NO855051L

NO855051L - Fremgangsmaate for fremstilling av l-carnitin.

Info

Publication number: NO855051L
Application number: NO855051A
Authority: NO
Inventors: Charles J Sih
Original assignee: Wisconsin Alumni Res Found
Priority date: 1984-04-20
Filing date: 1985-12-16
Publication date: 1985-12-16
Also published as: FI855074A; GR850950B; AU4233285A; JPS61501886A; PT80323B; WO1985004900A1; KR860700045A; CA1269941A; ES542411A0; FI855074A0; YU69785A; PT80323A; ZA852808B; DE3579284D1; EP0179864A1; CA1269941C; PH24045A; EP0179864A4; EP0179864B1; MX7657E

Abstract

Foreliggende oppfinnelse omhandler en fremgangsmåte .for å skille DL-carnitin ved å sette et racemat av DL-carnitin i kontakt med en mikroorganisme som fortrinn-vis metaboliserer D-carnitin og tillater akkumulering av L-carnitin i reaksjonsmediet, og en ny stamme av slike mikroorganismer og en mutant av en slik stamme.

Description

FREMGANGSMÅTE FOR FREMSTILLING AV L-CARNITIN

Foreliggende oppfinnelse omhandler en fremgangsmåte for fremstilling L-carnitin. Mer spesielt omhandler foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for fremstilling av L-carnitin ved fermentering. Enda mer spesielt omhandler foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for å oppløse DL-carnitin mikrobiologisk. Foreliggende oppfinnelse omhandler også nye mikroorganismer som kan benyttes for å oppløse DL-carni tin.

Det er godt dokumentert at en mengde forskjellige mikroorganismer kan benytte L-carnitin som eneste karbonkilde. Foreksempel ble det rapportert at et bakterium (forsøksvis identifisert som Pseudomonad), isolert fra en forurenset elvebunn, benyttet L-carnitin fra en DL-blanding for å danne D-carnitin med høyt optisk utbytte (G. Fraenkel og S. Friedman, Vitam, Horm. (N.Y,) 1957 16, 73). Senere ble metabolismen av D- og L-carnitin undersøkt gjennom hvilende celler av Psudomonas putida og Acinetobacter calcoaceticus. Celler av Ps. putida dyrket på DL-carnitin brøt ned bare L-carnitin med støkiometrisk akkumulering av glycinbetain (J. Miura-Fraboni og S. Englard, FEMS Microbiology Lett. 18

(1983) 113). En viss tilsynelatende motsetning eksisterer relativt til carnitin-metabolismen av A. calcoaceticus. En rapport hevdet at denne organismen kun vokste på L-carnitin under dannelse av trimetylamin (H. P. Kleber et al., Arch. Microbiol. 112 (1977) 201). D-carnitin ble metabolisert hvis en ytterligere karbonkilde som L-carnitin var tilstede i inkuberingsblåndingen eller hvis bakteriene ble pre-inkubert med L- eller DL-carnitin, men ingen vekst ble obser-vert på D-carnitin som eneste karbonkilde. På den andre side hevdet J. Miura-Fraboni og S. Englard at A. calcoaceticus benyttet både D- og L-isomerene av carnitin som eneste karbonkilde for vekst med støkiometrisk dannelse av trimetylamin, men inntil den foreliggende oppfinnelse har det ikke blitt rapportert noen mikroorganismer som, i en inkuberingsblanding inneholdende DL-carnitin, fortrinnsvis bryter ned den unaturlige form av carnitin, D-carnitin, som resulterer i akkumuleringen av det ønskede naturlite L-carnitin i mediet.

Det har nå blitt funnet at et racemat av DL-carnitin kan separeres ved å utsette det for fermentering av enzymer fremstilt av mikroorganismer som erkarakterisert vedderes enestående egenskap og fortrinnsvis metabolisere den unaturlige D-form av forbindelsen for dermed å tillate den ønskede naturlige L-carnitin og akkumulere i reaksjonsmediet hvorfra L-carnitin lett kan gjenvinnes. Denne reaksjon kan representeres skjematisk som følger:

En villtype av A. calcoaceticus som har det enestående karakteristikum som er nevnt ovenfor har blitt isolert fra kloakk. Mens kjente stammer a- m kro^rganismer som vil metabolisere carnitin ikke vil separere DL-carnitin siden se metaboliserer D- og L-carnitin med lik hastighet, er denne villtype som har karakteristika av ATCC 39648,karakterisert vedsin egenskap å metabolisere D-carnitin med større enn L-carnitin i flytende og faste media. Således reagerer denne stamme på de kriteria som kreves av en mikroorganisme med hensyn til fremgangsmåten av foreliggende oppfinnelse og har den enestående egenskap å skille DL-carnitin og tillate gjenvinning av denne naturlige ogønskede form av carnitin, L-carnitin.

