JP3774581B2

JP3774581B2 - 熱安定性酵素およびその製造方法

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Publication number: JP3774581B2
Application number: JP34321298A
Authority: JP
Inventors: 良一蓑島; 世里子遠藤
Original assignee: Nisshin Oillio Group Ltd
Current assignee: Nisshin Oillio Group Ltd
Priority date: 1998-12-02
Filing date: 1998-12-02
Publication date: 2006-05-17
Anticipated expiration: 2018-12-02
Also published as: JP2000166549A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は脂質分解酵素の熱安定性に係る。詳しくは脱イオン処理が施された酵素溶液に金属塩を添加することで酵素の熱安定化を図ると共に、安定的な酵素製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
酵素は温和な条件で触媒反応を行うことができ、また、化学反応と比較して基質特異性が高い等により、近年、食品工業、化学工業、医薬品工業等の分野で酵素の利用範囲が拡大してきている。一般に酵素は不安定なものであり、特に溶液中での酵素の安定性は低い。したがって、酵素の濃縮粉末化法としては、熱がかかりにくい凍結乾燥法、真空乾燥法等が主に利用されてきている。しかしながら、これらの乾燥法では、大量生産のための設備投資が莫大になったり、ユーテリテイー等のランニングコストが高くなってしまったりして、産業分野で利用するのは問題がある。
また、酵素の中でも、多くの油脂関連酵素は水溶液中で約３５℃を超えると、熱変性が起こり始め、安定的な収率の高い酵素の工業生産は困難になる。したがって、低い温度域での酵素液の処理が必要となり、濃縮・粉末化法が上記の方法に限定されることになる。そこで、これまで酵素の水溶液中での熱安定性を向上させるため、安定化剤の添加等が試みられてきた。例えば、酵素溶液にアルブミン、カゼイン等の蛋白質、グルタミン酸ソーダ等のアミノ酸、メルカプトエタノール、システイン等の還元剤、グリセロール、ショ糖、ソルビトール等のポリオール類、デキストラン等の水溶性高分子物質等を酵素安定化剤として添加する方法などは一般的に検討されてきた。特開平６−２８４８８６公報には、酵素の溶液中での安定化方法として、リポプロテインリパーゼ溶液にマグネシウムイオンおよびカルシウムイオンを添加することが、また、特表平８−５０００１３公報には、シュードモナス属リパーゼ水溶液中にリパーゼの量に対して少なくも化学理論的に当量の二価陽イオンを添加することが報告されている。しかしながら、これらの方法では、脂質分解酵素の水溶液中の熱安定性は３７℃〜８０℃程度が限界であり、融点が高い基質を用いる酵素合成等への応用は困難であった。また、代表的な乾燥法である噴霧乾燥による酵素の粉末化法においても、加熱濃縮を経て熱気流中で乾燥されるため、噴霧乾燥では酵素活性の低下が生じるという欠点を有していた。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、酵素の熱安定性を高め、高温での反応を行うことが可能な脂質関連酵素を提供するとともに、粉末化法においても、熱による失活が起こり難く、安定的に酵素粉末を生産ができる製造方法を提供することである。
【０００４】
【発明が解決するための手段】
本発明者らは上記課題を達成するために、鋭意検討を重ねた結果、脂質分解酵素溶液を脱イオンした後、鉄塩およびカルシウム塩を添加することで、酵素の熱安定性が飛躍的に向上することを見出し、本発明を完成した。
すなわち、金属の含有量が０．５重量％以下である脂質分解酵素に、鉄塩およびカルシウム塩を添加することを特徴とする、熱安定性酵素に関する。上記脂質分解酵素は脱イオン処理が施されていることが好ましい。また、鉄塩が酵素の重量に対して０．０１〜５０重量％、カルシウム塩が酵素の重量に対して０．０１〜７０重量％であることが好ましい。
また本発明は、鉄塩およびカルシウム塩を含む脂質分解酵素溶液を噴霧乾燥して酵素粉末を得る酵素の製造法に関する。
【０００５】
【発明の実施の形態】
以下本発明を詳しく説明する。本発明は、脱イオンした脂質分解酵素溶液に、鉄塩およびカルシウム塩を添加することによる酵素の熱安定化方法と加熱乾燥方法による粉末化においても熱による酵素失活が起こり難くい酵素粉末生産ができる脂質分解酵素の製造方法である。
【０００６】
本発明に用いる脂質分解酵素は特に限定されるものではないが、市販の酵素製剤、微生物培養液、植物抽出液、動物細胞抽出液、動物細胞抽出液等が利用でき、さらに、培養液、抽出液の濃縮液等も利用できる。
【０００７】
脂質分解酵素としては、リパーゼ類、フォスフォリパーゼ類、エステラーゼ類等があげられる。リパーゼ類は、リポプロテインリパーゼ、モノアシルグリセロリパーゼ、ジアシルグリセロリパーゼ、トリアシルグリセロリパーゼ、ガラクトリパーゼ等があげられる。フォスフォリパーゼ類は、リゾフォスフォリパーゼ、フォスフォリパーゼＡ１，Ａ２，Ｂ，Ｃ，Ｄ等があげられる。エステラーゼ類は、コリンエステラーゼ、コレステロールエステラーゼ、ペクチンエステラーゼ、トロピンエステラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、アセチルエステラーゼ、カルボキシエステラーゼ、アリルエステラーゼ等があげられる。
【０００８】
