JPH0269181A - スーパーオキシドディスムターゼの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明はスーパーオキシドディスムターゼの製造方法に
関し、詳しくは藻類を処理してその菌体内スーパーオキ
シドディスムターゼを増加させて大量に効率よくスーパ
ーオキシにディスムターゼを製造する方法に関する。

スーパーオキシドディスムターゼ（以下、ＳＯＤと略記
する。）は超酸化物不均化酵素とも称され、生体内で脂
質、不飽和脂肪酸などの細胞内成分の自動酸化や外部か
らの可視光線、紫外線、放射線などの影晋により生じた
スーパーオキシドアニオンラジカル（０−）の不均化反
応を触媒する酵素である。ＳＯＤは動物、植物、微生物
に存在することが知られており、その用途に関する研究
が行われ、食品等の被酸化性物質の酸化抑制（特開昭５
Ｏ−４０７８５）　；化粧料の１成分として皮膚１毛髪
の保護や皮膚への色素沈着抑制、皮膚に対する抗炎症作
用、さらには化粧料組成物を構成する成分の変改防止（
特開昭５１−６３９４９．同５５−８７７１２）などの
作用が見出されている。さらに、抗炎症剤として慢性関
節リウマチ、変形性関節症、放射線照射による副作用、
ある種の泌尿器疾患などの治療に用いることも提案され
ている。

そこで、ＳＯＤを工業的に大量に生産する技術の開発が
望まれている。

［従来の技術、発明が解決しようとする課題］ＳＯＤを
大量生産する方法として微生物の利用が考えられ、現在
までにホトバクテリウム属（特開昭５Ｏ−４０７８５）
　、セラチア属（特開昭５７−２９２８５）　。

などの細菌やアスペルギルス属、ペニシリウム属トリコ
デルマ属などのカビ（特公昭６Ｏ−１２０２４）サツカ
ロミセス腐などの酵母（特開昭８２−７９７１７）など
を用いてＳＯＤを製造する方法が提案されている。

しかしながら、例えば大腸菌などの菌体に含まれるＳＯ
Ｄを採取して食品や化粧品等の素材として用いる場合、
安全性の問題が心配とされる。

これに対して藻類は蛋白質、β−カロチン、ビタミン類
等を多量に含み栄養バランスが良いため、従来より食品
、飼料等の原料として用いられており、大腸菌等に比べ
てＳＯＤの供給源として優れていると考えられる。しか
るに、藻類にＳＯＤが含まれていることは知られている
ものの該藻類の菌体内ＳＯＤを増加させてＳＯＤを大量
に生産する方法に関しては全く知られていない。

［課題を解決するための手段］ 本発明者らは藻類によるＳＯＤの生産方法について検討
を重ね、藻類の培養方法を改善することによって藻類の
菌体内ＳＯＤを増加させ、効率よ＜　ＳＯＤを製造する
方法を見出し、本発明を完成するに至フたのである。

すなわち、本発明は以下のＳＯＤの製造方法を提供する
ものである。

（１）スーパーオキシドディスムターゼを含有するに頚
を鉄イオンおよび／またはマンガンイオンを５０μＭ以
上の濃度で含有する処理液で処理し、次いで該藻類から
スーパーオキシドディスムターゼを採取することを特徴
とするスーパーオキシドディスムターゼの製造方法。

（２）スーパーオキシドディスムターゼを含有する藻類
を酸素濃度２２容量％以上の気体と接触させて処理し、
次いで該藻類からスーパーオキシドディスムターゼを採
取することを特徴とするスーパーオキシドディスムター
ゼの製造方法。

（３）スーパーオキシドディスムターゼを含有する藻類
を１００〜４００μｍＥｉｎｓｔｅｉｎｓ／ｍ’／ｓｅ
ｃ、の光照射処理し、次いで該藻類からスーパーオキシ
ドディスムターゼを採取することを特徴とするスーパー
オキシドディスムターゼの製造方法。

（４）スーパーオキシドディスムターゼを含有する藻類
を鉄イオンおよび／またはマンガンイオンを５０ｕＭ以
上の濃度で含有する処理液中で酸素濃度２２容量％以上
の気体と接触させ、かつｉｏｏ〜４００μ・Ｅｉｎｓｔ
ｅｉｎｓ／ｍ２／ｓｅｃ、の光照射処理し、次いで該藻
類からスーパーオキシドディスムターゼを採取すること
を特徴とするスーパーオキシドディスムターゼの製造方
法。