I tillegg til den ovenfor identifiserte villtype har en mutant av denne stamme som har karakteristika av ATCC 39647 blitt fremstilt. Denne mutanten er avledet fra villtypen ved sin egenskap å tillate akkumulering av større mengder L-carnitin i reaksjonsmediet når den blir brukt til å skille DL-carnitin ved fermentering.

Mutanten ATCC 39647 kan erholdes ved å dyrke A. calcoaceticus ATCC 39648 på et passende medium inneholdende DL-carnitin og så utsette den for nitrosoguanidin (NTG) mutagenese. Mutanten blir så utvalgt fra agarplater inneholdende enten D- eller L-carnitin som eneste karbonkilde. Den ønskede mutant A. calcoaceticusATCC 39647 vil vokse dårlig på et medium inneholdende L-carnitin som eneste karbonkilde, men vil vokse raskt på platen inneholdende D-carnitin som eneste karbonkilde. Denne utvelgelse ble oppnådd ved re-plicaplate-metoden ("replica plating method") (D. F. Spooner og G. Sykes i "Methods in microbiology", Vol. 7B, p. 244 (1972)). Det vil være innlysende for en fagmann at andre mutasjonsprosedyrer med hell kan benyttes for å danne mutanter passende for fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse. Således istedet for å bruke nitrosoguanidin for å oppnå mutagenese, kan andre kjemiske mutagenener bli benyttet så som foreksempel natriumnitrit, etylenimin, 8-asaguanin, N-metyl N'-nitrosoguanin eller nitrogensenneper fulgt av seleksjon. I tillegg kan fysisk mutagenese benyttes ved å bruke UV-lys og ioniserende eller høyenerget-isk betråling så som røntkenstråler, gammastråler eller elektronstråler. Mutagenese kan også fremskaffes ved nå-værende tilgjengelige molekylære biologiske teknikker foreksempel transduksjon, transformasjon, konjugasjon, celle-fusjon, rekombinat DNA-teknikker kan bli brukt for å danne nye mikroorganisme stammer.

Den foretrukkede fremgangsmåte ifølge foreliggende oppfinnelse består av å dyrke en mirkoorganisme med de identifiserende karakteristika til A. calcoaceticus ATCC 39647 i et vandig næringsmedium under aerobiske betingelser i et mineralsaltmedium inneholdende DL-carnitin som eneste karbonkilde. Alternativt kan DL-carnitin bli tilsatt mikro-organismekulturen etter at den har blitt dyrket på et næringsmedium .

Den foretrukkede konsentrasjon av Dl-carnitin (som hydro-klorid) er ca. 0,1 til ca. 100 g/l avhengig av forholdet av DL-carnitin og ammoniakk-konsentrasjonen i mediet. Det er underforstått at medøkende DL-carnitinkonsentrasjoner kreves mer ammoniumioder for å oppnå optimal hastighet av omsetning D-isomeren. Det er også underforstått at be-tegnelsene DL-carnitin og DL-carnitinklorid blir brukt om hverandre i beskrivelsen og kravene siden de kan bli brukt om hverandre i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen med mindre noe annet er spesielt indikert. Den samme ombytt-barhet er også brukt med hensyn til D- og L-carnitin og deres tilsvarende klorider.

Varigheten av prosessen kan være fra 24 timer til 5 dager eller mer. Inkuberingstemperaturen er vanligvis fra 25^C til 37^C. Innholdet blir passende aerert med steril luft og omrørt for å lette vekst av mikroorganismene og således øke effektiviteten av prosessen.

