JPS6352888A - 微生物の高濃度培養によるビタミンｂ↓１↓２の生産方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の技術分野〕 本発明はビタミンＢ１２を生産１゛る微生物の高濃度菌
体培養を利用した新規なビタミンＢ１□生産法に関する
ものである。

〔従来技術とその問題点〕

ビタミンＢ１２は、炭水化物、脂肪、蛋白質、核酸など
の生体内代謝に必要な因子であり、また抗悪性貧血因子
として知られ悪性貧血の治療薬とされるなど、薬剤とし
ての利用が増大している。また、家畜、へどに対する医
薬または飼餌料添加剤としても広く利用され、益々その
重要性が高まってきている。

現在、ビタミンＢ１゜の工業的生産に関しては、ビタミ
ンＢ１２の構造が複雑であり、特に立体異性体が存在す
るために化学的合成がぎわめで困難なために、もっばら
微生物の働きを利用した醗酵生産法が行われている。そ
してその５ｌｊｌ生産法のほがとられている。ところで
、ビタミンＢ１２を生産する微生物のほとんどは、窒素
源、炭素源をはじめとする必要な栄養分をすべて満たし
た培地で最適な培養条件（温度、ＰＨ，（ＬＭ気度等）
をすべて満たした条件で培養すると、菌の菌体数が少な
い、即ち菌体９度が低いときには、ぞの菌の最大の増殖
速度で対数的に増殖するが、ある程度まで増殖すると、
増殖速度が遅くなり、ついには増殖が止まってしまう。

この理由はビタミンＢ１２生産菌が生育のために栄養分
を代謝して、その菌に特有な１つ或は２つ以上のビタミ
ンＢ１２以外の代謝産物を生成するが、この代謝産物の
培養液中での濃度が菌体増殖に伴なっである一定レベル
以上になると、その代謝産物によって増殖を阻害される
ためである。

かくして従来の回分培養法では、培養液中にある程度の
（１〜５　ｇｄｒｙｃｅｌｌ　／ｆＪ　−ｂｒｏｔｈ　
）菌体濃度しか１１られていない。また、ビタミンＢ１
２生産能の高い微生物のほとんどは、菌体内にビタミン
Ｂ１２を生成するため、従来のような回分培養法では、
ある程度の菌体濃度に対応したビタミンＢ１２しか生産
することができない。

しかしながら従来からの研究は、ビタミンＢ１２の生産
性を向上させるために、ビタミンＢ１２生産能の高い微
生物を見つけ出すとか細胞融合により作り出すこと或は
、培地や培養条件を検討していかにして効率よく微生物
菌体にビタミンＢ１２を生成させるかといったことのみ
が目的とされてきている。そこで本発明者らは、濾過を
伴う培養法によりビタミンＢ１２生産菌を高濃度に培養
しビタミンＢ１゜の生産性を飛躍的に向上させ得ること
に岩目し本発明をなすに至った。

（発明の概要） 本発明では、ビタミンＢ１２生産菌のビタミンＢ１２以
外の代謝産物（菌体外に生成される）の培養液中での濃
度が一定レベル以上にならないようにしつつビタミンＢ
１２生産菌の高濃度菌体を得、そしてビタミンＢ１２を
多量にしかも工業的に容易に生産しようとするものであ
り、本発明者らの研究、実験によれば、菌の増殖を阻害
する代謝産物（菌体外に生成される）の培養液中での濃
度が上がらないようにするため、増殖を続ける菌体を含
む培養液を連続的に中空糸型マイクロフィルターモジュ
ール或はセラミック等の１戸材を通すことによって、ｉ
濾過して菌体を含む液と菌体を含まない液とに分離し菌
体を含む液は、培養槽内に返送し代謝産物が溶けこんで
いる後者の液を取出し、新鮮な培地を供給、補充するこ
とによってビタミンＢ１２生産菌の高濃度菌体が１９ら
れることが見出された。

