JPS63304981A

JPS63304981A - タンナ−ゼの製造方法

Info

Publication number: JPS63304981A
Application number: JP14150987A
Authority: JP
Inventors: Shigemichi Okamura; 岡村　成通; Kiyoshi Mizusawa; 水沢　清; Kosuke Takei; 武井　宏介; Yasuhiko Imai; 今井　泰彦; Saburo Ito; 伊東　佐武郎
Original assignee: Kikkoman Corp; Inabata and Co Ltd
Current assignee: Kikkoman Corp; Inabata and Co Ltd
Priority date: 1987-06-08
Filing date: 1987-06-08
Publication date: 1988-12-13
Anticipated expiration: 2009-05-02
Also published as: JPH0632609B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明はタンナーゼの製造方法に関する。

タンナーゼは、例えば紅茶のクリームダウンの防止剤、
あるいはビール製造の際に清澄化に使用される等極めて
有用な酵素である。

〔従来の技術〕

従来、タンナーゼの製造方法としては、例えば粉砕され
たタラの木の莢からメタノールを用いて抽出し、該抽出
物を噴霧乾燥したものを含む培地に、アスペルギルス・
ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）の変異
株を培養してタンナーゼを製造する方法が知られている
〔ジエイ・ファーメントテクノル。

（Ｊ、Ｆｅｒｍｅｎｔ、　Ｔｅｃｈｎｏｌ、）＋　Ｖｏ
ｌ、５０＋　Ｎｏ、　６　＋　ｐ、３６１〜３７０　（
１９７２））　。

本発明者等も、先にアスペルギルス属に属し、タンナー
ゼ生産能を有する微生物を、タンニン含有植物体の極性
溶媒抽出物を含み、かつ培地中の金属イオン類を除去も
しくは減少させるか、又は該金属イオン類を錯体とした
培地に培養し、培養物からタンナーゼを採取することに
より収率よくかつ短時間にタンナーゼを得る方法を特許
出願した（特願昭６１−１１６２２３号）。

〔発明が解決しようとする問題点〕

上記した本発明者等の方法は、従来の方法に比べて著し
く収率を改善するものであるが、培地中に金属イオン類
が存在すると、これがタンナーゼ生産を著しく阻害し、
そのためタンナーゼ生産菌の培養に際してあらかじめ培
地中の金属イオン類を除去もしくは減少させるか、又は
該金属イオン類を錯体とする等の工程が必要であった。

本発明は、この問題を解決したもので、従来の方法に比
べて工程が簡略化され、かつ著しく収率よくタンナーゼ
を製造する方法を提供することを目的とするものである
。

（問題点を解決するための手段〕本発明者等は、金属イオン類の存在により、タンナーゼ
生産が阻害されない変異株を誘導すれば上記問題点を解
決できるものとの着想のもとに種々検討した結果、アス
ペルギルス属に属し、タンナーゼ生産能を有する菌株に
、変異処理を加えて得られた変異株が、培地中に金属イ
オン類が存在しても何ら阻害されることなく培養物中に
著しく収率よくタンナーゼを生産することを知り本発明
を完成した。

即ち、本発明は、アスペルギルス属に属し、タンナーゼ
生産能を有し、かつ金属イオン類の存在によっても前記
タンナーゼ生産能が阻害されない微生物を、タンニンを
含有する培地に培養し、培養物からタンナーゼを採取す
ることを特徴とするタンナーゼの製造方法である。

以下、本発明を具体的に説明する。

先ず、本発明に用いられる菌としては、アスペルギルス
属に属し、タンナーゼ生産能を有し、かつ金属イオン類
の存在によってもタンナーゼ生産能が阻害されない微生
物であれば、如何なる菌でもよいが、その具体例として
は、例えばアスペルギルス・オリゼー１９−３０が挙げ
られる。このアスペルギルス・オリゼー１９−３０は、
アスペルギルス・オリゼーｔｐｏ　４２０６を親株とし
て、この胞子に紫外線照射、Ｘ線照射、あるいはナイト
ロジェン・マスタード処理等を施して変異を行なわせ得
られたもので、その菌学的性質を親株と比較して示すと
第１表の如くである。

（本頁以下余白）第１表１、形態学的性質（イ）麦芽汁寒天培地（３０℃、５日間）（ロ）ツアペ
ック寒天培地（３０℃、５日間）２、生理学的性質（注）金属イオン含有培地でのタンナーゼ生産能の測定
は、以下の如く行った。

