JPH0286785A - γ―イロンの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、γ−イロンの生物変換による製造方法に関す
る。

この方法は、イリス根茎、かかる根茎の部分、イリス抽
出物、イリス残分、またはイリスの植物細胞培養物を、
バクテリアまたはそれらの活性酵素画分と共に、植物細
胞培養培地の存在下に処理することからなる。

γ−イロンのもとくおいては特に下記式６に示されるシ
スーγ−イロンであるものと理解される。

このシスーγ−イロンは、該反応生成物において、式１
．２および４により記述されるイロン類の１種またはそ
れ以上を伴っていてもよい。

第１に興味あるバクテリア株は、好ましくはエンテロバ
クタ−およびシュードモナス属由来のもので、かつ好ま
しくはイリス根茎から単離可能なものである。

好適な種は、次のとおりである： セラチア・リケファシエンス（５ｅｒｒａｔ１ａ　１ｉ
ｑｕｅｆａ−ｃｌｅｎｓ） エンテロバクタ−・クロアカニ（Ｅｎ　シｅｒｏｂａｃ
　ｈｅｒｃｌｏａｃａｅ　） エシェリキア・コリ（Ｅａｃｈｅｒｌｃｈｌａ　ｃｏｌ
ｉ　）シュードモナス・フルオレッセンス （Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ
　）シュードモナス・マルトマイリア（Ｐ８ｅｕｄｏｍ
ｏｎａｓｍａｌ　ｔ、ｏｐｈｌｌｌａ） 上記において指摘したように、好適な菌株は好ましくは
イリス根茎類から単離される。これらの根茎は、好まし
くは第１に清浄化され、皮をむかれ、不純物を取り去ら
れ、小片にされ、栄養ブロス中に置かれ、次いでバクテ
リアの育生を許容するように培養され、育生されたバク
テリアが、例えば常法である希釈法により単離され、精
製され、そして例えば生化学的試験片によ勺同定される
。

バクテリア育生のための好適な栄養ブロスは、（１）　
　ペプトン； （４）内袖出物； （１１０酵母抽出物； （１ψ　　無機塩類、例えばＮａｃｔ、　ＮＨ４ＮＯ３
等を含有してもよい。

本発明による根茎類のバクテリアによる処理およびこれ
らのバクテリアの培養の為に便利な培地は、それぞれ植
物カルスの育生および懸濁培養物のだめの通常の標準的
な培地である。かぐしてそれらは、 （１）主要無機栄養物； （１１）　　微量元素類； （＋１）　　鉄源； （１ψ　有機補充物（ビタミン類）： （ｖ）　　炭素源； （Ｖ−有機補充物（植物成長制御剤類）を含有してもよ
く、また、先に概要を示したバクテリア育生を行なう為
のもの等の追加的な栄養ブロスを補充してもよい。

これらの培地は、特に半固形または液体であってよく、
例えばＳ、Ｓ、ＢｈｏｊｗａｎｉおよびＭ−に、　Ｒａ
ｚｄａｗの　Ｐｌａｎｔ　　Ｔｉ５ｅｕｅ　　ｃｕｌｌ
ｕｒｅ　　：　　Ｔｈｅｏｒｙ　　ａｎｄ　　Ｐｒａｃ
ｈｉｃｅ。

Ｅ１θｅｖｉｅｒ　（１９８３）の例えば２１編、およ
びＲ，Ａ、Ｄｉｘｏｎ　ＯＰｌａｎｔ　ｃｅｌｌ　ｃｕ
ｌｔｕｒｅ　、　ａ　Ｐｒａｃｔ、１ｃａｌａｐｐｒｏ
ａｃｈの例えば２編、ＩＲＬ　ＰｒｅＢＱ　、　０ｘｆ
ｏｒｄ　。

Ｗａθｈｉｎｇｅ、ｏｎ　Ｉ）ｃ　（１９８５）を参照
。

かくして特に好適なものは、次の培地である：Ｍｕｒａ
ｌｉｌｈｉｇｅおよびＳｋｏｏｇ　、　（）ａｍｂｏｒ
ｇ　、修飾Ｈｅ１ｌｅｒ。

修飾Ｓｋｏｏｇ。

イリスなる用語のもとでは、特にイリス・バリダ（Ｉｒ
ｉθｐａｌｌｉｄａ　）、イリス・フロレンチナ（Ｉｒ
１ｓ　ｆｌｏｒｅｎｔｌｎａ　）　、イリス・デルマニ
力（Ｉｒｉｓ　ｇｅｒｍａｎｉＣａ　）またはベロナ（
ＶｅｒＯｎａ　）のイリスであるものと理解されるべき
である。

