WO2011121768A1 - 新規セルラーゼ遺伝子 - Google Patents

新規セルラーゼ遺伝子 Download PDF

Info

Publication number
WO2011121768A1
WO2011121768A1 PCT/JP2010/055897 JP2010055897W WO2011121768A1 WO 2011121768 A1 WO2011121768 A1 WO 2011121768A1 JP 2010055897 W JP2010055897 W JP 2010055897W WO 2011121768 A1 WO2011121768 A1 WO 2011121768A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
sequence
dna
seq
set forth
amino acid
Prior art date
Application number
PCT/JP2010/055897
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
史和 横山
Original Assignee
明治製菓株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 明治製菓株式会社 filed Critical 明治製菓株式会社
Priority to CN201080067181.XA priority Critical patent/CN102939376B/zh
Priority to DK10848946.9T priority patent/DK2554667T3/en
Priority to PCT/JP2010/055897 priority patent/WO2011121768A1/ja
Priority to ES10848946.9T priority patent/ES2608402T3/es
Priority to EP10848946.9A priority patent/EP2554667B1/en
Priority to CA2794471A priority patent/CA2794471A1/en
Priority to BR112012024959A priority patent/BR112012024959A2/pt
Priority to US13/638,538 priority patent/US10053679B2/en
Publication of WO2011121768A1 publication Critical patent/WO2011121768A1/ja
Priority to US16/038,459 priority patent/US10774318B2/en

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2437—Cellulases (3.2.1.4; 3.2.1.74; 3.2.1.91; 3.2.1.150)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K10/00—Animal feeding-stuffs
    • A23K10/10—Animal feeding-stuffs obtained by microbiological or biochemical processes
    • A23K10/14—Pretreatment of feeding-stuffs with enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
    • A23K20/10—Organic substances
    • A23K20/189—Enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2445—Beta-glucosidase (3.2.1.21)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/02—Monosaccharides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/14—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a carbohydrase (EC 3.2.x), e.g. by alpha-amylase, e.g. by cellulase, hemicellulase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01004—Cellulase (3.2.1.4), i.e. endo-1,4-beta-glucanase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01021—Beta-glucosidase (3.2.1.21)
    • D—TEXTILES; PAPER
    • D06—TREATMENT OF TEXTILES OR THE LIKE; LAUNDERING; FLEXIBLE MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • D06M—TREATMENT, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE IN CLASS D06, OF FIBRES, THREADS, YARNS, FABRICS, FEATHERS OR FIBROUS GOODS MADE FROM SUCH MATERIALS
    • D06M16/00—Biochemical treatment of fibres, threads, yarns, fabrics, or fibrous goods made from such materials, e.g. enzymatic
    • D06M16/003—Biochemical treatment of fibres, threads, yarns, fabrics, or fibrous goods made from such materials, e.g. enzymatic with enzymes or microorganisms
    • D—TEXTILES; PAPER
    • D21—PAPER-MAKING; PRODUCTION OF CELLULOSE
    • D21C—PRODUCTION OF CELLULOSE BY REMOVING NON-CELLULOSE SUBSTANCES FROM CELLULOSE-CONTAINING MATERIALS; REGENERATION OF PULPING LIQUORS; APPARATUS THEREFOR
    • D21C5/00—Other processes for obtaining cellulose, e.g. cooking cotton linters ; Processes characterised by the choice of cellulose-containing starting materials
    • D21C5/005—Treatment of cellulose-containing material with microorganisms or enzymes
    • D—TEXTILES; PAPER
    • D21—PAPER-MAKING; PRODUCTION OF CELLULOSE
    • D21C—PRODUCTION OF CELLULOSE BY REMOVING NON-CELLULOSE SUBSTANCES FROM CELLULOSE-CONTAINING MATERIALS; REGENERATION OF PULPING LIQUORS; APPARATUS THEREFOR
    • D21C5/00—Other processes for obtaining cellulose, e.g. cooking cotton linters ; Processes characterised by the choice of cellulose-containing starting materials
    • D21C5/02—Working-up waste paper
    • D21C5/025—De-inking
    • D—TEXTILES; PAPER
    • D21—PAPER-MAKING; PRODUCTION OF CELLULOSE
    • D21H—PULP COMPOSITIONS; PREPARATION THEREOF NOT COVERED BY SUBCLASSES D21C OR D21D; IMPREGNATING OR COATING OF PAPER; TREATMENT OF FINISHED PAPER NOT COVERED BY CLASS B31 OR SUBCLASS D21G; PAPER NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • D21H21/00—Non-fibrous material added to the pulp, characterised by its function, form or properties; Paper-impregnating or coating material, characterised by its function, form or properties
    • D21H21/06—Paper forming aids
    • D21H21/10—Retention agents or drainage improvers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P2203/00—Fermentation products obtained from optionally pretreated or hydrolyzed cellulosic or lignocellulosic material as the carbon source
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02W—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES RELATED TO WASTEWATER TREATMENT OR WASTE MANAGEMENT
    • Y02W30/00—Technologies for solid waste management
    • Y02W30/50—Reuse, recycling or recovery technologies
    • Y02W30/64—Paper recycling

Definitions

  • the present invention relates to a cellulase, and in particular, to a cellulase derived from Acremonium cellulolyticus , a polynucleotide encoding the cellulase, a method for producing cellulase using the polynucleotide, and use thereof Is.