本発明で使用される微生物は、細菌、酵母、糸状菌、放線菌等特に限定されるものではないが、シュードモナス属（Psudomonas sp.）、アルカリゲネス属（Alcaligenes sp.）、アスロバクター属（Arthrobacter sp.）、スタフィロコッカス属（Staphylococcus sp.）、トルロプシス属（Torulopsis sp.）、エスチエリシア属（Escherichia sp.）、マイコトルラ属（Micotorula sp.）、プロピオニバクテリウム属（Propionibacterum sp.）、クロモバクテリウム属（Chromobacterum sp.）、キサントモナス属（Xanthomonas sp.）、クロストリデイウム属（Clostridium sp.）、キャンデイダ属（Candida sp.）、ジオトリカム属（Geotrichum sp.）、サッカロマイコプシス属（Sacchromycopsis sp.）、ノカルデイア属（Nocardia sp.）、フザリウム属（Fuzarium sp.）、アスペルギルス属（Aspergillus sp.）、ペニシリウム属（Penicillum sp.）、ムコール属（Mucor sp.）、リゾプス属（Rhizopus sp）、フィコマイセス属（Phycomycese sp.）、プチニア属（Puccinia sp.）、バチルス属（Bacillus sp.）、ストレプトマイセス属（Streptmycese sp.）等があげられる。
【０００９】
リパーゼ生産用培地としては、特に限定されるものではないが、好ましくは、大豆粉、ペプトン、コーン・ステープ・リカー、Ｋ₂ＨＰＯ₄、（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ等が使用できる。添加量については、大豆粉は０．１〜２０重量％、好ましくは１．０〜１０．０重量％である。ペプトンは０．１〜３０重量％、好ましくは０．５〜１０重量％である。コーン・ステープ・リカーは０．１〜３０重量％、好ましくは０．５〜１０．０重量％である。Ｋ₂ＨＰＯ₄は０．０１〜２０重量％、好ましくは０．１〜５重量％である。（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄は０．０１〜２０重量％、好ましくは０．０５〜５重量％である。ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏは０．０１〜２０重量％、好ましくは０．０５〜５重量％である。培養条件については、培養温度は１０〜４０℃、好ましくは２０〜３５℃である。通気量は０．１〜２．０VVM、好ましくは０．１〜１．０VVMである。攪拌回転数は１００〜８００rpm、好ましくは２００〜４００rpmである。ｐＨは３．０〜１０．０、好ましくは４．０〜９．５である。
【００１０】
酵素の抽出方法は特に限定されるものではないが、菌体外分泌酵素の場合は、菌体を遠心分離、膜濾過などで除去することが好ましい。遠心分離は２００〜２０，０００×ｇ、膜濾過はＭＦ膜、フィルタープレスなどで圧力を３．０kg／ｍ²以下にコントロールするのが好ましい。菌体内酵素の場合は、ホモジナイザー、ワーリングブレンダー、超音波破砕、フレンチプレス、ボールミル等で細胞破砕し、遠心分離、膜濾過などで細胞残さを除去することが好ましい。ホモジナイザーは５００〜３０，０００rpm、好ましくは１，０００〜１５，０００rpmである。ワーリングブレンダーは５００〜５，０００rpm、０．５〜１０分、好ましくは１００〜１０，０００rpm、１〜５分である。超音波破砕は１〜５０KHz、好ましくは１０〜２０KHzである。ボールミルは直径０．１〜０．５mm程度のガラス製小球を用いるのが好ましい。
【００１１】
本発明の金属とは、元素周期表における金属元素を言い、水素を除くＩ族、ＩＩ族、ホウ素を除くＩＩＩ族、炭素とケイ素を除くＩＶ族、ＶＩＩＩ族およびＶ，ＶＩ，ＶＩＩ族の各ａ亜族に属する元素である。このほかアンチモン、ビスマス、ポロニウム等もあげられる。
脱イオン処理とは、具体的には酵素の溶液から金属イオンを除去あるいは低減することで、結果として脂質分解酵素中の金属の含有量の低減が図られる。除去する金属の種類はいずれでもよく、低減する割合が問題となる。すなわち、脱イオン処理後の酵素に残存する金属は０．５重量％以下であり、好ましくは０．２５重量％以下であり、特に好ましくは０．０５重量％以下である。０．５重量％を越えて金属が存在すると、鉄塩およびカルシウム塩を添加しても熱安定性酵素を得ることはできない。
酵素の脱イオンの方法としては、特に限定されるものではないが、半透膜、異方性膜等の膜を用いた分子量分画による方法、ＥＤＴＡによる金属塩の析出法、分子篩クロマトグラフィー法、電気透析法等があげられる。半透膜の材質としては、セロハン膜、コロジオン膜、セルロースアセテート膜等があげられる。また、異方性膜の材質としては、高分子電解質、ポリサッカライド、セルローストリアセテート、セルロースアセテート、セルロースナイトレート、ポリアクリルニトリル、ポリフッ化ビニリデンポリアミド、ポリフッ化ビニリデン系等があげられる。膜は平膜、中空繊維膜等があげられる。また、膜の分画分子量は、３，０００〜１００，０００、好ましくは６，０００〜５０，０００である。膜による濃縮脱イオンの場合、酵素溶液を緩衝液、蒸留水、イオン交換水、水道水等により、液量を１倍〜１，０００倍、好ましくは２倍〜５０倍まで希釈する。その希釈酵素溶液を膜により濃縮を行い、希釈酵素溶液重量あたり２倍〜１，０００倍まで濃縮を行う。濃縮時の膜モジュール入口圧力は０．５〜２．０ａｔｍ、出口圧力は０．１〜１．５ａｔｍが好ましい。分子篩クロマトグラフィーは、ゲルとしてＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５、ゲル粒度ｍｅｄｉｕｍあるいはｃｏａｒｓｅが好ましい。また、カラムのベット体積の３０重量％程度以下になるように酵素蛋白質量またはゲル量を調製することが好ましい。また、Ｓｅｐｈａｄｅｘなどのゲルのカルボキシ基などの解離基に蛋白質が吸着されないように、酵素溶液のイオン強度は０．０２以上にするのが好ましい。電気透析法は、隔膜として、陽イオン交換膜と陰イオン交換膜を交互に重ね合わせる方法が好ましい。ＥＤＴＡの濃度は、０．０１〜１００ｍＭ、好ましくは０．１〜５０ｍＭである。
【００１２】
酵素の安定化に使用する鉄塩としては、塩化第一鉄、塩化第二鉄、硫酸第一鉄、硫酸第二鉄、硝酸鉄、リン酸鉄、シュウ酸鉄、乳酸鉄、フマル酸鉄、クエン酸鉄のうち１種または２種以上であることが好ましい。カルシウム塩としては、塩化カルシウム、硫酸カルシウム、硝酸カルシウム、酢酸カルシウム、シュウ酸カルシウム、クエン酸カルシウム、アスコルビン酸カルシウム、安息香酸カルシウム、プロピオン酸カルシウム、サリチル酸カルシウム、ステアリン酸カルシウム、酒石酸カルシウム、チオシアン酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、ケイ酸カルシウムのうち１種または２種以上であることが好ましい。
