JPH072113B2 - 高温性細菌アシドサームス・セルロリティクスからの熱安定性精製エンドグルカナーゼ - Google Patents
高温性細菌アシドサームス・セルロリティクスからの熱安定性精製エンドグルカナーゼInfo
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- JPH072113B2 JPH072113B2 JP2513175A JP51317590A JPH072113B2 JP H072113 B2 JPH072113 B2 JP H072113B2 JP 2513175 A JP2513175 A JP 2513175A JP 51317590 A JP51317590 A JP 51317590A JP H072113 B2 JPH072113 B2 JP H072113B2
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
- C12N9/2437—Cellulases (3.2.1.4; 3.2.1.74; 3.2.1.91; 3.2.1.150)
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01004—Cellulase (3.2.1.4), i.e. endo-1,4-beta-glucanase
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
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- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
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- Biomedical Technology (AREA)
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Description
【発明の詳細な説明】 ユナイテッド ステイツ デパートメント オブ エナ
ージとミッドウエスト リサーチ インスティチュート
との間の契約No.DE-AC02-83CH10093に従って、この発明
についての権利はアメリカ合衆国が所有する。
ージとミッドウエスト リサーチ インスティチュート
との間の契約No.DE-AC02-83CH10093に従って、この発明
についての権利はアメリカ合衆国が所有する。
技術分野 この発明は一般的には、アシドサームス・セルロリティ
クス（Acidothermus cellulolyticus）が生産するエン
ドグルカナーゼの精製方法に関し、更に詳しくは、細菌
であるアシドサームス・セルロリティクスから得られる
セルラーゼ酵素複合体から高分子量および２種の低分子
量のエンドグルカナーゼを精製するための精製技術に関
するものである。この細菌は、アメリカン タイプ カ
ルチュアー コレクション（ATCC）に寄託番号43068で
寄託されている。
クス（Acidothermus cellulolyticus）が生産するエン
ドグルカナーゼの精製方法に関し、更に詳しくは、細菌
であるアシドサームス・セルロリティクスから得られる
セルラーゼ酵素複合体から高分子量および２種の低分子
量のエンドグルカナーゼを精製するための精製技術に関
するものである。この細菌は、アメリカン タイプ カ
ルチュアー コレクション（ATCC）に寄託番号43068で
寄託されている。
従来技術 セルロースは、多数のグルコース分子が共有結合した不
溶性長鎖からなっており、かような不溶性長鎖の状態で
はあまりに巨大すぎてヒトや動物の細胞壁を通って移動
することができない。しかし、カビや細菌といった微生
物の作用で、セルラーゼとして周知の酵素が分泌され、
これらの酵素がセルロースをその単量体成分であるグル
コースに加水分解または解重合する。グルコースは、細
胞壁を通して容易に移動されて代謝される糖である。
溶性長鎖からなっており、かような不溶性長鎖の状態で
はあまりに巨大すぎてヒトや動物の細胞壁を通って移動
することができない。しかし、カビや細菌といった微生
物の作用で、セルラーゼとして周知の酵素が分泌され、
これらの酵素がセルロースをその単量体成分であるグル
コースに加水分解または解重合する。グルコースは、細
胞壁を通して容易に移動されて代謝される糖である。
セルラーゼは酵素複合体であり、３種類の異なる酵素、
すなわちエンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼおよ
びセロビアーゼを含んでいる。セルロースをグルコース
まで完全に解重合するためには、これら３種類の酵素の
相乗作用が必要となる。
すなわちエンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼおよ
びセロビアーゼを含んでいる。セルロースをグルコース
まで完全に解重合するためには、これら３種類の酵素の
相乗作用が必要となる。
相乗的反応は、複合体中３種類の酵素成分の間の連続的
かつ共同的な作用の結果生ずるものであり、１つの酵素
反応の生成物が次の酵素の基質となる。
かつ共同的な作用の結果生ずるものであり、１つの酵素
反応の生成物が次の酵素の基質となる。
セルロース分解能を有する微生物として多くの微生物が
分類されているが、ある条件下で結晶性セルロースを効
果的に解重合せしめる完全なセルラーゼ複合体を生成す
るのは数種である。不完全菌類の一般的な土壌真菌であ
るトリコデルマ・レセイ（Trichoderma reesei）（Simm
ons,E.G.,1977,Abst.Ind.Mycol.Cong.,p.618）は、セル
ロース分解能を有する微生物の１つであるが、セロビア
ーゼのmM当り最大活性に対するパーセントは極めて限定
されており、このセルラーゼは高温範囲に曝されるとあ
まり安定でない。このトリコデルマ・レセイの酵素につ
いては生化学的研究がかなりなされているが（Shoemake
r,S.P.and R.D.Brown,1978,“T.virideから生成された
エンド‐1,4-β‐D-グルカナーゼEC-3.2.1.4"Biochim,B
iophys.Acta.523,1,pp.133-146）、これらの酵素は高温
下で安定であるとは示されていない。例えば、野性型の
トリコデルマ・レセイは、総活性に対しては45℃の最適
温度で、エンドグルカナーゼ活性に対しては55℃の最適
温度でセルラーゼ酵素を分泌することが知られている。
しかし60℃で約１時間おくと、このトリコデルマ・レセ
