JPS61501886A - Ｌ−カルニチンの調製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

り一カルニ　ン　・ 伎」ＤＬ二 本発明はＬ−力ルこチンの調製方法に関する。 より詳しくは１本発明は発酵法によるＬ−カルニチンの調製方法に関する。さら に詳しくは、本発明はＤＬ−カルニチンの微生物学的分割方法に関する。 また、本発明はＤＬ−カルニチンの分割に使用することができる新規な微生物に 関する。 １見藍遺 各種の微生物がＬ−カルニチンを単独炭素源として利用する能力を持っているこ とは十分立証されていることである０例えば、汚染された河床から分離された一 種の細菌（試験的にシュードモナス科に属するとして固定された）はＤＬ−混合 力ルニチンからＬ−カルニチンを使用してＤ−カルニチンを高光学的収率で生産 することが報告されている（Ｇ、フランケル、Ｓ、フリートマン　Ｖｉｔａｍ　 Ｈａｒｍ、　Ｎ、　Ｙ、　１１１５７１６．７３　）　、続いて、シュードモナ スブチ　（Ｐｓｅｕｄｍｏｎａｓｕ　ｐｕｔｉｄａ）およびアシネトバクタ−カ ルコアセチカス（Ａｃ１ｎｅｔｏｂａｃｔｅｒｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ　） の静止細胞（ｒｅｓｔｉｎｇ　ｃｅｌｌＳ）によるＤ−カルニチンおよびＬ−カ ルニチンの物質代謝の研究が行なわれた。ＤＬ−力ルニチン上に生育したＰｓ、 プＬグの細胞はＬ−力ルニチンのみを分解してグリシンベタインを化学量論的に 蓄積した（Ｊ、ミウラフラポニイ、Ｓ、エンゲラード１邦　Ｌ旦Ｉ」±ＩＬ巨旦 工旦（＋９８３）　１１３）　、　Ａ　、カルコアセチカスによるカルニチンの 物質代謝については若干の明白な論争がある。ある報文はこの生物がＬ−力ルニ チンの上にのみ成長してトリメチルアミンを生成すると報告している（Ｈ、Ｐ　 、フレバーら　Ａｒｃｈ、　Ｍｉｃｒａｂｉｏｌ、　１１２　（１９７？）　２ ０＋　）　、もし、培養混合物中にＬ−カルニチンの如き付加的な炭素源が存在 するならば、あるいはもしその細菌がＬ−カルニチンまたはＤＬ−カルニチンで 予め培養されたならば、Ｄ−カルニチンが代謝作用を受けるが、Ｄ−カルニチン が単独炭素源となる場合には成長はｉｕ察されなかった。他方、Ｊ、ミウラフラ ポニイとＳ、エンゲラードはＡ、カルコアセチカスは炭素源としてカルニチンの Ｄ、Ｌ異性体のどちらもその生育のために利用し、化学量論的にトリメチルアミ ンを生成すると報告している。しかし、これまでのところ、ＤＬ−カルニチンを 含有する培養混合液中で非天然型のカルニチン、すなわち、Ｄ−力ルニチンを優 先的に分解して、その培地中に所望の天然型のＬ−カルニチンを蓄積する微生物 についての報告は全くない。 免且五里ｊ ここに、ＤＬ−カルニチンラセミ混合物の分割が、その中に含まれる非天然型の Ｄ−カルニチンを優先的に代謝し、それにより所望の天然型のし一力ルニチンを 容易に取り出すことができるように反応培地中に蓄積することができる独特の能 力により特徴づけられた微生物産出酵素の発酵作用に付することにより可能であ ることが発見された。この方法は図式的には次のように表わされる。 上に述べたような独特の特性を持つＡ、カルコアセ皇１の野生菌株は下水から単 離された。既知のカルニチンを代謝する微生物菌株はＤ−およびＬ−カルニチン を同速度で代謝するから、ＤＬ−カルニチンを分割する機使を持っていないが、 ＡＴＣＣ３９６４８という識別番号を持つこの野生菌株は培体培地または固形培 地中でＤ−力ルニチンをＬ−力ルニチンよりも速い速度で代謝するという能力に より特徴づけられる。