タラパラター（ペルー国、エルソール社製）　４−を温
水２４１に添加し、温度６０℃で１時間攪拌しつつタン
ニンを抽出し、これを木綿布を用いて常法により圧搾し
て濾液を得、更に、これを常法により９０００ｒ、ｐ、
ｍ、で１５分間遠心分離処理して７．２％（％１／ｖ）
のタンニンを含有するタンニン溶液２ＯＮを得た。

上記タンニン溶液１０１を、流速３ＳＶで、常法により
再生したダイヤイオン５ＫＩＢ強酸性陽イオン交換樹脂
（三菱化成工業社製）の充填されたカラム（４Ｘ６０３
）に通じて金属イオン類の除去もしくは減少された７、
０％（Ｗ／Ｖ）のタンニンを含有するタンニン溶液を得
た。

次いで、このようにして調製されたタンニン溶液を用い
、ｌ試験区光リグルコース１％（Ｗ／Ｖ）、リン酸１ア
ンモニウム１．４％（Ｗ／Ｖ）　、リン酸１カリウム０
．２％（Ｗ／Ｖ）、硫酸マグネシウム７水和物０．１％
（Ｗ／Ｖ）及びタンニン３％（Ｗ／Ｖ）　（ｐ　Ｈ５，
７０）からなる組成の培地を調製し、それぞれ５０−を
５００−容坂ロフラスコに分注した。そして上記組成の
培地に更に上記金属イオン類を１０■／ｌとなる如く添
加し夫々温度１２０℃で圧力１ｋｇ／ｃｊ（ゲージ圧力
）の飽和水蒸気を５分間作用させ、殺菌処理された培地
をそれぞれ得た。

上記の培地に、夫々麹汁寒天斜面培地を用いて前壇養し
て得たアスペルギルス・オリゼー１９−３０（本菌株）
及びアスペルギルス・オリゼーＩＰＯ４２０６（親株）
を１白金耳ずつ接種し、温度３０℃で９６時間振盪培養
（１４０ｒ、ｐ、ｍ、／分）し、培養液を得た。

上記培養液を夫々常法により１２０００ｒ、ｐ、ｍ、で
１５分間遠心分離処理して上澄液を得、該液中のタンナ
ーゼ活性を、ニス、イイブチ、ワイ、ミノダ及びケイ、
ヤマダ（Ｓ、　ｌ１ｂｕｃｈｉ、　Ｙ、　Ｍｉｎｏｄａ
　ａｎｄ　Ｋ。

Ｙａｍａｄａ）：　Ａｇｒｉｃ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ＋ｓ
、Ｖｏｌ、３１＋　Ｎｏ、５＋　ｐ、５１３〜５１８　
（１９６７）記載の方法と同様にして測定して得た結果
を夫々＋、−で示した。

以上の結果から、本菌株は形態的性質において、集落の
色及び形状が、白色ないし白黄色で中央が隆起している
こと、胞子類の形がほうき状であること、また生理的性
質において、本菌株は金属イオン含有培地でのタンナー
ゼ生産能が高いことから親株とは異なる新菌株であるこ
とが理解される。

なお、アスペルギルス・オリゼー１９−３０は、工業技
術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第９３９２号（
ＦＥＲＭ　　Ｐ−９３９２）として寄託されている。

次に、本発明方法においてタンナーゼ生産に使用される
培地としては、タンニンを含有し、更に必要により窒素
源、炭素源、無機物、ビタミン等より選択されたものを
適量含有する培地であれば、合成もしくは天然培地等如
何なるものでも使用可能である。

そしてタンニン含有物としては、タンニンを含むもので
あれば、如何なるものでもよいが、好適には植物起源の
もの、例えばタラの木の莢、ウルシ科植物であるヌルデ
の樹皮および葉等が挙げられる。これらタンニン含有物
を、例えば通常の破砕手段により処理して得られた破砕
物から、例えば水、メタノール、エタノール、酢酸エチ
ル等の極性溶媒を用いて、例えば温度６０℃で１時間程
度加熱処理し、常法により固液分離してタンニン含有抽
出物を得ることができる。

そして培地へのタンニン含有抽出物の添加量は、例えば
タンニン濃度として、０．５％（Ｗ／ｌ／）以上、好ま
しくは２〜５％（Ｗ／Ｖ）である。

培地の窒素源としては、例えばカゼイン、硝酸カリウム
、硝酸ナトリウム、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウ
ム、リン酸１アンモニウム、リン酸２アンモニウム、尿
素、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、メ
チオニン、トリプトファン等が挙げられる。