【００１３】
酵素に鉄塩およびカルシウム塩を添加する方法としては、酵素を水に溶解し酵素溶液とし、まず対象となる酵素を０〜２５℃、好ましくは０〜５℃において、鉄塩の場合は、鉄塩を酵素の重量に対して０．０１〜５０重量％、好ましくは０．０５〜３０重量％を添加し、カルシウム塩の場合は、カルシウム塩を酵素の重量に対して０．０１〜７０重量％、好ましくは０．０５〜５０重量％を添加し、スターラー攪拌で１分〜４８時間、好ましくは３０分〜１０時間攪拌を行う。
また、上記脱イオン化した酵素溶液に直接鉄塩およびカルシウム塩を加えることもできる。
【００１４】
酵素の粉末化方法は、特に限定されるものではないが、通常酵素溶液を濃縮した後、乾燥して酵素粉末を得る。濃縮法としては、エバポレーター、フラッシュエバポレーター、ＵＦ膜濃縮、ＭＦ膜濃縮、無機塩類による塩析、溶剤による沈殿法、イオン交換セルロース等による吸着法、吸水性ゲルによる吸水法等の全ての方法が利用可能である。好ましくはＵＦ膜濃縮、エバポレーターが良い。ＵＦ膜濃縮用モジュールとしては、分画分子量３，０００〜１００，０００好ましくは６，０００〜５０，０００の平膜または中空糸膜,材質はポリアクリルニトリル系、ポリスルフォン系などが好ましい。エバポレーターとしては、加熱温度９０℃以下、減圧量４０cmHg以下、好ましくは加熱温度８０℃以下、減圧量６０cmHg以下である。
【００１５】
乾燥法としては、減圧乾燥、凍結乾燥、噴霧乾燥などがあげられるが、噴霧乾燥が好ましい。噴霧乾燥機としては、ノズル向流式、デイスク向流式、ノズル並流式、デイスク並流式等があげられる。好ましくはデイスク並流式が良く、アトマイザー回転数は４，０００〜２０，０００rpm、加熱は入口温度１００〜２００℃、出口温度６０〜１００℃で制御する。
【００１６】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はそれらによって限定されるものではない。
実施例および比較例で得られた酵素の熱安定性と残存活性の評価方法を以下に示す。
[熱安定性]
酵素粉末の場合は１０重量％の溶液とし、酵素液の場合は、そのまま９０℃恒温槽に入れ、１０分、２０分、３０分経過時にサンプリングを行い、それぞれの酵素液の残存活性を測定し、熱処理していないサンプルと比較を行った。
[残存活性]
残存活性は、リパーゼの場合、オリーブ油７５ｍＬ、２％ポリビニルアルコール２２５ｍＬをホモジナイザー（日本精機製）の容器に入れ、１０℃に氷冷しながら１５，０００rpm、１０分乳化したオリーブ油乳化液５ｍＬにリン酸緩衝液ｐＨ７．０を４ｍＬ加えて試験管に入れ、酵素液１ｍＬを添加し、３７℃、１０分反応後、２ＮＨＣＬで反応停止させ、加水分解したフリーの脂肪酸をフェノールフタレインを発色液として、２ＮＮａＯＨで滴定を行う。その滴定量を比較して残存活性を算出した。フォスフォリパーゼの場合、１ｍＬのレシチン乳化液、０．０５ｍＬの０．１ＭＣａＣＬ２・２Ｈ２Ｏ溶液、０．１ｍＬのクエン酸緩衝液（ｐＨ５．５）、０．１５ｍＬの７．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００溶液に０．１ｍＬの酵素液を加えて、３７℃、１０分反応を行い、沸騰水に入れて反応停止し、その反応液に４ｍＬの０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、４ＵのＣｈｏｌｉｎｅｏｘｉｄａｓｅ、４ＵのＰｅｒｏｘｔｄａｓｅ、２ｍｇの４−ａｍｉｎｏａｎｔｉｐｙｒｉｎｅ、１ｍｇのｐｈｅｎｏｌ、２０ｍｇのＴｒｉｔｏｎＸ−１００を添加し、３７℃、２０分さらに反応を行い、この反応液の５００ｎｍの吸光度を測定して算出した。酵素１Ｕは、１分間に１μｍｏｌのコリンを生成する酵素量とした。
【００１７】
実施例１
アルカリゲネススピーシーズＩＦＯ１４１３０(Alcaligenes sp.)５０Ｌ発酵槽（仕込み３０Ｌ）で２５℃、０、５ＶＶＭ、培地１で３６時間培養を行い、２６Ｌの培養液を得た。その培養液を遠心分離（４０００×ｇ、１５分）した上澄みを水道水で２６０Ｌに希釈し、その希釈液を限外ろ過膜（分画分子量；３，０００、材質；ポリアクリルニトリル系）を用いて、入り口２．８ａｔｍ、出口１．０ａｔｍに調製して、金属が酵素に対して０．０５重量％になるまで脱イオンを行った。さらに、乳酸カルシウムを酵素重量あたり２０重量％、硫酸第一鉄７水和物を１０重量％添加し、５℃に氷冷しながらスターラー攪拌を３０分行い、混合した。この混合液を噴霧乾燥（入口温度：１９０℃、出口温度：９５℃）してリパーゼ粉末４３２ｇを得た。その混合液および粉末について熱安定性を測定した。結果を表１に示す。なお、乳酸カルシウムと硫酸第一鉄７水和物を添加しない脱イオン酵素溶液を噴霧乾燥したリパーゼ粉末３２６ｇ（対照１）を得、また、限外ろ過前の希釈液（リパーゼに対して金属が２．３重量％含有）に上記と同量の乳酸カルシウムと硫酸第一鉄７水和物を添加し、同様に処理した混合液を噴霧乾燥したリパーゼ粉末３１８ｇ（対照２）を得た。
【００１８】
実施例２
実施例１と同様にして培養し、脱イオンした酵素水溶液２４Ｌに塩化第一鉄を酵素重量あたり２０重量％添加し、実施例１と同様な方法で混合した混合液とそれを噴霧乾燥したリパーゼ粉末４１０ｇを得た。その混合液および粉末について熱安定性を測定した。結果を表１に示す。
【００１９】
比較例１
実施例１と同様にして培養し、脱イオンした酵素水溶液２５Ｌに塩化銅を酵素重量あたり３０重量％、硫酸マグネシウムを２０重量％添加し、実施例１と同様な方法で混合した混合液とそれを噴霧乾燥したリパーゼ粉末４１５ｇを得た。その混合液および粉末について熱安定性を測定した。結果を表１に示す。
【００２０】
比較例２
実施例１と同様にして培養した培養上澄み液２６Ｌに塩化亜鉛を酵素重量あたり１０重量％、塩化マンガンを３０重量％添加し、実施例１と同様に混合した混合液とそれを噴霧乾燥したリパーゼ粉末４２１ｇを得た。その混合液および粉末について熱安定性を測定した。結果を表１に示す。
【００２１】
【表１】

