニトロ・・・」から第１７頁１８行「・・・（前出のLea, T. (1988)）」までの部分に該当し、具体的補正箇所は同翻訳文第１７頁１１行「Ｔｗｅｅｎ２０」の「Ｔｗｅｅｎ２０（Tweenは登録商標）」への訂正に該当する）。１３．国際出願時における明細書第２０頁の差替え（特許法第１８４条の４に規定する翻訳文第１７頁１８行「であるＤｙｎａｂｅａｄｓ・・・」から第１８頁１６行「・・・否かについて」までの部分に該当し、具体的補正箇所は同翻訳文第１７頁１８行「ＤｙｎａｂｅａｄｓＭ２８０」の「ＤｙｎａｂｅａｄｓＭ２８０（Dynabeadsは登録商標）」への訂正、及び同翻訳文第１８頁２〜３行「Ｓｅｑｕｅｎａｓｅｖｅｒ２．０（米国のＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ社製）」の「Ｓｅｑｕｅｎａｓｅｖｅｒ２．０（米国のＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ社製，Sequenaseは登録商標）」への訂正に該当する）。１４．国際出願時における明細書第２１頁の差替え（特許法第１８４条の４に規定する翻訳文第１８頁１６行「ＥＬＩＤＡ法で・・・」から第１９頁１２行「・・・アリコートに分割し、」までの部分に該当し、具体的補正箇所は同翻訳文第１９頁３行の「Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ」の「Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（登録商標）」への訂正に該当する）。ポリメラーゼ存在下でそれぞれのプライマーから標的ＤＮＡ鋳型の末端に至るまで伸長したＤＮＡ配列が生ずるようにする。こうして合成されたＤＮＡを次に二本鎖解離処理（通常は約９０℃の温度で融解して行なう）に付すと、新たに合成された一本鎖ＤＮＡ配列が混合液中の過剰のプライマーとハイブリダイズ（通常は温度をアニーリングに適した範囲まで下げた後）するので、ポリメラーゼ存在下でさらにＤＮＡ鎖が合成されるが、このときは両プライマーの末端から末端までの部分しか伸長しない。ポリメラーゼは上記二本鎖解離段階で利用される高温に耐え得るものが好ましいが、最近、これに適した好熱性ポリメラーゼ、即ちＴａｑ、が入手できるようになった。ＤＮＡ合成に必要な上記２種類のプライマーと各種ヌクレオチドとを媒液中に過剰量維持しておくと、各々の鎖を合成し、解離し、プライマーをアニーリングし、さらに新しい鎖を合成するという循環過程の繰返しを、単にこれら各々の段階の至適温度に温度を上下させるだけで遂行することができる。このようにして、最初の標的ＤＮＡを指数関数的に増幅させることができ、比較的短時間のうちに濃度を百万倍も増大させることができる。ＰＣＲ法を用いる場合には、例えば比較的低いレベルのバックグラウンドで明確な結果を与えるような十分なＤＮＡが合成されたか否かを決定するために、そのＰＣＲ法の効率を評価するのが望ましい。各種の試験法が知られているが、本出願人の考えでは、本出願人が以前に報告した固定化増幅核酸を検出するためのＤＩＡＮＡという固相法（ＰＣＴ/ＥＰ９０/００４５４(ＷＯ９０/１１３６９) ）を用いるのが好ましい。このＤＩＡＮＡ法は、例えばその好ましい具体的態様では、インヴィトロで増幅されたＤＮＡの比色検出に用いられる。このアッセイはビオチン化又はその他の手段で官能化されたＰＣＲプライマーの使用に基づくものであり、このプライマーはインヴィトロ増幅物を例えばストレプトアビジン被覆磁性ビーズ上に捕捉するために用いられる。増幅ＤＮＡの末端に導入された２１塩基対のｌａｃオペレーター配列を認識するようなＬａｃＩリプレッサー-β-ガラクトシダーゼ融合タンパク質を使用するのが好ましい。このｌａｃオペレーター配列は、ＰＣＲプライマー対を使用する場合にはそのプライマー対の一方（好ましくは固定化プライマー）によって導入することもできるし、或いは、増幅べクター内の、増幅試料ＤＮＡと一緒に切り出すのに適した位置にこの配列が存在していてもよい。この融合タンパク質はＤＮＡのｌａｃＯＰ配列に結合し、ＯＮＰＧ（o-ニトロフェニル-β-D-ガラクトシド）の添加によって発色するので、これを分光光度法で測定することができる。この融合タンパク質とＯＮＰＧ（o-ニトロフェニル-β-D-ガラクトシド）を使用すると迅速で簡単な比色アッセイを行なうことができ、放射性標識の使用に伴う安全性の問題は生じない。