これによってビタミンＢ１２生産菌の高濃度菌体培養液
中に高濃度のビタミンＢ１２が得られたわけであるが、
さらに前記のようなｉ濾過を伴う培養を続けると同時に
、ビタミンＢ１２生産菌の高濃度菌体培養液を菌体を含
まない１戸液とは別に、新たに連続的に広き取り、それ
と同体積の新鮮培地を新たに連続的に追加供給すれば、
広き取ったビタミンＢ１２生産菌の高濃度菌体培養液よ
り高濃度のビタミンＢ１２を連続的に採取することがで
きる。ここで高濃度菌体を抜き取った分だけ菌体濃度は
、希釈されるわけであるが、ｉ濾過により増殖阻害の原
因である代謝産物は、除かれているため、菌体が増殖を
続けられるので、増殖速度と平衡したレベルの希釈率で
高濃度菌体培養液を採取することができる。

つまりこの方法によれば、高濃度のビタミンＢ１２を連
続的に採取することができることによってビタミンＢ１
２の飛躍的な生産性向上が実現できるばかりか、生産設
備を小規模化、連続生産化できるなど、省エネルギーの
観点からも極めて有効なビタミンＢ１２生産を実現する
ことができる。

よって本発明は、ビタミンＢ１２生産菌を培養槽内で液
体培地にて培養して高′ａ度国体を生成する方法におい
て菌体を含む培養液を増殖が低下又は停止する前に連続
的に中空糸型マイクロフィルターモジュール或はセラミ
ック等の炉材を通して枦過してビタミンＢ１゜生産菌体
を含む液とビタミンＢ１２生産菌体を含まない液とに分
離し菌体を含む液は培養槽内に返送し、菌体を含まない
液を抜き取り、その扱き取った液と同体積の新鮮な液体
培地をビタミンＢ１２生産菌培養液に供給しつつろ過培
養を続け、それによってビタミン”１２生産菌のｉｒ′
ｆｌＩ１１度菌体を１７、ざらに前記のようなｉ濾過を
伴う培養を続けつつ、得られたビタミンＢ１２を高濃度
に含有するビタミン８１２生産菌の高濃度菌体培養液を
菌体を含まない炉液とは別に新たに連続的に抜き取り、
それと同体積の新鮮培地を新たに連続的に追加供給する
ことによって、抜き取ったビタミンＢ１２生産菌の高濃
度菌体培養液から連続的に高濃度のビタミンＢ１２を生
産することを特徴とするビタミンＢ１２の生産方法を提
供するものである。

〔発明の詳細な説明〕

本発明について更に詳細に説明する。

本発明方法は、ビタミンＢ１２生産能の高い微生物を対
照とするものであり、ビタミンＢ１□生産菌としては主
に細菌、放線菌が知られており具体的には、プロピオニ
バクテリウム属、スｌ−レブトミセス属、ミクロモノス
ポラ属、シュードモナス属、ノカルジア属、コリネバク
テリウム属、クロスミルリジウム属、ブチリバクテリウ
ム屈、ミクロコツカス属、アースロバフタ−属、パラコ
ツカス属、バチルス属、プロタミノバクタ−属、ロドシ
ュードモナス属などが代表的な菌としてあげられる。

これらのビタミンＢ１２生産菌の培養に用いられるｊ８
地としては、窒素源、炭素源をはじめとするビタミンＢ
１２生産菌の増殖に必要な栄養分を満たした培地ならば
任意であるが、ビタミンＢ１２生産のために少量のコバ
ルト塩（ＧＯＣＩ２−６Ｈ２０或は、ＣＯＳ　０４−７
１−１２０　）を加える。

また通常液体培地が用いられ、対象とするビタミンＢ１
２生産菌によって適宜組成の培地が選択、使用される。

本発明ではこのようなビタミンＢ１２生産菌を培地で培
養するに際し、増殖を続ける菌体を含む培養液を適当な
炉材により濾過しつつ培養するのであるが、かかるン濾
過培養を行うに当って、まず前培養、菌接種、Ｐ　Ｈコ
ントロール回分培養を行う。

