JPS62272973A - タンナ−ゼの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ３、発明の詳細な説明 〔産業上の利用分野〕 本発明はタンナーゼの製造法に関する。

タンナーゼは、例えば紅茶のクリームダウンの防止剤、
あるいはビール製造の際に清澄化に使用される等橿めて
有用な酵素である。

〔従来の技術〕

従来、タンナーゼの製造法としては、例えば粉砕された
タラの木の莢からメタノールを用いて抽出し、該抽出物
を噴霧乾燥したものを含む培地に、アスペルギルス・ニ
ガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）の変異株
を培養してタンナーゼを製造する方法が知られている〔
ジェイ、ファーメント、チクノル。

（Ｊ、　Ｆｅｒｍｅｎｔ、　Ｔｅｃｈｎｏｌ、）、　Ｖ
ｏｌ、５０．　Ｎｏ−６＋　ｐ、３６１〜３７０　（１
９７２））　。

〔発明が解決しようとする問題点〕

上記方法のような従来のタンナーゼの製造法によるとき
には、タンナーゼの収量は、まだ充分満足すべきもので
はない６本発明は、この問題を解決したもので、従来の
方法に比べて著しく収率よ（タンナーゼを製造する方法
を堤供することを目的とするものである。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者等は、上記問題を解決すべく種々検討した結果
、アスペルギルス属に属し、タンナーゼ生産能を有する
菌株を、タンニン含有植物体の極性溶媒抽出物を含み、
かつ培地中の金属イオン類を除去もしくは減少させるか
、又は該金属イオン類を錯体とした培地に培養すれば、
無処理の培地を用いた場合に比し、培養物中に著しく収
率よくタンナーゼが生産されること、また更に、上記培
地に亜鉛イオンを添加すれば、なお一層タンナーゼの収
率が向上すること等の知見を得、本発明を完成したので
ある。

すなわち、本発明は、アスペルギルス属に属しタンナー
ゼ生産能を有する微生物を、タンニン含有植物体の極性
溶媒抽出物を含み、かつ培地中の金属イオン類を除去も
しくは減少させるか、又は該金属イオン類を錯体とした
培地に培養し、培養物からタンナーゼを採取することを
特徴とするタンナーゼの製造法であり、また本発明は、
アスペルギルス属に属し、タンナーゼ生産能を有する微
生物を、タンニン含有植物体の極性溶媒抽出物及び亜鉛
イオンを含み、かつ培地中のその他の金属イオン類を除
去もしくは減少させるか、又は該金属イオン類を錯体と
した培地に培養し、培養物からタンナーゼを採取するこ
とを特徴とするタンナーゼの製造法である。

以下、本発明を具体的に説明する。

先ず、本発明に用いられる菌としては、７スベルギルス
属に属し、タンナーゼを生産する微生物であれば、如何
なる菌でもよ（、またこれらの菌の変種もしくは変異株
であってもよい。

そして、この微生物の具体例としては、例えばアスペル
ギルス・オリゼーＩＦＯ４２０６、アスペルギルス・フ
ラバスＩＡＭ　２１８４、アスペルギルス・ニガーＩ＾
ｉ’ｌ　２０９４等が挙げられる。

次に、タンナーゼ生産に使用される培地としては、タン
ニン含有植物体の極性溶媒抽出物を含み、かつ培地中の
金属イオン類を除去もしくは減少させるか、又は該金属
イオン類を錯体とし、更に必要により窒素源、炭素源、
無機物、ビタミン等より選択されたものを適量含存する
培地であれば、合成もしくは天然培地等如何なるもので
も使用可能である。

そしてタンニン含有植物体としては、タンニンを含む植
物体であれば、如何なるものでもよく、例えばタラの木
の莢、ウルシ科植物であるヌレデの樹皮および葉等が挙
げられる。これらタンニン含有植物体の極性溶媒抽出物
は、該植物体を、例えば通常の破砕手段により処理して
得られた破砕物から、例えば水、メタノール、エタノー
ル、酢酸エチル等の掻性溶媒を用いて、例えば温度６０
℃で１時間程度加熱処理し、常法により固液分離して得
ることができる。

そして培地へのタンニン含有植物体の極性溶媒抽出物の
添加量は、例えばタンニン濃度として、０．５％（Ｗ／
Ｖ）以上、好ましくは２〜５％（Ｗ／Ｖ）である。

培地の窒素源としては、例えばカゼイン、硝酸カリウム
、硝酸ナトリウム、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウ
ム、リン酸１アンモニウム、リン酸２アンモニウム、尿
素、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、メ
チオニン、トリプトファン等が挙げられる。