例えばＩＰＴＧ（n-イソプロピルーβ-D-チオガラクトピラノシド）を加えると、この融合タンパク質をＤＮＡから解離させることができる。シグナル対ノイズ（Ｓ/Ｎ）比を高めるために、本出願人の係属中の出願ＰＣＴ/ＥＰ９０/００４５４（ＷＯ９０/１１３６９）に記載されているような二段階ＰＣＲ法（ネステド（nested）プライマーを使用）を用いてもよく、そうすることによって、本発明の方法の感度を向上させることができる。このような予備増幅によって、試料中に混在している可能性のある他のＤＮＡに比して標的ＤＮＡの濃度が大幅に増加するし、また、標的ＤＮＡの別の配列に特異的な少なくとも１種類のプライマーを用いて第二段増幅を行なうと「バックグラウンドノイズ」に比して標的ＤＮＡのシグナルが顕著に増大する。適当なポリメラーゼであればどんなものを用いてもよいが、Ｔａｑポリメラーゼのような好熱性酵素を用いるのが好ましく、そうすれば、ＰＣＲの各サイクルごとに例えばクレノウフラグメントのようなポリメラーゼをわざわざ追加しなくても上述の温度サイクルを繰返すことができる。ＰＣＲを一段階法又は二段階法のいずれで行なうにしても、本発明はアリコート間のはっきりとした差異に基づくものであるのでＰＣＲの効率はさほど重要ではない。ただし、上述の通り、増幅ＤＮＡの有無をチェックするために最初に定量的ＤＩＡＮＡを行なうのが好ましい。これらはプライマーＤＮＡと結合するような活性化ポリスチレンで作製し得る（ K.Almer，博士論文，王立工業大学（Royal Institute of Technology），スウェーデン国ストックホルム，1988）。担体は、また、例えばアガロース、セルロース、アルギン酸塩、テフロン（登録商標）又はポリスチレンなどで作られた粒子や繊維やキャピラリーであってもよい。担体は、磁性粒子、例えばＤｙｎａｌＡＳ社（ノルウェー国オスロ）製の超常磁性ビーズなどであってもよい。固体担体は、プライマーを結合するための、水酸基やカルボキシル基やアルデヒド基やアミノ基のような官能基又はアビジンやストレプトアビジンのような部分を保有していてもよい。これらは一般に、かかる官能基のいずれかを有するポリマーの表面コーティングを与えるような処理を担体に施すことによって与えることができ、例えば、ポリウレタンとポリグリコールを併用して水酸基を与えたり、セルロース誘導体で水酸基を与えたり、アクリル酸又はメタクリル酸のポリマー又はコポリマーでカルボキシル基を与えたり、或いはアミノアルキル化ポリマーでアミノ基を与えたりすることができる。米国特許第４６５４２６７号には、このような表面コーティングの導入法が多数記載されている。アッセイ技術は非常に簡単で迅速であり、したがって多数の試料が迅速に分析できるようなロボット装置を用いて自動化するのは簡単である。好ましい検出及び定量は比色反応に基づいているので、視覚的な検査だけで判定できる場合も多い。標的ＤＮＡは試料中のｍＲＮＡから合成されたｃＤＮＡであってもよく、本発明の方法はこうして特徴的なｍＲＮＡに基づく診断にも応用できる。このような予備合成は逆転写酵素による予備処理によって行なうことができるが、好適には、後段でＰＣＲを行なう場合にはそのＰＣＲ段階で用いる緩衝液及び塩基の系と同じ系の中で行なう。ＰＣＲ操作は二本鎖を解離させるための加熱処理を要するので、逆転写酵素は最初のＰＣＲサイクルにおいて失活するはずである。ｍＲＮＡが試料核酸である場合には、最初の試料（例えば血清試料）を固定化ポリｄＴオリゴヌクレオチドで処理して、その末端ポリＡ配列を介してすべてのｍＲＮＡが回収できるようにするのが有利である。別法として、特異的ＲＮＡ配列を介してＲＮＡを回収するために、特異的オリゴヌクレオチド配列を用いることもできる。かかるオリゴヌクレオチドは、国際特許出願ＰＣＴ/ＥＰ８９/００３０４（ＷＯ８９/０９２８２）に記載されているように、後でｃＤＮＡに対するプライマーとして役立てることができる。標的ＤＮＡを最初に増幅する好ましい方法としてＰＣＲについて述べてきたが、ＰＣＲと組合わせる代わりに別の方法を用いてもよいことは当業者には明らかであろう。温度サイクリングも耐熱性ポリメラーゼも必要としない近年開発された増幅技術として、自続式配列複製（３ＳＲ）法がある。３ＳＲ法はレトロウイルスの複製をモデルにしたもので、増幅に使用することができる（Gingeras，T. R.et al, PNAS (USA) 87： 1874-1878；並びに Gingeras, T.R. et al, PCRMe thods and Amplifications Vol.1, pp25-33 などを参照）。