以下類に説明する。

まずビタミンＢ１２生産菌を予め滅菌した上述の如き液
体培地で、最適条件下において回分Ｊｇ′ｆ！ｉシ、こ
れを本発明の培養（本培養）のための前ｊ８養として初
発の接種菌を得る。

次に本培養槽に同様な液体培地を入れ滅菌した後、そこ
に前培養した菌を接種する。このとき前培養液をそのま
ま添加してもよいが、必要ならば、前培養液を無菌的に
遠心力にＩ器にかけ、８．０００〜１３．００Ｏｒｐｍ
で３〜１０分間遠心分離して集菌しその集菌した菌体を
予め滅菌した新鮮な同種培地に懸濁して本培養槽培地に
添加する。その時に本培養液の初光菌体温度は、ごく少
なくてよいが、望ましくは、菌体を含む培養液の５７０
ｎｍにおける吸光度（濁度）っまりＯ，Ｄ（＝Ｏｐｔｉ
ｃａｌ　Ｄｅｎｓｉｔｙ　）　５７０　＊で０．０１〜
０．３程度とするのがよい。尚培養液中の実際の菌体温
度は通常この吸光度から求められる。即ち菌体を含む液
の吸光度を測定して、前記０．０５７ＣＮｆｆｌを求め
、その値から一定の数式を用いて一定液吊中の乾燥菌体
重量を知ることができるが、一般には前記○、Ｄ５７０
値自体により間接的に菌体濃度レベルが表わされる。

本培養槽に菌を接種したならば、温度、Ｐ　ｌ−１。

嫌気度等を最適条件に維持しつつ本培養を行なう。

たとえば本培養槽をジャケット型にしてジャケット槽に
最適な温度の恒温水を循環させて最適な温度条件に維持
したり、また、アンモニア水や水酸化ナトリウム等のア
ルカリ液や塩酸等の酸液を自動的に滴下して最適なＰ　
Ｈ条件に維持するＪ：うにする。また菌体が沈殿しない
よう適量な速度で液を攪拌したり、通性嫌気性菌の場合
は、適量の無菌窒素ガスを供給して通性嫌気状態に保ち
、偏性嫌気性菌の場合には、気密な培養槽に無菌窒素ガ
スを通気して培養槽内を陽圧に保ちながら、徐々に排気
して嫌気状態を保つ必要がある。また好気性菌の場合に
は無菌空気、必要ならば酸素ガスを培養液中に通気して
好気状態が保たれるようにする。

上述のように本培養槽で培養していくと、ビタミンＢ１
２生産菌は、最大の増殖速度で対数的に増殖し続けてい
くが、ある程度の菌体１１度レベルに達するとビタミン
８１２以外の自己の代謝産物（菌体外に生成する）によ
り増殖が阻害されて菌体の増殖速度が漸次低下し、遂に
は増殖が止まってしまう。そのレベルはたとえばプロピ
オン酸菌では０、Ｄ５７０値１０程度である。このよう
なレベルはそれぞれのビタミンＢ１２生産菌について予
め回分培養により調べておくのが好ましい。

本発明では、このように培養を続けていき、増殖が低下
又は停止する前、望ましくは直前に、つまり対数増ＩＭ
後期に本培養槽内の培養液を２戸材に連続的に供給して
ｉ濾過する操作を開始する。そして、ン戸材としては、
中空糸（ホローファイバー）型マイクロフィルターモジ
ュール 材等が考えられるが、特に中空糸（ホローファイバー）
型マイクロフィルターモジュールを用いるのが好ましい
。これは、菌体が通れないほどの小さくシャープな孔径
分布をもつ合成樹脂製の精密ン濾過膜（マイクロフィル
ター）からなる中空糸状精密ｉ濾過膜を多数本、接着剤
によりモジュールケースに一体構造に固定したものであ
り、使用時は、中空糸膜の中空部に液体を圧送し、中空
糸膜内表面に対して原液を平行に流す、いわゆるクロス
フロ一方式によるン濾過を行なうものである。

