JPH1066569A - エンドグルカナーゼ - Google Patents
エンドグルカナーゼInfo
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- JPH1066569A JPH1066569A JP24398696A JP24398696A JPH1066569A JP H1066569 A JPH1066569 A JP H1066569A JP 24398696 A JP24398696 A JP 24398696A JP 24398696 A JP24398696 A JP 24398696A JP H1066569 A JPH1066569 A JP H1066569A
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- carboxymethylcellulose
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 アクレモニウム・セルロリティカス由来のセ
ルラーゼ系を構成する種々の酵素中の有効成分であるエ
ンドグルカナーゼを提供すること。 【解決手段】 糸状菌アクレモニウム・セルロリティカ
スに由来し、アビセル糖化活性が低く、カルボキシメチ
ルセルロース液化活性とカルボキシメチルセルロース糖
化活性の比率が中エンド型を示し、カルボキシメチルセ
ルロースを基質とした糖化活性では至適ｐＨが4.０であ
り、分子量が３8,０００（ＳＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動法による）であるエンドグルカナーゼ。
ルラーゼ系を構成する種々の酵素中の有効成分であるエ
ンドグルカナーゼを提供すること。 【解決手段】 糸状菌アクレモニウム・セルロリティカ
スに由来し、アビセル糖化活性が低く、カルボキシメチ
ルセルロース液化活性とカルボキシメチルセルロース糖
化活性の比率が中エンド型を示し、カルボキシメチルセ
ルロースを基質とした糖化活性では至適ｐＨが4.０であ
り、分子量が３8,０００（ＳＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動法による）であるエンドグルカナーゼ。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、エンドグルカナー
ゼに関し、詳しくは糸状菌アクレモニウム・セルロリテ
ィカスに由来する新規なエンドグルカナーゼに関する。
ゼに関し、詳しくは糸状菌アクレモニウム・セルロリテ
ィカスに由来する新規なエンドグルカナーゼに関する。
【０００２】
【従来の技術】セルロースは、高等植物細胞壁の主要な
構成成分であり、広く天然に存在する酵素である。セル
ロースは、グルコースを単位とするβ-1，4-グルコシド
結合により重合した高分子多糖であり、天然にはセルロ
ースが結晶状、あるいは非結晶状で存在しており、更に
は他の成分、リグニン、へミセルロース類、ペクチン類
などとも複雑に結合して植物組織を構成している。セル
ラーゼは、セルロースをセロオリゴ糖、セロビオース、
最終的にはグルコースにまで分解する酵素反応系を触媒
する酵素群の総称であり、その作用様式によって、エン
ドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼ、β−グルコシダ
ーゼなどに大別される。それらの作用様式の詳細まで比
較すると非常に多数の酵素が存在するので、従来から様
々な作用様式を示す酵素が互いに補い合って、相乗効果
を発現して植物組織としてのセルロースを分解するもの
と考えられてきた。しかし最近、飼料用酵素分野などで
は、それらセルラーゼ群の中で特に効果的なセルラーゼ
成分の検討が進み、エンドグルカナーゼが主要な役割を
果たしていることが判明しつつある（例えば、WO95／16
360 公報）。
構成成分であり、広く天然に存在する酵素である。セル
ロースは、グルコースを単位とするβ-1，4-グルコシド
結合により重合した高分子多糖であり、天然にはセルロ
ースが結晶状、あるいは非結晶状で存在しており、更に
は他の成分、リグニン、へミセルロース類、ペクチン類
などとも複雑に結合して植物組織を構成している。セル
ラーゼは、セルロースをセロオリゴ糖、セロビオース、
最終的にはグルコースにまで分解する酵素反応系を触媒
する酵素群の総称であり、その作用様式によって、エン
ドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼ、β−グルコシダ
ーゼなどに大別される。それらの作用様式の詳細まで比
較すると非常に多数の酵素が存在するので、従来から様
々な作用様式を示す酵素が互いに補い合って、相乗効果
を発現して植物組織としてのセルロースを分解するもの
と考えられてきた。しかし最近、飼料用酵素分野などで
は、それらセルラーゼ群の中で特に効果的なセルラーゼ
成分の検討が進み、エンドグルカナーゼが主要な役割を
