JPS6352888A - 微生物の高濃度培養によるビタミンb↓1↓2の生産方法 - Google Patents
微生物の高濃度培養によるビタミンb↓1↓2の生産方法Info
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- JPS6352888A JPS6352888A JP19488086A JP19488086A JPS6352888A JP S6352888 A JPS6352888 A JP S6352888A JP 19488086 A JP19488086 A JP 19488086A JP 19488086 A JP19488086 A JP 19488086A JP S6352888 A JPS6352888 A JP S6352888A
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Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
〔発明の技術分野〕
本発明はビタミンB12を生産1゛る微生物の高濃度菌
体培養を利用した新規なビタミンB1□生産法に関する
ものである。
体培養を利用した新規なビタミンB1□生産法に関する
ものである。
ビタミンB12は、炭水化物、脂肪、蛋白質、核酸など
の生体内代謝に必要な因子であり、また抗悪性貧血因子
として知られ悪性貧血の治療薬とされるなど、薬剤とし
ての利用が増大している。また、家畜、へどに対する医
薬または飼餌料添加剤としても広く利用され、益々その
重要性が高まってきている。
の生体内代謝に必要な因子であり、また抗悪性貧血因子
として知られ悪性貧血の治療薬とされるなど、薬剤とし
ての利用が増大している。また、家畜、へどに対する医
薬または飼餌料添加剤としても広く利用され、益々その
重要性が高まってきている。
現在、ビタミンB1゜の工業的生産に関しては、ビタミ
ンB12の構造が複雑であり、特に立体異性体が存在す
るために化学的合成がぎわめで困難なために、もっばら
微生物の働きを利用した醗酵生産法が行われている。そ
してその5ljl生産法のほがとられている。ところで
、ビタミンB12を生産する微生物のほとんどは、窒素
源、炭素源をはじめとする必要な栄養分をすべて満たし
た培地で最適な培養条件(温度、PH,(LM気度等)
をすべて満たした条件で培養すると、菌の菌体数が少な
い、即ち菌体9度が低いときには、ぞの菌の最大の増殖
速度で対数的に増殖するが、ある程度まで増殖すると、
増殖速度が遅くなり、ついには増殖が止まってしまう。
ンB12の構造が複雑であり、特に立体異性体が存在す
るために化学的合成がぎわめで困難なために、もっばら
微生物の働きを利用した醗酵生産法が行われている。そ
してその5ljl生産法のほがとられている。ところで
、ビタミンB12を生産する微生物のほとんどは、窒素
源、炭素源をはじめとする必要な栄養分をすべて満たし
た培地で最適な培養条件(温度、PH,(LM気度等)
をすべて満たした条件で培養すると、菌の菌体数が少な
い、即ち菌体9度が低いときには、ぞの菌の最大の増殖
速度で対数的に増殖するが、ある程度まで増殖すると、
増殖速度が遅くなり、ついには増殖が止まってしまう。
この理由はビタミンB12生産菌が生育のために栄養分
を代謝して、その菌に特有な1つ或は2つ以上のビタミ
ンB12以外の代謝産物を生成するが、この代謝産物の
培養液中での濃度が菌体増殖に伴なっである一定レベル
以上になると、その代謝産物によって増殖を阻害される
ためである。
を代謝して、その菌に特有な1つ或は2つ以上のビタミ
ンB12以外の代謝産物を生成するが、この代謝産物の
培養液中での濃度が菌体増殖に伴なっである一定レベル
以上になると、その代謝産物によって増殖を阻害される
ためである。
かくして従来の回分培養法では、培養液中にある程度の
(1〜5 gdrycell /fJ −broth
)菌体濃度しか11られていない。また、ビタミンB1
2生産能の高い微生物のほとんどは、菌体内にビタミン
B12を生成するため、従来のような回分培養法では、
ある程度の菌体濃度に対応したビタミンB12しか生産
することができない。
(1〜5 gdrycell /fJ −broth
)菌体濃度しか11られていない。また、ビタミンB1
2生産能の高い微生物のほとんどは、菌体内にビタミン
B12を生成するため、従来のような回分培養法では、
ある程度の菌体濃度に対応したビタミンB12しか生産
することができない。
しかしながら従来からの研究は、ビタミンB12の生産
性を向上させるために、ビタミンB12生産能の高い微
生物を見つけ出すとか細胞融合により作り出すこと或は
、培地や培養条件を検討していかにして効率よく微生物
菌体にビタミンB12を生成させるかといったことのみ
が目的とされてきている。そこで本発明者らは、濾過を
伴う培養法によりビタミンB12生産菌を高濃度に培養
しビタミンB1゜の生産性を飛躍的に向上させ得ること
に岩目し本発明をなすに至った。
性を向上させるために、ビタミンB12生産能の高い微
生物を見つけ出すとか細胞融合により作り出すこと或は
、培地や培養条件を検討していかにして効率よく微生物
菌体にビタミンB12を生成させるかといったことのみ
が目的とされてきている。そこで本発明者らは、濾過を
伴う培養法によりビタミンB12生産菌を高濃度に培養
しビタミンB1゜の生産性を飛躍的に向上させ得ること
に岩目し本発明をなすに至った。
(発明の概要)
本発明では、ビタミンB12生産菌のビタミンB12以
外の代謝産物(菌体外に生成される)の培養液中での濃
度が一定レベル以上にならないようにしつつビタミンB
12生産菌の高濃度菌体を得、そしてビタミンB12を
多量にしかも工業的に容易に生産しようとするものであ
り、本発明者らの研究、実験によれば、菌の増殖を阻害
する代謝産物(菌体外に生成される)の培養液中での濃
度が上がらないようにするため、増殖を続ける菌体を含
む培養液を連続的に中空糸型マイクロフィルターモジュ
ール或はセラミック等の1戸材を通すことによって、i
濾過して菌体を含む液と菌体を含まない液とに分離し菌
体を含む液は、培養槽内に返送し代謝産物が溶けこんで
いる後者の液を取出し、新鮮な培地を供給、補充するこ
とによってビタミンB12生産菌の高濃度菌体が19ら
れることが見出された。
外の代謝産物(菌体外に生成される)の培養液中での濃
度が一定レベル以上にならないようにしつつビタミンB
12生産菌の高濃度菌体を得、そしてビタミンB12を
多量にしかも工業的に容易に生産しようとするものであ
り、本発明者らの研究、実験によれば、菌の増殖を阻害
