JPH07501686A

JPH07501686A - ポリフェノールオキシダーゼ遺伝子

Info

Publication number: JPH07501686A
Application number: JP5502480A
Authority: JP
Inventors: ロビンソン，シモン・ピアース; ドライ，イアン・バリー
Original assignee: コモンウェルス・サイエンティフィック・アンド・インダストリアル・リサーチ・オーガナイゼーション
Priority date: 1991-07-17
Filing date: 1992-07-16
Publication date: 1995-02-23
Also published as: ATE188507T1; AU2331692A; EP0599868B1; WO1993002195A1; DE69230535T2; AU655494B2; EP0599868A4; US6703542B1; CA2112998C; DK0599868T3; NZ243594A; EP0599868A1; CA2112998A1; US6936748B1; ES2143475T3; DE69230535D1; GR3033104T3

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ポリフェノールオキシダーゼ遺伝子本発明は、果実および野菜のポリフェノールオキシダーゼ（ＰＰＯ）活性を変更する方法並びにそこで使用するためのＤＮＡ配列に関する。

植物組織の褐変は、しばしば、引続きの損傷または損害を引起こし、概して、これは果実および野菜を腐敗させる結果となる。望ましくない褐変は、植物材料を加工して食品または他の製品を製造する際にも生じる。これらの褐変反応を防止する処置は輸送、貯蔵および加工中に講じられる。しばしば、これは二酸化硫黄などの化学物質の使用を必要とするが、これらの物質の使用は、それらの安全性および消費者の許容の懸念ゆえに将来において制限されると考えられる。例えば、米国食品医薬品症は、１９８６年に、大部分の生鮮果実および野菜に対する亜硫酸塩の使用を禁止した。褐変に対する感受性が本質的に低い果実および野菜変種の生産は、これらの化学物質処理の必要をなくするであろう。

したがって、本発明の目的は、先行技術に関連した１種類またはそれ以上の問題を克服するまたは少なくとも軽減することである。

植物の褐変が主として酵素ＰＰＯによって触媒されていることは理解される。

ＰＰＯは植物細胞の色素体中に局在しているが、酵素のフェノール性基質は植物細胞液胞中に貯蔵されている。この分画は、植物細胞が損傷さね〜そして酵素およびその基質が混合されない限り、褐変反応を生じさせない。この酵素の量を減少させることができるならば、褐変に対する組織の感受性は減少するであろう。

ＰＰＯ配列情報を用いて、正常なＰＰＯ遺伝子の発現を減少させるように植物を形質転換することができる合成遺伝子を構築し、それによって酵素の合成を減少させることができる。

更に、ある場合において、例えば、紅茶、ココア、コーヒー、黒胡淑、ブラ・ツクオリーブ等の生産においては、植物の褐変反応か望ましいことが理解される。

これらの場合、ＰＰＯの量を増大させて、望ましい程度の褐変または風味成分の変化を生じさせることが望ましいことがある。

正常な植物の成長および発育におけるＰＰｏの役割は、現在のところ理解されていない。この酵素の増大した濃度が植物病原体に対する増大した耐性と相関している場合が多数存在している。当然の結果として、ＰＰｏ活性の水準を増大させる植物の遺伝子操作は、病原体および有害生物に対する有用な耐性を与えることができる。

グレープパイン（ｇｒａｐｅｖｉｎｅ）のＰＰｏ遺伝子は、成熟タンパク質のＮ末端の上流の追加の１０３アミノ酸をコードする。この領域は、葉緑体トランシットペプチドの性質を有し、しかもタンパク質が葉緑体中に引き入れられ且つ成熟ＰＰＯタンパク質を生産するように処理されるように的をしぼるためのものであると考えられる。この遺伝子による植物の形質転換は、したがって、他種においてグレープバインＰＰＯの正しい標的および成熟を生じ且つこれらの組織の色素体中で活性グレープバインＰＰＯ酵素の蓄積を引起こすことができる。

本明細書中で用いられるｒｐｐｏをコードしている遺伝子」、ｒｐｐｏをコードする遺伝子」またはｒｐｐｏ遺伝子コは、ＰＰｏ遺伝子またはそれと実質的に相同の配列を意味すると理解されるべきである。

本発明の第一の態様において、ポリフェノールオキシダーゼ（ＰＰＯ）活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含むＤＮＡ配列またはそのフラグメントを提供する。

ＤＮＤ配列は、トランシットペプチドをコードするＰＰＯ遺伝子のプレ配列を含んでいてよい。

ＤＮＤ配列は修飾されていてよい。ＤＮＡ配列は、正常なＰＰＯ遺伝子に対するアンチセンスｍＲＮＡをコードする配列またはそのフラグメントを含んでいてよい。

ＤＮＡ配列は、触媒開裂部位を更に含んでいてよい。

或いは、プレ配列は、ＰＰＯタンパク質を他の細胞区分に向けるように他の標的配列によって置き換えることができる。

ＤＮＡ配列は、図１に図示したような、推定上の葉緑体トランシット配列および成熟グレープバインＰＰＯタンパク質を含んでいてよい。

ＤＮＡ配列は、図２に図示したような、ソラマメの葉のＰＰＯ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含んでいてよい。

ＤＮＡ配列は、図３に図示したような、リンゴ果実ＰＰＯ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含んでいてよい。

ＤＮＡ配列は、図４に図示したような、ジャガイモ塊茎ＰＰＯ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含んでいてよい。

本発明のもう一つの態様において、ＰＰＯをコードするＤＮＡ配列またはそのフラグメントを含む組換えＤＮＡプラスミドを製造する方法であって、ＰＰＯ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含むＤＮＡ配列またはそのフラグメント；およびプラスミド発現ベクターを提供し；そして該ＤＮＡ配列および該プラスミド発現ベクターを反応させて、該ＤＮＡ配列を該プラスミド発現ベクター中に配置することを含む上記方法を提供する。

ＰＰＯをコードするＤＮＡ配列は、例えば、植物試料から単離されたポリアデニル化ＲＮＡから生成することができる。植物は、リンゴ、ジャガイモ、ブドウおよび豆から選択することができる。好ましくは、植物試料は、スルタナブドウ果実、ソラマメの葉、リンゴの外皮若しくは皮層またはジャガイモ塊茎から単離される。

ＰＰＯをコードするＤＮＡ配列を提供するために、本発明の好ましい態様において、組換えＤＮＡプラスミドの製造方法は、ＰＰＯポリペプチド源を提供し；ＰＰＯをコードするポリアデニル化ＲＮＡをそこから単離し；そしてコピーＤＮＡ　（ＣＤＮＡ）を構築するように該ポリアデニル化ＲＮＡを処理する予備工程を含むことができる。

ポリアデニル化ＲＮＡの単離は、オリゴ−ｄＴスパンカラムを用いて実施することができる。

本発明のこの態様にしたがってｃＤＮＡを構築するようにポリアデニル化ＲＮＡを処理する工程は、該ポリアデニル化ＲＮＡを逆転写酵素およびアダプタープライマーで処理して第 −鎖ｃＤＮＡを生成し；そしてそのように生成されたｃＤＮＡを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて増幅させることを含むことができる。

ポリアデニル化ＲＮＡと逆転写酵素との反応工程は、配列５’　−ＧＡＣＴＣＧＡＧＴＣＧＡＣＡＴＣＧＡを有するオリゴヌクレオチドアダプタープライマーを用いることができる。

ｃＤＮＡを増幅させる工程は、配列５’　−ＧＡＣＴＣＧＡＧＴＣＧＡＣＡＴＣＧを有するアダプタープライマーおよび５′末端プライマーを用いることができる。

５′末端プライマーは、ブドウｃＤＮＡの増幅用に用いられる場合、配列５’　 −ＣＣＩＡＴＩＣＡＧＧＣＩＣＣＩＧＡＴＡＴＩＩＣＩＡＡＧＴＧＴＧＧを有することができる。

５′末端プライマーは、豆ｃＤＮＡの増幅用に用いられる場合、配列５’　−ＧＣＧＧＡＴＣＣＴｒ［ＣＴ］ＴＡ　［ＣＴコＧＡ　［ＣＴ］　ＧＡ　［ＧＡ］　ＡＡ　［ＣＴ］　ＡＡを有することができる。

５′末端プライマーは、リンゴｃＤＮＡの増幅用に用いられる場合、配列（５’ 　−ＧＣＧＡＡＴＴＣＧＡ　［ＡＧコＧＡ［ＴＣ］ＡＴＧＧＧＩＡＡ［ＴＣ］Ｔｒ［ＴＣ］Ｔ＾）を有することができる。

５′末端プライマーは、ジャガイモｃＤＮＡの増幅用に用いられる場合、配列ＧＥＮ３　：　（５’　−ＧＣＧＡＡＴＴＣＴＴ　［Ｔｅ３　［Ｔｅ３　ＴＩＣＣＩＴｒ　［Ｔｅ３　ＣＡ　［Ｔｅ３　［ＡＣ］のＧＥＮ７　：　（５’　−ＧＣＧＡＡＴｒＣＡＡ　［Ｔｅ３　ＧＴＩＧＡ　［Ｔｅ３　［ＡＣ］　ＧＩＡＴＧＴＧＧ）を有することができる。

或いは、本発明のこの態様にしたがってｃＤＮＡを構築するようにポリアデニル化ＲＮＡを処理する工程は、該ポリアデニル化ＲＮＡを逆転写酵素およびＰＰＯ特異的プライマーで処理して第−鎖ｃＤＮＡを生成し；そのように生成されたｃＤＮＡをターミナルｄトランスフェラーゼで処理して、ポリアデノシン尾部配列を該ｃＤＮＡの３′末端に結合し；そしてそのように生成されたポリアデニル化ｃＤＮＡをＰＣＲによって増幅させることを含むことができる。

ポリアデニル化ＲＮＡを逆転写酵素で処理する工程は、ブドウＰＰＯに関して配列５’　−ＡＡＴＣＴＴｒＧＴＧＧＴＧＡＣＴＧＧＣＧを有するＰｒｏ特異的オリゴヌクレオチドプライマーを用いることができるしまたは該ＰＰＯ特異的プライマーはジャガイモ塊茎ＰＰＯに関して配列５’　ＧＡＣＧＧＴＡＣＡＴｒＡＧＴＣＴｒ＾＾ＡＴを有するオリゴヌクレオチドプライマーである。

ｃＤＮＡを増幅させる工程は、配列５’　−ＧＡＣＴＣＧＡＧＴＣＧＡＣＡＴＣＧＡＴＴ■テ羽ＴＴＴ汀■を有するオリゴヌクレオチドアダプタープライマーおよびブドウＰＰＯに関して配列５′−＾ＣＣＡＴＣＡＧＧＣＡＣＧＧＴＧＧＣＧＧまたはジャガイモ塊茎ＰＰＯに関して配列５’　−ＴＧＣＴＣＡＴＣＡＡＣＴＧＧＡＧＴＴＧＡＧを有するＰＰＯ特異的オリゴヌクレオチドプライマーを用いることができる。

二本鎖ｃＤＮＡのクローニングのためのプラスミド発現ベクターは任意の適当な種類であってよい。プラスミドベクターブルースクリプト（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）ＳＫ　は適当であることが分かつている。