該根茎類は、好ましくは成長力のある状態で植物から取
られ、新鮮な状態、すなわち収穫後短時間内に次の形態
で使用される。

一押砕または粉砕された根茎、 一根茎の部分、 一イリス抽出物、例えばアルコール性、好ましくはメタ
ノール性抽出物、あるいは、 −イリス残分、すなわちイリス根茎の工業的な抽出の後
に回収される残査、 一イリスの植物細胞培養物：この場合においては、該イ
リスカルス培養物は、通常の培養培地（先に示した）上
で標準的方法を用いて外植体から始められ、そして得ら
れた植物細胞は、最終的に微生物培養物と合せられる。

根茎類は、上に概説したように適切に前処理される。

適当な温度範囲は、約１５から４０°Ｃまでであシ、２
５から６５℃までが好ましい。

適箔な反応時間は、１から２０日間であシ、６から６日
間までが好ましい。

根茎：培地の比の適当な範囲は、約１：２０から２：１
までであり、約１：１０から１＝１までが好ましい。

栄養ブロスを補充する場合には、全培地（すなわち、植
物細胞培養培地＋栄養ブロス）に対する植物細胞培養培
地の適切な割合は、約０．５−０．９５＝１である。

半固形培地に対しては、固形化剤、好ましくは寒天が、
最終濃度的６−１５ｇ／Ｉ）ットル、好ましくは約８−
１２ｇ／リットルをもって添加される。

最終生成物の単離は、植物からの揮発性成分の単離また
は芳香料もしくは香味料の製造のために今日使われてい
る通常の方法、すなわち、水蒸気蒸留、または水蒸気蒸
留と抽出とを同時に含み、揮発性有機溶媒、好ましくは
塩化メチレン、ジエチルエーテル、ヘキサン等を使用す
るＬｌｋｅｎｓ−Ｎｉｃｋｅｒａｏｎの技術を用いて好
適に行なわれる。

通常には、酵素的処理が生物反応容器中で例えばバッチ
培養物または連続培養物としてなされてもよい。このよ
うな場合のすべてにおいて、分離相培養を含め通常の発
酵方法が適用され得る。

バクテリアの使用に代えて、それらから得られる活性酵
素画分もまた使用することができる。このような活性酵
素画分は、バクテリアの水性抽出物の調製による常法を
もって得られ、必要に応じて、このような抽出物を例え
ばクロマトグラフ的方法、例えばイオン交換クロマトグ
ラフィー　液体クロマトグラフィー、ケ９ルロ過（好適
）、デル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー
等により清浄化して得られる。これは、緩衝溶液中、例
えば−５，５−６，５の間において都合よく行なわれる
。最も普通には、清浄化さえも必要でなく、純粋でない
抽出物を使用することができる。

ｒ−イロンのその他のイロン類からの分離は、通常は必
要ではない。しかしながら、必要な場合には、これは例
えばクロマトグラフ的技術等の常法により達成し得る。

Ｙ、ＲａｕｔｅｎｓｌｒａｕｃｈおよびＧ。

ｏｈｌｏｆｆｏ　Ｈｅ１ｖ、　Ｃｈｌｍ、　Ａｃｔａ　
、　５４　（７）　１８９（１９７１）も参照。

例　　１ 造 イリス・バリダの根茎は、植物体から成長力のある状態
で取られる。それらは、第１Ｋは過剰の±を取り去られ
、外部上皮を取るために皮をむかれる。その後、それら
は、浸漬により、第１には水性アルコール溶液（７０％
ＥｈｏＨ／［０％Ｈ２０体＆）中に６０秒間、次いで、
ＨｇＣｊ２の水性溶液（１ｆｉ／ｌ　）中に６０秒間、
そして最後にそれらを６回蒸留水中ですすいで浄化され
る。〔他のよシ簡単に浄化方法は、１２０°Ｃにて２０
分間圧熱殺菌することである。〕 該浄化根茎（５ｇ）は、約０．５ｇの小片に切断され、
セラチア・リケファシエンスのバクテリア培養物（注２
）が、針で刺すことによりあらかじめ接種された半固形
Ｍｕｒａｓｈ１ｇｅおよび８ｋｏｏｇ培地（寒天：１ｏ
ｇ／−ｇ）（注１）の表面に塗布される。対照実験とし
て、非接種（すなわち、バクテリアを接種されていない
）固形Ｍｕｒａ８ｈｉｇｅおよびＳｋｏｏｇ培地を他は
同じ東件下で使用した。該培養は、６０℃にて１５日間
行なわれた。この期間の最後に、該根茎および培地は、
共にまたは別々に（すなわち根茎部分をナイロン布、孔
径５０μｍでの口過により分離して）、同時的な蒸留お
よび抽出（Ｌｉｋｅｎｆｉ−Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎの技術
、注６）により抽出される。該結合抽出物（例えば根茎
＋培地）は、ＧＣおよびＧＣ／ＭＳ（注４）により分析
され、以下の概略的な結果を示したニドランス−α−イ
ロン５．４％、シス−α−イロン６６％、シスーγ−イ
ロン６１％、同定不能＝０．６％（イロン類の全量を１
００％と仮定した）。対照実験（結合抽出物中に、基質
として用いた新鮮根茎１ｇあたシとして２．８μｇ／ｇ
）と比較すると、新鮮根茎をセラチア・リケファシエン
スにより処理することにより産生された主要な天然異性
体であるシスーγ−イロンの債（６７μｇ／ｇ新鮮根茎
）は、しかして２４の因子をもって増加していた。