【００２２】
実施例３
ペニシリウムシクロピウムＡＴＣＣ−３４６１３株（Penicillium cychlopium）を３０Ｌ発酵槽で培地２を用い、２５０rpm、４８時間、通気量１ＶＶＭで培養を行った。この培養液を圧搾ろ過により除菌を行った上澄み液１８Ｌをイオン交換水で２００Ｌに希釈した。その希釈液を限外ろ過膜（分画分子量；１０，０００、材質；セルロースアセテート）により金属が酵素に対して０．１重量％になるまで脱イオンした。さらに、硫酸カルシウムを酵素重量あたり５０重量％、塩化第一鉄を３０重量％添加し、実施例１と同様な方法で混合して、混合液を得た。その混合液について熱安定性を測定した。
【００２３】
実施例４
実施例３と同様にして培養した培養上澄み液をＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５ゲル粒度ｍｅｄｉｕｍを用いて、分子篩クロマトグラフィーにより金属が酵素に対して０．２５重量％になるまで脱イオンを行った。こさらに、リン酸カルシウムを酵素重量あたり２０重量％、クエン酸鉄を１０重量％添加し、実施例３と同様に混合した混合液を得た。その混合液について熱安定性を測定した。結果を表２に示す。
【００２４】
実施例５
実施例３と同様にして培養した培養上澄み液を半透膜（分画分子量；１０，０００、セルロースアセテート膜）を用い、入り口１．５ａｔｍ、出口１．０ａｔｍに調製して、金属が酵素に対して０．３重量％になるまで脱イオンを行った。さらに、酢酸カルシウムを酵素重量あたり５０重量％、硝酸鉄を２０重量％添加し、実施例３と同様に混合した混合液を得た。その混合液について熱安定性を測定した。結果を表２に示す。
【００２５】
【表２】