クローニング工程は任意の適当な形式をとってよい。好ましい形式はｃＤＮＡをフレノウフラグメントてプラント末端付きにし；そのように生成されたｃＤＮＡをアガロースゲル上で分別し；予想の寸法のフラグメントをゲルから単離し：そして該フラグメントをブルースクリプトＳＫ　ベクターのＨｉｎｄＩ　Ｉ　ＩまたはＥｃｏＲ１部位に連結することを含むことができる。

このように生成されたクローンを試験するために、適当な微生物をプラスミド発現ベクターによって形質転換することができ、該微生物を培養し、そしてそこにおいてコードされたポリペプチドを発現させることができる。微生物大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＤＨ５は適当であることが分かつている。

本発明のもう一つの態様において、ＰＰＯ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列またはそのフラグメントを含む組換えＤＮＡプラスミドであって、単細胞生物において複製され、転写され、そして翻訳されることができる上記プラスミドを提供する。

プラスミド発現ベクターは任意の適当な種類であってよい。組換体プラスミドは、ＰＰＯ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の上流の構成的プロモーター要素を含むことができる。

本発明のもう一つの態様において、植物組織中のＰＰＯ活性の水準を低下させる方法であって、修飾ＰＰＯ遺伝子またはそのフラグメントを含むＤＮＡ構築物；および植物試料を提供し；そして該ＤＮＡ構築物を該植物試料中に導入して形質転換した植物を製造することを含む上記方法を提供する。

ＤＮＡ構築物は、正常ＰＰＯ遺伝子に対するアンチセンスｍＲＮＡをコードしている配列またはそのフラグメントを含むことができる。ＤＮＡ構築物は、ＰＰＯ遺伝子またはそのフラグメントを含み、触媒開裂部位を組込んでいることができる。

植物は任意の適当な種類であってよい。好ましい態様において、植物は、グレープパイン、ジャガイモ、リンゴおよび豆を含む群より選択することができる。

本発明のもう一つの態様において、植物組織中のＰＰＯ活性の水準を増大させる方法であって、ＰＰＯ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子またはそのフラグメントを含むＤＮＡ構築物；および植物試料を提供し；そして該ＤＮＡ構築物を該植物試料中に導入して形質転換した植物を製造することを含む上記方法を提供する。

ＤＮＡ構築物は、ＰＰＯプレ配列をコードしているＤＮＡ配列またはそのフラグメントを含むことができる。

植物は任意の適当な種類であってよい。好ましい態様において、植物は、タバコ、ソラマメ、トマト、茶、コーヒーおよびココアから成る群より選択することができる。

トランシットペプチドをコードするプレ配列は、ＰＰＯタンパク質を他の細胞区分に向けるように、他の標的配列と置き換えることができる。異種遺伝子を植物細胞の液胞、ミトコンドリアまたは細胞内空間に向ける配列は既に知られている。更に、グレープバインＰＰＯに関するトランシット配列を用いて他のタンパク質を色素体に集中させることができた。

ＤＮＡ構築物は、導入された遺伝子を植物中の至る所で発現させると考えられる構成的プロモーターを含むことができる。

多数の植物組織中において、ＰＰＯがある組織種牛で高度に発現されることは理解される。例えば、ＰＰＯ活性はブドウ果実の皮において果肉の場合よりもはるかに高く、そしてジャガイモ塊茎の外皮は皮層よりも高い活性を有する。

ＰＰＯ活性の水準を植物のある組織中においてのみまたは植物のある発育段階でのみ変更することは望ましいことがあるが、これは特異的プロモーター要素を用いることによって達成することができる。例えば、パタティン（ｐａｔａｔｉｎ）プロモーターの使用は、ジャガイモ植物の塊茎組織中においてのみＰＰＯ濃度を変更する。これは塊茎におけるＰＰＯ活性を低下させ且つ褐変を減少させるが、ジャガイモ植物の他の部分におけるＰＰＯ活性は変化［２ない。

したがって、ＤＮＡ構築物は、果実および野菜の外皮すなわち皮に対して特異的であるプロモーターを含んで、異種タンパク質を外部組織層に特異的に集中させることができる。

これは、外皮すなわち皮の性質、例えば、色、風味、病原体に対する耐性等を、消費される果実または野菜の内部とは無関係に操作することを可能にしうる。

好ましい態様において、ＤＮＡ構築物は、ＰＰＯをコードしているＤＮＡ配列またはそのフラグメントを導入された二成分ベクターを含むことができる。

もう一つの好ましい態様において、ＤＮＡ構築物の植物中への導入は、ＤＮＡ構築物を有するアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）による植物の感染によることができる。

本発明のもう一つの態様においで、形質転換した植物であって、正常なＰＰＯ遺伝子の発現を変更しつる合成遺伝子を含む上記植物を提供する。

植物は任意の適当な種類であってよい。好ましい態様において、植物は、グレープパイン、ジャガイモ、リンゴ、タバコ、豆、モモ、ナシおよびアンズから成る群より選択することができる。

本発明のもう一つの態様において、ＰＰｏをコードしている配列またはそのフラグメントを含む植物用ワクチンを提供する。

本発明のもう一つの態様において、ＰＰｏをコードしているＤＮＡ配列またはそのフラグメントを含むＤＮＡプローブを提供する。

プローブは、任意の適当な方式で標識することができる。放射性標識または非放射性標識を用いることができる。便宜上、プローブは、適当なプラスミドベクター中のクローン化されたインサートの形で提供することができる。

グレープバインＰＰＯ配列を用いて、この遺伝子を他の種から得るようにＰｃＲで用いるための一般的な目的オリゴヌクレオチドプライマーを設計することができる。植物ＰＰＯタンパク質は補欠分子族として銅を含むことが知られており、そしてヘモシアニンおよびチロシナーゼタンパク質からの配列に対して相同を示し、これらのタンパク質上の銅結合性部位に対応するブドウタンパク質配列の二つの領域が識別された。これらの領域は種々の生物間で明らかに保存されるので、それらは、他の植物ＰＰＯ遺伝子を得るようにプローブおよびプライマーを設計するのに適している。

したがって、本発明の更にもう一つの態様において、ＰＰＯ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含むＤＮＡ配列またはそのフラグメントを植物種から単離する方法であって、ｃＤＮＡまたはゲノムライブラリー；およびポリフェノールオキシダーゼ（Ｐ　Ｐ　Ｏ）活性を有するポリペプチドの遺伝子を含むＤＮＡ配列またはそのフラグメントを含むＤＮＡプローブを提供し：そして該プローブをゲノムライブリーとハイブリッド形成させて、該ＤＮＡ配列を有するクローンを識別することを含む上記方法を提供する。

ＤＮＡプローブは、異種間に高度に保存されるリンゴ、ジャガイモ、ブドウまたは豆のＰＰＯ遺伝子のフラグメントを含むＤＮＡ配列を含むことができる。

ＤＮＡプローブは、植物種からの全ｃＤＮＡ；およびＰＰＯ遺伝子と特異的にハイブリッド形成し且つ異種間に高度に保存されるリンゴ、ジャガイモ、ブドウまたは豆のＰＰＯ遺伝子の配列を含む２種類またはそれ以上のオリゴヌクレオチドプライマーを提供し；そしてＰＣＲを行なって、ＰＰＯ遺伝子を含むＤＮＡ配列またはそのフラグメントを増幅させることを含む方法によって製造することができる。

オリゴヌクレオチドプライマーは、ＰＰＯタンパク質上の銅結合性部位に対応するＤＮＡ配列を含むことができる。

本発明のもう一つの態様において、ＰＰＯ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含むＤＮＡ配列またはそのフラグメントを植物種から単離する方法であって、植物種から単離されたｍＲＮＡ；ポリーｄＴアダプタープライマー；および２種類またはそれ以上のオリゴヌクレオチドプライマーを提供し；ｍＲＮＡを逆転写酵素およびアダプタープライマーで処理して第−鎖ｃＤＮＡを生成し；そしてそのように生成されたｃＤＮＡを、オリゴヌクレオチドプライマ〜およびポリメラーゼ連鎖反応を用いて増幅させることを含む上記方法を提供する。

好ましい態様において、オリゴヌクレオチドプライマーは、リンゴ、ジャガイモ、ブドウまたは豆のＰＰＯ遺伝子配列に基づくことができる。

本発明のもう一つの態様において、ＰＰＯタンパク質の精製法であって、植物試料。

デタージエント；および１種類またはそれ以上のクロマトグラフィーカラムを提供し：該植物試料を該デタージエントで抽出し；そのように生成された抽出物を硫酸アンモニウムで処理し：そしてそのように生成された抽出物を、それをクロマトグラフィーカラムに通すことによって分別することを含む上記方法を提供する。

植物試料は任意の適当な種類であってよい。植物試料はグレープパイン果実であってよい。この組織は高濃度のＰＰＯを含み、成熟ブドウ果実の果汁中の大部分のＰＰＯ活性は固形物によるものであり、遠心分離によって果汁から分離した後にデタージエントによって可溶化することができる。植物試料は豆の葉であってよい。

デタージェントは陽イオン性であってよい。臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）デタージエントは適当であることが分かっている。

クロマトグラフィーカラムはセファロース基材であってよい。３種類のクロマトグラフィーカラムを用いることができる。Ｑ−セファロースに続いてフェニル− セファロース、次にヒドロキシルアパタイトが適当であることが分かっている。

本発明のもう一つの態様において、Ｎ末端アミノ酸配列ＡＰＩＱＡＰＤＩＳＫＣＧＴＡＴＶＰＤＧＶＴＰを有する実質的に純粋な状態のＰＰＯタンパク質を提供する。

ここで、本発明を実施例および図面に関して更に充分に記載する。しかしながら、以下の説明が単に例示するためのものであることは理解されるべきであり、いかなる場合にも上記の本発明の一般性を制限するものとしてとるべきではない。

図面において、図１＝推定上の葉緑体トランシット配列および成熟グレープバインＰＰＯタンパク質双方をコードする複合完全長ＧＰＯＩ　ｃＤＮＡヌクレオチド配列および誘導タンパク質配列。

翻訳開始部位をボールド体で示し、成熟タンパク質のＮ末端に星印を付ける。

破線はＮ末端プライマーの位置を示し、そして２本の実線は、トランシットペプチド配列をクローニングするための２種類のアンチセンスプライマーを構築するのに用いられた領域を示す。

図２゜ソラマメの葉のポリフェノールオキシダーゼのＢＰＯＩクローンの核酸および誘導タンパク質配列。実線は、ポリメラーゼ連鎖反応によってｃＤＮＡを増幅させるのに用いたＢ１５プライマーの領域を示す。

図３：リンゴ果実ＰＰＯをコードするクローンｐＳＲ７およびｐｓＲ８の核酸および誘導タンパク質配列。実線は、ポリメラーゼ連鎖反応によってｃＤＮＡを増幅させるのに用いたＧＥＮ４プライマーの領域を示す。

