JPS63313583A - セルラ−ゼの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 近年、セルロースが安価なグルコース源として脚光をあ
び、それを発酵原料として工業用アルコールなどを大量
に安定供給する技術の開発が進められている。本発明は
このセルロースを効率よく分解しうる酵素を提供するも
のである。

〔従来の技術〕

セルラーゼは糸状菌、担子菌、放線菌、細菌など多種多
様の微生物によって生産されることが知られているが、
主にトリコデルマ属、アスペルギルス属、スポロトリク
ム属などの糸状菌がセルラーゼの生産に利用されている
。

セルラーゼ産生菌は一般にプロテアーゼを副生じ、糸状
菌は１５〜２０単位／戚程度を副生する。

〔発明が解決しよとする問題点〕

セルロース産生能を有する糸状菌をセルラーゼ生産培地
で培養すると、しばしばセルラーゼ産生能の低下が起こ
る。また、糸状菌より得られたセルラーゼ製剤を用いて
膜リアクター中でセルロースの連続糖化を長時間繰返す
と糖化活性の低下が起こる。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者らは、このような問題を解決すべく種々研究の
結果、プロテアーゼ副生量の低下した変異株を誘導する
ことによってセルラーゼ産生能も高く、しかも長時間安
定な糖化活性を示すセルラーゼ製剤が得られることを見
出し本発明を完成した。すなわち、本発明はセルラーゼ
産性能を有する糸状菌よりプロテアーゼ低下変位株を誘
導しその株をセルロースを含有する栄養培地に培養し、
培養物からセルラーゼを採取することを特徴とするセル
ラーゼの製造方法に関するものである。

本発明に用いる糸状菌はセルラーゼ産性能を有するもの
から誘導する。このセルラーゼ産性能を有する糸状菌は
種々のものが知られているが、例えば、スポロトリクム
・セルロフィルムＡＴＣＣ２０４９３（ＡＪ　６９８７
）、トリコデルマ・リーセイＡＴＣＣ２６９〜゛ ２１（ＱＭ　９４１４）　、アスペルヂルス・アクレア
ータス（ＡＪＩＩ　７０７３）などがある。

これらから、プロテアーゼ産生能の低下した変異株を取
得する方法は、通常の微生物の変異方法に従って変異操
作を行い、プロテアーゼ産性能低下株の選別方法に従っ
て変異操作を行なえばよい。

変異方法の例としては、ＮＧ（Ｎ−メチル−Ｎ゛−ニト
ロ−Ｎ−ニトロソグアニジン）、亜硝酸などの薬剤によ
る処理、Ｘ線、紫外線などの照射処理などがある。

プロテアーゼ産生能低下株の選別方法は次のように行な
う。まず、基準培地としてマンデルスの培地を用いる。

この培地は後述する取得例に記載された組成を有するも
ので“ＡＤＶＡＮＣＥＳ　ＩＮ　ＣＨＥＭＩＳ−ＴＲＹ
　５ＥＲＩＥＳ”　ＮＯ，９５”Ｃｅ１ｌｕｌａｓｅｓ
　ａｎｄ　ｔｈｅｉｒ　Ａｐｐ１ｉｃａｔｉｏｎ″ｐｐ
３９１〜４１３に記載されている。この培地に前記変異
処理した糸状菌を培養する。培養は当該糸状菌変異株を
親株の至適温度でセルラーゼの生産量が最大値に達する
まで好気的条件下で行う。通常は２０〜４５℃で２〜１
０日間程度培養すればよい。糸状菌の生産するプロテア
ーゼには、酸性、中性、及びアルカリ性ｐＨに最大活性
を示す少なくとも３種のプロテアーゼが知られているが
、選別基準のプロテアーゼは、そのいずれであってもよ
い。プロテアーゼ活性は基質にカゼインを用いた萩原法
で測定する。すなわち、０．６％基質溶液５−に酵素液
１１１２１！を加え、３０°Ｃ１最適ｐＨ下で１０分間
反応させる。除蛋白液５ＩＩＩｌを加え、濾液中の分解
生成物を２７５ｍμにおける吸収やフォーリン呈色法で
定量する。１分間にチロシン１μｇ相当量の吸収又は呈
色を示す非蛋白性物質を生成する活性を１単位とする。