イからのセルラーゼはその総活性の半分を失う。種々の
微生物により生成されるセルラーゼは、米国特許第3,23
2,832号（リゾプス）、第3,398,055号（トリコデルマ・
ビリジATCC 16425;およびその他のカビ類）、第3,438,8
64号（真菌類カビATCC 16425）、第3,677,899号、およ
び第3,734,831号に記載されている。しかしながら、ト
ルコデルマ・ビリジから得られたセルラーゼは、市販さ
れている他のセルラーゼよりもC1酵素活性が高いことが
知られているが、それらの酵素反応の最適温度は約50℃
であるという欠点を有している（Mandels,et al.“セル
ラーゼおよびそれらの応用"ACS,Vol.95,pp.398-411（19
69））。米国特許第4,081,328号には、カビであるチオ
ラビア・テレストリス（Thiolavia terestris）（NRRL
8126）により生成され、C1およびCxタイプのセルロース
分解能を有する熱安定性セルラーゼが開示されている。
この熱安定性セルラーゼ調製物は約60℃から約70℃（14
0〜160°Ｆ）の温度でC1およびCxタイプのセルロース分
解能を有している。
分類されているが、ある条件下で結晶性セルロースを効
果的に解重合せしめる完全なセルラーゼ複合体を生成す
るのは数種である。不完全菌類の一般的な土壌真菌であ
るトリコデルマ・レセイ（Trichoderma reesei）（Simm
ons,E.G.,1977,Abst.Ind.Mycol.Cong.,p.618）は、セル
ロース分解能を有する微生物の１つであるが、セロビア
ーゼのmM当り最大活性に対するパーセントは極めて限定
されており、このセルラーゼは高温範囲に曝されるとあ
まり安定でない。このトリコデルマ・レセイの酵素につ
いては生化学的研究がかなりなされているが（Shoemake
r,S.P.and R.D.Brown,1978,“T.virideから生成された
エンド‐1,4-β‐D-グルカナーゼEC-3.2.1.4"Biochim,B
iophys.Acta.523,1,pp.133-146）、これらの酵素は高温
下で安定であるとは示されていない。例えば、野性型の
トリコデルマ・レセイは、総活性に対しては45℃の最適
温度で、エンドグルカナーゼ活性に対しては55℃の最適
温度でセルラーゼ酵素を分泌することが知られている。
しかし60℃で約１時間おくと、このトリコデルマ・レセ
イからのセルラーゼはその総活性の半分を失う。種々の
微生物により生成されるセルラーゼは、米国特許第3,23
2,832号（リゾプス）、第3,398,055号（トリコデルマ・
ビリジATCC 16425;およびその他のカビ類）、第3,438,8
64号（真菌類カビATCC 16425）、第3,677,899号、およ
び第3,734,831号に記載されている。しかしながら、ト
ルコデルマ・ビリジから得られたセルラーゼは、市販さ
れている他のセルラーゼよりもC1酵素活性が高いことが
知られているが、それらの酵素反応の最適温度は約50℃
であるという欠点を有している（Mandels,et al.“セル
ラーゼおよびそれらの応用"ACS,Vol.95,pp.398-411（19
69））。米国特許第4,081,328号には、カビであるチオ
ラビア・テレストリス（Thiolavia terestris）（NRRL
8126）により生成され、C1およびCxタイプのセルロース
分解能を有する熱安定性セルラーゼが開示されている。
この熱安定性セルラーゼ調製物は約60℃から約70℃（14
0〜160°Ｆ）の温度でC1およびCxタイプのセルロース分
解能を有している。
現在、トリコデルマ種から得られる45〜50℃近くの最適
温度を有する中温性セルラーゼ（Mandels and Weber,19
69,“セルラーゼの製造"Advan.Chem.Ser.,Vol.95,pp.39
1-414）が工業的に使用されているが、中温性セルラー
ゼの工業的使用はプロセス流を冷却するための高価な冷
却を必要とし、日和見微生物による汚染の可能性が増大
する。
温度を有する中温性セルラーゼ（Mandels and Weber,19
69,“セルラーゼの製造"Advan.Chem.Ser.,Vol.95,pp.39
1-414）が工業的に使用されているが、中温性セルラー
ゼの工業的使用はプロセス流を冷却するための高価な冷
却を必要とし、日和見微生物による汚染の可能性が増大
する。
従って、比較的低い最適温度（60〜70℃）の中温性セル
ラーゼ酵素に置き換えることができる、より一層高い最
適温度範囲のセルラーゼ酵素の出現が必要とされる。
ラーゼ酵素に置き換えることができる、より一層高い最
適温度範囲のセルラーゼ酵素の出現が必要とされる。
発明の開示 この発明の第１の観点によれば、この発明の方法によっ
て生成されたアシドサームス・セルロリティクスから得
られる比較的高い最適温度（70〜80℃）のセルラーゼ酵
素複合体が、現在工業的に用いられている中温性セルラ
ーゼ酵素に代えて使用できることを見出だした。
て生成されたアシドサームス・セルロリティクスから得
られる比較的高い最適温度（70〜80℃）のセルラーゼ酵
素複合体が、現在工業的に用いられている中温性セルラ
ーゼ酵素に代えて使用できることを見出だした。
高い最適温度のセルラーゼ酵素を製造するためのこの発
明の方法は、硫酸アンモニウム沈殿（40〜60％飽和溶
液）を用いることによって、あるいは、pM-10膜を備え
たアミコン（Amicon）限外濾過装置を用いる限外濾過に
よって、アシドサームス・セルロリティクスの培養ブロ
スを濃縮するための手段を提供する。この濃縮物は20％
グリセロールの存在下、−20℃で１年以上保存でき、酵
素活性の損失もない。
明の方法は、硫酸アンモニウム沈殿（40〜60％飽和溶
液）を用いることによって、あるいは、pM-10膜を備え
たアミコン（Amicon）限外濾過装置を用いる限外濾過に
よって、アシドサームス・セルロリティクスの培養ブロ
スを濃縮するための手段を提供する。この濃縮物は20％
グリセロールの存在下、−20℃で１年以上保存でき、酵
素活性の損失もない。
この発明の第２の観点によれば、アシドサームス・セル
ロリティクスにより生成されるセルラーゼ酵素復合体は
C1およびCxの両方の酵素活性を有し、20〜110℃の範囲
の温度で２〜９の範囲のpH、好ましくはpH約４〜８、最
も好ましくはpH約５でセルロース分解能を示す。この発
明のセルラーゼの重要な性質は耐熱性であり、熱に曝さ
れたときに高い安定性を示す。粗酵素溶液を90℃で約２
時間保温した後に、酵素活性の20％が残存する。