従って、この菌種は本発明の工程用としての微生物規準に 適合するものであり、ＤＬ−力ルニチンを分割して所望の天然型のカルニチン、 すなわちＬ−カルニチンの回収を可能にするという独特の能力を有している。 上述した野生菌株に加えて、その菌の突然変異株ＡＴＣＣ３９６４７が作り出さ れた。この変異株は発酵作用によるＤＬ−カルニチンの分割に付した時にその反 応液中に野生菌株の場合よりも多量のＬ−カルニチンを蓄積する能力を有してい ることで野生菌株よりも優れている。 突然変異株ＡＴＣＣ３９６４７はＡ、カルコアセチ力ＸＡＴＣＣ３９６４８をＤ Ｌ−カルニチン含有の適当な培地上で成長させ、ニドソログアニジン（ＮＴＧ） 突然変異化法（ｍｕｔａｇｅｎｉｓｉｓ）処理することにより得られる。 この突然変異株は、次いで、単独炭素源としてＤ−カルニチンまたはＬ−カルニ チンを含有する寒天プレート上ＡＴＣＣ３９６４７は単独炭素源としてＬ−カル ニチンを含有する媒体上で僅かしか成長しないが、単独炭素源としてＤ−カルニ チンを含有するプレート上では急速に成長する。この選別はレプリカ平板法（Ｄ 　、　Ｆ　、スプーナー、Ｇ、サイケスＭｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉ ｏｌｏ　、　Ｖａｌ、７Ｂｐ、２４４１９７２）により行なわれた０本発明方法 に好適な突然変異株の生産に上記以外の突然変異誘導法が十分利用できることは 当業者には明白であろう、すなわち、突然変異誘導用薬品として上記ニトロソグ アニジンの他に、例えば、亜硝酸ナトリウム、エチレレイミン、８−７ザグアニ ジン、Ｎ−メチルＮ′−ニトロソグアニジン、ナイト口　ジエンマスタードなど の薬品を選択使用することができよう、その外、紫外線およびＸ線、ガンマ線、 電子ビームなどを用いるイオン化法または高エネルギー照射法などの物理的突然 変異誘導法も適用できよう、また、最近の分子生物学技術の適切なもの、すなわ ち、形質導入　（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）　、形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒ ｍａｔｉｏｎ）。 接合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）、細胞融合、Ｉ）ＮＡ組換え技術なども新しい 微生物菌株を作る突然変異誘導法として用いることができよう。 るため　。 本発明における好ましい方法は識別番号として人工ＪＬ工り皇ヱ１２ＡＴｃｃ３ ９６４７を有する微生物を水性栄養化培地中で単独炭素源としてＤＬ−カルニチ ンを含有するミネラル堪培地中の好気条件下で培養することよりなる。別法とし て、この微生物を栄養化借地上で成長させた後、ＤＬ−力ルニチンを加えて培養 することもできる。 ＤＬ−カルニチンの好ましい濃度（塩化水素塩として）は、培地中のＤＬ−力ル ニチンとアンモニアの濃度比に応じて約０．１から約１００　ｇ／ｌの範囲にあ る。ＤＬ−力ルニチン塩化物の濃度が増すと、Ｄ−異性体の最適代謝速度を維持 するため、より多くのアンモニラムイオンが必要になることが理解されるであろ う、また、ＤＬ−カルニチン上よびＤＬ−カルニチン塩化物という二つの用語は 本発明において、特に指定しない限り、互換的に用いられるから、本発明の明細 書および請求の範囲項目中において互換的に使用されていると理解すべきである 。また、同様な互換性はＤ−カルニチンまたはＬ−力ルニチンそれぞれとその塩 化物の間にも適用される。′ 培養時間は２４時間から５日間またはそれ以上の範囲にある。温度は通常２５℃ から３７℃である。