注に １　Ｔｎ９／　ｌの６−フルフリルアミンプリン（カイ
ネチン）および１ｍ９７１の２，４−ジクロロフェノキ
シ酢酸が添加されたＭｕｒａｓｈｉｇｅおよびＳｋｏｏ
ｇ培地（Ｔ、ＭｕｒａｌｉｌｈｉｇｅおよびＦ、　８ｋ
ｏｏｇの、Ｐｈｙｌｉｉｏｌｏｇｉａ　Ｐｌａｎｔ、ａ
ｒｕｍ　１５　＊　４７３　（１９６２））；試験管あ
たりに１２１ｎｌの培地および０．５　ｇのイリス根茎
。

注２： バクテリアセラチア・リケファシエンスの単離および同
定。

イリス・バリダの根茎は、過剰の土を除かれ、皮をむか
れ、浄化された（水性アルコール溶液、７０％ＥｂｏＨ
／６０％Ｈ２０中に６０秒間）。１０ゴの栄養ブロス（
ペプトン５ｇ、内袖出＄１ｇ、酵母抽出物２ｇ、ＮａＣ
ｌ３９、！（２（１１１）中に置かれた約ｏ、ｓ　ｇの
該根茎の内部断片が、２７°Ｃにて１５日間培養された
。この培養物から、バクテリアセラチア・リケファシエ
ンスが単離され、同様な組成を有する栄養寒天（寒天：
１０ｇ／ｌ）を入れたベトリ皿上で精選され、生化学的
試験片ＡＰＩ　　２０Ｅ（ＡＰＩ　　ＳＹＳ’ｌ”詣Ｓ
、Ａ、　、５８６９　ＤＭｏｎｔａｌＬｅｕ−Ｖｅｒｃ
ｉｅｕ　、　Ｆｒａｎｃｅ　）により同定された。

該株は、栄養寒天を入れたベトリ皿への週毎の転移によ
う維持され、いかなる標準的方法によっても保存され得
る。

注６： Ｔ、Ｈ，５ｃｈｕｌ　ｔｚらのＪ、Ａｇｒｉｃ、　Ｆｏ
ｏｄ　Ｃｈｅｍ、　２５．４４６（１９７７）に記述さ
れている手法に従ったＬｌｋｅｎｌｌｌ−Ｎｉｃｋｅｒ
ａｏｎの技術で、揮発性弓媒、好ましくは塩化メチレン
を用いている。

注４： ガスクロマトグラフィー：　ＤＥＬＳＩ　ＤＩ　７００
、キャぎラリカラムＣａｒｂ、　２０　Ｍ　ｓキャリア
ガス４．５−／分のヘリウム、設定７０／１８０℃、２
°Ｃ／分、質量分析装置：　ＦＩＮＮＩＧＡＮ　４５０
０、電気衝撃。

例　　２ これらの実験のために、６種の異なった型の根茎が使用
されたニ ーバッチ【二側１に記載されたのと同様に、過剰の土を
除き、皮をむかれ、小片に切断された成長力がある状態
の新鮮根茎。

一バッチｆｆ　：　１９８７年にイタリアで収穫され、
使用前に４℃にて保存され（６−６チ月）、次いで使用
直前に粉末化された乾燥皮付根茎。

−バツチｌ：６年間室温で、次いで数ケ月間４５０Ｃで
熟成され、次いで上記（バッチ■）と同様に処理された
乾燥皮付根茎。

粉末化または切断された根茎は、それぞれ２５０　ｍｌ
のエーレンメイヤーフラスコ中（フラスコあたり５ｇの
根茎）で１２０℃にて６０分間圧熱殺菌される。冷却後
、各フラスコに無蕗条件下で１００　ＩｌｌのＭｕｒａ
ａｈｌｇｅおよび８ｋｏｏｇ培地ならびに１０−の栄養
ブロス（例１および注５参照）が加えられる。対照実験
を除いて、各フラスコは、セラチア拳すケファシエンス
（単離は、例１参照）０２４時間経過培養物（栄養ブロ
ス、２５℃、回転振とう器）を０．５Ｍ接種され、回転
振とう器（１００回転／分）上で２５℃にて２週間培養
された。この期間の最後に、根茎および培地の両者は、
抽出され、例１と同様に分析された。