培地の炭素源としては、例えばアラビノース、グルコー
ス、マンノース、ラムノース、ソルボース、シェークロ
ース、キシロース、メリビオース、クリセロール、ラク
トース、マルトース、マンニラトール、ラフィノース、
澱粉、セロビオース、トレハロース等が挙げられ、無機
物としては、例えば硫酸マグネシウム、リン酸１カリウ
ム等が用いられる。

次に、培地中の金属イオン類を除去あるいは減少させる
には、例えば調製された培地を、陽イオン交換樹脂、例
えばダイヤイオン５ＫＩＢ　（三菱化成工業社製）、ダ
ウエックス５０Ｗ（米国、ダウケミカル社製）、デュオ
ライトＣＧ−１２０（米国、ダイアモンド・アルカリ社
製）、アンバーライトＩＲＣ−５０（米国、ローム・ア
ンド・バー入社製）　、Ｃ−１３２（栗田工業社製）等
と、回分式の場合には、例えば温度１０℃以上、好まし
くは２０〜５０℃で、そのままもしくは撹拌しつつ０．
５時間以上、好ましくは２〜３時間接触させ、また連続
式の場合には、例えば陽イオン交換樹脂の充填されたカ
ラムに流下速度２０ＳＶ以下、好ましくは５〜２ＳＶの
条件下で接触させることにより、培地中の金属イオンＭ
ｌ（主として、銅イオン、鉄イオン等）を除去あるいは
減少させることができる。そして他に培地中に金属イオ
ン類を添加あるいは水道水から混入されない限りは、金
属イオン類は、主としてタンニン含を植物体の極性溶媒
抽出物に由来するので、該抽出物を上記した陽イオン交
換樹脂で上記したと同様に処理してもよい。

また、培地中の金属イオン類を錯体とするには例えば培
地又は上記理由によりタンニン含有植物体の極性溶媒抽
出物にキレート剤、例えば０−フェナントロリン、α、
α−ジピリジル、２，４．６．−トリピリジル−３−）
リアジン等を、５１１ｆＺ１以上、好ましくは３０〜１
００■７１程度添加し、温度５℃以上、好ましくは２０
〜４０℃で、そのままもしくは攪拌しつつ０．５時間以
上、好ましくは１〜２時間程度反応させて、培地あるい
はタンニン含有植物体の極性溶媒抽出物中の金属イオン
類を錯体とすることができる。

なお、上記キレート剤は、そのまま使用してもよいが、
エタノール等の橿性溶媒に溶解して使用するのが好まし
い。

また、本発明では、タンニン含有植物体の極性溶媒抽出
物及び亜鉛イオン（例えば硫酸亜鉛、塩化亜鉛など）を
含み、かつ培地中のその他の金属イオン類を除去もしく
は減少させるか、又は該金属イオン！！±錯体とした培
地に、上記したタンナーゼ生産菌を培養すれば、更にな
お一層収率よくタンナーゼを生産することができる。

培地に含有させる亜鉛イオン濃度としては、０．０２■
／１以、上、好ましくは０．０５〜０．２　■／１であ
り、また亜鉛イオンを含有させる具体的手段としては、
例えば亜鉛イオンを培地に添加する方法などが挙げられ
る。

なお、培地中の亜鉛イオン以外の金属イオン類を除去も
しくは減少させることは、例えばユニセレックス（ユニ
チカ社製）、ＣＲ−１０（三菱化・成工業社製）などの
キレート樹脂などを使用することにより行なうこともで
きる。

本発明において、タンナーゼ生産菌の培養は、固体培養
法でもよいが、通常液体培養法を採用するのが有利であ
り、具体的には振盪培養、攪拌培養、通気培養等により
好気的に培養を行なう。

培養温度は、例えば通常２０〜４０℃、好ましくは２５
〜３５℃で、初発ｐＨは例えば５．５〜５．７、培養時
のｐＨは例えば５．５〜２．５、好ましくはｐｏｓ、。

〜３．５である。

このような培養条件下に、培養時間は培養形態によって
も異なるが、２日間以上、好ましくは３〜５日間程度培
養することにより、培養物中にタンナーゼが生産蓄積さ
れる。