果たしていることが判明しつつある（例えば、WO95／16
360 公報）。
【０００３】糸状菌アクレモニウム・セルロリティカス
（Acremonium cellulolyticus）の生産するセルラーゼ
は糖化力の強いことが特徴であり、飼料用途やサイレー
ジ用途での有用性が報告されている（例えば、特開平4-
117244号公報、特開平7-236431号公報）。また、含有さ
れているセルラーゼ成分についても報告されている（例
えば、Agric. Biol. Chem., 52, 2493〜2501(1988)、同
誌53, 3359〜3360（1989）、同誌54, 309 〜317(1990)
）。しかし、そのセルラーゼ酵素群の中でどの成分が
有効成分であるかについては十分に知られていなかっ
た。
（Acremonium cellulolyticus）の生産するセルラーゼ
は糖化力の強いことが特徴であり、飼料用途やサイレー
ジ用途での有用性が報告されている（例えば、特開平4-
117244号公報、特開平7-236431号公報）。また、含有さ
れているセルラーゼ成分についても報告されている（例
えば、Agric. Biol. Chem., 52, 2493〜2501(1988)、同
誌53, 3359〜3360（1989）、同誌54, 309 〜317(1990)
）。しかし、そのセルラーゼ酵素群の中でどの成分が
有効成分であるかについては十分に知られていなかっ
た。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】そこで本発明者らは、
アクレモニウム・セルロリティカス由来のセルラーゼ系
を構成する種々の酵素を分画、精製して鋭意検討した。
その結果、酵素群の中の有効成分を見出し、本発明を完
成した。本発明は、新規なエンドグルカナーゼの提供を
目的とするものである。
アクレモニウム・セルロリティカス由来のセルラーゼ系
を構成する種々の酵素を分画、精製して鋭意検討した。
その結果、酵素群の中の有効成分を見出し、本発明を完
成した。本発明は、新規なエンドグルカナーゼの提供を
目的とするものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】請求項１に記載の本発明
は、糸状菌アクレモニウム・セルロリティカスに由来
し、下記の性質を有するエンドグルカナーゼである。 (a) 作用：アビセル糖化活性が低く、カルボキシメチル
セルロース液化活性とカルボキシメチルセルロース糖化
活性の比率が中エンド型を示す。 (b) 基質特異性：本酵素はカルボキシメチルセルロース
に作用する。 (c) 至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲：カルボキシメチルセル
ロースを基質とした糖化活性では、至適ｐＨは4.０であ
り、ｐＨ4.２〜１0.０（４℃、２４時間）の範囲で安定
である。 (d) 作用最適温度：カルボキシメチルセルロースを基質
とした糖化活性では、６０℃である。 (e) 温度安定性：６０℃以下で安定である（ｐＨ 4.
０、１０分）。 (f) 等電点：ｐＩ 3.２〜3.４（ポリアクリルアミドゲ
ル等電点電気泳動法による） (g) 分子量：３8,０００（ＳＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動法による） (h) 比活性：９1.７単位／ｍｇ蛋白質（カルボキシメチ
ルセルロース糖化活性） 0.０８単位／ｍｇ蛋白質（アビセル糖化活性） (i) Ｎ末端アミノ酸配列：配列表の配列番号１記載の配
列を有する。
は、糸状菌アクレモニウム・セルロリティカスに由来
し、下記の性質を有するエンドグルカナーゼである。 (a) 作用：アビセル糖化活性が低く、カルボキシメチル
セルロース液化活性とカルボキシメチルセルロース糖化
活性の比率が中エンド型を示す。 (b) 基質特異性：本酵素はカルボキシメチルセルロース
に作用する。 (c) 至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲：カルボキシメチルセル
ロースを基質とした糖化活性では、至適ｐＨは4.０であ
り、ｐＨ4.２〜１0.０（４℃、２４時間）の範囲で安定
である。 (d) 作用最適温度：カルボキシメチルセルロースを基質
とした糖化活性では、６０℃である。 (e) 温度安定性：６０℃以下で安定である（ｐＨ 4.
０、１０分）。 (f) 等電点：ｐＩ 3.２〜3.４（ポリアクリルアミドゲ
ル等電点電気泳動法による） (g) 分子量：３8,０００（ＳＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動法による） (h) 比活性：９1.７単位／ｍｇ蛋白質（カルボキシメチ
ルセルロース糖化活性） 0.０８単位／ｍｇ蛋白質（アビセル糖化活性） (i) Ｎ末端アミノ酸配列：配列表の配列番号１記載の配
列を有する。
【０００６】
【発明の実施の形態】本発明のエンドグルカナーゼは、