伸長プライマーは、標的位置の直ぐ隣で固定化鎖と適度なハイブリダイゼーションを起こす程度の十分な大きさを有している一方で、不要な化学合成を避けるためにある程度短いほうが都合がよい。Ｃ−Ｇ間の対合の方が結合に関与する水素結合の数が多いので、プライマーの大きさ並びにハイブリダイゼーションの安定性がＡ−Ｔ塩基対のＣ−Ｇ塩基対に対する比率にある程度依存していることは当業者には明らかであろう。また、当業者であれば、当然に、伸長プライマーと増幅配列のその他の部分との相同性並びにそれに応じた条件設定（ストリンジェンシー）を考慮するはずである。このようなルーチン実験についての指針は、例えば Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T.著のMolecular Cloning: a laboratory manual (1989)などの文献に見出だすことができる。伸長プライマーは試料を４つのアリコートに分割する前に加えるのが好ましいが、各々のアリコートに個別に伸長プライマーを加えてもよい。伸長プライマーはＰＣＲプライマーと同一であってもよいが、系に追加要素を導入するために異なっているほうが好ましい。ジデオキシヌクレオチド存在下でのポリメラーゼ反応は、Ｔ７ポリメラーゼ、クレノウ又はＳｅｑｕｅｎａｓｅＶｅｒ．２．０（米国ＵＳＢ社製，Sequenas eは登録商標である）などの、ジデオキシヌクレオチドの取込みを行なうポリメラーゼを使用して行なわれる。ただし、公知の通り、多くのポリメラーゼがプルーフリーディング（校正）活性、即ち、エラーチェッキング活性を有していて、鎖伸長に利用される３′末端の１個もしくはそれ以上のヌクレオチドが時により消化されることがある。本発明の方法でこのような消化が起こると、バックグラウンドノイズが増加する。この問題が起こらないように、例えばＴ７ポリメラーゼやＳｅｑｕｅｎａｓｅのような非プルーフリーディング型ポリメラーゼを使用するのが好ましい。さもなければ、ポリメラーゼによる３′消化を抑制するフッ素イオン又はヌクレオチドーリン酸を各アリコートに加えるのが望ましい。二本鎖ＤＮＡ及び／又は非伸長ＤＮＡの同定は様々な方法で行なうことができる。二本鎖ＤＮＡに関しては、鎖伸長反応の際の放射標識の導入などの慣用技術で可能であるが、ｌａｃオペレーター配列を用いるのが好ましく、このｌａｃオペレーター配列は好ましくは上述の通り増幅時にＤＮＡに組込む。鎖全体の伸長によって二本鎖ＤＮＡ配列が生じ、これにｌａｃＩリプレッサー-β-ガラクトシダーゼ融合タンパク質が結合する。結合した融合タンパク質は上述の通り比色法で同定することができ、これによって伸長反応の起こった３つのアリコートが同定され、残りのアリコートに加えられたジデオキシ塩基が判明する。プライマーの伸長がジデオキシヌクレオチドでブロックされた非伸長ＤＮＡに関しても数多くの同定法が可能であり、当業者には容易に分かるであろう。好ましくは、伸長プライマーの３′末端の下流にハイブリダイズするプローブ、即ち、伸長プライマーのハイブリダイゼーション部位と固定化鎖の５′末端の間の固定化鎖にハイブリダイズするプローブを用いる。プローブは標識の付いているもの或いは標識を結合するための手段を有しているものが適している。このようなプローブは一本鎖ＤＮＡには結合するが、二本鎖ＤＮＡには結合しない。所望により、二本鎖ＤＮＡと一本鎖ＤＮＡの両方を同定してもよく、そうすると結果の正確性をさらにチェックすることができる。通常は、ジデオキシヌクレオチドを全く含んでいない対照実験並びに４種類すべてのジデオキシヌクレオチドの混合物を含んだ「ゼロ対照実験」を行なうのが好ましい。もう一つの同定手段は、本出願人の同一の出願日に係る係属出願（ＰＣＴ/ＥＰ９３/０１２０５（ＷＯ９３/２３５６４））に開示されている方法で、鎖伸長反応時に放出されるピロリン酸を検出するというものである。各ヌクレオチドが取込まれる際に、ヌクレオチド三リン酸からピロリン酸が解離して、残ったヌクレオチド一リン酸が生長核酸鎖の末端に取込まれる。終結ジデオキシヌクレオチドが鎖に取込まれていないアリコートでは、鎖伸長反応時にピロリン酸の放出が盛んに起こる。このようなピロリン酸の放出はルシフェリンとルシフェラーゼを用いて測定することができる。ルシフェリン／ルシフェラーゼ系はピロリン酸の存在量に実質的に正比例して光を発する。例えば遺伝病のキャリヤーの遺伝的検査などの診断用途においては、試料はヘテロ接合性の材料を含んでいる。