このような中空糸状型マイクロフィルターモジュールと
しては、例えば旭化成工業四から市販されているマイク
ローザ（ＨＩＣＲＯＺＡ　）　ＰＷ　−　３　０　３、
ＰＷ−１０３を用いることができる。これらのポリオレ
フィン中空糸は内径数Ｍ以下の中空膜でつくられ、平均
孔径０．１μｍである。８０℃の温度に耐えられ、又ｐ
Ｈ１〜１４の範囲で使用可能であり耐薬品性も良好であ
る。ポリプロピレン中空糸、ハロゲン化炭化水素とポリ
オレフィンとの共ｍ合体系中空糸も使用することができ
る。使用される膜の平均孔径中０．０５ないし１μｍ径
のも、のを使用するのがよい。

このように増殖速度が低下するか増殖が止まる前に本培
ｆｓ槽の増養液を前記のような中空糸状型マイクロフィ
ルターモジュールに供給してン濾過して菌体を含む液と
菌体を含まない液とに分離し、菌体を含む液は本培￥ｋ
Ｗｉ内に返送し、菌体を含まない液、即ち増殖阻害の原
因となる代謝産物を含む液を順次扱き取る。そして抜き
取った液と同じ体積の新鮮な液体培地を連続的に培養槽
に供給して、増殖阻害を受けることなく更にン濾過培養
を続行することができる。

これによって菌体は代謝産物による阻害を受けることな
く最大の増殖速度で対数的に増殖を続けて高２＋１度の
菌体を得ることができる。しかし菌体濃度が高まれば高
まる程抜き取るが液の聞を多くする。いいかえれば新鮮
な培地による希釈率を高くすることが必要である。そう
しなければ代謝産物濃度があがりすぎ、その時点で増殖
が止まってしまうからである。そのためｉ濾過開始時は
１戸液を抜き取る格は、受石でよいが、濾過培養が進む
につれて段階的に望ましくは連続的にその炉液汰き取り
量を多くしていくよう注意することが必要である。ここ
で、上述のように本発明で用いる中空糸状型マイクロフ
ィルターモジュールは、その膜面積がモジュール体積に
比べて非常に大きいため、他の種類のマイクロフィルタ
ーに比して濾過能力にすぐれ、このように連続的にか過
を行っても培養液の全体積とモジュール膜表面積の比が
）８当であれば、常に良好にン濾過して段階的又は連続
的にか液を増加させるに十分な母の１戸液を扱き取るこ
とができる。

このようにしてン濾過培養を続ければ、菌体は対数的に
増殖し続け、物理的な限界まで高濃度になる。たとえば
プロピオン酸菌では従来の回分培養法の少くとも５０倍
以上にも達する高濃度の菌体培養液を１ワることができ
る。そこでこのようにしてビタミンＢ１２生産菌の高濃
度菌体培養液が得られたら、さらにろ過培養を続けつつ
得られたビタミン８１２を高濃度に含有するビタミン８
１２生産菌の高濃度菌体培養液をン戸液とは別に連続的
に扱き取り、それと同体積の新鮮培地を連続的に追加供
給することによって抜き取ったビタミンＢ１２生産菌の
高濃度菌体培養液から連続的に高濃度のビタミンＢ１２
を生産することができる。

次に本発明の培養法を実施するための装置の一例を図面
第１図に示す。第１図について説明すると、１がガラス
製で二重栖になっている培養槽で、外側のジャケット部
分２に一定温度の恒温水３を循環させて内部の培養液４
を一定温度に保つようにする。蓋５の部分はステンレス
製で容器との間にシリコンゴム製のバッキング６が入れ
てあり、蝶ねじ７で締め付けて気密性にし雑菌汚染を防
ぐようにしである。この培養槽１はマグネチックスター
シー８上に載せられてＪ５す、培養槽１内底部のマグネ
ットチップ９を回転せしめて培養液４を攪拌するように
する。