【００２６】
実施例６
アスペルギルスニガーＮＲＲＬ−３３７株（Aspergillus niger）を５００Ｌ発酵槽（仕込み３００Ｌ）で、２５℃、１ＶＶＭ、攪拌回転数３００rpm、培地２で４８時間培養行った。この培養液を圧搾ろ過でろ過し、除菌した上澄み液を２５１Ｌ回収した。上澄み液は蒸留水で１，０００Ｌに希釈した。その希釈液をＵＦ膜モジュール（分画分子量；３，０００、材質；ポリアクリルニトリル系、中空糸膜）により、３０Ｌまで濃縮した。さらに２３０Ｌの水道水により希釈を行った後、さらに同様な方法で金属が酵素に対して０．４重量％になるまで脱イオンを行い、３５Ｌまで濃縮を行った。さらに、クエン酸カルシウムを酵素重量あたり４０重量％、シュウ酸鉄１０重量％を実施例と同様な方法で混合した。その混合濃縮液を噴霧乾燥（入り口温度：１９５℃、出口温度：９５℃、蒸発量：１０Ｌ／ｈｒ）し、４．８ｋｇのリパーゼ粉末を得た。この粉末の活性回収率は７６．９％であった。このリパーゼ粉末の熱安定性試験の結果を表３に示す。
【００２７】
比較例３
実施例６と同様に混合濃縮液を得た。この混合濃縮液に対し−２０℃のアセトンを等量（１：１）を添加し、スターラーで２時間攪拌を行い、沈殿物をろ紙（Ａ型）で吸引ろ過し、沈殿物を回収後、真空乾燥（７０ｃｍＨｇ以上）を行い、２．０ｋｇのリパーゼ粉末を得た。この活性回収率は３０．６％であった。このリパーゼ粉末の熱安定性試験の結果を表３に示す。
【００２８】
【表３】