培養終了後、該培養物よりタンナーゼを採取するには、
通常の酵素採取手段を用いて得ることができる０例えば
、培養物を濾過、遠心分離などして固形分を除去したも
のに、硫酸アンモニウム、アルコール、アセトン等を添
加して分画し、沈澱物を採取し、これを水に対して透析
し、粗酵素液を得るか、あるいはこれを真空乾燥して粗
酵素粉末を得る。

上記粗酵素もしくは粗酵素粉末より更に精製酵素標品を
得るには、例えばセファデックスＧ−２００等を用いる
ゲル濾過法、イオン交喚体、ハイドロキシアパタイト等
を用いる吸着溶出法、ショＩ！密度勾配遠心法等の沈降
法、アフィニティクロマトグラフィー法、分子ふるい膜
もしくは中空糸膜等を用いる分画法等を適宜選択し、組
み合わせて実施することにより精製されたタンナーゼ標
品を得ることができる。

上記精製手段により得られた精製タンナーゼの理化学的
性質は、アグル、パイオル、ケム、（＾ｇｒ。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、）、Ｖｏｌ、３２．　Ｎｏ、７
．　ｐ、　８０３〜８０９（１９６８）記載のタンナー
ゼの理化学的性質と全く同様である。

〔実施例〕

以下、本発明を実施例を挙げて具体的に説明する。

実施例 タラパウダー（ペルー国、エルソール社製）４−を温水
２４１に添加し、温度６０℃で１時間撹拌しつつタンニ
ンを抽出し、これを木綿布を用いて常法により圧搾して
濾液を得、更に、これを常法により９０００　ｒ、ｐ、
ｓ、で１５分間遠心分離処理して７．２％（Ｗ／Ｖ）の
タンニンを含有するタンニン溶液２０１を得た。

上記タンニン溶液１０２を、流速３ＳＶで、常法により
再生したダイヤイオン５ＫＩＢ強酸性陽イオン交換樹脂
（三菱化成工業社製）の充填されたカラム（４Ｘ５０ｃ
ｍ）に通じて金属イオン類の除去もしくは減少された７
、０％（Ｗ／Ｖ）のタンニンを含有するタンニン溶液を
得た。

次いで、このようにして調製されたタンニン溶液を用い
、グルコース１％（Ｗ／Ｖ）　、リン酸ｌアンモニウム
１．４　％（Ｗ／Ｖ）　、リン酸１カリウム０．２％（
Ｗ／Ｖ）　、硫酸マグネシウム７水和物０．１　％（Ｗ
／Ｖ）及びタンニン３％（Ｗ／Ｖ）（ｐＨ５，７０）か
らなる組成の培地を調製し、そのうち５０１を５００−
１容坂ロフラスコに分注し、また上記組成の培地に更に
硫酸亜鉛７水和物を０．２ｍｇ／ｊとなる如く添加した
培地５０ｍ１を上記フラスコに分注したものに、夫々温
度１２０℃で圧力Ｉｋｇ／ｃ＋Ｊ（ゲージ圧力）の飽和
水蒸気を５分間作用させ、殺菌処理された培地２区分を
得た（本発明区分）。

なお、上記培地の調製に使用した水は蒸留水を用い、以
下の培地の調製にも蒸留水を使用した。

一方、上記強酸性陽イオン交換樹脂処理を全く施さない
タンニン溶液を用いて上記組成の培地を調製し、これに
キレート剤としてＯ−フェナントロリンを３０■／１と
なる如く添加し、上記したと同様に殺菌処理し、殺菌さ
れた培地を得た（本　　。

発明区分）。

また、対照区分として、上記の処理を全（施さないタン
ニン溶液を用いて上記組成の培地を調製し、上記したと
同様に殺菌処理して殺菌された培地をつくった。

このようにして得た本発明３区分及び対照区分の培地に
、夫々麹汁寒天斜面培地を用いて前培養して得たアスペ
ルギルス・オリゼーＩＦＯ４２０６を１白金耳ずつ接種
し、温度３０℃で９６時間振盪培養（１４０ｒ、ｐ、ｓ
、　７分）し、培養液を得た。

上記培養液を夫々常法により１２０００ｒ、ｐ、ｍ。

で１５分間遠心分離処理して上澄液を得、該液中のタン
ナーゼ活性を、ニス、イイプチ、ワイ、ミノダ及びケイ
、ヤマダ（Ｓ、ｌ１ｂｕｃｈｉ、Ｙ、Ｍｉｎｏｄａ　ａ
ｎｄに、’ｌａｍａｄａ＞　：＾ｇｒＬｃ、　　Ｂｉｏ
ｌ、　　Ｃｈｅｗ、　　　Ｖｏｌ、３１．　　Ｎｏ、５
゜ｐ、５１３〜５１８　（１９６７）記載の方法と同様
にして測定して得た結果を夫々下記第１表に示した。