乾燥重量で１に９の根茎あた）のイロン類の雫で表した
結果（バッチＩ、　ＩＩ、Ｉ）が、第１表中に与えられ
ている。これらの抽出物中のイロン類の平均的分布は、
次のとおシであるニ ートランス−α−イロン６．５％ 一シスーα−イロン６４％ 一シスーｒ−イロン５８％ 一β−イロン１．５％ 一同定不能のイロン（類）０．２チ これとは対照的に、熟成根茎（バッチｌ）の旧来のＬｉ
ｋｅｎｓ−Ｎｉｃｋｅｒ８ｏｎ抽出（＃生物的処理せず
）は、乾燥重量１ｋｌｉｌあた）の根茎にりいて７００
ヤのイロン類を生じ、概略下記の分配を示したニートラ
ンス−α−イロン４％ 一シスーα−イロン　４４％ 一シスーｒ−イロン５０％ 一β−イロン　１．２％ 一同定不能　　０．８％ 第　　Ｉ　　表 バッチＩ　　バッチ…　　バッチＩ （Ｔ）セラチア・リケファシ エンスによる処理　　　　７２０　　　６７５　　　　
８２２（Ｑ）対照実験　　　　　　６８　　１９８　　
　６２５（刊＝Ｔ／Ｃ１０，５６，５１，５ 注５： バクテリア育生の通常の条件下では、セラチア・リケフ
ァシエンスによるイリス根茎の処理を栄養ブロス（すな
わちバクテリア育生のための通常の栄養ブロス）のみを
用いて行なった場合には、イロン類の含有量の増加は起
こらない。

注６： 動力学的研究は、バッチＩＫついて最大の含有量（７２
（１１ｎ９のイロン類／乾燥重量１ｋｇの根茎）が培養
５日後に得られることを示した（第１図参照）。

ｂ）数種の他の型の植物細胞培養培地を用いた実験 他の点では変更の無い反応条件（例２と比較）を用いた
Ｍｕｒａｓｈｉｇｅおよび８ｋｏｏ　ｇの培地の数種の
別の型の植物細胞培養培地（培地Ｂ５とも称されるＧａ
ｍｂＯｒｇ　ｓ修飾Ｈｅ１ｌｅｒ　ｓ修飾Ｓｋｏｏｇ　
％ＰｌａｎｔＴＨ３ａｕｅ　　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　　、Ｔ
ｈｅｏｒｙ　　ａｎｄ　　Ｐｒａｃｂｉｃｅ　　、　　
８．８゜ＢｈｏｊｗａｎｌおよびＭ、に、　Ｒａｚｄａ
ｗ　、　Ｅｌａｅｖｉｅｒ　ｌ　９８５参照）による置
換は、イロン類含有量の顕著な増大を同様に導いた。第
２表参照。

第　　…　　茂 培地の変化 量１ｋｇの根茎 簀修飾Ｈｅ１ｌｅｒ　：　Ｍｏｒｅｌビタミン類を有す
るＨｅ１ｌｅｒ培地（ＷｅＬｍｏｒｓ　Ｒ，Ｈ，のＡｍ
、、Ｔ、Ｂｏｔ、０、５８１９５１　）１４１−１４５
；２−４ｎ（２，４−ジクロロフェニル酢酸）（１叩／
−）Ｘ１１）　　修飾８ｋｏｏｇ　：　Ｍｏｒａｌビタ
ミン類、２−４Ｄ（１ｍ９／−ｅ）、カイネチン（１叩
／４）を有するＭｕｒａａｈｉｇｅおよび８ｋｏｏｇの
培地。

例において使用されたセラチア・リケファシエンｘｏ株
は、１４．１．ｖとして番号ｚ−７８０のもとに１９８
８年７月１２日付でｈｈｅ　Ｉｎ８ｔ、１ｔｕｔ。

Ｐａ８１．ｅｕｒ　、　Ｃｏ１１ｅｃＦＪ１ｏｎ　Ｎａ
ｂｌｏｎａｌｅ　ｄｏ　Ｃｕ１ｌｕｒｅθｄｅ　Ｍｉｃ
ｒｏｏｒｇａｎｌｓｍｅｇ　（Ｃ，Ｎ、Ｃ，Ｍ、）　、
２５　、ｒｕｅ　ｄｅＤｏｃｂｅｕｒ　　Ｒｏｕｘ　　
７　５　７　２４　−　　Ｐａｒｌ　　Ｃｅｄｅｘ　　
ｉ　　５　　に寄託されている。

