JPH0518552B2 - - Google Patents
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- JPH0518552B2 JPH0518552B2 JP23698684A JP23698684A JPH0518552B2 JP H0518552 B2 JPH0518552 B2 JP H0518552B2 JP 23698684 A JP23698684 A JP 23698684A JP 23698684 A JP23698684 A JP 23698684A JP H0518552 B2 JPH0518552 B2 JP H0518552B2
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Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
ポリフエノールオキシダーゼはフエノラーゼ、
チロシナーゼ、ラツカーゼ、クレヅラーゼ、カテ
コールオキシダーゼ等種々の名前で呼ばれており
ｏ−ジフエニールをｏ−キノンに酸化する酵素で
ある。
チロシナーゼ、ラツカーゼ、クレヅラーゼ、カテ
コールオキシダーゼ等種々の名前で呼ばれており
ｏ−ジフエニールをｏ−キノンに酸化する酵素で
ある。
フエノール類を含む植物又は動物の組織の破砕
物又は抽出液に当該酵素を作用させると粘度上
昇、固化、被膜形成等の物性の変化が起る。また
味の変化も起る場合もある。具体的な応用の可能
な例としてはウルシの固化促進剤、紅茶やココア
の製造への利用等を挙げることができるが、他の
種々の食品加工への応用の可能性がある。特に高
い温度においても安定な酵素の産業上での利用範
囲は広い。
物又は抽出液に当該酵素を作用させると粘度上
昇、固化、被膜形成等の物性の変化が起る。また
味の変化も起る場合もある。具体的な応用の可能
な例としてはウルシの固化促進剤、紅茶やココア
の製造への利用等を挙げることができるが、他の
種々の食品加工への応用の可能性がある。特に高
い温度においても安定な酵素の産業上での利用範
囲は広い。
従来、植物、動物、微生物にポリフエノールオ
キシダーゼの存在が知られているがいずれも不安
定であり、更に活性も低いという欠点を有してお
り、食品加工等への応用はなされていないのが現
状である。
キシダーゼの存在が知られているがいずれも不安
定であり、更に活性も低いという欠点を有してお
り、食品加工等への応用はなされていないのが現
状である。
従来より知られているポリフエノールオキシダ
ーゼは上述したように不安定であり、例えば高温
糸状菌として採取されたミリオコツカム・アルボ
ミセス（AJ117121）FERM−P7239のポリフエ
ノールオキシダーゼ（特願昭58−17007）の活性
の至適温度は40℃であり、酵素処理における雑菌
の夾雑を防ぐためには更に高温に至適を持つ酵素
を見出だす必要がある。更に短時間で酵素処理す
るためには従来以上に高い活性をもつ酵素製剤が
望まれる。
ーゼは上述したように不安定であり、例えば高温
糸状菌として採取されたミリオコツカム・アルボ
ミセス（AJ117121）FERM−P7239のポリフエ
ノールオキシダーゼ（特願昭58−17007）の活性
の至適温度は40℃であり、酵素処理における雑菌
の夾雑を防ぐためには更に高温に至適を持つ酵素
を見出だす必要がある。更に短時間で酵素処理す
るためには従来以上に高い活性をもつ酵素製剤が
望まれる。
本発明者等は上述の事情に鑑み、利用範囲も広
く高温に至適温度を示し、活性の高いポリフエノ
ールオキシダーゼを得るべく広く自然界より検索
した結果、高温糸状菌の一菌株が高温に至適温度
を示すポリフエノールオキシダーゼを生産するこ
とを見い出し、本菌を液体培養又は固体培養する
事によりポリフエノールオキシダーゼを生成さ
せ、これを精製することにより効率よく高純度で
高温で活性を示すポリフエノールオキシダーゼを
製造する方法を完成した。
く高温に至適温度を示し、活性の高いポリフエノ
ールオキシダーゼを得るべく広く自然界より検索
した結果、高温糸状菌の一菌株が高温に至適温度
を示すポリフエノールオキシダーゼを生産するこ