微生物の成長を促進しプロセスの効率を向上させるため、内 容物は滅菌空気による適切な通気および攪拌をうける。 発酵工程完了後、所望のＬ−カルニチンは当業者周知の方法により取り出される １例えば、発酵液と細胞の分別は通常の方法、すなわち濾過または遠心分離によ り行われ、その後発酵液は減圧蒸留により乾固される。所望のＬ−カルニチンを 含有する残留固型物は無水エタノールにより抽出され、エタノール抽出物は減圧 蒸発乾固され、その残留物を６ＮＨＣＪｌで処理することによりＬ−カルニチン はその塩化水素塩に転換される。この水溶液を蒸発乾固した後、Ｌ−力ルニチン 塩化物が無水エタノール−アセトン混液中で結晶分離される。これに代る方法と して、Ｌ−力ルニチン内塩はダウエックス（Ｄｏｖｅｘ）　−１−ＯＨイオン交 換カラム上でエタノール抽出物の残留物をクロマトグラフィーすることによって も得ることができる（Ｆ、ストラック、■、ローレンツ、Ｌユ■且風、　Ｃｈｅ ｍｉｅ　３１８　、１Ｊ６０．１２９）。 もし所望ならば、この方法を連続的な処理法として実施できるように微生物細胞 を固定化する（Ｓ、福井。 Ａ、国中、Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　ｏｆに１ｃｒｏｂｉａ１．　＋！１８２．　Ｖ ｏｌ、　３８、ｐ、１４５）ことも考えられよう、また立体選択性を高めるため 、生育培地を修正するか、もしくはさらに突然変異株を突然変異誘導処理しうろ ことも明白であろう。 下記の実施例は本発明の内容を明らかにするためのみのものであり１本発明を限 定するものと解すべきではない、特に指定しない限り、パーセントは重量パーセ ント５溶剤の混合化は容積比である６分離されたし一力ルニチンは陽子磁気共鳴 スペクトル、融点、薄層クロマトグラフおよび旋光性により特定した。 支ｉ班ニ アシネドパ　−力ルファセチカス　ｄｆ−２ＡＴＣＣ３９６４８ Ａ、カルコアセチカスＡＴＣＣ３９６４８は、下記の操作により、スキムタンク より採取した下水試料から選択培地を用い単離された。 下水スキムタンク（ナインスプリングス下水処理プラント、マジソン、ウィスコ ンシン州）から油状（ｑｒｅａｓり表面水１０ｍ文を捕集し、その１ｍ文を修正 ジ璽ンソン培地（培＃ｌ！Ａ）５０℃交を含有する２５０ｍ見容エルレンマイヤ ーフラスコに加工た。 敷−並一通 酵母エキス（ディフコ）　５０　ｍ　ｇＫＨ２ＰＯ４５，５ｇ Ｎ　ａ　２　ＨＰ　Ｏ４１０、Ｏｇ （Ｎ　Ｈ４）　２　ＨＰ　Ｏａ　２−　ＯｇＮＨ４Ｈ２Ｐ０．　１．５ｇ ＣａＣｌ２　１５ｍｇ ＭｇＤ０　．７Ｈ，，０２００ｍｇ Ｆｅ２　（ｓｏ、）３　０．６ｍｇ Ｚｎ５Ｏａ、７Ｈ２０、０，２ｍｇ Ｃｕ　Ｓ　０　、　５　Ｈ２０ ４０。２ｒｎｇ Ｍ　ｎ　Ｓ　Ｏａ　、　Ｈ２００−２ｍｇ脱イオン蒸留水　１文 Ｄ　Ｌ　−力／ｌ／　ニチ７　ＨＣｌ　（シグマ）（１０ｇ／！ｌ）を加え、１ ２１”０１２０分間の滅菌ＭＦｌ前に４Ｎ　ＮａＯＨを用いてＰＨを６．８に調 整した。接′ｓフラスコは回転振とう機を用いて培養した（２５０ｒｐｍ、２イ ンチストローク、２７℃）、１６時間後、濁ったスープ状液（ｔｕｒｂｉｄ　ｂ ｒｏｔｈ）　ｌ　ｍ文を同じ培地含有の別のフラスコに移し、再び回転振とぅ機 を用いて１６時間培養を続けた。この操作を３回繰返した後、濁ったスープ状液 をｐＨ７，４のＭ／１５リン酸填緩酸液緩衝液て順次希釈した。各希釈液のアリ コート量（０，１ｍ党）を修正ジョンソン培地Ａ中に１％のＤＬ−カルニチン塩 化物と２％の寒天を含有したベトリブレートの寒天表面上に均一に拡げた。