JPS62205783A - 耐熱性ポリフエノ−ルオキシダ−ゼの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 ポリフェノールオキシダーゼはフェノラーゼ、チロシナ
ーゼ、ラッカーゼ、カテコールオキンダーゼ等の名前で
呼ばれており、Ｏ−ジフェニールをＯ−キノンに酸化す
る酵素である。

フェノール類を含む植物、又は動物の組織の破砕物又は
抽出液に当該酵素を作用させると粘度上昇、固化被膜形
成等の物性の変化が起る。また味の変化も起る場合もあ
る。具体的な応用の可能な例としてはウルシの固化促進
、紅茶、ココア製造への利用等を挙げることが出来るが
他の種々の食品加工や化成品製造への応用の可能性があ
る。特に高い温度においても安定な酵素の産業上での利
用範囲は広い。

〔従来の技術〕

従来、植物、動物、微生物にポリフェノールオキシダー
ゼの存在が知られているがいずれも不安定であり更に活
性も低いと云う欠点を有しておシ食品加工等への応用は
なされていないのが現状である。

近年本発明者によシミリオコツカムＲ（特開昭６０−６
２９８０　）、ムコール属（特願昭５９−２３６９８６
）による耐熱性ポリフェノールオキシダーゼが本出願人
によって開発されているが特異性がやや狭い欠点を有し
ている。

〔発明が解決しようとする問題点〕

上述した様に従来得られｔこ耐熱性ポリフェノールオキ
シダーゼは基質特異性が狭く汎用性に欠ける為耐熱性を
有しかつ基質特異性の広い酵素を見出す必要がある。又
効率良く酵素を得る為に従来以上の高い活性をもつ酵素
製剤が望まれる。

〔問題を解決するための手段〕

本発明者等は上述の事情に鑑み、利用範囲も広く高温に
至適温度を示し、かつ種々の基質に作用する、活性の高
いポリフェノールオキシダーゼを得るべく広く保存株及
び自然界よシ検索した結果、高温糸状菌の一菌株が高温
に至適温度を示しかつ広い基質特異性を示すポリフェノ
ールオキシダーゼ？生産することを見い出し、本菌を液
体培養又鉱固体培養することによ、９／リフエノールオ
キシダーゼを生成させ、これをｆ＃製することによタ効
７率良く高純度で高温でかつ広い基質特異性を示すポリ
フェノールオキシダーゼを製造する方法を完成した。

本発明に使用するケトミウム・サーモファイルＡＪ７７
２２はＡＴＣＣ２８０７７として登録されているもので
あり、本株又はその各種変異株も使用出来る。

次に本発明に於いて本菌株を培養し耐熱性ポリフェノー
ルオキシダーゼを採取する詳細について述べる。

培養法は通常行なわれる液体培養法でも固体培養法でも
良く、培養温度を４０〜６０℃で１〜１０日間振盪又は
静置培養すれば良い。

液体培養培地では炭素源としてグルコース、シェフロー
ス、澱粉有機酸など、窒素源としてペグトン、イースト
エキスｒ　（ＮＨ４）２ｓｏ４１　ＮＨ４Ｎｏ５など、
無機塩として双２ＰＯ４，Ｋ２ＨＰＯ４，Ｍｇ８０４．
　ＣａＣ１２ｒａｔど、その他必要に応じてＺｎ＋、　
Ｆｅ＋、　Ｃｕ″＋、　Ｍｎ”などの微量金属やポリフ
ェノール類を適宜添加する。

固体培養には鯨を用い、必要に応じ無機塩類やＩリフエ
ノール類を添加する。

この様な方法で得られた培養物よりフェノール安塩析又
はアセトン、アルコール等による溶媒沈澱によシ粗酵素
を得ることが出来る。

さらに高度な精製標品を得るには限外濾過、グル濾過ク
ロマト、吸着クロマト、イオン交換クロマト又は等電点
分画などの手法又はこれ等を組み合せることによシ精製
することが出来る。

この様にして精製されたケトミウム・サーモファイルＡ
Ｊ　７７２２の精製した酵素の理化学的性質は次の通り
である。

１、至適温度、第１図に示す。

１０〜７０℃で酵素活性を測定した結果、５０℃に最高
の活性がみられた。

２、熱安定性、第２図に示す。

ｏ、ｏｓＭリン酸緩衝演（ｐＨ５，０）中で１０〜７０
℃３０分間処理し、各温度に於ける残存活性は第２図に
示す様にきわめて優れた安定比を示した０３、至適−１
第３図に示す。

マツクペイン緩衝液中での至適−は５．０附近である。

４、ＰＨ安定性、第４図に示す。

緩衝液中、３０℃、２４時間放置したがｐＨ４，０〜１
０．０間で安定であった。

５、基質特異性 ｄ−カテキｙ　　　　　　　　　３９０ｎｍ　　１００
　　％ピロカテコール　　　　　　３９５　　　　２２
．６ｄｔ　−ドー７４　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　４６０　　　　　　　　　　　　　０．３
３１ハイドロキノン　　　　　　　２５０　　　　４５
．７０−７エニレンゾアミン　　　　４４０　　　　　
３．１３ＮＮジメチルｐ−７エニレンゾアミン　　５５
０　　　　　６３．０活性測定は各々の吸収値のポリフ
ェノールオキシダーゼ作用による変化を測定しｄカテキ
ンに対する活性を１００とした時の相対活性で示した。