Mot slutten av fermenteringsprosessen gjenvinnes det ønskede L-carnitin ved metoder som er velkjent i faget. Foreksempel kan fermenteringsvæsken og cellene først separeres ved konvensjonelle metoder f.eks. filtrering eller sentrifugering hvorpå fermenteringsvæsken kan vakumdestill-eres til tørrhet. Det resulterende residium som inneholder det ønskede L-carnitin kan ekstraheres med vannfri etanol hvor det etanoliske ekstrakt inndampes til tørrhet in vacuo og L-carnitinet konverteres til sitt hydrokloridsalt ved å behandle residiet med 6 N HC1. Etter inndamping av den vandige oppløsning til tørrhet kan L-carnitinkloridet krystalliseres fra en blanding av absolutt etanol-aceton. Alternativt kan L-carnitin indre salt erholdes ved å kroma-tografere residiet av det etanoliske ekstrakt på en Dowex-1-OH ionebytterkolonne (F. Strack og I. Lorenz, Z. Physiol. Chemie 318 (1960) 129).

Det vil forstås at cellene av mikroorganismen om ønsket kan immobiliseres (S. Fukui, Tanaka, Ann. Rev. og Microbiol. 1982, Vol. 36 p. 145) for å tillate prosessen å bli utført på en kontinuerlig måte. Det vil også være innlysende at å øke sterioselektivt vekstmediet kan modifiseres eller ytterligere mutagunese av mutanten oppnås.

De følgende eksempler må betraktes kun illustrative for foreliggende oppfinnelse og må ikke betraktes som begrens-ende. Prosentanføringer er gitt som vekt-% og løsnings-middelblandingsforhold er uttrykt i volum med mindre annet er angitt. Det isolerte L-carnitin blekarakterisertav proton magnetisk resonansspektra, smeltepunkt, mobilitet på tynnsjiktkromatografi og optisk rotasjon.

Eksempel 1

Isolasjon av villtype (df-2) av Acineto bact er calco aceticus ATCC 3 9 648

A. calcoaceticus ATCC 39648 ble isolert fra en kloakkprøve erholdt fra en skummingstank ved å bruke et seleksjonsmedi-um via følgende prosedyre:

10 ml med oljeaktig overflatevann fra en kloakkskummings-tank (Nine Springs behandlingsfabrikk, Madison, WI) ble oppsamlet og 1 ml av denne prøven ble tilsatt en 250 ml Erlenmeyer kolbe inneholdende 50 ml modifisert Johnson's medium (Medium A):

DL-carnitin HC1 (Sigma) (10 g/l) ble tilsatt og pH ble justert til 6,8 med 4 N NaOH før sterilisering ved 121°C

i 20 minutter. Den inokulerte flaske ble inkubert på en rotasjonsrister (250 rpm, 5,1 mm utslag, 27^C). Etter 16 timer ble 1 ml av den turbide væske overført til en annen flaske inneholdende tilsvarende .medium og reinkubert på en rotasjonsrister i 16 timer. Prosedyren ble gjentatt for en

tredje gang hvorpå den turbide vasske ble fortynnet i serie ved å bruke M/15 fosfat buffer, pH 7,4. En aliguot (0,1 ml) av hver fortynning ble spredt jevnt over agaroverflaten til en petriskål inneholdende 1% DL-carnitinklorid og 2% agar i modifisert Johnson's medium A. Forskjellige koloni-typer ble utvalgt fra skålene som inneholdt mellom 30 og 300 kolonier per skål. Koloniene ble strøket ut på 1% DL-carnitinklorid modifiserte Johnson's medium agarplater og sjekket for renhet. De rene isolatene ble så tested for sin egenskap å benytte D-carnitin og L-carnitin som eneste karbonkilde på modifisert Johnson1s medium inneholdende 0,5% av enten D- eller L-carnitin. Det ble funnet at iso-latet "df-2" vokste vesentlig raskere på D-carnitin enn på L-carnitin. Følgelige ble denne villtypen valgt for på-følgende mutagensestudium.

Eksempel 2

Fre mstilling av mutan t A. cal coaceticus A TCC 39 647 fra villtype "df-2", A. calc oaceti cus ATCC 39468

a) Nitrosoguanidin mutagenese

Villtypen "df-2", identifisert som Acinetobacter calcoaceticus (University Hospital Clinical Microbiology Laboratory, Madison, WI) ble holdt på 1% DL-carnitinklorid modifisert Johnson's agarmedium skråplan og lagret ved 4^C. En 250

ml Erlenmeyer kolbe inneholdende 50 ml 1% DL-carnitinklorid modifisert Johnson's medium ble inokulert fra et skråplan og så inkubert i 16 timer på en roterende rister (250 rpm, 5,1 cm utslag, 27^C). Til denne over natten vekst ble det tilsatt N-etyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (Aldrich)