基質にカゼインを用いた萩原法は例えば「酵素研究法」
第２巻第２４０頁（昭和３３年）朝食書店に記載されて
いる。このような条件で公知のセルラーゼ生産糸状菌を
培養するとプロテアーゼが１５〜２０単位／Ｉｄ生成さ
れるが、本発明においては生成量が１０年位置□１１以
下に低下したものを選別して使用する。プロテアーゼの
生成量は低いもののほうが好ましく、５単位／ａ！以下
特に２単位／Ｉ１１以下のものが好ましい、ａ株に対し
てはプロテアーゼ生成量がη以下、特にＸ以下のものが
適当である。

このような糸状菌の取得例を次に示す。

取得例１ 親株として、スポロトリクム・セルロフィルムＡＪ　１
１７１１６　（ＦＥＲＭ−Ｐ　７０３７）をポテトデキ
ストロース寒天斜面培養地（ＰＤＡ培養値と略称する）
、で４５℃５日間、引続いて２６°Ｃ３日間培養し、胞
子を充分形成せしめた。形成した胞子を０．０１％Ｔｗ
ｅｅｎ−８０を含む０．１ＭＫ−リン酸緩衝液、ｐ）１
７．０、に懸濁させ、ガーゼで濾過して大きな菌糸体を
除き、ＮＧ　１０００μｇ／！Ｉ１１の存在下で２６℃
、３０分間インキエベートした。この胞子懸濁液を遠心
して胞子を集め、前記リン酸緩衝液を用いて充分に洗浄
し、ＰＤＡ平面プレート培地に、プレート当り５０〜１
００個のコロニーが出るようにまいた。これを２〜３日
間日間インバエベート出現したコロニーをスキムミルク
（０，５％）寒天（１，５％）培地（５Ｍ培地と略称す
る）にレプリカした。

この５Ｍ培地でハロー形成が親株より著しく低下したコ
ロニーを１５株釣菌し、下記組成のセルラーゼ生産培地
（マンデルスの培地）５１ｄを含む３０ＩＩ１１容の大
型試験管中で４５゛Ｃで４日間振盪培養した。

マンデルス培地 セルロースパウダー　　　　４．０　　ｇ／ｄｉ！。

ＫＨ！ＰＯ４０，２〃 （Ｎ　Ｈａ）ｚｓ　Ｏｓ　　　　　　　０．１４　　”
ペプトン　　　　　　　　　１．２　〃Ｍｇ５Ｏｎ・７
Ｈ！０　　　　　１．０３　〃ＣａＣｊ！　ｇ・２８　
ｔｏ　　　　　　０．０３　’尿　　素　　　　　　　
　　　　　０．０３　〃Ｔｗｅｅｎ−８００，２” 微量要素液”　　　　　　　　　０．１　ｄ／ｄｉｌｐ
ｎｓ、。

”ＺｎＳ　０ｎ４Ｈｚ０　　　　　　　１５０１ｇ　　
　　’ＦｅＳ　０＝４ＨｚＯ５００１１ｇ ＣｏＣｌ　ｚ、６Ｈｚ０　　　　　　　２００１ｍｇＭ
ｎＳ　０４４Ｈｚ０　　　　　　　１５０　ｍｔｇを水
１００ｄに溶解 このようにして培養したプロテアーゼ産生能低下株の中
で生育が親株と同程度に良好なもの６株について培養液
のセルラーゼ活性及びプロテアーゼ活性を測定したとこ
ろ、いずれの変異株の培養液も３〜９単位／ｄ（親株の
’Ａ　−’Ａ　）のプロテアーゼ活性を示した。この６
株のうち最もセルラーゼ活性の高く、比較的プロテアー
ゼ活性の低下した変異株スポロトリクム・セルロフィル
ムＡＪ　１１７１６３（ＦＥＲＭ−Ｐ　９３７５）を得
た。

