JPH03277276A - 新規耐熱性β―ガラクトシル基転移酵素、その製造法及びその用途 - Google Patents
新規耐熱性β―ガラクトシル基転移酵素、その製造法及びその用途Info
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Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Dairy Products (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
[産業上の利用分野]
本発明は、新規なβ−ガラクトシル基転移酵票、その製
造法及びその用途に関するものであり、さらに詳しくは
、サツカロポリスボラ属等の放線菌に属する微生物が生
産し、高い熱安定性を有する新規なβ−ガラクトシル基
転移N素およびその製造法並びにその利用法に関する。
造法及びその用途に関するものであり、さらに詳しくは
、サツカロポリスボラ属等の放線菌に属する微生物が生
産し、高い熱安定性を有する新規なβ−ガラクトシル基
転移N素およびその製造法並びにその利用法に関する。
[従来の技術]
糖や配糖体を更に糖で修飾することにより、それらの糖
や配糖体(以下、「糖類」と略称する)に新たな生理活
性や物性を付与できることが知られている0例えば、甘
味度を増加させたり、苦味を緩和あるいは消去したり、
水に対する溶解度の低い配糖体(漢方薬の有効成分等に
その例が見られる)の水溶性を高めたり、生体内安定性
や腸管吸収性を増加させたりする作用が知られている。
や配糖体(以下、「糖類」と略称する)に新たな生理活
性や物性を付与できることが知られている0例えば、甘
味度を増加させたり、苦味を緩和あるいは消去したり、
水に対する溶解度の低い配糖体(漢方薬の有効成分等に
その例が見られる)の水溶性を高めたり、生体内安定性
や腸管吸収性を増加させたりする作用が知られている。
糖の修飾により付与される機能やその程度は、用いられ
る糖および修飾される糖類の種類によって異なるが、糖
類をガラクトシル基でg飾することによって、上述の目
的に対して好ましい効果を得られる例が多く報告されて
おり、これに基づき様々な機能性オリゴ糖や機能性配糖
体が開発されてきた。
る糖および修飾される糖類の種類によって異なるが、糖
類をガラクトシル基でg飾することによって、上述の目
的に対して好ましい効果を得られる例が多く報告されて
おり、これに基づき様々な機能性オリゴ糖や機能性配糖
体が開発されてきた。
例えば次の式
%式%
(式中、Galはガラクトース残基を、Xは糖類若しく
は配糖体を示し、mは整数である)で表されるオリゴ糖
またはWM修飾配糖体において、Xがグルコース残基(
Glu) 、mが0〜4の整数であるオリゴIN(ガラ
クトオリゴ糖)は善玉腸内細菌であるビフィズス菌の増
殖促進性物質として知られ(特開昭 55−10488
5号)、またその優れた甘味度、甘味質、難う触性、低
カロリー性、加工安定性、保湿性、水分活性低下能、着
色性などにより、食品素材として幅広く利用されつつあ
る。
は配糖体を示し、mは整数である)で表されるオリゴ糖
またはWM修飾配糖体において、Xがグルコース残基(
Glu) 、mが0〜4の整数であるオリゴIN(ガラ
クトオリゴ糖)は善玉腸内細菌であるビフィズス菌の増
殖促進性物質として知られ(特開昭 55−10488
5号)、またその優れた甘味度、甘味質、難う触性、低
カロリー性、加工安定性、保湿性、水分活性低下能、着
色性などにより、食品素材として幅広く利用されつつあ
る。
また、蔗糖のガラクトシル化により、前記式においてX
がシュークロース、mが0であるガラクトシルシューク
ロース(特開昭64−85090号)が、また、ラクチ
ュロースのガラクトシル化により、前記式中、Xがラク
チュロース、mが0であるガラクトシルラクチュロース
(特開昭 63−94987号′)がそれぞれ得られ、
これらもガラクトオリゴ等と同様、新しい機能性食品素
材として利用されつつある。更に、せ昧配糖体ルブソシ
ドについては、そのガラクトシル化により甘味度、甘味
質の改善が達成されている (Argic、 Biol
、 Chew、 53.2923−2928.1989
)。
がシュークロース、mが0であるガラクトシルシューク
ロース(特開昭64−85090号)が、また、ラクチ
ュロースのガラクトシル化により、前記式中、Xがラク
チュロース、mが0であるガラクトシルラクチュロース
(特開昭 63−94987号′)がそれぞれ得られ、
これらもガラクトオリゴ等と同様、新しい機能性食品素
材として利用されつつある。更に、せ昧配糖体ルブソシ
ドについては、そのガラクトシル化により甘味度、甘味
質の改善が達成されている (Argic、 Biol
、 Chew、 53.2923−2928.1989
)。
以上のように、糖類にガラクトシル基あるいはオリゴガ
ラクトシル基を付加させ、ガラクトシル基付加物を製造
するには、β−ガラクトシダーゼのガラクトシル基転移
反応が利用されている。
ラクトシル基を付加させ、ガラクトシル基付加物を製造
するには、β−ガラクトシダーゼのガラクトシル基転移
反応が利用されている。
この反応は、高濃度のβ−ガラクトピラノシド(例えば
ラクトース)の存在下、いくつかのβ−ガラクトシダー
ゼが、糖(あるいは配糖体の糖部分)へのβ−D−ガラ
クトシル基転移反応を触媒するという事実に基づいてい
る。
ラクトース)の存在下、いくつかのβ−ガラクトシダー
ゼが、糖(あるいは配糖体の糖部分)へのβ−D−ガラ
クトシル基転移反応を触媒するという事実に基づいてい
る。
酵素のβ−D−ガラクトシル基転移能の高さは、その起
源によって様々であり、効率良く反応を進めるためには
、高い転移能を持つβ−ガラクトシダーゼを用いる必要
があった。
源によって様々であり、効率良く反応を進めるためには
、高い転移能を持つβ−ガラクトシダーゼを用いる必要
があった。
従来用いられているβ−ガラクトシダーゼの例としては
、糸状菌アスペルギルス・オリゼー(ρ5perrli
/1rt5 orjllle、特公昭55−10488
5号)、細菌バチルス・サーキュランス(Iticil
/lrs circu/arts、特公昭62−209
780号)、ストレプトコッカス・サーモフィラス(5
1replococctts l/rerzophi/
us。
、糸状菌アスペルギルス・オリゼー(ρ5perrli
/1rt5 orjllle、特公昭55−10488
5号)、細菌バチルス・サーキュランス(Iticil
/lrs circu/arts、特公昭62−209
780号)、ストレプトコッカス・サーモフィラス(5
1replococctts l/rerzophi/
us。
Food Chew、 10.195−204.(19
83))起源の酵素があり、これらの酵素をラクトース
に作用させることにより、実際にガラクトオリゴ糟が製
造されている。 また、β−ガラクトシダーゼ活性をも
つ酵母菌体の例としては、リボマイセス(l 1poz
)tces ) 、ロドトルラ(tihodotrtt
tz ) 、シロバシディウム(5traitstit
las>−ステリグマドマイセス(51ert’guz
ztoa/c#s、 日本農芸化学会誌、63巻、3
号、629ページ、1989年)、スポロボロマイセス
(5poroborozpces 。
83))起源の酵素があり、これらの酵素をラクトース
に作用させることにより、実際にガラクトオリゴ糟が製
造されている。 また、β−ガラクトシダーゼ活性をも
つ酵母菌体の例としては、リボマイセス(l 1poz
)tces ) 、ロドトルラ(tihodotrtt
tz ) 、シロバシディウム(5traitstit
las>−ステリグマドマイセス(51ert’guz
ztoa/c#s、 日本農芸化学会誌、63巻、3
号、629ページ、1989年)、スポロボロマイセス
(5poroborozpces 。
特公昭62−208293号)、クリプトコツカス(C
rpptococctts、 特公昭60−2518
96号、特公昭62−130695号、特公昭61−2
36790号)、クリベロマイセス(K/u)tver
oBtctts、特公昭61−271999号)などが
知られており、これらを利用するガラクトオリゴ糖の製
造も試みられている。
rpptococctts、 特公昭60−2518
96号、特公昭62−130695号、特公昭61−2
36790号)、クリベロマイセス(K/u)tver
oBtctts、特公昭61−271999号)などが
知られており、これらを利用するガラクトオリゴ糖の製
造も試みられている。
通常、β−D−ガラクトシル基の供与体としては、ラク
トースを用いるのが産業上もっとも有利である。ラクト
ースは牛乳中に多量に含まれ、また、海外において酪農
廃棄物として多量に産出され、原料としてはもっとも安
価であるからである。ちなみに、β−ガラクトシダーゼ
を用いた乳糖分解乳の製造が既に実用化されていること
(フードケミカル、第7巻、38−44、(1986)