本発明が適用される藻類としてはＳＯＤ生産能を有する
ものであれば、いずれの属に属する藻類でもよい。この
ような藻類の具体例としてＭ％のシネココツカス（Ｓｙ
ｎｅｃｈｏｃｏｃｕｓ）属、スピルリナ（Ｓｐｉｒｕｌ
ｉｎａ）属、アナベナ（Ａｎａｂａｎａ）属、アナシス
タス（Ａｎａｃｙｓｔｉｓ）属等や緑藻のクロレラ（Ｃ
ｈｌｏｒｅｌｌａ）属、ドナリエラ（Ｄｕｎａｌｉｅｌ
ｌａ）属等を挙げることができる。そのほか、これら藻
類を通常の微生物突然変異誘導法、たとえば紫外線。

Ｘ線、γ線などを照射する物理的処理、ニトロソグアニ
ジンなどの薬剤を用いる化学的処理等によって得られた
ＳＯＤ高生産性突然変異株や遺伝子組換え技術によって
ＳＯＤ遺伝子を導入して作成されたＳＯＤ高生産株等も
本発明に使用することが出来る。

本発明によって得られるＳＯＤの食品、化粧品等への利
用を考慮すると、使用する藻類としては既に食品、飼料
などとして用いられ、安全性が確認されているスピルリ
ナやクロレラ等が好適である。しかも、これら藻類は屋
外での大量培養法が確立されており、大量のＳＯＤを得
るための原料として通している。

ＳＯＤを含有する藻類のＳＯＤ含有量を増加させるため
の処理とは、該藻類が生育または生存できる組成物、た
とえば該藻類の培地（ＳＯＴ培地、ＢＧ−１１培地など
）、リン酸緩衝液（特にｐＨ７，８に調整したもの）（
以下、処理液と称する。）に該藻類を接種または懸濁し
、下記の条件にて所定期間培養または放置することを意
味する。

本発明に用いられる処理液としての培地は藻類が良好に
生育できるものであればよく、特に制限はないが、一般
的にはスピルリナ・プラテンシス（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ
　ｐｌａｔｅｎｓｉｓ）培地（ＳＯＴ培地）やＢＧ−１
１培地などが好適である。また、リン酸緩衝液について
はｐ）１７．８に調整したものが好適である。

上記の処理液に■鉄イオンおよび／またはマンガンイオ
ンを５ＯａＭ以上の濃度、通常は５０〜１５００μＭ１
好ましくは１００〜１０００μＭとなるように加える、
■酸素濃度２２容量％以上の気体を導入する、■１００
〜４００μｍＥｉｎｓｔｅｉｎｓ／ｍ２／ｓｅｃ、の光
を照射する、■これら条件■〜■のすべてを組合せるの
うちのいずれかの条件を採用し、藻類を処理液中で培養
または放置する。ここで、鉄イオンやマンガンイオンの
供給源としてはＦｅＳＯ４・７　Ｈ２０やＭｎ５Ｏａ・
７Ｈ２０などがあり、酸素濃度２２容量％以上の気体と
藻類を接触させる方法としては、培地等に酸素通気した
り、気相を酸素で置換する方法や加圧下に通気する方法
などが考えられる。また、光源としては太陽光のばか蛍
光灯、陽光ランプなどを処理液表面で１００〜４００μ
・Ｅｉｎｓｔｅｉｎｓ／ｍ’／ｓｅｃ、の光強度となる
ように直接もしくは集光して用いる。

上記■〜■のいずれかの条件下で藻類を処理するにあた
り、効率よく、かつ経済的に行うには、たとえば従来法
により屋外で太陽光の下にて大量に培養した菌体を集め
、最初から高濃度の菌体懸濁液を調製して処理すること
が望ましい。このようにすれば、使用する処理液量、光
量１通気量などが少量で足り、設備的にも小さな発酵槽
を用いて効率的な処理が可能である。また、藻類の培養
は温度２０〜３５℃、好ましくは２８〜３０℃で、２〜
７日、好ましくは４〜６日間好気的に行えばよい。一方
、緩衝液に藻類を懸濁させて放置する場合も、上記培養
と同様にして行えばよい。

上記処理を施すことによって藻類菌体中のＳＯＤ含量は
著しく増加する。このようにして得られた藻類からのＳ
ＯＤの採取は、たとえば培養物などから？濾過、遠心分
離等の常法によって菌体な集め、オートリシス法または
溶菌酵素を用いる方法、ガラスピーズを加えグラインデ
ィングによる破砕法あるいはフレンチプレスを用いる方
法、さらには超音波破砕法などの既知の物理的方法等を
適用して行うことができる。