培地の炭素源としては、例えばアラビノース、グルコー
ス、マンノース、ラムノース、ソルボース、シェークロ
ース、キシロース、メリビオース、クリセロース、ラク
トース、マルトース、マンニトール、ラフィノース、澱
粉、セロビオース、トレハロース等が挙げられ、無機物
としては、例えば硫酸マグネシウム、リン酸１カリウム
等が用いられる。

本発明において、アスペルギルス・オリゼー１９−３０
の培養は、固体培養法でもよいが、通常液体培養法を採
用するのが有利であり、具体的には振盪培養、攪拌培養
、通気培養等により好気的に培養を行なう。

培養温度は、例えば通常２０〜４０℃、好ましくは２５
〜３５℃で、初発ｐＨは例えば５．５〜５．７、培養時
のｐＨは例えば５．５〜２．５、好ましくはＰＨ５，０
〜３．５である。

このような培養条件下に、培養時間は培養形態によって
も異なるが、２日間以上、好ましくは３〜５日間程度培
養することにより、培養物中にタンナーゼが生産蓄積さ
れる。

培養終了後、該培養物よりタンナーゼを採取するには、
通常の酵素採取手段を用いて得ることができる０例えば
、培養物を濾過、遠心分離などして固形分を除去したも
のに、硫酸アンモニウム、アルコール、アセトン等を添
加して分画し、沈澱物を採取し、これを水に対して透析
し、粗酵素液を得るか、あるいはこれを真空乾燥して粗
酵素粉末を得る。

上記粗酵素もしくは粗酵素粉末より更に精製酵素標品を
得るには、例えばセファデックスＧ−２００等を用いる
ゲル濾過法、イオン交換体、ハイドロキシアパタイト等
を用いる吸着溶出法、シラ稠密度勾配遠心法等の沈降法
、アフィニティクロマトグラフィー法、分子ふるい膜も
しくは中空糸膜等を用いる分画法等を適宜選択し、組み
合わせて実施することにより精製されたタンナーゼ標品
を得ることができる。

上記精製手段により得られた精製タンナーゼの理化学的
性質は、アグル、パイオル、ケム、　（Ａｇｒ。

Ｂｉｏｌ、　　Ｃｈｅｓｓ、）、　ＶＯｌ、３２．　　
Ｎ１７　、　　ｐ、８０３〜８０９（１９６８）記載の
タンナーゼの理化学的性質と全く同様である。

〔実施例〕

以下、本発明を実施例を挙げて具体的に説明する。

実施例タラパウダー（ペルー国、エルソール社製）４瞳を温水
２４１に添加し、温度６０℃で１時間攪拌しつつタンニ
ンを抽出し、これを木綿布を用いて常法により圧搾して
濾液を得、更に、これを常法により９０００ｒ、ｐ、ｍ
、で１５分間遠心分離処理して７．２％（Ｗ／Ｖ）のタ
ンニンを含有するタンニン溶液２ＯＮを得た。

次いで、このようにして調製されたタンニン溶液を用い
、グルコース１％（Ｗ／Ｖ）　、リン酸１アンモニウム
１．４％（Ｗ／Ｖ）、リン酸１カリウム０．２％（Ｗ／
Ｖ）、硫酸マグネシウム７水和物０．１％（Ｗ／Ｖ）及
びタンニン３％（％４ハ）（ｐＨ５，７０）からなる組
成の培地を調製したのち５０−を５００−容坂ロフラス
コに分注した。そして温度１２０℃で圧力１　ｋｇ　／
　ａＪ（ゲージ圧力）の飽和水蒸気を５分間作用させ、
殺菌処理された培地を得た（本発明区分、キレート剤無
添加培地）。

一方、上記タンニン溶液を用いて上記組成の培地を調製
し、これにキレート剤として０−フェナントロリンを３
０■／ｌとなる如く添加し、上記したと同様に殺菌処理
し、殺菌された培地を得た（本発明区分、キレート剤添
加培地）。

このようにして得た培地に、麹汁寒天斜面培地を用いて
前培養して得たアスペルギルス・オリゼー１１９−３０
（ＦＥＲＰ−９３９２）を１白金耳ずつ接種し、温度３
０℃で９６時間振盪培養（１４０ｒ、ｐ、ｓ。