とを見い出し、本菌を液体培養又は固体培養する
事によりポリフエノールオキシダーゼを生成さ
せ、これを精製することにより効率よく高純度で
高温で活性を示すポリフエノールオキシダーゼを
製造する方法を完成した。
本発明に使用するムコール・メイヘイは
Donald Ｇ，Cooney Ralph，Emerson著の“サ
ーモフイリツク フアンジアイ”アン アカウン
ト オブ ゼア バイオログル．アクテイビ テ
イーズ アンド クラスフイケーシヨン、（ダブ
リユ．エイチ フリーマン アンド カンパニ
ー）、 （“Thermophilic Fungi”an account of
their biologr.Activities and Classification，
（W.H Freeman and Company））に従い検索、
同定されたものでありFERM−P7923として寄託
されている。
Donald Ｇ，Cooney Ralph，Emerson著の“サ
ーモフイリツク フアンジアイ”アン アカウン
ト オブ ゼア バイオログル．アクテイビ テ
イーズ アンド クラスフイケーシヨン、（ダブ
リユ．エイチ フリーマン アンド カンパニ
ー）、 （“Thermophilic Fungi”an account of
their biologr.Activities and Classification，
（W.H Freeman and Company））に従い検索、
同定されたものでありFERM−P7923として寄託
されている。
次に本発明に於いて本菌株を培養し耐熱性ポリ
フエノールオキシダーゼを採取する詳細について
述べる。
フエノールオキシダーゼを採取する詳細について
述べる。
培養法は通常行なわれる液体培養法でも固体培
養法でも良く、培養温度を40〜60℃で１〜10日間
振盪又は静置培養すれば良い。
養法でも良く、培養温度を40〜60℃で１〜10日間
振盪又は静置培養すれば良い。
液体培養培地では炭素源としてグルコース、シ
ユクロース、澱粉有機酸など、窒素源としてペプ
トン、イーストエキス、（NH4）2SO4、NH4NO3
など、無機塩としてKH2PO4、K2HPO4、
MgSO4、CaCl2など、その他必要に応じてZn、
Fe、Cu、Mnなどの微量金属やポリフエノ
ール類を適宜添加する。
ユクロース、澱粉有機酸など、窒素源としてペプ
トン、イーストエキス、（NH4）2SO4、NH4NO3
など、無機塩としてKH2PO4、K2HPO4、
MgSO4、CaCl2など、その他必要に応じてZn、
Fe、Cu、Mnなどの微量金属やポリフエノ
ール類を適宜添加する。
固体培養には皴を用い、必要に応じ無機塩類や
ポリフエノール類を添加する。
ポリフエノール類を添加する。
この様な方法で得られた培養物よりフエノール
オキシダーゼを採取するには液体培養の場合には
除菌液、固体培養の場合には水抽出液を得、まず
硫安塩析又はアセトン、アルコール等による溶媒
沈澱により粗酵素を得ることが出来る。
オキシダーゼを採取するには液体培養の場合には
除菌液、固体培養の場合には水抽出液を得、まず
硫安塩析又はアセトン、アルコール等による溶媒
沈澱により粗酵素を得ることが出来る。
さらに高度な精製標品を得るには限外濾過、ゲ
ル濾過クロマト、吸着クロマト、イオン交換クロ
マト又は等電点分画などの手法又はこれ等を組み
合せることにより精製することが出来る。
ル濾過クロマト、吸着クロマト、イオン交換クロ
マト又は等電点分画などの手法又はこれ等を組み
合せることにより精製することが出来る。
この様にして精製されたムコール・ミエヘイ
AJ117120FERM−P7923の酵素の理化学的性質
は次の通りである。
AJ117120FERM−P7923の酵素の理化学的性質
は次の通りである。
１ 至適温度、第１図に示す
25〜70℃で酵素活性を測定した結果、50℃に
最高の活性がみられた。
最高の活性がみられた。
２ 熱安定性、第２図に示す。
0.05Mリン酸緩衝液（PH5.0）中で40〜65℃、
５分間処理し、各温度に於ける残存活性は第１
図に示す様にきわめて優れた安定性を示した。
５分間処理し、各温度に於ける残存活性は第１