ＳＯＤの精製を行うに際しても既知の分離精製手段を適
宜利用することによって所望の純度のＳＯＤを得ること
ができる。すなわち、硫酸アンモニウム等による塩析法
、有機溶媒による沈澱法１等電点沈澱法、電気透析等に
よる膜処理法。

リン酸カルシウムやアルミナ等による吸着法。

ジエチルアミノエチルやカルボキシメチルセルロース等
によるイオン交換クロマトグラフ法、セファデックス（
ファルマシア製）やウルトラゲル（ＬＫＢ製）等による
ゲルを濾過クロマトグラフ法などを適宜組合せることに
よって精製することができ、使用目的に応じた精製酵素
標品を得ることができる。

し実施例］ 次に、本発明を実施例により詳しく説明する。

なお、ＳＯＤ活性の測定はチトクロームＣ法（Ｊ、ＭＪ
ｌｃＣｏｒｄ　　ａｎｄ　　１．Ｆｒ１ｄｏｒｔｃｈ　
　Ｘ　Ｊ、Ｂｉｏｌ、（：ｈｅｍ、。

２４４．６０４９〜６０５５　（１９６９））により行
った。すなわち、光路１　ｃｍセルに最終濃度が５０ｍ
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，８）　、　Ｏ，Ｉｍｋｌエチ
レンジアミン四酢酸ナトリウム、１０μＭフェリチトク
ロームＣ，５ｕＭキサンチンとなるように反応液（０，
４＋＋ｌ）を調１し、コレニリン酸緩衝液（ｐＨ７，８
）で測定可能な範囲に稀釈した酵素′ａ、５０ｔｔ！！
を加え、キサンチンオキシダーゼ溶液５０μｐを添加し
、全量を０．５１とし、２５℃において分光光度計によ
る５５０ｎｍにおけるフェリチトクロームＣの還元に基
づく吸収増加の初速度（Ｖ）を測定する。ＳＯＤ活性は
上記反応条件下において、フェリチトクロームＣ還元に
基づく吸収増加速度を５０％阻害する酵素量を１ユニツ
トとすると、Ｖ／Ｖ−１の式から求めることができる。

比較例１ ３℃フラスコに滅菌ずみスピルリナ・プラテンシス（Ｓ
ｐｉｒｕｌｉｎａ　ｐｌａｔｅｎｓｉｓ）培地（ＳＯＴ
培地）１１２を入れ、これにスピルリナ・サプサルサＩ
ＡＭト１８３を植菌した。なお、ＳＯＴ培地の組成を下
表に示す。

第　　１　　表 ＮａＨＣＯ３１６８（ｌ　ｍｇ Ｋ２ＨＰＯ４５０ｖａｇ ＮａＮ０．　　　２５０　ｍｇ Ｋ２ＳＯ４１００ｍｇ ＮａＣｊ！　　　　１００　ｍｇ ｕｇｓｏ４−７１（２ｏ　　　２０　ｍｇＣｕＣｊ！ｚ
−２Ｈ２０４ｍｇ ＦｅＳＯ４−７８゜０　　　１　ｍｇ Ｎａ２ＥＤＴＡ・２Ｈ２０８ｍｇ Ａ、溶液　　　　　　　　　　０．１＋ｎｊ）蒸留水　
　　　　　　　９９．９ｍＲ 幸八、へＹ夜の組成 ）Ｉ、ＢＯ３２Ｂ８　　ｍｇ ＭｎＳＯ４１８２０２５０ｍｇ ＺｎＳ０４４Ｈ２０２２，２１ｎｇ ＣｕＳＯ４”５Ｈ２０７，９ｍ３ Ｎａ２ＭｏＯ４２，１ｍｇ 蒸留水　　　　　　１００　　ｍ４１ 次いで、蛍光灯４０Ｗを用い、処理液表面で光強度５０
μ４ｉｎｓｔｅｉｎｓ／ｍ’／ｓｅｃ　、の光を上記フ
ラスコに照射しながら３０℃で６日間空気による通気培
養を行った。培養終了後、遠心分離法により洗浄し、集
菌した。得られた菌体の乾燥重量を測定したところ１４
　ｇであった。