上記のような培養操作を繰り返して得られた培養液９１
を、夫々常法により吸引濾過し菌体を濾別して濾液を得
、これにセライト（和光純薬工業社製）５・ＱＯｇを添
加し、充分混和させたのち、再び常法により吸引濾過し
て清澄化したものに、夫々硫酸アンモニウムを０．８１
＆和となる如（添加して沈澱物を生成させ、常法により
９０００ｒ、ｐｏｍ、で１５分間遠心分離処理して沈澱
物を得た。

該沈澱物を５００ｍ１の蒸留水に溶解したものを常法に
より１２０００ｒ、ｐ、＋ｗ、で１５分間遠心分離処理
して不溶物を除去して得た上滑液を、５℃で２４時間常
法により透析して透析物を得た。この透析物を、再びＯ
，０１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ５，０）中で透析して得
た試料を、同緩衝液で平衡化済みのＤＥＡＲセファデッ
クスＡ−５０（ファルマシア・ファインケミカル社製）
の充填されたカラム（４ＸｌＯｃｓ）に通じ、更に２０
０ｏ＋１の同緩衝液で上記カラムを洗浄したのち、上記
樹脂に吸着されたタンナーゼを０．０１Ｍクエン酸緩衝
液（ｐＨ５，０）中の塩化ナトリウム０〜ＩＭ迄の直線
的濃度勾配溶出法で溶出してタンナーゼ活性を有するフ
ラクションを集め、これを０．０１　Ｍクエン酸緩衝液
（ｐＨ３，５）中で透析して透析物を得た。

更にこの透析物を、同クエン酸緩衝液で平衡化済みのＳ
ＰセファデックスＣ−５０（ファルマシア・ファインケ
ミカル社製）の充填されたカラム（２，６ｘ　２０　ａ
ｌ）に通じ、同クエン酸緩衝液１００ｍ１を用いて洗浄
し、樹脂に吸着されたタンナーゼを、０．０１Ｍクエン
酸緩衝液（ｐＨ３，５）中の塩化ナトリウム０〜０．２
５Ｍの直線的濃度勾配溶出法で溶出し、タンナーゼ活性
区分を採取する操作を２度繰り返してタンナーゼ活性区
分を得た。

次いで、得られたタンナーゼ活性区分を限外濾過膜（ア
ミコン・ファー・イースト・リミテッド社製、分画分子
量５０．　　ＯＯＯ）及びコロジオンバンク（ザートリ
エース社製）を順次用いて２ｇ＋１迄濃縮したものを、
０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ５，０）で平衡化済みの
セファデックスＧ−２００（ファルマシア・ファインケ
ミカル社製）の充填されたカラム（２，６Ｘ　１００　
ｃｍ）を用いてゲル濾過し、タンナーゼ活性区分を採取
し、更に同一条件下でゲル濾過して得た精製タンナーゼ
の重量及び比活性を夫々下記第１表に示した。

第１表から、本発明区分は、対照区分に比較して、著し
くタンナーゼの収量が増加すること、また亜鉛イオン含
を陽イオン交換樹脂処理培地を用いた場合には、亜鉛イ
オンを含有しない陽イオン交換樹脂処理培地を用いた場
合に比し、なお一層タンナーゼの収量が増加することが
わかる。

〔発明の効果〕

上述した如く本発明によれば、著しく収率よくかつ短時
間のうちにタンナーゼを得ることができるので、本発明
は産業上極めて有用である。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）アスペルギルス属に属し、タンナーゼ生産能を有
   する微生物を、タンニン含有植物体の極性溶媒抽出物を
   含み、かつ培地中の金属イオン類を除去もしくは減少さ
   せるか、又は該金属イオン類を錯体とした培地に培養し
   、培養物からタンナーゼを採取することを特徴とするタ
   ンナーゼの製造法。
2. （２）アスペルギルス属に属し、タンナーゼ生産能を有
   する微生物を、タンニン含有植物体の極性溶媒抽出物及
   び亜鉛イオンを含み、かつ培地中のその他の金属イオン
   類を除去もしくは減少させるか、又は該金属イオン類を
   錯体とした培地に培養し、培養物からタンナーゼを採取
   することを特徴とするタンナーゼの製造法。