アクレモニウム・セルロリティカスが生産するセルラー
ゼ系中に含まれる有効成分である。以下に本発明を詳細
に説明する。本発明のエンドグルカナーゼを含むセルラ
ーゼ系を生産する微生物としては、アクレモウム・セル
ロリティカス Y-94 株(FERM P-6867) 、アクレモウム・
セルロリティカス TN 株(FERM BP-685) などがあり、本
菌によるセルラーゼの製造については、例えば特公昭60
-43954号公報、特公昭63-63197号公報に記載された方法
に従って行えば良い。上記微生物の培養終了後、培養物
を遠心分離等により除去して得た上清液を粗酵素として
用いることもできるが、通常は、この上清液を限外濾過
法などにより濃縮し、防腐剤などを加えて濃縮酵素とす
るか、濃縮後スプレードライ法によって粉末酵素とす
る。
アクレモニウム・セルロリティカスが生産するセルラー
ゼ系中に含まれる有効成分である。以下に本発明を詳細
に説明する。本発明のエンドグルカナーゼを含むセルラ
ーゼ系を生産する微生物としては、アクレモウム・セル
ロリティカス Y-94 株(FERM P-6867) 、アクレモウム・
セルロリティカス TN 株(FERM BP-685) などがあり、本
菌によるセルラーゼの製造については、例えば特公昭60
-43954号公報、特公昭63-63197号公報に記載された方法
に従って行えば良い。上記微生物の培養終了後、培養物
を遠心分離等により除去して得た上清液を粗酵素として
用いることもできるが、通常は、この上清液を限外濾過
法などにより濃縮し、防腐剤などを加えて濃縮酵素とす
るか、濃縮後スプレードライ法によって粉末酵素とす
る。
【０００７】本発明のエンドグルカナーゼは、これら濃
縮酵素又は粉末酵素を必要に応じて部分精製又は高度に
精製して得ることができる。精製方法としては常法、即
ち硫安などによる塩析法、アルコールなどによる有機溶
媒沈澱法、膜分離法、イオン交換体、疎水クロマトグラ
フ用担体、ゲル濾過用担体などを用いるクロマト分離法
などを単独又は適宜組み合わせて用いることができる。
縮酵素又は粉末酵素を必要に応じて部分精製又は高度に
精製して得ることができる。精製方法としては常法、即
ち硫安などによる塩析法、アルコールなどによる有機溶
媒沈澱法、膜分離法、イオン交換体、疎水クロマトグラ
フ用担体、ゲル濾過用担体などを用いるクロマト分離法
などを単独又は適宜組み合わせて用いることができる。
【０００８】本発明によって得られる高純度に精製され
たエンドグルカナーゼの性質は下記の通りである。この
酵素は今までの文献には知られていない新規酵素であ
る。 (a) 作用：アビセル（Avicel）糖化活性が低く、カルボ
キシメチルセルロース(CMC) 液化活性とCMC 糖化活性の
比率が中エンド型を示す（図２）。 (b）基質特異性: 本酵素はCMC に作用する。 (c) 至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲：CMC を基質とした糖化
活性（３０℃）では、至適ｐＨは4.０であり（図３）、
CMC を基質とした糖化活性（４℃、２４時間）ではｐＨ
4.２〜１0.０の範囲で安定であり（図４ａ）、４５℃、
２時間ではｐＨ4.４〜１0.０の範囲で安定である（図４
ｂ）。 (d) 作用最適温度：CMC を基質とした糖化活性（ｐＨ
4.０）では、６０℃である（図５）。 (e) 温度安定性：６０℃以下で安定である（ｐＨ 4.
０、１０分）（図６）。 (f) 等電点：ｐＩ 3.２〜3.４（ポリアクリルアミドゲ
ル等電点電気泳動法による） (g) 分子量：３8,０００（ＳＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動法による）（図７） (h) 比活性：９1.７単位／ｍｇ蛋白質（CMC 糖化活性） 0.０８単位／ｍｇ蛋白質（アビセル糖化活性） (i) Ｎ末端アミノ酸配列：配列表の配列番号１記載の配
列（２５残基）（パーキンエルマー社製、プロテインシ
ーケンサー Model 492による）を有する。
たエンドグルカナーゼの性質は下記の通りである。この
酵素は今までの文献には知られていない新規酵素であ
る。 (a) 作用：アビセル（Avicel）糖化活性が低く、カルボ
キシメチルセルロース(CMC) 液化活性とCMC 糖化活性の
比率が中エンド型を示す（図２）。 (b）基質特異性: 本酵素はCMC に作用する。 (c) 至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲：CMC を基質とした糖化
活性（３０℃）では、至適ｐＨは4.０であり（図３）、
CMC を基質とした糖化活性（４℃、２４時間）ではｐＨ
4.２〜１0.０の範囲で安定であり（図４ａ）、４５℃、
２時間ではｐＨ4.４〜１0.０の範囲で安定である（図４
ｂ）。 (d) 作用最適温度：CMC を基質とした糖化活性（ｐＨ
4.０）では、６０℃である（図５）。 (e) 温度安定性：６０℃以下で安定である（ｐＨ 4.