する代謝産物(菌体外に生成される)の培養液中での濃
度が上がらないようにするため、増殖を続ける菌体を含
む培養液を連続的に中空糸型マイクロフィルターモジュ
ール或はセラミック等の1戸材を通すことによって、i
濾過して菌体を含む液と菌体を含まない液とに分離し菌
体を含む液は、培養槽内に返送し代謝産物が溶けこんで
いる後者の液を取出し、新鮮な培地を供給、補充するこ
とによってビタミンB12生産菌の高濃度菌体が19ら
れることが見出された。
これによってビタミンB12生産菌の高濃度菌体培養液
中に高濃度のビタミンB12が得られたわけであるが、
さらに前記のようなi濾過を伴う培養を続けると同時に
、ビタミンB12生産菌の高濃度菌体培養液を菌体を含
まない1戸液とは別に、新たに連続的に広き取り、それ
と同体積の新鮮培地を新たに連続的に追加供給すれば、
広き取ったビタミンB12生産菌の高濃度菌体培養液よ
り高濃度のビタミンB12を連続的に採取することがで
きる。ここで高濃度菌体を抜き取った分だけ菌体濃度は
、希釈されるわけであるが、i濾過により増殖阻害の原
因である代謝産物は、除かれているため、菌体が増殖を
続けられるので、増殖速度と平衡したレベルの希釈率で
高濃度菌体培養液を採取することができる。
中に高濃度のビタミンB12が得られたわけであるが、
さらに前記のようなi濾過を伴う培養を続けると同時に
、ビタミンB12生産菌の高濃度菌体培養液を菌体を含
まない1戸液とは別に、新たに連続的に広き取り、それ
と同体積の新鮮培地を新たに連続的に追加供給すれば、
広き取ったビタミンB12生産菌の高濃度菌体培養液よ
り高濃度のビタミンB12を連続的に採取することがで
きる。ここで高濃度菌体を抜き取った分だけ菌体濃度は
、希釈されるわけであるが、i濾過により増殖阻害の原
因である代謝産物は、除かれているため、菌体が増殖を
続けられるので、増殖速度と平衡したレベルの希釈率で
高濃度菌体培養液を採取することができる。
つまりこの方法によれば、高濃度のビタミンB12を連
続的に採取することができることによってビタミンB1
2の飛躍的な生産性向上が実現できるばかりか、生産設
備を小規模化、連続生産化できるなど、省エネルギーの
観点からも極めて有効なビタミンB12生産を実現する
ことができる。
続的に採取することができることによってビタミンB1
2の飛躍的な生産性向上が実現できるばかりか、生産設
備を小規模化、連続生産化できるなど、省エネルギーの
観点からも極めて有効なビタミンB12生産を実現する
ことができる。
よって本発明は、ビタミンB12生産菌を培養槽内で液
体培地にて培養して高′a度国体を生成する方法におい
て菌体を含む培養液を増殖が低下又は停止する前に連続
的に中空糸型マイクロフィルターモジュール或はセラミ
ック等の炉材を通して枦過してビタミンB1゜生産菌体
を含む液とビタミンB12生産菌体を含まない液とに分
離し菌体を含む液は培養槽内に返送し、菌体を含まない
液を抜き取り、その扱き取った液と同体積の新鮮な液体
培地をビタミンB12生産菌培養液に供給しつつろ過培
養を続け、それによってビタミン”12生産菌のir′
flI11度菌体を17、ざらに前記のようなi濾過を
伴う培養を続けつつ、得られたビタミンB12を高濃度
に含有するビタミン812生産菌の高濃度菌体培養液を
菌体を含まない炉液とは別に新たに連続的に抜き取り、
それと同体積の新鮮培地を新たに連続的に追加供給する
ことによって、抜き取ったビタミンB12生産菌の高濃
度菌体培養液から連続的に高濃度のビタミンB12を生
産することを特徴とするビタミンB12の生産方法を提
供するものである。
体培地にて培養して高′a度国体を生成する方法におい
て菌体を含む培養液を増殖が低下又は停止する前に連続
的に中空糸型マイクロフィルターモジュール或はセラミ
ック等の炉材を通して枦過してビタミンB1゜生産菌体
を含む液とビタミンB12生産菌体を含まない液とに分
離し菌体を含む液は培養槽内に返送し、菌体を含まない
液を抜き取り、その扱き取った液と同体積の新鮮な液体
培地をビタミンB12生産菌培養液に供給しつつろ過培
養を続け、それによってビタミン”12生産菌のir′
flI11度菌体を17、ざらに前記のようなi濾過を
伴う培養を続けつつ、得られたビタミンB12を高濃度
に含有するビタミン812生産菌の高濃度菌体培養液を
菌体を含まない炉液とは別に新たに連続的に抜き取り、
それと同体積の新鮮培地を新たに連続的に追加供給する
ことによって、抜き取ったビタミンB12生産菌の高濃
度菌体培養液から連続的に高濃度のビタミンB12を生
産することを特徴とするビタミンB12の生産方法を提
供するものである。
本発明について更に詳細に説明する。
本発明方法は、ビタミンB12生産能の高い微生物を対
照とするものであり、ビタミンB1□生産菌としては主
に細菌、放線菌が知られており具体的には、プロピオニ
バクテリウム属、スl−レブトミセス属、ミクロモノス
ポラ属、シュードモナス属、ノカルジア属、コリネバク
テリウム属、クロスミルリジウム属、ブチリバクテリウ
ム屈、ミクロコツカス属、アースロバフタ−属、パラコ
ツカス属、バチルス属、プロタミノバクタ−属、ロドシ
ュードモナス属などが代表的な菌としてあげられる。
照とするものであり、ビタミンB1□生産菌としては主
に細菌、放線菌が知られており具体的には、プロピオニ
バクテリウム属、スl−レブトミセス属、ミクロモノス
ポラ属、シュードモナス属、ノカルジア属、コリネバク
テリウム属、クロスミルリジウム属、ブチリバクテリウ
ム屈、ミクロコツカス属、アースロバフタ−属、パラコ
ツカス属、バチルス属、プロタミノバクタ−属、ロドシ
ュードモナス属などが代表的な菌としてあげられる。
これらのビタミンB12生産菌の培養に用いられるj8
地としては、窒素源、炭素源をはじめとするビタミンB
12生産菌の増殖に必要な栄養分を満たした培地ならば
任意であるが、ビタミンB12生産のために少量のコバ
ルト塩(GOCI2−6H20或は、COS 04−7
1−120 )を加える。
地としては、窒素源、炭素源をはじめとするビタミンB
12生産菌の増殖に必要な栄養分を満たした培地ならば
任意であるが、ビタミンB12生産のために少量のコバ
ルト塩(GOCI2−6H20或は、COS 04−7
1−120 )を加える。
また通常液体培地が用いられ、対象とするビタミンB1
2生産菌によって適宜組成の培地が選択、使用される。
2生産菌によって適宜組成の培地が選択、使用される。
本発明ではこのようなビタミンB12生産菌を培地で培
養するに際し、増殖を続ける菌体を含む培養液を適当な
炉材により濾過しつつ培養するのであるが、かかるン濾
過培養を行うに当って、まず前培養、菌接種、P Hコ
ントロール回分培養を行う。