)を背景として、転移活性の高いβ−ガラクトシダー
ゼを用いたガラクトオリゴ糖含有加工乳の製造法が近年
報告された(特開平1−168234号)。
トースを用いるのが産業上もっとも有利である。ラクト
ースは牛乳中に多量に含まれ、また、海外において酪農
廃棄物として多量に産出され、原料としてはもっとも安
価であるからである。ちなみに、β−ガラクトシダーゼ
を用いた乳糖分解乳の製造が既に実用化されていること
(フードケミカル、第7巻、38−44、(1986)
)を背景として、転移活性の高いβ−ガラクトシダー
ゼを用いたガラクトオリゴ糖含有加工乳の製造法が近年
報告された(特開平1−168234号)。
[発明が解決しようとする課題]
ところで、−aに糖転移反応は、糖供与体(ここではラ
クトース)の濃度が高いほど速やかにかつ収率良く進行
する。そして、このためには反応溶液中のラクトースの
濃度を上げれば良いのであるが、高濃度のラクトース溶
液は、常温では粘度が高いうえに結晶が析出しやすく、
製造工程上での取り扱いが困難であるという問題があっ
た。
クトース)の濃度が高いほど速やかにかつ収率良く進行
する。そして、このためには反応溶液中のラクトースの
濃度を上げれば良いのであるが、高濃度のラクトース溶
液は、常温では粘度が高いうえに結晶が析出しやすく、
製造工程上での取り扱いが困難であるという問題があっ
た。
そこで、反応系の温度を上げて(例えば、60″C以上
ン、ラクトースの析出を押さえ、粘度を低下させること
が求められていた。
ン、ラクトースの析出を押さえ、粘度を低下させること
が求められていた。
また、溶解度を上げることにより単位体積当たりの反応
物(ラクトース等)の仕込み量を多くすればコスト的に
も有利であり、しかも化学反応は温度が高いほど早く進
行するので、反応系の温度を上げることによって、#素
反応速度を大きくし反応時間を短縮化することも可能と
なる。 更に、反応温度の高温化によって雑菌が成育し
にくなり、また、高温によって達成される高濃度糖の高
い浸透圧による静菌作用が働き、製造工程の雑菌汚染防
止にも役立つことが予想される。
物(ラクトース等)の仕込み量を多くすればコスト的に
も有利であり、しかも化学反応は温度が高いほど早く進
行するので、反応系の温度を上げることによって、#素
反応速度を大きくし反応時間を短縮化することも可能と
なる。 更に、反応温度の高温化によって雑菌が成育し
にくなり、また、高温によって達成される高濃度糖の高
い浸透圧による静菌作用が働き、製造工程の雑菌汚染防
止にも役立つことが予想される。
このように、高温によるがラク゛トシル基転移反応は利
点が多いのであるが、このように高温で反応を行なうた
めには、酵素に高い熱安定性が要求される。更に、上記
反応を工業的に有利に利用するためには、付加物の量産
化と製造コストの低減化のために、酵素を固定化し、反
応工程を自動化、連続化することが求められている。
点が多いのであるが、このように高温で反応を行なうた
めには、酵素に高い熱安定性が要求される。更に、上記
反応を工業的に有利に利用するためには、付加物の量産
化と製造コストの低減化のために、酵素を固定化し、反
応工程を自動化、連続化することが求められている。
一般に、β−ガラクトシダーゼは高濃度のラクトースに
よr)官憲化されるが、これを固定化して、高温で長期
間にわたり縁り近し使用するためには、さらに高度な耐
熱性が要求される。 しかし、前述の糸状菌アスペルギ
ルス・オリゼー、細菌バチルス・サーキュランス、スト
レプトコッカス・サーモフィラス起源の酵素、あるいは
りボマイセス、ロドトルラ、シロバシディウム、スポロ
ボロマイセス、クリプトコツカス、クリベロマイセスな
どのβ−ガラクトシダーゼ活性をもつ酵母菌体は、熱安
定性が必ずしも高くなく、高温での繰り返し使用には適
切ではない。
よr)官憲化されるが、これを固定化して、高温で長期
間にわたり縁り近し使用するためには、さらに高度な耐
熱性が要求される。 しかし、前述の糸状菌アスペルギ
ルス・オリゼー、細菌バチルス・サーキュランス、スト
レプトコッカス・サーモフィラス起源の酵素、あるいは
りボマイセス、ロドトルラ、シロバシディウム、スポロ
ボロマイセス、クリプトコツカス、クリベロマイセスな
どのβ−ガラクトシダーゼ活性をもつ酵母菌体は、熱安
定性が必ずしも高くなく、高温での繰り返し使用には適
切ではない。
一方、熱安定性を有し、しかも高温繰り返し使用に耐え
うるβ−ガラクトシダーゼとしては、ペシロマイセス
(Pzeciloaycesvzr;atl)の酵素(
Appl、 Microbiol。
うるβ−ガラクトシダーゼとしては、ペシロマイセス
(Pzeciloaycesvzr;atl)の酵素(
Appl、 Microbiol。
Biotechnol、 27.383−388.19
88 )が知られているが、この酵素の反応最通pHは
3.5であって、例えば牛乳(pH7付近)中のラクト
ースを利用する製造工程には不適当であった。
88 )が知られているが、この酵素の反応最通pHは
3.5であって、例えば牛乳(pH7付近)中のラクト
ースを利用する製造工程には不適当であった。
したがって、実際の高温酵素反応に適する酵素の提供が
求められていた。
求められていた。
[ff!!9!を解決するための手段]本発明者らは、
高いβ−D−ガラクトシル基転移能ならびに高い熱安定
性をもち、中性域で作用しうる酵素を自然界より探索し
た結果、放線菌に属する微生物、特にサツカロポリスボ
ラ (5zcchiropolpsparz) 、サー
モモノスポラ(Iheraozonasporz )ま
たはサーモアクチノマイセス (Iherzaicti
noayces )に属する菌株中に上記の目的にかな
うβ−ガラクトシル基転移酵素を生産するものがあるこ
とを見いだした。
高いβ−D−ガラクトシル基転移能ならびに高い熱安定
性をもち、中性域で作用しうる酵素を自然界より探索し
た結果、放線菌に属する微生物、特にサツカロポリスボ
ラ (5zcchiropolpsparz) 、サー
モモノスポラ(Iheraozonasporz )ま
たはサーモアクチノマイセス (Iherzaicti
noayces )に属する菌株中に上記の目的にかな
うβ−ガラクトシル基転移酵素を生産するものがあるこ
とを見いだした。
そして、これらの菌株を液体培養または固体培養するこ
とによりβ−ガラクトシル基転移酵素を生産させ、これ
を必要に即して精製純化あるいは固定化することにより
、−a式() %式%) (式中、Galはガラクトース残基を、Xは糖類若しく
は配糖体を示し、nl、tO−4の整数である) で示されるオリゴ環あるいは糖峰飾配糖体の製造に利用
することができることを見出した。
とによりβ−ガラクトシル基転移酵素を生産させ、これ
を必要に即して精製純化あるいは固定化することにより
、−a式() %式%) (式中、Galはガラクトース残基を、Xは糖類若しく
は配糖体を示し、nl、tO−4の整数である) で示されるオリゴ環あるいは糖峰飾配糖体の製造に利用
することができることを見出した。
即ち、本発明は、新規なβ−ガラクトシル基転移酵素、
該酵素の製造法、および該酵素の利用法を提供するもの
であ石。
該酵素の製造法、および該酵素の利用法を提供するもの
であ石。
本発明のβ−ガラクトシル基転移酵素は、放線菌に属す
る微生物、特にサツカロポリスボラ、サーモモノスポラ
、サーモアクチノマイセス等に属する菌株の培養物から
得ることができる。
る微生物、特にサツカロポリスボラ、サーモモノスポラ
、サーモアクチノマイセス等に属する菌株の培養物から
得ることができる。
本発明者らは、前記したように、高い熱安定性を有し、
中性域で作用しうるβ−ガラクトシル基転移酵素生産菌
を自然界より探索した結果、上記に属する菌株中に目的
とするβ−ガラクトシル基転移酵素を生産するものが存
在することを見いだしてお、ワ、その中でも特に石川系
の牧草地土壌から分離したサツカロポリスボラに属する
菌株、SAM1400株が、目的とするβ−ガラクトシ
ル基転移酵素をとりわけ多量に生産している。
中性域で作用しうるβ−ガラクトシル基転移酵素生産菌
を自然界より探索した結果、上記に属する菌株中に目的
とするβ−ガラクトシル基転移酵素を生産するものが存
在することを見いだしてお、ワ、その中でも特に石川系
の牧草地土壌から分離したサツカロポリスボラに属する
菌株、SAM1400株が、目的とするβ−ガラクトシ
ル基転移酵素をとりわけ多量に生産している。
そこで、本発明において用いることができるβ−ガラク
トシル基転移酵素産生菌の代表例として、微生物SAM
1400株をあげ、その菌学的特徴を以下に述べる
。
トシル基転移酵素産生菌の代表例として、微生物SAM
1400株をあげ、その菌学的特徴を以下に述べる
。
菌 学 的 特 徴 :
(1)形態学的所見
SAM 1400株は、直径0.4〜0.8μmの基
底菌糸および気中菌糸を形成する。
底菌糸および気中菌糸を形成する。
基底菌糸は分岐し、まれに分断が認められる。
気中菌糸は分岐し、その先端に3ないし7個、まれに1
0個以上の直鎖状の胞子連鎖を形成する。一方、気中菌