(NTG) til en endelig konsentrasjon på 300ug/ml av medium. Kolben ble satt tilbake på rotasjonsristeren og inkubert i nøyaktig 30 min. Det hadde tidligere blitt funnet at 300 (ag NTG/ml medium i 30 min. drepte ca. 99,9% av levedyktige celler. Etter 30 min. eksponering til NTG ble cellene sentrifugert ned (10.000 rpm, 15 min.). Cellepelleten ble

resuspendert i 5 ml modifisert Johnson's medium inneholdende 1% Dl-carnitinklorid. 2 ml av denne suspensjon ble brukt for å inakkulerere en 250 ml Erlenmeyer kolbe inneholdende 50 ml 1% DL-carnitinklorid modifisert Johnson's medium. Etter at kolben var inkubert på en rotasjonsrister (200 rpm, 27°C) i 16 timer ble turbiditeten bestemt på en Gilford UV-synlig spektrofotometer (model 240) ved å måle absorbansen ved 600 mm. Disse data tillot utregning av passende fortynning som skulle benyttes for utsåing og mut-antutvelgelse.

b) Utvelgelse og isolering av mutant A. calcoaceticus ATCC 39647

Muterte celler som beskrevet ovenfor ble fortynnet i serie i M/15 fosfatbuffer pH 7,4 og spredd på skåler inneholdende 1% DL-carnitinklorid modifisert Johnson's agar medium. Etter inkubering ved 28°C i ca. 4 dager ble de resulterende kolonier replikkert på modifisert Johnson's agar medium A inneholdende 0,5% L-carnitin eller 0,5% D-carnitin.

Kolonier som vokste godt på D-carnitinplaten men dårlig på L-carnitinplaten ble renset ved utstrykning på 0,5 D-carnitin modifisert Johnson's agarplater (medium A). Etter vekst ved 28^C ble individuelle kolonier plukket fra agarskålene på skråplan og så evaluert i rysteflasker.

c) Rystekolbe-evaluering

Rystekolber (250 ml) inneholdende 50 ml 1% DL-carnitinklorid modifisert Johnson's flytende medium A ble inokulert med flere løkker av celler tatt fra et agarskråplan. Etter 24 timer på en rotasjonsrister virket 50 ml av denne turbide væske som inokkulum for ytterligere 2 liter Erlenmeyer kolber inneholdende 500 ml av samme medium. Etter inkubering ved 27^C på rotasjonsrister (250 rpm, 5,1 cm utslag)

i 44 timer ble 100 ml av innholdet av flaskene inndampet til tørrhet in vacuo og det gjenværende ble ekstrahert med