例　　６ 新鮮根茎（バッチ１１例２）は、例２ａと同様にして以
下のバクテリアの１８１を用いて１週間処理される。

エンテロバクタ−属：　エンテロバクタ−・クロアカニ
餐エシェリキア・コリ０ シュードモナス属：　　　シュードモナス・フルオレッ
センス簀シュードモナス・マルトマイリア （ＡＴＣＣ１７Ｂ６６） 簀イリス根茎から単離され（例１、注２０単離方法によ
る）、Ｅ、クロアカニの特定の菌株は、Ｅ。

クロアカニ１として番号ｌ−７７９のもとに１９８８年
７月１２日にＣ，Ｎ、Ｃ，Ｍ、に寄託されたＯ ■寄託機関’　Ｕｎ１ｔｅ’ｄｅ　Ｂａｃｈｅ’ｒ１ｅ
ｓ　ｄｅ　１’Ｉｎｌ、１ＦＪｕシＰａ８むｅｕｒ　”
からの副培養で、Ｄｒ、　Ｃ，Ｍｌｃｈｅｌ（Ｌａｂｏ
ｒａｌ、ｏｉｒｅ　ｄ’　Ｉｃｈｔｙｏｐａｂｈｏｌｏ
ｇｉｅ、　ＩＮＲＡ。

Ｒｏｕｔｅ　ｄｏ　Ｔｈ１ｖｅｒｎａｌ−７８８５０Ｔ
ｈｉｖｅｒｖａｌ−Ｇｒｌｇｎｏｎ　）から供給された
株５４１２７゜該菌株は、Ｅ、コリ２として番号ｌ−７
９４のもとに１９８８年７月２８日にＣ，Ｎ、Ｃ，Ｍ、
に寄託された。

ｌ−７７９、ｌ−７８０およびｌ−７９４は、ブダペス
ト寄託であつる。

培養後、根茎および相当する培地の両者は抽出され、例
１ａに記載されているように分析される。

イロン類の叩／乾燥重量１ｋｇの根茎で表された結果が
第■表中に与えられている。

第　　ｌ　　我 菌株の影響 例　　４ イリス・バリダのカルス培養物は、Ｍｕｒａｓｈｌｇｅ
およびＳｋｏｏｇの培地（例１、注１参照）およびＧａ
ｍｂｏｒｇ培地（例２ｂ参照）上で、旧来の手法（Ｐｌ
ａｎｔ　Ｔｌａａｕｅ　、　Ｔｈｅｏｒｙ　ａｎｄ　Ｐ
ｒａｃｔｉｃｅ　、　８．Ｓ。

ＢｈｏｊｗａｎｉおよびＭ、に、　Ｒａｚｄａｗ　％ｇ
ｌｓｅｖｉｅｒ　（１９８５））に従って開始された。

イリス細胞培養物の２種類の株１１およびＩ２は、４５
ｒｎｌの半固形Ｍｕｒａ８ｈｉｇｅおよびＳｋＯＯｇの
培地を入れたペトリ皿上で維持され、月毎に新鮮培地に
再培養された。

これらの株は、液体培地（寒天を含まないＭｕｒａａｈ
ｉｇｅおよびＳｋｏｏｇまたはＧａｍｂｏｒｇ　）に移
され、回転振とう器（２６°Ｃ，１００回転／分、１５
日間）上に維持され、ナイロン布（孔径５０μｍ）で口
過され、２週毎に新鮮培地に再培養された。培養物が２
週令になった後、５ｇの新たに計量された細胞が、１０
０＋ｄのＭｕｒａａｈｉｇｅおよびＳｋｏｏｇの培地、
ならびにｌＱｍ／の栄養ブロス（例１参照）を容れた２
５０ゴのエーレンメイヤー・フラスコ中に入れられた。

対照実験に使用されるものを除き、各フラスコには、セ
ラチア・リケファシエンスの２４時時間項養物０．５−
が接種された。次いでそれらは、回転振とう器（１００
回転／分）上で２５℃にて２週間培養された。この期間
の最後に、生物物質および培地の両者は、例１に記載さ
れているように抽出され、分析された。