又至適温度、熱安定性、至適−１ｐ）１安定性の活性は
ｄ−カテキンを基質として用いた。

活性の単位は３５℃でｐｌ（５，０，１分間に吸収値ｏ
、ｏｏｉを増加させる活性を１３１位とした。

次に本発明を実施例によシ詳述する。

実施例Ｉ Ｗ溶ａｌｌｌ１１．５％、ＮＨ４Ｎｏ、　０．５　％、
　イー　ストエキス０．４％、ＫＨ２ＰＯ４０，１％、
ＭｇＳＯ４・７　Ｈ２Ｏ０，０５％　。

ツメチルアニリンｏ、００５％、Ｐ）ｉ６゜０の培地ｉ
ｏｏ＊を５００１ｄ容肩付フラスコに入れ１２０Ｃにて
１５分間オートクレーブ殺菌した。

これに市販ポテトデキストロース・アガー、（栄研）斜
面培地で４５℃、３日間前培養したケトミウム・サーモ
ファイルＡＪ７７２２を接種し４５℃、２日間振盪培養
した。

培養後の上清のポリフェノールオキシダーゼ活性は１５
単位／ゴであった。

実施例２ 破ｅ７ｇにＺｎＳＯ４・７　Ｈ２Ｏ６−２／’９／Ｊ、
Ｆ＠ＳＯ４’５Ｈ２０６，３Ｑ／Ｊ、ＣｕＳＯ４−５Ｈ
２００，８ｍ９７ノ、ＭｎＳＯ４’７　Ｈ２Ｏ・６．３
　ｍ９／Ｉを含む無機塩水２３ｇを加え、２！容三角形
フラスコに入れ１２０℃にて３０分間オートクレーブ殺
菌した。その後滅菌水５０ゴを加え、これに実施例１と
同様前培養したケトミウム・サーモファルＡＪ７７２２
１ｆＩ：接種しよく攪拌後４５℃で５日間時々攪拌し静
置培養する。培養終了後１００１ｄの水を加え４℃、３
０分間放置抽出する。抽出上清のポリフェノールオキシ
ダーゼ活性は３９単位／ｒＩＬｔであった。

実施例３ 実施例２で得られた抽出上清ＩＪ３９０００単位に硫酸
アンモニウム１１４ｇ（２０％飽和）ｆｃ加え攪拌溶解
し、生成した沈澱を１１００００ｒｐ。

１０分で遠心除去する。得られた上清硫酸アンモニウム
をさらに２６２１加え（６０％飽和となる）攪拌溶解後
生成した沈澱を１０００Ｏｒｐｍ、１０分遠心分離した
。得られた沈澱を０．０５’ｌＪン酸緩衝液μ５．５に
溶解し同緩衝液で１夜透析した。（回収率９０チ） この透析液を０．０５”ｊン酸緩衝液で平衡化したＤＦ
：ＡＩ−セファデックスＡ　−５０（３，２Ｘ　３２　
ａｎ　）に吸着後、同緩衝液で溶出した（回収率６４％
）。

活性７ラクシ冒ンを集め硫酸アンモニウムを６０１飽和
となる様に加え、攪拌後生成した沈澱を１１０００Ｏｒ
ｐ、１０分遠心分離した。沈澱を０．０５Ｍ１７ン酸緩
衝液−５，５に溶解し、同溶液で１夜透析した。次にこ
の透析液を同緩衝液で平衡化したＣＭ−セファデックス
Ｃ−５０（３，２Ｘ３２ｍ）に吸着させ０．０５ＭＩＪ
ン酸緩衝液−５．５で溶出した（回収率５３チ）。

次にＣｏｎ　Ａ−ａｅｐｈａｒｏ＠ｅを用層るアフィニ
ティクロマトカラム（１，４Ｘ　１１．５０）にかけ０
．０５’リン酸緩衝液ｐＨ５，５中メチルβ−グルコシ
ドの０〜ＩＭの直線濃度勾配で溶出した。活性画分を採
取し０．０５’！Ｊン酸緩衝液に対し透析後、凍結乾燥
を行なった結果白色粉末２８ダを得た。活性の回収率は
３６％であった。

【図面の簡単な説明】

第１図はケトミウム属に属する微生物の耐熱性ポリフェ
ノールオキシダーゼの温度に対する酵素活性を図示した
ものである。 第２図はケトミウム属に属する微生物の耐熱性ポリフェ
ノールオキシダーゼの温度安定性を図示したものである
。 第３図はケトミウム属に属する微生物の耐熱性ポリフェ
ノールオキシダーゼの−に対する酵素活性を図示したも
のである。 第４図はケトミウム属に属する微生物の耐熱性ポリフェ
ノールオキシダーゼの２安定性を図示シたものである。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. ケトミウム属に属する耐熱性ポリフェノールオキシダー
   ゼ生産菌を培養し、その培養物から耐熱性ポリフェノー
   ルオキシダーゼを採取することを特徴とする耐熱性ポリ
   フェノールオキシダーゼの製造法。