１０は、嫌気性菌を培養する場合には窒素ガスを、好気
性菌の場合には、空気又はＭ素ガスをエアフィルター１
１を通して無菌的に培養液４中に供給するラインであり
、その先端には金魚飼育用の泡立具１２を取むけておく
、１３は通気した前記ガスを排気するためのラインであ
りこの先にトラップを付けて雑菌汚染を防止する。１４
は培養液中に常に入っているように設けられている液面
計の片方の接点でありステンレス棒でよい。又１５は培
養液面に設定された液面胴のもう一方の接点であり、こ
れもステンレス棒でよい。

１６は恒温水槽１７の恒温水３に浸漬された容器１８に
充填された供給用新鮮培地１つを培養液４に供給するた
めのラインであり、ン濾過によりか液が抜き取られ液面
が低下して１）を閉接点１５が液面から離れると液面計
２０が働いてマイクロチューブポンプ２１を動かして新
鮮培地１９を培養液４に供給するようにする。

２２はＰＩ−１コントロールのためのアルカリ液又は酸
液２３を培養液４に供給するためのラインであり、培養
液４のＰ）−１が一定値にり低下又警ま上胃するとＰ　
Ｈｆｆ１ｆｆｉ極２４に接続しているＰ　Ｈコント１コ
ーラ−２５が働いて、ペリスタポンプ２６を動かして上
記アルカリ液又は酸液２３が培養液４に供給される６２
７はサンプルを取り出すためのラインである。

２８は培養槽１の下方側部に設けられた、培養液４を抜
き出し、中空糸型マイクロフィルターモジュール２９に
、その一端部開口３０から供給するためのラインであり
、ここにローラーポンプ３１、流量計３２、圧力計３３
が設けられている。

３４はモジュール２９の側部開口３５に接続されたか液
取り出しラインであり、電磁弁３６、ｉ戸液調節コック
３７が設けられ、モジュール２９の他端間口３８には、
そこから取り出した液を培養槽１に戻１゛ためのライン
３９が接続される。このライン３９には圧力計４０とボ
ールバルブ４１が設けられている。電磁弁３６は、ライ
ン４２により窒素ガスボンベ（図示せず）に接続されて
いる。

４３はライン４４により恒温水槽１７から恒温水３を培
養液ＷＪ１のジャケット部２に供給するための循環ポン
プを示す。各ラインはシリコンゴムでつくられる。

このような装置をセットして作動するときは、恒温水３
をジャケット２に流し又ＰＨ主電極４で測定されたＰ　
ｌ−１の値によりアルカリ液又は酸液２３を添加し、マ
グネチツクスターラ−８を働かせて培養液４を攪拌し、
必要によりライン１０より無菌窒素ガス或は無菌空気、
酸素を供給する等により培養液を夫々に最適の温度、Ｐ
Ｈ１嫌気度等に保らながら培養を続け、必要の都度ライ
ン２７よりサンプルを採取してその吸光度を測定する。

その吸光度が予め測定されている増殖明害を起こず値に
近くなったらローラーポンプ３１を働かしてライン２８
を経て培養液４を中空糸型マイクロフィルターモジュー
ル２９に供給してｉ濾過する。ン濾過された菌体を含ま
ない、そして代謝産物を含んでいる液０戸液）は、ライ
ン３４から取り出され、一方菌体を含む液はライン３９
を経て培養槽１に戻される。