イロン類のｍ９／乾燥重ｆ１ｋｇのイリス細胞で表わさ
れた結果は、第■表に与えられている。

第　　１ｖ 炎 これらの残分け、粉末化イリス根茎の工業的水蒸気蒸留
の後に回収された残査である。これらの残分け、例２ａ
Ｋ記載されているようにしてセラチア・リケファシエン
スにより処理された。第１表には、処理残分（ｒ−イロ
ンのｒｎ９／ｋｇの残分）の分析結果が、対照実験（バ
クテリアを含まない）の結果と比較されている。

第　　Ｖ　　表 Ｃ）イリス抽出物の処理 イリス根茎の不純抽出物（バッチ■由来、例２参照）は
、次のように調製された：細かく分断された根茎（１０
００ｇ）は、１０００ｍのメタノールによ９４時間の攪
拌のもとに２回抽出された。

口過後、合せられたメタノール溶液は濃縮された。

得られた不純抽出物の５ｇの試料がメタノール（Ｉ　Ｑ
ｍ）中に溶解され、この溶液の一部（０，５ｍｌ　）が
、ミラ０口過（８ａｒｔｏｒｉｕｓ　ＮＭＬＰＦ　０．
２２μｍ膜ｐ　５ＡＲＬ％ＢＰ　２７　、１１　ａｖｅ
ｎｕｅ　ｄｅ　ｌｅｒ　ｍａｉ、９１１２２　Ｐａ１ａ
ｉａｅａｎ　ｃｅｄｅｘ　）により無菌化され、それぞ
れ１００ゴの殺菌Ｍｕｒａ８ｈｉｇｅおよびＳｋｏｏｇ
の培地ならびに１０−の殺菌栄養ブロスが入れられたエ
ーレンメイヤー・フラスコに加えた。０．５−のセラチ
ア・リケファシエンスの２４時間令培養物（栄養ブロス
、２５℃、回転振とう器）を接種した後、これらのフラ
スコを７日間培養した。

全生物物質を、例１に記載されたのと同様にして抽出し
、分析した。結果は第ｗ表に示されている。

第　　■　　表 例　　５ シエンス培養物を用いた処理によるγ−イロンの製造 ａ）バッチ攪拌生物反応容器中でのイロン類の製造 バッチＩＩ（例２参照）からの粉末化根茎（１５０ｇ）
と、６リツトルのＭｕｒａ８ｈ１ｇｅおよび８１ｃｏｏ
ｇの培地とを５リツトルの生物反応容器中に入れ、１１
５℃にて２５分間圧熱殺菌した。６００　Ｔ！Ｌｔの殺
菌栄養ブロス（例１参照）の添加後、該混合物は、５０
Ｍのセラチア・リケファシエンスのバクテリア懸濁物（
例１参照）が接種された。該培養物は、機械的攪拌（１
００回転／分）および０．２Ｖ、Ｖ、Ｍ、の曝気（０，
２容の空気／培地容積／分）のもとに２５°Ｃにて８日
間維持された。分析のために、１００−の試料を１．２
および５日目に取出した。バクテリア接種の無い対照実
験（セラチア・リケファシエンスが接種されていない培
地）が、他は同等な条件としてエーレンメイヤー・フラ
スコ中で回転振とり器上で行なわれた。。試料の抽出は
、第ｖＩＩ表中に示された結果を与えた（分析は、例１
に記載されたのと同様に行なわれた）。

試料採取時間 ２４時間 ４８時間 １２０時間 １２０時間（対照） イロン類の■／乾燥重量ゆの根茎 透析膜による根茎のバクテリアからの分離を保つための
操作条件： 皮をむかれたイリス根茎の小片（バッチ１１例２）を１
０ｃＩＩの透析チューブ（Ｐｒｏｌａｂｏ　（ＢＦ２６
９　；　７５５２５　Ｐａｒ↓ｓ　Ｃｅｄｅｘ　］　；
　Ｒｅｆ−２４１３２，５ｇ／チューデ）内に入れ、チ
ューブの両端を特殊プラスチック連結子（５ｐｅｃｔｒ
ａ　（８ｐｅｃｔ＋ｒｕｍＭｅｄｉｃａｌ　Ｉｎｄｕａ
ｈｒｙ　Ｉｎｃ−６０９１６ＴｅｒｍｉｎａｌＡｎｎｅ
ｘ　％Ｌｏａ　Ａｎｇｅｌｅｌｌ　、Ｃａ１１ｆｏｒｎ
ｉａ　９６０　）　、”　ｒｅｆ。