図に示す様にきわめて優れた安定性を示した。
３ 至適PH、第３図に示す。
マツクベイン緩衝液中での至適PHは5.0附近
である。
である。
４ PH安定性、第４図に示す。
マツクベイン緩衝液中、30℃、24時間放置し
たがPH4.0〜10.0間で安定であつた。
たがPH4.0〜10.0間で安定であつた。
５ 基質特異性
基 質 相対活性
フエノール ０
グアイアコール ０
パラハイドロキシキノン 1.1
オルトフエニレンジアミン 1.7
ピロガロール ０
ピロカテコール 3.4 NNジメチルパラフエニレンジアミン 100.0
活性測定はフエノール；Kind−King変法、
他の基質については各々の吸収値（グアイアコ
ール436ｍμ、パラハイドロキノン250ｍμ、オ
ルトフエニレンジアミン、440ｍμ、ピロガロ
ール、437ｍμ、ピロカテコール、395ｍμ、
NNジメチルパラフエニレンジアミン、550ｍ
μ）の酸化による変化より算出し、NNジメチ
ルパラフエニレンジアミンに対する活性を100
とした時の相対値で示した。
他の基質については各々の吸収値（グアイアコ
ール436ｍμ、パラハイドロキノン250ｍμ、オ
ルトフエニレンジアミン、440ｍμ、ピロガロ
ール、437ｍμ、ピロカテコール、395ｍμ、
NNジメチルパラフエニレンジアミン、550ｍ
μ）の酸化による変化より算出し、NNジメチ
ルパラフエニレンジアミンに対する活性を100
とした時の相対値で示した。
本酵素はモノフエノール類にはほとんど作用
しない酵素と考えられる。
しない酵素と考えられる。
６ 分子量
セフアデツクスＧ−100を用いたゲル濾過法
により分子量約４万と測定された。
により分子量約４万と測定された。
７ 単一性
デイスク電気泳動（５ｍＡ／ゲル）により原
点から３cmの位置に単一のバンドを与えた。
点から３cmの位置に単一のバンドを与えた。
活性測定法
Ravinの方法（H.A Ravin；Lancet、726、
1956）に従い、基質としてNNジメチルパラフエ
ニレンジアミンを用いて行なつた。
1956）に従い、基質としてNNジメチルパラフエ
ニレンジアミンを用いて行なつた。
酵素液１mlにNNジメチルパラフエニレンジア
ミン１ｍＭ溶液2.5mlを加え37℃、60分反応し550
ｍμの吸光度を測定した。酵素単位は550ｍμの
吸光度を上記条件下で1.0増加させる活性を１単
位とした。
ミン１ｍＭ溶液2.5mlを加え37℃、60分反応し550
ｍμの吸光度を測定した。酵素単位は550ｍμの
吸光度を上記条件下で1.0増加させる活性を１単
位とした。
以上の結果から高温糸状菌ムコール・ミエヘイ
AJ117120FERM−P7923の生産するポリフエノ
ールオキシダーゼは安定性大なる酵素であり、従
来より知られているポリフエノールオキシダーゼ
よりも高い温度に最大活性を示す点より、より実
用化に適する酵素と言える。
AJ117120FERM−P7923の生産するポリフエノ
ールオキシダーゼは安定性大なる酵素であり、従
来より知られているポリフエノールオキシダーゼ
よりも高い温度に最大活性を示す点より、より実
用化に適する酵素と言える。
次に本発明を実施例により詳述する。
実施例 １
可溶性澱粉1.5％、NH4NO30.5％、イーストエ
キス0.4％、KH2PO40.1％、MgSO4・7H2O0.05
％、ジメチルアニリン0.005％、PH6.0の培地100
mlを500ml容肩付フラスコに入れ120℃にて15分間
オートクレーブ殺菌した。
キス0.4％、KH2PO40.1％、MgSO4・7H2O0.05
％、ジメチルアニリン0.005％、PH6.0の培地100
mlを500ml容肩付フラスコに入れ120℃にて15分間
オートクレーブ殺菌した。
これに市販ポテトデキストロース・アガー、
（栄研）斜面培地で45℃、３日間前培養したムコ
ール・ミエヘイAJ117120FERM−P7923を接種
し45℃、２日間振盪培養した。
（栄研）斜面培地で45℃、３日間前培養したムコ
ール・ミエヘイAJ117120FERM−P7923を接種
し45℃、２日間振盪培養した。
培養後の上清のポリフエノールオキシダーゼ活
性は4.5単位／mlであつた。
性は4.5単位／mlであつた。