即ち、ＤＮＡの半分は標的位置に一つのヌクレオチドを有しているが、もう半分は別のヌクレオチドを有している。したがって、本発明の方法に用いられる４つのアリコートのうち、２つは陽性シグナルを与え、２つは半陽性シグナルを与えるであろう。したがって、各試料中の検出標識量を定量的に決定するのが望ましい。ホモ接合性試料の場合には、４つのアリコートのうち、３つが陰性で１つが陽性シグナルを与えることは明らかであろう。好ましくは、本発明は、出願人の同一の出願日に係る係属出願（ＰＣＴ/ＥＰ９３/０１２０４(ＷＯ９３/２３５６３)）に教示されている発明と組合わせる。この係属出願に教示された発明では、ＰＣＲを用いて、問題とするＤＮＡ鎖の３ ′末端側に永久に結合したプライマーを与えるようなループ構造を導入する。例えば、このような修正法では、二本鎖ＤＮＡのうちの標的位置を含んでいる鎖の標的配列上に伸長プライマーを３′ループ構造の一部として組込む。この標的配列はその３′末端側に領域Ａを有していて場合によってはその領域Ａからさらに３′側に伸びたＤＮＡ領域Ｂが存在しており、上記標的配列に相補的な配列の３ ′末端側にハイブリダイズする第一のプライマーであって固体担体上に固定化されているか或いは固体担体に結合させるための手段の与えられている第一のプライマー並びに上記標的配列のＡ及び／又はＢの少なくとも一部分にハイブリダイズする３′末端配列を有していてかつその５′末端にはＡと実質的に同一の配列を有する第二のプライマーを使用したポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅処理に上記二本鎖ＤＮＡを付す。この増幅処理によって、標的配列の３′末端に、領域Ａ・ループを形成し得る領域・配列Ａに相補的な領域Ａ′を以上の順序で有する二本鎖標的ＤＮＡを生じさせる。しかる後に、増幅二本鎖ＤＮＡを固定化形で二本鎖解離処理に付して、そうすることにより、固定化されていない標的鎖を遊離させ、領域Ａ′を領域Ａに自然に或いは人為的にハイブリダイズさせてループを形成させる。領域Ａ′の３′末端は標的位置の直ぐ隣にハイブリダイズする。ジデオキシ反応及び伸長反応では上記のハイブリダイズした部分をプライマーとして用いる。標的位置に組込まれた塩基はどのような方法で同定してもよいが、好ましくは、上記の係属中の出願ＰＣＴ/ＥＰ９３/０１２０４（ＷＯ９３/２３５６３）に教示されているピロリン酸の放出による方法で同定する。本発明は、また、通常は少なくとも以下の構成成分：（ａ）その検査に特異的な伸長プライマーであって、標的位置がそのプライマーの３′末端の直ぐ隣になるように試料ＤＮＡにハイブリダイズする伸長プライマー；（ｂ）ポリメラーゼ；（ｃ）ジデオキシヌクレオチドとデオキシヌクレオチド；及び（ｄ）任意成分としての固体担体を含んだキットを包含する。このキットを一次ＰＣＲ増幅法で使用する場合には、キットは通常は少なくとも以下の構成成分：（ｉ）少なくとも一方のプライマーがそのプライマーを固定化するための手段を有している一対のＰＣＲ用プライマー；（ii）ポリメラーゼ、好ましくはＴａｑ１ポリメラーゼのような耐熱性のポリメラーゼ；（iii）ＰＣＲ反応用の緩衝液；及び（iv）デオキシヌクレオチドも含んでいる。酵素標識を使用する場合には、キットはその酵素の基質と検出系のその他の成分を含んでいるのが都合がよい。ＨＩＶ逆転写酵素遺伝子（ＲＴ）の活性部位の一部をコードする領域（塩基６２５〜１１６５； Myers, G., Korber, B., Berkovsky, J.A., Smith, R.F. and Pavlakis,G.N., Human Retroviruses and AIDS 1991 (Los Alamos National La boratory,NewMexico 1991)）に相補的な７種類のオリゴヌクレオチドプライマー：ＲＩＴ１３５、ＲＩＴ３２１、ＲＩＴ３２２、ＲＩＴ３３１、ＲＩＴ３３２及びＲＩＴ３３３（図２，図３参照）を、自動ＤＮＡ合成装置（スウェーデンのＫＡＢＩ-Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製のＧｅｎｅＡｓｓｅｍｂｌｅｒＰｌｕｓ(登録商標)）上で製造業者の説明書通りホスホルアミダイト化学により合成した。ＲＩＴ３２２はビオチンホスホルアミダイト（米国カリフォルニア州のＣｌｏｎｅｔｅｃｈ社製）を用いてビオチン化した。精製はｐｅｐＲＰＣ５/５逆相カラム（スウェーデン国のＫＡＢＩ-Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を用いて行なった。