ロリティクスにより生成されるセルラーゼ酵素復合体は
C1およびCxの両方の酵素活性を有し、20〜110℃の範囲
の温度で２〜９の範囲のpH、好ましくはpH約４〜８、最
も好ましくはpH約５でセルロース分解能を示す。この発
明のセルラーゼの重要な性質は耐熱性であり、熱に曝さ
れたときに高い安定性を示す。粗酵素溶液を90℃で約２
時間保温した後に、酵素活性の20％が残存する。
この発明はさらに、高温菌であるアシドサームス・セル
ロリティクスにより生成される３種類のエンドグルカナ
ーゼの精製に向けられている。高分子量のエンドグルカ
ナーゼは65℃近くの最適温度で安定性が少なく、一方、
２種類の低分子量のエンドグルカナーゼのうちエンドＩ
は80℃近くの最適温度を有している。
ロリティクスにより生成される３種類のエンドグルカナ
ーゼの精製に向けられている。高分子量のエンドグルカ
ナーゼは65℃近くの最適温度で安定性が少なく、一方、
２種類の低分子量のエンドグルカナーゼのうちエンドＩ
は80℃近くの最適温度を有している。
図面の簡単な説明 第１図は、5l撹拌槽中で5g/lのセロビアーゼ濃度で55
℃、pH約5.2で生育させたアシドサームス・セルロリテ
ィクスの生育サイクルを示すグラフである。
℃、pH約5.2で生育させたアシドサームス・セルロリテ
ィクスの生育サイクルを示すグラフである。
第２図は、アシドサームス・セルロリティクスからの粗
酵素の温度に対する活性変化を示すグラフである。
酵素の温度に対する活性変化を示すグラフである。
第３図は、アシドサームス・セルロリティクスからの粗
酵素のpHに対する活性変化を示すグラフである。
酵素のpHに対する活性変化を示すグラフである。
第４図は、有機および無機イオンによる濾紙活性の阻害
を示すグラフである。
を示すグラフである。
第５図は、最終生成物であるセロビオースによる濾紙活
性の阻害を比較したグラフであり、アシドサームス・セ
ルロリティクス、トリコデルマ・レセイ（RUT C-30）お
よびクロストリジウム・サーモセラム（Clostridium th
ermocellum）からのセルラーゼを比較してある。
性の阻害を比較したグラフであり、アシドサームス・セ
ルロリティクス、トリコデルマ・レセイ（RUT C-30）お
よびクロストリジウム・サーモセラム（Clostridium th
ermocellum）からのセルラーゼを比較してある。
発明の詳細な説明 アシドサームス・セルロリティクスについて分類学的に
詳細に研究した結果、新たな属と種と命名し、微生物の
新規性の基準およびこの微生物の生育培地中に分泌され
るセルラーゼを確認した。この微生物の詳細な特性は、
International Journal of Systematic Bacteriology,3
6,1986 pp.435-443.に示されている。この微生物は広範
囲の単純な糖を利用すると同時に、唯一の炭素源として
セルロース粉末のごとき種々のセルロース性物質を利用
する。安価で入手容易な塩類および窒素源（無機アンモ
ニウム塩類あるいはアミノ酸のごとき有機窒素性物質）
を含む最小ミネラル培地が使用される。各種のグロス・
ファクターとして酵母エキスを補足的に添加してもよ
い。
詳細に研究した結果、新たな属と種と命名し、微生物の
新規性の基準およびこの微生物の生育培地中に分泌され
るセルラーゼを確認した。この微生物の詳細な特性は、
International Journal of Systematic Bacteriology,3
6,1986 pp.435-443.に示されている。この微生物は広範
囲の単純な糖を利用すると同時に、唯一の炭素源として
セルロース粉末のごとき種々のセルロース性物質を利用
する。安価で入手容易な塩類および窒素源（無機アンモ
ニウム塩類あるいはアミノ酸のごとき有機窒素性物質）
を含む最小ミネラル培地が使用される。各種のグロス・
ファクターとして酵母エキスを補足的に添加してもよ
い。
この細菌はpH3〜７の範囲、温度40〜70℃の範囲で生育
するが、最適生育条件はpH5付近で温度55℃である。
するが、最適生育条件はpH5付近で温度55℃である。
アシドサームス・セルロリティクスの保存培養菌は、一
次培養ブロスにジメチルスルホキシド（DMSO）を添加し
て−70℃で保存される。セルラーゼ生成のためにアシド
サームス・セルロリティクスを培養するためには、保存
されていた凍結培養菌を解凍し、これを無菌培地を入れ
たフラスコに移すことによって一次培養接種物が調製さ
れる。この一次培養接種物はより一層大きい大容量発酵
槽用の接種物の出発材料として使用され、接種されるべ
き大容量発酵槽の容量の1/10の容量を有する。培地の初
期pHは約5.2であり、培養温度は55℃に設定される。こ
の微生物は約20〜36時間で最大生育に到達し、その後セ
ルラーゼ酵素複合体の分泌がなされることが判明してい
る。この微生物からの粗培養ブロスは、結晶性セルロー
スの解重合のための最適温度は75℃を示し、カルボキシ
メチルセルロース（CMC）に対するエンドグルカナーゼ
活性のための最適温度は83℃を示す。90℃ではセルロー
スの分解のための最適活性の38％を示し、標準検定条件
下ではエンドグルカナーゼ活性の60％を示した。かよう
なセルラーゼ酵素は、工業的に使用されている従来の中
温性セルラーゼ酵素と置き換えることができる。なぜな
らば、このセルラーゼ酵素の最適温度は70℃と80℃との
間であり、現在工業的に用いられている殺菌温度の60〜
70℃（140〜160°Ｆ）よりも高い温度であるからであ
る。
次培養ブロスにジメチルスルホキシド（DMSO）を添加し
て−70℃で保存される。セルラーゼ生成のためにアシド
サームス・セルロリティクスを培養するためには、保存
されていた凍結培養菌を解凍し、これを無菌培地を入れ
たフラスコに移すことによって一次培養接種物が調製さ
れる。この一次培養接種物はより一層大きい大容量発酵
槽用の接種物の出発材料として使用され、接種されるべ
き大容量発酵槽の容量の1/10の容量を有する。培地の初
期pHは約5.2であり、培養温度は55℃に設定される。こ
の微生物は約20〜36時間で最大生育に到達し、その後セ
ルラーゼ酵素複合体の分泌がなされることが判明してい
る。この微生物からの粗培養ブロスは、結晶性セルロー
スの解重合のための最適温度は75℃を示し、カルボキシ
メチルセルロース（CMC）に対するエンドグルカナーゼ
活性のための最適温度は83℃を示す。90℃ではセルロー
スの分解のための最適活性の38％を示し、標準検定条件
下ではエンドグルカナーゼ活性の60％を示した。かよう
なセルラーゼ酵素は、工業的に使用されている従来の中
温性セルラーゼ酵素と置き換えることができる。なぜな