糸を形成していない場合でも、基底菌糸において2ない
し6個の胞子鎖を、寒天培地内部、寒天培地表面、およ
び表面より気中に向かって形成する。胞子は球状であり
、その大きさは直径0.8〜1.0μmで、その表面は
平滑である。胞子嚢、菌糸束、菌核などの構造体は、1
4日培養後も認められなかった。
0個以上の直鎖状の胞子連鎖を形成する。一方、気中菌
糸を形成していない場合でも、基底菌糸において2ない
し6個の胞子鎖を、寒天培地内部、寒天培地表面、およ
び表面より気中に向かって形成する。胞子は球状であり
、その大きさは直径0.8〜1.0μmで、その表面は
平滑である。胞子嚢、菌糸束、菌核などの構造体は、1
4日培養後も認められなかった。
(2)培養所見(55°C114日間培養)ショ糖・硝
酸塩寒天培地; 生 育 : 貧 弱 気中菌糸 : 形成せず 裏面の色調: 灰黄色 可溶性色素: な し グルコース・アスパラギン寒天培地; 生 育 : 貢 弱 気中菌糸 : 形成せず 裏面の色調: 灰黄色 可溶性色素: な し グリセリン・アスパラギン寒天培地; 生 育 : 良 好 気中菌糸 : 形成せず 裏面の色調:Wl黄色 可溶性色素: な し スターチ・無機塩培地: 生 育: 貧弱 気中菌糸 : 形成せず 裏面の色調: 黄 色 可溶性色素: な し チロシン・寒天培地; 生 育 : 良 好 気中菌糸 : 形成せず 裏面の色調: 灰黄色 可溶性色素: な し 栄養寒天培地; 生 育 : 良 好 気中菌糸 : かすか 裏面の色調: 黄 色 可溶性色素: な し n母エキス・麦芽エキス寒天培地; 生 育 : 良 好 気中菌糸 : 貧弱、白色 裏面の色調: 黄褐色 可溶性色素: な し オートミール寒天培地; 生 育 : 良 好 気中菌糸 : 形成せず 裏面の色調: 黄 色 可溶性色素: な し NaC1寒天培地1 生 育 : 良 好 気中菌糸 : 豊富、白色 裏面の色調: 黄 色 可溶性色素: な し 110% NaC1を含むトリブチケースソイブロス(
BBL) +2%寒天培地 (3)生理学的所見 ■生育温度範囲 1%グルコースを含む栄養寒天培地で、50℃、55“
C265℃での生育が認められ、トリプチケースソイブ
ロス(BBL)+2%寒天培地で、30°C137℃で
の生育が認められた。最適生育温度は50〜55℃と思
われた。
酸塩寒天培地; 生 育 : 貧 弱 気中菌糸 : 形成せず 裏面の色調: 灰黄色 可溶性色素: な し グルコース・アスパラギン寒天培地; 生 育 : 貢 弱 気中菌糸 : 形成せず 裏面の色調: 灰黄色 可溶性色素: な し グリセリン・アスパラギン寒天培地; 生 育 : 良 好 気中菌糸 : 形成せず 裏面の色調:Wl黄色 可溶性色素: な し スターチ・無機塩培地: 生 育: 貧弱 気中菌糸 : 形成せず 裏面の色調: 黄 色 可溶性色素: な し チロシン・寒天培地; 生 育 : 良 好 気中菌糸 : 形成せず 裏面の色調: 灰黄色 可溶性色素: な し 栄養寒天培地; 生 育 : 良 好 気中菌糸 : かすか 裏面の色調: 黄 色 可溶性色素: な し n母エキス・麦芽エキス寒天培地; 生 育 : 良 好 気中菌糸 : 貧弱、白色 裏面の色調: 黄褐色 可溶性色素: な し オートミール寒天培地; 生 育 : 良 好 気中菌糸 : 形成せず 裏面の色調: 黄 色 可溶性色素: な し NaC1寒天培地1 生 育 : 良 好 気中菌糸 : 豊富、白色 裏面の色調: 黄 色 可溶性色素: な し 110% NaC1を含むトリブチケースソイブロス(
BBL) +2%寒天培地 (3)生理学的所見 ■生育温度範囲 1%グルコースを含む栄養寒天培地で、50℃、55“
C265℃での生育が認められ、トリプチケースソイブ
ロス(BBL)+2%寒天培地で、30°C137℃で
の生育が認められた。最適生育温度は50〜55℃と思
われた。
■ゼラチンの液化(55°C)
ゼラチン液化試験用培地のいずれにおいても、生育が認
められなかった・ ■スターチの加水分解: 陰 性 ■脱脂乳の凝固: 陰 性 ■脱脂乳のペプトン化: 陰 性 ■メラニン様色素の生成 ペプトン・酵母エキス・鉄寒天培地二 陰 性8 チロシン寒天培地: 陰 性 トリプトン・酵母エキス寒天培地: 陰性 ネ: 培地の底に、薄褐色の色素の沈降が見られる。
められなかった・ ■スターチの加水分解: 陰 性 ■脱脂乳の凝固: 陰 性 ■脱脂乳のペプトン化: 陰 性 ■メラニン様色素の生成 ペプトン・酵母エキス・鉄寒天培地二 陰 性8 チロシン寒天培地: 陰 性 トリプトン・酵母エキス寒天培地: 陰性 ネ: 培地の底に、薄褐色の色素の沈降が見られる。
硝酸塩の還元=
10%NaC1耐性ニ
ゲアニンの分解:
エラスチンの分解:
陽性
陽 性
陽 性
陰性
■キサンチンの分解: 陽 性
@ヒボキサンチンの分M: 陽 性
■炭素源の利用性(ブリドハム・ゴトリーブ寒天培地、
55℃、17日間培養):D−グルコース + D−キシロース + ラクトース + L−ラムノース 士 L−アラビノース 士 D−フルクトース + ラフィノース D−マンニトール + イノシトール + シュクロース ただし、+;利用する、±;利用するかどうか髪わしい
、−;利用しない。
55℃、17日間培養):D−グルコース + D−キシロース + ラクトース + L−ラムノース 士 L−アラビノース 士 D−フルクトース + ラフィノース D−マンニトール + イノシトール + シュクロース ただし、+;利用する、±;利用するかどうか髪わしい
、−;利用しない。
(4)化学分類学的性質
(a)2.6−ジアミノピメリン酸
全菌体を、スタネック(Staneck、J、L、 )
およびロバーツ(Roberts、G、D、 )の方法
(アプライドマイクロバイオロジー (Applied Microbiology)、 2
8巻、226ベーシ、 1974年)に準拠して調べた
結果、メソ−2,6−ジアミツビメリン酸の存在が認め
られた。
およびロバーツ(Roberts、G、D、 )の方法
(アプライドマイクロバイオロジー (Applied Microbiology)、 2
8巻、226ベーシ、 1974年)に準拠して調べた
結果、メソ−2,6−ジアミツビメリン酸の存在が認め
られた。
(b) tm
全菌体の加水分解物中に、アラビノースとガラクトース
の存在が認められた。
の存在が認められた。
(c) キノン系
MK−9(H4)を主成分として有し、そのほかにMK
−9(H6) 、MK−9(H8)、MK−10(H4
)、MK−10(H6)、MK−10(H8)、 MK−10(HIO)を有していた。
−9(H6) 、MK−9(H8)、MK−10(H4
)、MK−10(H6)、MK−10(H8)、 MK−10(HIO)を有していた。
(d) リン脂質タイプ
フォスファチジルコリン、フオスファチジルグリセロー
ルを含む。これは、ルシェバリx M、P、 (Le
chevalier、 N、 P、ンおよびH,A、ル
シエバリエ(H,A。
ルを含む。これは、ルシェバリx M、P、 (Le
chevalier、 N、 P、ンおよびH,A、ル
シエバリエ(H,A。
Lechevalier) (A、 Dietz a
nd D、 W。
nd D、 W。
Thayer (編)、アクチノマイセート タフソノ
ミー(Actinosycete Taxonomy)
、227291頁、1980年)によるP−IIIタイ
プに属する。
ミー(Actinosycete Taxonomy)
、227291頁、1980年)によるP−IIIタイ
プに属する。
(e) ミコール酸
菌体内にミコール酸を含まない。
これらの結果から、SAM 1400株の細胞壁は、
メソ−2,6−ジアミツビメリン酸とガラクトース、ア
ラビノースを含む、IV−Aタイプと判断される。
メソ−2,6−ジアミツビメリン酸とガラクトース、ア
ラビノースを含む、IV−Aタイプと判断される。
形態的特徴としては、SAM1400株は気中菌糸を形
成し、分岐して平滑な球状の胞子を連鎖上に着生する。
成し、分岐して平滑な球状の胞子を連鎖上に着生する。
胞子の連鎖は短く、その数は3〜7個が普通で、まれに
10個以上の胞子連鎖も認められる。その一方で、気中
菌糸の形成が認められないときには、基底菌糸において
、胞子連鎖の形成が認められた。これは、基底菌糸から
短い胞子柄(認められない場合もある)の先に2〜6個
の平滑な球状の胞子が寒天培地表面より上に向かつて連
鎖するものである。キノン系はMK−9(H4)を主成
分として有し、リン脂質タイプはP−IIIで、ミコー
ル酸を含まない。グアニン、ヒボキサンチン、キサンチ
ンを分解し、エラスチンを分解せず、30〜65℃で生
育し、10% N a C1j:耐性を示す。
10個以上の胞子連鎖も認められる。その一方で、気中
菌糸の形成が認められないときには、基底菌糸において
、胞子連鎖の形成が認められた。これは、基底菌糸から
短い胞子柄(認められない場合もある)の先に2〜6個
の平滑な球状の胞子が寒天培地表面より上に向かつて連
鎖するものである。キノン系はMK−9(H4)を主成