０、１０分）（図６）。 (f) 等電点：ｐＩ 3.２〜3.４（ポリアクリルアミドゲ
ル等電点電気泳動法による） (g) 分子量：３8,０００（ＳＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動法による）（図７） (h) 比活性：９1.７単位／ｍｇ蛋白質（CMC 糖化活性） 0.０８単位／ｍｇ蛋白質（アビセル糖化活性） (i) Ｎ末端アミノ酸配列：配列表の配列番号１記載の配
列（２５残基）（パーキンエルマー社製、プロテインシ
ーケンサー Model 492による）を有する。
【０００９】ここで当該酵素の活性測定法と１単位の定
義については以下の通りとした。 ・アビセル糖化活性 ｐＨ4.０，４０℃で1 ％アビセル懸濁液に酵素を作用さ
せ、１分間に１μｍｏｌのグルコースに相当する還元糖
を生成する酵素量を１単位と定義した。 ・CMC 糖化活性 ｐＨ4.０，３０℃で0.２５％ CMC溶液に酵素を作用さ
せ、１分間に１μｍｏｌのグルコースに相当する還元糖
を生成する酵素量を１単位と定義した。 ・CMC 液化活性 キャノン・フェンスケ粘度計を用いて、ｐＨ4.０，３０
℃で0.２５％ CMC溶液に酵素を作用させ、経時的に反応
混液の流動度（η）を測定し、比流動度（φsp. ＝１／
η）をCMC 液化活性とした。
義については以下の通りとした。 ・アビセル糖化活性 ｐＨ4.０，４０℃で1 ％アビセル懸濁液に酵素を作用さ
せ、１分間に１μｍｏｌのグルコースに相当する還元糖
を生成する酵素量を１単位と定義した。 ・CMC 糖化活性 ｐＨ4.０，３０℃で0.２５％ CMC溶液に酵素を作用さ
せ、１分間に１μｍｏｌのグルコースに相当する還元糖
を生成する酵素量を１単位と定義した。 ・CMC 液化活性 キャノン・フェンスケ粘度計を用いて、ｐＨ4.０，３０
℃で0.２５％ CMC溶液に酵素を作用させ、経時的に反応
混液の流動度（η）を測定し、比流動度（φsp. ＝１／
η）をCMC 液化活性とした。
【００１０】
【実施例】次に、本発明を実施例により詳しく説明す
る。 実施例１（酵素原末の調製） アクレモニウム属微生物由来のセルラーゼ製剤を得るた
め、下記の手法により微生物の培養を行った。培地は、
すべて以下の組成よりなる培地を常法により加熱殺菌し
たものを用いた。セルロース４％、リン酸水素二カリウ
ム1.２％、バクトペプトン１％、硝酸カリウム0.６％、
尿素0.２％、塩化カリウム0.１６％、硫酸マグネシウム
七水塩0.１２％、硫酸亜鉛七水塩0.００１％、硫酸マン
ガン七水塩0.００１％、硫酸銅五水塩0.００１％（ｐＨ
4.０）。培地５００ｍｌにアクレモニウム・セルロリテ
ィカス TN 株（FERM BP-685 ）を接種し、３０℃で４８
時間攪拌しながら培養した。次に、この培養液をシード
として１５Ｌにスケールアップし、更にスケールアップ
を続けて最終的に６００Ｌタンク中の培養液量を３００
Ｌとし、通気攪拌培養を７日間行った。得られた培養液
をフィルタープレスで濾過した後、限外濾過により１５
Ｌまで濃縮し、乳糖２ｋｇを添加してスプレードライに
より粉末化した。この方法で得られたセルラーゼ製剤は
5.０ｋｇであった。
る。 実施例１（酵素原末の調製） アクレモニウム属微生物由来のセルラーゼ製剤を得るた
め、下記の手法により微生物の培養を行った。培地は、
すべて以下の組成よりなる培地を常法により加熱殺菌し
たものを用いた。セルロース４％、リン酸水素二カリウ
ム1.２％、バクトペプトン１％、硝酸カリウム0.６％、
尿素0.２％、塩化カリウム0.１６％、硫酸マグネシウム
七水塩0.１２％、硫酸亜鉛七水塩0.００１％、硫酸マン
ガン七水塩0.００１％、硫酸銅五水塩0.００１％（ｐＨ
4.０）。培地５００ｍｌにアクレモニウム・セルロリテ
ィカス TN 株（FERM BP-685 ）を接種し、３０℃で４８
時間攪拌しながら培養した。次に、この培養液をシード
として１５Ｌにスケールアップし、更にスケールアップ
を続けて最終的に６００Ｌタンク中の培養液量を３００
Ｌとし、通気攪拌培養を７日間行った。得られた培養液
をフィルタープレスで濾過した後、限外濾過により１５
Ｌまで濃縮し、乳糖２ｋｇを添加してスプレードライに
より粉末化した。この方法で得られたセルラーゼ製剤は
5.０ｋｇであった。
【００１１】実施例２（エンドグルカナーゼの精製） 実施例１で得られた原末を酢酸緩衝液（ｐＨ5.５）に溶
解し、不純物を高速冷却遠心分離により除去した。得ら
れた上清を酵素精製の出発材料として以下に示した方法
で精製した。 強塩基性陰イオン交換クロマトグラフィー： QAE−ト
ヨパール550C（東ソー（株））に上清を吸着させ、酢酸
緩衝液（0.０２Ｍ、ｐＨ5.５）中にＮａＣｌ各０、0.０
８、0.１５、0.５Ｍを含有せしめ、ステップワイズ溶出
を行い、0.５ＭＮａＣｌで溶出されるセルラーゼ活性画
分を分取した。 弱塩基性イオン交換クロマトグラフィー：DEAE−トヨ
パール650S（東ソー（株））に上記の分取画分を吸着
させ酢酸緩衝液（0.０２Ｍ、ｐＨ5.５）中にＮａＣｌ各
０、0.１４Ｍを含有せしめ、ステップワイズ溶出を行