らば、このセルラーゼ酵素の最適温度は70℃と80℃との
間であり、現在工業的に用いられている殺菌温度の60〜
70℃（140〜160°Ｆ）よりも高い温度であるからであ
る。
実施例１ 初期定常期まで生育させた培養物1mlに対して77mlのDMS
Oを添加したアシドサームス・セルロリティクスの保存
培養菌を−70℃に維持した。この保存培養菌の1mlを解
凍し、第１表に示した組成を有する培地20mlを含む50ml
容フラスコに移した。
Oを添加したアシドサームス・セルロリティクスの保存
培養菌を−70℃に維持した。この保存培養菌の1mlを解
凍し、第１表に示した組成を有する培地20mlを含む50ml
容フラスコに移した。
第１表：アシドサームス・セルロリティクス生育用培地
組成成 分 g/l（脱イオン水中） NH4Cl 2.0 NH2PO4 2.0 Na2HPO4 0.2 MgSo47H2O 0.4 CaCl2 0.04 酵母エキス 1.0 炭素源 5.0 FeSO4 0.01 pHは5.2に調製 このフラスコを55℃で20〜36時間培養し、この培養物を
培地200mlを含む500ml容フラスコへ移した。このフラス
コは、5l容発酵槽（使用容量2l）への接種物として使用
した。pHは、KOH（1N）あるいはHCl（1N）を滴下して5.
2に制御した。酵素活性は、この発酵サイクルの48時間
にわたって測定した。1mlの試料を採取して、12,000xg
で遠心分離し、上澄液の0.5mlを用いて濾紙活性（FPA）
を測定した。この濾紙活性は、International Union of
Pure and Applied Chemistry（IUPSC）,1987.に示され
た方法に従って測定したものであり、この文献を引用す
ることによってその内容を本明細書中に編入する。この
方法においては、上澄液の0.5mlをpH4.8のクエン酸塩緩
衝液（0.1M）0.75mlと混合し、これに脱イオン水（DI）
0.25mlを加えて検定混合物の総容量を1.5mlとした。50m
gの濾紙片（Whatman ♯１）を入れた複数の検定用試験
管を55℃で予備保温してから、酵素溶液を添加し、次い
で55℃で１時間保温した。酵素作用によって生成された
還元糖を、3,5-ジニトロサリチル酸（DNS）試薬を用い
て測定した。正確に秤量した０〜5mgの範囲内でのグル
コース標準品を用いて、生成グルコースに匹敵する標準
曲線を作成した。１時間保温した後のグルコース総生成
量が2mgとなるように、酵素の添加量を調節した。発酵
過程の間に得られた総活性は、0.02国際濾紙単位（IFP
U）/mlであった。酵素活性おけるかような低い値は、多
くの野性型微生物にとって生来的なものである。セルラ
ーゼ酵素の力価と総生産性を高めるためには菌株の改良
が必要とされる。生育サイクルを第１図に示す。
組成成 分 g/l（脱イオン水中） NH4Cl 2.0 NH2PO4 2.0 Na2HPO4 0.2 MgSo47H2O 0.4 CaCl2 0.04 酵母エキス 1.0 炭素源 5.0 FeSO4 0.01 pHは5.2に調製 このフラスコを55℃で20〜36時間培養し、この培養物を
培地200mlを含む500ml容フラスコへ移した。このフラス
コは、5l容発酵槽（使用容量2l）への接種物として使用
した。pHは、KOH（1N）あるいはHCl（1N）を滴下して5.
2に制御した。酵素活性は、この発酵サイクルの48時間
にわたって測定した。1mlの試料を採取して、12,000xg
で遠心分離し、上澄液の0.5mlを用いて濾紙活性（FPA）
を測定した。この濾紙活性は、International Union of
Pure and Applied Chemistry（IUPSC）,1987.に示され
た方法に従って測定したものであり、この文献を引用す
ることによってその内容を本明細書中に編入する。この
方法においては、上澄液の0.5mlをpH4.8のクエン酸塩緩
衝液（0.1M）0.75mlと混合し、これに脱イオン水（DI）
0.25mlを加えて検定混合物の総容量を1.5mlとした。50m
gの濾紙片（Whatman ♯１）を入れた複数の検定用試験
管を55℃で予備保温してから、酵素溶液を添加し、次い
で55℃で１時間保温した。酵素作用によって生成された
還元糖を、3,5-ジニトロサリチル酸（DNS）試薬を用い
て測定した。正確に秤量した０〜5mgの範囲内でのグル
コース標準品を用いて、生成グルコースに匹敵する標準
曲線を作成した。１時間保温した後のグルコース総生成
量が2mgとなるように、酵素の添加量を調節した。発酵
過程の間に得られた総活性は、0.02国際濾紙単位（IFP
U）/mlであった。酵素活性おけるかような低い値は、多
くの野性型微生物にとって生来的なものである。セルラ
ーゼ酵素の力価と総生産性を高めるためには菌株の改良
が必要とされる。生育サイクルを第１図に示す。
実施例２ 120lの発酵槽ブロスをCEPAタイプ41連続遠心分離器で遠
心分離した後、PM-10中空ファイバーフィルターを装着
した限外濾過装置（Amicon DC-30）を用いて上澄液を２
IFPU/mlのレベルまで濃縮した。この濃縮酵素溶液を2
0％グリセロールと混合し、−20℃で凍結保存した。
心分離した後、PM-10中空ファイバーフィルターを装着
した限外濾過装置（Amicon DC-30）を用いて上澄液を２
IFPU/mlのレベルまで濃縮した。この濃縮酵素溶液を2
0％グリセロールと混合し、−20℃で凍結保存した。
実施例３ アシドサームス・セルロリティクスにより分泌される酵
素が安定である温度範囲を試験した結果を第２図に示
す。30〜110℃の範囲における濾紙（FP）に対する活性
およびエンドグルカナーゼ（CMC）活性を示している。
活性の測定は、実施例１において引用したIUPAC方法に
準じて行った。広い温度範囲にわたって酵素が陣質的な
活性を有していることがわかる。濾紙活性についてはpH
5.0での最適温度は75℃近傍であり、エンドグルカナー
ゼ活性は83℃近傍である。
素が安定である温度範囲を試験した結果を第２図に示
す。30〜110℃の範囲における濾紙（FP）に対する活性
およびエンドグルカナーゼ（CMC）活性を示している。
活性の測定は、実施例１において引用したIUPAC方法に
準じて行った。広い温度範囲にわたって酵素が陣質的な
活性を有していることがわかる。濾紙活性についてはpH
5.0での最適温度は75℃近傍であり、エンドグルカナー
ゼ活性は83℃近傍である。
実施例４ アシドサームス・セルロリティクスにより分泌される酵
素が安定であるpH範囲を試験した結果を第３図に示す。
約65℃における一定イオン強度緩衝液系を用いたpH約2.