分として有し、リン脂質タイプはP−IIIで、ミコー
ル酸を含まない。グアニン、ヒボキサンチン、キサンチ
ンを分解し、エラスチンを分解せず、30〜65℃で生
育し、10% N a C1j:耐性を示す。
以上の菌学的性質より、S、T、ウィリアムス(S、T
、Williaas )編の、パージエイズ マニュア
ル オブ システマティック バクテリオロジー、第4
巻、1989年(Williaws。
、Williaas )編の、パージエイズ マニュア
ル オブ システマティック バクテリオロジー、第4
巻、1989年(Williaws。
S、T、(ed、)、Bergey’s Manual
of SystesaticBacteriolog
y、 vo14.1989)に従って、本菌株の分類学
的位置を求めたところ、SAλ(1400株はファエニ
ア・レクチヴイルグラ(Fleniz recttrt
rllulg)に属する放線菌であることが判明した。
of SystesaticBacteriolog
y、 vo14.1989)に従って、本菌株の分類学
的位置を求めたところ、SAλ(1400株はファエニ
ア・レクチヴイルグラ(Fleniz recttrt
rllulg)に属する放線菌であることが判明した。
そこで、F、レクチヴイルグラ(F。
rectivirgulz )の基準菌株と同種と同定
された菌株2株を入手し、SAM 1400株と培養
性状、 生理的性状及びキノン系の比較状 験を行った。
された菌株2株を入手し、SAM 1400株と培養
性状、 生理的性状及びキノン系の比較状 験を行った。
その結果を第1表に示す。
(
以
下
余
白
)
第1表に示すようにSAML400株とF。
レクチヴイルグラの基準法を含む3株は、非常に良く一
致する菌学的性質を示した。
致する菌学的性質を示した。
以上のことから、本発明者らはSAM
1400株をF、レクチヴイルグラであると同定した。
しかしながら、コーンーウエンデッシュ(Korn−
Wendisch )ら(インターナテヨナルジャーナ
ルオブシステマテイツクハクテリオロジー(Inter
national Journalof System
atic Bacteriology)39巻、430
−441頁、1989年)は、菌体脂肪酸組成、キノン
系、リン脂質タイプ等の化学分類学的性質によって、フ
ァエニア属はサツカロポリスボラ属と同一であるとし、
F、レクチヴイルグラをサツカロポリスボラ属に移し、
新組合せ、サツカロポリスボラ・レクチヴイルグラ(5
zcchzr。
Wendisch )ら(インターナテヨナルジャーナ
ルオブシステマテイツクハクテリオロジー(Inter
national Journalof System
atic Bacteriology)39巻、430
−441頁、1989年)は、菌体脂肪酸組成、キノン
系、リン脂質タイプ等の化学分類学的性質によって、フ
ァエニア属はサツカロポリスボラ属と同一であるとし、
F、レクチヴイルグラをサツカロポリスボラ属に移し、
新組合せ、サツカロポリスボラ・レクチヴイルグラ(5
zcchzr。
palysporit recliyirgttlz)
を提唱している。
を提唱している。
そこで、本発明者らは、コーンーウエンデッシュら(イ
ンターナテヨナル ジャーナルオブ システマテイック
バクテリオロジー(Internattonal J
ournal of SystematicBac
teriology’ )39巻、430−441頁、
1989年)に従い、本菌株をサツカロポリスボラ・レ
クチヴイルグラと同定した。
ンターナテヨナル ジャーナルオブ システマテイック
バクテリオロジー(Internattonal J
ournal of SystematicBac
teriology’ )39巻、430−441頁、
1989年)に従い、本菌株をサツカロポリスボラ・レ
クチヴイルグラと同定した。
なお、SAM 1400株は、サツカロポリスボラ・
レクチヴイルグラ SAM l 4 0 0 (Szcchzretpo/ys
porz rgclt’virguliSAに140
0 )と命名され、工業技術院微生物工業技術研究所に
、受託番号微工研条寄第2768号(FERM BP−
2768)として寄託されている。
レクチヴイルグラ SAM l 4 0 0 (Szcchzretpo/ys
porz rgclt’virguliSAに140
0 )と命名され、工業技術院微生物工業技術研究所に
、受託番号微工研条寄第2768号(FERM BP−
2768)として寄託されている。
また、他の属に属する本発明の新規β−ガラクトシル基
転移酵素産生微生物の例としては、サーモアクチノマイ
セス sp、SAMl 544 (Iherzozct
inozpces sp、 SAM1544)、サ
ーモアクチノマイセス sp。
転移酵素産生微生物の例としては、サーモアクチノマイ
セス sp、SAMl 544 (Iherzozct
inozpces sp、 SAM1544)、サ
ーモアクチノマイセス sp。
S AM 1 5 4 5 (Iheraoz
ctittoiりces sp。
ctittoiりces sp。
SAM 1545) 、サーモモノスポラ sp、SA
Ml 546 (Iherzozottosporz
sp、 SAM 1546 )、サーモモノスポラ s
p、SAM 1547(1herzozonos戸o
ri sp、 SAM 1547 )等が挙げられる。
Ml 546 (Iherzozottosporz
sp、 SAM 1546 )、サーモモノスポラ s
p、SAM 1547(1herzozonos戸o
ri sp、 SAM 1547 )等が挙げられる。
これらの微生物も、それぞれ工業技術院微生物工業技術
研究所に、受託番号微工研条寄第2769号(FERN
BP−2769)、同2770号(FERM BP−
2770) 、同2771号(FERM BP−277
1’) 、同2772号(FERN8P−2772)と
して寄託されている。
研究所に、受託番号微工研条寄第2769号(FERN
BP−2769)、同2770号(FERM BP−
2770) 、同2771号(FERM BP−277
1’) 、同2772号(FERN8P−2772)と
して寄託されている。
上記各微生物を利用する新規β−ガラクトシル基転移酵
素の製造は、常法にしたがって当該微生物を培地に接種
し、これを培養することにより行なわれる。
素の製造は、常法にしたがって当該微生物を培地に接種
し、これを培養することにより行なわれる。
各菌株の培養は、通常行なわれている通気撹拌培養、振
盪培養、静置培養等の潜体培養法もしくは固体培養法に
より行なうことができる。
盪培養、静置培養等の潜体培養法もしくは固体培養法に
より行なうことができる。
培地は、炭素源として、ラクトース、グルコース、シュ
クロース、デンプンなど、窒素源としてペプトン、酵母
エキス、尿素、硫酸アンモニウム、アミノ酸などを、無
機塩としては、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、塩
化カルシウムなどや、また必要に応じてM n”、 Z
n’−、N i 2−等の微量金属、ヒオチン、チア
ミンなどのビタミン類等を適宜加えたものを用いる。
クロース、デンプンなど、窒素源としてペプトン、酵母
エキス、尿素、硫酸アンモニウム、アミノ酸などを、無
機塩としては、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、塩
化カルシウムなどや、また必要に応じてM n”、 Z
n’−、N i 2−等の微量金属、ヒオチン、チア
ミンなどのビタミン類等を適宜加えたものを用いる。
培養温度は生育できる温度範囲ならとくに限定されない
が、50°C付近が望ましい。
が、50°C付近が望ましい。
また、培養は、24〜192時間程度行なわれる。
かくして得られた培養物から本発明のβ−ガラクトシル
基転移酵素を採取するには、まず遠心分離法や濾過法な
どにより培養物をブロス画分と菌体画分に分画する。β
−ガラクトシル基転移酵素活性画分につき、さらに限外
濾過、透析、塩析、溶媒沈殿、イオン交換クロマトグラ
フィー、ゲルクロマトグラフィー、吸着クロマトグラフ
ィー、疎水性クロマトグラフィー、等電点沈殿など周知
の方法を、単独あるいは組み合わせて行なうことにより
、β−ガラクトシル基転移酵素の濃縮あるいは精製標品
を得ることができる。
基転移酵素を採取するには、まず遠心分離法や濾過法な
どにより培養物をブロス画分と菌体画分に分画する。β
−ガラクトシル基転移酵素活性画分につき、さらに限外
濾過、透析、塩析、溶媒沈殿、イオン交換クロマトグラ
フィー、ゲルクロマトグラフィー、吸着クロマトグラフ
ィー、疎水性クロマトグラフィー、等電点沈殿など周知
の方法を、単独あるいは組み合わせて行なうことにより
、β−ガラクトシル基転移酵素の濃縮あるいは精製標品
を得ることができる。
以上のようにして分離、Willされた、本発明のβ−
ガラクトシル基転移畦素のうち、サツカロポリスボラ・
レクチヴイルグラSAM1400の産生する酵素の酵素