い、0.１４Ｍ ＮａＣｌで溶出されるセルラーゼ活性画
分を分取した。
解し、不純物を高速冷却遠心分離により除去した。得ら
れた上清を酵素精製の出発材料として以下に示した方法
で精製した。 強塩基性陰イオン交換クロマトグラフィー： QAE−ト
ヨパール550C（東ソー（株））に上清を吸着させ、酢酸
緩衝液（0.０２Ｍ、ｐＨ5.５）中にＮａＣｌ各０、0.０
８、0.１５、0.５Ｍを含有せしめ、ステップワイズ溶出
を行い、0.５ＭＮａＣｌで溶出されるセルラーゼ活性画
分を分取した。 弱塩基性イオン交換クロマトグラフィー：DEAE−トヨ
パール650S（東ソー（株））に上記の分取画分を吸着
させ酢酸緩衝液（0.０２Ｍ、ｐＨ5.５）中にＮａＣｌ各
０、0.１４Ｍを含有せしめ、ステップワイズ溶出を行
い、0.１４Ｍ ＮａＣｌで溶出されるセルラーゼ活性画
分を分取した。
【００１２】疎水クロマトグラフィー：ブチルトヨパ
ール（東ソー（株））に前記の分取画分を吸着させ、
酢酸緩衝液（0.０２Ｍ、ｐＨ3.５）中に（ＮＨ4)2 ＳＯ
4 を溶解せしめ、（ＮＨ4)2 ＳＯ4 0.５Ｍから０Ｍの
リニアグラジエント溶出と、その後脱イオン水溶出を行
い、酢酸緩衝液＋（ＮＨ4)2 ＳＯ4 ０Ｍ画分を分取
し、この画分中にセルラーゼ活性を集中的に回収した。 ゲル濾過クロマトグラフィー：バイオゲルＰ-100（バ
イオラッド社）にの分取画分を酢酸緩衝液（0.０５
Ｍ、ｐＨ5.０）を用いて通過させ、セルラーゼ活性画分
を分取した。これら画分の蛋白質量とCMC 糖化活性の測
定値を図１に示した。 以上の方法により、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動法により単一蛋白質成分になるまで高度に精製し
た。
ール（東ソー（株））に前記の分取画分を吸着させ、
酢酸緩衝液（0.０２Ｍ、ｐＨ3.５）中に（ＮＨ4)2 ＳＯ
4 を溶解せしめ、（ＮＨ4)2 ＳＯ4 0.５Ｍから０Ｍの
リニアグラジエント溶出と、その後脱イオン水溶出を行
い、酢酸緩衝液＋（ＮＨ4)2 ＳＯ4 ０Ｍ画分を分取
し、この画分中にセルラーゼ活性を集中的に回収した。 ゲル濾過クロマトグラフィー：バイオゲルＰ-100（バ
イオラッド社）にの分取画分を酢酸緩衝液（0.０５
Ｍ、ｐＨ5.０）を用いて通過させ、セルラーゼ活性画分
を分取した。これら画分の蛋白質量とCMC 糖化活性の測
定値を図１に示した。 以上の方法により、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動法により単一蛋白質成分になるまで高度に精製し
た。
【００１３】実施例３ 実施例２で得た精製エンドグルカナーゼのCMC に対する
エンド水解度の程度を下記の方法で調べた。ｐＨ4.０、
３０℃で0.２５％のCMC 溶液に一定量の当該酵素を作用
させ、経時的に採取した一定量の反応混液中の還元糖を
定量し、これをCMC 糖化活性（還元糖生成力）とした。
一方、上記と全く同一の反応組成及び反応条件下で酵素
反応を行い、粘度計を用いて経時的に反応混液の流動度
（η）を測定し、比流動度（φsp. ＝１／η）を求め、
これをCMC 液化活性（粘度低下力）とした。経時的に測
定されたCMC 糖化活性とCMC 液化活性とを相関させた結
果が図２である。一般に、このようにして得られた直線
の勾配は約４５°で、当該エンドグルカナーゼが中エン
ド型の酵素であることを示している。なお、この図の横
軸のグルコース換算還元糖はSomogyi-Nelson方法で測定
し、縦軸の比流動度はキャノン・フェンスケ粘度計を用
いて測定した流動度に基づいて算出された。
エンド水解度の程度を下記の方法で調べた。ｐＨ4.０、
３０℃で0.２５％のCMC 溶液に一定量の当該酵素を作用
させ、経時的に採取した一定量の反応混液中の還元糖を
定量し、これをCMC 糖化活性（還元糖生成力）とした。
一方、上記と全く同一の反応組成及び反応条件下で酵素
反応を行い、粘度計を用いて経時的に反応混液の流動度
（η）を測定し、比流動度（φsp. ＝１／η）を求め、
これをCMC 液化活性（粘度低下力）とした。経時的に測
定されたCMC 糖化活性とCMC 液化活性とを相関させた結
果が図２である。一般に、このようにして得られた直線
の勾配は約４５°で、当該エンドグルカナーゼが中エン
ド型の酵素であることを示している。なお、この図の横
軸のグルコース換算還元糖はSomogyi-Nelson方法で測定
し、縦軸の比流動度はキャノン・フェンスケ粘度計を用
いて測定した流動度に基づいて算出された。
【００１４】実施例４ 実施例２で得たエンドグルカナーゼの３０℃における至
適ｐＨを図３に示す。本酵素は McIlvaine緩衝液でｐＨ
4.０のときに最大の活性を示した。また、本酵素の４℃
におけるｐＨ安定性を図４ａに、４５℃におけるｐＨ安
定性を図４ｂにそれぞれ示す。図中の●と■はMcIlvain
e 緩衝液を示し、○と□はBritton & Robinson緩衝液を
示す。
適ｐＨを図３に示す。本酵素は McIlvaine緩衝液でｐＨ
4.０のときに最大の活性を示した。また、本酵素の４℃