酵素及びヌクレオチド．各種制限酵素、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ＫＡＢＩ-Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製，スウェーデン）、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ（ＫＡＢＩ-Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製，スウェーデン）、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（米国カリフォルニア州のＣｅｔｕｓ社製）及びＳｅｑｕｅｎａｓｅｖｅｒ２.０（米国ＵＳＢ社製，Sequena seは登録商標）は業者の忠告にしたがって使用した。デオキシヌクレオチド及びジデオキシヌクレオチドはドイツのＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｈｅｉｍ社から入手した。ＰＣＲクローニングＨＩＶ−１の患者から得られた臨床試料（スウェーデン国ストックホルムのスウェーデン細菌学研究所(Swedish Bacteriology Laboratory；ＳＢＬ)）から、各５ｐｍｏｌのＲＩＴ３３１とＲＩＴ３３３（図３）を用いた増幅によってＨＩＶＲＴフラグメントをクローニングした。ＲＩＴ３３１とＲＩＴ３３３は共に、上流ＢａｍＨＩ及び下流ＥｃｏＲＩ認識部位を導入するための「ハンドル」部を含んでいた。ＰＣＲ反応混液は、２００μＭの各ｄＮＴＰ、２０ｍＭのＴｒｉｓ -ＨＣＩ(ｐＨ８.７)、２ｍＭのＭｇＣｌ₂、０.１％のＴｗｅｅｎ２０（Tweenは登録商標）及び０.５ユニットのＡｍｐｌｉＴａｑを含んでいて、最終容積は５０μｌとした。温度プロフィールは、９５℃で０.５分間の変性段階、次いで５５℃で０.５分間のプライマーアニーリング段階、及び７２℃で２分間の伸長段階にセットした。これらの段階を、ＧｅｎｅＡｍｐＰＣＲＳｙｓｔｅｍＰＥ９６００（Ｐｅｒｋｉｎ-Ｅｌｍｅｒ社製，米国カリフォルニア州）を用いて３０回繰り返した。こうしてＰＣＲ増幅したＨＩＶＲＴ予備洗浄ストレプトアビジン被覆常磁性ビーズ（Lea, T., Vartdal, F.,Nustad, K., et al. (1988)“Monosized, magnetic polymer particles: andtheir use in separation of cells and subcellular components and in thestudy of lym phocyte function in vitro”Journal of Molecular Recognition1，9-18）、即ち、製造業者の推奨する結合溶液で予備洗浄しておいたＤｙｎａｂｅａｄｓＭ２８０ストレプトアビジン（ノルウェーのＤｙｎａｌＡＳ社製，Dynabeadsは登録商標）上に固定化した（Hultman, T., Stahl, S.,Hornes, E. and Uhlen, M. (1989) “Direct solid phase sequencing ofgenomic and plasmid DNA using magnetic beads as solid support”Nucl．Acids Res. 17, 4937-4946)。固定処理化後、ビーズを５０μｌの結合／洗浄溶液で洗って、結合ＤＮＡをアッセイした。ＤＮＡの固定化されたビーズを５０μｌの融合タンパク質ｌａｃＩ-β-ガラクトシダーゼ（ノルウェーのＤｙｎａｌＡＳ社製）と混合し、２０分間インキュベートした。ビーズをＤＩＡＮＡ緩衝液（ノルウェーのＤｙｎａｌＡＳ社製）で４回洗浄して過剰の融合タンパク質を除去し、壁の被膜によるバックグラウンドを排除するために最終段階で新しいチューブに変えた。１００μｌのo-ニトロフェニル-β-D-ガラクトシド（ＯＮＰＧ，１.２５ｍｇ/ｍｌ）を発色性基質として加え、そして６分後に１００μｌの１ＭＮａ₂ＣＯ₃を添加して反応を停止した。上清の４０５ｎｍの吸光度をＥＡＲ３４０ＡＴＥＬＩＳＡプレートリーダー（ＳＬＴ-Ｌａｂｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，オーストリア）で測定して分析した。２０μｌの０.