閃工：ジャガイモ塊茎ＰＰＯをコードするクローンの核酸および誘導タンパク質配列。

実線は、ポリメラーゼ連鎖反応によってｃＤＮＡを増幅させるのに用いたＧＥＮ３プライマーの領域を示す。

ＰＰＯをグレープパイン果実から精製した。最初の実験により、この組織が高濃度の酵素を含んでいることおよびドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミド（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）ゲルでの電気泳動によって確認されたように酵素が１種類だけの状態で存在しているらしいことが分かった。成熟ブドウ果実の果汁中において、大部分のＰＰＯ活性は固形物によるものであって、遠心分離によって果汁から分離した後にデタージエントで可溶化することができた。精製中の酵素活性は、基質である４〜メチルアルコールの存在下で消費された酸素として測定された。精製中の全工程を４℃で実施した。

スルタナブドウ３０キログラムを小規模のワインプレスで圧搾し、そして１００ｍＭアスコルビン酸塩に１０ｍＭジチオトレイトールを加えた溶液１００ｍ１を、ブドウ果汁各９００ｍ１に加えた。果汁を１０．０００ｘｇで１０分間遠心分離し、そして上澄みを捨てた。ペレット部分を、１０ｍＭアスコルビン酸塩および１ｍＭジチオトレイトールを加えた２５ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７，２中に最終容量１．７５リツトルまで再懸濁させた後、陽イオンデタージエントである臭化ドデシルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）の４％（Ｗ／Ｖ）溶液２５０ｍ１を加えた。２０分間インキュベートした後、抽出物を１５．０００ｘｇで１５分間遠心分離した。上澄みを固体硫酸アンモニウムで４５％まで飽和させ、ｐＨを７．０に調整した後、それを１５．０００ｘｇで１５分間遠心分離した。

この上澄みを固体硫酸アンモニウムで９５％まで飽和さ也ｐＨを７．０に調整した後、それを１５．０００ｘｇで３０分間遠心分離した。ペレットを、１０ｍＭアスコルビン酸塩および２ｍＭジチオトレイトールを加えた２０ｍＭビス−トリス−プロパン、ｐＨ７，５（バッファーＡ）中に最終容量１００ｍ１で再懸濁させた。抽出物を、バッファー八で平衡させたセファデックスＧ２５の４×４０ｃｍカラム上において流速１０ｍ１／分で脱塩し、そして活性画分を集めた。

抽出物を、バッファーＡで平衡させたＱ−セファロース・ファスト・フローの２．５ｘｌＯｃｍカラムに流速６ｍｌ／分で入れた後、カラムをバッファーＡ４００ｍ１で洗浄した。ｐｐｏをバッファーＡ中の０〜５００ｍＭ　ＮａＣ１の勾配で溶離し、そして活性画分を集めた。硫酸アンモニウムを最終濃度ＩＭまで加え、ｐＨを７．０に調整した。この画分を、１Ｍ硫酸アンモニウム、ＩＭ　ＫＣｌおよび１ｍＭジチオトレイトールを加えた５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７゜０（バッファーＢ）で平衡させたフェニルセファロース・ファスト・フローの１ ×３５ｃｍカラムに流速１．５ｍｌ／分で充填した。カラムをバッファー８１２０ｍ１で洗浄した後、ＰＰＯを１００〜０％バッファーＢの勾配で溶離した。活性画分を集め且つアミコン（Ａｍｉ　ｃｏｎ）ＰＭＩＯ限外濾過膜上で濃縮した後、１ｍＭジチオトレイトールを加えた２０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７，０（バッファーＣ）を３回取り換えるのに対して同−膜でダイアフィルトレージョンを行なった。この画分を、バッファーＣで平衡させたヒドロキシルアパタイトの１×１０ｃｍカラムに流速１ｍｌ／分で入れた。カラムをバッファーＣ５０ｍ１で洗浄した後、ＰＰＯをバッファーＣ中０〜５００ｍＭリン酸カリウムの勾配で溶離した。集めた活性画分をグリセロール中で２０％（Ｖ／Ｖ）にし且つ一８０ ℃で冷凍した。

この操作の結果、１８０倍に精製したＰＰＯが得られ且つ精製ＰＰＯタンパク質３．５ｍｇを生成した。精製を以下に要約する。

ＣＴＡＢ抽出物　９６０　２，０７０　２．２　２９　６硫酸アンモニウム　６００　１，７６０　２．９　２５　８Ｑ−セファロース　１３０　１．５２ｍ１１．８　２２　３３フエニルセフアロース　１０．８　４００　３７　６　１０３精製純度は、５ＤＳ−ＰＡＧＥを変性することによって検査した。見掛けの分子量が４０ｋＤａのタンパク質の単純拡散バンドは最終標品中において示された。

精製ＰＰＯタンパク質約１ｍｇを、２０ｍＭ重炭酸アンモニウム、ｐＨ７，６で平衡させたセファデックスＧ２５の２．５×２０ｃｍカラムにおいて流速５ｍｌ／分で脱塩した。タンパク質ピークを集め且つ窒素下で乾燥させた。乾燥タンパク質をカルボキシメチル化し、そしてＮ末端アミノ酸配列を、自動アミノ酸シークエネーターを用いてエドマン分解によって決定した。下記の配列ＡＰＩＱＡＰＤＩ　５ＫＣＧＴＡＴＶＰＤＧＶＴＰリサイアン（Ｒｅｚａｉａｎ）およびクラーク（Ｋｒａｋｅ）（１）の方法にしたがって、全ＲＮＡをスルタナブドウ果実から単離した。全ＲＮＡを１種類のオリゴ−ｄＴスパンカラム（ファーマシア・エルケイビー・）くイオテクノロジー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＬＫＢ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇ３／））Ｅ通すこと１こよってポリ（Ａ）　に富むＲＮＡ画分を得た。

第−鎖ｃＤＮＡを、５０ｍＭ）リス−ＨＣｌ　ｐＨ８，３，２５ｍＭ　ＫＣＩ。

４μｇ、ＡＭＶ逆転写酵素（プロメガ・コープ（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｃｏｒｐ））２１ＵおよびハイブリッドｄＴ１７−アダプタープライマー（５’　−ＧＡＣＴＣＧＡＧＴＣＧＡＣＡＴＣＧＡＴＴｆｆｒＴｒｍＴＴｒ’ｍＴ）０．５μｇを含む反応混合物中において４２℃で１時間合成した。次に、反応混合物をＴＥ（１０ｍＭトリス−ＭＣＩ　ｐＨ８，０，１ｍＭ　ＥＤＴＡ）で８０μｌまで希釈し且つ一２０℃で貯蔵した。

３２マーオリゴヌクレオチドプライマー（５’　−ＣＣＩＡＴＩＣＡＧＧＣＩＣＣＩＧＡＴＡＴＩＩＣＩＡＡＧＴＧＴＧＧ）を、精製ブドウＰＰＯのＮ末端タンパク質配列（アミノ酸２〜１２）に対して設計した。コドン使用表に基づいて３個以上の塩基を選択することができる位置でイノシンを用いた。これおよび他の記載したオリゴヌクレオチドプライマー全部をアプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）ＤＮＡ合成機で合成した。

ｃＤＮＡを、フローマン（Ｆｒｏｈｍａｎ）（２）の方法に本質的にしたがって、１０ｍＭ）リス−ＨＣｌ　（２５℃でｐＨ９，０）　、５０ｍＭ　ＫＣｌ１１゜０．１％トリトンｘ−ｉｏｏ、希釈した第−鎖ｃＤＮＡ反応混合物５μｍ、Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ（プロメガ・コープ）１，２５Ｕ、１１００ｎアダプタおよび１μＭＮ末端プライマー（上記に記載の）を含む反応混合物５０μｌ中においてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅させた。増幅は、９４℃ で１分間の変性、５５℃で１分間のアニーリング、７２℃まで２分間にわたるスローランプおよび７２℃で３分間の伸長を５サイクルの初期プログラムに続いて、９４℃１分間、５５℃１分間および７２℃３分間を２５サイクル実施した。増幅されたＤＮＡをフェノール／クロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿させ、そしてＴＥ中に再懸濁させた。ＤＮＡをフレノウフラグメントでプラント末端付きにし、そして２％ヌシーブ（Ｎｕｓ　ｉ　ｅｖｅ）ＧＴＧアガロース（ＦＭＣバイオロダクツ（Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ））ゲル上で分別した。１７ｏｏｂｐフラグメントをゲルから単離し且つブルースクリプトＳＫ＋ベクター（ストラタジーン・クローニングＳシステムズ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ　ＣｌｏｎｉｎｇＳｙｓｔｅｍｓ））のＨｉｎｃ１１部位に連結させた。連結したＤＮＡを大腸菌ＤＨ５中に導入した。陽性クローン（ＧＰＯと称する）を単離し且つジデオキシ配列決定法（３）によって配列決定した。

これは、Ｎ末端プライマーの存在を確証し、そして該プライマーの下流の誘導タンパク質配列と、上記の精製ブドウＰＰＯ酵素に関して得られたＮ末端タンパク質配列との比較により、このクローンがブドウＰＰＯをコードすることが確証上記の１７００ｂｐクローンでプローブされたブドウｍＲＮＡのノーザンプロットにより、該クローンとハイブリッド形成した２２００ｂｐの転写物が識別された。これは、そのクローンが成熟ＰＰＯ配列のＮ末端をコードしていたとしても、クローンの５プライム末端の上流に更に別の配列が存在したことを示唆した。

ＧＰＯｌ　ｍＲＮＡの５′末端を有するｃＤＮＡクローン（推定上のトランシットペプチドをコードする）を、本質的には（２）に記載の通りであるが嵌め込まれたアンチセンスプライマーを用いてブドウ果実ＲＮＡから増幅させた。第、− 鎖ｃＤＮＡを、上記に記載の通りであるがハイブリッドｄＴ１７−アダプタープライマーの代わりに、Ｎ末端プライマー領域の下流の４４塩基領域（すなわち、４１６〜４３５ｎｔ；図１）に相補的なＧＰＯＩ特異的プライマー１（５′−ＡＡＴＣＴＴＴＧＴＧＧＴＧＡＣＴＧＧＣＧ）＋を置き換えて、ブドウ果実のポリ（Ａ）　に富むＲＮＡから合成した。反応混合物を０．１ｘＴＥで２ｍｌまで希釈し且つセントリコン（Ｃｅｎｔ　ｒ　ｉ　ｃｏｎ）３０スピンフイルター（アミコン・コープ）によって４０００ｇで２０分間遠心分離して過剰のプライマーを除去した。この工程を繰返し、そして残留する液体を、スピードＶａｃ遠心分離を用いて２０μｌまで濃縮した。ポリ（ｄＡ）尾部配列は、３７℃で５分間に続いて６５℃で５分間インキュベートした後にＴＥで５００μｌまで希釈されたｃＤＮＡｌｌ、５μｌ、５ｘテーリングバツフアー（プロメガ・コープ）４μｌ、ＡＴＰ　（１ｍＭ）４μｌおよびターミナルベトランスフェラーゼ（プロメガ・コープ）１０Ｕを含む反応混合物２０μｍ中のターミナルベトランスフェラーゼによってｃＤＮＡ鎖の３′末端に結合された。ポリ（ｄＡ）末端付きｃＤＮＡのＰＣＲ増幅は、１０ｍＭトリス−ＨＣＩ（２５℃でｐＨ９，ＯＬ　５０ｍＭ　ＫＣＩ、１　、５　ｍＭ　Ｍ　ｇ　ＣＪ　２．０．２ｍＭ　ｄＮＴＰｓ、０．０１％ゼラチン（Ｗ／Ｖ）　、０．１％トリトンＸ−１００、希釈した第−鎖ｃＤＮＡ反応混合物５μＩ、Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ（プロメガ・コープ）１．２５Ｕ、２００ｎＭハイブリッドｄＴ１７−アダプタープライマーおよび、Ｎ末端プライマー結合性領域のすぐ下流の領域（３７４〜３９３ｎｔ　；図１）に相補的な９００ｎＭ　ＧＰＯＩ特異的プライマー２（５’　−ＡＣＣＡＴＣＡＧＧＣＡＣＧＧＴＧＧＣＧＧ）を含む反応混合物中において実施した。増幅は、９４℃１分間、５５℃１分間おｊび７２℃３分間を２５サイクル実施した。得られた４３ｏｂｐフラグメントをブルースクリプトＳＫ＋ベクターでクローン化し、前記のように配列決定し、そしてＧＰＯＩクローンと重複する配列の予想領域を含むことが分かり、このｃＤＮＡクローンがＧＰＯｌｍＲＮＡの５′末端を含むことが確証された。