2〜約８の範囲における濾紙（FP）に対する活性および
エンドグルカナーゼ（CMC）活性を示している。
素が安定であるpH範囲を試験した結果を第３図に示す。
約65℃における一定イオン強度緩衝液系を用いたpH約2.
2〜約８の範囲における濾紙（FP）に対する活性および
エンドグルカナーゼ（CMC）活性を示している。
実施例５ 無機および有機イオンによる濾紙（FP）活性の阻害を第
４図に示す。このグラフは、活性曲線と塩濃度との関係
を実施例１に引用したIUPAC方法に準じて測定したもの
である。ただし、NaClの最終濃度がグラフの点により示
した値と等しくなるように種々の量の1M NaCl溶液を添
加した。有機イオン濃度は、図示した濃度になるように
1M酢酸塩緩衝液（pH5）を添加して変化させた。濾紙活
性は、高濃度の無機イオン（塩）の存在下で25％低下し
た。濾紙活性は有機イオン（酢酸塩）の存在に対して一
層敏感であり、酢酸塩の0.5M近傍では最大活性の40％に
まで低下していることがわかる。
４図に示す。このグラフは、活性曲線と塩濃度との関係
を実施例１に引用したIUPAC方法に準じて測定したもの
である。ただし、NaClの最終濃度がグラフの点により示
した値と等しくなるように種々の量の1M NaCl溶液を添
加した。有機イオン濃度は、図示した濃度になるように
1M酢酸塩緩衝液（pH5）を添加して変化させた。濾紙活
性は、高濃度の無機イオン（塩）の存在下で25％低下し
た。濾紙活性は有機イオン（酢酸塩）の存在に対して一
層敏感であり、酢酸塩の0.5M近傍では最大活性の40％に
まで低下していることがわかる。
実施例６ 最終生成物阻害剤であるセロビオースによる濾紙（FP）
活性の阻害を第５図に示す。セロビオースは、トリコデ
ルマ・レセイにより分泌されるセルラーゼの有力な阻害
物質であり、約60mMで完全な阻害が生じる。アシドサー
ムス・セルロリティクスからのセルラーゼは、セロビオ
ースによる阻害に対してより一層抵抗性があり、0.5M近
くでも活性が認められた。
活性の阻害を第５図に示す。セロビオースは、トリコデ
ルマ・レセイにより分泌されるセルラーゼの有力な阻害
物質であり、約60mMで完全な阻害が生じる。アシドサー
ムス・セルロリティクスからのセルラーゼは、セロビオ
ースによる阻害に対してより一層抵抗性があり、0.5M近
くでも活性が認められた。
実施例7:高分子量エンドグルカナーゼ 粗培養ブロスから高分子量エンドグルカナーゼを以下の
工程で精製した。先ず、150l発酵槽からの粗培養物をCE
PA連続流ボウル式遠心分離器により20,000rpmで遠心分
離して、アシドサームス・セルロリティクス菌体を除去
した。回収した上澄液をAmicon DC-30限外濾過装置を用
いて10倍以上に濃縮した。アリコート量の濃縮液をPM-1
0膜を装着した小型Amicon撹拌セル限外濾過装置を用い
てさらに濃縮した後、半準備的なサイズ排除クロマトグ
ラフィー（SEC）カラムに装填した。このSECカラムはTo
yo Soda製（TSK 3000SWG）であり、21.5×700mmの寸法
であった。このカラムから蛋白質を各々の分子量に従っ
て溶出させて分画し、種々のピーク画分として収集し
た。これらの酵素の分子量は約156,600〜約203,400ダル
トンの範囲であった。
工程で精製した。先ず、150l発酵槽からの粗培養物をCE
PA連続流ボウル式遠心分離器により20,000rpmで遠心分
離して、アシドサームス・セルロリティクス菌体を除去
した。回収した上澄液をAmicon DC-30限外濾過装置を用
いて10倍以上に濃縮した。アリコート量の濃縮液をPM-1
0膜を装着した小型Amicon撹拌セル限外濾過装置を用い
てさらに濃縮した後、半準備的なサイズ排除クロマトグ
ラフィー（SEC）カラムに装填した。このSECカラムはTo
yo Soda製（TSK 3000SWG）であり、21.5×700mmの寸法
であった。このカラムから蛋白質を各々の分子量に従っ
て溶出させて分画し、種々のピーク画分として収集し
た。これらの酵素の分子量は約156,600〜約203,400ダル
トンの範囲であった。
このカラムからの高分子量エンドグルカナーゼのピーク
を含む画分を溜めて、15mMのビス−トリス（Bis-Tris）
のpH6.5のイオン交換クロマトグラフィー（IEC）装填緩
衝液に対してダイアフィルトレーションを行った。この
高分子量エンドグルカナーゼを次いで第４アンモニウム
塩を交換基として有する強陰イオン交換カラム（Mono
Q、ファルマシア（Pharmacia）社製商品名）に装填し
た。
を含む画分を溜めて、15mMのビス−トリス（Bis-Tris）
のpH6.5のイオン交換クロマトグラフィー（IEC）装填緩
衝液に対してダイアフィルトレーションを行った。この
高分子量エンドグルカナーゼを次いで第４アンモニウム
塩を交換基として有する強陰イオン交換カラム（Mono
Q、ファルマシア（Pharmacia）社製商品名）に装填し
た。
カラム容量の10倍量の装填緩衝液で洗浄した後、NaClの
０から50mMまで直線的にイオン強度が緩やかな匂配で増
加する緩衝液を用いて、前記IECから高分子エンドグル
カナーゼを溶出させた。このときの時間は320分、流速
を1ml/分とした。精製高分子量エンドグルカナーゼは、
NaClの約25mMに相当する匂配イオン強度でカラムから溶
出した。下記の工程図はアシドサームス・セルロリティ
クスからの高分子量エンドグルカナーゼの精製技術を模
式的に説明するものである。
０から50mMまで直線的にイオン強度が緩やかな匂配で増
加する緩衝液を用いて、前記IECから高分子エンドグル
カナーゼを溶出させた。このときの時間は320分、流速
を1ml/分とした。精製高分子量エンドグルカナーゼは、
NaClの約25mMに相当する匂配イオン強度でカラムから溶
出した。下記の工程図はアシドサームス・セルロリティ
クスからの高分子量エンドグルカナーゼの精製技術を模
