JPS58146292A - 醗酵法ビタミンｂ↓１↓２の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 不発明は、プロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉ
−ｂαｃｔｅｒｉｕｒｎ、）楓に槙するビタミンＢ７．
生産菌７培地中で培養して、ト１体ビＪに蓄積するビタ
ミンＢ、２ケ採取するビタミンＢ７．、の製造方法に関
し、とくに顕著に数置された生産量でビタミンＢ５．を
取得できる数倍方法に関する。

史に詳し０ユ、不究明はプロピオニバクテリウムｊ屯に
―するビタミンＢＩ２生１！Ｌ菌を培地中で培養し、培
地中に副生ずるプロピオン酸濃度がビタミンＢ、２の生
産を実質的に阻害するようなＳ度に増加した際もしくは
それ以降に、新たな培地と該培養糸の閑１４一部分もし
くげそれを王とする部分との共存条汗下に史に培養を続
けたの、ち、菌体内に蓄オムするビタミンＢｌ！を採板
することを特徴とする内、）・Ｉ解法によるビタミンＢ
、！の製造方法に関する。

従来、ビタミンＢ、２生肢繭たとえはプロピオニバクテ
リウムｈハにＪ１間するビタミンＢ１２生蔑餉を培地中
で招肴して、菌体内に蓄積するビタミンＢ、。

を採取するビタミンＢＩ２の製法は知られている（し１
１えは、米国特許２，９５１，０１７　　（１９６０）
）。

不発り１」堝等は、プロピオニバクテリウムｋｕ　ＶＣ
ＩＪｔするビタミンＢ、！生）〉ｈ菌を利用して、ビタ
ミンＢ、２を製造する醗酵法ビタミンＢ、ｔの製法につ
いて輔ｉ＋・Ｊを進めてきた。

ソノ結果、プロピオニバクテリウム属に桐するビタミン
Ｂ１２生蔑餉による醐解法ビタミンＢ１２の製造に際し
て、培養中に、該ビタミンＢＩ２生産菌の亀・殖が停圧
し、ビタミンＢ３．の生産か停止するトラブルのあるこ
とを発見し、その原因について検討の結果、培養中に、
培養系中の副生プロピオン配ノが、ｉ１１次、蓄積増加
し５この培養系中のプロピオン酸が成る程ｉ％稙増加す
ると、ビタミンＢ１゜生産菌の増殖が阻′＠きれてヤの
増殖が停止し、勘くて、該生＃、閉によるビタミンＢ７
．の生だ・が実質的に１泪簀されることを発見した。

そして、本発明者等は、この技術的トラブルを工業的に
１利に克服して、ビタミンＢ、ｔの生産量を増大させる
方法を開発すべく研究を続けた結果、培地中にｊｉｉｉ
ｌ生するプロピオン酸濃度がビタミンＢｌ。

の生産を実質的に阻害するような嬢ＩＷにノ゛Ｎ加した
し４、もしくはそれ以降に、新たな培地と培養系の閑杯
肖１〕分もしくはそれを王とする部分との共存条件下に
史に培養を続けたのち、菌体内に蓄積するビクばンＢ、
２を採取することによって、例えば、後ｍ’）施例１及
び比較例１に示すように、約６５％或はそれ秒、上にも
達する顕著に増大された生産量で、ビタミンＢ、２を製
造できることを発見した。

史に又、」二記培地中に副生ずるプロピオン酸濃度がビ
タミンＢＩ２の生涯を実質的に１泪害するよう　５− な′ａ肝に増加した隙もしくはそれ以降に、簡尾蟹系中
の菌体部分もしくはそれを王とする部分を形成さ−Ｖる
手法として、凝集剤を第１」用して国体を凝集沈降ネせ
る手段、餉固定化担体に固Ｗ化したビタミンＢＩｔ生差
菌全使用する手段、それ自体沈ト躯じゃすい４り（、質
を賦与さ扛たビタミンＢ７．生成菌を使用する手段、な
どの釉々の手段を利用できることを知った。

従って、不発明の目的は、プロピオニバクテリウム拠に
輌するビタミンＢ、！生産菌３：用いてビタミンＢ１１
をＪＡ造する改督方法を提供するにある。

本発明の上記目的及び更に多くの他の目的ならびに利点
は、以下の記帷から−）２明らかとなるであろう。

本発明方法に於ては、プロピオニバクテリウム域に楓す
るビタミンＢ５．生産菌を利用する。

このよう々ビタミンＢＩ２生産菌としては、例え　６　
− ６；ｔ、７’ロビオニパクテリウム・ゾヤーマニー（Ｐ
ｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　　ｓｈｅｒｍａｎ
ｉｉ）Ｉ　Ｆ’０１２４２６あるいはＪＰ’＜９１２３
９１株し　ｉｒｒ、５ｔｉｔｕｔｅ　　ｆｏｒ　　Ｆｅ
ｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ、　　０８Ａｊ（Ａ。