１ＭＮａＯＨと５分間インキュベートして融解により二本鎖を解離させて、一本鎖固定化ＤＮＡ鋳型を生じさせ、これを再度５０μ ｌの結合溶液、５０μｌの１×ＴＥで洗浄した。ＩｐｍｏｌのＲＩＴ３３２（図２）を用い、８ｍＭＭｇＣｌ₂及び２０ｍＭＴｒｉｓ-ＨＣｌ(ｐＨ７.５)中で容積を１３μｌとして、６５℃に５分間加熱して次に室温に１０分間静置することによって、プライマーのアニーリングを行なった。ミニシーケンシング反応適合ジデオキシヌクレオチドに関して、６つの別個の伸長反応 (１つはｄｄＡＴＰのみで、１つはｄｄＣＴＰのみで、１つはｄｄＧＴＰのみで、１つはｄｄＴＴＰのみで、１つは４種類すべてのｄｄＮＴＰと共に、１つはｄｄＮＴＰを全く加えずに）は、２μｌのアニーリング混液、１７ｍＭＴｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ７.５）、６ｍＭＭｇＣｌ₂、１ｍＭＤＴＴ、１μＭの適合ジデオキシヌクレオチド及び０.１３ユニットのＳｅｑｕｅｎａｓｅＶｅｒ．２（Seque naseは登録商標）を含んだ全量１０μｌの中で行なった。この実験の概略図を図１に示す。ジデオキシ取込み反応は室温で５分間行ない、２０μｌの０．５ＭＥＤＴＡの添加により停止させた。しかる後に、ビーズを３０μｌの１０ｍＭＴｒｉｓ-ＨＣＩ（ｐＨ７.５）で２回洗浄した。次の伸長段階では、２００μＭのｄＮＴＰ濃度を使用し、２５ｍＭのＴｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１２．５ｍＭのＭｇＣｌ₂、１ｍＭのＤＴＴ及び０.１３ユニットのＳｅｑｕｅｎａｓｅ（登録商標）と共に全量を１０μｌとした。ジデオキシヌクレオチドが組込まれていないアリコートでは、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（登録商標）による鎖の伸長が起こって、完全な鎖長の二本鎖ＤＮＡがビーズに結合するようになる。室温で５分間インキュベーションした後、２０μｌの０.５ＭＥＤＴＡを加え、ビーズを４０μｌのＤＩＡＮＡ緩衝液（ノルウェーのＤｙｎａｌＡＳ社製）（０.１ＭＴｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ７．５），０．１５ＭＮａＣｌ，０．１％Ｔｗｅｅｎ２０，１ｍＭＭｇＣｌ₂及び１０ｍＭ β-メルカプトエタノール）で洗浄した。ＤＩＡＮＡによる検出結果はＤＩＡＮＡ法（Wahlberg, J., Lundeberg, J., Hultman, T.and allowing direct solid-phase genomic sequencing of the positive samples” Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 6569-6573）で検出した。ＤＮＡの固定化されたビーズを５０μｌの融合タンパク質ｌａｃＩ-β-ガラクトシダーゼ（ノルウェーのＤｙｎａｌＡＳ社製）と混合し、２０分間インキュベートした。ビーズをＤＩＡＮＡ緩衝液（ノルウェーのＤｙｎａｌＡＳ社製）で４回洗浄して過剰の融合タンパク質を除去し、壁の被膜によるバックグラウンドを排除するために最終段階で新しいチューブに変えた。１００μｌのo-ニトロフェニル-β-D-ガラクトシド（ＯＮＰＧ，１.２５ｍｇ/ｍｌ）を発色性基質として加え、そして６分後に１００μｌの１ＭＮａ₂ＣＯ3を添加して反応を停止した。上清の４０５ｎｍの吸光度をＥＡＲ３４０ＡＴＥＬＩＳＡプレートリーダー（ＳＬＴ-Ｌａｂｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，オーストリア）で測定して分析した。その結果を図４に示す。このアッセイでは、４種類すべてのジデオキシヌクレオチド（ｄｄＮＴＰ）を使用した場合とｄｄＡＴＰのみを使用した場合に低いシグナルが得られた。配列決定用プライマーの３′末端の次の相補塩基はジデオキシチミジンであるので、上記の結果は、このアッセイ法を使用してある特定の場所の塩基配列を検出することができることを示している。実施例２鋳型の調製ＡＺＴ耐性を示す患者から得たＨＩＶ逆転写酵素遺伝子フラグメント（Petter son, B. et al 未発表データ）を、ＲＩＴ３３１とＲＩＴ３３３のプライマー対を用いて、ベクターｐＲＩＴ２８にＰＣＲクローニングした。大腸菌ＲＲＩΔＭ１５株を形質転換して、青／白選択法（前出の Langley, E.K., etal(1975)）を用いて選択した。細菌コロニーを９９℃の２０ｍＭＴｒｉｓ-Ｃｌ（ｐＨ８.