得られた湿菌体に６５ｍＭリン酸緩；酸液（ｐＨ７，８
１を加え、超音波発生装置（トミー精工製）を用いて菌
体を破砕した。破砕の確認は顕微鏡観察により行った。

この破砕菌体懸濁液を遠心分離し、得られた上澄のＳＯ
Ｄ活性および蛋白質含量を測定した。ＳＯＤ活性は１１
５単位／ｇ乾燥菌体であった。

実施例１ 比較例１と同様にしてスピルリナ・サブサルサＩＡＭ　
Ｍ−１８３を培養し、対数後期に菌体を集め、滅菌ずみ
６５ｍＭリン酸緩衝液に滅菌的に懸濁し、リン酸緩衝液
で１０９個／ｒａ１となるように調整した。

上記菌体懸濁液ＨｍＪ！に所定の鉄イオン濃度となるよ
うにＦｅＳＯ４・７Ｈ２０溶液を加えた。この懸濁液１
００ｍＡ＋を三角フラスコに入れ、ブチルゴム栓で密栓
し、気相をアルゴン置換して暗条件下３０℃で４８時間
放置した。４８時間後に菌体のＳＯＤ活性を測定した。

結果を第２表に示す。

第２表 実施例２ 実施例１において鉄イオンの代りにマンガンイオンが所
定濃度となるようにＭｎＳＯ４・７　Ｈ２０溶液を加え
たこと以外は実施例１と同様にして行った。結果を第３
表に示す。

第　　３　　表 実施例３、比較例２，３ 比較例１と同様にしてスピルリナ・サブサルサＩＡＭ　
Ｍ−１８３を培養し、対数後期に菌体を集め、滅菌ずみ
５５ｍＭリン酸緩衝液に滅菌的に懸濁し、リン酸緩衝液
で１０９個／ｍβとなるように調整した。

上記菌体懸濁液８０１ｕＪを１００ｍｆ！三角フラスコ
に入れ、ブチルゴム栓で密栓し、気相をアルゴン、空気
または酸素で置換した。これらフラスコを暗条件下３０
℃で４８時間県とうしつつ放置した。４８時間後に菌体
のＳＯＤ活性を測定した。結果を第４表に示す。

第　　４　　表 比較例２ 〃　　　３ 実施例３ 実力五個４ 比較例１と同様にしてスピルリナ・サブサルサＩＡＭ　
Ｍ−１８３を培養し、対数後期に菌体を集め、滅菌ずみ
８５ｍＭリン酸緩衝液に滅菌的に懸濁し、リン酸緩衝液
で１０”個／ｍＲとなるように調整した。

上記菌体懸濁液８０ｍＡ＋を１００ｍｆ三角フラスコに
入れ、処理液表面で光強度０〜４００μｍＥｉｎｓｔｅ
ｉｎｓ／ｍ２／アルゴン 空　　　気 酸　　　素 ＳｅＣ，の光を照射しながら３０℃で２日間通気培養し
た。２日後に集関し、ＳＯＤ活性を測定した。結果を第
５表に示す。

！００　　　　　　　　　　　　　　　　　　１５６実
施例５，６、比較例４ 比較例１と同様にしてスピルリナ・サブサルサＩＭＡ　
Ｍ−１ｆ１３を培養し、対数後期に菌体を集め、滅菌ず
み６５ｍＭリン酸緩衝液に滅菌的に懸濁し、リン酸緩衝
液で１０９個／ｍ１となるように調整した。

上記菌体懸濁Ｍ８０ｍｚを１００ｍ１！三角フラスコに
入れ、ブチルゴム栓で密栓し、酸素置換を行ないフラス
コ内の気相を酸素にしたものと、綿栓をし、空気通気ま
たは酸素通気したものを作った。これらのフラスコを処
理液表面で光強度４００μ・Ｅｉｎｓｔｅｉｎｓ／ｍ２
／ｓｅｃ、の光を照射しながら３０℃で１２時間県とう
培養を行なった。１２時間後に菌体のＳＯＤ活性を測定
した。結果を第６表に示す。

第　　６　　表 比較例４　　空気通気　　　　１２６ 実施例５　　酸素置換　　　　３０２ 〃　６　　酸素通気　　　　４００ 実施例７ 比較例１において、スピルリナ・プラテンシス■へＭ　
Ｍ−１３５、スピルリナ およびスピルリナ・マキシマについてはＳＯＴ培地を用
い、シネココッカス・エスピーＡＴＣＣ２７１４４　、
アナベナ・シリンドリカＩＡＭ　Ｍ−１　、アナシスタ
ス・ニドランスＩＡＭ　Ｍ−６　、クロレラ・ブルガリ
ス八Ｔ（：Ｃ　３０５８１およびクロレラ・エリプソイ
デアＡＴＣＣ　１１４６６についてはＢＧ−１１培地を
用いたこと以外は同様の条件で培養し、対数後期に菌体
を集め、滅菌ずみ６５ｍＭリン酸緩衝液に滅菌的に懸濁
し、リン酸緩衝液で１０９個／ｍρどなるように調整し
た。なお、８Ｇ−１１培地の組成を第７表に示す。

