JPS6062980A - 耐熱性ポリフエノ−ルオキシダ−ゼの製造法 - Google Patents
耐熱性ポリフエノ−ルオキシダ−ゼの製造法Info
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- JPS6062980A JPS6062980A JP17000783A JP17000783A JPS6062980A JP S6062980 A JPS6062980 A JP S6062980A JP 17000783 A JP17000783 A JP 17000783A JP 17000783 A JP17000783 A JP 17000783A JP S6062980 A JPS6062980 A JP S6062980A
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- polyphenol oxidase
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はミリオコツカム属に属する菌株を培養し耐熱性
ポリフェノールオキシダーゼを製造する方法に関する。
ポリフェノールオキシダーゼを製造する方法に関する。
ポリフェノールオキシダーゼはフェノラーゼ。
チロシナーゼ、ラッカーゼ、クレノラーゼ、カテコール
オキシダーゼ等種々の名前で呼ばれておシ０−ジフェニ
ールを０−キノンに酸化する酵素である。
オキシダーゼ等種々の名前で呼ばれておシ０−ジフェニ
ールを０−キノンに酸化する酵素である。
従来、植物、動物、微生物にポリフェノールオキシダー
ゼの存在が知られているがいずれも不安定でアシ食品加
工等への応用はなされていないのが現状である。
ゼの存在が知られているがいずれも不安定でアシ食品加
工等への応用はなされていないのが現状である。
本発明者等は種々の用途に応用が可能な安定性の高いポ
リフェノールオキシダーゼを得るべく広く自然界より検
索した結果、高温糸状菌の一菌株が安定性の高いポリフ
ェノールオキシダーゼを生産することを見い出し、本菌
を液体培養又は固体培養する事によシボリフエノールオ
キシダーゼを生成させ、これを精製することによシ効率
よく高純度で安定性の高いポリフェノールオキシダーゼ
を製造する方法を完成した。
リフェノールオキシダーゼを得るべく広く自然界より検
索した結果、高温糸状菌の一菌株が安定性の高いポリフ
ェノールオキシダーゼを生産することを見い出し、本菌
を液体培養又は固体培養する事によシボリフエノールオ
キシダーゼを生成させ、これを精製することによシ効率
よく高純度で安定性の高いポリフェノールオキシダーゼ
を製造する方法を完成した。
本発明に使用するミリオコツカム・アルボミセスＡＪ１
１７１２１はＤｏｎａｌｄ Ｇ 、 Ｃｏｏｎｅｙ Ｒ
ａ１ｐｈ 。
１７１２１はＤｏｎａｌｄ Ｇ 、 Ｃｏｏｎｅｙ Ｒ
ａ１ｐｈ 。
Ｅｍｅ ｒ ＊ ｏ ｎ著の＠Ｔｈ＠ｒｍｏｐｈｉｌｉ
ｅ Ｆｕｎｇｉ ’ ａｔ、 ａｃｃｏｕｎｔｏｆ ｔ
ｈｅｉｒ ｂｉｏｌｏｇｒ 、 Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ
ａｎｄ Ｃ１ａｓａｉｆｉｃ−ａｔｉｏｎ 、 （Ｗ
、 ＨＦｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ ）に
従い検索、同定されたものであｊｊ） ＦＥＲＭ −Ｐ
として寄託されている。
ｅ Ｆｕｎｇｉ ’ ａｔ、 ａｃｃｏｕｎｔｏｆ ｔ
ｈｅｉｒ ｂｉｏｌｏｇｒ 、 Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ
ａｎｄ Ｃ１ａｓａｉｆｉｃ−ａｔｉｏｎ 、 （Ｗ
、 ＨＦｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ ）に
従い検索、同定されたものであｊｊ） ＦＥＲＭ −Ｐ
として寄託されている。
次に本発明に於いて本菌株を培養し耐熱性ポリフェノー
ルオキシダーゼを採取する詳細について述べる。
ルオキシダーゼを採取する詳細について述べる。
培養法は通常行なわれる液体培養法でも固体培養法でも
良く、培養温度を４０〜６０℃で１〜１０日間振盪又は
静置培養すれば良い。
良く、培養温度を４０〜６０℃で１〜１０日間振盪又は
静置培養すれば良い。
液体培養培地では炭素源としてグルコース、シュクロー
ス、澱粉有機酸など、窒素源としてペプトン、イースト
エキス、 （ＮＨ４）２Ｓｏ４． ＮＨ４Ｎｏ３など、
無機塩としてＫＨ２ＰＯ４，Ｋ２ＨＰＯ４，ＭｇＳＯ４
，ＣａＣｌ２など、その他必要に応じてＺｎ＋＋ Ｆｅ
＋＠ Ｃｕ＋ＨＭｎ４＋などの微量金属やポリフェノー
ル類を適宜添加する。
ス、澱粉有機酸など、窒素源としてペプトン、イースト
エキス、 （ＮＨ４）２Ｓｏ４． ＮＨ４Ｎｏ３など、
無機塩としてＫＨ２ＰＯ４，Ｋ２ＨＰＯ４，ＭｇＳＯ４
，ＣａＣｌ２など、その他必要に応じてＺｎ＋＋ Ｆｅ
＋＠ Ｃｕ＋ＨＭｎ４＋などの微量金属やポリフェノー
ル類を適宜添加する。
固体培養には餅を用い、“必要に応じ無機塩類やポリフ
ェノール類を添加する。
ェノール類を添加する。
この様な方法で得られた培養物よジフェノールオキシダ
ーゼを採取するには液体培養の場合には除菌液、固体培
養の場合には水抽出液を得、まず硫安塩析又はアセトン
、アルコール等による溶媒マド又は等電点分画などの手
法又はこれ等を組みこの様にして精製されたミリオコツ
カム！アルゴミセスＡＪ１１７１２１の酵素の理化学的
性質は次の通シである。
ーゼを採取するには液体培養の場合には除菌液、固体培
養の場合には水抽出液を得、まず硫安塩析又はアセトン
、アルコール等による溶媒マド又は等電点分画などの手
法又はこれ等を組みこの様にして精製されたミリオコツ
カム！アルゴミセスＡＪ１１７１２１の酵素の理化学的
性質は次の通シである。
１、熱安定性、第１図に示す。
０．０５’リン酸緩衝液（ＰＩ（５，０）中で４０〜性
を示した。
を示した。
２、至適ＰＨ１第２図に示す。
マツクペイン緩衝液中での至適μ■は５．０附近である
。
。
３、ｐＨ安定性、第３図に示す。
マツクペイン緩衝液中、３０℃、２４時間放置したがｐ
Ｈ３，０〜１０．０間で安定であった。
Ｈ３，０〜１０．０間で安定であった。
４、基質特異性
フェノール Ｏ
キノン ０
ノ４ラハイドロキシキノン ２２．５
オルトフエニレンジアミン １７．５
ピロガロール ６３．０
ピロカテコール ５１．Ｏ
ＮＮジメチルパラフェニレンジアミン １００．０活性
測定はフェノール： Ｋｉｎｄ −Ｋｉｎｇ変法、他の
基質については各々の吸収値（キノン＼４７０ｍμ、バ
ラハイドロキノン２５０ｍμ、オルトフェニレンジアミ
ン、４４０ｍμζピロ〃ロール、４３７ｍμ、ピロカテ
コール、３９５ｍμ、ＮＮジメテルノ母シラフェニレン
ジアミン５５０ｍμ）の酸化による変化より算出し、Ｎ
Ｎジメチルパラフェニレンジアミンに対する活性を１０
０とした時の相対値で示した。
測定はフェノール： Ｋｉｎｄ −Ｋｉｎｇ変法、他の
基質については各々の吸収値（キノン＼４７０ｍμ、バ
ラハイドロキノン２５０ｍμ、オルトフェニレンジアミ
ン、４４０ｍμζピロ〃ロール、４３７ｍμ、ピロカテ
コール、３９５ｍμ、ＮＮジメテルノ母シラフェニレン
ジアミン５５０ｍμ）の酸化による変化より算出し、Ｎ