リザイアンおよびクラーク（１）の方法にしたがって、全ＲＮＡをソラマメの葉から単離した。全ＲＮＡを１種類のオリゴ−ｄＴスパンカラム（ファーマシア・ＬＫＢ・バイオテクノロジー）に通すことによってポリ（Ａ）＋に富むＲＮＡ画分を得た。

第−鎖ｃＤＮＡを、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ　ｐＨｓ、３．２５ｍＭ　ＫＣＬ１ μｇ、ＡＭＶ逆転写酵素（プロメガ・コープ）２１ＵおよびハイブリッドｄＴ１７−アダプタープライマー（５’　−（１；ＡＣＴＣＧＡＧＴＣＧＡＣＡＴＣＧＡＴＴｆｆｆｆｒＴＴＴＴＴｒＴｍ）０．８１μｇを含む反応混合物中において４２℃で１時間合成した。

次に、反応混合物をＴＥ　（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ　ｐＨ８，０，１ｍＭ　ＥＤＴＡ、）で８４０μｌまで希釈し且つ一２０℃で貯蔵した。

２５マーオリゴヌクレオチドプライマー（Ｂ１５）（５’　−ＧＣＧＧＡＴＣＣＴＴ　［ＣＴ］　Ｔ＾［ＣＴ］　ＧＡ　［ＣＴ］　ＧＡ　［ＧＡ］　ＡＡ　［ＣＴ］＾＾）を、ブドウＰＰＯの配列に基づいて設計した。

ｃＤＮＡを、本質的にはフローマン（２）の方法にしたがって、１０ｍＭ）リス −ＨＣＩ（２５℃でｐＨ９，０）　、５０ｍＭ　ＫＣＩ、１．５ｍＭＭｇＣ１２，０，２ｍＭ　ｄＮＴＰｓ、０．０１％ゼラチン（ｗ／ｖ）、０．１％トリトンＸ−１００、希釈した第−鎖ｃＤＮＡ反応混合物２０１１１、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（プロメガ・コープ）２．５Ｕ、１１００ｎアダプターブライマー（５’　−ＧＡＣＴＣＧＡＧＴＣＧＡＣＡＴＣＧ）および１μＭ　Ｂ１５プライマー（上記に記載の）を含む反応混合物１００μｌ中においてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅させた。

増幅は、９４℃で１分間の変性、３７℃で２分間のアニーリング、７２℃まで２分間にわたるスローランプおよび７２℃で３分間の伸長を３サイクルの初期プログラムに続いて、９４℃１分間、５５℃１分間および７２℃３分間を２５サイクル実施した。増幅されたＤＮＡをフェノール／クロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿させ、そしてＴＥ中に再懸濁させた。ＤＮＡをフレノウフラグメントでプラント末端付きにし、そして２％ヌシーブＧＴＧアガロース（ＦＭＣバイオロダクツ）ゲル上で分別した。７００ｂｐフラグメントをゲルから単離し且つブ十、ルースクリプトＳＫ　ヘクター（ストラタジーン・クローニング・システムズ）のＥｃｏＲＶ部位に連結させた。連結したＤＮＡを大腸菌ＤＨ５中に導入した。

組換体クローンを、ブドウＰＰＯクローン（ＧＰＯＩ）の放射性標識フラグメントを用いてスクリーンし、そして陽性クローン（ＢＰＯＩと称する）を単離し且つジデオキシ配列決定法（３）によって配列決定した。

実施例６リザイアンおよびクラーク（１）の方法にしたがって、全ＲＮＡを成熟リンゴ果実から単離した。ポリ（Ａ）＋に富むＲＮＡ画分は、ポリＡＴ）ラクトｍＲＮＡキット（プロメガ−コーポレーション）を用いて得られた。

第−鎖ｃＤＮＡを、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ　ｐＨ８，３，２５ｍＭ　ＫＣＩ。

ｇ、、ＡＭＶ逆転写酵素（プロメガ・コープ）２４ＵおよびハイブリッドｄＴ１７０．５４μｇを含む反応混合物２５μｍ中において４２℃で１時間合成した。

次に、反応混合物をＴＥ　（１０ｍＭ）リス−ＨＣｌ　ｐＨ８，０，１ｍＭ　ＥＤＴＡ）で５２５μｍまで希釈し且つ一２０℃で貯蔵した。

２８マーオリゴヌクレオチドプライマー（ＧＥＮ４）（５’　−ＧＣＧＡＡＴＴＣＧＡ［＾Ｇ］ＧＡ［ＴＣ］ＡＴＧＧＧＩＡＡ［ＴＣ］Ｔｒ［ＴＣ］Ｔ＾）を、ブドウＰＰＯの配列に基づいて設計した。

ｃＤＮＡを、本質的にはフローマン（２）の方法にしたがって、１０ｍＭトリス −ＨＣｌ　（２５℃でｐＨ９，０）、５０ｍＭ　ＫＣＬ　１．５ｍＭＭｇＣＩ２．０．２ｍＭ　ｄＮＴＰｓ、０．０１％ゼラチン（Ｗ／Ｖ）　、０．　１％トリトンＸ−１００、希釈した第−鎖ｃＤＮＡ反応混合物２０μｌ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（プロメガ・コープ）２．５Ｕ、１１００ｎアダプタープライマー（５’　−ＧＡＣＴＣＧＡＧＴＣＧＡＣＡＴＣＧ）および１μＭ　ＧＥＮ４プライマー（上記に記載の）を含む反応混合物１００μＩ中においてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅させた。

増幅は、９４℃で１分間の変性、３７℃で２分間のアニーリング、７２℃まで２分間にわたるスローランプおよび７２℃で３分間の伸長を３サイクルの初期プログラムに続いて、９４℃１分間、５５℃１分間および７２℃３分間を２５サイクル実施した。増幅されたＤＮＡをフェノール／クロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿さ也そしてＴＥ中に再懸濁させた。ＤＮＡをフレノウフラグメントでプラント末端付きにし、そして２％ヌシーブＧＴＧアガロース（ＦＭＣ／＜イオロダクツ）ゲル上で分別した。１０５０ｂｐのフラグメントをゲルから単離し且つブルースクリプトＳＫ　ベクター（ストラタジーン・クローニング・システムズ）のＥｃｏＲＶ部位に連結させた。連結したＤＮＡを大腸菌ＤＨ５中に導入した。組換体クローンを、ブドウＰＰＯクローン（ＧＰＯＩ）の放射性標識フラグメントを用いてスクリーンし、そして２種類の陽性クローン（ｐＳＲ７およびｐＳＲ８と称する）を単離し且つジデオキシ配列決定法（３）によって配列決定した。

コープマン（Ｌｏｇｅｍａｎｎ）ら（４）の方法にしたがって、全ＲＮＡを未熟ジャガイモ塊茎から単離した。ポリ（Ａ）　に富むＲＮＡ画分は、ポリＡＴトラクトｍＲＮＡキット（プロメガ・コーポレーション）を用いて得られた。　。

１．８μｇ、ＡＭＶ逆転写酵素（プロメガ・コープ）２４Ｕおよびｌ＼イブリ・ソドｄＴ１７−アダプタープライマー（５’　−ＧＡＣＴＣＧＡＧＴＣＧＡＣＡＴＣＧＡＴＴｒＴＴｒＴＴｒＴｒＴｒＴＴＩＴ）０．５４μｇを含む反応混合物２５μｌ中において４２℃で１時間合成した。次に、反応混合物をＴＥ　（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ　ｐＨ８，０，１ｍＭ　ＥＤＴＡ）で５２５μＩまで希釈し且つ一２０℃で貯蔵した。

２種類のオリゴヌクレオチドプライマーを、ブドウおよびリンゴのＰＰＯの配列中の領域から設計した。

ＧＥＮ３　：　（５’　−ＧＣＧＡＡＴｒＣＴＴ　［Ｔｅ３　［Ｔｅ３　ＴＩＣＣＩＴＴ　［Ｔｅ３　ＣＡ　［Ｔｅ３　［ＡＣ］　Ｇ）ＧＥＮ７　：　（５’　 −ＧＣＧＡＡＴｒＣＡＡ　［Ｔｅ３　ＧＴＩＧＡ　［Ｔｅ３　［ＡＣ］　ＧＩＡＴＧＴＧＧ）ｃＤＮＡを、本質的には７０−マン（２）の方法にしたがって、ｌＱｍＭトリス−１００、希釈した第−鎖ｃＤＮＡ反応混合物２０μＬ　Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ（プロメガ・コープ）２．５Ｕ、１１００ｎアダプタープライマー（５’　−ＧＡＣＴＣＧＡＧＴＣＧＡＣＡＴＣＧ）および１μＭ　ＧＥＮプライマー（上記に記載の）を含む反応混合物１００μｌ中においてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅させた。

増幅は、９４℃で１分間の変性、３７℃で２分間のアニーリング、７２℃まで２分間にわたるスローランプおよび７２℃で３分間の伸長を３サイクルの初期プログラムに続いて、９４℃１分間、５５℃１分間および７２℃３分間を２５サイクル実施した。増幅されたＤＮＡをフェノール／クロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿させ、そしてＴＥ中に再懸濁させた。ＤＮＡをフレノウフラグメントでプラント末端付きにし、そして２％ヌシーブＧＴＧアガロース（ＦＭＣバイオロダクツ）ゲル上で分別した。１５００ｂｐおよび１０００ｂｐのフラグメント＋をゲルから単離し且つブルースクリプトＳＫ　ベクター（ストラタジーン・クローニング・システムズ）のＥｃｏＲＶ部位に連結させた。連結したＤＮＡを大腸菌Ｄ）（５中に導入した。組換体クローンを選択し、そして３種類のクローン（ｐＳＲＰ３２、ｐＳＲＰ３３およびｐＳＲＰ７２と称する）を単離し且つジデオキシ配列決定法（３）によって配列決定した。