培養液４が扱き取られて液面が低下するとマイクロチュ
ーブポンプ２１が働いて供給用新鮮培地１９がライン１
６を経て培養槽１に供給される。

液面が液面計の接点１５に達するとぞの供給は停止され
常に抜き取られたのと同体積の斬負工培地１つが、培養
槽１に供給されてン濾過培養（よ続行される。その際炉
液調節コック３７を操作することによって、ン濾過開始
時の炉液抜き取り伍を少なく、漸次段階的又は連続的に
抜き取り量を多くするよう調整する。しかし菌体濃度が
非常に高まってくると、思うようにン戸液量を取れなく
なる場合も考えられるので、その時にはローラーポンプ
３１の流量を上げてモジュール２９の中空糸内の培養液
の流速を上げるとか、ライン３９のボールバルブ４１を
しぼって圧力をかけるなどしてか液量を上げることがで
きる。尚上記モジュール２９は、マイクローザＰＷ１０
３の場合、通常約２気圧の圧力まで耐えることができる
。

濾過が進行してモジュール２９の中空糸膜に菌体が付着
するに至った時はその外側から内側に圧力をかけて取除
く。この場合もモジュール２９の耐えつる圧力まで圧力
をかけることができる。その際は［ｉ弁３６をタイマー
につなげて一定時間間隔で一定時間（約１秒程度）電磁
弁３６によりライン３４を閉じて、ライン４２より窒素
ガスを加えてガス圧がかかるようにする。勿論通常は窒
素ガスライン４２は閉じてン戸液抜き取りライン３４が
開いている。

尚、中空糸型マイクロフィルターを使用するときは、培
養液を通す前に予め０．３％次亜塩素酸ナトリウム水溶
液を通して洗浄、滅菌した後、滅菌水と滅菌済の８０℃
熱水を通して次亜塩素酸ナトリウムを洗い流しておくの
がよい。又再使用するときは、前に使用した直後に水に
より十分に菌体を洗い出した後、同様に０．３％次亜塩
素酸ナトリウム水溶液により中空糸膜に付着した菌体を
滅菌し溶菌させて溶かして洗浄しておくのが好ましい。

又本培養槽は蓋又はライン接続部を気密性にして雑菌汚
染しないようにする。またここに用いたマイクロチュー
ブポンプ２１、ペリスタポンプ２６、ローラーボン７３
１等は、回転ローラーがシリコンチューブを圧搾するこ
とによってチューブ内の液体（ガス）に嬬動作用を発生
させることを原理としたポンプであるのでチューブ内の
培養液を外気にふれさせることがなく、雑菌汚染の心配
がない。このようなポンプを使用することなどによって
本発明方法を雑菌汚染の懸念な〈実施することができる
。

尚、高濃度菌体が得られた後、高濃度菌体培養液を連続
的に採取する場合は、図には示していないが、培養槽１
に新たに培養液４（高濃度菌体になっている）の扱き取
りラインを設けて、Ｄ−ラーボンブにより一定量を抜き
取るようにずればよい。この時培養液は減少するわ：す
だが、液面３１が働いて自動的に新鮮培地が供給される
ため、培養液量は常に一定に保つことができる。

〔実施例〕

菌株；　Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　Ｓｈｅ
ｒｍａｎｉｉ培地組成；ポリペプトン１％、Ｐ？ｉ母エ
生エキス０％、グルコース２％、 Ｋ２ＨＰＯ４０，０５％、 Ｃｏ　Ｓ　０　　・７　Ｈ２０１５ｐＤＩＰＨ６，５ ■前培養 １Ｂ威容試験管２本にそれぞれ培地１０Ｉｌｔｅづつ入
れ綿栓後、オートクレーブにて１２１℃１５分間滅菌（
グルコースは別滅菌した）後、菌を接種し３０’Ｃ恒温
水槽で２４時間静置培養した。