Ｎジメチルパラフェニレンジアミンに対する活性を１０
０とした時の相対値で示した。
本酵素はモノフェノール類にははとんど作用しない酵素
と考えられる。
と考えられる。
５、分子量
セフアゾ、クスＧ−１００を用いたグルｐ力法により分
子量約１０万と測定された。
子量約１０万と測定された。
６、単一性
ディスク電気泳動（５ｍＡ／グル）によシ原点から３儒
の位置に単一のバンドを与えた。
の位置に単一のバンドを与えた。
活性測定法
Ｒａｖｉｎの方法（Ｈ，Ａ Ｒａｖｉｎ ： Ｌａｎｃ
ｅｔ ＋ ７２６ ｅｌ ９５６’ ）に従い、基質と
してＮＮジメチル／？ラフェニレンジアミンを用いて行
なった。
ｅｔ ＋ ７２６ ｅｌ ９５６’ ）に従い、基質と
してＮＮジメチル／？ラフェニレンジアミンを用いて行
なった。
酵素液１ｍＫＮＮジメチルパラフェニレンジアミン１
ｍＭ溶液２．５ｄを加え３７℃、６０分反応し５５０ｍ
μの吸光度を測定した。酵素単位は５５０ｍμの吸光度
を上記条件下で１．０増加させる活性を１単位とした。
ｍＭ溶液２．５ｄを加え３７℃、６０分反応し５５０ｍ
μの吸光度を測定した。酵素単位は５５０ｍμの吸光度
を上記条件下で１．０増加させる活性を１単位とした。
以上の結果から高温糸状菌ミリオコツカム・アルデミセ
スＡＪ １１７１２１の生産するポリフェノールオキシ
ダーゼは安定性大なる酵素であシ、より実用化に適する
酵素と云える。
スＡＪ １１７１２１の生産するポリフェノールオキシ
ダーゼは安定性大なる酵素であシ、より実用化に適する
酵素と云える。
次に本発Ｆ３Ａｔ−実施例にょシ詳述する。
実施例１
可溶性澱粉１．５チ、Ｎ）ｆ４ＮＯ３０，５％、イース
トエキス０．４ ％、ＫＨ２ＰＯ４０，１％、Ｍｇ５０
４−７Ｈ２００，０５チ、ジメチルアニリン０．００５
％、メ１６．ｏの培地・１００Ｍを５００ｍ／容肩付フ
ラスコに入れ１２０ｔ：にて１５分間オートクレーブ殺
菌した。
トエキス０．４ ％、ＫＨ２ＰＯ４０，１％、Ｍｇ５０
４−７Ｈ２００，０５チ、ジメチルアニリン０．００５
％、メ１６．ｏの培地・１００Ｍを５００ｍ／容肩付フ
ラスコに入れ１２０ｔ：にて１５分間オートクレーブ殺
菌した。
？−１１−に市販ポテトデキストロース・７．ｆ−１（
栄研）斜面培地で４５℃、３日間前培養したミリオコツ
カム・アルゲミセスＡＪ １１７１２１ ヲｍ種し４５
℃、２日間振盪培養した。
栄研）斜面培地で４５℃、３日間前培養したミリオコツ
カム・アルゲミセスＡＪ １１７１２１ ヲｍ種し４５
℃、２日間振盪培養した。
培養後の上清のポリフェノールオキダーゼ活性は０．９
単位／ ｍｌであった。
単位／ ｍｌであった。
実施例２
紺１００１ｉ’Ｋ ＺｎＳＯ４・７Ｈ２０６，２ｍ９／
ｌ、 ＦｅＳＯ４”５Ｈ２０６，３ｍ９／ｌ、 ＣｕＳ
Ｏ４・５Ｈ２００，８１ｎｇ／ｌ、 ＭｎＳＯ４−７Ｈ
２０６，３ｍ９／ｌ ヲ含む無機塩水６０ ｉヲ加え、
１を客玉角形フラスコに入れ１２０ｔｌＣて３ｏ分間オ
ートクレーブ殺菌した。
ｌ、 ＦｅＳＯ４”５Ｈ２０６，３ｍ９／ｌ、 ＣｕＳ
Ｏ４・５Ｈ２００，８１ｎｇ／ｌ、 ＭｎＳＯ４−７Ｈ
２０６，３ｍ９／ｌ ヲ含む無機塩水６０ ｉヲ加え、
１を客玉角形フラスコに入れ１２０ｔｌＣて３ｏ分間オ
ートクレーブ殺菌した。
これに実施例−１と同様前培養したミリオコツカム・ア
ルぎミセスＡＪ１１７１２１を接種しよく攪拌後４５℃
で５日間時々攪拌し静置培養する。培養終了後１００Ｗ
Ｌｔの水を加え４℃、３０分間放置抽出する。抽出上清
のポリフェノールオキシダーゼ活性は１．６単位／ ｍ
ｌであった。
ルぎミセスＡＪ１１７１２１を接種しよく攪拌後４５℃
で５日間時々攪拌し静置培養する。培養終了後１００Ｗ