  • the “polynucleotide” includes, for example, DNA or RNA, or a modified or chimeric body thereof, preferably DNA.
  • Cellulase is a general term for enzymes that decompose cellulose, and generally cellulases produced by microorganisms are composed of many types of cellulase components.
  • Cellulase components are classified into three types, cellobiohydrolase, endoglucanase, and ⁇ -glucosidase, based on their substrate specificity.
  • Aspergillus niger which is a filamentous fungus producing cellulase, a maximum of 4 is available. It is believed that type cellobiohydrolase, 15 types of endoglucanase, and 15 types of ⁇ -glucosidase are produced. Therefore, when the cellulase produced by a microorganism is used industrially, it is used as a mixture of various cellulase components produced by the microorganism.
  • Non-patent Document 1 The filamentous fungus Acremonium cellulolyticus is characterized by producing cellulase with strong saccharification (Non-patent Document 1), and has been reported to have high utility in feed and silage applications (Patent Document) 1-3). Further, a detailed study has been made on the contained cellulase component (Patent Documents 4-10), and it has been clarified that many kinds of cellulase components are secreted as in other filamentous fungi.
  • the cellulase component composition can be optimized according to the use of the cellulase produced by the microorganism.
  • the best method for that purpose is to introduce a specific enzyme gene by gene recombination and overexpress it, or to delete the gene of the specific enzyme.
  • Patent Documents 4 and 5 two types of cellobiohydrolase genes (Patent Documents 4 and 5) and one type of ⁇ -glucosidase gene (Patent Document 10) are included.
  • the expression of the other cellulases could not be enhanced by the gene transfer or the expression of the cellulases could not be suppressed by the deletion.
  • JP 7-264994 A Japanese Patent No. 2531595 JP 7-236431 A JP 2001-17180 A International Publication WO97 / 33982 Pamphlet International Publication WO99 / 011767 Pamphlet JP 2000-69978 A JP-A-10-066569 JP 2002-101876 A JP 2000-298262 A
  • the present invention isolates genomic DNA containing cellulase genes classified into endoglucanase and ⁇ -glucosidase from Acremonium cellulolyticus, and identifies the endoglucanase and ⁇ -glucosidase genes by analyzing the base sequence. Is an issue.
  • the present inventors have made a thorough comparison of amino acid sequences of known endoglucanases and ⁇ -glucosidases, and found amino acid sequences that can be conserved in Acremonium cellulolyticus.
  • Various primers were designed. PCR using genomic DNA or cDNA as a template was carried out using various primers designed in this way. As a result, endoglucanase and ⁇ -glucosidase gene fragments were obtained. Based on this gene fragment, primers were designed and PCR was continued to amplify nine endoglucanase and ⁇ -glucosidase genes. The base sequence was analyzed and the present invention was completed.
  • DNA comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 5 or a modified sequence thereof, [24] DNA selected from the following (i), (ii), and (iii): (I) DNA encoding the protein according to [3]; (Ii) a DNA comprising the sequence of positions 169 to 1598 of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 5; (Iii) DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA consisting of the sequences 169 to 1598 of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 5 and encodes a protein having endoglucanase activity; [25] DNA obtained by removing intron sequences from the DNA according to [24], [26] The intron sequence is a sequence comprising one or more sequences selected from sequences 254 to 309, 406 to 461, or 1372 to 1450 of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 5.
  • DNA according to [27] DNA obtained by removing a base sequence encoding a signal sequence from the DNA described in [23] to [26], [28] The DNA according to [27], wherein the base sequence encoding the signal sequence is the sequence of Nos. 169 to 231 of the base sequence described in SEQ ID NO: 5.
  • DNA comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 7 or a modified sequence thereof [30] DNA selected from the following (i), (ii), and (iii): (I) DNA encoding the protein according to [4]; (Ii) a DNA comprising a sequence of positions 70 to 1376 of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 7; (Iii) a DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA comprising the nucleotide sequence 70 to 1376 of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 7 and encodes a protein having endoglucanase activity; [31] DNA obtained by removing intron sequences from the DNA according to [30], [32] The DNA according to [31], wherein the intron sequence is a sequence comprising one or more sequences selected from the nucleotide sequences 451 to 500 or 765 to 830 of the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 7.
  • DNA comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 11 or a modified sequence thereof, [42] DNA selected from the following (i), (ii), and (iii): (I) DNA encoding the protein according to [6]; (Ii) a DNA comprising a sequence of Nos.
  • DNA that hybridizes under stringent conditions with DNA consisting of the nucleotide sequence 114 to 1230 of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 11 and that encodes a protein having endoglucanase activity; [43] DNA obtained by removing an intron sequence from the DNA according to [42], [44] The DNA according to [43], wherein the intron sequence is a sequence comprising one or more sequences selected from the sequences 183 to 232 or 299 to 357 of the base sequence described in SEQ ID NO: 11 , [45] DNA obtained by removing the base sequence encoding the signal sequence from the DNA described in [41] to [44], [46] The DNA according to [45], wherein the base sequence encoding the signal sequence is the sequence 114 to 161 of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 11.