におけるｐＨ安定性を図４ａに、４５℃におけるｐＨ安
定性を図４ｂにそれぞれ示す。図中の●と■はMcIlvain
e 緩衝液を示し、○と□はBritton & Robinson緩衝液を
示す。
【００１５】実施例５ 実施例２で得たエンドグルカナーゼの作用最適温度を調
べるため、CMC を基質とした糖化活性を測定したとこ
ろ、図５に示したように、至適温度は６０℃（ｐＨ4.
０）であった。次に、本酵素の温度安定性をｐＨ4.０、
１０分の条件で測定したところ、図６に示したように、
６０℃以下で安定であった。
べるため、CMC を基質とした糖化活性を測定したとこ
ろ、図５に示したように、至適温度は６０℃（ｐＨ4.
０）であった。次に、本酵素の温度安定性をｐＨ4.０、
１０分の条件で測定したところ、図６に示したように、
６０℃以下で安定であった。
【００１６】実施例６ 実施例２で得たエンドグルカナーゼの分子量を決定する
ため、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行っ
た。すなわち、１2.５％ゲルを用いて２０ｍＡの定電流
で室温にて５０分間通電して行った。その結果、本酵素
の分子量は約３8,０００と算出された。なお、この試験
に用いた標準サンプルの分子量は以下の通りである。 Phosphorylase b ９7,０００ Serum albumin ６6,０００ Ovalbumin ４5,０００ Carbonic anhydrase ３1,０００ Trypsin inhibitor ２1,５００ Lysozyme １4,４００
ため、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行っ
た。すなわち、１2.５％ゲルを用いて２０ｍＡの定電流
で室温にて５０分間通電して行った。その結果、本酵素
の分子量は約３8,０００と算出された。なお、この試験
に用いた標準サンプルの分子量は以下の通りである。 Phosphorylase b ９7,０００ Serum albumin ６6,０００ Ovalbumin ４5,０００ Carbonic anhydrase ３1,０００ Trypsin inhibitor ２1,５００ Lysozyme １4,４００
【００１７】実施例７ 実施例２で得られたエンドグルカナーゼのＮ末端アミノ
酸配列を決定した。まず、８％Gel SDS-PAGE mini （テ
フコ社製）を用いて電気泳動分離を行った後、マルチフ
ォーII（ファルマシアバイオテク社製）にて、ＰＶＤＦ
膜（ミリポア社製）に、タンパク質を電気的にうつしと
り、コマジーブリリアントブルーＲ−２５０（ナカライ
テスク社製）で染色した後、水で洗浄し、風乾した。こ
こから分子量３8,０００のタンパク質がブロットされて
いる部分を切り出し、プロテインシーケンサーModel492
（パーキンエルマー社製）に供し、Ｎ末端アミノ酸の決
定を試みたが、エドマン分解により切り出されるアミノ
酸が得られず、Ｎ末端側アミノ酸が修飾保護されている
ことが判明した。そこで、先の染色し、洗浄したメンブ
レンから分子量３8,０００のタンパク質を切り出し、Po
dell,D.N. 等, Biochem. Biophys. Res. Commun.,(197
8), 81:176 の方法に従って、牛肝臓ピログルタメート
ペプチダーゼ（ベーリンガー社製）を用いて処理するこ
とにより、修飾Ｎ末端残基を除去した。しかる後、再度
前記したプロテインシーケンサーにより、Ｎ末端側アミ
ノ酸配列を２５残基決定した。得られた配列は配列表の
配列番号１に示される通りであった。
酸配列を決定した。まず、８％Gel SDS-PAGE mini （テ
フコ社製）を用いて電気泳動分離を行った後、マルチフ
ォーII（ファルマシアバイオテク社製）にて、ＰＶＤＦ
膜（ミリポア社製）に、タンパク質を電気的にうつしと
り、コマジーブリリアントブルーＲ−２５０（ナカライ
テスク社製）で染色した後、水で洗浄し、風乾した。こ
こから分子量３8,０００のタンパク質がブロットされて
いる部分を切り出し、プロテインシーケンサーModel492
（パーキンエルマー社製）に供し、Ｎ末端アミノ酸の決
定を試みたが、エドマン分解により切り出されるアミノ
酸が得られず、Ｎ末端側アミノ酸が修飾保護されている
ことが判明した。そこで、先の染色し、洗浄したメンブ
レンから分子量３8,０００のタンパク質を切り出し、Po
dell,D.N. 等, Biochem. Biophys. Res. Commun.,(197
8), 81:176 の方法に従って、牛肝臓ピログルタメート
ペプチダーゼ（ベーリンガー社製）を用いて処理するこ
とにより、修飾Ｎ末端残基を除去した。しかる後、再度
前記したプロテインシーケンサーにより、Ｎ末端側アミ
ノ酸配列を２５残基決定した。得られた配列は配列表の
配列番号１に示される通りであった。
【００１８】
【発明の効果】本発明の酵素エンドグルカナーゼは、糖
化力が強いとされるアクレモニウム由来のセルラーゼの
主成分の一つであり、その性質が初めて明らかになっ