１５２７６６）によ少閉塞した。かくしてｖ４Ｍされた
それぞれの透析チューブを、２５０ｄのＭｕｒａｓｈｉ
ｇｅおよびＳｋｏｏｇ培地が入れられた５００プフラス
コ中に入れ、全体を１１５°Ｃにて２０分間圧熱殺菌し
た。冷却および栄養ブロス（６０ｄ）の添加後、各フラ
スコに、対照実験に用いるものｔ除１１．５１１のセラ
チア・リケファシ尋ンスのバクテリア懸濁液（例１参照
）を接種した。回転振とう器（１００回転／分）上、２
５℃にて１週間の培養後、全生物物質（チューブからの
根茎およびフラスコからのバクテリア）および培地（チ
ューブからおよびフラスコから）の両者を抽出し、そし
て例２ａに記載のようにして分析した。結果は、第Ｖ１
表に示されている。

第 ｖＩ　　表 イロン類のｒｖ／乾燥 重量１′に９の根茎 畳Ｍ＆８培地＋栄養ブロスは接種されていない。

例　　６ 製造 工程は、２つの段階をもって行なわれたニー第１段階：
帽調整培地口の調製、すなわち、液体植物細胞培養培地
＋栄養ブロス中でのセラチア・リケファシエンスを用い
たイリス根茎の培養、および根茎残査の分離。この培地
は、ここで酵素を含有する。

一第２段階：イリス根茎のＳ調整培地１による培養。

ａ）第１段階： 乾燥根茎（ハツチ「、例２）を、ＭｕｒａＢｈｉｇｅお
よび８ｋｏｏｇ培地が以下のように調製された緩衝化植
物細胞培養培地に置換されたことを除いて例２ａと同様
に（４Ｘ２５（１１ｄエーレンメイヤーフラスコ）セラ
チア・リケファシエンスと共に１週間培養するニ ー生物学的緩衝液（Ｍ、Ｅ、８．すなわち、２−（Ｎ−
モルホリノ）−エタンスルホンａ、８１ｇｍａ。

ｒｅｆ、：　Ｍ８２５０　）を、非殺菌Ｍｕｒａｓｈ１
ｇｅおよびＳｋｏｏｇ培地に添加して５０ｍモル／勇の
濃度とし、−を５　Ｎ　ＫＯＨ溶液を用いて６に調節す
る。該混合物を１１５℃にて２０分間圧熱殺菌するか、
あるいはミクロ口過（Ｍ［１ｌ−ｐｏｒｅ膜、０．２　
ｕｎ　）により無菌化す〜る。

１週間の培養後、バクテリアの生存が、４つのフラスコ
について既に無いことが観察された。この期間の最後に
根茎残査を培地から５０μｍの多孔性のナイロン布で口
過することにより分離する。

続いて、かくして得られた口銭（培地十死滅バクテリア
細胞＋酵素）を覆調整培地會と称した。

ｂ）第２段階： 該１調整培地−（１００ｍ／）をＯ−４℃にて１２００
０ｇで１０分間、または４１１４０ｇで２０分間遠°心
分離し、第１には死滅バクテリア細胞を培地から分離し
た。

一該上澄は、５Ｉのイリス根茎（例２のバッチ■、１２
０°Ｃにて６０分間圧熱殺菌されている）を、２５（１
２）γＩＬｌのエーレンメイヤー・フラスコ中で回転振
とう器（１００回転／分、２５°Ｃにて１週間）を用い
て培養するために使用された。

−遠心分離残査は、−を５に調節された先に調製された
緩衝化ＭｕｒａｓｈｉｇｅおよびＳｋｏｏｇ培地１００
ｄと混合され、次いで、上記と同様に５ｇのイリス根茎
の培養に使用された。

該１調整培地−を、根茎と共にまたは無しで使用する対
照実験は、同等な粂件下で行なわれた。

試料の抽出および例１の記載に従った分析は、第１Ｘ表
に示される結果を与えた。

第 １Ｘ 表 であろう。

例　　７ 対照実験　　（ａ） 一調整培地　　　　　　　　　　　２９−調整培地十根
茎　　　　　　　８６８実験培養　　（ｂ） 一上澄＋根茎　　　　　　　　　７７２−遠心残査＋根
茎　　　　　　　１７４遠心分離４６１４０ｇ／１０分 一上澄＋根茎　　　　　　　　　７０６−遠心残査＋根
茎　　　　　　　２２９結論 ａ）　　（非熟成）根茎からの液体培地におけるγ−イ
ロン形成を再び確立する（例２も参照）。

ｂ）活性酵素の主要部分は、水溶性であり、細胞外酵素
である事実を確立した。

菌株［−７８０，ｒ−７７９、ｒ−７９４は、１９９０
年２月５日以後、一般に入手可能となるロンの製造 例６の第１段階で調製された１調整培地“が、下記のよ
うに得られたいわゆる１前培養−に置換されていること
を除き、方法は例乙に記載されているのと同様である。