  • DNA comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 13 or a modified sequence thereof, [48] DNA selected from the following (i), (ii), and (iii): (I) DNA encoding the protein according to [7]; (Ii) a DNA comprising a sequence of positions 124 to 1143 of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 13; (Iii) a DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA consisting of sequences 124 to 1143 of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 13 and encodes a protein having endoglucanase activity; [49] DNA obtained by removing an intron sequence from the DNA according to [48], [50] The DNA according to [49], wherein the intron sequence is a sequence of positions 225 to 275 of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 13.
  • DNA comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 15 or a modified sequence thereof [54] DNA selected from the following (i), (ii), and (iii): (I) DNA encoding the protein according to [8]; (Ii) a DNA comprising the sequence from number 238 to 1887 of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 15; (Iii) a DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA comprising the nucleotide sequence 238 to 1887 of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 15 and encodes a protein having ⁇ -glucosidase activity; [55] DNA obtained by removing an intron sequence from the DNA described in [54], [56] The intron sequence is a sequence comprising one or more sequences selected from the sequences 784 to 850, 1138 to 1205, or 1703 to 1756 of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 15.
  • DNA according to [57] DNA obtained by removing a base sequence encoding a signal sequence from the DNA described in [53] to [56], [58] The DNA according to [57], wherein the base sequence encoding the signal sequence is the sequence from number 238 to number 321 of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 15.
  • DNA comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 17 or a modified sequence thereof, [60] DNA selected from the following (i), (ii), and (iii): (I) DNA encoding the protein according to [9]; (Ii) a DNA comprising a sequence of positions 66 to 1765 of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 17; (Iii) a DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA consisting of sequences 66 to 1765 of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 17 and encodes a protein having ⁇ -glucosidase activity; [61] DNA obtained by removing an intron sequence from the DNA according to [60], [62] The intron sequence comprising one or more sequences selected from the sequences 149 to 211, 404 to 460, 934 to 988, or 1575 to 1626 of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 17 The DNA according to [61], [63] DNA obtained by removing
  • An expression vector comprising the DNA of [12] to [64], [66] A host cell transformed with the expression vector according to [65], [67] The host cell according to [66], wherein the host cell is yeast or filamentous fungus, [68] yeast, Saccharomyces (Saccharomyces) genus, those belonging to Hansenula (Hansenula) spp or Pichia (Pichia) sp., A host cell according to [67], [69] The host cell according to [68], wherein the yeast is Saccharomyces cerevisiae , [70] filamentous fungus, Humicola (Humicola) genus Aspergillus (Aspergillus) genus Trichoderma (Trichoderma) genus belongs to Fusarium (Fusarium) or Acremonium (Acremonium) spp host cell according to [67] , [71] The filamentous fungus is Acremonium cellulolyticus , Humicola, Sac
  • Methods, [79] Using the protein according to [1] to [9] or [75] or the cellulase preparation according to [76] in the step of deinking by treating waste paper with a deinking chemical.
  • Used paper deinking method, [80] A method for improving the freeness of paper pulp, comprising the step of treating paper pulp with the protein according to [1] to [9] or [75] or the cellulase preparation according to [76].
  • Including, method, [81] A method for improving the digestibility of animal feed, wherein the animal feed is treated with the protein according to [1] to [9] or [75] or the cellulase preparation according to [76].
  • DNA necessary for efficiently producing a specific endoglucanase and ⁇ -glucosidase derived from Acremonium cellulolyticus as a recombinant protein can be obtained, and the cellulase components can be expressed efficiently.
  • Recombinant microorganisms can be obtained. Furthermore, by culturing the obtained recombinant microorganism, specific endoglucanase and ⁇ -glucosidase can be produced efficiently and inexpensively.
  • specific endoglucanase and ⁇ -glucosidase genes can be deleted from the genome of Acremonium cellulolyticus, and as a result, cellulases free from these endoglucanases and ⁇ -glucosidases are produced.
  • Recombinant Acremonium cellulolyticus can be obtained to produce cellulases free of specific endoglucanases and ⁇ -glucosidase cellulases.
  • the cellulosic substrate By selecting an optimal cellulase group from various cellulases obtained in the present invention and treating the cellulosic substrate, the cellulosic substrate can be decomposed efficiently and inexpensively.
  • Endoglucanase and ⁇ -glucosidase which are the proteins of the present invention, are present in the mature protein portion in the amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18.
  • a corresponding sequence can be included, or an amino acid sequence substantially equivalent to the amino acid sequence can be included.
  • the “substantially equivalent amino acid sequence” means, for example, alteration by substitution, deletion, and / or addition of one or more (preferably several) amino acids, but the activity of the polypeptide. It means an amino acid sequence that is not affected by or an amino acid sequence that has 70% or more identity but is not affected by the activity of the polypeptide.
  • the number of amino acid residues to be modified is preferably 1 to 40, more preferably 1 to several, still more preferably 1 to 8, and most preferably 1 to 4.
  • modifications that do not affect activity include conservative substitutions.