取得例２ 親株としてトリコデルマ・リーセイＡＴＣＣ２６９２１
を用い、取得例１と同様の方法によってプロテアーゼ産
性能低下株３５株を得た。この各変異株を前記の組成の
マンデルス液体培地に３０℃で１０日間振盪培養し、良
好に生育した８株について培養液のセルラーゼ活性及び
プロテアーゼ活性を測定したところ、いずれの変異株も
２〜６単位／ｄ　（ａ株の％−！４）に低下したプロテ
アーゼ測定を示した。

これらのうち培養液のセルラーゼ活性の最も高い変異株
トリコデルマ・リーセイＲＴ−５（ＦＥＰＭ−Ｐ　９３
７６）を得た。

本発明で実施される変異株の培養法は親株の場合と同様
の方法により実施され、固体培養法、液体培養法のいず
れでも生産される。固体培養法、液体培養法のいずれで
も生産される。培養はｐＨ４〜９．０、温度３０〜５０
℃で２〜１４日間行う。

この場合セルラーゼ生産に用いられる培地の炭素源とし
ては、親株の場合と同様に、濾紙、一般紙類、オガクヅ
、大豆粕、コーヒー粕等の植物繊維質およびその含有物
が用いられる。窒素源としては、硫安等の無機アンモニ
ウム塩、尿素、アミノ酸、肉エキス、ペプトン、蛋白分
解物等の有機窒素源が使用される。その他、Ｋ）ＩｚＰ
Ｏ，ＭｇＳＯ４゜ＣａＣｊ！　ｚ、　ＣｏＣ１ｚ、　Ｆ
ｅ５０＊、　Ｍｎ５Ｏ，、Ｚｎ５Ｏａ等の無機塩類さ・
らに必要に応じて有機微量栄養源を含有する栄養培地が
使用される。

このような方法で培養して得られた培養液はそのまま酵
素源として使用できるが、得られた培養液から分離した
菌体および培養濾液はいずれも粗酵素として使用するこ
ともできる。また菌体を除去した培養液から、塩析法、
有機溶剤による沈澱決算公知の方法を用いることにより
、強力な活性を有する粗酵素剤を得ることができる。

本明細書におけるセルラーゼ活性は以下の方法で測定し
た。すなわち、濾紙（ワットマンＮｏ、１）５０■を基
質とし、これに酵素液０．５ａｄと酢酸酸緩衝液（ｐＨ
４，９，０，０５Ｍ）　１．０ｍを加え、６０℃で１．
０時間酵素反応を行った後、１００℃で５．０分間加熱
し酵素反応を停止させ、これにジニトロサルチル酸試薬
３．０−を加え、１００℃で５．０分間加熱し発色させ
る。これに水１６絨を加え５５０ｎｍの波長で比色定置
し、生成した還元糖量を求めてフィルターペーパー活性
（ＦＰＡ）で表示した。なお、トリコデルマ・リーセイ
変異株のセルラーゼ活性の場合には５０℃で反応を行っ
た。

実施例Ｉ スボロトリクム・セルロフィルムＡＪ　１１７１１６　
（ＦＥＲＭ−Ｐ　７０３７）及びそのプロテアーゼ産性
能低下変異株ＡＪ　１１７１６３（ＦＥＲＭ−Ｐ　９３
７５）をＰＡＤ培地ｐＨ６，０のスラントを用いて４５
℃５日間、引続き２６°ｃ３日間培養して充分胞子を形
成させた。スラント上の胞子及び菌体を７５１１の上記
セルラーゼ生産培地を含む５００１１１容坂ロフラスコ
に接種し４８℃で４日間振盪培養（振幅７．０ＣＩ、　
１２０ｒｐｅ＋）３日目と培養終了後、培養液を３００
０ｒｐＩ１１で遠心して、培養濾液を分離し、この培養
濾液中のセルラーゼ活性及びプロテアーゼ活性を測定し
たところ下表に示すような結果が得られた。