absolutt etanol. Det "etanoliske ekstrakt ble igjen evaporert til tørrhet in vacuo og residiet ble oppløst i 10 ml 6 N HC1 for å konvertere carnitin til dets kloridsalt. Den vandige prøve ble så konsentrert til tørrhet in vacuo og det gjenværende L-carnitinklorid ble krystallisert fra absolutt etanol-aceton. Den høye negative rotasjon av pro-duktet ((<*)^<5>-23,07°C (c,3,5 H20)) bekrefter sele- ;ktive nedbrytning av D-carnitin av den nye mutanten dannet fra den parentale villtype A. calcoaceticus ATCC 39648. ;Acinetobacter calcoaceticus og stammene identifisert ved ATCC 39647 og ATCC 39648 har følgende egenskaper: ;MORFOLOGISKE KARAKTERISTIKA;Medium - Difco næringsagar (Difco Laboratories, Detroit, Michigan); ;Form og størrelse på cellene - staver 1-1,6 jum i diameter og ca. 1,5 - 22 um i lengde; ;blir sfæriske (coccoide staver) i den stasjonære vekstfase; ;opptrer ofte i par og i kjeder med forskjellig lengde. ;Ingen flageller.;Ingen sporer.;Gram negative.;Ikke syrebestandig.;KULTURVEKSTBETINGELSER;Medium - Difco næringsagar (Difco Laboratories, Detroit, Michigan) ;Kolonier er relativt store (2-3 mm i 24 timer) er ugjennom-siktige og ikke-pigmenterte: Organismene kan vokse i et enkelt mineralsaltmedium inneholdende en enkel karbonenergikilde så som etanol, acetat, lactat, pyruvat, malat eller alfa-ketoglutarat; ;Ammoniumsalter virker som nitrogenkilder; ;Gelatin ikke gjort flytende i gelatinstikk-kultur og vekst begrenset til de øverste 3 mm av medium; ;Alkalisk reaksjon i lakmusmelk med ingen koagulering eller flyting og meget dårlig vekst. ;FYSIOLOGISKE EGENSKAPER;Nitratreduksjon - negativ;Denitrifiseringsreaksjon - negativ;MR test - negativ;Indolproduksjon - negativ;VP test - negativ;Hydrogensulfiddannelse - meget, meget svak ;Stivelsehydrolyse - negativ;Utnyttelse av nitrat - positiv;Utnytter ammoniumsalter;Pigmentdannelse - gulaktig intracellulært vannoppløselig pigment som frigjøres i mediet ved autolyse etter 2-3 dager Urease - positiv ;Oksidase - positiv;Vekstbetingelser - pH 5-8,5;- temperatur 5^-35^C;- vil ikke vokse anaerobt i noe medium. ;Dannelse av syrer og gass i følgende: ; Nøkkel: A = syrereaksjon;u = svak reaksjon;- = ingen forandring eller alkalisk reaksjon ;ANDRE KARAKTERISTIKA;Oksyderer etylalkohol; ;Har høyere toleranse for natriumklorid (2-3% NaCl); ;Kan vokse ved 33^C;Fenylalanin blir ikke deaminert; ;Lysin blir ikke dekarboksylert; ;Ornitin blir ikke dekarboksylert.;Stammene identifisert av deponeringsnummeret ATCC 39647 og 39648 ble deponert hos American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852-1776, 2. april 1984. ;Eksempel 3;Foretrukket utnyttelse av D- carnitin av A. calcoaceticus ATCC 39648 ;Overflateveksten fra et en uke gammelt skråplan av A. calcoaceticus ATCC 39648 ble suspendert i 5 ml fysiologisk saltvann (0,85%) oppløsning. 2 ml av denne suspensjon ble brukt for å inokkulere 50 ml av det modifiserte Johnson's medium A inneholdende 1% DL-carnitinklorid nevnt ovenfor oppbevart i en 250 ml Erlenmeyer kolbe (F-l stadium). Kolben ble inkubert ved 25^C på en roterende rister (250 rpm/min. - 5,1 cm radius) i 24 timer hvorpå en 10% volum-overføring ble gjort til en 2 liter Erlenmeyer kolbe (F-2 stadium) inneholdende 500 ml av samme medium. Etter 12 timer på rotasjonsristeren ble 100 ml av mediet fjernet og så evoporert til tørrhet in vacuo. Residiet ble ekstrahert med varm etanol og det etanoliske ekstrakt ble konsentrert til tørrhet in vacuo. Residiet ble oppløst i 10 ml 6 N HC1 og den vandige oppløsning ble konsentrert til tørrhet. Krystallisering av residiet fra absolutt etanol/aceton ga ;25 ;en prøve med carnitinklorid (216 mg, 43% utbytte) (Wn -12,0^) (c,7,2 f^O) noe som indikerer et enantiomerisk overskudd (ee) på 0,51. ;Eksempel 4;Overflateveksten ga et en uke gammelt skråplan av A. calcoaceticus ATCC 39647 ble suspendert i 5 ml av medium A. 4 ml av denne suspensjon ble brukt for å inokulere 50 ml av modifisert Johnson's medium A inneholdende 1% DL-carnitinklorid nevnt ovenfor oppbevart i en 250 ml Erlenmeyer kolbe (F-l stadium). Kolben ble inkubert ved 25^C på en rotasjonsrister (250 rpm/min. - 5,1 cm radius) i 24 timer hvorpå en 10 volum-% overføring ble gjort til en 2 liter Erlenmeyer kolbe (F-2 stadium) inneholdende 500 ml av følgende medium (medium B): ; Dl-carnitin HC1 (Sigma) (20g/l) tilsettes og pH justeres til 6,8 med 4 N NaOH før sterilisering ved 121°C i 20 min. ;Etter inkubering i 44 timer på en rotasjonsrister ved 25 C ble 50 ml av innholdet sentrifugert for å fjerne cellene og supernatanten ble så evaporert til tørrhet. L-carnitinklorid (196 mg, 38% utbytte) ble isolert ifølge prosedyren beskrevet i eksempel 3. Den optiske renhet ble beregnet til å være større enn 96,5% ee fra (C*)D25

-22,9° (c,2,65 H20) verdien

Eksempel 5

Fremgangsmåten ifølge eksempel 4 ble fulgt bortsett fra at konsentrasjonen av Dl-carnitinklorid for F-2 stadiet var 50 g/l i en 250 ml Erlenmeyer kolbe inneholdende 50 ml av samme medium. Etter at F-2 stadiet hadde fått pågå i 68 timer ble L-carnitinklorid (180 mg, 42% utbytte) isolert via samme prosedyre (eksempel 3) fra 17 ml av fermenterings væsken. Den optiske renhet av prøven var større enn 86% ee ifølge W)p<5>-20,43° (c, 2,36 H20) verdi.