化学的性質はつぎのとおりである。
ガラクトシル基転移畦素のうち、サツカロポリスボラ・
レクチヴイルグラSAM1400の産生する酵素の酵素
化学的性質はつぎのとおりである。
酵素化学的性質:
(1)作用
転移反応:
β−D−ガラクトピラノシド
Gal−X1モルと、ガラクトシル基
受容体Y 1モルとから、あらたなβ
−D−ガラクトピラノシドGal−Y
1モルと、x 1モルを生成する。
ここで、X、Yはいずれも木繊外の
化合物で、糖あるいはアグリコンで
ある。
加水分解:
1モルのβ−D−ガラクトピラノシ
ドGal−Xを加水分解し、1モルの
Xと1モルのガラクトースを生成す
る。
(2) pH安定性
0、OIM!酸緩衝液(PH3,5−6,5)、0、O
IM リンWl*衝液(p)f 6.0−8.0)、
あるいは0.0IM ビロリン酸緩衝液(pH8,0−
9,5)中で55℃、15分間インキュベートし、各p
Hでの残存活性を測定した結果、pH5,0以上で安定
であった。
IM リンWl*衝液(p)f 6.0−8.0)、
あるいは0.0IM ビロリン酸緩衝液(pH8,0−
9,5)中で55℃、15分間インキュベートし、各p
Hでの残存活性を測定した結果、pH5,0以上で安定
であった。
<3)熱安定性
0、OIM リンMIN衛液(pH7,2)中にて、
30〜80″Cで1時間インキュベートし、各温度にお
ける残存活性を測定した結果、60℃まではほぼ安定で
あった。また1Mラクトースを含有する0、OIM
リンal1面液(p!(7,2)中で、65℃、24時
間処理し、残存活性を測定した結果、失活は認められな
かった。
30〜80″Cで1時間インキュベートし、各温度にお
ける残存活性を測定した結果、60℃まではほぼ安定で
あった。また1Mラクトースを含有する0、OIM
リンal1面液(p!(7,2)中で、65℃、24時
間処理し、残存活性を測定した結果、失活は認められな
かった。
(4)最適p)(
0,1λイ リン酸Pi衝溌(pH6,0−8,0)に
おける最適pHは7.2であった。
おける最適pHは7.2であった。
(5)基質特異性ならびにミカエリス定数各種のβ−ガ
ラクトピラノシドおよびその類縁体について、基jit
濃度105Mにおける加水分解反応を行なった結果を第
2表に示す。
ラクトピラノシドおよびその類縁体について、基jit
濃度105Mにおける加水分解反応を行なった結果を第
2表に示す。
(以下余白)
第
表
基 質 (10mM)
相対活性
p−ニトロフェニル−β−
D−ガラクトピラノシド
p−ニトロフェニル−α−
D−ガラクトピラノシド
p−ニトロフェニル−β−
D−キシロピラノシド
p−ニトロフェニル−β−
D−グルコピラノシド
p−ニトロフェニル−β−
D−フルコシド
p−ニトロフェニル−β−
D−マンノシド
ラクトース
100 %
0 %
〉 1 %
〉 1 %
0 %
0 %
161 %
(6)分子量
TSK−G3000 5W−XLカラムを用いた高速液
体ゲルクロマトグラフィー(移動相: 0.158
KCIを含む0.01Mリン酸緩衝液pH7,2,流速
+ 1.0 ml/gain )により、オリエンタル
酵母社製の各種標準タンパク質との相対溶出保持時間か
ら分子量を求めた結果、本酵素の分子量は140,00
0±20,000であった。
体ゲルクロマトグラフィー(移動相: 0.158
KCIを含む0.01Mリン酸緩衝液pH7,2,流速
+ 1.0 ml/gain )により、オリエンタル
酵母社製の各種標準タンパク質との相対溶出保持時間か
ら分子量を求めた結果、本酵素の分子量は140,00
0±20,000であった。
(7)サブユニット分子量およびサブユニット構造
SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動法により本酵素
のサブユニットの分子量を求めたところ、140,00
0±20,000であった。ファスト−ゲル(Phas
t−Gel ) 1jl気泳動装置を用い、各種標準蛋
白質との相対移動度から求めた。本酵素は単量体と思わ
れる(8)阻害剤 本酵素はHg”、 Cu s+、などの金属イオンおよ
びエチレンジアミン四酢酸により阻害された(第3表)
。
のサブユニットの分子量を求めたところ、140,00
0±20,000であった。ファスト−ゲル(Phas
t−Gel ) 1jl気泳動装置を用い、各種標準蛋
白質との相対移動度から求めた。本酵素は単量体と思わ
れる(8)阻害剤 本酵素はHg”、 Cu s+、などの金属イオンおよ
びエチレンジアミン四酢酸により阻害された(第3表)
。
第
表
化
合 物
残存活性
dC12
nCl2
CaC1□
aC12
N i C12
Mn C12
0C12
eC12
CuC1□
DTA
2−メルカプトエタノール
TNB
モノヨード酢酸
96 %
122%
87 %
96%
59%
103 %
97 %
87%
28%
5 %
96 %
107 %
69%
(9)活性測定
p−ニトロフェニル−β−D−ガラクトピラノシドの加
水分解の活性測定は、基質の加水分解により生成するp
−ニトロフェノールを分光学的に追跡することにより行
なった。
水分解の活性測定は、基質の加水分解により生成するp
−ニトロフェノールを分光学的に追跡することにより行
なった。
すなわち、0.OIMのp−ニトロフェニル−β−D−
ガラクトピラノシドを含有する0、OIMリンリン酸緩
衝液H7,2) 0.60mlに、0.1o■lの酵
素液を加え、405n■における吸光度の増加を55℃
において追跡した。p−ニトロフェノールの生成量(μ
mo1)を、pH7,2におけるp−ニトロフェノール
の分子吸光係数(ε4゜、=1.34 X 10’)を
用いて計算により求めた。p−ニトロフェニル−β−D
−ガラクトピラノシドの加水分解により定義したjl素
1単位(pNPGLりは、1分間に1M口O1のp−ニ
トロフェニル−β−D−ガラクトピラノシドを加水分解
する酵素量である。 ラクトースの加水分解の活性測定
は、基質の分解により生成するグルコースを分光学的に
定量することにより行なつ力。すなわち、0.1Mのラ
クトースを含有する0 0 、 I M リン酸緩衝
液(ρ)17.2) 0.90m1に、O,lOa+
1の酵素液を加え、55°Cで10分間反応させ、33
%トリクロロ酢酸0.05@1を加えて反応を停止させ
た。反応停止させた上記反応液0.1vlに、ベーリン
ガーマンハイム社製グルコース定量キット1.01を加
え、室温で45分間放置したのち、660neにおける
吸光度を測定した。
ガラクトピラノシドを含有する0、OIMリンリン酸緩
衝液H7,2) 0.60mlに、0.1o■lの酵
素液を加え、405n■における吸光度の増加を55℃
において追跡した。p−ニトロフェノールの生成量(μ
mo1)を、pH7,2におけるp−ニトロフェノール
の分子吸光係数(ε4゜、=1.34 X 10’)を
用いて計算により求めた。p−ニトロフェニル−β−D
−ガラクトピラノシドの加水分解により定義したjl素
1単位(pNPGLりは、1分間に1M口O1のp−ニ
トロフェニル−β−D−ガラクトピラノシドを加水分解
する酵素量である。 ラクトースの加水分解の活性測定
は、基質の分解により生成するグルコースを分光学的に
定量することにより行なつ力。すなわち、0.1Mのラ
クトースを含有する0 0 、 I M リン酸緩衝
液(ρ)17.2) 0.90m1に、O,lOa+
1の酵素液を加え、55°Cで10分間反応させ、33
%トリクロロ酢酸0.05@1を加えて反応を停止させ
た。反応停止させた上記反応液0.1vlに、ベーリン
ガーマンハイム社製グルコース定量キット1.01を加
え、室温で45分間放置したのち、660neにおける
吸光度を測定した。
ラクトースの加水分解により定義した酵素1単位(LU
)は、1分間に1μ[01のラクトースを加水分解する
酵素量である。
)は、1分間に1μ[01のラクトースを加水分解する
酵素量である。
本発明のβ−ガラクトシル基転移酵素は、上記の酵素化
学的諸性質から新規であると判断された。
学的諸性質から新規であると判断された。
[実N例コ
次に、本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。
実施例 1
ラクトース 3.0%、アミノサンV3(甜菜抽出M)
1.4%、グルタミン酸1ナトリウム塩0.2%、酵母
エキス 0.1%、リン酸1カリウム0.1%、硫酸マ
グネシウム0.05%を含有する培地(p)(7,2)
100wlずつを500+1マイヤーフラスコにいれ
、120℃ 1気圧にて15分間オートクレーブ殺菌し
たものに、SAM 1400株を1白金耳ずつ植菌し
、55“Cにて120時間通気撹拌培養した。 培養終
了後、培養物を遠心処理して得た上清2 、277を、
101M リンrae緩面液(pH7,2)で平衡化し
たイオン交換樹脂セパビーズ(SEPABEADS)
FP−DA13カラム(三菱化成製、5cm K 2
0cm)に負荷し、上記l!衝液、次いで0.3M塩化
カリウムを含有する上記mi液でカラムを洗浄後、0.