実施例２ トリコデルマ・リーセイＡＴＣＣ２６９２１及びそのプ
ロテアーゼ産生能低下変異株ＴＲ−ＴＲ−５（ＦＥＲ９
３７６）をＰＤＡ培地ｐＨ６，０のスラントに３０℃で
１５日間培養した。スラント上に生育した菌体を実施例
１と同じ培養液に接種し、３０℃で１０日間振盪培養し
た。

培養８日及び１０日口の培養液のセルラーゼ活性及びプ
ロテアーゼ活性を測定したところ下表の示すような結果
が得られた。

親株ＡＴＣＣ２６９２１４，０３，８１３，６１４，１
実施例３ セルロース粉末（出隅国策バルブ社製ＫＣフロック）を
０．０５Ｍ酢酸緩衝液に懸濁し、これに酵素と酢酸エチ
ル（０，２％）を添加した。酵素は実施例１と同様な条
件で調製したスボロトリクム、セルロフィルムＡＪ　１
１７１１６　（ＦＥＲＭ−Ｐ　７０３７）とプロテアー
ゼ産生能低下変異株ＡＪ１１７１６３（ＦＥＲＭ−Ｐ　
９３７５）の培地濾液の限外濾過濃縮・凍結乾燥標品を
用いた。この反応液２０〜４０℃を第１図に示したよう
な膜リアクターの中う入れ、リアター全体を温度５０”
Ｃになるように制御した。用いた膜は日東電工■製のチ
ェーブラ型ＵＦ膜（ＮＴＵ−３０２０）　（分画分子量
２００００）である。反応は連続的に行い、ＵＦ膜を透
過する糖化液量に見合った量のセルロース懸濁液を常に
供給し、反応液量を一定に保った。

親株（ＦＥＲＭ−Ｐ　７０３７）及び変異株（ＦＥＲＭ
−Ｐ　９３７５）のセルラーゼ標品を使用した場合の糖
化液中のグルコース濃度を測定した結果を第２図に示し
た。

第２図が示すようにリアクターを用いた連続糖化には親
株よりもプロテアーゼ産生能低下変異株（ＦＥＲＭ−Ｐ
　９３７５）の方がより高い糖化活性を維持しているこ
とがわかった。

〔発明の効果〕

本発明のセルラーゼ製剤を用いることによりセルロース
から酵素法でグルコースを効率よ（かつ高収率で取得す
ることができる。

【図面の簡単な説明】

第１図はセルラーゼにセルロースの連続糖化装置を示し
たものであり、第２図は連続糖化による糖化液中のグル
コース濃度を経時的に示したものである。 特許出願人　新燃料油開発技術研究組合代理人　　　弁
理士　日中　政治　はか１名手続補正書（自発） 昭和６２年８月５日 特許庁長官　　小　川　邦　夫　殿 ｌ　事件の表示 特願昭６２−１４８０５４号 ２　発明の名称 セルラーゼの製造法 ３　補正をする者 事件との関係　　　特許出願人 名　　　　称　　　新燃料油開発技術研究組合４代理人 居所　　〒１０４東京都中央区八丁堀三丁目２１番３−
６０７号６　補正の内容 （１）　　明細書の第６頁第１７行に記載されたｒｌ、
０３ＪをｒＱ、０３Ｊと訂正する。 （２）明細書の第１２頁第６行に記載された［リアター
」を「リアクター」と訂正する。 以上

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. マンデルスの培地にセルラーゼ生産量が最大値に達する
   まで至適温度で培養したときのプロテアーゼ副生量が１
   ０単位／ｍｌ以下である糸状菌をセルロースを含有する
   栄養培地に培養し、培養物からセルラーゼを採取するこ
   とを特徴とするセルラーゼの製造法