ジャガイモ塊茎ＰＰＯｍＲＮＡの５′末端を有するｃＤＮＡクローンを、本質的には（２）に記載の通りであるが嵌め込まれたアンチセンスプライマーを用いてジャガイモ塊茎ＲＮＡから増幅させた。第−鎖ｃＤＮＡを、上記に記載の通りであるがハイブリッドｄＴ１７−アダプタープライマーの代わりに、ｐ　５ＲＰ３２およびｐＳＲＰ３３の５′末端の下流の２５７〜２７８塩基領域に相補的なジャガイモ塊茎ＰＰＯ特異的プライマー１（５’　−ＧＡＣＧＧＴＡＣＡＴＴＡＧＴＧＴＴＡＡＡＴ）＋を置き換えて、ジャガイモ塊茎のポリ（Ａ）　に富むＲＮＡから合成した。反応混合物をＱ、１ｘＴＥで２ｍｌまで希釈し且つセントリコン３０スピンフイルター（アミコン・コープ）によって４０００ｇで２０分間遠心分離して過剰のプライマーを除去した。この工程を繰返し、そして残留する液体を、スピードＶａｃ遠心分離を用いて１２μＩまで濃縮した。ポリ（ｄＡ）尾部配列は、３７℃で５分間に続いて６５℃で５分間インキュベートした後にＴＥで５００μｌまで希釈されたｃＤＮＡｌｌ、５μｍ％５Ｘテーリングバツフアー（プロメガ・コープ）４μＬ　ＡＴＰ　（１ｍＭ）４μｌおよびターミナルｄトランスフェラーゼ（プロメガ・コープ）１０Ｕを含む反応混合物２０μｌ中においてターミナルｄトランスフェラーゼによってｃＤＮＡ鎖の３′末端に結合された。ポリ（ｄＡ）末端付きｃＤＮＡのＰＣＲ増幅は、１０ｍＭ）リス−ＨＣｌ　（２５℃でｐＨ９，０）、５０ｍＭ　ＫＣＩ、　１゜５　ｍＭ　Ｍ　ｇ　ＣＩ　２．０．２ｍＭ　ｄＮＴＰｓ、　０．０１％ゼラチン（ｗ／ｖ）　、０．　１％トリトンＸ−１００、希釈した第−鎖ｃＤＮＡ反応混合物５μｍ、Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ（プロメガ・コーｆ）１．　２５ｔＪ、２００ｎＭハイブリッドｄＴ１７−アダプタープライマーおよび、ｐＳＲＰ３２およびｐ　ＳＲＰ　３３の５′末端の下流の２３３〜２５４塩基領域に相補的な９００ｎＭ　ジャガイモ塊茎ＰＰＯ特異的プライマー２（５’　−ＴＧＣＴＣＡＴＣＡＡＣＴＧＧＡＧＴｒＧＡＧ）を含む反応混合物中において実施した。増幅は、９４℃１分間、５５℃１分間および７２℃ ３分間を２５サイクル実施した。得られたフラグメントをカレースクリプトＳＫ＋ベクターでクローン化し、前記のように配列決定し、そしてｐＳＲＰ３２クローンと重複する配列の予想領域を含むことが分かり、このｃＤＮＡクローンがジャガイモ塊茎ｍＲＮＡの５′末端を含むことが確証された。

参考文献１、リザイアン（Ｒｅ　ｚ　ａ　ｉ　ａｎ）　、　Ｍ、　Ａ、およびクラーク（Ｋｒａｋｅ）、Ｌ、Ｒ，（１９８７）。グレープパインの核酸抽出およびつるの検出（Ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｖｉｎｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ｇｒａｐｅｖｉｎｅ）。Ｊ、Ｖｉｒ。

Ｍｅｔｈｏｄｓ　１７：２７７−２１３５゜２、　７０−ｖン（Ｆｒｏｈｍａｎｎ）、Ｍ、Ａ、（１９９０）　、ＰＣＲ旦工旦土旦エ巴」」二Ａ（込山」しＬ− りとコ生虹ｔｈと１五−１１生−（Ｇｅ　Ｉ　ｆ　ａｎｄ）　、Ｄ、　Ｈ，、スニンスキー（Ｓｎｉｎｓｋｙ）、Ｊ、Ｊｏ、ホワイト（Ｗｈ　ｉ　ｔ　ｅ）　、　Ｔ、Ｊ、監修）、アカデミツク・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ）、　ニューヨーク、２８〜３８頁。

３、　サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）、Ｆ、　、＝ックレン（Ｎｉｃｋｌｅｎ）、ｓ。

およびクールソン（Ｃｏｕｌｓｏｎ）、Ａ、Ｒ，（１９７７）。鎖終結阻害剤によるＤＮＡ配列決定（ＤＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｗｉｔｈ　ｃｈａｉｎ− ｔｅｒｍｊｎａｔｉｎｇ　１ｎｈｉｂｉｔｏｒｓ）。Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｅｔ、ＵＳＡ　７４：５４６３〜５４６７゜４、コープマン（Ｌｏｇｅｍａｎｎ）、Ｊ、　、シェル（Ｓｃｈｅ　１１）、Ｊ。

およびウィルミッツｙ−（Ｗｉ　ｌ　１ｍｉ　ｔｚｅｒ）、Ｌ、（１９８７）ｏ植物組織からＲＮＡを単離する改良法（Ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒｔｈｅ　１ｓｏｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＲＮＡ　ｆｒｏｍ　ｐｌａｎｔｔｉｓｓｕｅｓ）。Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１６３：１６〜２０゜最後に、本明細書中に概説した本発明の精神から逸脱することなく様々な他の修正および／または変更を行なうことができることは理解されるべきである。

Ｆ工ＧＵＲＥ　１ＱＫＡＬＰＤＤＤＰＲ５ＦＫＱＱＡＮＶＨＣＴＹＣＱＧＡＹＤＱＶＧＹＴＤＬＥＬＱＶＨＡＳＷＬＦＬＰＦＨＲＹＹＬＹＦＮＥＲＩＬＡＫＬＩＤＤＰＴＦＡＬＰＹＷＡＷＤＮＰＤＧＭＹＭＰＴＩＹＡＳＳＰＳＳＬＹＤＥＫＲＩＰＤＤＥＬＫＴＤＮＬＡ　工　ＭＹＫＱＩＶＳＧ　工　ＥＬＤＲＥＮＦＶＫＦＤＶＹＩＮＤＥＤＹＳＶＳＲＰＫＮＳＥＦＡＧＳＦＶＮＶＰＨＫＨＭＫＥＭＫＴＫＴＮＬＲＦｋＸＮＥＬＬＥＤＬＧＡＥＤＤＥＳＶＩＶＴ　工　ＶＰＲＡＧＧＤＤＶＴ　工　ＧＧＸＥＸＥＦＶＳＤ−人入入入ＡＡＡＡＡＡ！工ＧＵＲＥ　２ＩＴＣＬＲＬＧ　工　ＴＤＬＬＥＤＬＤＶＥＧＤＤＮＩＶＶＴＬＶＰＫＣＧＮＧＱＶＫ　工　ＮＮＶＥ　工　ＶＦＥＤ− 居社’Ｊ−ｒｘａ田ル。

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正常な植物の成長および発育におけるＰＰＯの役割は、現在のところ理解されていない。この酵素の増大した濃度が植物病原体に対する増大した耐性と相関している場合か多数存在している。当然の結果として、ＰＰＯ活性の水準を増大させる植物の遺伝子操作は、病原体および有害生物に対する有用な耐性を与えることができる。

グレープパイン（ｇｒａｐｅｖｉｎｅ）のＰＰＯ遺伝子は、成熟タン、＜り質のＮ末端の上流の追加の１０３アミノ酸をコードする。この領域は、葉緑体トランシットペプチドの性質を有し、しかもタンパク質が葉緑体中に引き入れられ且つ成熟ＰＰＯタンパク質を生産するように処理されるように的をしぼるためのものであると考えられる。この遺伝子による植物の形質転換は、したがって、他種においてグレープバインＰＰＯの正しい標的および成熟を生じ且つこれらの組織の色素体中で活性グレープバインＰＰＯ酵素の蓄積を引起こすことができる。

本明細書中で用いられるｒｐｐｏをコードしている遺伝子」、ｒｐｐｏをコートする遺伝子」またはｒｐｐｏ遺伝子コは、ＰＰＯ遺伝子またはそれと実質的（こ相同の配列を意味すると理解されるへきである。

本発明の第一の態様において、植物ポリフェノールオキシダーゼ（ＰＰＯ）活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含むＤＮＡ配列またはそのフラグメントを提供する。

ＤＮＤ配列は、トランシットペプチドをコードする植物ＰＰＯ遺伝子のプレ配列を含んでいてよい。

ＤＮＤ配列は修飾されていてよい。ＤＮＡ配列は、植物ＰＰＯ遺伝子に対するアンチセンスｍＲＮＡをコードする配列またはそのフラグメントを含んて０てよい。

ＤＮＡ配列は、触媒開裂部位を更に含んでいてよい。

或いは、プレ配列は、植物ＰＰＯ活性を有するポリペプチドを他の細胞区分に向けるように他の標的配列によって置き換えることができる。

本発明のもう一つの態様において、植物ＰＰＯ遺伝子に対するアンチセンスｍＲＮＡをコードする配列を含むＤＮＡ配列またはそのフラグメントを提供する。

本発明のもう一つの態様において、植物ＰＰＯ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列またはそのフラグメントを含む組換えＤＮＡプラスミドを製造する方法であって、ＰＰＯ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含むＤＮＡ配列またはそのフラグメント：およびプラスミド発現ベクターを提供し；そして該ＤＮＡ配列および該プラスミド発現ベクターを反応させて、該ＤＮＡ配列を該プラスミド発現ベクター中に配置することを含む上記方法を提供する。

ＰＰＯをコードするＤＮＡ配列を提供するために、本発明の好ましい態様において、組換えＤＮＡプラスミドの製造方法は、植物ＰＰＯ活性を有するポリペプチド源を提供し。

植物ＰＰＯ活性を有するポリペプチドをコードするポリアデニル化ＲＮＡをそこから単離し；そしてコピーＤＮＡ　（ｃＤＮＡ）を構築するように該ポリアデニル化ＲＮＡを処理する予備工程を含むことができる。

（差し替え用紙筒５．６．６ａ頁の翻訳文；原翻訳文第４頁２２行〜第７頁１行と差し替える）或いは、本発明のこの態様にしたがってｃＤＮＡを構築するようにポリアデニル化ＲＮＡを処理する工程は、該ポリアデニル化ＲＮＡを逆転写酵素およびＰＰＯ特異的プライマーで処理して第−鎖ｃＤＮＡを生成し；そのように生成されたｃＤＮＡをターミナルｄトランスフェラーゼで処理して、ポリアデノシン尾部配列を該ｃＤＮＡの３′末端に結合し；そしてそのように生成されたポリアデニル化ｃＤＮＡ′４：ＰＣＲによって増幅させることを含むことができる。

ポリアデニル化ＲＮＡを逆転写酵素で処理する工程は、ブドウＰＰｏに関して配列５’　−ＡＡＴＣｍＧＴＧＧＴＧＡＣＴＧＧＣＧを有するＰＰＯ特異的オリゴヌクレオチドブライマーを用いることができるしまたは該ＰＰＯ特異的プライマーはジャガイモ塊茎ＰＰｏに関して配列５’　ＧＡＣＧＧＴＡＣＡＴｒＡＧＴＣＴＴＡＡＡＴを有するオリゴヌクレオチドプライマーである。