７分）し、培養液を得た。なお、対照区分として、アス
ペルギルス・オリゼーＩＦＯ４２０６を用いる以外は上
記と全く同様にして培養液を得た。

上記培養液を夫々常法により１２０００ｒ、ｐ、ｍ、で
１５分間遠心分離処理して上澄液を得、該液中のタンナ
ーゼ活性を、ニス、イイブチ、ワイ、ミノダ及びケイ、
ヤマダ（Ｓ、　ｌ１ｂｕｃｈＬ　Ｙ、　Ｍｉｎｏｄａ　
ａｎｄ　Ｋ。

Ｙａｍａｄａ）：　　Ａｇｒｉｃ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ
、Ｖｏｌ、３１．　　Ｎｏ、５．　　ｐ、５１３〜５１
Ｂ（１９６７）記載の方法と同様にして測定して得た結
果を夫々下記第２表に示した。

上記のような培養操作を繰り返して得られた培養液９１
を、夫々常法により吸引濾過し菌体を濾別して濾液を得
、これにセライト　（和光純薬工業社製）５００　ｇを
添加し、充分混和させたのち、再び常法により吸引濾過
して清澄化したものに、夫々硫酸アンモニウムを０．８
飽和となる如く添加して沈澱物を生成させ、常法により
９０００ｒ、ｐ、＋＋＋、で１５分間遠心分離処理して
沈澱物を得た。

該沈澱物を５００−の蒸留水に溶解したものを常法によ
り１２０００ｒ、ｐ、−、で１５分間遠心分離処理して
不溶物を除去して得た上清液を、５℃で２４時間常法に
より透析して透析物を得た。この透析物を、再び０．０
１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ５，０）中で透析して得た試
料を、同緩衝液で平衡化済みのＤＥＡＥセファデックス
Ａ−５０（ファルマシア・ファインケミカル社製）の充
填されたカラム（４Ｘ１０ｃｍ）に通じ、更に２００−
の同緩衝液で上記カラムを洗浄したのち、上記樹脂に吸
着されたタンナーゼを０．０１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ
５，０）中の塩化ナトリウム０−ＩＭ迄の直線的濃度勾
配溶出法で溶出してタンナーゼ活性を有するフラクショ
ンを集め、これを０．０１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ３，
５）中で透析して透析物を得た。

更にこの透析物を、同クエン酸緩衝液で平衡化済みのＳ
ＰセファデックスＣ−５０（ファルマシア・ファインケ
ミカル社製）の充填されたカラム（２，６Ｘ２０Ｃ１ｌ
）に通じ、同クエン酸緩衝液１００ｍを用いて洗浄し、
樹脂に吸着されたタンナーゼを、０．０１Ｍクエン酸緩
衝液（ｐＨ３，５）中の塩化ナトリウムＯ〜０．２５Ｍ
の直線的濃度勾配溶出法で溶出し、タンナーゼ活性区分
を採取する操作を２度繰り返してタンナーゼ活性区分を
得た。

次いで、得られたタンナーゼ活性区分を限外濾過膜（ア
ミコン・ファー・イースト・リミテッド社製、分画分子
量５０．０００）及びコロジオンバック（ザートリュー
ス社製）を順次用いて２−迄濃縮したものを、０．１　
Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ５，０）で平衡化済みのセファ
デックスＧ−２００（ファルマシア・ファインケミカル
社製）の充填されたカラム（２，６Ｘ１００（Ｊ）を用
いてゲル濾過し、タンナーゼ活性区分を採取し、更に同
一条件下でゲル濾過して得た精製タンナーゼの重量及び
比活性を夫々下記第２表に示した。

第２表に示す如く、対照区分がキレート剤添加、無添加
培地によってタンナーゼの収量に差が生じるのに比べ、
本発明区分は、キレート剤添加、無添加に関係なく著し
くタンナーゼの収量が増加することがわかる。

〔発明の効果〕

上述した如く本発明によれば、工程を簡略化し、著しく
収率よくかつ短時間のうちにタンナーゼを得ることがで
きるので、本発明は産業上極めて有用である。

Claims

【特許請求の範囲】１、アスペルギルス属に属し、タンナーゼ生産能を有し
、かつ金属イオン類の存在によっても前記タンナーゼ生
産能が阻害されない微生物をタンニンを含有する培地に
培養し、培養物からタンナーゼを採取することを特徴と
するタンナーゼの製造方法。２、金属イオンが銅又は鉄である特許請求の範囲第１項
記載の製造方法。