例６に記載されているように調製された緩衝化植物細胞
培養培地１００ゴと、１（１２）γＩｌｌの栄養ブロス
（例１参照）とを４　Ｘ　２５０　ｍｌのエーレンメイ
ヤーフラスコからなる群の各フラスコに加える。

各フラスコは、セラチア・リケファシエンスを接種され
、例２と同様にして培養される。２４時間の培養期間の
後に、前培養と称されるこの培養物を、“調整培地曾に
代えて第２段階において例６に記載され、使用されてい
るのと同様にして使用される。結果は、第Ｘ表に示され
ている。

第　　Ｘ 表 イロン類のη／乾燥 重量ゆの根茎 対照実験 実験培養 遠心分離４６１４０ｇ７２０分 一上澄十根茎

【図面の簡単な説明】

第１図は、液体培地におけるγ−イロン生成の動力学的
研究の結果を示すグラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）生物変換によるγ−イロンの製造方法であつて、
   イリス根茎、かかる根茎の部分、イリス抽出物、イリス
   抽出残分またはイリスの植物細胞培養物を、バクテリア
   、好ましくはエンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔ
   ｅｒｉａｃｅａ）もしくはシュードモナス（Ｐｓｅｕｄ
   ｏｍｏｎａｃｅａ）属、またはそれらの活性酵素画分と
   共に、植物細胞培養培地の存在下に処理することからな
   る製造方法。 （２）該根茎の処理を、セラチア・リケフアシエンス（
   Ｓｅｒｒａｔｉａｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｃｅ）、エン
   テロバクター・クロアカエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ
   ｃｌｏａｃａｅ）、エシエリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒ
   ｉｃｈｉａｃｏｌｉ）、シュードモナス・フルオレツセ
   ンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ
   ）もしくはシュードモナス・マルトフイリア（Ｐｓｅｕ
   ｄｏｍｏｎａｓｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）の培養物、ま
   たはそれらの活性酵素画分と共に行なう請求項第１項に
   記載の方法。 （３）該バクテリア培養物が、イリス根茎から単離可能
   である請求項第１項または第２項に記載の方法。 （４）該根茎が、イリス・パリダ（Ｉｒｉｓｐａｌｌｉ
   ｄａ）、イリス・フルオレンチア（Ｉｒｉｓｆｌｕｏｒ
   ｅｎｔｉａ）、イリス・ゲルマニカ（Ｉｒｉｓｇｅｒｍ
   ａｎｉｃａ）またはベローナ（Ｖｅｒｏｎａ）のイリス
   から生じるものである請求項第１項、第２項または第３
   項に記載の方法。 （５）新鮮な根茎が用いられる請求項第１項ないし第４
   項のいずれか一つに記載の方法。（６）イリス抽出物を
   原料とする請求項第１項ないし第４項のいずれか一つに
   記載の方法。 （７）イリス抽出残分を原料とする請求項第１項ないし
   第４項のいずれか一つに記載の方法。 （８）イリスの植物細胞培養物を原料とする請求項第１
   項ないし第４項のいずれか一つに記載の方法。 （９）前記培養培地が、ＭｕｒａｓｉｇｅおよびＳｋｏ
   ｏｇ、Ｇａｍｂｏｒｇ、修飾Ｈｅｌｌｅｒまたは修飾Ｓ
   ｋｏｏｇの培地であり、好ましくは栄養ブロスの存在下
   に使用される請求項第１項ないし第４項のいずれか一つ
   に記載の方法。 （１０）該根茎が、半固形培地中で処理される請求項第
   １項ないし第９項のいずれか一つに記載の方法。 （１１）該根茎が、液体培地中で処理される請求項第１
   項ないし第９項のいずれか一つに記載の方法。 （１２）γ−イロンの酵素的調製が、生物反応容器中で
   行なわれる請求項第１項ないし第９項および第１１項の
   いずれか一つに記載の方法。 （１３）シス−α−イロン、トランス−α−イロン、お
   よび／またはβ−イロンが、シス−γ−イロンと共に生
   成される請求項第１項ないし第１２項のいずれか一つに
   記載の方法。 （１４）該根茎の処理が、室温またはわずかに上昇され
   た温度にて行われる請求項第１項ないし第１３項のいず
   れか一つに記載の方法。 （１５）該根茎の処理が、１ないし１５日間行われる請
   求項第１項ないし第１４項のいずれか一つに記載の方法
   。 （１６）該イロンが、抽出および／または蒸留法により
   単離される請求第１項ないし第１５項のいずれか一つに
   記載の方法。