ｃＤＮＡを増幅させる工程は、配列５’　−ＧＡＣＴＣＧＡＧＴＣＧＡＣＡＴＣＧＡＴｒＴｒＴｎを有するオリゴヌクレオチドアダプタープライマーおよびブドウＰＰｏに関して配列５′−＾ＣＣＡＴＣＡＧＧＣＡＣＧＧＴＧＧＣＧＧまたはジャガイモ塊茎ＰＰＯに関して配列５’　−ＴＧＣＴＣＡＴＣＡＡＣＴＧＧＡＧＴＴＧＡＧを有するＰＰＯ特異的オリゴヌクレオチドプライマーを用いることができる。

二本鎖ｃＤＮＡのクローニングのためのプラスミド発現ベクターは任意の適当な種類であってよい。プラスミドベクターブルースクリプト（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）ＳＫ　は適当であることが分かっている。

クローニング工程は任意の適当な形式をとってよい。好ましい形式はｃＤＮＡを、例えば、フレノウフラグメントでプラント末端付きにし：そのように生成されたｃＤＮＡを、例えば、アガロースゲル上で分別し；予想の寸法のフラグメントを、例えば、ゲルから単離し：そして該フラグメントを適当な制限酵素部位、例えば、ブルースクリプトＳＫ＋ベクターのＨｉｎｄｌｒｌまたはＥｃｏＲ１部位に連結することを含むことができる。

このように生成されたクローンを試験するために、適当な微生物をプラスミド発現ベクターによって形質転換することができ、該微生物を培養し、そしてそこにおいてコードされたポリペプチドを発現させることができる。微生物大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＤＨ５は適当であることが分かっている。

本発明のもう一つの態様において、植物ＰＰＯ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列またはそのフラグメントを含む組換えＤＮＡプラスミドであって、単細胞生物において複製され、転写され、そして翻訳されることができる上記プラスミドを提供する。

本発明のもう一つの態様において、植物組織中のＰＰＯ活性の水準を低下させる方法であって、植物ＰＰＯ活性を有するポリペプチドをコードする修飾遺伝子またはそのフラグメントを含むＤＮＡ構築物；および植物試料を提供し；そして該ＤＮＡ構築物を該植物試料中に導入して形質転換した植物を製造することを含む上記方法を提供する。

ＤＮＡ構築物は、植物ＰＰＯ遺伝子に対するアンチセンスｍＲＮＡをコードしている配列またはそのフラグメントを含むことかできる。ＤＮＡ構築物は、植物ＰＰＯ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子またはそのフラグメントを含み、触媒開裂部位を組込んでいることができる。

植物は任意の適当な種類であってよい。好ましい態様において、植物は、グレープバイン、ジャガイモ、リンゴおよび豆を含む群より選択することができる。

本発明のもう一つの態様において、植物組織中のＰＰｏ活性の水準を増大させる方法であって、植物ＰＰＯ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子またはそのフラグメントを含むＤＮＡ構築物；および植物試料を提供し；そして該ＤＮＡ構築物を該植物試料中に導入して形質転換した植物を製造することを含む上記方法を提供する。

ＤＮＡ構築物は、植物ＰＰＯ遺伝子のプレ配列をコードしているＤＮＡ配列またはそのフラグメントを含むことができる。

（差し替え用紙第８．９．１０．１０ａ頁の翻訳文：原翻訳文第７頁２８行〜第１０頁２０行と差し替える）本発明のもう一つの態様において、形質転換した植物であって、正常なＰＰＯ遺伝子の発現を変更しつる合成遺伝子を含む上記植物を提供する。

本発明のもう一つの態様において、植物ＰＰＯ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列またはそのフラグメントを含むＤＮＡプローブを提供する。

グレープバインＰＰＯ配列を用いて、この遺伝子を他の種から得るようにＰＣＲて用いるための一般的な目的オリゴヌクレオチドプライマーを設計することができる。植物ＰＰＯタンパク質は補欠分子族として銅を含むことが知られており、そしてヘモシアニンおよびチロシナーゼタンパク質からの配列に対して同族を示す、これらのタンパク質上の銅結合性部位に対応するブドウタンパク質配列の二つの領域が識別された。これらの領域は種々の生物間で明らかに保存されるので、それらは、他の植物ＰＰＯ遺ｆ丑子を得るようにプローブおよびプライマーを設計するのに適している。

したがって、本発明の更にもう一つの態様において、ＰＰＯ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含むＤＮＡ配列またはそのフラグメントを植物種から単離する方法であって、ｃＤＮＡまたはゲノムライブラリー；および植物ＰＰＯ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列またはそのフラグメントを含むＤＮＡプローブを提供し；そして該プローブをゲノムライブリーとハイブリッド形成させて、該ＤＮＡ配列を有するクローンを識別することを含む上記方法を提供する。

ＤＮＡプローブは、植物種からの全ｃＤＮＡ；および植物ＰＰＯ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子と特異的にハイブリッド形成し且つ異種間に高度に保存されるリンゴ、ジャガイモ、ブドウまたは豆のＰＰＯ遺伝子の配列を含む２種類またはそれ以上のオリゴヌクレオチドプライマーを提供し；そしてＰ　ＣＲ，を行なって、植物ＰＰＯ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含むＤＮＡ配列またはそのフラグメントを増幅させることを含む方法によって製造することができる。

オリゴヌクレオチドプライマーは、植物ＰＰＯ活性を有するポリペプチド上の銅結合性部位に対応するＤＮＡ配列を含むことができる。

本発明のもう一つの態様において、ＰＰＯ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含むＤＮＡ配列またはそのフラグメントを植物種から単離する方法であって、植物種から単離されたｍＲＮＡ；ポリーｄＴアダプターブライマー；および２種類またはそれ以上のオリゴヌクレオチドプライマーを提供し；ｍＲＮＡを逆転写酵素およびアダプタープライマーで処理して第−鎖ｃＤＮＡを生成し；そしてそのように生成されたｃＤＮＡを、オリゴヌクレオチドプライマーおよびポリメラーゼ連鎖反応を用いて増幅させることを含む上記方法を提供する。

本発明のもう一つの態様において、ＰＰＯ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含むＤＮＡ配列またはそのフラグメントを植物種から単離する方法であって、発現ライブラリー：およびＰＰＯ活性を有する精製ポリペプチドに対して生じた多クローン性抗体を提供し；そして該多クローン性抗体と該発現ライブラリーとを反応させて、ＰＰＯ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含むＤＮＡ配列またはそのフラグメントを有するクローンを識別することを含む上記方法を提供する。

本発明のもう一つの態様において、ＰＰＯタンパク質の精製法であって、植物試料；デタージエント；および１種類またはそれ以上のクロマトグラフィーカラムを提供し；該植物試料を該デタージエントで抽出し：そのように生成された抽出物を硫酸アンモニウムで処理し；そしてそのように生成された抽出物を、それをクロマトグラフィーカラムに通すことによって分別することを含む上記方法を提供する。

植物試料は任意の適当な種類であってよい。植物試料はグレープノくイン果実であってよい。この組織は高濃度のＰＰＯを含み、成熟ブドウ果実の果汁中の大部分のＰＰＯ活性は固形物によるものであり、遠心分離によって果汁から分離した後にデタージエントによって可溶化することができる。植物試料は豆の葉であってよい。

デタージエントは陽イオン性であってよい。臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）デタージエントは適当であることが分かつている。

クロマトグラフィーカラムはセファロース基材であってよ（嶌。３種類のクロマトグラフィーカラムを用いることができる。Ｑ−セファロースに続０てフェニル −セファ０−ス、次にヒドロキシルアパタイトが適当であることが分かつてＩＩ蒐る。

本発明のもう一つの態様において、Ｎ末端アミノ酸配列ＡＰＩＱＡＰＤＩＳＫＣＧＴＡＴＶＰＤＧＶＴＰを有する実質的に純粋な状態の植物ＰＰＯ活性を有するポリペプチドを提供する。

ここで、本発明を実施例および図面に関して更に充分に記載する。しめ為しな力くら、以下の説明が単に例示するためのものであることは理解されるべきであり、いかなる場合にも上記の本発明の一般性を制限するものとしてとるべきではない。

図面において、茎１：推定上の葉緑体トランシット配列および成熟グレープパインＰＰＯタンパク質双方をコードする複合完全長ＧＰＯＩ　ｃＤＮＡヌクレオチド配列および誘導タンパク質配列。

（原請求の範囲を以下の新請求の範囲に全文差し替える；原翻訳文第２３〜２、特許請求の範囲１、　植物ポリフェノールオキシダーゼ（ｐｐｏ）活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含むＤＮＡ配列またはそのフラグメント。

２、トランシットペプチドをコードする植物ＰＰＯ遺伝子のプレ配列を含むＤＮＡ配列。

３、トランシットペプチドをコードする植物ＰＰＯ遺伝子のプレ配列を含む請求項１に記載のＤＮＡ配列。

４、　植物ＰＰＯ遺伝子に対するアンチセンスｍＲＮＡをコードする配列またはそのフラグメントを含む請求項１に記載のＤＮＡ配列。

５、　植物ＰＰＯ遺伝子に対するアンチセンスｍＲＮＡをコードする配列を含むＤＮＡ配列またはそのフラグメント。

６、　触媒開裂部位を組込んでいる請求項１に記載のＤＮＡ配列。

７、　プレ配列が、植物ＰＰＯ活性を有するポリペプチドを他の細胞区分に向けるように他の標的配列によって置き換えられている請求項３に記載のＤＮＡ配列。

８、　図１に図示したような、推定上の葉緑体トランシットペプチド配列および成熟グレープバインＰＰＯポリペプチドをコードする配列を含む請求項３に記載のＤＮＡ配列。

９、　図２に図示したような、ソラマメの葉のＰＰＯ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含む請求項１に記載のＤＮＡ配列。

１０、図３に図示したような、リンゴ果実のＰＰＯ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含む請求項１に記載のＤＮＡ配列。

１１、図４に図示したような、ジャガイモ塊茎のＰＰＯ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含む請求項１に記載のＤＮＡ配列。

１２、植物ＰＰＯ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列またはそのフラグメントを含む組換えＤＮＡプラスミドを製造する方法であって、植物ＰＰＯ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含むＤＮＡ配列またはそのフラグメント；およびプラスミド発現ベクターを提供し：そして該ＤＮＡ配列および該プラスミド発現ベクターを反応させて、該ＤＮＡ配列を該プラスミド発現ベクター中に配置することを含む上記方法。

１３、ＤＮＡ配列を、植物試料から単離されたポリアデニル化ＲＮＡから生成する請求項１２に記載の方法。

１４、植物試料を、リンゴ、ジャガイモ、ブドウおよび豆から選択する請求項１３に記載の方法。

１５、植物ＰＰＯ活性を有するポリペプチド源を提供し；植物ＰＰＯ活性を有するポリペプチドをコードするポリアデニル化ＲＮＡをそこから単離し：そしてコピーＤＮＡ　（ｃＤＮＡ）を構築するように該ポリアデニル化ＲＮＡを処理する予備工程を含む請求項１３に記載の方法。