Ｊａｐαη、；自山分＝公知−〕；プロピオニバクテリ
ウム・７０イデンライヒ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａａｔ　
ｅｒｉｕｒｎ。

、ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ）　Ｉ　、７”　０１
２４２４株し　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　　ｊ’ｏｒ　　Ｆ
ｅｒｔｎ、ｅｎｔａｔｉｏｎ、　　　０ｓａｋａ。

Ｊαｐαｎ；自山分誼公知酌〕など全例示することがで
きる。鰍に又、沈降しゃすい性質を賦与されたビタミン
ＢＩｔ生％ｌ［＋プロピオニバクテリウム・シャーマニ
−ＡＩ（Ｊに１１０１１菌株〔ＩＬ’ＥＲＭＨＰ　−８
５；　Ｆｅｒｍ、ｅ７＋、ｔａｔｉｎｎ　Ｒｅ５ｅａｒ
ｃんＩｎ５ｔｉｔｕｔｅ　Ａｇｅｎｃｙ　ｏｆ　Ｉｎｄ
ｕｓｔｒｉａｌ　５ｉｅｎｃｅａｎｄ　ｌ’ｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｙ　、　ＪｒＨｙａｎ　”；グダ−＜スト粂約に
基づく国際寄託菌〕、更に、プロピオン酸耐性を賦与σ
れたビタミンＢ５．生産菌プロピオニバクテリウム・シ
ャーマニーんＯｃｔ　］　０１２　〔ＦＥＲＭ　　Ｂ　
Ｐ　−８６；　ｌ’ｅｒｒｎ、ｅｎｔａｔ４．ｏｎ　Ｒ
ｅ５ｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅ　Ａｇｅｎｃｙ　ｏ
ｊ’　Ｉｎ、ｄｕｓｔｒｉａｌ　５ｉｅｎｃｅａ”ｎ、
ｄ　ｉ’ｅｃ／１．ｎ、ｏｌｏｇｙ、　Ｊａ７ｒａｎ；
ブダペスト条約に力、。

づく１占ｊ除賓陥ｉ；　ｒＷ＋　〕、プロピオン酸白面
１生を財、力されたビタミンＢ、２生狂飾プロピオニバ
クテリウム・フロイデンライヒんｏに１１０１３　［Ｊ
Ｉ′ｒＦｔンＭＨＰ　−８７；　Ｆｇｒｒｎｅｎｔａｔ
ｉｏｎ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅ　　Ａｇ
ｅｎｃｌ）　　ｏｆ　　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａ、Ｉ　　ム
゛ｉｅｎ、ｃｅａｎｄ　Ｉ’ｅＣ五ｔＬｏＬｏｇｙ、　
Ｊ−ａｐａｎ；ブダペスト榔Ｊ矛、ｊにノ書づく国除若
１七閉〕々とをオ・］川することかできる。

上記プロピオニバクテリウム・シャーマニーＮυＧｔｌ
ｏｔｘ菌株の１２１字的舛′Ｐ４は、培屑糸紮装置した
際の菌体の沈降速度が親田株プロビオニバ□ クテリウム・シキーマニ−ＩＪ−’０１２３９１ゼ１３
より速いという以外は、該親菌株について公知のイーれ
らと同一である。又、上記プロピオニバクテリウム・シ
ャーマニー＃Ｏ（、’１１０１２菌株の両年的１９・質
は、プロピオン酸耐性がより犬であるという以外ｒＪ、
その親菌株であるプロピオニバクテリウム・シャーマニ
ーＩＦ０１２３９１株について公知のそれらと同一であ
る。東に、上記プロピオニバクテリウム・フロイデンラ
イヒ、／ＶＱＧＩＩＯ１３凶株の蘭学的性質は、プロピ
オン酸耐性がより大であるという以外は、そのｔｔｍ株
であるプロピオニバクテリウム・フロイデンライヒｌ１
１０１２４２４株について公知のそれらと同一である。

そして、これら親菌株の菌学的性質は公知であり、例え
ば、　Ｂｅｒｇｙ’　ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　ｌ）ｅ
ｔｅｒｒｎｉｎａｔｉｖｅＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、
第８版に記載されている。尚。

上記プロピオニバクテリウム・シャーマニーＮ。

Ｇ１１０１２及びプロピオニバクテリウム・フロイデン
ライヒ＃ＱＣ，’１１０１３に代表されるプロピオン酸
−１性菌株の製法は、同−出願人の同日付　９− 出１に係わる特願昭５７−　　　　　号（ηけ１１の名
称：醪酔法ビタミンＢ、２の製法及びぞの生左菌）に詳
しく開示さ詐でいる。