養するに際し、増殖を続ける菌体を含む培養液を適当な
炉材により濾過しつつ培養するのであるが、かかるン濾
過培養を行うに当って、まず前培養、菌接種、P Hコ
ントロール回分培養を行う。
以下類に説明する。
まずビタミンB12生産菌を予め滅菌した上述の如き液
体培地で、最適条件下において回分Jg′f!iシ、こ
れを本発明の培養(本培養)のための前j8養として初
発の接種菌を得る。
体培地で、最適条件下において回分Jg′f!iシ、こ
れを本発明の培養(本培養)のための前j8養として初
発の接種菌を得る。
次に本培養槽に同様な液体培地を入れ滅菌した後、そこ
に前培養した菌を接種する。このとき前培養液をそのま
ま添加してもよいが、必要ならば、前培養液を無菌的に
遠心力にI器にかけ、8.000〜13.00Orpm
で3〜10分間遠心分離して集菌しその集菌した菌体を
予め滅菌した新鮮な同種培地に懸濁して本培養槽培地に
添加する。その時に本培養液の初光菌体温度は、ごく少
なくてよいが、望ましくは、菌体を含む培養液の570
nmにおける吸光度(濁度)っまりO,D(=Opti
cal Density ) 570 *で0.01〜
0.3程度とするのがよい。尚培養液中の実際の菌体温
度は通常この吸光度から求められる。即ち菌体を含む液
の吸光度を測定して、前記0.057CNfflを求め
、その値から一定の数式を用いて一定液吊中の乾燥菌体
重量を知ることができるが、一般には前記○、D570
値自体により間接的に菌体濃度レベルが表わされる。
に前培養した菌を接種する。このとき前培養液をそのま
ま添加してもよいが、必要ならば、前培養液を無菌的に
遠心力にI器にかけ、8.000〜13.00Orpm
で3〜10分間遠心分離して集菌しその集菌した菌体を
予め滅菌した新鮮な同種培地に懸濁して本培養槽培地に
添加する。その時に本培養液の初光菌体温度は、ごく少
なくてよいが、望ましくは、菌体を含む培養液の570
nmにおける吸光度(濁度)っまりO,D(=Opti
cal Density ) 570 *で0.01〜
0.3程度とするのがよい。尚培養液中の実際の菌体温
度は通常この吸光度から求められる。即ち菌体を含む液
の吸光度を測定して、前記0.057CNfflを求め
、その値から一定の数式を用いて一定液吊中の乾燥菌体
重量を知ることができるが、一般には前記○、D570
値自体により間接的に菌体濃度レベルが表わされる。
本培養槽に菌を接種したならば、温度、P l−1。
嫌気度等を最適条件に維持しつつ本培養を行なう。
たとえば本培養槽をジャケット型にしてジャケット槽に
最適な温度の恒温水を循環させて最適な温度条件に維持
したり、また、アンモニア水や水酸化ナトリウム等のア
ルカリ液や塩酸等の酸液を自動的に滴下して最適なP
H条件に維持するJ:うにする。また菌体が沈殿しない
よう適量な速度で液を攪拌したり、通性嫌気性菌の場合
は、適量の無菌窒素ガスを供給して通性嫌気状態に保ち
、偏性嫌気性菌の場合には、気密な培養槽に無菌窒素ガ
スを通気して培養槽内を陽圧に保ちながら、徐々に排気
して嫌気状態を保つ必要がある。また好気性菌の場合に
は無菌空気、必要ならば酸素ガスを培養液中に通気して
好気状態が保たれるようにする。
最適な温度の恒温水を循環させて最適な温度条件に維持
したり、また、アンモニア水や水酸化ナトリウム等のア
ルカリ液や塩酸等の酸液を自動的に滴下して最適なP
H条件に維持するJ:うにする。また菌体が沈殿しない
よう適量な速度で液を攪拌したり、通性嫌気性菌の場合
は、適量の無菌窒素ガスを供給して通性嫌気状態に保ち
、偏性嫌気性菌の場合には、気密な培養槽に無菌窒素ガ
スを通気して培養槽内を陽圧に保ちながら、徐々に排気
して嫌気状態を保つ必要がある。また好気性菌の場合に
は無菌空気、必要ならば酸素ガスを培養液中に通気して
好気状態が保たれるようにする。
上述のように本培養槽で培養していくと、ビタミンB1
2生産菌は、最大の増殖速度で対数的に増殖し続けてい
くが、ある程度の菌体11度レベルに達するとビタミン
812以外の自己の代謝産物(菌体外に生成する)によ
り増殖が阻害されて菌体の増殖速度が漸次低下し、遂に
は増殖が止まってしまう。そのレベルはたとえばプロピ
オン酸菌では0、D570値10程度である。このよう
なレベルはそれぞれのビタミンB12生産菌について予
め回分培養により調べておくのが好ましい。
2生産菌は、最大の増殖速度で対数的に増殖し続けてい
くが、ある程度の菌体11度レベルに達するとビタミン
812以外の自己の代謝産物(菌体外に生成する)によ
り増殖が阻害されて菌体の増殖速度が漸次低下し、遂に
は増殖が止まってしまう。そのレベルはたとえばプロピ
オン酸菌では0、D570値10程度である。このよう
なレベルはそれぞれのビタミンB12生産菌について予
め回分培養により調べておくのが好ましい。
本発明では、このように培養を続けていき、増殖が低下
又は停止する前、望ましくは直前に、つまり対数増IM
後期に本培養槽内の培養液を2戸材に連続的に供給して
i濾過する操作を開始する。そして、ン戸材としては、
中空糸(ホローファイバー)型マイクロフィルターモジ
ュール 材等が考えられるが、特に中空糸(ホローファイバー)
型マイクロフィルターモジュールを用いるのが好ましい
。これは、菌体が通れないほどの小さくシャープな孔径
分布をもつ合成樹脂製の精密ン濾過膜(マイクロフィル
ター)からなる中空糸状精密i濾過膜を多数本、接着剤
によりモジュールケースに一体構造に固定したものであ
り、使用時は、中空糸膜の中空部に液体を圧送し、中空
糸膜内表面に対して原液を平行に流す、いわゆるクロス
フロ一方式によるン濾過を行なうものである。
又は停止する前、望ましくは直前に、つまり対数増IM
後期に本培養槽内の培養液を2戸材に連続的に供給して
i濾過する操作を開始する。そして、ン戸材としては、
中空糸(ホローファイバー)型マイクロフィルターモジ
ュール 材等が考えられるが、特に中空糸(ホローファイバー)
型マイクロフィルターモジュールを用いるのが好ましい
。これは、菌体が通れないほどの小さくシャープな孔径
分布をもつ合成樹脂製の精密ン濾過膜(マイクロフィル
ター)からなる中空糸状精密i濾過膜を多数本、接着剤
によりモジュールケースに一体構造に固定したものであ
り、使用時は、中空糸膜の中空部に液体を圧送し、中空
糸膜内表面に対して原液を平行に流す、いわゆるクロス
フロ一方式によるン濾過を行なうものである。
このような中空糸状型マイクロフィルターモジュールと
しては、例えば旭化成工業四から市販されているマイク
ローザ(HICROZA ) PW − 3 0 3、
PW−103を用いることができる。これらのポリオレ