Eksempel 6

Prosedyren fra eksempel 2c ble fulgt bortsett fra 1% DL-carnitinkloridkonsentrasjonen besto av en blanding av 0,3% L-carnitinklorid og 0,7% D-carnitinklorid i medium A. Fermenteringen ble utført i en 2 liter Erlenmeyer kolbe inneholdende 250 ml medium A ved å bruke A. calcoaceticus ATCC 39647. Etter at F-2 stadiet hadde fått pågå i 44 timer ble 100 ml av væsken fjernet og L-carnitinkloridet isolert (36 mg (12% utbytte), (o<)p<5>-21,1°, c, 3,6,

H20).

Eksempel 7

Prosedyren fra eksempel 2c ble fulgt bortsett fra at 2% DL-carnitinkloridkonsentrasjonen besto av en blanding av 1,6% L-carnitinklorid og 0,4% D-carnitinklorid medium A ved å benytte A. calcoaceticus ATCC 39647. Etter at F-2 stadiet hadde fått pågå i 44 timer ble 100 ml av væsken fjernet og L-carnitinkloridet isolert (551 mg (34% utbytte), fc?0 2D5 -25,05°, c, 2,6,H20).

Eksempel 8

Fremgangsmåten ifølge eksempel 2c ble fulgt bortsett fra at konsentrasjonen av DL-carnitinklorid for F-2 stadiet var 50 g/l som besto av 3 deler L-carnitinklorid og 7 deler D- carnitinklorid i 250 ml medium B inneholdt i en 2 liter Erlenmeyer kolbe. Etter inkubering med A. calcoaceticus ATCC 39647 i 69 timer (F-2 stadium) ble 50 ml av væsken sentrifugert (9000 x 6 i 20 min.) for å fjerne cellene. Supernatanten ble inndampet til tørrhet in vacuo og residiet ble ekstrahert med vannfri etanol. Det etanoliske ekstrakt ble konsentrert til tørrhet og residiet ble opp-løst i destillert vann og kromatografert i en Dowex l-X-4 OH kolonne (5 x 22 cm) for å fremskaffe L-carnitin (140 mg (23% utbytte), (( X)^ 5 -29,2° c, 1,5 H20).

Eksempel 9

Fremgangsmåten ifølge eksempel 8 ble fulgt bortsett fra at konsentrasjonen av DL-carnitinklorid for F-2 stadiet var 50 g/l som besto av 8 deler L-carnitinklorid og 2 deler D-carnitinklorid. L-carnitin indre salt ble isolert som tidligere fra 50 ml av fermenteringsblandingen (F-2 stadium 69 timer) (1,216 g (75% utbytte), (oO -30,4°, c=2,8 H20).

Eksempel 10

Fremgangsmåten ifølge eksempel 8 ble fulgt bortsett fra at konsentrasjonen av DL-carnitinklorid for F-2 stadiet var 50 g/l. Etter at F-2 stadiet hadde fått pågå i 90 timer ble 40 ml av fermenteringsblåndingen fjernet og sentrifugert. L-carnitin indre salt ble isolert som tidligere (0,62 g (75% utbytte), (oO^<5>-27,0°, c = 4,4 H20).