実施例 ２
皴100ｇにZnSO4・7H2O6.2mg／、FeSO4・
5H2O6.3mg／、CuSO4・5H2O0.8mg／、
MnSO4・7H2O6.3mg／を含む無機塩水60ｇを
加え、１容三角形フラスコに入れ120℃にて30
分間オートクレーブ殺菌した。
5H2O6.3mg／、CuSO4・5H2O0.8mg／、
MnSO4・7H2O6.3mg／を含む無機塩水60ｇを
加え、１容三角形フラスコに入れ120℃にて30
分間オートクレーブ殺菌した。
これに実施例１と同様前培養したムコール・ミ
エヘイAJを接種しよく撹拌後45℃で５日間時々
撹拌し静置培養する。培養終了後100mlの水を加
え４℃、30分間放置抽出する。抽出上清のポリフ
エノールオキシダーゼ活性は8.0単位／mlであつ
た。
エヘイAJを接種しよく撹拌後45℃で５日間時々
撹拌し静置培養する。培養終了後100mlの水を加
え４℃、30分間放置抽出する。抽出上清のポリフ
エノールオキシダーゼ活性は8.0単位／mlであつ
た。
実施例 ３
実施例２で得られた抽出上清１（8000単位）
に硫酸アンモニウム114Kg（20％飽和）を加え撹
拌溶解し生成した沈澱を10000rpm、10分で遠心
除去する。得られた上清硫酸アンモニウムをさら
に189Kg加え（50％飽和となる）撹拌溶解後生成
した沈澱を10000rpm、10分遠心分離した。得ら
れた沈澱を0.05Mリン酸緩衝液PH5.5に溶解し同緩
衝液で１夜透析した。
に硫酸アンモニウム114Kg（20％飽和）を加え撹
拌溶解し生成した沈澱を10000rpm、10分で遠心
除去する。得られた上清硫酸アンモニウムをさら
に189Kg加え（50％飽和となる）撹拌溶解後生成
した沈澱を10000rpm、10分遠心分離した。得ら
れた沈澱を0.05Mリン酸緩衝液PH5.5に溶解し同緩
衝液で１夜透析した。
この透析液を0.05Mリン酸緩衝液で平衡化した
DEAE−セフアデツクスＡ−50（3.2×3.2cm）に吸
着後、同緩衝液の０〜0.8MNaClの直線濃度勾配
溶出を行なつた（回収率95％）。
DEAE−セフアデツクスＡ−50（3.2×3.2cm）に吸
着後、同緩衝液の０〜0.8MNaClの直線濃度勾配
溶出を行なつた（回収率95％）。
活性フラクシヨンを集め0.05Mリン酸緩衝液PH
6.0に対し透析した。透析後0.05Mリン酸緩衝液PH
5.5で平衡化したハイドロキシアパタイト、カラ
ム（1.5×30cm）に吸着せしめ、同緩衝液0.05〜
1.0Mの直線濃度勾配溶出を行なつた。
6.0に対し透析した。透析後0.05Mリン酸緩衝液PH
5.5で平衡化したハイドロキシアパタイト、カラ
ム（1.5×30cm）に吸着せしめ、同緩衝液0.05〜
1.0Mの直線濃度勾配溶出を行なつた。
活性画分を集め一夜透析後DEAE−Sephadex
Ａ−50（2.0×30cm）に吸着せしめ、同緩衝液を含
む０〜0.5MNaClで濃度勾配溶出を行つた。活性
画分を集め、Sephadex Ｇ−200（1.8×64cm）に
よりゲル濾過し、活性画分をCon Ａ−
Sepharoseに吸着後０〜10％メチル−α−Ｄ−マ
ンノピラノサイドにて溶出した。活性画分を濃縮
後更にSephacryl Ｓ−400（1.8×64cm）を用いて
クロマトを行つて精製酵素標品を得た。全活性
800単位、回収率10％であつた。
Ａ−50（2.0×30cm）に吸着せしめ、同緩衝液を含
む０〜0.5MNaClで濃度勾配溶出を行つた。活性
画分を集め、Sephadex Ｇ−200（1.8×64cm）に
よりゲル濾過し、活性画分をCon Ａ−
Sepharoseに吸着後０〜10％メチル−α−Ｄ−マ
ンノピラノサイドにて溶出した。活性画分を濃縮
後更にSephacryl Ｓ−400（1.8×64cm）を用いて
クロマトを行つて精製酵素標品を得た。全活性
800単位、回収率10％であつた。
本精製酵素はデイスク電気泳動に於いて単一の
バンドを与えた。
バンドを与えた。
第１図は、本発明の耐熱性ポリフエノールオキ
シダーゼの至適温度を示すものである。第２図
は、本発明の耐熱性ポリフエノールオキシダーゼ
の熱安定性を示すものである。第３図は、本発明