１６、ポリアデニル化ＲＮＡを処理する工程が、該ポリアデニル化ＲＮＡを逆転写酵素およびアダプタープライマーで処理して第−鎖ｃＤＮＡを生成し；そしてそのように生成されたｃＤＮＡを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて増幅させることを含む請求項１５に記載の方法。

１７、アダプタープライマーが、Ｖす５’　−ＧＡＣＴＣＧＡＧＴＣＧＡＣＡＴＣＧＡＴＴＴＩＴｍＴＴｒ’ｍ’ｍを有するオリゴヌクレオチドアダプターである請求項１６に記載の方法。

１８、ｃＤＮＡを増幅させる工程が、配列５’　−ＧＡＣＴＣＧＡＧＴＣＧＡＣＡＴＣＧを有するアダプタープライマーおよび５′末端プライマーを用いる請求項１７に記載の方法。

１９．５’末端プライマーが、ブドウｃＤＮＡの増幅用に用いられる場合に配列５’　−ＣＣＩＡＴＩＣＡＧＧＣＩＣＣＩＧＡＴＡＴＩＩＣＩＡＡＧＴＧＴＧＧ　。

豆ｃＤＮＡの増幅用に用いられる場合に配列５’　−ＧＣＧＧＡＴＣＣＴＴ［ＣＴ］ＴＡ［ＣＴ］ＧＡ［ＣＴ］ＧＡ［ＧＡ］ＡＡ［ＣＴ］ＡＡ　；リンゴｃＤＮＡの増幅用に用いられる場合に配列（５’　−ＧＣＧＡＡＴｒＣＧＡ　［ＡＣ］ＧＡ　［ＴＣ］＾ＴＧＧＧＩＡＡ［ＴＣ］Ｔｒ［ＴＣ］ＴＡ）　；そしてジャガイモｃＤＮＡの増幅用に用いられる場合に配列ＧＥＮ３　：　（５’　−ＧＣＧＡＡＴｒＣＴＴ　［ＴＣコ［ＴＣ］ＴＩＣＣＩＴＴ［ＴＣ］ＣＡ［ＴＣ］　［ＡＣ］のＧＥＮ７　：　（５’　−ＧＣＧＡＡＴｒＣＡＡ　［ＴＣ］　ＧＴＩＧＡ　［ＴＣ且ＡＣ］　ＧＩＡＴＧＴＧＧ）を有する請求項１８に記載の方法。

２０、ポリアデニル化ＲＮＡを処理する工程が、該ポリアデニル化ＲＮＡを逆転写酵素およびＰＰＯ特異的プライマーで処理して第−鎖ｃＤＮＡを生成し：そのように生成されたｃＤＮＡをターミナルｄトランスフェラーゼで処理して、ポリアデノシン尾部配列を該ｃＤＮＡの３′末端に結合し；そしてそのように生成されたポリアデニル化ｃＤＮＡを、ＰＣＲを用いて増幅させることを含む請求項１５に記載の方法。

２１、ＰＰＯ特異的プライマーが、ブドウＰＰＯに関して配列５’　−ＡＡＴＣＴＴｒＧＴＧＧＴＧＡＣＴＧＧＣＧを有するオリゴヌクレオチドプライマーでありまたは該ＰＰＯ特異的プライマーが、ジャガイモ塊茎ＰＰＯに関して配列５’ 　ＧＡＣＧＧＴＡＣＡＴｒＡＧＴＣＴＴＡＡＡＴを有するオリゴヌクレオチドプライマーである請求項２０に記載の方法。

２２、ｃＤＮＡを増幅させる工程が、配列５−ＧＡＣＴＣＧＡＧＴＣＧＡＣＡＴＣＧＡＴｒＴｒＴｍＴｍＴｒｍを有するオリゴヌクレオチドアダプタープライマーおよびブドウＰＰＯに関して配列５’　−ＡＣＣＡＴＣＡＧＧＣＡＣＧＧＴＧＧＣＧＧまたはジャガイモ塊茎ＰＰＯに関して配列５’　−ＴＧＣＴＣＡＴＣＡＡＣＴＧＧＡＧＴＴＧＡＧを有するＰＰＯ特異的オリゴヌクレオチドプライマーを用いる請求項２１に記載の方法。

２３、プラスミド発現ベクターがプラスミドベクターブルースクリプトＳＫ＋であり且つＤＮＡ配列がｃＤＮＡ配列である請求項２２に記載の方法。

２４、ＤＮＡ配列をプラスミド発現ベクター中に配置する工程が、ｃＤＮＡをプラント末端付きにし；そのように生成されたプラント末端付きｃＤＮＡを分別し；予想の寸法のフラグメントを単離し；そして該フラグメントをブルースクリプトＳＫ　ベクターの適当な制限酵素部位に連結することを含む請求項２３に記載の方法。

２５、植物ＰＰＯ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列またはそのフラグメントを含む組換えＤＮＡプラスミドであって、単細胞生物におり）で複製され、転写さね、そして翻訳されることができる上記プラスミド。

２６、ＤＮＡ配列の上流の構成的プロモーター要素を含む請求項２５に記載の組換体プラスミド。

２７、ＤＮＡ配列が、ブドウ、豆、リンゴまたはジャガイモ塊茎のＰＰＯ活性を有するポリペプチドを特徴とする請求項２６に記載の組換体プラスミド。

２８、植物組織中のＰＰＯ活性の水準を低下させる方法であって、植物ＰＰＯ活性を有するポリペプチドをコードする修飾遺伝子またはそのフラグメントを含むＤＮＡ構築物：および植物試料を提供し；そして該ＤＮＡ構築物を該植物試料中に導入して形質転換した植物を製造することを含む上記方法。

２９、ＤＮＡ構築物が、植物ＰＰＯ遺伝子に対するアンチセンスｍＲＮＡをコードする配列またはそのフラグメントを含む請求項２８に記載の方法。

３０、ＤＮＡ構築物が、植物ＰＰＯ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子またはそのフラグメントを含み、触媒開裂部位を組込んでいる請求項２８に記載の方法。

３１、植物試料を、グレープパイン、ジャガイモ、リンゴおよび豆から選択された植物から得る請求項２８に記載の方法。

３２、ＤＮＡ構築物が、ＤＮＡ配列を導入された二成分ベクター；および果実または野菜の皮すなわち外皮に特異的であるプロモーターを含む請求項２８に記載の方法。

３３、植物組織中のＰＰＯ活性の水準を増大させる方法であって、植物ＰＰＯ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子またはそのフラグメントを含むＤＮＡ構築物；および植物試料を提供し；そして該ＤＮＡ構築物を該植物試料中に導入して形質転換した植物を製造することを含む上記方法。

３１、ＤＮＡ構築物が、トランシットペプチドをコードする植物ＰＰＯ遺伝子のプレ配列をコードしているＤＮＡ配列またはそのフラグメントを含む請求項３３に記載の方法。

３５、プレ配列が、植物ＰＰＯ活性を有するポリペプチドを他の細胞区分に向けるように他の標的配列によって置き換えられている請求項３４に記載の方法。

３６、植物試料を、タバコ、ソラマメ、トマト、茶、コーヒーおよびココアから選択された植物から得る請求項３３に記載の方法。

３７、ＤＮＡ構築物が、ＤＮＡ配列を導入された二成分ベクター；および果実または野菜の皮すなわち外皮に特異的であるプロモーターを含む請求項３３に記載の方法。

３８、植物ＰＰＯ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列またはそのフラグメントを含むＤＮＡプローブ。

３９、ＰＰＯ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列またはそのフラグメントを植物種から単離する方法であって、ｃＤＮＡまたはゲノムライブラリー；および植物ＰＰＯ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列またはそのフラグメントを含むＤＮＡプローブを提供し；そして該プローブを該ゲノムライブリーとハイブリッド形成させて、該ＤＮＡ配列を有するクローンを識別することを含む上記方法。

４０、ＤＮＡプローブが、異種間に高度に保存されるリンゴ、ジャガイモ、ブドウまたは豆のＰＰＯ遺伝子のフラグメントを含むＤＮＡ配列を含む請求項３９に記載の方法。

４１、ＤＮＡプローブを、植物種からの全ｃＤＮＡ；および植物ＰＰＯ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子と特異的にハイブリッド形成し且つ異種間に高度に保存されるリンゴ、ジャガイモ、ブドウまたは豆のＰＰＯ遺伝子の配列を含む２種類またはそれ以上のオリゴヌクレオチドブライマーを提供し；そしてＰＣＲを実施して、植物ＰＰＯ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含むＤＮＡ配列またはそのフラグメントを増幅させることを含む方法によって製造する請求項３９に記載の方法。

４２、オリゴヌクレオチドプライマーが、植物ＰＰＯ活性を有するポリペプチド上の銅結合性部位に対応するＤＮＡ配列を含む請求項４１に記載の方法。

４３、ＰＰＯ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含むＤＮＡ配列またはそのフラグメントを植物種から単離する方法であって、植物から単離されたｍＲＮＡ；２種類またはそれ以上のオリゴヌクレオチドプライマーを提供し；該ｍＲＮＡを逆転写酵素およびアダプターブライマーで処理して第−ｉｌｌ　ｃ　Ｄ　ＮＡを生成し；そしてそのように生成されたｃＤＮＡを、オリゴヌクレオチドプライマーおよびポリメラーゼ連鎖反応を用いて増幅させることを含む上記方法。

４４、ＰＰＯ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含むＤＮＡ配列またはそのフラグメントを植物種から単離する方法であって、発現ライブラリー；およびＰＰＯを有する精製ポリペプチドに対して生じた多クローン性抗体を提供し；そして該多クローン性抗体と該発現ライブラリーとを反応させて、ＰＰｏ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含むＤＮＡ配列またはそのフラグメントを有するクローンを識別することを含む上記方法。

４５、Ｎ末端アミノ酸配列ＡＰＩＱＡＰＤＩ　５ＫＣＧＴＡＴＶＰＤＧＶＴＰを有する、実質的に純粋な状態の植物ＰＰＯ活性を有するポリペプチド。

国際調査報告　１ｍｌ＠ｙｐｋｕｋａａＮ。

Ｐｅｒ／ＡＵｊｉ１０ｏ３Ｓ４ −にテ市Ａ／２１０１ψ命隅自煽りｆ−１−１ｆｉ　（２１１＋Ｉυ１ｙ襲γη ）ω−Ｍ国際調査報告　−ｗｋａａｌ−−Ｎ。

Ｆｅｎ＋＋ＰＣＴｌｕＡ７２１０（−−ｏｆ−−ＸＩｕｌｙ１９９２１国際調査報告　″に″″″′□２ｐｃｒｒ＾υ載Ａ諭１− ＴＮｓＡｎｎｅｘｌｉｍｔｈｅｋｎｏｗｎ”＾”ｐｕｂｌｉｃａｄｏｎｌｅｖｅｌｐａｔｅｎｔｆ−ｕ１１１１ｙｍｅｍｔ＋ｅｎｒｅｈｔｍ■狽盾狽ｂ■Aｐａｌｅｎ＋ｄｏｃｕｍｅｎｕｃｉｔａｌ　ｉｎ　ｔｈｅａｂｏｖｅ−ｍｅｎｔｉｏｎｅｄ　ｍヒ隨１ｏｒｕｌ　５ａｒｃｈ　ｒｅｐｏｎ、　Ｔｈｅ＾−ｔｉｎＰｍｒ＋＋Oｆｆｉｃｅ＋ｓｖｎ　ｎｏｗａｙｌｉｍｉｔｒｏｔｔｈａｗｐｍｃｕｌａｒｓｗｈｉｃｈｕｅ　ｍｅｒｅｌｙｇｉｖｅｎ　ｆｏｒ山Ｃ四―５ｅｏｒｉｎｆｏｒ＋ｍｔｉｏｎ。