■菌接種 本培養槽に培地６００ｄを入れ、予め本培養槽にヒツト
したシリコンチューブライン等も含めてＪ−トクレーブ
にて１２１℃１５分間滅菌した。

（グルコースは別滅菌した）その後、前培Ｎ液をそのま
ま、本培養槽中の培地に添加し、菌を接種した。

■Ｐ　Ｈコントロール回分培養 本培養槽中の培地に菌を接種したら、ただちに培養液を
３０℃に保ち、窒素ガスを通気し、攪拌（１００ｒｐｍ
）を始めた。またＰＨコントローラーを働かせて、ＰＨ
６，５に保つようにした。予めＰＨコントロール回分培
養を３５時間行った結果より、この菌は、回分培養２７
〜３０時間後、０．０５７０値７〜１０で自己の代謝産
物であるブ０ピオン酸及び酢酸によって増殖３１害を受
は始めることがわかっているので、２７時時間　Ｈコン
トロール回分培養を行った後、濾過培養を開始した。尚
、培養中３〜８時間おきに培養液をサンプリングして、
Ｏ，Ｄ５７０値を測定後、ただちに−２０℃にストック
して経時的なサンプルとした。

※本培養槽のラインの先端部分（濾過ラインや新鮮供給
培地との接続部分）は、ピンチコックあるいは、スクリ
ューコックにより完全に締め、雑菌汚染しないようにし
た。

■ン濾過培養準備 濾過培養が開始される前に予め供給用の新ｉ￥培地１Ｏ
Ｎを５本のガラス容器にそれぞれ入れ、１２１℃１５分
間オートクレーブ滅菌（グルコースは別滅菌）した後、
１本は３０℃恒温水槽に入れて３０℃に保っておいた。

また中空糸型マイクロフィルターモジュールとしては、
旭化成工業製マイクローザＰＷ−１０３を使用した。マ
イクローザＰＷ−１０３は、予め０．３％の次亜塩素酸
ナトリウム水溶液を通して滅菌、洗浄した後、滅菌水及
び滅菌済みの８０℃熱水で次亜塩素酸ナトリウムを洗い
流しておいたものを使用した。

■ン濾過培養開始 Ｐｌ−１コントロ一ル回分培養により２７時間培養した
なら、本坊ｆＨｆｆに取り付けであるｒ濾過ラインとマ
イクローザＰＷ−１０３を接続し、新鮮培地供給ライン
等が過培養に必要なすべてのラインを接続し、ローラー
ポンプを作動させて本培養槽から培養液を抜き取り、マ
イクローザＰＷ−１０３（平均孔径０．１μｍ、膜面積
０．２Ｔｄ＞を通し、菌体を含む液と菌体を含まない液
に分Ｎ（シ、菌体を含まない液即ちン戸液をラインから
連続的に抜き取った。この時、コックをしぼることによ
って炉液量を調節した。それと同時に液面５１が動いて
、マイクロデユープポンプにより抜き取られたが液と同
体積の新鮮培地が本培養液に供給された。尚、ローラー
ポンプの流量ば４ＯＮ／ｈ程度とし、また今回ラインの
容積に比べて本培養槽が小さいため、ン濾過ラインら含
めた培養液の客足は濾過開始時に回分培養時の６００　
ｍｌ、から８００ｄに増やした。尚、２〜４時間おきに
培養液をサンプリングし０．Ｄ５７０値を測定後、ただ
ちに−２０℃にストックして経時的なサンプルをｔｑる
とともに、１〜４時間おきにｉ戸液間を測定した。ス１
〜ツクした経時的な菌体培養液は、回分培養時のサンプ
ルもいっしょに、それぞれ遠心分焔器により菌体と上清
に分離した後（８，０００〜１３．００Ｏｒｐｍ　５〜
１０分間）、上清を採取して、グルコースとプロピオン
酸、酢酸の定量を行った。グルコースは、ソモギーネル
ンン法により、プロピオン酸、酢酸は、ガスクロマトグ
ラフィーにより定Ｇした。また、ビタミンＢ１２は菌体
培養液をそのままサンプルとして、ＫＣＮにより熱抽出
を行った後、遠心分ｍ　（１０，０００〜１５．０００
ｒｐｎ＋５〜１０分聞）して上清を採取し、シアン型に
変換した形のビタミンＢ１２サンプルとした。ビタミン
Ｂ　の定量は、ビタミンＢ１２栄養認求性の大腸菌変異
株（Ｅｓｈｃｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　２１５　）を宙
吊用菌株としてバイオアッヒイにより定量した。