式的に説明するものである。
実施例８および9:低分子量エンドグルカナーゼＩおよび
II 下記の工程により、150l発酵槽の粗培養ブロスから低分
子量エンドグルカナーゼＩおよびIIを精製した。先ず、
150l発酵槽からの粗培養ブロスをCEPA連続流ボウル式遠
心分離器により20,000rpmで遠心分離して、アシドサー
ムス・セルロリティクス菌体を除去した。回収した上澄
液をAmicon DC-30限外濾過装置を用いて少なくとも10倍
に濃縮した。アリコート量の濃縮液をPM-10膜を装着し
た小型Amicon撹拌セル限外濾過装置を用いてさらに濃縮
した後、半準備的なサイズ排除クロマトグラフィー（SE
C）カラムに装填した。TSK 3000 SWG SECカラムから溶
出する低分子量エンドグルカナーゼのピークを分画し、
10mlまで超濃縮した。この超濃縮物を６本の試験管に分
け、各々に6.200gのCsC（超高純度）を添加した。高濃
度酢酸緩衝液（1M、pH5.0）を添加し、（1.13ml）、水
を11.3ml添加して試験管への総添加重量を15.82gとし
た。６本の試験管の各々をBeckman SW-41揺動バケット
ローターに装填し、これをBeckman超遠心分離器内に配
置した。35,000rpmで少なくとも96時間遠心分離を行っ
た後、試験管を取出して分画した。得られた画分から等
密度バンドの蛋白質を溜め、これを遠心分離し、装填緩
衝液に対してダイヤフィルトレーションし、イオン交換
カラムに装填した。Mono Q強陰イオン交換カラム（Phar
macia）を、15mMビス−トリスpH7.0の装填緩衝液に対し
て平衡化した後、ダイヤルフィルトレーションした低分
子量エンドグルカナーゼのピークを装填した。カラム容
量の10倍量の緩衝液で洗浄した後、イオン強度が緩やか
な匂配で増加する緩衝液を用いて低分子量エンドグルカ
ナーゼＩおよびIIをこのカラムから溶出させた。匂配
は、流速1ml/分で320分で０から50mM（NaCl濃度）まで
直線的に増加する。低分子量エンドグルカナーゼＩは約
25mMのイオン強度の匂配でこのカラムから溶出し、低分
子量エンドグルカナーゼIIはNaClの約31mMで溶出した。
溜めておいた低分子量エンドグルカナーゼＩとIIのピー
クは次いで超濃縮され、TSK 3000 SWG SECカラムに別々
に装填されて分画される。エンドグルカナーゼ活性を含
む画分を溜めておき、超濃縮（PM-10）して、最終的に
精製された低分子量エンドグルカナーゼＩおよびIIを得
た。これらは、それぞれ約57,420〜74,580ダルトンの分
子量および約50,000〜70,000ダルトンの分子量を持つこ
とが判明した。
II 下記の工程により、150l発酵槽の粗培養ブロスから低分
子量エンドグルカナーゼＩおよびIIを精製した。先ず、
150l発酵槽からの粗培養ブロスをCEPA連続流ボウル式遠
心分離器により20,000rpmで遠心分離して、アシドサー
ムス・セルロリティクス菌体を除去した。回収した上澄
液をAmicon DC-30限外濾過装置を用いて少なくとも10倍
に濃縮した。アリコート量の濃縮液をPM-10膜を装着し
た小型Amicon撹拌セル限外濾過装置を用いてさらに濃縮
した後、半準備的なサイズ排除クロマトグラフィー（SE
C）カラムに装填した。TSK 3000 SWG SECカラムから溶
出する低分子量エンドグルカナーゼのピークを分画し、
10mlまで超濃縮した。この超濃縮物を６本の試験管に分
け、各々に6.200gのCsC（超高純度）を添加した。高濃
度酢酸緩衝液（1M、pH5.0）を添加し、（1.13ml）、水
を11.3ml添加して試験管への総添加重量を15.82gとし
た。６本の試験管の各々をBeckman SW-41揺動バケット
ローターに装填し、これをBeckman超遠心分離器内に配
置した。35,000rpmで少なくとも96時間遠心分離を行っ
た後、試験管を取出して分画した。得られた画分から等
密度バンドの蛋白質を溜め、これを遠心分離し、装填緩
衝液に対してダイヤフィルトレーションし、イオン交換
カラムに装填した。Mono Q強陰イオン交換カラム（Phar
macia）を、15mMビス−トリスpH7.0の装填緩衝液に対し
て平衡化した後、ダイヤルフィルトレーションした低分
子量エンドグルカナーゼのピークを装填した。カラム容
量の10倍量の緩衝液で洗浄した後、イオン強度が緩やか
な匂配で増加する緩衝液を用いて低分子量エンドグルカ
ナーゼＩおよびIIをこのカラムから溶出させた。匂配
は、流速1ml/分で320分で０から50mM（NaCl濃度）まで
直線的に増加する。低分子量エンドグルカナーゼＩは約
25mMのイオン強度の匂配でこのカラムから溶出し、低分
子量エンドグルカナーゼIIはNaClの約31mMで溶出した。
溜めておいた低分子量エンドグルカナーゼＩとIIのピー
クは次いで超濃縮され、TSK 3000 SWG SECカラムに別々
に装填されて分画される。エンドグルカナーゼ活性を含
む画分を溜めておき、超濃縮（PM-10）して、最終的に
精製された低分子量エンドグルカナーゼＩおよびIIを得
た。これらは、それぞれ約57,420〜74,580ダルトンの分
子量および約50,000〜70,000ダルトンの分子量を持つこ
とが判明した。
かき工程図はアシドサームス・セルロリティクスからの
低分子量エンドグルカナーゼＩおよびIIの精製技術を模
式的に説明するものである。
低分子量エンドグルカナーゼＩおよびIIの精製技術を模
式的に説明するものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ヒンメル，ミッチェル イー. アメリカ合衆国，コロラド州 80123，リ ットルトン，ハイアリー ストリート, 9202 タブリュ. (72)発明者 グローマン，カレル アメリカ合衆国，コロラド州 80123，リ ットルトン，レイトン アベニュ，8832 ダブリュ.