フィン中空糸は内径数M以下の中空膜でつくられ、平均
孔径0.1μmである。80℃の温度に耐えられ、又p
H1〜14の範囲で使用可能であり耐薬品性も良好であ
る。ポリプロピレン中空糸、ハロゲン化炭化水素とポリ
オレフィンとの共m合体系中空糸も使用することができ
る。使用される膜の平均孔径中0.05ないし1μm径
のも、のを使用するのがよい。
しては、例えば旭化成工業四から市販されているマイク
ローザ(HICROZA ) PW − 3 0 3、
PW−103を用いることができる。これらのポリオレ
フィン中空糸は内径数M以下の中空膜でつくられ、平均
孔径0.1μmである。80℃の温度に耐えられ、又p
H1〜14の範囲で使用可能であり耐薬品性も良好であ
る。ポリプロピレン中空糸、ハロゲン化炭化水素とポリ
オレフィンとの共m合体系中空糸も使用することができ
る。使用される膜の平均孔径中0.05ないし1μm径
のも、のを使用するのがよい。
このように増殖速度が低下するか増殖が止まる前に本培
fs槽の増養液を前記のような中空糸状型マイクロフィ
ルターモジュールに供給してン濾過して菌体を含む液と
菌体を含まない液とに分離し、菌体を含む液は本培¥k
Wi内に返送し、菌体を含まない液、即ち増殖阻害の原
因となる代謝産物を含む液を順次扱き取る。そして抜き
取った液と同じ体積の新鮮な液体培地を連続的に培養槽
に供給して、増殖阻害を受けることなく更にン濾過培養
を続行することができる。
fs槽の増養液を前記のような中空糸状型マイクロフィ
ルターモジュールに供給してン濾過して菌体を含む液と
菌体を含まない液とに分離し、菌体を含む液は本培¥k
Wi内に返送し、菌体を含まない液、即ち増殖阻害の原
因となる代謝産物を含む液を順次扱き取る。そして抜き
取った液と同じ体積の新鮮な液体培地を連続的に培養槽
に供給して、増殖阻害を受けることなく更にン濾過培養
を続行することができる。
これによって菌体は代謝産物による阻害を受けることな
く最大の増殖速度で対数的に増殖を続けて高2+1度の
菌体を得ることができる。しかし菌体濃度が高まれば高
まる程抜き取るが液の聞を多くする。いいかえれば新鮮
な培地による希釈率を高くすることが必要である。そう
しなければ代謝産物濃度があがりすぎ、その時点で増殖
が止まってしまうからである。そのためi濾過開始時は
1戸液を抜き取る格は、受石でよいが、濾過培養が進む
につれて段階的に望ましくは連続的にその炉液汰き取り
量を多くしていくよう注意することが必要である。ここ
で、上述のように本発明で用いる中空糸状型マイクロフ
ィルターモジュールは、その膜面積がモジュール体積に
比べて非常に大きいため、他の種類のマイクロフィルタ
ーに比して濾過能力にすぐれ、このように連続的にか過
を行っても培養液の全体積とモジュール膜表面積の比が
)8当であれば、常に良好にン濾過して段階的又は連続
的にか液を増加させるに十分な母の1戸液を扱き取るこ
とができる。
く最大の増殖速度で対数的に増殖を続けて高2+1度の
菌体を得ることができる。しかし菌体濃度が高まれば高
まる程抜き取るが液の聞を多くする。いいかえれば新鮮
な培地による希釈率を高くすることが必要である。そう
しなければ代謝産物濃度があがりすぎ、その時点で増殖
が止まってしまうからである。そのためi濾過開始時は
1戸液を抜き取る格は、受石でよいが、濾過培養が進む
につれて段階的に望ましくは連続的にその炉液汰き取り
量を多くしていくよう注意することが必要である。ここ
で、上述のように本発明で用いる中空糸状型マイクロフ
ィルターモジュールは、その膜面積がモジュール体積に
比べて非常に大きいため、他の種類のマイクロフィルタ
ーに比して濾過能力にすぐれ、このように連続的にか過
を行っても培養液の全体積とモジュール膜表面積の比が
)8当であれば、常に良好にン濾過して段階的又は連続
的にか液を増加させるに十分な母の1戸液を扱き取るこ
とができる。
このようにしてン濾過培養を続ければ、菌体は対数的に
増殖し続け、物理的な限界まで高濃度になる。たとえば
プロピオン酸菌では従来の回分培養法の少くとも50倍
以上にも達する高濃度の菌体培養液を1ワることができ
る。そこでこのようにしてビタミンB12生産菌の高濃
度菌体培養液が得られたら、さらにろ過培養を続けつつ
得られたビタミン812を高濃度に含有するビタミン8
12生産菌の高濃度菌体培養液をン戸液とは別に連続的
に扱き取り、それと同体積の新鮮培地を連続的に追加供
給することによって抜き取ったビタミンB12生産菌の
高濃度菌体培養液から連続的に高濃度のビタミンB12
を生産することができる。
増殖し続け、物理的な限界まで高濃度になる。たとえば
プロピオン酸菌では従来の回分培養法の少くとも50倍
以上にも達する高濃度の菌体培養液を1ワることができ
る。そこでこのようにしてビタミンB12生産菌の高濃
度菌体培養液が得られたら、さらにろ過培養を続けつつ
得られたビタミン812を高濃度に含有するビタミン8
12生産菌の高濃度菌体培養液をン戸液とは別に連続的
に扱き取り、それと同体積の新鮮培地を連続的に追加供
給することによって抜き取ったビタミンB12生産菌の
高濃度菌体培養液から連続的に高濃度のビタミンB12
を生産することができる。
次に本発明の培養法を実施するための装置の一例を図面
第1図に示す。第1図について説明すると、1がガラス
製で二重栖になっている培養槽で、外側のジャケット部
分2に一定温度の恒温水3を循環させて内部の培養液4
を一定温度に保つようにする。蓋5の部分はステンレス
製で容器との間にシリコンゴム製のバッキング6が入れ
てあり、蝶ねじ7で締め付けて気密性にし雑菌汚染を防
ぐようにしである。この培養槽1はマグネチックスター
シー8上に載せられてJ5す、培養槽1内底部のマグネ
ットチップ9を回転せしめて培養液4を攪拌するように
する。
第1図に示す。第1図について説明すると、1がガラス
製で二重栖になっている培養槽で、外側のジャケット部
分2に一定温度の恒温水3を循環させて内部の培養液4
を一定温度に保つようにする。蓋5の部分はステンレス
製で容器との間にシリコンゴム製のバッキング6が入れ
てあり、蝶ねじ7で締め付けて気密性にし雑菌汚染を防
ぐようにしである。この培養槽1はマグネチックスター
シー8上に載せられてJ5す、培養槽1内底部のマグネ
ットチップ9を回転せしめて培養液4を攪拌するように
する。
10は、嫌気性菌を培養する場合には窒素ガスを、好気
性菌の場合には、空気又はM素ガスをエアフィルター1
1を通して無菌的に培養液4中に供給するラインであり
、その先端には金魚飼育用の泡立具12を取むけておく
、13は通気した前記ガスを排気するためのラインであ
りこの先にトラップを付けて雑菌汚染を防止する。14