３０ 〜３００コロニーを有するプレートから種々のタイプのコロニーを選び出し、１ ％ＤＬ−力ルニチン塩化物修正ジョンソン培地寒天上に筋っけ接種し、その純度 をチェックした。純化単離された菌は０．５％のＤ−カルニチンまたはＬ−カル ニチンのどちらかを含有する修正ジョンソン培地上で単独炭素源としてＤ−カル ニチンを利用するかＬ−力ルニチンを利用するかの能力試験に供された。単離体 ｒｄｆ−２ＪはＬ−カルニチンよりもＤ−カルニチン上でかなり急速に成長する ことが観察された。かくして、この野生菌株が下記の突然変異誘導法研究用に選 ばれた。 支亙皇」 Ａ、ｆＪルコ７セチカｘ　ｒｄｆ−２Ｊ　ＡＴＣＣ３９６４８からのＡ、カルコ アセチカス　ＡＴＣＣ３９６４７の・ ａ　こトロングアニジン　・　“− ７’ｙ主土ΔｊＪ、コリＬ≧乙工上Ｊ］と識別（大学病院クリニカル微生物研究 所−ＩＪｎｉｖｅｒｓｉｔＦ　ＨｏｓｐｉｔａｌＣ１１ｎｉｃａｌ　Ｍｉｃｒｏ ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、マジソン、ウィスコンシン州）された 野生菌株ｒｄｆ−２Ｊは１％ＤＬ−カルニチン塩化物修正ジョンソン寒天培地ス テン）ｈで保持し、４℃で貯蔵した。このスラントから１％ＤＬカルニチン塩化 物修正ジョンソン培ｊｌＢ　５０　ｍ　ｌを入れた２５０ｍ１容エルレンマイヤ ーフラスコへのｔｅＭｌｃ行い、回転振とう機上で１６時間の培養を行った（２ ５０ｒｐｍ、２インチストローク、２７℃）、この１夜培養成長物へＮ−エチル −Ｎ′−二トローＮ−ニトロソグアニジン（アルドリッチ）（ＮＴＧ）を最終濃 度として３００ｇｇ／培地１ｍＪＬになるよう添加した。フラスコを回転振とう 機上にもどし、正確に３０分間培養を行った。　ＮＴＧ３００ｇｇ／培地１ｍｕ 添加３培地１理ｕ添加３０細胞の約９９．９％が死滅することは事前に確認され ていた。ＮＴＧ３０分間処理後細胞は遠心分離（ｔｏ、ＯＯＯｒｐｍ、１５分間 ）された、ぺＬ／フット状なった細胞を１％ＤＬ−力ルニチン塩化物修正ジョン ソン培地５ｍ文中に再度懸濁させ、その懸濁液２ｍ文を１％ＤＬ−カルニチン塩 化物修正ジョンソン培地５０ｍ１を入れた２５０ｍ１容エルレンマイヤーフラス コに接種するのに用いた。このフラスコを回転振とう機上（２７０ｒｐｍ、２７ ℃）で１６時間培養した後、液の濁度をギルフォード（Ｇｉｌｆｏｒｄ）紫外可 視分光々度肝（モデル２４０）の６００ｎｍ吸光度モニターにより測定した。こ のデータにより接種および突然変異種選定に使用する希釈率計算が可能となった 。 ｂ　Ａ、カルコアセチカス　ＡＴＣＣ３９４６７、 上述した突然変異処理細胞はｐＨ７，４のＭ／１５１Ｊン酸塩緩衝液を用いて順 次希釈し、それを１％ＤＬ−力ルニチン塩化物修正ジョンソン培地寒天上に拡

【 ｆた。 ２８℃で約４日間培養後、得られたコロニーを０．５％のＬ−カルニチンまたは ０．５％のＤ−カルニチンを含有した修正ジョンソン培地寒天上で複製した。 Ｄ−カルニチンプレート上ではよく成長する力く、Ｌ−カルニチンプレート上で 殆ど成長しなかったコロニーｔ±０．５％Ｄ−カルニチン修正ジョンソン培地（ Ａ培地）寒天プレートに筋つけ接種することにより純化した。 ２８℃での成長を行わせた後、寒天上の個々のコロニーをスラント上に採取し、 振とうフラスコ中で評価した。 Ｃ−フラスコ； １％ＤＬ−カルニチン塩化物修正ジョンソン培＃！Ａ５０ｍＪｌを入れた２５０ ｍ１容フラスコに寒天スラントから採取した数理の細胞群を接種した０回転振と う機上で２４時間処理後、その濁ったスープ状液５０ｍ交を同じ培地液５００　 ｍ　ｇ、含有の別の２交容エルレンマイヤーフラスコへの接種液として使用した ０回転振とう機（２５０ｒｏｍ、２インチストローク）上で２５℃、４４時間培 養後、フラスコ内容物Ｌｏｏｍ見を減圧蒸発により乾固し、残留物を無水エタノ ールで抽出した。