上Ｎｒ２プロピオニバクテリウム・シャーマニ−ＩＰ’
Ｏｌ　２４２６、　ｌ　ＦＯｌ　２３９１、　八’　０
ＣＩＩ０１１、ＮＯＣ１１０１２閑株、更に、プロピオ
ニバクテリウム・フロイデンライヒｉ　Ｉ”０１２４２
４、Ａ／Ｑに１１０１３凶休會包含して、プロピオニ・
々クテリウム篇に践するビタミンＢ、２生＃ｉ丙を培養
液中で培Ｖするｆｃめの利用できる培地、培養条件など
は、それ自体公知であり１本発明方法の実施に際して利
用できる。

培地としては、炭＊源、蒙累諒を含有し、Ｑｉ望によシ
、更にミネラル類、ビタミン類、ビタミンＢＩ２構成成
分なと紫宮有−！る培地を′；ｒす川することができる
。このような炭素源の例としては、がξ水化物知、＆ｌ
貿力゛八へ１機酸類、アルコール類などを−１０− 例ボすることが１″きる。これらの具体例としては、ブ
ζトエｉＪ’、クルコース、ラクトース、マンノース、
ガラクト−ス、乳酸、酒石酸、グリセリンなどの炭象源
を例示することができる。これらは複数柚趨宜に〃１釈
して利用することができる。

父、室糸源の例としては、たとえＩ−、ｒ、アンモニア
均曝、硝酸ｊ塩類、ペプトン、酵母エキス、カゼイン、
肉エキン１、コーン・ステー７０・リカー、サングロ、
λ、ルＪ（素、大豆粕、魚粕、醗酵廃棄物、等を１力」
イですることかできる。

史に、５．６−ノメチルペンズイミダゾールの如きビタ
ミンｂ　＋　２構吸、成分、リン酸塩類、マグネシウム
塩類、）Ｊリウム均類、カルシウム塩類、マンガン編耕
、コバルト塩類、鉄塩類、亜鉛塩類、モリブデン檀、類
、鉋；塩ν、アルミニウム塩類、パントテン酸の如きビ
タミン類などの如きミネラル類、ビタミン類、ビタミン
Ｂ７．構成成分類などをクリ示することかできる。

培養は嫌気条件下に行うことができ、培当方式としてＣ
」、ψ１」えけ静置３′？ｉ寮方式、Ｎ、ガスやＣＯ。

ガスＶＣよる池気１Ｊρ拌培養方式などの培養方式ケ好
せしく　ｖ／１示できる。培養温度とＬ２ては約２５°
〜約３５Ｃの１１１就求Ｙ「、培養７）Ｈとしては約５
〜約７．５、より好捷しくに約６〜約７程度のｒＪＪＪ
条件をクリ示すゐことズバできる。ｊ＠　￥　’Ｄ　”
目、適時７Ｃ１抄・ｌ　；ｉ−ｂａｔ、かせいソータ、
かせいカリ５アンモニア、炭酸ナトリウム、水酸化カル
シウム、の如きアルカリ類を培＊系に冷加して、上記例
示ｐｌｉ範囲に系のｐｆＪを訓緊してず−ｉうのがよい
。

本発明方法によれば、上述のようにして、プロビオニバ
クテリウ、ｔｓ　ｒｄＺに為するビタミンＢＩ２生九茜
會培卸り中でノ名禾し、・培す也中に副生するプロピオ
ン＠搭度が、ビタミンＢ、２の生産を実質的に阻害する
ような確度に増加し、た除もしくはそれ以降の時点に、
新たな培地と上記培養系の菌体部分もしくはそれを主と
する部分との共存条件下に、更に培養を行なう。

培地中に副生するプロピオン酸濃度が、ビタミンＢ１□
の生産を笑餉的に阻害するような濃度に増加する時点は
、使用する菌株、使用する培地組成、培誉条Ｐ＋などに
よっても適宜に変更選択でき、予め実験的に各局に選択
設定することができる。そして、Ｙ７１１えは、随時、
培養系中のプロピオン酸一度を６４１１定し、七のｍ度
が予め選択設定した一度に達した瞳もしくはそれ以降の
時点に於て、培養系中の酌１・１４部分もしくはそれを
王とする部分を取得し、該部分と耕たな培地と１ｒ：會
む培養系を形成して史に培養全続行することにより、ビ
タミンＢ、！生友社を顕著に増大させることができる。

上記副生フ′ロビオン酸−厩が、ビタミンＢ、ｔの生産
を夫費的ｒ１ｃ阻害するようになる濃度としては、約ｌ
Ｏ−１３− ｙ７を培地以上のプロピオン酸濃度を例示することがで
きる。好１しくは、約２０９／を培地〜約３０　？／を
培地の如きプロピオン際一度を例示することができる。