は培養液中に常に入っているように設けられている液面
計の片方の接点でありステンレス棒でよい。又15は培
養液面に設定された液面胴のもう一方の接点であり、こ
れもステンレス棒でよい。
性菌の場合には、空気又はM素ガスをエアフィルター1
1を通して無菌的に培養液4中に供給するラインであり
、その先端には金魚飼育用の泡立具12を取むけておく
、13は通気した前記ガスを排気するためのラインであ
りこの先にトラップを付けて雑菌汚染を防止する。14
は培養液中に常に入っているように設けられている液面
計の片方の接点でありステンレス棒でよい。又15は培
養液面に設定された液面胴のもう一方の接点であり、こ
れもステンレス棒でよい。
16は恒温水槽17の恒温水3に浸漬された容器18に
充填された供給用新鮮培地1つを培養液4に供給するた
めのラインであり、ン濾過によりか液が抜き取られ液面
が低下して1)を閉接点15が液面から離れると液面計
20が働いてマイクロチューブポンプ21を動かして新
鮮培地19を培養液4に供給するようにする。
充填された供給用新鮮培地1つを培養液4に供給するた
めのラインであり、ン濾過によりか液が抜き取られ液面
が低下して1)を閉接点15が液面から離れると液面計
20が働いてマイクロチューブポンプ21を動かして新
鮮培地19を培養液4に供給するようにする。
22はPI−1コントロールのためのアルカリ液又は酸
液23を培養液4に供給するためのラインであり、培養
液4のP)−1が一定値にり低下又警ま上胃するとP
Hff1ffi極24に接続しているP Hコント1コ
ーラ−25が働いて、ペリスタポンプ26を動かして上
記アルカリ液又は酸液23が培養液4に供給される62
7はサンプルを取り出すためのラインである。
液23を培養液4に供給するためのラインであり、培養
液4のP)−1が一定値にり低下又警ま上胃するとP
Hff1ffi極24に接続しているP Hコント1コ
ーラ−25が働いて、ペリスタポンプ26を動かして上
記アルカリ液又は酸液23が培養液4に供給される62
7はサンプルを取り出すためのラインである。
28は培養槽1の下方側部に設けられた、培養液4を抜
き出し、中空糸型マイクロフィルターモジュール29に
、その一端部開口30から供給するためのラインであり
、ここにローラーポンプ31、流量計32、圧力計33
が設けられている。
き出し、中空糸型マイクロフィルターモジュール29に
、その一端部開口30から供給するためのラインであり
、ここにローラーポンプ31、流量計32、圧力計33
が設けられている。
34はモジュール29の側部開口35に接続されたか液
取り出しラインであり、電磁弁36、i戸液調節コック
37が設けられ、モジュール29の他端間口38には、
そこから取り出した液を培養槽1に戻1゛ためのライン
39が接続される。このライン39には圧力計40とボ
ールバルブ41が設けられている。電磁弁36は、ライ
ン42により窒素ガスボンベ(図示せず)に接続されて
いる。
取り出しラインであり、電磁弁36、i戸液調節コック
37が設けられ、モジュール29の他端間口38には、
そこから取り出した液を培養槽1に戻1゛ためのライン
39が接続される。このライン39には圧力計40とボ
ールバルブ41が設けられている。電磁弁36は、ライ
ン42により窒素ガスボンベ(図示せず)に接続されて
いる。
43はライン44により恒温水槽17から恒温水3を培
養液WJ1のジャケット部2に供給するための循環ポン
プを示す。各ラインはシリコンゴムでつくられる。
養液WJ1のジャケット部2に供給するための循環ポン
プを示す。各ラインはシリコンゴムでつくられる。
このような装置をセットして作動するときは、恒温水3
をジャケット2に流し又PH主電極4で測定されたP
l−1の値によりアルカリ液又は酸液23を添加し、マ
グネチツクスターラ−8を働かせて培養液4を攪拌し、
必要によりライン10より無菌窒素ガス或は無菌空気、
酸素を供給する等により培養液を夫々に最適の温度、P
H1嫌気度等に保らながら培養を続け、必要の都度ライ
ン27よりサンプルを採取してその吸光度を測定する。
をジャケット2に流し又PH主電極4で測定されたP
l−1の値によりアルカリ液又は酸液23を添加し、マ
グネチツクスターラ−8を働かせて培養液4を攪拌し、
必要によりライン10より無菌窒素ガス或は無菌空気、
酸素を供給する等により培養液を夫々に最適の温度、P
H1嫌気度等に保らながら培養を続け、必要の都度ライ
ン27よりサンプルを採取してその吸光度を測定する。
その吸光度が予め測定されている増殖明害を起こず値に
近くなったらローラーポンプ31を働かしてライン28
を経て培養液4を中空糸型マイクロフィルターモジュー
ル29に供給してi濾過する。ン濾過された菌体を含ま
ない、そして代謝産物を含んでいる液0戸液)は、ライ
ン34から取り出され、一方菌体を含む液はライン39
を経て培養槽1に戻される。
近くなったらローラーポンプ31を働かしてライン28
を経て培養液4を中空糸型マイクロフィルターモジュー
ル29に供給してi濾過する。ン濾過された菌体を含ま
ない、そして代謝産物を含んでいる液0戸液)は、ライ
ン34から取り出され、一方菌体を含む液はライン39
を経て培養槽1に戻される。
培養液4が扱き取られて液面が低下するとマイクロチュ
ーブポンプ21が働いて供給用新鮮培地19がライン1
6を経て培養槽1に供給される。
ーブポンプ21が働いて供給用新鮮培地19がライン1
6を経て培養槽1に供給される。
液面が液面計の接点15に達するとぞの供給は停止され
常に抜き取られたのと同体積の斬負工培地1つが、培養
槽1に供給されてン濾過培養(よ続行される。その際炉
液調節コック37を操作することによって、ン濾過開始
時の炉液抜き取り伍を少なく、漸次段階的又は連続的に
抜き取り量を多くするよう調整する。しかし菌体濃度が
非常に高まってくると、思うようにン戸液量を取れなく
なる場合も考えられるので、その時にはローラーポンプ
31の流量を上げてモジュール29の中空糸内の培養液
の流速を上げるとか、ライン39のボールバルブ41を
しぼって圧力をかけるなどしてか液量を上げることがで
きる。尚上記モジュール29は、マイクローザPW10
3の場合、通常約2気圧の圧力まで耐えることができる
。
常に抜き取られたのと同体積の斬負工培地1つが、培養
槽1に供給されてン濾過培養(よ続行される。その際炉
液調節コック37を操作することによって、ン濾過開始
時の炉液抜き取り伍を少なく、漸次段階的又は連続的に
抜き取り量を多くするよう調整する。しかし菌体濃度が
非常に高まってくると、思うようにン戸液量を取れなく
なる場合も考えられるので、その時にはローラーポンプ
31の流量を上げてモジュール29の中空糸内の培養液