  • Constant substitution means replacing one or more amino acid residues with another chemically similar amino acid residue so as not to substantially alter the activity of the polypeptide. For example, when a certain hydrophobic amino acid residue is substituted by another hydrophobic amino acid residue, a certain polar amino acid residue is substituted by another polar amino acid residue having the same charge, and the like. Functionally similar amino acids that can make such substitutions are known in the art for each amino acid.
  • nonpolar (hydrophobic) amino acids include alanine, valine, isoleucine, leucine, proline, tryptophan, phenylalanine, methionine, and the like.
  • polar (neutral) amino acids include glycine, serine, threonine, tyrosine, glutamine, asparagine, cysteine and the like.
  • positively charged (basic) amino acids include arginine, histidine, and lysine.
  • negatively charged (acidic) amino acids include aspartic acid and glutamic acid.
  • identity refers to FASTA3 [Science, 227, 1435-1441 (1985); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 2444-2448 (1988); http: // www. ddbj. nig. ac. jp / E-mail / homology-j. html] is a numerical value calculated using default (initial setting) parameters.
  • the identity is preferably 80% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more, still more preferably 98% or more, particularly preferably 99%. It can be the above identity.
  • the protein of the present invention may be any polypeptide as long as it does not affect the enzyme activity at the N-terminus and / or C-terminus of each amino acid sequence corresponding to the mature protein portion or an amino acid sequence substantially equivalent thereto.
  • An array can be provided. Examples of such a polypeptide sequence include a signal sequence, a detection marker (eg, FLAG tag), and a purification polypeptide [eg, glutathione S-transferase (GST)].
  • Endoglucanase and ⁇ -glucosidase gene can contain the base sequence encoding the protein of the present invention, and the base sequence described in SEQ ID NO: 1 Sequence Nos. 136 to 1437, sequence Nos. 128 to 1615 of the base sequence shown in SEQ ID No. 3, sequence Nos. 169 to 1598 of the base sequence shown in SEQ ID No. 5, and sequence 70 of the base sequence shown in SEQ ID No. 7 The sequence of No. 1376, the sequence of Nos. 141 to 974 of the base sequence shown in SEQ ID No. 9, the sequence of Nos.
  • a base sequence selected from the 65th sequence, or a base sequence that can hybridize with the base sequence under stringent conditions can be included.
  • stringent conditions means that the membrane is washed after hybridization in a high temperature, low salt concentration solution.
  • 2 ⁇ SSC concentration (1 ⁇ SSC: 15 mmol / L) (Sodium citrate, 150 mmol / L sodium chloride) in 0.5% SDS solution means washing conditions at 60 ° C. for 20 minutes.
  • the endoglucanase and ⁇ -glucosidase gene of the present invention can be isolated from Acremonium cellulolyticus or a mutant thereof, for example, by the following method.
  • the base sequence since the base sequence has been clarified as disclosed in the present invention, it can be artificially chemically synthesized.
  • Genomic DNA is extracted from Acremonium cellulolyticus cells by conventional methods.
  • the genomic DNA is digested with an appropriate restriction enzyme and then ligated to an appropriate vector to prepare an Acremonium cellulolyticus genomic DNA library.
  • a vector various things, such as a plasmid vector, a phage vector, a cosmid vector, a BAC vector, can be used, for example.
  • an appropriate probe is prepared based on the base sequences of the endoglucanase and ⁇ -glucosidase genes disclosed in the present specification, and a DNA fragment containing the desired endoglucanase and ⁇ -glucosidase genes by hybridization from a genomic DNA library Can be isolated.
  • primers for amplifying a desired gene based on the base sequences of the endoglucanase and ⁇ -glucosidase genes disclosed in the present specification were prepared, and PCR was performed using the genomic DNA of Acremonium cellulolyticus as a template.
  • the desired gene can be isolated by ligating the amplified DNA fragment with an appropriate vector.
  • endoglucanase and ⁇ -glucosidase genes according to the present invention are contained in plasmids pACC3, pACC5, pACC6, pACC7, pACC8, pACC9, pACC10, pBGLC, and plasmid pBGLD, they are used as template DNA for PCR. Is possible. Moreover, a desired DNA fragment can be prepared from these plasmids with an appropriate restriction enzyme.
  • Escherichia coli TOP10 / pACC3 transformed with the deposit of microorganisms pACC3 is the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology patent biological deposit center on October 9, 2008 (Ibaraki, 305-8565, Japan). Deposited internationally in 1-6 Higashi 1-chome, Tsukuba City, Prefecture 6). The accession number is FERM BP-11029.
  • Escherichia coli TOP10 / pACC5 transformed with pACC5 is the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology patent biological deposit center on October 9, 2008 (East Tsukuba City, Ibaraki, Japan 305-8565) Deposited internationally at 1-chome, 1-address, 1-center 6). The accession number is FERM BP-11030.
  • Escherichia coli TOP10 / pACC6 transformed with pACC6 is the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology patent biological deposit center on October 9, 2008 (East Tsukuba City, Ibaraki, Japan 305-8565) Deposited internationally at 1-chome, 1-address, 1-center 6).