７）１０μｌ中で５分間溶菌して、ＰＣＲ増幅を行なった。次に、１μｌの溶菌液を、５ｐｍｏ１のプライマーセットＡ、２００μＭの各ｄＮＴＰ、２０ｍＭのＴｒｉｓ-Ｃｌ（ｐＨ８．７）、２ｍＭのＭｇＣｌ₂、０．１％のＴｗｅｅｎ２０（Tweenは登録商標）及び０．５ユニットのＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（米国カリフォルニア州のＣｅｔｕｓ社製）に加えて、最終容積を５０μｌとした。温度プロフィールには、９５℃での０.５分間の変性段階、７０℃での１. ５分間のアニーリング／伸長段階が含まれており、これらの段階を３０回繰り返した。上述の細菌コロニーの溶菌並びに上記反応操作には、ＧｅｎｅＡｍｐＰＣＲＳｙｓｔｅｍ９６００（Ｐｅｒｋｉｎ-Ｅｌｍｅｒ社製，米国カリフォルニア州）を用いた。ＰＣＲ生成物を、ストレプトアビジンの共有結合した常磁性ビーズ（前出のLea, T. (1988)）であるＤｙｎａｂｅａｄｓＭ２８０（Dynabeadsは登録商標）上に固定化した。ビーズは製造業者（ノルウェーのＤｙｎａｌＡＳ社）の使用説明書通りに使用した。固定化ＰＣＲ生成物を０．１０ＭＮａＯＨ中で１０分間インキュベートした後、上清を除去することにより、一本鎖ＤＮＡを得た。固定化一本鎖ＤＮＡを、５０μｌの１０ｍＭＴｒｉｓ-Ｃｌ（ｐＨ７．５），１ｍＭＥＤＴＡ，２ＭＮａＣｌで洗浄し、次いで５０μｌの１０ｍＭＴｒｉｓ-Ｃｌ（ｐＨ７．５）で洗浄した。洗浄後、２０ｍＭのＴｒｉｓ-Ｃｌ（ｐＨ７.５）、８ｍＭのＭｇＣｌ₂及び１ｐｍｏｌの配列決定用プライマーを加えて全量を１３μ ｌとした。混合液を６５℃で５分間インキュベートした後、室温に冷却した。ミニシーケンシングジデオキシヌクレオチド組込み反応は、常磁性ビーズ上に固定化された鋳型／プライマー-フラグメント１μｌ（５０μｌＰＣＲ増幅反応液の１/１３）と、０．１３ユニットのＳｅｑｕｅｎａｓｅｖｅｒｓｉｏｎ２．０（米国のＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ社製， Sequenaseは登録商標）と、０．５μｌの１０μＭｄｄＮＴＰ（１種類）と、さらに２５ｍＭＴｒｉｓ-Ｃｌ（ｐＨ７.５），１２.５ｍＭＭｇＣｌ₂，２.５ｍＭＤＴＴを含んだ緩衝液とからなる全量で１０μｌの混合液中で行なった。室温で５分間インキュベートした後、５０μｌの１０ｍＭＴｒｉｓ-Ｃｌ（ｐＨ７.５），１ｍＭＥＤＴＡ，２ＭＮａＣｌ，１％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄し、次いで５０μ ｌの１０ｍＭＴｒｉｓ-Ｃｌ（ｐＨ７．５），１ｍＭＥＤＴＡ，２ＭＮａＣＩで洗浄し、最後に５０μｌの１０ｍＭＴｒｉｓ-Ｃｌ（ｐＨ７．５）で洗浄した。１０ｍＭＴｒｉｓ-Ｃｌ（ｐＨ７．５）で容積を５μｌに調整した。対照フラグメントはｄｄＮＴＰ非存在下で、ゼロ対照フラグメントは全種類のｄｄＮＴＰ存在下で、ＤＮＡポリメラーゼとインキュベートした。これら様々な試料を次にＥＬＩＤＡで分析した。ＥＬＩＤＡ上記のミニシーケンシングの各プレインキュベーション試料が完全なプライマー伸長をするか否かについてＥＬＩＤＡ法でアッセイした。このアッセイは、ＬＫＢ１２５０ルミノメーターと電位差記録計を用いて行なった。ルミノメーターは内部標準光に対するレスポンスが１０ｍＶとなるように較正した。発光出力は既知量のＡＴＰ又はｐｐｉを添加して較正した。反応は室温で行なった。標準アッセイ容積は０.２ｍｌであり、以下の成分：０.１ＭＴｒｉｓ-酢酸（ｐＨ７.７５），２ｍＭＥＤＴＡ，１０ｍＭ酢酸マグネシウム，０．１％ＢＳＡ，１ｍＭＤＴＴ，０ .４ｍｇ/ｍｌポリビニルピロリドン３６００００，２μＭｄＮＴＰ，１００ｍｇ/ｍｌ D-ルシフェリン（ＢｉｏＯｒｂｉｔ社製，フ_ィンランド），４μ ｇ/ｍｌＬ-ルシフェリン（ＢｉｏＯｒｂｉｔ社製，フィンランド），０.３ユニット/ｍｌＡＴＰ依存性スルフリラーゼ（Ｓｉｇｍａ，米国）及び精製ルシフェラーゼ標品（Ｅｎｚｙｍａｔｉｘ，英国）を含んでいた。使用したルシフェラーゼの量は、容積１ｍｌで１００ｐｍｏｌのＡＴＰに対して１Ｖのレスポンスを与えるものであった。５分間のプレインキュベーションの後、アデノシン５ ′-ホスホ硫酸とＮａＦとｄＮＭＰとをそれぞれ最終濃度が２μＭ，５ｍＭ，０.４ｍＭとなるように加えた。ジデオキシ組込み試料から分取した５μｌの鋳型／プライマー-フラグメントを添加した後、０．１３ユニットのＳｅｑｕｅｎａｓｅ（登録商標）を添加して反応を開始した。反応は５分以内に完了した。結果ミニシーケンシング法の原理ミニシーケンシング法の原理を図１に概略図として示す。この図では、残基Ｔの存在の有無を検査している。問題とする特定ＤＮＡフラグメントを、プライマー対の一方が５′末端がビオチン化されているようなＰＣＲ法で増幅する。ＰＣＲ増幅した問題のＤＮＡ断片をストレプトアビジンの共有結合した磁性ビーズ上に固定化し、次いでＮａＯＨで洗浄して一本鎖形に変換し、この一本鎖ＤＮＡに１種類のプライマーをアニールする。鋳型／プライマー-フラグメントを次に４つの異なるアリコートに分割し、