このエタノール抽出液を再び減圧蒸発により乾固し、その残留 物を６ＮＨＣ１１０ｍｕに溶解してカルニチンをカルニチン塩化物に変換した。 その水溶液試料は減圧下で乾固し、残留するし一力ルニチン塩化物を無水エタノ ール−アセトン溶媒中で結晶化した。その製品の高度な負の旋光（［α］　”　 ２３　、０７℃（Ｃ，３，５Ｈ２０））によりＡ、カルコアセチカス野生株ＡＴ ＣＣ３９６４８から製作された新規な突然変異株によりＤ−カルニチンが選択的 に分解されたことが確認された。 ＡＴＣＣ３９６４７，ＡＴＣＣ３９６４８として識別されたアセトバクターカル コアセチカスおよびその菌株は以下に述べる特性を有している。 Ｅ１主匁亘ｊ 培地−ディフコ栄養化寒天（ディフコ研究所、デトロイト、ミシガン州） 細胞の形状および大きさ一直径１〜１．６ｇｍ、長さ１．５５−２２ｐＬの桿状 。 成長静止期に達すると球状（球状桿）になる。 しばしば対になったり、種々の長さの鎖状となる。 鞭毛なし。 胞子なし。 グラム陰性。 抗酸性なし。 （ｌ車重１盪 培地−ディフコ栄養化寒天（ディフコ研究序、デトロイト、ミシガン州） コロニーは比較的大きく（２４時間で２〜３ｍｍ）。 不透明で、着色していない。 例えばエタノール、酢酸塩、乳酸塩、ピルビン酸塩。 リンゴ酸塩またはアルファケトグルタル酸塩などの単濁炭素エネルギー源を含有 する簡単なミネラル塩培地中で成長可能である。 アンモニウム塩を窒素源として使用する。 ゼラチン培地中でゼラチンを液化せず、成長は培地の表面から３ｍｍの深さまで に限定される。 リドマスミルク中でアルカリ反応を示し、凝集、液化を生じないが、成長は非常 に緩慢。 １１ヱ１ヱＩ 硝酸塩還元−陰性。 脱窒反応−陰性。 ＭＲテスト−陰性。 インドール生産−陰性。 ＶＰテスト−陰性。 硫化水素生産−極々弱い。 でんぷん加水分解−陰性。 硝酸塩消費−陽性。 アンモニウム塩使用可能。 色素生産−自己分解で２〜３日後に培地中へ溶出する黄色の細胞内水溶性色素を 有する。 ウレアーゼ−陽性。 オキシターゼー陽性。 成長条件−ｐＨ５〜８．５゜ 温度５°〜３５℃ どんな培地中でも嫌気的では成長しないであろう。 ・よびガス ＡＴＣＣ３９６４８ＡＴＣＣ３９Ｂ４７開放　蓋付き　開放　蓋付き １）Ｌ−７ラビノース　Ａ−Ａ− ２）Ｄ−キシロース　Ａ　−Ａ　− ３）Ｄ−グルコース　ＡＡル　Ａ　− ４）Ｄ−マンノース　Ａ−Ａ− ５）Ｄ−フラクトース　へル　−　Ａル　−６）Ｄ−ガラクトース　Ａ−Ａ− ９）ラクトース　−−−− １０）トレハロース　−−−− 注）Ａ＝酸反応 終＝弱反応 一＝無反応またはアルカリ反応 り立立立且ｊ エチルアルコールを酸化する。 塩化ナトリウム許容限は高い（２〜３＄ＮａＣｕ）。 ３３℃で成長可能。 フェニルアラニンを脱アミノ化しない。 リシンを脱カルボキシル化しない。 オルニチンを脱カルボキシル化しない。 寄託番号ＡＴＣＣ３９６４７およびＡＴＣＣ３９６４８として識別される菌株は アメリカンタイプ力ルチュアコレクシ震ン（ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　丁ｙｐ ｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）（１２３０１パークローンドライ ブ、ロックビル、メリーランド州　２０８５２−１７７６）に１９８４年４月２ 日に寄託された。 実」ｕｌ】 Ａ、カルコアセ　カスＡＴＣＣ３９６４ＢによるＤ−カルニチン 一週間培養したＡ、カルコアセチカスＡＴＣＣ３９６４８スラントから表面成長 部を採取し、塩水（０，８５％）ＳｍＪＬ中に懸濁させた。