  • the accession number is FERM BP-11031.
  • Escherichia coli TOP10 / pACC7 transformed with pACC7 is the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology patent biological deposit center on October 9, 2008 (East Tsukuba City, Ibaraki, Japan 305-8565) Deposited internationally at 1-chome, 1-address, 1-center 6).
  • the accession number is FERM BP-11032.
  • Escherichia coli TOP10 / pACC8 transformed with pACC8 is the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology patent biological deposit center on October 9, 2008 (East Tsukuba City, Ibaraki, Japan 305-8586) Deposited internationally at 1-chome, 1-address, 1-center 6).
  • the accession number is FERM BP-11033.
  • Escherichia coli TOP10 / pACC9 transformed with pACC9 is the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology patent biological deposit center on October 9, 2008 (East Tsukuba City, Ibaraki, Japan 305-8565) Deposited internationally at 1-chome, 1-address, 1-center 6).
  • the accession number is FERM BP-11034.
  • Escherichia coli TOP10 / pACC10 transformed with pACC10 is the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent Biodeposition Center (East Tsukuba City, Ibaraki 305-8586, Japan) on October 9, 2008. Deposited internationally at 1-chome, 1-address, 1-center 6).
  • the accession number is FERM BP-11035.
  • Escherichia coli TOP10 / pBGLC transformed with pBGLC is the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology patent biological deposit center on October 9, 2008 (East Tsukuba City, Ibaraki, Japan 305-8565) Deposited internationally at 1-chome, 1-address, 1-center 6).
  • the accession number is FERM BP-11036.
  • Escherichia coli TOP10 / pBGLD transformed with pBGLD is the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology patent biological deposit center on October 9, 2008 (East Tsukuba City, Ibaraki, Japan 305-8565). Deposited internationally at 1-chome, 1-address, 1-center 6). The accession number is FERM BP-11037.
  • Expression vector and transformed microorganism in the present invention, a base encoding the amino acid sequence described in SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 or a modified amino acid sequence thereof
  • an expression vector comprising a DNA containing a sequence (hereinafter simply referred to as “DNA sequence according to the present invention”) capable of replicating in a host microorganism and expressing a protein encoded by the DNA sequence.
  • the present expression vector can be constructed on the basis of a self-replicating vector, that is, as an extrachromosomal independent entity whose replication does not depend on chromosomal replication, for example, a plasmid.
  • this expression vector when introduced into a host microorganism, it may be integrated into the genome of the host microorganism and replicated together with the chromosome into which it has been integrated.
  • this procedure and method for constructing the vector according to the present invention those conventionally used in the field of genetic engineering can be used.
  • the expression vector according to the present invention includes a DNA sequence or microorganism that controls the expression in addition to the DNA sequence according to the present invention. It is desirable to include a genetic marker or the like for selection.
  • the DNA sequence for controlling expression include a DNA sequence encoding a promoter, terminator, and signal peptide.
  • the promoter is not particularly limited as long as it exhibits transcriptional activity in the host microorganism, and can be obtained as a DNA sequence that controls the expression of a gene encoding a protein that is the same or different from the host microorganism.
  • the signal peptide is not particularly limited as long as it contributes to protein secretion in the host microorganism, and can be obtained from a DNA sequence derived from a gene encoding a protein that is the same or different from the host microorganism. it can.
  • the gene marker in the present invention may be appropriately selected according to the method for selecting a transformant. For example, a gene encoding drug resistance and a gene complementary to auxotrophy can be used.
  • a microorganism transformed with this expression vector is provided.
  • This host-vector system is not particularly limited, and for example, a system using Escherichia coli, actinomycetes, yeast, filamentous fungi, etc., and a fusion protein expression system with other proteins using them can be used.
  • transformation of microorganisms with this expression vector can also be carried out according to a method commonly used in this field.
  • the transformant can be obtained by culturing in an appropriate medium and isolating the protein according to the present invention from the culture. Therefore, according to another aspect of the present invention, a method for producing the novel protein according to the present invention is provided.
  • the culture of the transformant and its conditions may be essentially equivalent to that for the microorganism used.
  • a method commonly used in this field can be used for recovering the target protein.
  • yeast cell capable of expressing endoglucanase and ⁇ -glucosidase enzymes encoded by the DNA sequence according to the present invention.
  • the yeast cells in the present invention for example, Saccharomyces (Saccharomyces) genus Hansenula (Hansenula) spp, or Pichia (Pichia) microorganism belonging to the genus, for example, Saccharomyces cerevisiae (Saccharomyces cerevisiae) and the like.
  • Humicola genus Aspergillus (Aspergillus) genus or Trichoderma (Trichoderma) sp
  • can Fusarium (Fusarium) genus, or Acremonium (Acremonium) are those belonging to the genus.
  • Further preferred examples thereof include Humicola insolens , Aspergillus niger or Aspergillus oryzae , Trichoderma viride , Fusarium oxysporum ( Fusarium oxysporum ) Or Acremonium cellulolyticus .
  • endoglucanase and ⁇ -glucosidase genes according to the present invention are linked to appropriate vectors and introduced into Acremonium cellulolyticus to suppress their expression, or the genes are disrupted using homologous recombination. Deletion of the function can suppress the expression of specific endoglucanase and ⁇ -glucosidase.