Claims

【特許請求の範囲】１．ＤＮＡ配列のある標的位置の塩基を同定する方法にして、試料ＤＮＡを増幅処理に付し、その増幅ＤＮＡを固定化した後で二本鎖解離処理に付して、標的位置の直ぐ隣にハイブリダイズするような伸長プライマーから非固定化鎖を取り除いておき、固定化された一本鎖ＤＮＡの４つのアリコートの各々を１種類のジデオキシヌクレオチド存在下でのポリメラーゼ反応に付し、その際、各アリコートについて異なるジデオキシヌクレオチドを用いて標的位置の塩基に相補的なジデオキシヌクレオチドだけが組込まれるようにしておき、次に、４つのアリコートを４種類すべてのデオキシヌクレオチドの存在下での伸長反応に付して、各アリコート中においてジデオキシヌクレオチドと反応していないＤＮＡが伸長して二本鎖ＤＮＡを形成する一方で、ジデオキシヌクレオチドでブロックされたＤＮＡは非伸長鎖ＤＮＡとして残るようにしておき、しかる後に、二本鎖及び／又は非伸長鎖ＤＮＡの同定を行なって、どのジデオキシヌクレオチドが導入されていて、したがってどの塩基が標的位置に存在しているのかを明らかにすることを特徴とする方法２．請求項１記載の方法にして、固定化されているか或いは固定化用手段の備わっている第一のプライマーを用いるインヴィトロ増幅反応によって、試料ＤＮＡを増幅することを特徴とする方法。３．請求項２記載の方法にして、前記第一プライマーが、標識保有ＤＮＡ結合タンパク質に対する認識部位を二本鎖形のときに含んでいる領域を有していて、鎖伸長反応による二本鎖ＤＮＡの形成を上記標識タンパク質への結合によって同定することを特徴とする方法。４．請求項２又は請求項３記載の方法にして、前記第一プライマーが固定化用手段としてビオチンを有することを特徴とする方法。５．請求項２乃至請求項４のいずれか１項記載の方法にして、前記インヴィトロ増幅に、前記標的ＤＮＡの３′末端側の領域Ａ及び／又はその領域Ａからさらに３′側に伸びた領域Ｂにハイブリダイズする第二のプライマーであって、上記標的配列のＡ及び／又はＢの少なくとも一部分にハイブリダイズする３′末端配列を有していてかつその５′末端にはＡと実質的に同一の配列を有する第二のプライマーを使用し、この増幅処理によって、標的配列の３′末端に、領域Ａとループを形成し得る領域と配列Ａに相補的な領域Ａ′とを以上の順序で有する二本鎖標的ＤＮＡを生じさせ、しかる後に、増幅二本鎖ＤＮＡを固定化形で二本鎖解離処理に付して、そうすることによって固定化されていない標的鎖を遊離させて、領域Ａ′を領域Ａに自然に或いは人為的にハイブリダイズさせてループを形成させることを特徴とする方法。６．請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載の方法にして、二本鎖ＤＮＡの形成を、鎖伸長反応中に放出されたピロリン酸の検出又は推計によって同定することを特徴とする方法。７．請求項６記載の方法にして、発光をピロリン酸のインジケーター又は指標とするルシフェリン／ルシフェラーゼ反応によってピロリン酸を検出又は推計することを特徴とする方法。８．請求項１記載の方法を実施するためのキットにして、少なくとも以下の構成成分：（ａ）その検査に特異的な伸長プライマーであって、前記標的位置がそのプライマーの３′末端の直ぐ隣になるように試料ＤＮＡにハイブリダイズする伸長プライマー；（ｂ）ポリメラーゼ；（ｃ）ジデオキシヌクレオチドとデオキシヌクレオチド；及び（ｄ）任意成分としての固体担体を含んでなることを特徴とするキット。９．請求項８記載のキットにして、さらに少なくとも以下の構成成分：（ｉ）少なくとも一方のプライマーがそのプライマーを固定化するための手段を有している一対のＰＣＲ用プライマー；（ii）ポリメラーゼ、好ましくはＴａｑ１ポリメラーゼのような耐熱性のポリメラーゼ；（iii）ＰＣＲ反応用の緩衝液；及び（iv）デオキシヌクレオチドをも含んでいることを特徴とするキット。