【００２９】
実施例７
キャンデイダシリンドラッセＮＲＲＬＹ−１４６９株（Canida sylindracea）を５０Ｌ発酵槽（仕込み３０Ｌ）で２５℃、１ＶＶＭ、培地３、攪拌回転数３５０rpmで２４時間培養を行った。その培養液を遠心分離（３，０００×ｇ，１５分）し、上澄み液２６Ｌを得た。上澄み液は、限外ろ過膜により２００Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で希釈後、金属が酵素に対して０．０５重量％になるまで脱イオンを行い、エバポレーター（加熱温度８０℃、減圧度６０ｃｍＨｇ）で濃縮を行い、３．２Ｌの濃縮液を得た。さらに、濃縮液に安息香酸カルシウムを酵素重量あたり１重量％、乳酸鉄を２重量％添加し実施例１と同様な方法で混合した。この混合濃縮液を噴霧乾燥（入口温度：１９５℃、出口温度：９０℃、蒸発量：９Ｌ／ｈｒ）し、４３０ｇのリパーゼ粉末を得た。この混合濃縮液と粉末の熱安定性試験の結果を表４に示す。
【００３０】
実施例８
ストレプトマイセススピーシーズＩＦＯ３１１０株（Streptmyces sp.）を５０Ｌ発酵槽（仕込み３０Ｌ）で、２５℃、１ＶＶＭ、３００rpm、培地４で４８時間培養を行った。培養液を遠心分離（６，０００×ｇ、１０分）を行い、２６Ｌの上澄み液を得た。上澄み液は、３００Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で希釈を行い、限外ろ過膜（分画分子量；３，０００、材質；ポリアクリルニトリル）により、金属が酵素に対して０．０２重量％になるまで脱イオンを行った後、エバポレーター（加熱温度８０℃、減圧度６０ｃｍＨｇ）で濃縮を行い、３．２Ｌの濃縮液を得た。さらに、濃縮液に酵素重量あたり０．１重量％のアスコルビン酸カルシウム、０．１重量％の塩化第一鉄を添加し実施例１と同様な方法で混合した。この混合濃縮液を噴霧乾燥（入口温度：１９５℃、出口温度：９５℃、蒸発量：１０Ｌ／ｈｒ）し、５１０ｇのフォスフォリパーゼ粉末を得た。この混合濃縮液と粉末の熱安定性の結果を表４に示す。
【００３１】
実施例９
キサントモナスキャンペストリスＮＲＲＬ−Ｂ１４５９株（Xanthomonas campestris)を２０Ｌ発酵槽で、３０℃、２５０rpm、通気量１ＶＶＭ、培地１で４８時間培養を行った。この培養液を遠心分離（６，０００×ｇ、１５分）した上澄み液を２００Ｌトリス緩衝液（ｐＨ８．０）で希釈を行った。この希釈液を限外ろ過膜（分画分子量；１０，０００、材質；セルロースナイトレート）により、金属が酵素に対して０．０１重量％になるまで脱イオンを行った。さらに、４℃に氷冷しながらこの脱イオン溶液に酵素重量あたり０．０５重量％の硫酸カルシウムと０．０５重量％の硝酸鉄を添加し、４℃に氷冷しながらスターラーで２４時間攪拌を行い、混合した。この混合液を噴霧乾燥（入り口温度：１９１℃、出口温度：９５℃、水蒸発量５Ｌ／ｈｒ）して、エステラーゼ粉末酵素８５０ｇを得た。この混合濃縮液と粉末の熱安定性試験の結果を表４に示す。
【００３２】
【表４】