  • Gene disruption using homologous recombination can be carried out according to conventional methods, and it will be obvious to those skilled in the art how to make a vector used for gene disruption and introduce the vector into a host.
  • the transformant thus obtained can be cultured in an appropriate medium, and the above-described protein of the present invention can be isolated from the culture. What is necessary is just to set suitably the culture
  • recovery and purification of the target protein from the culture solution can be performed according to a conventional method.
  • Cellulase preparation comprising a protein (cellulase) according to the present invention as described above.
  • the cellulase preparation according to the present invention is produced by mixing the cellulase according to the present invention with components generally contained, for example, excipients (for example, lactose, sodium chloride, sorbitol, etc.), surfactants, preservatives and the like. Also good.
  • excipients for example, lactose, sodium chloride, sorbitol, etc.
  • surfactants for example, sodium chloride, sorbitol, etc.
  • preservatives preservatives and the like.
  • the cellulase preparation in the present invention can be prepared in any appropriate shape, such as powder or liquid.
  • biomass saccharification can significantly improve saccharification by treatment with the cellulase enzyme (s) or cellulase preparation of the present invention. Therefore, according to the present invention, there is provided a method for improving biomass saccharification, comprising the step of treating biomass with the cellulase enzyme (s) or cellulase preparation of the present invention.
  • biomass that can be treated in the present invention include rice straw, bagasse, corn stover, fruit pomace such as coconut, waste wood, and materials that have been appropriately pretreated.
  • a method for providing clarification of colored cellulose-containing fibers comprising the step of treating the colored cellulose-containing fibers with cellulase enzyme (s) or cellulase preparations, and There is provided a method for producing a local change in color, i.e. a method for giving colored cellulose-containing fibers a stonewash appearance. And this method includes the process of processing a colored cellulose containing fiber by the endoglucanase enzyme or cellulase preparation of this invention.
  • the freeness of paper pulp can be significantly improved by the treatment with the endoglucanase enzyme according to the present invention without causing a significant decrease in strength. Therefore, according to the present invention, there is provided a method for improving the freeness of pulp, comprising the step of treating paper pulp with the endoglucanase enzyme or cellulase preparation of the present invention.
  • pulps that can be treated in the present invention include waste paper pulp, recycled paperboard pulp, kraft pulp, sulfite pulp or process heat treated and other high yield pulps.
  • the digestibility of glucan in the feed can be improved. Therefore, according to the present invention, there is provided a method for improving the digestibility of animal feed, comprising the step of treating the animal feed with the endoglucanase enzyme or cellulase preparation of the present invention.
  • Example 1 Cloning of ACC3 gene (1-1) Isolation of genomic DNA Acremonium cellulolyticus ACCP-5-1 strain (s) medium (2% bouillon, 0.5% yeast extract and 2% glucose) at 32 ° C After culturing for 2 days, the cells were collected by centrifugation. Genomic DNA was isolated from the obtained cells according to the method of Horiuchi et al . (H. Horiuchi et . Al ., J. Bacteriol., 170, 272-278, (1988)).
  • ACC3-F GGGCGTCTGTRTTYGARTGT (SEQ ID NO: 19)
  • ACC3-R AAAATGTAGTCTCCCCACCA (SEQ ID NO: 20)
  • PCR was performed using ACC3-F and ACC3-R as primers and genomic DNA as a template. PCR was performed using LA taq polymerase (manufactured by Takara Bio Inc.). PCR was performed with a program that carried out 40 cycles of 94 ° C for 30 seconds, annealing for 30 seconds, and 72 ° C for 1 minute. The annealing temperature was gradually reduced from 63 ° C to 53 ° C in the first 20 cycles, and then The 20 cycles were fixed at 53 ° C.
  • the amplified 1 kbp DNA fragment was inserted into the pCR2.1-TOPO plasmid vector using the TOPO ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ TA cloning kit (manufactured by Invitrogen) according to the attached protocol to obtain plasmid TOPO-pACC3-partial.
  • the sequence of the inserted DNA fragment cloned in the plasmid TOPO-pACC3-partial is the attached protocol using BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequebcing Kit (Applied Biosystems) and ABI PRISM Genetic Analyzer (Applied Biosystems). Went according to.
  • the resulting base sequence was translated into an amino acid sequence, and as a result of homology search, the amino acid sequence showed 74% identity with endoglucanase EG1 (Q8WZD7) from Talaromyces emersonii.
  • the fragment was judged to be part of the endoglucanase (Glycoside Hydrolase family 5) gene.
  • ACC3-inv-F ACTTCCAGACTTTCTGGTCC (SEQ ID NO: 21)
  • ACC3-inv-R AGGCCGAGAGTAAGTATCTC (SEQ ID NO: 22)
  • the 5 ′ upstream region and 3 ′ downstream region were analyzed by the method described in Example 1-2, and the full-length nucleotide sequence of the ACC3 gene was determined.
  • the following primers were prepared based on the base sequence obtained by the inverse PCR method, PCR was performed using the genomic DNA as a template, and the ACC3 gene was amplified.