Ｌｔの水を加え４℃、３０分間放置抽出する。抽出上清
のポリフェノールオキシダーゼ活性は１．６単位／ ｍ
ｌであった。
実施例３
実施例１で得られた培養液上清ｉｏｚに硫酸アンモニウ
ム１．４４ｋｇ（２５％飽和）を加え攪拌溶解し生成し
た沈澱を１０００Ｏｒｉｒｎ、１０分で遠心除去する。
ム１．４４ｋｇ（２５％飽和）を加え攪拌溶解し生成し
た沈澱を１０００Ｏｒｉｒｎ、１０分で遠心除去する。
得られた上清硫酸アンモニウムをさらに０．９３ ｋｌ
加え（４０チ飽和となる）攪拌溶解後生成した沈澱を１
０００ Ｏｒｐｍ 、１０分遠心分離した。
加え（４０チ飽和となる）攪拌溶解後生成した沈澱を１
０００ Ｏｒｐｍ 、１０分遠心分離した。
得られた沈澱を０．０５’ ！７ン酸緩衝液ｐＨ５，５
に溶解し同緩衝液で１夜透析した。
に溶解し同緩衝液で１夜透析した。
透析液を０．０５’ リン酸緩衝液で洗浄したセファデ
ックスＧ−１００カラム（３，ＯＸ ７０ ｃｍ ）で
グル濾過し、活性フラクションを０．０５’リン酸緩衝
液で平衡化したＤＥＡＥ−セファデックスＡ−５０（１
，５Ｘ５０画）に吸着後、同緩衝液の０．０５〜１、Ｏ
Ｍの直線濃度勾配溶出を行なった。
ックスＧ−１００カラム（３，ＯＸ ７０ ｃｍ ）で
グル濾過し、活性フラクションを０．０５’リン酸緩衝
液で平衡化したＤＥＡＥ−セファデックスＡ−５０（１
，５Ｘ５０画）に吸着後、同緩衝液の０．０５〜１、Ｏ
Ｍの直線濃度勾配溶出を行なった。
ポリフェノールオキシダーゼは０．３〜０．４”で溶出
される。活性は１８００単位、回収率は６０％であった
。
される。活性は１８００単位、回収率は６０％であった
。
活性フラクションを集めｏ、０５Ｍす゛・ン酸緩衝液声
６．０に対し透析した。透析後０．０５’ ＩＪン酸緩
衝液ｐｉ４５．５ テ平ｉ化したハイドロキシアノ４ｆ
ｉイト、カラム（１，５Ｘ３０ｃｍ）Ｋ吸着せしめ、同
緩衝液０．０５〜１．０Ｍの直線濃度勾配溶出を行なっ
た。ポリフェノールオキシダーゼは０．１５’で溶出さ
れた。
６．０に対し透析した。透析後０．０５’ ＩＪン酸緩
衝液ｐｉ４５．５ テ平ｉ化したハイドロキシアノ４ｆ
ｉイト、カラム（１，５Ｘ３０ｃｍ）Ｋ吸着せしめ、同
緩衝液０．０５〜１．０Ｍの直線濃度勾配溶出を行なっ
た。ポリフェノールオキシダーゼは０．１５’で溶出さ
れた。
活性は９００単位、回収率は３０％であった。
本精製酵素はディスク電気泳動に於いて単一のバンドを
与えた。
与えた。
第１図は、本発明の耐熱性ポリフェノールオキシダーゼ
の熱安定性を示すものである。 第２図は、本発明の耐熱性ポリフェノールオキシダーゼ
の至適−を示すものである。 第３図ｔよ、本発明の耐熱性ポリフェノールオキシダー
ゼの一安定性を示すものである。 第１図 ９υ ｂｕ ｂｏ ７０ ８０ ９０ °Ｃ第２図 ３．０ ４．０ ５．０ ６．０ ７．０ Ｂ、０第３
図 ３．０４．０ ５．０６．０７．０ Ｂ、０９．０１０
．０ ｐｉ（手続補正用 ２、発明の名称 耐熱性ポリフェノールオキシダーゼの製造法３、補正を
する者 事件との関係 特９′を出願人 住所 東京都中央区京橋−丁目５番８号！）、補正によ
り増加Ｊる発明の数 なし３、補正の対象 明細内の発
明の詳細な説明の欄７、補正の内容 明細四組２頁、下
から５行目のｒＦＥＲＭ−ＰＪをｒＦＥＲＭ−Ｐ ７２
３９Ｊと訂正しまず。 コ
の熱安定性を示すものである。 第２図は、本発明の耐熱性ポリフェノールオキシダーゼ
の至適−を示すものである。 第３図ｔよ、本発明の耐熱性ポリフェノールオキシダー
ゼの一安定性を示すものである。 第１図 ９υ ｂｕ ｂｏ ７０ ８０ ９０ °Ｃ第２図 ３．０ ４．０ ５．０ ６．０ ７．０ Ｂ、０第３