この懸濁液２ｍ文を １％ＤＬ−カルニチン塩化物修正ジョンソン培地Ａ　５０　ｍ　ｌを入れた２５ ０ｍ１容のエルレンマイヤーフラスコの接種に使用した（ｆ−１段階）、このフ ラスコは回転振とう機（２５０ｒｐ曹／ｗｉｎ　２インチ径）上２５℃で２４時 間培養した後その容積１０％相当分を同じ培地５００ｍ文を入れた２文官エルレ ンマイヤーフラスコに移した（Ｆ−２段階）、これを回転振とう機上で１２時間 培養した後その１００ｍ１をとり出し、遠心分離し１分離液を減圧蒸発により乾 固した。残留物を熱エタノールで抽出し。 抽出液を減圧下で乾固した。その残留物を６ＮＨＣ１１０ｍ文中に溶解しこの液 を濃縮乾固した。この残留物の無水エタノール・アセトン溶液からの結晶化によ り光学対掌体過剰値（ｅｎａｎｔｉｏ■ｅｒｉｃ　ｅｘｃｅｓｓ　）　（肚）０ ．５１を示すカルニチン塩化物（２１６ｍｇ、収率４３％）（（α）　１２．０ ’″）（Ｃ１７，２Ｈ２０の試料を与えた。 支亙更」 一週間培養したＡ、カルコアセチカスＡＴＣＣ３９６４７スラントの表面成長部 を５ｍＪＬの培＃！Ａに懸濁した。この液の４ｍＪ１を１％ＤＬ−カルニチン修 正ジョンソン培地Ａ５０ｍＪＬを入れた２５０ｍＭエルレンマイヤーフラスコの 接種に使用した（Ｆ−１段階）、フラスコを回転振とう機（２５０ｒ　ｐ　ｍ　 ／　ｍ　ｉ　ｎ　、　２インチ径）上２５℃で２４時間培養した後、その容積１ ０％相当分を下記の培地（培地Ｂ）５００ｍ文を入れた２文官エルレンマイヤー フラスコに移した（Ｆ−２段階）。 酵母エキス（ディフコ）　５０ｍ文 ＫＨ２ＰＯ４５，５ｇ Ｎａ２４ＰＯ４１０，Ｏｇ （ＮＨ４）２ＨＰＯ４４、Ｏｇ Ｎ　ＨＨＰ　Ｏ＜　３−５　ｇ Ｃａ　Ｃｉ２　１５　ｍｇ Ｍ　ｇ　Ｓ　０　、　７　Ｈ２０２００ｍｇＦ　ｅ　（Ｓ　Ｏ４）３　０−６　 ｍ　ｇＺｎ５Ｏ，７Ｈ２００，２ｍｇ Ｃｕ　Ｓ　０　、　５　Ｈ２Ｏ０、２ｍ　ｇＭ　ｎ　Ｓ　Ｏ４、Ｈ２００、２ｍ ｇ 脱イオン蒸留水　１文 ＤＬ−力ルニチン（シグマ）（２０ｇ／交）を加え、ＰＨを４Ｎ　ＮａＯＨによ り６．８に調整し、１２１℃で２０分間の滅菌を行なった。 回転振とう機上で２５℃、４４時間培養した後、内容物５０ｍ文を遠心分離によ り細胞除去し、上澄液を蒸発乾固した。実施例３に記載した方法によりＬ−力ル ニチン塩化物（１９６ｍｇ　、収率３８％）を単離した。 〔α〕Ｄ−２２，９°（Ｃ１２，６５Ｈ２０）（７）値から光学的純度は９６． ５部二以上と評価された。 １１貫」 実施例４とＦ−２段階でのＤＬ−力ルニチン塩化物濃度が同じ培地５０ｍ１を入 れた２５０ｍＪ１エルレンマイヤレフマイヤーフラスコ中ｇ／ｌであることの浦 は同じ操作を行った。Ｆ−２段階を６８時間経過して、発酵液１７ｍ１から同じ 操作（実施例３）によりＬ−カルニチン塩化物を単離した（１８０ｍｇ、収率　 ４２％）、この試料の光学的純度は〔α〕。−２０，４３＠（Ｃ，２，３６Ｈ２ ０）という値から明らかなように８６％旦以上であった。 ！ｊｄ１下 実施例２Ｃと培地Ａ中に０．３％Ｌ−力ルニチン塩化物と０．７％Ｄ−カルニチ ン塩化物の混合物よりなる１％ＤＬ−カルニチン塩化物を用いることのほかは同 じ操作を行った０発酵はＡ、カルコアセチカスＡＴＣＣ３９６４７を用い培地Ａ ２５０ｍ文を入れた２交容エルレンマイヤーフラスコで行った。Ｆ−２段階を４ ４時間経過してから１００　ｍ　！Ｌの発酵液を採り、Ｌ−カルニチン塩化物（ ３６ｍ　ｇ　、収率１２％、（ａ）　ｏ　２１−２°、Ｃ１３，６，Ｈ２Ｏ）を 単離した。 支嵐皇１ 実施例２ＣとＡ、カルコアセチカスＡＴＣＣ３９６４７を用い培地Ａ中に１．