  • pACC3-F GAAGGATGGTAGATTGTCCG (SEQ ID NO: 23)
  • pACC3-R ACCGAGAAGGATTTCTCGCA (SEQ ID NO: 24)
  • the amplified DNA was inserted into the pCR2.1-TOPO plasmid vector using TOPO TA cloning kit (Invitrogen) to obtain plasmid pACC3.
  • Escherichia coli TOP10 strain / pACC3 was obtained by transforming Escherichia coli TOP10 strain (manufactured by Invitrogen) with the obtained plasmid pACC3.
  • cDNA was synthesized by TimeSaver cDNA Synthesis Kit (Pharmacia) according to the attached protocol.
  • the following primers including an initiation codon and a termination codon were prepared from the ACC3 gene sequence, and PCR was performed using the cDNA as a template to amplify the ACC3 cDNA gene.
  • ACC3-N ATGAAGACCAGCATCATTTCTATC (SEQ ID NO: 25)
  • ACC3-C TCATGGGAAATAACTCTCCAGAAT (SEQ ID NO: 26)
  • the ACC3 cDNA gene was analyzed by the method described in Example 1-2, and the position of the intron was determined by comparing with the pACC3 gene.
  • the endoglucanase ACC3 gene isolated from Acremonium cellulolyticus by the above method has a nucleotide sequence of 1302 bp shown in the 136-1437 base sequence of SEQ ID NO: 1. It consisted of a base.
  • this ACC3 gene contains the 5 introns shown in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, 233 to 291, 351 to 425, 579 to 631, 697 to 754, and 853 to 907. It was shown that The amino acid sequence of ACC3 predicted from the open reading frame (ORF) was as shown in SEQ ID NO: 2.
  • Signal sequence prediction software SignalP 3.0 was used to estimate the signal sequence from -27 to -1 amino acid residues of ACC3.
  • Example 2 Cloning of ACC5 gene (2-1) Isolation of genomic DNA and mRNA and preparation of cDNA Genomic DNA of Acremonium cellulolyticus ACCP-5-1 was isolated by the method described in Example 1-1. Moreover, the cDNA of Acremonium cellulolyticus ACCP-5-1 was prepared by the method described in Example 1-4.
  • ACC5-F CAGCAGGCCCCCACCCCNGAYAAYYTNGC (SEQ ID NO: 27)
  • ACC5-R AATTCGCGGCCGCTAAAAAAAAA (SEQ ID NO: 28)
  • PCR was performed using ACC5-F and ACC5-R as primers and cDNA as a template. PCR was performed using LA taq polymerase (manufactured by Takara Bio Inc.). PCR was performed with a program that carried out 40 cycles of 94 ° C for 30 seconds, annealing for 30 seconds, and 72 ° C for 1 minute. The annealing temperature was gradually reduced from 63 ° C to 53 ° C in the first 20 cycles, and then The 20 cycles were fixed at 53 ° C.
  • the amplified 1.5 kbp DNA fragment was inserted into the pCR2.1-TOPO plasmid vector using the TOPO TA cloning kit (manufactured by Invitrogen) according to the attached protocol to obtain the plasmid TOPO-pACC5-partial.
  • pACC5-F ATTGCTCCGCATAGGTTCAA (SEQ ID NO: 31)
  • pACC5-R TTCAGAGTTAGTGCCTCCAG (SEQ ID NO: 32)
  • the amplified DNA was inserted into the pCR2.1-TOPO plasmid vector using TOPO TA cloning kit (Invitrogen) to obtain plasmid pACC5.
  • Escherichia coli TOP10 strain / pACC5 was obtained by transforming Escherichia coli TOP10 strain (manufactured by Invitrogen) with the obtained plasmid pACC5.
  • Example 3 Cloning of ACC6 gene (3-1) Isolation of genomic DNA and preparation of genomic library
  • Genomic DNA of Acremonium cellulolyticus ACCP-5-1 was isolated by the method described in Example 1-1.
  • the isolated genomic DNA was partially digested with Sau 3AI. This was ligated to the Bam HI arm of the phage vector / dMBL3 cloning kit (Stratagene) using Ligation Kit Ver.2 (Takara Shuzo). This was precipitated in ethanol and then dissolved in TE buffer. Phage particles were formed from the ligation mixture using MaxPlax ⁇ packerging kit (manufactured by Epicenter Technology) and infected with E. coli XL1-blue MRA (P2) strain. By this method, a genomic DNA library consisting of 1.1 ⁇ 10 4 phages was obtained.
  • ACC6-F GTGAACATCGCCGGCTTYGAYTTYGG (SEQ ID NO: 35)
  • ACC6-R CCGTTCCACCGGGCRTARTTRTG (SEQ ID NO: 36)
  • PCR was performed using ACC6-F and ACC6-R as primers and genomic DNA as a template. PCR was performed using LA taq polymerase (manufactured by Takara Bio Inc.). PCR was performed with a program that carried out 40 cycles of 94 ° C for 30 seconds, annealing for 30 seconds, and 72 ° C for 1 minute. The annealing temperature was gradually reduced from 63 ° C to 53 ° C in the first 20 cycles, and then The 20 cycles were fixed at 53 ° C.