の流速を上げるとか、ライン39のボールバルブ41を
しぼって圧力をかけるなどしてか液量を上げることがで
きる。尚上記モジュール29は、マイクローザPW10
3の場合、通常約2気圧の圧力まで耐えることができる
。
濾過が進行してモジュール29の中空糸膜に菌体が付着
するに至った時はその外側から内側に圧力をかけて取除
く。この場合もモジュール29の耐えつる圧力まで圧力
をかけることができる。その際は[i弁36をタイマー
につなげて一定時間間隔で一定時間(約1秒程度)電磁
弁36によりライン34を閉じて、ライン42より窒素
ガスを加えてガス圧がかかるようにする。勿論通常は窒
素ガスライン42は閉じてン戸液抜き取りライン34が
開いている。
するに至った時はその外側から内側に圧力をかけて取除
く。この場合もモジュール29の耐えつる圧力まで圧力
をかけることができる。その際は[i弁36をタイマー
につなげて一定時間間隔で一定時間(約1秒程度)電磁
弁36によりライン34を閉じて、ライン42より窒素
ガスを加えてガス圧がかかるようにする。勿論通常は窒
素ガスライン42は閉じてン戸液抜き取りライン34が
開いている。
尚、中空糸型マイクロフィルターを使用するときは、培
養液を通す前に予め0.3%次亜塩素酸ナトリウム水溶
液を通して洗浄、滅菌した後、滅菌水と滅菌済の80℃
熱水を通して次亜塩素酸ナトリウムを洗い流しておくの
がよい。又再使用するときは、前に使用した直後に水に
より十分に菌体を洗い出した後、同様に0.3%次亜塩
素酸ナトリウム水溶液により中空糸膜に付着した菌体を
滅菌し溶菌させて溶かして洗浄しておくのが好ましい。
養液を通す前に予め0.3%次亜塩素酸ナトリウム水溶
液を通して洗浄、滅菌した後、滅菌水と滅菌済の80℃
熱水を通して次亜塩素酸ナトリウムを洗い流しておくの
がよい。又再使用するときは、前に使用した直後に水に
より十分に菌体を洗い出した後、同様に0.3%次亜塩
素酸ナトリウム水溶液により中空糸膜に付着した菌体を
滅菌し溶菌させて溶かして洗浄しておくのが好ましい。
又本培養槽は蓋又はライン接続部を気密性にして雑菌汚
染しないようにする。またここに用いたマイクロチュー
ブポンプ21、ペリスタポンプ26、ローラーボン73
1等は、回転ローラーがシリコンチューブを圧搾するこ
とによってチューブ内の液体(ガス)に嬬動作用を発生
させることを原理としたポンプであるのでチューブ内の
培養液を外気にふれさせることがなく、雑菌汚染の心配
がない。このようなポンプを使用することなどによって
本発明方法を雑菌汚染の懸念な〈実施することができる
。
染しないようにする。またここに用いたマイクロチュー
ブポンプ21、ペリスタポンプ26、ローラーボン73
1等は、回転ローラーがシリコンチューブを圧搾するこ
とによってチューブ内の液体(ガス)に嬬動作用を発生
させることを原理としたポンプであるのでチューブ内の
培養液を外気にふれさせることがなく、雑菌汚染の心配
がない。このようなポンプを使用することなどによって
本発明方法を雑菌汚染の懸念な〈実施することができる
。
尚、高濃度菌体が得られた後、高濃度菌体培養液を連続
的に採取する場合は、図には示していないが、培養槽1
に新たに培養液4(高濃度菌体になっている)の扱き取
りラインを設けて、D−ラーボンブにより一定量を抜き
取るようにずればよい。この時培養液は減少するわ:す
だが、液面31が働いて自動的に新鮮培地が供給される
ため、培養液量は常に一定に保つことができる。
的に採取する場合は、図には示していないが、培養槽1
に新たに培養液4(高濃度菌体になっている)の扱き取
りラインを設けて、D−ラーボンブにより一定量を抜き
取るようにずればよい。この時培養液は減少するわ:す
だが、液面31が働いて自動的に新鮮培地が供給される
ため、培養液量は常に一定に保つことができる。
菌株; Propionibacterium She
rmanii培地組成;ポリペプトン1%、P?i母エ
生エキス0%、グルコース2%、 K2HPO40,05%、 Co S 0 ・7 H2015pDIPH6,5 ■前培養 1B威容試験管2本にそれぞれ培地10Ilteづつ入
れ綿栓後、オートクレーブにて121℃15分間滅菌(
グルコースは別滅菌した)後、菌を接種し30’C恒温
水槽で24時間静置培養した。
rmanii培地組成;ポリペプトン1%、P?i母エ
生エキス0%、グルコース2%、 K2HPO40,05%、 Co S 0 ・7 H2015pDIPH6,5 ■前培養 1B威容試験管2本にそれぞれ培地10Ilteづつ入
れ綿栓後、オートクレーブにて121℃15分間滅菌(
グルコースは別滅菌した)後、菌を接種し30’C恒温
水槽で24時間静置培養した。
■菌接種
本培養槽に培地600dを入れ、予め本培養槽にヒツト
したシリコンチューブライン等も含めてJ−トクレーブ
にて121℃15分間滅菌した。
したシリコンチューブライン等も含めてJ−トクレーブ
にて121℃15分間滅菌した。
(グルコースは別滅菌した)その後、前培N液をそのま
ま、本培養槽中の培地に添加し、菌を接種した。
ま、本培養槽中の培地に添加し、菌を接種した。
■P Hコントロール回分培養
本培養槽中の培地に菌を接種したら、ただちに培養液を
30℃に保ち、窒素ガスを通気し、攪拌(100rpm
)を始めた。またPHコントローラーを働かせて、PH
6,5に保つようにした。予めPHコントロール回分培
養を35時間行った結果より、この菌は、回分培養27
〜30時間後、0.0570値7〜10で自己の代謝産
物であるブ0ピオン酸及び酢酸によって増殖31害を受
は始めることがわかっているので、27時時間 Hコン
トロール回分培養を行った後、濾過培養を開始した。尚
、培養中3〜8時間おきに培養液をサンプリングして、
O,D570値を測定後、ただちに−20℃にストック
して経時的なサンプルとした。
30℃に保ち、窒素ガスを通気し、攪拌(100rpm
)を始めた。またPHコントローラーを働かせて、PH
6,5に保つようにした。予めPHコントロール回分培
養を35時間行った結果より、この菌は、回分培養27
〜30時間後、0.0570値7〜10で自己の代謝産
物であるブ0ピオン酸及び酢酸によって増殖31害を受
は始めることがわかっているので、27時時間 Hコン
トロール回分培養を行った後、濾過培養を開始した。尚
、培養中3〜8時間おきに培養液をサンプリングして、
O,D570値を測定後、ただちに−20℃にストック
して経時的なサンプルとした。
※本培養槽のラインの先端部分(濾過ラインや新鮮供給
培地との接続部分)は、ピンチコックあるいは、スクリ
ューコックにより完全に締め、雑菌汚染しないようにし
た。