６ ％Ｌ−カルニチン塩化物とＱ、４％Ｄ−カルニチン墳化物の混合物よりなる２％ ＤＬ−カルニチン塩化物を用いることのほかは同じ操作を行った。Ｆ−２段階を ４４時間経過してから１００ｍ１の発酵液を採り、Ｌ−カルニチン塩化物（５５ １ｍｇ、収率３４％、（ｃｃ）　２５−２３　、０５°、Ｃ，２，６、Ｈ２Ｏ３ を単離した。 支嵐上」 実施例２ＣとＤＬ−力ルニチン塩化物濃度が２！；Ｌ容エルレンマイヤーフラス コ中に保持された培地Ｂ２５゜ｒｎｌ中でＬ−力ルニチン塩化物３部とＤ−カル ニチン塩化物７部よりなる混合物が５０ｇ／文であることのほかは同じ操作を行 った。Ａ、カルコアセ　カスＡＴＣＣ３９６４７を用いる６９時間の培養（Ｆ− ２段階）後、５０ｍ文の発酵液を遠心分離（９０００Ｘ６．２０分間）して細胞 を除去した。この上澄液を減圧乾固し、その残留物を無水エタノールで抽出した 。エタノール抽出液を乾固し、その残留物を蒸留水中に溶解し、ドウエックス（ ［］ｏｗｅｘ）　ｌ　−Ｘ　−４０Ｈカラム（５Ｘ２２ｃｍ）上のクロマトグラ フィーでＬ−カルニチンを得た〔１４゜ｆｆ１ｇ、収率２３％、（ａ）２５−２ ９．２°、Ｃ１１，５゜Ｈ２０）。 見見■」 実施例８とＦ−２段階のＤＬ−カルニチン廖化物濃度がＬ−カルニチン塩化物８ 部とＤ−カルニチン塩化物２部よりなる５　０　ｇ／ｌであることのほかは同じ 操作を行った６発酵液（Ｆ−２段階、６９時間）５０ｍ文から前述の方法でＬ− カルニチン内填を単離した。 （１，２１６ｇ、Ｉ［５１７５％、（ａ）　２５−３０　、４°、Ｃ＝２．８． Ｈ２Ｏ） ＬＯｕ」 実施例８とＦ−２段階のＤＬ−カルニチン廖化物濃度が５０ｇ／ｌであることの ほかは同じ操作を行った。Ｆ−２段階を９０時間経過した後、発酵液４０ｍ１を 採り、遠心分離した。前述の方法でＬ−カルニチン内填を単離した（０．６２ｇ 、収率７５％、〔α）Ｐ−２７，０＠、Ｃ＝４．４、Ｈ２Ｏ）。 国際調査報告 １、ｌ＠＋ｎｌ＋、。１ｌＩＩ　Ａ１１１１１ｆ１１６゜９゜ＰＣ″７　“、、 ｌ（Ｑ　５　□　□Ｔ・５１！

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ＤＬ−カルネチンラセミ混合物をそれに含まれる非天然型のＤ−力ルニチン を優先的に分解し、所望の天然型のＬ−カルニチンを反応培地中に蓄積する独特 の能力により特徴づけられた微生物により作り出された酸素の発酵作用に付し、 かつその反応培地からＬ−カルニチンを取り出すことよりなるＬ−カルニンおよ び同塩を調製する方法。 ２．徴生物が細菌である請求の範囲第１項記載の方法。 ３．細菌がグラム陰性細菌である請求の範囲第２項記載の方法。 ４．細菌が球桿菌（ｃｏｃｃｏ−ｂａｃｉｌｌａｒｙ　ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）で ある請求の範囲第２項記載の方法。 ５．細菌がナイセリア科（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｃｅａｅ）の１種である請求の範 囲第２項記載の方法。 ６．細菌がアシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属の１種である請 求の範囲第２項記載の方法。 ７．細菌がアシネトバクターの突然変異株である請求の範囲第６項記載の方法。 ８．細菌がアシネトバクターカルコアセチカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　 ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）ＡＴＣＣ３９６４８の特性を有するものである請 求の範囲第６項記載の方法。 ９．細菌がアシネトバクターカルコアセチカスＡＴＣＣ３９６４８の突然変異株 である請求の範囲第８項記載の方法。 １０．細菌がアシネトバクターカルコアセチカスＡＴＣＣ３９６４７の特性を有 するものである請求の範囲第９項記載の方法。 １１．水性栄養化培地中、好気条件下での微生物成長培養液中で行われる請求の 範囲第１項記載の方法。 １２．微生物の固定細菌によって行う請求範囲第１項記載の方法。 １３．連続的である請求の範囲第１２項記載の方法。 １４．微生物により作り出された酵素を含有し、微生物を含有しない培地中で行 われる請求の範囲第１項記載の方法。 １５．約２５°から３７℃までの範囲の温度で行われる請求の範囲第１項記載の 方法。 １８．ミネラル塩、ミネラルイオンおよび単独炭素源としてのＤＬ−方ルニチン よりなる培地中で行われる請求の範囲第１項記載の方法。 １７．ミネラル塩培地がジョンソン培地Ａ（Ｊｏｈｎｓｏｎ′ｓＭｅｄｉｕｍＡ ）である請求の範囲第１５項記載の方法。 １８．ミネラル塩培地がジョンソン培地Ｂ（Ｊｏｈｎｓｏｎ′ｓＭｅｄｉｕｍＢ ）である請求の範囲第１５項記載の方法。 １９．ＤＬ−カルニチン濃度が増大するに従って反応培地中のアンモニウムイオ ン濃度を増大させることによってカルニチンのＤ−異性体の代謝速度を最適化す る請求の範囲第１５項記載の方法。 ２０．ＤＬ−カルニチンのラセミ混合物をその混合物中の非天然型のＤ−カルニ チンを優先的に分解し、Ｌ−カルニチンの蓄積を可能ならしめることによって分 割するという能力により特徴づけられるナイセリア科細菌。 ２１．アシネストバクター属、その突然変異株よび遺伝学的に創出されたその変 種から選択された請求の範囲第２０項に記載の細菌。 ２アシネトバクターカルコアセチカス種の微生物、その突然変異株および遺伝学 的に処理されたその変種。 ２３．識別特性ＡＴＣＣ３９６４８を有するアシネトバクターカルコアセチカス 菌株の微生物。 ２４．識別特性ＡＴＣＣ３９６４７を有するアシネトバクターカルコアセチカス 菌株の微生物。 ２５．識別特性ＡＴＣＣ３３９６４を有する微生物アシネトバクターカルコアセ チカス種を含有し、ＤＬ−カルネチンラセミ混合物中の非天然型のＤ−カルネチ ンを優先的に分解することによってそのラセミ混合物を分割することが可能な微 生物学的純粋培養物。 ２６．微生物が識別特性ＡＴＣＣ３９６４７を有するアシネトバクターカルコア セチカスである請求の範囲第２５項記載の培養物。 ２７．凍結乾燥形である請求の範囲第２５項記載の培養物。 ２８．凍結乾燥形である請求の範囲第２６項記載の培養物。 ２９．微生物アシネトバクターカルコアセチカスを合有し、ＤＬ−カルネチンラ セミ混合物の中の非天然型のＤ−カルニチンを優先的に分解することによりその ラセミ混合物を分割することが可能な培養物。 ３０．微生物アシネトバクターカルコアセチカス（ＡＴＣＣ３９６４８）を水性 栄養化培地中で単独炭素源としてのＤＬ−カルネチンラセミ混合物の存在下．好 気条件下でそのラセミ混合物中のＤ−カルニチンを優先的に分解するように培養 し、次いでその培地から蓄積されたＬ−カルニチンを取り出すことよりなるＤＬ −カルニチンのセラミ混合物を分割する方法。 ３１．微生物がアシネトバクターカルコアセチカス（ＡＴＣＣ３９６４７）であ る請求の範囲第２７項記載の方法。 ３２．ＤＬ−カルニチン自体を非天然型のＤ−カルニチンを優先的に分解する独 特な能力によって特徴づけられる微生物によって作り出された酵素の発酵作用に 付し、その反応培地からＬ−カルニチンを取り出すことよりなる誘導体を予め調 製するという必要条件なしでＤＬ−カルニチンを分割する方法。