図 ３．０４．０ ５．０６．０７．０ Ｂ、０９．０１０
．０ ｐｉ（手続補正用 ２、発明の名称 耐熱性ポリフェノールオキシダーゼの製造法３、補正を
する者 事件との関係 特９′を出願人 住所 東京都中央区京橋−丁目５番８号！）、補正によ
り増加Ｊる発明の数 なし３、補正の対象 明細内の発
明の詳細な説明の欄７、補正の内容 明細四組２頁、下
から５行目のｒＦＥＲＭ−ＰＪをｒＦＥＲＭ−Ｐ ７２
３９Ｊと訂正しまず。 コ
Claims (1)
- ミリオコツカム属に属する耐熱性ポリフェノールオキシ
ダーゼ生産菌を培養し、その培養物から耐熱性ポリフェ
ノールオキシダーゼを採取することを特徴とする耐熱性
ポリフェノールオキシダーゼの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17000783A JPS6062980A (ja) | 1983-09-14 | 1983-09-14 | 耐熱性ポリフエノ−ルオキシダ−ゼの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17000783A JPS6062980A (ja) | 1983-09-14 | 1983-09-14 | 耐熱性ポリフエノ−ルオキシダ−ゼの製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6062980A true JPS6062980A (ja) | 1985-04-11 |
Family
ID=15896856
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP17000783A Pending JPS6062980A (ja) | 1983-09-14 | 1983-09-14 | 耐熱性ポリフエノ−ルオキシダ−ゼの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6062980A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5171681A (en) * | 1989-07-24 | 1992-12-15 | Toyo Jozo Kabushiki Kaisha | Omega-carboxyalcohol oxidase |
| US5238816A (en) * | 1989-07-24 | 1993-08-24 | Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha | Omega carboxyalcohol oxidase enzyme |
-
1983
- 1983-09-14 JP JP17000783A patent/JPS6062980A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5171681A (en) * | 1989-07-24 | 1992-12-15 | Toyo Jozo Kabushiki Kaisha | Omega-carboxyalcohol oxidase |
| US5238816A (en) * | 1989-07-24 | 1993-08-24 | Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha | Omega carboxyalcohol oxidase enzyme |
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