培地との接続部分)は、ピンチコックあるいは、スクリ
ューコックにより完全に締め、雑菌汚染しないようにし
た。
■ン濾過培養準備
濾過培養が開始される前に予め供給用の新i¥培地1O
Nを5本のガラス容器にそれぞれ入れ、121℃15分
間オートクレーブ滅菌(グルコースは別滅菌)した後、
1本は30℃恒温水槽に入れて30℃に保っておいた。
Nを5本のガラス容器にそれぞれ入れ、121℃15分
間オートクレーブ滅菌(グルコースは別滅菌)した後、
1本は30℃恒温水槽に入れて30℃に保っておいた。
また中空糸型マイクロフィルターモジュールとしては、
旭化成工業製マイクローザPW−103を使用した。マ
イクローザPW−103は、予め0.3%の次亜塩素酸
ナトリウム水溶液を通して滅菌、洗浄した後、滅菌水及
び滅菌済みの80℃熱水で次亜塩素酸ナトリウムを洗い
流しておいたものを使用した。
旭化成工業製マイクローザPW−103を使用した。マ
イクローザPW−103は、予め0.3%の次亜塩素酸
ナトリウム水溶液を通して滅菌、洗浄した後、滅菌水及
び滅菌済みの80℃熱水で次亜塩素酸ナトリウムを洗い
流しておいたものを使用した。
■ン濾過培養開始
Pl−1コントロ一ル回分培養により27時間培養した
なら、本坊fHffに取り付けであるr濾過ラインとマ
イクローザPW−103を接続し、新鮮培地供給ライン
等が過培養に必要なすべてのラインを接続し、ローラー
ポンプを作動させて本培養槽から培養液を抜き取り、マ
イクローザPW−103(平均孔径0.1μm、膜面積
0.2Td>を通し、菌体を含む液と菌体を含まない液
に分N(シ、菌体を含まない液即ちン戸液をラインから
連続的に抜き取った。この時、コックをしぼることによ
って炉液量を調節した。それと同時に液面51が動いて
、マイクロデユープポンプにより抜き取られたが液と同
体積の新鮮培地が本培養液に供給された。尚、ローラー
ポンプの流量ば4ON/h程度とし、また今回ラインの
容積に比べて本培養槽が小さいため、ン濾過ラインら含
めた培養液の客足は濾過開始時に回分培養時の600
ml、から800dに増やした。尚、2〜4時間おきに
培養液をサンプリングし0.D570値を測定後、ただ
ちに−20℃にストックして経時的なサンプルをtqる
とともに、1〜4時間おきにi戸液間を測定した。ス1
〜ツクした経時的な菌体培養液は、回分培養時のサンプ
ルもいっしょに、それぞれ遠心分焔器により菌体と上清
に分離した後(8,000〜13.00Orpm 5〜
10分間)、上清を採取して、グルコースとプロピオン
酸、酢酸の定量を行った。グルコースは、ソモギーネル
ンン法により、プロピオン酸、酢酸は、ガスクロマトグ
ラフィーにより定Gした。また、ビタミンB12は菌体
培養液をそのままサンプルとして、KCNにより熱抽出
を行った後、遠心分m (10,000〜15.000
rpn+5〜10分聞)して上清を採取し、シアン型に
変換した形のビタミンB12サンプルとした。ビタミン
B の定量は、ビタミンB12栄養認求性の大腸菌変異
株(Eshcrichia coli 215 )を宙
吊用菌株としてバイオアッヒイにより定量した。
なら、本坊fHffに取り付けであるr濾過ラインとマ
イクローザPW−103を接続し、新鮮培地供給ライン
等が過培養に必要なすべてのラインを接続し、ローラー
ポンプを作動させて本培養槽から培養液を抜き取り、マ
イクローザPW−103(平均孔径0.1μm、膜面積
0.2Td>を通し、菌体を含む液と菌体を含まない液
に分N(シ、菌体を含まない液即ちン戸液をラインから
連続的に抜き取った。この時、コックをしぼることによ
って炉液量を調節した。それと同時に液面51が動いて
、マイクロデユープポンプにより抜き取られたが液と同
体積の新鮮培地が本培養液に供給された。尚、ローラー
ポンプの流量ば4ON/h程度とし、また今回ラインの
容積に比べて本培養槽が小さいため、ン濾過ラインら含
めた培養液の客足は濾過開始時に回分培養時の600
ml、から800dに増やした。尚、2〜4時間おきに
培養液をサンプリングし0.D570値を測定後、ただ
ちに−20℃にストックして経時的なサンプルをtqる
とともに、1〜4時間おきにi戸液間を測定した。ス1
〜ツクした経時的な菌体培養液は、回分培養時のサンプ
ルもいっしょに、それぞれ遠心分焔器により菌体と上清
に分離した後(8,000〜13.00Orpm 5〜
10分間)、上清を採取して、グルコースとプロピオン
酸、酢酸の定量を行った。グルコースは、ソモギーネル
ンン法により、プロピオン酸、酢酸は、ガスクロマトグ
ラフィーにより定Gした。また、ビタミンB12は菌体
培養液をそのままサンプルとして、KCNにより熱抽出
を行った後、遠心分m (10,000〜15.000
rpn+5〜10分聞)して上清を採取し、シアン型に
変換した形のビタミンB12サンプルとした。ビタミン
B の定量は、ビタミンB12栄養認求性の大腸菌変異
株(Eshcrichia coli 215 )を宙
吊用菌株としてバイオアッヒイにより定量した。
■培養結果
上記のように培養を行った結果を第1表、第2表、第3
表及び第2図(a)、第2図(b)、第3図に示した。
表及び第2図(a)、第2図(b)、第3図に示した。
第1表、培N軒過にお番ノるO、Dfiiとン戸a吊・
O20値と乾燥菌体重量(11当りの乾菌重量の関係 0、D値×0.289 =乾燥菌体単回(!9/J) 69h後 乾燥菌体重量227g/fl第2表、培養液
中のグルコース、プロピオン酸、酢酸、濃度(g/J) ) 第3表、培養液中のビタミンB12(シアノコパラ
この結果から明らかなようにプロピオン義歯を中空糸型
マイクロフィルターモジュールを用いて濾過培養するこ
とによって、通常の回分培養によッテ19られる菌体8
1 (0,D570値で約10)の75倍以上(0,D
570値787)の高濃度な菌体温度にすることができ
、ビタミンB 12淵度も菌体潤度が高まるとともに、
増加して最終的には52.4m9/fl−brothを
得ルコトがテキタ。
O20値と乾燥菌体重量(11当りの乾菌重量の関係 0、D値×0.289 =乾燥菌体単回(!9/J) 69h後 乾燥菌体重量227g/fl第2表、培養液
中のグルコース、プロピオン酸、酢酸、濃度(g/J) ) 第3表、培養液中のビタミンB12(シアノコパラ
この結果から明らかなようにプロピオン義歯を中空糸型
マイクロフィルターモジュールを用いて濾過培養するこ
とによって、通常の回分培養によッテ19られる菌体8
1 (0,D570値で約10)の75倍以上(0,D
570値787)の高濃度な菌体温度にすることができ
、ビタミンB 12淵度も菌体潤度が高まるとともに、
増加して最終的には52.4m9/fl−brothを
得ルコトがテキタ。