た。本酵素は、飼料、サイレージなどの用途に有用であ
る。
化力が強いとされるアクレモニウム由来のセルラーゼの
主成分の一つであり、その性質が初めて明らかになっ
た。本酵素は、飼料、サイレージなどの用途に有用であ
る。
【００１９】
【００２０】配列番号：１ 配列の長さ：２５アミノ酸残基 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴 アクレモニウム・セルロリティカス由来のエンドグルカ
ナーゼのＮ末端アミノ酸配列 存在位置：Ｎ末端 配列： Ala-Ser-(Cys)-Phe-Glu-Trp-Phe-Gly-Ser-Asn-Glu-Ser-
Gly-Ala-Glu-Phe-Gly-Ser-Gly-Asn-Ile-Pro-Gly-Val-Gl
u-（２５残基）
ナーゼのＮ末端アミノ酸配列 存在位置：Ｎ末端 配列： Ala-Ser-(Cys)-Phe-Glu-Trp-Phe-Gly-Ser-Asn-Glu-Ser-
Gly-Ala-Glu-Phe-Gly-Ser-Gly-Asn-Ile-Pro-Gly-Val-Gl
u-（２５残基）
【図１】 バイオゲルＰ-100によるゲル濾過クロマトグ
ラフィー分画図である。
ラフィー分画図である。
【図２】 本酵素のＣＭＣに対する糖化活性と液化活性
を相関させた図である。
を相関させた図である。
【図３】 本酵素の至適ｐＨを示す図である。
【図４】 ａは４℃、２４時間での本酵素の安定ｐＨ範
囲を、ｂは４５℃、２時間での本酵素の安定ｐＨ範囲を
示す図である。
囲を、ｂは４５℃、２時間での本酵素の安定ｐＨ範囲を
示す図である。
【図５】 本酵素の最適温度を示す図である。
【図６】 本酵素の温度安定性を示す図である。
【図７】 本酵素の分子量を測定した際のＳＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動分析を示す図である。
アクリルアミドゲル電気泳動分析を示す図である。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成９年３月３日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００６】
【発明の実施の形態】本発明のエンドグルカナーゼは、
アクレモニウム・セルロリティカスが生産するセルラー
ゼ系中に含まれる有効成分である。以下に本発明を詳細
に説明する。本発明のエンドグルカナーゼを含むセルラ
ーゼ系を生産する微生物としては、アクレモウム・セル
ロリティカスＹ−９４株（ＦＥＲＭ ＢＰ−５８２
６）、アクレモウム・セルロリティカスＴＮ株（ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−６８５）などがあり、本菌によるセルラーゼ
の製造については、例えば特公昭６０−４３９５４号公
報、特公昭６３−６３１９７号公報に記載された方法に
従って行えば良い。上記微生物の培養終了後、培養物を
遠心分離等により除去して得た上清液を粗酵素として用
いることもできるが、通常は、この上清液を限外濾過法
などにより濃縮し、防腐剤などを加えて濃縮酵素とする
か、濃縮後スプレードライ法によって粉末酵素とする。
アクレモニウム・セルロリティカスが生産するセルラー
ゼ系中に含まれる有効成分である。以下に本発明を詳細
に説明する。本発明のエンドグルカナーゼを含むセルラ
ーゼ系を生産する微生物としては、アクレモウム・セル
ロリティカスＹ−９４株（ＦＥＲＭ ＢＰ−５８２
６）、アクレモウム・セルロリティカスＴＮ株（ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−６８５）などがあり、本菌によるセルラーゼ
の製造については、例えば特公昭６０−４３９５４号公
報、特公昭６３−６３１９７号公報に記載された方法に
従って行えば良い。上記微生物の培養終了後、培養物を
遠心分離等により除去して得た上清液を粗酵素として用
いることもできるが、通常は、この上清液を限外濾過法
などにより濃縮し、防腐剤などを加えて濃縮酵素とする
か、濃縮後スプレードライ法によって粉末酵素とする。
【書類名】 受託番号変更届
【提出日】 平成９年３月３ 日
【旧寄託機関の名称】 工業技術院微生物工業技術
研究所
研究所
【旧受託番号】 ＦＥＲＭ Ｐ−６８６７
【新寄託機関の名称】 工業技術院生命工学工業技
術研究所
術研究所
【新受託番号】 ＦＥＲＭ ＢＰ−５８２６
フロントページの続き (72)発明者 松下 直由 静岡県静岡市池田716−４ 第２コーポ池 田202号 (72)発明者 隅田 奈緒美 神奈川県小田原市栢山788番地 明治製菓 株式会社薬品技術研究所内 (72)発明者 河野 敏明 埼玉県坂戸市千代田５−３−１ 明治製菓 株式会社生物科学研究所内 (72)発明者 山辺 倫 茨城県つくば市東１−１−３ 工業技術院 生命工学工業技術研究所内
Claims (1)
- 【請求項１】 糸状菌アクレモニウム・セルロリティカ
スに由来し、下記の性質を有するエンドグルカナーゼ。 (a) 作用：アビセル糖化活性が低く、カルボキシメチル