本発明方法の実施に際して、前培養糸の目体部分のみ金
光全に外殻採取して後培養系を形成する必似はなく、該
一体６１５分を王とする部分を利用して走支えない。従
って、パッチ方式の実施に限らす、例えは、培地中に副
生ずるプロピオン酸本度がビタミンＢＩ！の生産を実質
的に阻害するような一度に増加した除もしくはそれ以降
に於て、培養糸の囲体部分を沈降させる手段を施し、沈
降線下方に設けた排出口から次の培養槽に王として画体
′部分を含む沈降部を抜き出して、そこで新たな培地と
前培誉糸の凶体部分全主とする部分とからなる佐培誉系
を形成して、＠養に続けるような連続方式の実／４を採
用することもできる。勿論、菌体−１４− 部分を分離採取して佐培養糸ケ形成して実施することも
できる。

体培養にお・ける培地組成、培賛条＋になどについては
、前Ｊ−０賛についてのべたと同様な組成及び榮件ケ鴫
官に選択して実施することができる。

本発明方法の実Ｍｌｊに際しで、前培養糸の剛体部分も
しくはそれを王とする部分を形成させるのには、神々の
手法を利用することかでさる。そのような手法の一例と
しては、培養糸に凝集剤金際加して菌体′ｋｖ集沈降さ
せる手法を利用することができる。

この１？、一様でオリ用する凝集剤としては、中１・主
、アニオン糸、カチオン系の旨分子凝集剤會包含して１
２１の生＊を実質的に阻杏しない限り、任意の有機もし
くは力（１゛イ奴凝集剤を利用するゝことができる。こ
のような凝集剤のガとしては、硫酸アルミニウム、塩化
仙鉛、塩化カルシウム、メタけい酸ソーダ。

アルギン１１安すトリウム、外大及びポリアクリルアミ
ド吊持・１１旨より）−１’ｉ、６群からえらばれた少
なくとも一紳の上樋もしくは無機凝集剤を例１示するこ
とができる。

本発明方法の実施に際して、前培養糸のｍ　Ｋ部分もし
くぐよそれを主とすゐト」５分全形成させる手法の他の
例としては、閑同定化」」１体にｌＩ！ｉＩ定化したビ
タミンＢ、２生灰酌を便用する＋法ｒ孕けることができ
る。

このｙｂ様で第１］用する賄固定化担体への国体の固定
化手法七扛自体は知ら扛ており、本発明方法の実施に；
ｆ１用できる。このような蘭固定化担体のし１１として
は、汐すえは、カラギーナン、寒天、ポリアクリルアミ
ド系柄脂なとの如き筒分子糸耐固定化担体７、セリ示す
な／゛とかできる。この態（。・によれは、例えに」、
所望の時期に培養糸を酎ｒｔｔ　＃態にして固足化凶体
を沈降させ、上澄部を除去して、培養系の菌台ＩＳ分も
しくはそれを王とする部分全分離させることができる。

本発明方法の実施に除して、前培養系の菌体部分もしく
はそれを王とする部分を形成式せる史に他の手法として
は、使用菌株として、それ自体沈降しやすい性質全賦与
されたビタミンＢ□生産菌を使用する手段を採用するこ
ともできる。

この態様の実施に利用するのに通したプロピオニバクテ
リウム属に属するビタミンＢｌ！生産菌の例としては、
俊に、参考例１に記載したような紫外縁照射変異株形成
十段を利用したプロピオニバクテリウム・シャーマニー
Ａ／ＱＣＩＩＯＩＩ菌株（ＦＥＮＭ　　ＢＰ−８５）葡
輿１示することができる。尚、該菌株の菌学的特徴は、
親菌株プロピオニバクテリウム・シャーマニ−１＃’０
１２３９１に比べて、培養系中での系の静止時の沈１輝
速度が大きいという点で異なるほかは、上記親菌株につ
−１７− いて公知の菌学的特徴と同様である。

本発明方法の実施に際して、前培養糸の菌体部分もしく
はそれ金玉とする部分を形成させるには、上述の如き神
々の態様で実施することができ、これらの態様を房室に
組み合わせ一〇行うこともできる。

本発明方法によれは、上述のようにして、プロピオニバ
クテリウム縞に属するビタミンＢ、ｆｆｉ生ｎｉ閑ケ培
地中で培養し、培地中に副生ずるプロピオン酸＃度がビ
タミンＢ１１の生産金実η的に１ｓ１４　Ｗするような
誂度に増加した際もしくはそれ以降に、新たな培地と該
培養系の囲体ＮＩＳ分もしくはそれ全王とする部分との
共存条件下に更に培養を続けたのち、菌体内に蓄積した
ビタミンＢ１２を採取する。