Claims

1. Fremgangsmåte for fremstilling av L-carnitin og salter derav, karakterisert ved at den består av å underkaste et racemat av DL-carnitin til fermenteringsvirkningen av enzymer fremstilt av en mikroorganisme som er karakteristisk ved sin enestående egenskap og fortrinnsvis bryte ned den unaturlige form D-carnitin i blandingen og tillate den ønskede naturlige form L-carnitin å akkumulere i reaksjonsmediet og å isolere L-carnitin fra reaksjonsmediet.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at mikroorganismen er et bakterium.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at bakterien er en gramnegativ bakterie.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at bakterien er en coccobacillus bakterium.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at bakterien hører til familien Neissericeae.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at bakterien tilhører slekten Acinetobacter.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at bakterien er en mutant av Acinetobacter.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at bakterien har karakteristika av Acinetobacter calcoaceticus ATCC 39648.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 8, karakterisert ved at bakterien er en mutant av Acinetobacter calcoaceticus ATTCC 39648.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 9, karakterisert ved at bakterien har karakteristika av Acinetobacter calcoaceticus ATCC 39647.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at fremgangsmåten ut-føres i en voksende kultur av mikroorganismen i et vandig næringsmedium under aerobiske betingelser.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at fremgangsmåten ut-føres på imobiliserte celler av mikroorganismen.

13. Fremgangsmåte ifølge krav 12, karakterisert ved at prosessen er kontinuerlig.

14. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at prosessen utfø res i et mikroorganismefritt medium inneholdende enzymer fremstilt av mikroorganismen.

15. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at prosessen utføres ved en temperatur i området fra 25°C til 37°C.

16. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at prosessen utføres i et medium bestående av mineralsalter, mineralioner og DL-carnitin som eneste karbonkilde.

17. Fremgangsmåte ifølge krav 15, karakterisert ved at mineralsaltmediet er Johnson's medium A.

18. Fremgangsmåte ifølge krav 15, karakterisert ved at mineralsaltmediet er Johnson's medium B.

19. Fremgangsmåte ifølge krav 15, karakterisert ved at metaboliseringshast-igheten av D-isomeren av carnitin optimaliseres ved å øke ammoniumionekonsentrasjonen i reaksjonsmediet ettersom DL-carnitinkonsentrasjonen øker.

20. Bakterium av familien Neissericeae, karakterisert ved sin egenskap å skille en racemisk blanding av DL-carnitin ved fortrinnsvis å bryte ned den unaturlige D-form av carnitin i racematet og tillate L-formen å akkumulere.

21. Bakterium ifølge krav 20, karakterisert ved at den er valgt fra slekten Acinetobacter og mutanter og genetisk endrede varianter derav.

22. Mikroorganisme av slekten Acinetobacter calcoaceticus og mutanter og genetisk endrede varianter derav.

23. Mikroorganisme av stammen Acinetobacter calcoaceticus, karakterisert ved at den har de identifiserende karakteristika av ATCC 39648.

24. Mikroorganismer av stammen Acinetobacter calcoaceticus, karakterisert ved at den har de karakteriserende egenskaper til ATCC 39647.

25. Biologisk ren kultur av mikroorganismen til Acinetobacter calcoaceticus med de karakteriserende trekk til ATCC 39648, karakterisert ved at kulturen er i stand til å skille et racemat av DL-carnitin ved fortrinnsvis å bryte ned den unaturlige D-form i racematet.

26. Kultur ifølge krav 25, karakterisert ved at mikroorganismen er Acinetobacter calcoaceticus med de identifiserende trekk til ATCC 39647.

27. Kulturen ifølge krav 25, karakterisert ved at den foreligger i frysetørket form.

28. Kulturen ifølge krav 26, karakterisert ved at den foreliggere i frysetørket form.

29. Kultur inneholdende mikororganismen Acinetobacter calcoaceticus, karakterisert ved at kulturen er i stand til å skille et racemat av DL-carnitin ved fortrinnsvis å bryte ned den unaturlige form av racematet.

30. Fremgangsmåte for å skille et racemat av DL-carnitin, karakterisert ved at den består av å dyrke en mikroorganisme av stammen Acinetobacter calcoaceticus (ATCC 39648) i vandig næringsmedium under aerobiske betingelser i nærvær av et racemat av DL-carnitn som eneste karbonkilde, hvorved D-carnitin i racmetatet fortrinnsvis blir brutt ned og gjenvinne det akkumulerte L-carnitin fra kulturmediet.

31. Fremgangsmåte ifølge krav 27, karakterisert ved at mikroorganismen er Acinetobacter calcoaceticus (ATCC 39647).

32. Fremgangsmåte for å skille DL-carnitin uten den tidligere nødvendige fremstilling av derivater derav, karakterisert ved å underkaste DL-carnitin per se til fermenteringsvirkningen av enzymer fremstilt av en mikroorganisme som er karakterisert ved sin enestående egenskap å fortrinnsvis bryte ned den unaturlige D-form og å gjenvinne L-formen fra reaksjonsmediet.