■培養結果 上記のように培養を行った結果を第１表、第２表、第３
表及び第２図（ａ）、第２図（ｂ）、第３図に示した。

第１表、培Ｎ軒過にお番ノるＯ、Ｄｆｉｉとン戸ａ吊・
Ｏ２０値と乾燥菌体重量（１１当りの乾菌重量の関係 ０、Ｄ値×０．２８９ ＝乾燥菌体単回（！９／Ｊ） ６９ｈ後　乾燥菌体重量２２７ｇ／ｆｌ第２表、培養液
中のグルコース、プロピオン酸、酢酸、濃度（ｇ／Ｊ） ）　第３表、培養液中のビタミンＢ１２（シアノコパラ
この結果から明らかなようにプロピオン義歯を中空糸型
マイクロフィルターモジュールを用いて濾過培養するこ
とによって、通常の回分培養によッテ１９られる菌体８
１　（０，Ｄ５７０値で約１０）の７５倍以上（０，Ｄ
５７０値７８７）の高濃度な菌体温度にすることができ
、ビタミンＢ　１２淵度も菌体潤度が高まるとともに、
増加して最終的には５２．４ｍ９／ｆｌ−ｂｒｏｔｈを
得ルコトがテキタ。

ここで、このプロピオン義歯は、乾燥菌体１ｇ当り約２
５０μｑのビタミンＢ１２を含有していたが、高濃度菌
体になってもその邑は変わらなかった。

〔効　果〕

かくして本発明によればビタミンＢ１２生産菌の高濃度
菌体を得、そしてビタミンＢ１２を多量にしかも工業的
に容易に生産することができる。したがってさらに菌体
当りのビタミンＢ１２含量の高い、言い換えれば菌体の
ビタミン８１２生産能の高い菌を高濃度培養すれば、さ
らに高濃度のビタミンＢ１２を得ることができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明方法を実施するための装置の一例の系
統図、第２図（ａ）、（ｂ）と第３図は実施例によって
得られた結果を示すグラフであり、第２図（ａ）は培養
時間とン戸液量との関係を示すグラフ、第２図（ｂ）は
培養時間と菌体培養液の吸光度（０，０５７０）、グル
コース濃度、プロピオンＭ　６度、酢酸ａ度との関係を
示すグラフ、第３図は、培養時間と培養液中のビタミン
８１２１２度、乾燥菌体濃度、乾燥菌体１３当りのビタ
ミン８１２含けとの関係を示すグラフである。 第１図において、 １・・・培養槽、４・・・培養液、８・・・マグネット
スターラー、１９・・・新鮮培地、２４・・・ｌ）Ｈ電
極、２５・・・ＰＩ−１コントローラ、２９・・・マイ
クロフィルターモジュール、３４・・・炉液取り出しラ
イン、３５・・・菌体含有液戻しライン。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. ビタミンＢ＿１＿２を生産する微生物を培養槽内の液体
   培地にて培養して高濃度菌体を得ることによつてビタミ
   ンＢ＿１＿２を高濃度に生産する方法において、ビタミ
   ンＢ＿１＿２生産菌がビタミンＢ＿１＿２以外の自己の
   代謝産物によつて増殖が低下又は停止する前に、菌体を
   含む培養液を連続的にろ過して微生物菌体を含む液と微
   生物菌体を含まない液とに分離し、菌体を含む液は培養
   槽内に返送し、菌体を含まない液を抜き取り、その抜き
   取つた液と同体積の新鮮な液体培地をビタミンＢ＿１＿
   ２生産菌培養液に供給しつつろ過培養を続け、それによ
   って前記ビタミンＢ＿１＿２　生産菌の高濃度菌体を得
   、それによつて高濃度のビタミンＢ＿１＿２を生産する
   ことを特徴とする、ビタミンＢ＿１＿２生産菌の高濃度
   培養によるビタミンＢ＿１＿２の生産方法。