ビタミン”１１の採取は、培養プロスを例え＆、ｆ遠心
分離処理して菌体を分離採取し、該菌体からビタミンＢ
、２を分離採取することにより行うことが−１８− できる。

該ビタミンＢ１２の画体からの分肉１；採取、更にはＯ
ｉ製は、神々の生膜で行うことができる。

例えば、袖酵索型ビタミンＢ１２　（５、６−シメチル
ペンズイミダゾールコノ９ミドエンザイム）の形で、困
体炉し外削する場合には、味取した画体、もしくは困体
帷側腺−’ｔｃ　９１１えば尼砕の如き吻埋的生膜やに
一音数＋段でイｔｙゼトｊシた国体破砕物を、メタノー
ル、エタノール、イソフ０ロノぐノールなどの如きアル
コール漬やピリジンなとの如きＨ剤ケ用いて、１ｖＱｒ
で佃出す゛ることにより、菌体から抽出分離することが
できな。又　ヒドロキソコバラミンの形で國１仝から抽
出分１１１１１する吻合には、上述のようにして侍ら′
ｊ′Ｉ−ゐ袖酔素型ビタミンＢ１□の抽出液に光を当て
ることにより、ヒドロキソヲノぐラミンの形ＶＬ転化さ
−Ｕることかできる。ナにシアノコ・々ラミンの形で画
体から抽出分団１する場合には、上述の如きｆｔ媒とシ
アン塙たとえは、シアンカリ、シアンソーダ５々どの共
存下に抽出することにより、ジアノコバラミンの形で抽
出分離−Ｔることができる。

父、他の）匝様によれは、団体の１ｉｌｌｉ仙、腺を上
述のようにして破砕した困体破伜物赦、奴り、」−メ、
１イ」１φもしくはその破砕物全上記例示の１７１−１
き抽出ａテ媒で抽出した抽出ＮＩなどの？ｌＩき竹輪１
１、成分を包むビタミンＢ、２含有７俟會、吸庸剤を用
いて吸廂−ｋｊ出処理１ろことにより一草に鞘１り分肉
１ｒすめこともできる。

この慇１求において＆；ｊ：、回−出１ｈ・（１人の分
；　”ｊｊ＋”）ｕ明に材１わる生膜を利用す／）こと
かできな。

例えは、同−出１人の出樋に係わる柄、駒１昭５５−１
６７３７５号に開示された提某に従って、例えは、ｈｌ
」述の如き画体もしくけ国体破砕物の０１媒抽出液や酌
俸破砕物撤の如き１夾随Ｉｆｊ・分ｋ　’にむビタミン
Ｂ＋２＠有液を、　ゾビニルベンゼン、スチレンもしく
はその′目Ｉ］ｉ：件肋専体、例えは、メチルスチレン
、エチルスチレン、ジメチルスチレン、７′ロビルスｆ
ｌ／ンなどのに　、−に　、アルキルノー忙廟するアル
キル１〜？Ａ　Ｋ）″５５理の如き官能性ト尋体、及び
下記式 １１１シ式中、ｉｔ軒１埃集−炭素間二重結付を有する
Ｃ３〜Ｇ、。の不飽和アルキル残基金示し、ｎげ２又は
３である。

でき・わさ！＋２．ξ、芳壱族多佃１カルボン附小飽和
アルキルエステル、例えば、ｘ、２．４−ベンゼントリ
ツＪルボンｉｖ）リイソプロペニルエステル、テレフタ
ル師ジイソプロペニルエステルの如きジーもしくリトリ
ーＣ（”’−Ｃ＋０アルケニルエステルウＡ、よシ＾も
かれた共Ｍ（合体樹脂であって且つ表面積か約７０　Ｏ
ｎ？／　ｆ）Ｅ：Ｉ上の仙腸と接触させて、該４ｉｆ脂
にビタミンＢ、２を吸着さ−は、該吸着さ扛たビタミン
−２１− Ｂ３．を俗出斉ｉ１により俗出芒ゼでＹｒｊ性浴出浴出
力υ１・伶うる態様で行うことかできる。上記１！り系
及び浴出はバツテカ式でもカラム・クロマトグラフィ一
方式でも行うことができる。吸油は、例えはｐ　Ｈ約５
〜約８、より好＝’、Ｌ、＜Ｃユ約７削俵のｐｌＪ条ｈ
−及び例えは永」１０°〜糸り３０［の如さ温■１１−
で惰うことかできる。又、吸肩処理佐、ノブ１望により
黄、銀処境盆ｈ’ｎｊ　Ｌ、浴出処理を行って泊性苗出
分画を得ることができる。

上Ｌ１晧５゛シ条）１理としてＶよ、例えは水、低碗紅
の富水アルコール類たとえば５袈メタノール丞、２％エ
タノール水、１裂イソプロパツール水による６コ条処理
をし１」示できる。父、上記険出剤としては。