ここで、このプロピオン義歯は、乾燥菌体1g当り約2
50μqのビタミンB12を含有していたが、高濃度菌
体になってもその邑は変わらなかった。
50μqのビタミンB12を含有していたが、高濃度菌
体になってもその邑は変わらなかった。
かくして本発明によればビタミンB12生産菌の高濃度
菌体を得、そしてビタミンB12を多量にしかも工業的
に容易に生産することができる。したがってさらに菌体
当りのビタミンB12含量の高い、言い換えれば菌体の
ビタミン812生産能の高い菌を高濃度培養すれば、さ
らに高濃度のビタミンB12を得ることができる。
菌体を得、そしてビタミンB12を多量にしかも工業的
に容易に生産することができる。したがってさらに菌体
当りのビタミンB12含量の高い、言い換えれば菌体の
ビタミン812生産能の高い菌を高濃度培養すれば、さ
らに高濃度のビタミンB12を得ることができる。
第1図は、本発明方法を実施するための装置の一例の系
統図、第2図(a)、(b)と第3図は実施例によって
得られた結果を示すグラフであり、第2図(a)は培養
時間とン戸液量との関係を示すグラフ、第2図(b)は
培養時間と菌体培養液の吸光度(0,0570)、グル
コース濃度、プロピオンM 6度、酢酸a度との関係を
示すグラフ、第3図は、培養時間と培養液中のビタミン
81212度、乾燥菌体濃度、乾燥菌体13当りのビタ
ミン812含けとの関係を示すグラフである。 第1図において、 1・・・培養槽、4・・・培養液、8・・・マグネット
スターラー、19・・・新鮮培地、24・・・l)H電
極、25・・・PI−1コントローラ、29・・・マイ
クロフィルターモジュール、34・・・炉液取り出しラ
イン、35・・・菌体含有液戻しライン。
統図、第2図(a)、(b)と第3図は実施例によって
得られた結果を示すグラフであり、第2図(a)は培養
時間とン戸液量との関係を示すグラフ、第2図(b)は
培養時間と菌体培養液の吸光度(0,0570)、グル
コース濃度、プロピオンM 6度、酢酸a度との関係を
示すグラフ、第3図は、培養時間と培養液中のビタミン
81212度、乾燥菌体濃度、乾燥菌体13当りのビタ
ミン812含けとの関係を示すグラフである。 第1図において、 1・・・培養槽、4・・・培養液、8・・・マグネット
スターラー、19・・・新鮮培地、24・・・l)H電
極、25・・・PI−1コントローラ、29・・・マイ
クロフィルターモジュール、34・・・炉液取り出しラ
イン、35・・・菌体含有液戻しライン。
Claims (1)
- ビタミンB_1_2を生産する微生物を培養槽内の液体
培地にて培養して高濃度菌体を得ることによつてビタミ
ンB_1_2を高濃度に生産する方法において、ビタミ
ンB_1_2生産菌がビタミンB_1_2以外の自己の
代謝産物によつて増殖が低下又は停止する前に、菌体を
含む培養液を連続的にろ過して微生物菌体を含む液と微
生物菌体を含まない液とに分離し、菌体を含む液は培養
槽内に返送し、菌体を含まない液を抜き取り、その抜き
取つた液と同体積の新鮮な液体培地をビタミンB_1_
2生産菌培養液に供給しつつろ過培養を続け、それによ
って前記ビタミンB_1_2 生産菌の高濃度菌体を得
、それによつて高濃度のビタミンB_1_2を生産する
ことを特徴とする、ビタミンB_1_2生産菌の高濃度
培養によるビタミンB_1_2の生産方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP61194880A JPH0638753B2 (ja) | 1986-08-20 | 1986-08-20 | 微生物の高濃度培養によるビタミンb▲下1▼▲下2▼の生産方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP61194880A JPH0638753B2 (ja) | 1986-08-20 | 1986-08-20 | 微生物の高濃度培養によるビタミンb▲下1▼▲下2▼の生産方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS6352888A true JPS6352888A (ja) | 1988-03-07 |
JPH0638753B2 JPH0638753B2 (ja) | 1994-05-25 |
Family
ID=16331852
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP61194880A Expired - Lifetime JPH0638753B2 (ja) | 1986-08-20 | 1986-08-20 | 微生物の高濃度培養によるビタミンb▲下1▼▲下2▼の生産方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH0638753B2 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2011036146A (ja) * | 2009-08-07 | 2011-02-24 | Toray Ind Inc | 連続培養による化学品の製造方法および製造装置 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS58146292A (ja) * | 1982-02-26 | 1983-08-31 | Nippon Oil Co Ltd | 醗酵法ビタミンb↓1↓2の製造方法 |
-
1986
- 1986-08-20 JP JP61194880A patent/JPH0638753B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS58146292A (ja) * | 1982-02-26 | 1983-08-31 | Nippon Oil Co Ltd | 醗酵法ビタミンb↓1↓2の製造方法 |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2011036146A (ja) * | 2009-08-07 | 2011-02-24 | Toray Ind Inc | 連続培養による化学品の製造方法および製造装置 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH0638753B2 (ja) | 1994-05-25 |
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
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