5M塩化カリウムを含有する上記m%液にてβ−ガラク
トシル基転移酵素を溶出した。活性画分を限外濾過法に
て濃縮し、10wM ワン酸1衝液(pH7,2)に対
して透析した。
1.4%、グルタミン酸1ナトリウム塩0.2%、酵母
エキス 0.1%、リン酸1カリウム0.1%、硫酸マ
グネシウム0.05%を含有する培地(p)(7,2)
100wlずつを500+1マイヤーフラスコにいれ
、120℃ 1気圧にて15分間オートクレーブ殺菌し
たものに、SAM 1400株を1白金耳ずつ植菌し
、55“Cにて120時間通気撹拌培養した。 培養終
了後、培養物を遠心処理して得た上清2 、277を、
101M リンrae緩面液(pH7,2)で平衡化し
たイオン交換樹脂セパビーズ(SEPABEADS)
FP−DA13カラム(三菱化成製、5cm K 2
0cm)に負荷し、上記l!衝液、次いで0.3M塩化
カリウムを含有する上記mi液でカラムを洗浄後、0.
5M塩化カリウムを含有する上記m%液にてβ−ガラク
トシル基転移酵素を溶出した。活性画分を限外濾過法に
て濃縮し、10wM ワン酸1衝液(pH7,2)に対
して透析した。
実1M例2
上記透析内液を、10dリン!2緩衝液(pH7,2)
で平衡化したイオン交換樹脂DEAE−セファロース(
DEAE−Sepharose) CL −6B(ファ
ルマシア製、2.8C■X 20c■)に負荷し、上記
緩衝液、次いで、0.2M塩化カリウムを含有する上記
緩衝液にてカラムを洗浄後、0.2Mから0 、6 M
の塩化カリウムの直wA濃度勾配(総量400m1 )
をかけることによりβ−ガラクトシル基転移酵素を溶出
した。
で平衡化したイオン交換樹脂DEAE−セファロース(
DEAE−Sepharose) CL −6B(ファ
ルマシア製、2.8C■X 20c■)に負荷し、上記
緩衝液、次いで、0.2M塩化カリウムを含有する上記
緩衝液にてカラムを洗浄後、0.2Mから0 、6 M
の塩化カリウムの直wA濃度勾配(総量400m1 )
をかけることによりβ−ガラクトシル基転移酵素を溶出
した。
活性画分を限外濾過法にて濃縮した後、0.15M塩化
カリウムを含む10■Hリン酸緩衝液(pH7,2)で
平衡化したTSKゲルG3000SW−XL (東ソ
ー製)に、濃縮液を数回に分けて負荷し、クロマトグラ
フィーを行なった(流速、1.0 ml/■in;
検出、280n−における吸光度)。 活性画分を限外
濾過法にて濃縮し、10−に リン酸11!!面液(p
H7,2)に対して透析した。
カリウムを含む10■Hリン酸緩衝液(pH7,2)で
平衡化したTSKゲルG3000SW−XL (東ソ
ー製)に、濃縮液を数回に分けて負荷し、クロマトグラ
フィーを行なった(流速、1.0 ml/■in;
検出、280n−における吸光度)。 活性画分を限外
濾過法にて濃縮し、10−に リン酸11!!面液(p
H7,2)に対して透析した。
以上の操作によりえられた精製β−ガラクトシル基転移
酵素の聴話性は240 pNPGU、比活性は10 p
NPGU/sgであった。
酵素の聴話性は240 pNPGU、比活性は10 p
NPGU/sgであった。
実施例3
ラクトース5gを0.05M酢酸緩衝液(pH6,0)
に溶解して10−1とし、これに実施例1で得られたβ
−ガラクトシル基転移酵素[品topNPGUを加え、
65℃T4R間反応させた。反応液を95°Cで5分間
処理して反応を停止させ、1部分を10倍に希釈してこ
れをショーデックス・イオンバックK S 801カラ
ムを用いた高速液体クロマトグラフィー(移動相、水;
カラム温度、70℃:流速、1 sl/win ;検出
、示差屈折計)で分析することにより、反応液の糖組成
を決定した。反応液には、7%の四糖以上のオリゴ糖、
21%の三糖類、48%の三糖類、及び24%の単糖類
(いずれも全糖に対する重量%)が含まれていた。
に溶解して10−1とし、これに実施例1で得られたβ
−ガラクトシル基転移酵素[品topNPGUを加え、
65℃T4R間反応させた。反応液を95°Cで5分間
処理して反応を停止させ、1部分を10倍に希釈してこ
れをショーデックス・イオンバックK S 801カラ
ムを用いた高速液体クロマトグラフィー(移動相、水;
カラム温度、70℃:流速、1 sl/win ;検出
、示差屈折計)で分析することにより、反応液の糖組成
を決定した。反応液には、7%の四糖以上のオリゴ糖、
21%の三糖類、48%の三糖類、及び24%の単糖類
(いずれも全糖に対する重量%)が含まれていた。
実施例4
5gの酵素固定化用担体FE4612(オルガノ製)を
4%NaOH中 50°Cで2時間撹拌し、純水にて洗
浄後、5%グルタルアルデヒド15 m 11=懸濁し
1時間撹拌する。
4%NaOH中 50°Cで2時間撹拌し、純水にて洗
浄後、5%グルタルアルデヒド15 m 11=懸濁し
1時間撹拌する。
その佳、担体を10mM リン酸緩衝液にて洗浄し、
100OUの酵素を含む10mMリン酸緩衝液中に懸濁
し、20間撹拌して固定化する。担体を10 m M
リン酸m?liiにて洗浄し、これを固定化β−ガラ
クトシル基転移酵素とした。固定化における活性収率は
87%であった。 固定化β−ガラクトシル基転移酵素
1gを、60%(W/V)ラクトースを含有する0、0
5M酢酸緩衝液(pH6,0) 100 m lに懸濁
し、65℃で24時間撹拌し反応を行なった。反応液の
1部分を10倍に希釈してこれをショーデックス・イオ
ンバックKS801カラムを用いた高速液体クロマトグ
ラフィー(移動相、水:カラム温度、70C;流速、1
ml/sin ;検出、示差屈折計)で分析すること
により、反応液の糖組成を決定した。 反応液には、3
%の四糖以上のオリゴ糖、25%の三糖類、58%の三
糖類、及び14%の単糖類(いずれも全糖に対する重量
%)が含まれていた。また、以上の反応を1サイクルと
してこれを繰り返し、固定化β−ガラクトシル基転移酵
素の活性半減期を1次反応に従うものとして計算により
求めたところ、固定化β−ガラクトシル基転移酵素の活
性半減期は少なくとも300サイクル以上と求められた
。
100OUの酵素を含む10mMリン酸緩衝液中に懸濁
し、20間撹拌して固定化する。担体を10 m M
リン酸m?liiにて洗浄し、これを固定化β−ガラ
クトシル基転移酵素とした。固定化における活性収率は
87%であった。 固定化β−ガラクトシル基転移酵素
1gを、60%(W/V)ラクトースを含有する0、0
5M酢酸緩衝液(pH6,0) 100 m lに懸濁
し、65℃で24時間撹拌し反応を行なった。反応液の
1部分を10倍に希釈してこれをショーデックス・イオ
ンバックKS801カラムを用いた高速液体クロマトグ
ラフィー(移動相、水:カラム温度、70C;流速、1
ml/sin ;検出、示差屈折計)で分析すること
により、反応液の糖組成を決定した。 反応液には、3
%の四糖以上のオリゴ糖、25%の三糖類、58%の三
糖類、及び14%の単糖類(いずれも全糖に対する重量
%)が含まれていた。また、以上の反応を1サイクルと
してこれを繰り返し、固定化β−ガラクトシル基転移酵
素の活性半減期を1次反応に従うものとして計算により
求めたところ、固定化β−ガラクトシル基転移酵素の活
性半減期は少なくとも300サイクル以上と求められた
。
実施g45
サーモモノスポラ sp、SAM 1546、同 s
p、SAM 1547、サーモアクチノマイセス s
p、SAM 1544および同sp、SAM 15
45の4菌株を、500m1のフラスコ中、100m1
のラクトース3%、ペプトン0.2%、酵母エキス0.