晋走１の亀山剤がオリ月Ｊでき、′丙えは、低叙アノー
コール加１．屹類、アルカリ知及び塩類よりなる群から
えらはオシた角出削全君′七すゐ水性電液を例示するこ
とができ心。このような浴出ａｊＣＯ共体νりとして−
２２− は、たとえば、メタノール、エタノール、イソプロ・９
ノールのｙｌ」き１（ｊ１級アルコール知；たとえば、
りん酸、酢酸、ホウ酸、塩酸の如き酸類；たとえに１、
水酸化ナトリウム、リン酸−アンモニウム、りん１液ニ
アンモニウム、水酸化アンモニウムの々［］さアルカリ
類；たとえば、炭酸ナトリウム、を怜酸ナトリウム、り
ん酸ナトリウム、りん酸カリウムの如き塩類；をｆｌｌ
＋示することかできる。このような鼾出剤の種類は、挟
体成分の４（ｊｉ類及び知、吸漸剤４Ｓ！Ｉ脂の釉類な
どによっても、適宜に選択できるが、低級アルコール類
の水溶液の利用が好ましく、ｆｌ１」えは、２５〜５０
％メタノール、１５〜４０％エタノール、６〜２０％イ
ソプロノＲノール等の如きアルコール含し約５０襲以下
の含水アルコール類の利用が例示できる。浴出操゛作も
室温で行うことができ、とくに加温もしくは冷却の必要
はないが望むならば行ってもよい。例えば約３０〜約６
０Ｃの９１き操１乍ｉ蒲Ｖ　’ｆ　１２ｉＪ刀く′する
ことかできる。

このようにして浴出したＹ占１牛旧出分］１１１１奢取
イ１４シ、所實ノにより、−縮、４１４粕品化々どを行
りごとができる。

又例えは、同一出願人の出１卸に係わる特ＩＭ１．Ａ　
ｌｌｆ：（５５−１６７３７４＋ｉに開示さてｉ′ｆ？
Ｃ」ム案に便って。

前述の如き仏雅成分４冨むビタミンＢ１２言有数を、敢
修頻朋細孔径し１−多孔４．ｊ：１−１」３１〜７３自
（ｊｌ−藤逐一者、昭４１４８年９月５日技機堂発行）
に６己載される測ず及び沃定力めにより得られ／８１１
は〕が約２００Ａ以上−Ｃ，佐ｆｉＬ、＜μ約２５０Ａ
１メ上、たとえは約２００〜ボＪ１２ＵＯＡで、旧つ細
孔容積か０．６　ｍｌ、／　？　ｆ％え々１、ｌ″εと
エニ１°０．６　ｍ１２／　？　ｆ超え約１．２　ｍｅ
　／’　Ｖ６度の重１」、囲の、ノビニルベンゼン／ス
チレン示共嘉゛名イキ４．ｆ」月Ｔイと・１ｚけ・１之
させて、１ｙ位ｊ脂にビタミンＢ、２會吸ｉ？−１’ｖ
δ−ｉＬ、しく１、・ｐｔプ？・さ牡たビタミンＢ１．
を・酪出剣により浴出さ−ぎて活１住浴出分画會取イｎ
する態様で行うこともできる。

この際、利用できる市壱で入十用酢な該係・１１菅の扮
１としてＱゴ、ダイヤイオンｔｌｐ−１ｏ、Ｉ−Ｉ　Ｐ
　−２０、ｔｉｌ′−３０，１ｉＰ−４０、＃Ｐ−５０
（部品名：三２化成：（−１：　＊：ｃ品）などを夕１
１丁することができる。

このよりな：１立・１脂は、ヅビニルベンゼンとスチレ
ンもしくはその官詑性防纏体、たとえば前記Ｖ１１示の
如きスチレンの官ｆ］ヒ性訪専体、との共寿付反応によ
ってン・逓することもできる。

１女看及び俗出鎌作及び栄畦は前記提案について欣明し
たと同＠な操作及び条件で行うことができる。吸崩伎、
Ｈｒ望により行う洗粂処理、浴出処理の作作及び第件に
ついても、旧訳機業について睨明したと同体な冑作及び
条件で竹うことができる。

不り１．１Ｆ１方法の芙ｆｉｇに隙しては、上述のよう
にし−２５− で肯１４・からビタミン”１２才、抹ハＶ、す２（で−
１シバ望により精製することができる。和殻手最′２ニ
ジてθ、１１Ｌｌの公知手ト〉もオリ月１でき、１！／
ｌ：λ−は、フェノール；ｌ！１出・ト段、Ｙ〜１件炭
ｅ（、よゐｌ！り希１＋１ｋ・、イオンメサ樹脂やセル
ロース等を用いた昧７凸手囚、・ちるいはカラムクロマ
トグラフ１′−生砂なと娑尤・８宜ホ１１みイｊ−わ」
づてイーＪうことかでさる。