Ｆｅ＋ｖ＋＋　ＰＣ＋ｒ／ＩｓＡ／２１句−−ｈｍＭｙ　ａｍｗ×Ｊ＋＋ｌｙ　ＩｎｚＩ−１フロントページの続き（７２）発明者　ドライ、イアン・バリーオーストラリア連邦サウス・オーストラリア州５０３９．メルローズ・パーク、キックストン・アベニュー　１１１

Claims

【特許請求の範囲】

１．ポリフェノールオキシダーゼ（ＰＰＯ）活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含むＤＮＡ配列またはそのフラグメント。
２．トランシットペプチドをコードするＰＰＯ遺伝子のプレ配列を含むＤＮＡ配列。
３．正常なＰＰＯ遺伝子に対するアンチセンスｍＲＮＡをコードする配列またはそのフラグメントを含む請求項１に記載のＤＮＡ配列。
４．触媒開裂部位を組込んでいる請求項３に記載のＤＮＡ配列。
５．プレ配列が、ＰＰＯタンパク質を他の細胞区分に向けるように他の標的配列によって置き換えられている請求項２に記載のＤＮＡ配列。
６．図１に図示したような、推定上の葉緑体トランシットペプチド配列および成熟グレープパインＰＰＯポリペプチドをコードする配列を含む請求項２に記載のＤＮＡ配列。
７．図２に図示したような、ソラマメの葉のＰＰＯ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含む請求項１に記載のＤＮＡ配列。
８．図３に図示したような、リンゴ果実のＰＰＯ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含む請求項１に記載のＤＮＡ配列。
９．図４に図示したような、ジャガイモ塊茎のＰＰＯ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含む請求項１に記載のＤＮＡ配列。
１０．ＰＰＯ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列またはそのフラグメントを含む組換えＤＮＡプラスミドを製造する方法であって、ＰＰＯ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含むＤＮＡ配列またはそのフラグメント；およびプラスミド発現ベクターを提供し；そして該ＤＮＡ配列および該プラスミド発現ベクターを反応させて、該ＤＮＡ配列を該プラスミド発現ベクター中に配置することを含む上記方法。
１１．ＤＮＡ配列を、植物試料から単離されたポリアデニル化ＲＮＡから生成する請求項１０に記載の方法。
１２．植物試料を、リンゴ、ジャガイモ、ブドウおよび豆から選択する請求項１１に記載の方法。
１３．ＰＰＯポリペプチド源を提供し；ＰＰＯをコードするポリアデニル化ＲＮＡをそこから単離し；そしてコピーＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を構築するように該ポリアデニル化ＲＮＡを処理する予備工程を含む請求項１１に記載の方法。
１４．ポリアデニル化ＲＮＡを処理する工程が、該ポリアデニル化ＲＮＡを逆転写酵素およびアダプタープライマーで処理して第一鎖ｃＤＮＡを生成し；そしてそのように生成されたｃＤＮＡを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて増幅させることを含む請求項１３に記載の方法。
１５．アダプタープライマーが、配列５′−【配列があります】を有するオリゴヌクレオチドアダプターである請求項１４に記載の方法。
１６．ｃＤＮＡを増幅させる工程が、配列５′−【配列があります】を有するアダプタープライマーおよび５′末端プライマーを用いる請求項１５に記載の方法。
１７．５′末端プライマーが、ブドウｃＤＮＡの増幅用に用いられる場合に配列５′−【配列があります】；豆ｃＤＮＡの増幅用に用いられる場合に配列５′−【配列があります】；リンゴｃＤＮＡの増幅用に用いられる場合に配列（５′−【配列があります】；そしてジャガイモｃＤＮＡの増幅用に用いられる場合に配列ＧＥＮ３：（５′【配列があります】ＧＥＮ７：（５′【配列があります】を有する請求項１６に記載の方法。
１８．ポリアデニル化ＲＮＡを処理する工程が、該ポリアデニル化ＲＮＡを逆転写酵素およびＰＰＯ特異的プライマーで処理して第一鎖ｃＤＮＡを生成し；そのように生成されたｃＤＮＡをターミナルｄトランスフェラーゼで処理して、ポリアデノシン尾部配列を該ｃＤＮＡの３′末端に結合し；そしてそのように生成されたポリアデニル化ｃＤＮＡを、ＰＣＲを用いて増幅させることを含む請求項１３に記載の方法。
１９．ＰＰＯ特異的プライマーが、ブドウＰＰＯに関して配列５′−【配列があります】を有するオリゴヌクレオチドプライマーでありまたは該ＰＰＯ特異的プライマーが、ジャガイモ塊茎ＰＰＯに関して配列５′−【配列があります】を有するオリゴヌクレオチドプライマーである請求項１８に記載の方法。
２０．ｃＤＮＡを増幅させる工程が、配列５′−【配列があります】を有するオリゴヌクレオチドオリゴヌクレオチドアダプタープライマーおよびブドウＰＰＯに関して配列５′−【配列があります】またはジャガイモ塊茎ＰＰＯに関して配列５′−【配列があります】を有するＰＰＯ特異的オリゴヌクレオチドプライマーを用いる請求項１９に記載の方法。
２１．プラスミド発現ベクターがプラスミドベクタープルースクリプトＳＫ＋であり、ＤＮＡ配列がｃＤＮＡ配列であり、ＤＮＡ配列をプラスミド発現ベクター中に配置する工程が、該ｃＤＮＡをクレノウフラグメントでプラント末端付きにし；そのように生成されたｃＤＮＡをアガロースゲル上で分別し；予想の寸法のフラグメントをゲルから単離し；そして該フラグメントをブルースクリプトＳＫ＋ベクターのＨｉｎｄＩＩＩまたはＥｃｏＲＩ部位に連結することを含む請求項１０に記載の方法。
２２．ＰＰＯ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列またはそのフラグメントを含む組換えＤＮＡプラスミドであって、単細胞生物において複製され、転写され、そして翻訳されることができる上記プラスミド。
２３．ＤＮＡ配列の上流の構成的プロモーター要素を含む請求項２２に記載の組換体プラスミド。
２４．ＤＮＡ配列が、ブドウ、豆、リンゴまたはジャガイモ塊茎のＰＰＯ活性を有するポリペプチドをコードする請求項２３に記載の組換体プラスミド。
２５．植物組織中のＰＰＯ活性の水準を低下させる方法であって、修飾ＰＰＯ遺伝子またはそのフラグメントを含むＤＮＡ構築物；および植物試料を提供し；そして該ＤＮＡ構築物を該植物試料中に導入して形質転換した植物を製造することを含む上記方法。
２６．ＤＮＡ構築物が、正常ＰＰＯ遺伝子に対するアンチセンスｍＲＮＡをコードする配列またはそのフラグメントを含む請求項２５に記載の方法。
２７．ＤＮＡ構築物が、ＰＰＯ遺伝子またはそのフラグメントを含み、触媒開裂部位を組込んでいる請求項２６に記載の方法。
２８．植物試料を、グレープパイン、ジャガイモ、リンゴおよび豆から選択された植物から得る請求項２５に記載の方法。
２９．ＤＮＡ構築物が、ＤＮＡ配列を導入された二成分ベクター；および果実または野菜の皮すなわち外皮に特異的であるプロモーターを含む請求項２５に記載の方法。
３０．植物組織中のＰＰＯ活性の水準を増大させる方法であって、ＰＰＯ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子またはそのフラグメントを含むＤＮＡ構築物；および植物試料を提供し；そして該ＤＮＡ構築物を該植物試料中に導入して形質転換した植物を製造することを含む上記方法。
３１．ＤＮＡ構築物が、トランシットペプチドをコードするＰＰＯプレ配列をコードしているＤＮＡ配列またはそのフラグメントを含む請求項３０に記載の方法。
３２．ＰＰＯプレ配列が、ＰＰＯタンパク質を他の細胞区分に向けるように他の標的配列と置き換えられている請求項３１に記載の方法。
３３．植物試料を、タバコ、ソラマメ、トマト、茶、コーヒーおよびココアから選択された植物から得る請求項３０に記載の方法。
３４．ＤＮＡ構築物が、ＤＮＡ配列を導入された二成分ベクター；および果実または野菜の皮すなわち外皮に特異的であるプロモーターを含む請求項３０に記載の方法。
３５．ＰＰＯ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含むＤＮＡ配列またはそのフラグメントを含むＤＮＡプローブ。
３６．ＰＰＯ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列またはそのフラグメントを植物種から単離する方法であって、ｃＤＮＡまたはゲノムライブラリー；およびＰＰＯ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列またはそのフラグメントを含むＤＮＡプローブを提供し；そして該プローブを該ゲノムライプリーとハイブリッド形成させて、該ＤＮＡ配列を有するクローンを識別することを含む上記方法。
３７．ＤＮＡプローブが、異種間に高度に保存されるリンゴ、ジャガイモ、ブドウまたは豆のＰＰＯ遺伝子のフラグメントを含むＤＮＡ配列を含む請求項３６に記載の方法。
３８．ＤＮＡプローブを、植物種からの全ｃＤＮＡ；およびＰＰＯ遺伝子と特異的にハイブリッド形成し且つ異種間に高度に保存されるリンゴ、ジャガイモ、ブドウまたは豆のＰＰＯ遺伝子の配列を含む２種類またはそれ以上のオリゴヌクレオチドプライマーを提供し；そしてＰＣＲを実施して、ＰＰＯ遺伝子を含むＤＮＡ配列またはそのフラグメントを増幅させることを含む方法によって製造する請求項３７に記載の方法。
３９．オリゴヌクレオチドプライマーが、ＰＰＯタンパク質上の銅結合性部位に対応するＤＮＡ配列を含む請求項３８に記載の方法。
４０．ＰＰＯ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含むＤＮＡ配列またはそのフラグメントを植物種から単離する方法であって、植物から単離されたｍＲＮＡ；ポリ−ｄＴアダプタープライマー；および２種類またはそれ以上のオリゴヌクレオチドプライマーを提供し；該ｍＲＮＡを逆転写酵素およびアダプタープライマーで処理して第一鎖ｃＤＮＡを生成し；そしてそのように生成されたｃＤＮＡを、オリゴヌクレオチドプライマーおよびポリメラーゼ連鎖反応を用いて増幅させることを含む上記方法。
４１．ＰＰＯ遺伝子またはそのフラグメントを植物種から単離する方法であって、発現ライブラリー；および精製ＰＰＯタンパク質に対して生じた多クローン性抗体を提供し；そして該多クローン性抗体と該発現ライブラリーとを反応させて、ＰＰＯ遺伝子を含むＤＮＡ配列またはそのフラグメントを有するクローンを識別することを含む上記方法。
４２．Ｎ末端アミノ酸配列【配列があります】を有する、実質的に純粋な状態のＰＰＯタンパク質。