第７表 ＮａＮ０，　　　　　　　　　　　　　　　１．５　ｇ
Ｋ２＋（ＰＯ４　　　　　　　　　　　　　　　３０　
　ｍｇＭｇＳＱ４・７ｔ（、Ｑ　　　　　　　　　　　
　７５　　＋ｎ３ＣｕＣＩ！２’２Ｈ２０　　　　　　
　　　　　　３６　　１１１ｇクエン酸　　　　　　　
　　６　　ｍｇＮａ２・ＥＤＴＡ　　　　　　　　　　
１　　ｍｇＮ８２Ｃ０３２０　　ｍｇ 微量金属Ａｓ　　　　　　　　　ｌ　　ｍｊ’クエン酸
アンモニウム　　　６ＩＩ１ｇＨ３ＢＯ３　　　　　　
　　　　　　　　２．８６　ｇＭｎＣｊ！２・４８２０
　　　　　　　　　　　１．８１　ｇＺｎＳＯ４・７Ｈ
２０　　　　　　　　　　２２２　　ｍｇＮａ，ＭｏＯ
４’２Ｈ，０　　　　　　　　　０．３９　ｇ（：ｕＳ
Ｏ４・５Ｈ２０　　　　　　　　　　　７９　　　ｍｇ
Ｃｌｌ（Ｎ０３）ｚ・６）１２０　　　　　　　　４９
．４ｍｇ脱水イオン水　　　　　　Ｉｆｌ 上記菌体懸濁９ｉ８０ｍ＋！を１００１三角フラスコに
入れ、ここに鉄イオンおよびマンガンイオンがそれぞれ
５００〃Ｍになるように加えたのち、ブチルゴム栓で密
栓し、気相を酸素に置換した。

これらのフラスコを処理液表面で光強度４００μ・Ｅｉ
ｎｓｔｅｉｎｓ／ｍ２／ｓｅｃ、の光を照射しながら３
０℃で４８時時間上うしつつ放置した。４８時間後に菌
体のＳＯＤ活性を測定した。結果を第８表に示す。なお
、コン］・ロールは鉄イオンおよびマンガンイオンな０
にし、かつ気相を空気に置換して、上記と同様に培養し
た。

第８表 ［発明の効果］ 本発明によればＳＯＤを大量に効率よく製造することか
できる。得られるＳＯＤは安全性が高いので、食品、化
叫品、医薬品の素材として有用である。

特許出頭人 松　　　永　　　　　　　是 出光石油化学株式会社 スピルリナ・マキシマ

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）スーパーオキシドディスムターゼを含有する藻類
   を鉄イオンおよび／またはマンガンイオンを５０μＭ以
   上の濃度で含有する処理液で処理し、次いで該藻類から
   スーパーオキシドディスムターゼを採取することを特徴
   とするスーパーオキシドディスムターゼの製造方法。
2. （２）スーパーオキシドディスムターゼを含有する藻類
   を酸素濃度２２容量％以上の気体と接触させて処理し、
   次いで該藻類からスーパーオキシドディスムターゼを採
   取することを特徴とするスーパーオキシドディスムター
   ゼの製造方法。
3. （３）スーパーオキシドディスムターゼを含有する藻類
   を１００〜４００μ・Ｅｉｎｓｔｅｉｎｓ／ｍ＾２／ｓ
   ｅｃ．の光照射処理し、次いで該藻類からスーパーオキ
   シドディスムターゼを採取することを特徴とするスーパ
   ーオキシドディスムターゼの製造方法。
4. （４）スーパーオキシドディスムターゼを含有する藻類
   を鉄イオンおよび／またはマンガンイオンを５０μＭ以
   上の濃度で含有する処理液中で酸素濃度２２容量％以上
   の気体と接触させ、かつ１００〜４００μ・Ｅｉｎｓｔ
   ｅｉｎｓ／ｍ＾２／ｓｅｃ．の光照射処理し、次いで該
   藻類からスーパーオキシドディスムターゼを採取するこ
   とを特徴とするスーパーオキシドディスムターゼの製造
   方法。