Claims (17)
- 【請求項１】細菌であるアシドサームス・セルロリティ
クス（Acidothermuscellulolyticus）ATCC 43068から生
産され、分子量が約156,600〜203,400ダルトンである酵
素であって、水溶性であり、C1およびCXタイプの酵素活
性を有し、熱に対して高度に安定であり、活性に対する
最適温度がpH約２〜９で約65℃であり、不活性化温度が
pH約２〜９で約90℃であることを特徴とする精製された
高分子量セルラーゼ酵素。 - 【請求項２】最適温度活性に対するpHが約４〜８であ
り、不活性化温度に対するpHが約４〜８である請求項１
記載の精製されたセルラーゼ酵素。 - 【請求項３】最適温度活性に対するpHが約５であり、不
活性化温度に対するpHが約５である請求項１記載の精製
されたセルラーゼ酵素。 - 【請求項４】前記細菌を栄養培地で培養し、生成された
粗セルラーゼ酵素複合体を限外濾過により濾過し、未精
製の高分子量限外濾過物画分をサイズ排除クロマトグラ
フィーにより分離し、約15mMのビス−トリスのpH約6.5
の装填緩衝液に対して平衡化させた第４アンモニウム塩
を交換基として有する強陰イオン交換カラムに前記画分
を装填し、前記画分を前記装填緩衝液で洗浄し、NaClの
０から50mMまで直線的にイオン強度が緩やかな匂配で増
加する緩衝液を用いて精製高分子量セルラーゼ画分を約
25mMで溶出させることにより前記高分子量セルラーゼ画
分を回収すること特徴とする、請求項１記載の酵素の製
造方法。 - 【請求項５】細菌であるアシドサームス・セルロリティ
クス（Acidothermuscellulolyticus）ATCC 43068から生
産される酵素であって、水溶性であり、C1およびCxタイ
プの酵素活性を有し、熱に対して高度に安定であり、活
性に対する最適温度がpH約２〜９で約80℃であり、不活
性化温度がpH約２〜９で約110℃であることを特徴とす
る精製された低分子量セルラーゼ酵素。 - 【請求項６】最適温度活性に対するpHが約４〜８であ
り、不活性化温度に対するpHが約４〜８である請求項５
記載の精製されたセルラーゼ酵素。 - 【請求項７】最適温度活性に対するpHが約５であり、不
活性化温度に対するpHが約５である請求項５記載の精製
されたセルラーゼ酵素。 - 【請求項８】分子量が約57,420〜74,580ダルトンである
請求項５記載の精製されたセルローズ酵素。 - 【請求項９】セルロース分解用に使用される請求項５記
載の精製された低分子量セルラーゼ酵素。 - 【請求項１０】前記細菌を栄養培地で培養し、生成され
た粗セルラーゼ酵素複合体を限外濾過により濾過し、未
精製の高分子量および低分子量の限外濾過物画分をサイ
ズ排除クロマトグラフィーおよびCsCl沈殿により分離
し、15mMのビス−トリスのpH7の装填緩衝液に対して平
衡化させた第４アンモニウム塩を交換基として有する強
陰イオン交換カラムに前記低分子量画分を装填し、NaCl
の０から50mMまで直線的にイオン強度が緩やかな匂配で
増加する緩衝液を用いて精製低分子量セルラーゼ画分を
約25mMで溶出させることにより前記低分子量セルラーゼ
画分を回収すること特徴とする、請求項５記載の酵素の
製造方法。 - 【請求項１１】細菌であるアシドサームス・セルロリテ
ィクス（Acidothermuscellulolyticus）ATCC 43068を栄
養培地で培養し、生成された粗セルラーゼ酵素複合体を
限外濾過により濾過し、未精製の高分子量および低分子
量の限外濾過物画分をサイズ排除クロマトグラフィーに
より分離し、前記低分子量画分にCaClおよび高濃度酢酸
塩緩衝液を添加し、15mMのビス−トリスのpH約７の装填
緩衝液に対して平衡化させた第４アンモニウム塩を交換
基として有する強陰イオン交換カラムに前記低分子量画
分を通液し、NaClの０から約50mMまで直線的にイオン強
度が緩やかな匂配で増加する緩衝液を用いて精製低分子
量セルラーゼ画分を約31mMで溶出させることにより前記
低分子量セルラーゼ画分を回収すること特徴とする、精
製された低分子量セルラーゼ酵素（エンドグルカナーゼ
II）の製造方法。 - 【請求項１２】細菌であるアシドサームス・セルロリテ
ィクス（Acidothermuscellulolyticus）ATCC 43068から
生産される酵素であって、水溶性であり、C1およびCxタ
イプの酵素活性を有し、熱に対して高度に安定であり、
第４アンモニウム塩を交換基として有する強陰イオン交
換カラムに装填したのちNaClの０から約50mMまで直線的
にイオン強度が緩やかな匂配で増加する緩衝液を用いて
約31mMで低分子量酵素の混合物から溶出回収されること
を特徴とする、精製された低分子量セルラーゼ酵素。 - 【請求項１３】活性に対する最適温度がpH約２〜９で約
80℃であり、不活性化温度がpH約２〜９で約110℃であ
ることを特徴とする請求項12記載の精製されたセルラー
ゼ酵素。 - 【請求項１４】最適温度活性に対するpHが約４〜８であ
り、不活性化温度に対するpHが約４〜８である請求項13
記載のセルラーゼ酵素。 - 【請求項１５】最適温度活性に対するpHが約５であり、
不活性化温度に対するpHが約５である請求項13記載の精
製されたセルラーゼ酵素。 - 【請求項１６】分子量が約50,000〜70,000ダルトンであ
る請求項12記載の精製されたセルローズ酵素。 - 【請求項１７】セルロース分解用に使用される請求項12
記載の精製された低分子量セルラーゼ酵素。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US412434 | 1989-09-26 | ||
| US07/412,434 US5110735A (en) | 1989-09-26 | 1989-09-26 | Thermostable purified endoglucanase from thermophilic bacterium acidothermus cellulolyticus |
| PCT/US1990/004868 WO1991005039A1 (en) | 1989-09-26 | 1990-08-27 | Thermostable purified endoglucanases from thermophilic bacterium acidothermus cellulolyticus |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05500752A JPH05500752A (ja) | 1993-02-18 |
| JPH072113B2 true JPH072113B2 (ja) | 1995-01-18 |
Family
ID=23632963
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2513175A Expired - Lifetime JPH072113B2 (ja) | 1989-09-26 | 1990-08-27 | 高温性細菌アシドサームス・セルロリティクスからの熱安定性精製エンドグルカナーゼ |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5110735A (ja) |