02%、KH2P0.0.2%、NaC10,3%およ
びMg S O,1−H2O0,01%ヲ含ti培地(
1)I(7,2)を用い、55℃で4日間振盪培養して
β−ガ2クトシル基転移#票を得た。
p、SAM 1547、サーモアクチノマイセス s
p、SAM 1544および同sp、SAM 15
45の4菌株を、500m1のフラスコ中、100m1
のラクトース3%、ペプトン0.2%、酵母エキス0.
02%、KH2P0.0.2%、NaC10,3%およ
びMg S O,1−H2O0,01%ヲ含ti培地(
1)I(7,2)を用い、55℃で4日間振盪培養して
β−ガ2クトシル基転移#票を得た。
得られたβ−ガラクトシル基転移酵素は、それぞれ第4
表に示すような性質を有するものであった。
表に示すような性質を有するものであった。
(以下余白)
実施例6
アスペルギルス・オリゼー(l5pztlIi/)15
agztte )起源のラクターゼ(ヤクルト本社製ラ
クターゼY−AO)、バシルス・サーキュランス(8z
c#/as circttlttns )起源のラクタ
ーゼ(大和化成製、ビオラフタ)、および本発明のβ−
ガラクトシル基転移酵素を、それぞれ0、OIM リ
ン酸I!衝液(pH7,0)に溶解し、0.1mg/m
lの溶液を調製した。各酵素溶液を60″Cで1時間イ
ンキュベートした後、ただちに氷冷した。次いで、各酵
素の残存活性をそれぞれの説明書に記載しである最適条
件に従い測定した結果、アスペルギルス・オリゼー起源
のラクターゼ、バシルス・サーキュランス起源のラクタ
ーゼ、および本発明のβ−ガラクトシル基転移酵素の残
存活性は、それぞれ1%、1%および96%であった。
agztte )起源のラクターゼ(ヤクルト本社製ラ
クターゼY−AO)、バシルス・サーキュランス(8z
c#/as circttlttns )起源のラクタ
ーゼ(大和化成製、ビオラフタ)、および本発明のβ−
ガラクトシル基転移酵素を、それぞれ0、OIM リ
ン酸I!衝液(pH7,0)に溶解し、0.1mg/m
lの溶液を調製した。各酵素溶液を60″Cで1時間イ
ンキュベートした後、ただちに氷冷した。次いで、各酵
素の残存活性をそれぞれの説明書に記載しである最適条
件に従い測定した結果、アスペルギルス・オリゼー起源
のラクターゼ、バシルス・サーキュランス起源のラクタ
ーゼ、および本発明のβ−ガラクトシル基転移酵素の残
存活性は、それぞれ1%、1%および96%であった。
実施例7
ラクトース 0.5gを0.05M酢酸59衛溶液(ρ
)16.0)に溶解した溶液に、サーモモノスポラ s
p、SAM 1546、サーモモノスポラ sp、5
A)si 1547、?−モ7クチノマイセス sp
、SAM 1544およびサーモアクチノマイセス
sp、SAM1545の各培養物より得たβ−ガラクト
シル基転移酵素、19NPGUを加えて最紡容量 1.
0mlとし、65℃で8時間反応させた。
)16.0)に溶解した溶液に、サーモモノスポラ s
p、SAM 1546、サーモモノスポラ sp、5
A)si 1547、?−モ7クチノマイセス sp
、SAM 1544およびサーモアクチノマイセス
sp、SAM1545の各培養物より得たβ−ガラクト
シル基転移酵素、19NPGUを加えて最紡容量 1.
0mlとし、65℃で8時間反応させた。
反応液を95°Cで5分間処理して反応を停止させ、1
部分を10倍に希釈してこれをショーデックス・イオン
バック KS−801カラムを用いた高速液体クロマト
グラフィー(移動相、水;カラム温度、70℃;流速、
1ml/min;検出:、示差屈折計)で分析すること
により反応液の糖組成を決定した。
部分を10倍に希釈してこれをショーデックス・イオン
バック KS−801カラムを用いた高速液体クロマト
グラフィー(移動相、水;カラム温度、70℃;流速、
1ml/min;検出:、示差屈折計)で分析すること
により反応液の糖組成を決定した。
この結果、いずれの起源のβ−ガラクトシル基転移酵素
を用いた場合でも、反応液には3〜7%の4糖以上のオ
リゴ糖、18〜21%の3WM類、48〜52%の2[
類および21〜26%の単糖類(いずれも全糖に対する
重量%ンが含まれていた。
を用いた場合でも、反応液には3〜7%の4糖以上のオ
リゴ糖、18〜21%の3WM類、48〜52%の2[
類および21〜26%の単糖類(いずれも全糖に対する
重量%ンが含まれていた。
実IM例8
サツカロポリスボラ・レクチヴイルグ
ラ (5zcclrzrapa/psporz rg
clivirguli )のβ−ガラクトシル基転移酵
素を利用 した、ガラクトオリゴ糖を含有する乳 糖分解乳の製造: 牛乳(乳糖濃度4.8%、篇脂乳固形分濃度8.3%〉
を60″Cに加温し、これにサツカロポリスボラ・レク
チヴイルグラがら得たβ−ガラクトシル基転移酵素を乳
1!Igあたり16〜24LU添加し、4〜7時間反応
させた。次いでショーデックス・イオンバックKS80
1カラムを用いた高速液体クロマトグラフィー(移動相
、水:カラム温度、70℃;流速、1.0ml/min
;検出、示差屈折計)により、上記処理後の牛乳中の糖
組成を分析した。その結果は第5表のとおりてあった。
clivirguli )のβ−ガラクトシル基転移酵
素を利用 した、ガラクトオリゴ糖を含有する乳 糖分解乳の製造: 牛乳(乳糖濃度4.8%、篇脂乳固形分濃度8.3%〉
を60″Cに加温し、これにサツカロポリスボラ・レク
チヴイルグラがら得たβ−ガラクトシル基転移酵素を乳
1!Igあたり16〜24LU添加し、4〜7時間反応
させた。次いでショーデックス・イオンバックKS80
1カラムを用いた高速液体クロマトグラフィー(移動相
、水:カラム温度、70℃;流速、1.0ml/min
;検出、示差屈折計)により、上記処理後の牛乳中の糖
組成を分析した。その結果は第5表のとおりてあった。
なお、ガラクトシル基転移酵素のラクトース加水分解活
性は、上記反応後もほぼ100%残存していた。
性は、上記反応後もほぼ100%残存していた。
第 5 表
未1611 la/gl’lJI 価/gFJ7時間
4時間 3目以上のオリゴ― 0.0(り 107■ 11.4(り 11111戚 対量1 頗 23.3 (%) 単一II O,o 66.0 63.9実施例
9 ガラクトオリゴ糖を含有する乳糖分解乳の製造における
、サツカロポリスボラ・レクチヴイルグラから得たβ−
ガラクトシル基転移酵素の牛乳中での安定性をさらに詳
しく調べた。
4時間 3目以上のオリゴ― 0.0(り 107■ 11.4(り 11111戚 対量1 頗 23.3 (%) 単一II O,o 66.0 63.9実施例
9 ガラクトオリゴ糖を含有する乳糖分解乳の製造における
、サツカロポリスボラ・レクチヴイルグラから得たβ−
ガラクトシル基転移酵素の牛乳中での安定性をさらに詳
しく調べた。
牛乳(乳I!濃度4.8%、無脂乳固形分濃度8.3%
)を60.65.70“Cの各温度に加温し、これにサ
ツカロポリスボラ・レクチヴイルグラのβ−ガラクトシ
ル基転移酵素を牛乳1mlあたり24pNPGU添加し
、反応を開始した。反応中の酵素の残存活性を求めるた
め、反応開始後1.2.4.8時間後に、反応液の一部
(0,02m1)をサンプリングして1.0mlの牛乳
に添加し、60°Cで1時間反応させ、その牛乳中の乳
糖の減少速度を測定した。また、これと同様の実験を、
バシルス・サーキュランス <Bacillus circu/arts)のβ−ガ
ラクトシダーゼ(ビオラフタ、大和化成製)についても
行ない、比較した。この結果を第6表に示す。
)を60.65.70“Cの各温度に加温し、これにサ
ツカロポリスボラ・レクチヴイルグラのβ−ガラクトシ
ル基転移酵素を牛乳1mlあたり24pNPGU添加し
、反応を開始した。反応中の酵素の残存活性を求めるた
め、反応開始後1.2.4.8時間後に、反応液の一部
(0,02m1)をサンプリングして1.0mlの牛乳
に添加し、60°Cで1時間反応させ、その牛乳中の乳
糖の減少速度を測定した。また、これと同様の実験を、
バシルス・サーキュランス <Bacillus circu/arts)のβ−ガ
ラクトシダーゼ(ビオラフタ、大和化成製)についても
行ない、比較した。この結果を第6表に示す。
(以下余白)
第
表
OO
00
00
00
00
00
00
以
上
出
願
人
サンド
リー株式会社
手続補正書(自発)
平成2年
11月
8日
Claims (7)
- (1)下記の理化学的性質をもつ新規β−ガラクトシル
基転移酵素。 [1]作用 転移反応: β−D−ガラクトピラノシドGal−X 1モルと、ガ
ラクトシル基受容体Y 1モルとから、あらたなβ−D
−ガラクトピラノシドGal−Y1モルと、X 1モル
を生成する。 ここで、X、Yはいずれも水以外の化合物で、糖あるい
はアグリコンである。 加水分解:1モルのβ−D−ガラクトピラノシドGal
−Xを加水分解し、1モルのXと1モルのガラクトース
を生成する。 [2]基質特異性ラクトースおよびp−ニトロフェニル
−β−D−ガラクトピラノシドを加水分解するが、p−
ニトロフェニル−α−D−ガラクトピラノシドは加水分