の耐熱性ポリフエノールオキシダーゼの至適PHを
示すものである。第４図は、本発明の耐熱性ポリ
フエノールオキシダーゼのPH安定性を示すもので
ある。
シダーゼの至適温度を示すものである。第２図
は、本発明の耐熱性ポリフエノールオキシダーゼ
の熱安定性を示すものである。第３図は、本発明
の耐熱性ポリフエノールオキシダーゼの至適PHを
示すものである。第４図は、本発明の耐熱性ポリ
フエノールオキシダーゼのPH安定性を示すもので
ある。
Claims (1)
- １ ムコール属に属する耐熱性ポリフエノールオ
キシダーゼ生産菌を培養し、その培養物から耐熱
性ポリフエノールオキシダーゼを採取することを
特徴とする耐熱性ポリフエノールオキシダーゼの
製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP23698684A JPS61115488A (ja) | 1984-11-09 | 1984-11-09 | 耐熱性ポリフエノ−ルオキシダ−ゼの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP23698684A JPS61115488A (ja) | 1984-11-09 | 1984-11-09 | 耐熱性ポリフエノ−ルオキシダ−ゼの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61115488A JPS61115488A (ja) | 1986-06-03 |
| JPH0518552B2 true JPH0518552B2 (ja) | 1993-03-12 |
Family
ID=17008696
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP23698684A Granted JPS61115488A (ja) | 1984-11-09 | 1984-11-09 | 耐熱性ポリフエノ−ルオキシダ−ゼの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61115488A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8409477B2 (en) | 2007-09-27 | 2013-04-02 | Mitsubishi Materials Corporation | ZnO vapor deposition material, process for producing the same, and ZnO film |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU8219801A (en) * | 2000-08-15 | 2002-02-25 | Valtion Teknillinen | A method for treating proteinaceous fibres |
| BR112023003136A2 (pt) | 2020-09-08 | 2023-04-04 | Curie Co Inc | Composições e métodos de uso das mesmas |
-
1984
- 1984-11-09 JP JP23698684A patent/JPS61115488A/ja active Granted
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8409477B2 (en) | 2007-09-27 | 2013-04-02 | Mitsubishi Materials Corporation | ZnO vapor deposition material, process for producing the same, and ZnO film |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS61115488A (ja) | 1986-06-03 |
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