Ｙ〕下、−Ｊ力ｉｂ　ｉり（１により１，４．発明カメ
と−）加１の、７４・［多１１についてに！、にＯシ＜
ｆｊ１１’、ゆ］する。

霞）ｆｌ−１１＋ｌｌ　１　１ｙ、ζ少士；薩そごし１
・　ｌ水ｌｔＶ＋写１し゛Ｃグルーてｌ−ス５０７．コ
ーンスチーブリ力−４０≦゛１硝ｔｌ＋アンモニウム３
ノ、ＫＨ，ＰＯ，（１，４’；ｌ　　、　　Ｈａ、１Ｊ
Ｐ（Ｊ、　　・　１２Ｈ，０］、　　５　　＆　　、Ｍ
　（７ＳＯ＋　　・　７７ｂ　００．５　９　　、　　
（、’ｏ（八′υｓＬ　　・　Ｇ１１２（）　　３　０
　　ｎｑ　１Ｚ？＋−ＳＯ４、ＴＨｔ　Ｑ　　１　０　
　’ノｌｔノ、　　Ｊル−ｔ　ｎ　ＩＪ　Ｏ４・　４１
ｉ　□Ｏｓ　　ｖ：ｓり、ＣｕＳＯ４−５Ｈ２０５０／
ｌｆｌ　　、　　　　（Ｎ）ｔＪ、Ｊ′に’　　Ｏ７Ｑ
、、　　、　４Ｈ，０−２６− １０μｍ、ノ々ントテン（ト）カルシウム５１ηおよび
ＣａＵＯ，１０ｔを含む培地Ａ、４０ｍ１’ｃ１００ｍ
ｌ容三角７　ラス：Ｉに入ｔｌ−テ９９−ｍし、　Ｐｒ
ｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｒｎ。

５ｈｅｒｒｎ、ａｎｉｉ　Ｉ　１”　０１２３９１　ｆ
、植菌した。培養は３０ｐで装置して行ない、１日に１
度、培養准の′ｐＩｉ　７．Ｈ中性付近に調整した。培
養４日目に、沈降剤として硫酸アルミニウムを培養液に
対して１０り／Ｌとなるよう力口えたのち、２時間静島
゛して、閑′Ｉ＋を沈降させた。上面の１５ｎｄＶ、を
除去し、前に培地ＡとＩｎ２様な新たな培地を１５ゴ加
えるとともに、５，６−シメチルペンズイミダゾールを
培養液に対して１０■／ｌとなるように加えてさらに２
日間培養を続けた。培養液のビタミンＢｌｔの生産＃度
ヲ常法に従いＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｌｅｉｃｈｍ
ａｎｎｉｉ　Ｉ　ｌ”　０３３７６１ｊｆＪいるバイオ
アッセイにより求めたところ２５１η／ｌであった。

比較のために（比較例１）、培養４日目に伯醗・アルミ
ニウムを加えずに５，６−ノメチルペンズイミダゾール
を加えてその１捷２日間培養を続けた場合のビタミンＢ
、２牛産外朋げ１５ηｑ／ｌであった。

実施例２ 水ｌｌに対してグルコース２５ｖ１コーンスチープリカ
−２０２、硝酸アンモニウム３？、ＫＨｌＦｏ、　０．
４　ｒ、Ｈａ、１ｌＰｏ、　、１２Ｈ１０１，５ｆ。

ＩｖｌｇＳＯ，、”７Ｈｔ００．５　？、Ｃｏ　（Ａｌ
Ｏ２）、　・６　Ｈ，０３０〜、Ｚｎ５Ｑ、　ＨＴＨｘ
　Ｑ　１０　Ｉｔ９．１１４ｎＳＯ４ｏ４Ｈ，０５〜、
Ｃ；ｒｂｓｏ４・５Ｂ、０５０　μｆ／　、　　（ＮＨ
，）、Ｍｏ、Ｏ１４・４Ｈ，Ｏ１ｏμＶ、パントテン限
カルシウム５ＴＷ／およびＣａＣＯ３１０ｆｆ含む培地
Ｂ　４０　ｍｅ　ｆ　１００　ｍｌ容三角フラスコに入
些て殺菌し、Ｐｒｏ７ｒｉｏｎｉ−ｂａｃｔｅｒｉｕｒ
ｎ、　ｓｈｅｒｍａｎｉｉ　Ｉ　Ｆｏ　１２３９１を植
菌した。培養は３０Ｃで６日間行った。殺菌したのち５
０Ｃに加温した痔天培地（実施例１に示した培地Ａに、
寒天を２係、カラギーナンを０．８チとなるように加え
たもの）１０ｍ／に先の培養液０５−を添加してかきま
ぜたのち５０Ｃに保温しておいた。実ＭＩＩ例１に示し
た培地３２ｍ１を１００ｍｅ　谷三角フラスコに入れて
殺菌し、先の寒天培畿物８！〃ｅを滴下し寒天固形物（
’ＩｇＦ１１固定化川体固定化化体た菌体）を懸濁させ
た。この状態で３Ｏｒに静置し１日に１度、培養物の上
８を採取し、Ｈを測足し培養物の、Ｈを中性付近に調整
した。＠養５日目に培養物の上履を２０ｍ１採取し、培
地Ａを２０ゴ加えるとともに５，６−シメチルベンズイ
ミダゾールを培養液に対して１０■／ｌとなるように加
えてさらに２日間培養を続けた。イ々すられた培養物の
ビタミンＢ１．生産濃度を常法に従い−２９− Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　　１ｅｒｃｈｒｎ、ａｎ
ｎｉｉ　　　Ｉ　ＦＯ３３７６を用いるバイオアッセイ
により求めたところ培養物１を当り３５■であった。