セルロース液化活性とカルボキシメチルセルロース糖化
活性の比率が中エンド型を示す。 (b) 基質特異性：本酵素はカルボキシメチルセルロース
に作用する。 (c) 至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲：カルボキシメチルセル
ロースを基質とした糖化活性では、至適ｐＨは4.０であ
り、ｐＨ4.２〜１0.０（４℃、２４時間）の範囲で安定
である。 (d) 作用最適温度：カルボキシメチルセルロースを基質
とした糖化活性では、６０℃である。 (e) 温度安定性：６０℃以下で安定である（ｐＨ 4.
０、１０分）。 (f) 等電点：ｐＩ 3.２〜3.４（ポリアクリルアミドゲ
ル等電点電気泳動法による） (g) 分子量：３8,０００（ＳＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動法による） (h) 比活性：９1.７単位／ｍｇ蛋白質（カルボキシメチ
ルセルロース糖化活性） 0.０８単位／ｍｇ蛋白質（アビセル糖化活性） (i) Ｎ末端アミノ酸配列：配列表の配列番号１記載の配
列を有する。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24398696A JPH1066569A (ja) | 1996-08-28 | 1996-08-28 | エンドグルカナーゼ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24398696A JPH1066569A (ja) | 1996-08-28 | 1996-08-28 | エンドグルカナーゼ |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1066569A true JPH1066569A (ja) | 1998-03-10 |
Family
ID=17112018
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP24398696A Pending JPH1066569A (ja) | 1996-08-28 | 1996-08-28 | エンドグルカナーゼ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH1066569A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2011021616A1 (ja) | 2009-08-20 | 2011-02-24 | 明治製菓株式会社 | β-グルコシダーゼ活性を有する新規タンパク質およびその用途 |
| WO2011121768A1 (ja) | 2010-03-31 | 2011-10-06 | 明治製菓株式会社 | 新規セルラーゼ遺伝子 |
| JP2016039821A (ja) * | 2015-11-20 | 2016-03-24 | Ｍｅｉｊｉ Ｓｅｉｋａファルマ株式会社 | 新規セルラーゼ遺伝子 |
-
1996
- 1996-08-28 JP JP24398696A patent/JPH1066569A/ja active Pending
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2011021616A1 (ja) | 2009-08-20 | 2011-02-24 | 明治製菓株式会社 | β-グルコシダーゼ活性を有する新規タンパク質およびその用途 |
| US8975057B2 (en) | 2009-08-20 | 2015-03-10 | Meiji Seika Pharma Co., Ltd. | Protein having β-glucosidase activity and uses thereof |
| US10125355B2 (en) | 2009-08-20 | 2018-11-13 | Meiji Seika Pharma Co., Ltd. | Protein having B-glucosidase activity and uses thereof |
| WO2011121768A1 (ja) | 2010-03-31 | 2011-10-06 | 明治製菓株式会社 | 新規セルラーゼ遺伝子 |
| US10053679B2 (en) | 2010-03-31 | 2018-08-21 | Meiji Seika Pharma Co., Ltd. | Cellulase gene |
| US10774318B2 (en) | 2010-03-31 | 2020-09-15 | Meiji Seika Pharma Co., Ltd. | Cellulase gene |
| JP2016039821A (ja) * | 2015-11-20 | 2016-03-24 | Ｍｅｉｊｉ Ｓｅｉｋａファルマ株式会社 | 新規セルラーゼ遺伝子 |
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