【００３３】
実施例１０
市販リパーゼのリパーゼＯＦ（名糖産業製）、パラターゼ（ノボ・ノルデスク製）、リパーゼＤ（天野製薬製）を１０重量％に水道水で溶解し、それぞれの酵素溶解液５Ｌをそれぞれ１００Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で希釈を行った。この希釈液を限外ろ過膜（分画分子量；１０，０００、材質；セルロースアセテート）を用いて、金属が酵素に対して０．０１重量％になるまで脱イオンを行った。この脱イオン酵素溶液に、酵素重量あたり３０重量％の硝酸カルシウム、１０重量％の塩化第一鉄を４℃に保ちながら、スターラーで２４時間攪拌を行って混合した。それぞれの混合液を無添加脱イオン酵素液を対照として熱安定性試験を行った。結果を表５に示す。
【００３４】
【表５】

【００３５】
培地１

【００３６】
培地２

【００３７】
培地３

【００３８】
培地４

【００３９】
【発明の効果】
本発明によれば、脱イオンを行った脂質分解酵素溶液に、鉄塩およびカルシウム塩を添加することにより、酵素の熱安定性が向上し、また、高温で十分な酵素活性が得られ安定であるため、融点が高い基質を用いる酵素合成が可能になる。さらに、脂質分解酵素の製造においても、加熱を経る濃縮、粉末化方法利用でき、効率的な酵素粉末の製造法が可能になるため極めて有用である。

Claims

金属の含有量が０．５重量％以下である脂質分解酵素に、鉄塩およびカルシウム塩を添加することを特徴とする熱安定性酵素。
脂質分解酵素が脱イオン処理を施されている請求項１記載の熱安定性酵素。
酵素の重量に対して、鉄塩が０．０１〜５０重量％、カルシウム塩が０．０１〜７０重量％である請求項１の熱安定性酵素。
鉄塩およびカルシウム塩を含む酵素溶液を乾燥して酵素粉末を得る請求項１〜３いずれか１項記載の酵素の製造方法。
乾燥が噴霧乾燥法である請求項４記載の酵素の製造方法。