解しない。 [3]至適pH5.0〜8.0 [4]pH安定性55℃、15分間の処理の場合、pH
5以上8以下で安定。 [5]熱安定性0.01Mリン酸緩衝液(pH7.2)
中、60℃、1時間のインキュベート後でも80%以上
の活性を有する。 あるいは、少なくとも1Mラクトースを含有する同上緩
衝液中、65℃で少なくとも24時間インキュベートし
た後も、80%以上の活性を有する。 - (2)放線菌に属する微生物により産生される請求項第
1項記載の新規β−ガラクトシル基転移酵素。 - (3)放線菌に属する微生物がサッカロポリスポラ(S
accharopolyspora)属、サーモモノス
ポラ(Thermomonospora)属またはサー
モアクチノマイセス(Thermo−actinomy
ces)属に属する微生物から選ばれたものである請求
項第2項記載の新規β−ガラクトシル基転移酵素。 - (4)放線菌に属し、請求項第1項記載の新規β−ガラ
クトシル基転移酵素を産生する微生物を培養し、該培養
物よりβ−ガラクトシル基転移酵素酵素を分離、取得す
ることを特徴とする新規β−ガラクトシル基転移酵素の
製造法。 - (5)放線菌に属し、請求項第1項記載の新規β−ガラ
クトシル基転移酵素を産生する微生物がサッカロポリス
ポラ(Saccharopolyspora)属、サー
モモノスポラ(Thermomonospora)属ま
たはサーモアクチノマイセス(Thermoactin
omyces)属に属する微生物である請求項第5項記
載の新規β−ガラクトシル基転移酵素の製造法。 - (6)請求項第1項記載の新規β−ガラクトシル基転移
酵素を用いることを特徴とする、次の一般式( I ) Gal−(Gal)n−X( I ) (式中、Galはガラクトース残基を、Xは糖類若しく
は配糖体を示し、nは0−4の整数である) で表されるオリゴ糖または糖修飾配糖体の製造法。 - (7)請求項第1項記載のβ−ガラクトシル基転移酵素
を獣乳に作用させ、原料乳中の乳糖の一部または全部を
一般式(II) Gal−(Gal)n−Glc(II) (式中、Galはガラクトース残基を、Glcはグルコ
ース残基示し、nは1−4の整数である) で表されるガラクトオリゴ糖に変換することを特徴とす
るガラクトオリゴ糖含有加工乳の製造方法。
Priority Applications (9)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DK91103967.5T DK0456986T3 (da) | 1990-03-16 | 1991-03-14 | Varmeresistent beta-galactosyltransferase, fremtillingsfremgangsmåde herfor og anvendelse heraf |
DE69115556T DE69115556T2 (de) | 1990-03-16 | 1991-03-14 | Wärmebeständige Beta-Galactosyltransferase, ihr Herstellungsverfahren und ihre Verwendung |
US07/669,574 US5153128A (en) | 1990-03-16 | 1991-03-14 | Heat-resistant β-galactosyltransferase, its production process and its use |
EP91103967A EP0456986B1 (en) | 1990-03-16 | 1991-03-14 | Heat resistant beta-galactosyltransferase, its production process and its use |
AT91103967T ATE131869T1 (de) | 1990-03-16 | 1991-03-14 | Wärmebeständige beta-galactosyltransferase, ihr herstellungsverfahren und ihre verwendung |
AU72958/91A AU633707B2 (en) | 1990-03-16 | 1991-03-15 | Novel heat-resistant beta-galactosyltransferase, its production process and its use |
CA002038352A CA2038352C (en) | 1990-03-16 | 1991-03-15 | Heat-resistant .beta.-galactosyltransferase, its production process and its use |
US07/907,639 US5234828A (en) | 1990-03-16 | 1992-07-02 | Process for producing novel heat-resistant β-galactosyltransferase |
US08/055,553 US5861289A (en) | 1990-03-16 | 1993-05-03 | Heat-resistant β-galactosyltransferase, its production process and its use |
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP6431890 | 1990-03-16 | ||
JP2-64318 | 1990-03-16 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH03277276A true JPH03277276A (ja) | 1991-12-09 |
JP2970932B2 JP2970932B2 (ja) | 1999-11-02 |
Family
ID=13254770
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2246792A Expired - Fee Related JP2970932B2 (ja) | 1990-03-16 | 1990-09-17 | 新規耐熱性β―ガラクトシル基転移酵素、その製造法及びその用途 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP2970932B2 (ja) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2000041693A (ja) * | 1998-07-27 | 2000-02-15 | Morinaga Milk Ind Co Ltd | ガラクトオリゴ糖の製造方法 |
US6797496B1 (en) | 1999-08-19 | 2004-09-28 | Showa Sangyo Co., Ltd. | Process for producing glycosides |
JP2016529912A (ja) * | 2013-09-05 | 2016-09-29 | フリースランドカンピナ ネーデルラント ベー.フェー. | ガラクト−オリゴサッカライドの製造 |
-
1990
- 1990-09-17 JP JP2246792A patent/JP2970932B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2000041693A (ja) * | 1998-07-27 | 2000-02-15 | Morinaga Milk Ind Co Ltd | ガラクトオリゴ糖の製造方法 |
US6797496B1 (en) | 1999-08-19 | 2004-09-28 | Showa Sangyo Co., Ltd. | Process for producing glycosides |
JP4504607B2 (ja) * | 1999-08-19 | 2010-07-14 | 焼津水産化学工業株式会社 | 配糖体の製造方法 |
JP2016529912A (ja) * | 2013-09-05 | 2016-09-29 | フリースランドカンピナ ネーデルラント ベー.フェー. | ガラクト−オリゴサッカライドの製造 |
JP2019213532A (ja) * | 2013-09-05 | 2019-12-19 | フリースランドカンピナ ネーデルラント ベー.フェー. | ガラクト−オリゴサッカライドの製造 |
US10590448B2 (en) | 2013-09-05 | 2020-03-17 | Friesland Campina Nederland B.V. | Production of galacto-oligosaccharides |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2970932B2 (ja) | 1999-11-02 |
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