実施例３ 実施例１に示した培′ＭＬＡ、４０ｒｄをｌｏＯｍｌ容
三角フラスコに入れて殺菌し、ｂ８例１に示した方法で
得られた変異株Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｒｎ
。

５ｈｅｒｒｎ、ａｎｉｉ　Ｎ　ＯＣ１１０１１を植菌し
た。培養は３０［で靜１１　Ｌで行ない、１日に１度培
養液のｐＨを中性付近に調整した。培養４日目に上澄１
０廓を採取し、培地Ａを１０１ｎｌ加えるとともに。

５．６−ノメチルベンズイミダゾールを培養液に対して
１０ｍｖ／ｌとなるように加えてさらに２日間培＊を続
けた。培養液のビタミンＢ、を生産濃度を常法に従イ％
Ｌａ、ｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　１ｅｒｃｈ、ｍａ、ｎ
ｎ１ｉＩＦＯ３３７６を用いるバイオアッセイにより求
−３０− めたところ２４　ＩＩＩ）／　ｔであった。

参堝例１ ７Ｍ　ノｒｎｔ例３に用いた変異株Ｐｒｏ７１１ｉｏｎ
ｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｈｅｒｒｎ、ａｎｉｉＮＯｃ　
　１　１　０　１　１　　［ＦＥＲＭ　　　Ｂｌノー８
５〕は次の方法により得らｎた。

ペトリ皿に、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｒｎ、
　５ｈｅｒｒｎ、ａｎｉｉＩＦＯ１２３９１の培養液を
６．５　ｍｅ入れて高さ４０　ｒｎ＋からｘ５Ｗの紫外
線灯２本で照射した。笑〃ｔ１１例１に示した培地Ａ８
ｒｎＩ！を外径ｌＴｎｒｍの試験管に入れて殺菌し、先
の紫外線を照射した培養液全２−加えて３０Ｃに静置し
た。１〜７日毎に、培養液８ｍｅを採取し、培地Ａ　８
　ｒｎｌを補充することを２６回繰返した。培地Ａに寒
天を２％となるように加えた平板培地に先の繰返し培養
液を希釈して植菌し、３０Ｃで２週間培養し得られたコ
ロニー１００ケ全各々殺菌された培地Ａを１０ｎ＋Ａ含
む外径１７　ｆｌｌｌｌｌの試験管１００本に移し５日
間培養し菌体の沈降性の良い菌株を分離し、これをＮｏ
Ｃｌｌｏｌｌ株とした。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、　プロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｇｉｏｎｉ−ｂ
   ａｃ　ｔ　ｅｒ　１ｕｎｔ、）　楓に属するビタミンＢ
   、、生江閉（ヲ培地中で培養し、培地中に副生ずるプロ
   ピオン酸濃度がビタミンＢ７．の生産を実質的に阻害す
   るよう々＃胆に瑠加した際もしくはそれ以降に、新た々
   培地と該培養系の菌体部分もしくはそれを主とする部分
   との共存条件下に更に培養を続けたのち、菌体内に蓄槙
   するビタミンＢｌ！を採取することを％徴とする醗酵法
   によるビタミンＢＩｔのグ！造方法。 ２、　該菌体部分もしくはそれを主とする部分が、培養
   系に凝集剤を添加して菌体を凝集沈降させることにより
   形成される特許請求の範囲第１項記載の製造方法。 ：３　該凝集剤が、餘１１．酩アルミニウム、塩化曲鉛
   、塩化カルシウム、メタけい酸ソーダ、アルギン酪ナト
   リウム、寒天及びポリアクリルアミド糸佃（１ｉｉ＋よ
   り成る群からえらＶ」れた化合物の少なくとも−４−で
   ある特許１角求の岬１曲第２項記載の娠・遣方法。 ４、　該ビタミンＢ１．生厚酌として、菌固矩化担ｆ・
   トにｈ１短化したトビタミンＢ、２生産醜を使用する特
   許請求の範囲第１項ｉ１謙νの製造方法。 ５　該ビタミンＢ７７勺っ童画としてプロピオニバクテ
   リウム・シャーマニー及びプロピオニバクテリウム・フ
   ロイデンライヒより選はれたビタミンＢ７７勺江１を使
   用する特許請求の範囲第１項〜第４項のいずれかに記蔽
   の方法。 ６、培地中に副生ずるプロピオン酸濃度が約１　ｏ　ｙ
   ７を培地以上となった隙に、新たな培地と培養系の菌体
   部分もしくはそ扛を主とする部分との共′４−Ｐ条Ｆ＋
   −下に更に培養を続ける特許請求の範囲第１現〜第５項
   のいずれかに記載の方法。