| EP (2) | EP0885955B1 (ja) |
| JP (1) | JPH072113B2 (ja) |
| AU (1) | AU6420290A (ja) |
| DE (2) | DE69034257D1 (ja) |
| WO (1) | WO1991005039A1 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5366884A (en) * | 1989-09-26 | 1994-11-22 | Midwest Research Institute | Thermostable purified endoglucanase II from Acidothermus cellulolyticus ATCC |
| US5536655A (en) * | 1989-09-26 | 1996-07-16 | Midwest Research Institute | Gene coding for the E1 endoglucanase |
| US5712142A (en) * | 1989-09-26 | 1998-01-27 | Midwest Research Institute | Method for increasing thermostability in cellulase ennzymes |
| US5432075A (en) * | 1989-09-26 | 1995-07-11 | Midwest Research Institute | Low molecular weight thermostable β-D-glucosidase from acidothermus cellulolyticus |
| US5275944A (en) * | 1989-09-26 | 1994-01-04 | Midwest Research Institute | Thermostable purified endoglucanas from acidothermus cellulolyticus ATCC 43068 |
| LT3208B (en) * | 1992-04-10 | 1995-03-27 | Ssv Dev Oy | Enzyme products for use in the improvement of feed value and conservation of fibrous crops |
| CA2139001A1 (en) * | 1993-05-10 | 1994-11-24 | Jean Paul Vincken | Combined action of endoglucanases and cellobiohydrolases |
| US5514584A (en) * | 1993-06-11 | 1996-05-07 | Midwest Research Institute | Cloning of cellulase genes from acidothermus cellulolyticus |
| ATE330055T1 (de) * | 1997-12-19 | 2006-07-15 | Novozymes North America Inc | Kontinuierliches biopolishing von cellulose enthaltenden fasern |
| US7393673B2 (en) | 2001-07-28 | 2008-07-01 | Midwest Research Institute | Thermal tolerant exoglucanase from Acidothermus cellulolyticus |
| US7112429B2 (en) | 2001-07-28 | 2006-09-26 | Midwest Research Institute | Thermal tolerant mannanase from acidothermus cellulolyticus |
| US7059993B2 (en) | 2001-07-28 | 2006-06-13 | Midwest Research Institute | Thermal tolerant cellulase from Acidothermus cellulolyticus |
| US7364890B2 (en) | 2001-07-28 | 2008-04-29 | Midwest Research Institute | Thermal tolerant avicelase from Acidothermus cellulolyticus |
| CN1930294A (zh) | 2004-03-25 | 2007-03-14 | 金克克国际有限公司 | 纤维素酶融合蛋白和编码该纤维素酶融合蛋白的异源纤维素酶融合构建物 |
| US8097445B2 (en) | 2004-03-25 | 2012-01-17 | Danisco Us Inc. | Exo-endo cellulase fusion protein |
| EP2292747B1 (en) | 2004-12-30 | 2017-01-25 | Danisco US Inc. | Variant hypocrea jecorina cbh2 cellulases |
| ES2538360T3 (es) | 2006-07-21 | 2015-06-19 | Novozymes, Inc. | Métodos para aumentar la secreción de polipéptidos que tienen actividad biológica |
| AU2008343105A1 (en) | 2007-12-19 | 2009-07-09 | Novozymes A/S | Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same |
| WO2010065830A1 (en) | 2008-12-04 | 2010-06-10 | Novozymes, Inc. | Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same |
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| CN102325889A (zh) | 2008-12-19 | 2012-01-18 | 诺维信股份有限公司 | 增加纤维素材料水解的方法 |
| US8426158B2 (en) | 2008-12-19 | 2013-04-23 | Novozymes, Inc. | Methods for increasing enzymatic hydrolysis of cellulosic material in the presence of a peroxidase |
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