  • the amplified 300 bp DNA fragment was inserted into the pCR2.1-TOPO plasmid vector using the TOPO ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ TA cloning kit (manufactured by Invitrogen) according to the attached protocol to obtain the plasmid TOPO-pACC6-partial.
  • This DNA fragment was amplified by PCR using the plasmid TOPO-pACC6-partial as a template in the same manner as described above, and the obtained PCR product was labeled using an ECL direct system (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech) as a probe.
  • Example 3-3 Screening by plaque hybridization
  • the phage plaque prepared in Example 3-1 was transferred to a high bond N + nylon transfer membrane (manufactured by Amersham), and after alkali denaturation, 5 times concentration SSC (SSC: 15 mmol / L) DNA was fixed by washing with trisodium citrate (150 mmol / L sodium chloride) and drying. Hybridization was carried out for 4 hours (42 ° C.) by adding an HRP-labeled probe after pre-hybridization (42 ° C.) for 1 hour. The probe was washed twice with 6 M urea and 0.4% SDS-added 0.5-fold SSC and twice with 2-fold SSC.
  • the nylon membrane that had been washed with the probe was immersed in a detection solution for 1 minute and then exposed to Hyperfilm ECL manufactured by the same company to obtain one positive clone.
  • DNA preparation from positive clones was performed using LE392 as the host E. coli according to the method of Maniatis et al. (J. Sambrook, EF Fritsch and T. Maniat1s, “Molecular Cloning”, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1989). It was. First, LE392 was cultured overnight in LB-MM medium (1% peptone, 0.5% yeast extract, 0.5% sodium chloride, 10 mmol / L magnesium sulfate, 0.2% maltose).
  • the 2.9 kbp Xba I fragment showed a common hybridization pattern with chromosomal DNA.
  • This Xba I fragment was cloned into pUC118 to obtain plasmid pUC-ACC6, and then the nucleotide sequence of the plasmid was analyzed.
  • pACC6-F CTCTGCATTGAATCCCGAGA (SEQ ID NO: 37)
  • pACC6-R GCAACGCTAAAGTGCTCATC (SEQ ID NO: 38)
  • the amplified DNA was inserted into the pCR2.1-TOPO plasmid vector using TOPO TA cloning kit (Invitrogen) to obtain plasmid pACC6.
  • Escherichia coli TOP10 strain / pACC6 was obtained by transforming Escherichia coli TOP10 strain (manufactured by Invitrogen) with the obtained plasmid pACC6.
  • Example 4 Cloning of ACC7 gene (4-1) Isolation of genomic DNA and preparation of genomic library A genomic DNA library of Acremonium cellulolyticus ACCP-5-1 was prepared by the method described in Example 3-1.
  • ACC7-F CACGCCATGATCGACCCNCAYAAYTAYG (SEQ ID NO: 41)
  • ACC7-R ACCAGGGGCCGGCNGYCCACCA (SEQ ID NO: 42)
  • PCR was performed using ACC7-F and ACC7-R as primers and genomic DNA as a template. PCR was performed using LA taq polymerase (manufactured by Takara Bio Inc.). PCR was performed with a program that carried out 40 cycles of 94 ° C for 30 seconds, annealing for 30 seconds, and 72 ° C for 1 minute. The annealing temperature was gradually reduced from 63 ° C to 53 ° C in the first 20 cycles, and then The 20 cycles were fixed at 53 ° C.
  • the amplified 670 bp DNA fragment was inserted into the pCR2.1-TOPO plasmid vector according to the attached protocol using TOPO (TA cloning kit (manufactured by Invitrogen) to obtain plasmid TOPO-pACC7-partial.
  • TOPO TA cloning kit (manufactured by Invitrogen)
  • This DNA fragment was amplified by PCR using the plasmid TOPO-pACC7-partial as a template in the same manner as described above, and the obtained PCR product was labeled using an ECL direct system (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech) as a probe.
  • pACC7-F CAGTCAGTTGTGTAGACACG (SEQ ID NO: 43)
  • pACC7-R ACTCAGCTGGGTCTTCATAG (SEQ ID NO: 44)
  • the amplified DNA was inserted into the pCR2.1-TOPO plasmid vector using TOPO TA cloning kit (Invitrogen) to obtain plasmid pACC7.
  • Escherichia coli TOP10 strain / pACC7 was obtained by transforming Escherichia coli TOP10 strain (manufactured by Invitrogen) with the obtained plasmid pACC7.
  • Example 5 Cloning of ACC8 Gene (5-1) Isolation of genomic DNA and preparation of genomic library A genomic DNA library of Acremonium cellulolyticus ACCP-5-1 was prepared by the method described in Example 3-1.
  • PCR was performed using MSW-N and MSW-C as primers and genomic DNA as a template. PCR was performed using LA taq polymerase (manufactured by Takara Bio Inc.). PCR was performed with a program that carried out 40 cycles of 94 ° C for 30 seconds, annealing for 30 seconds, and 72 ° C for 1 minute. The annealing temperature was gradually reduced from 63 ° C to 53 ° C in the first 20 cycles, and then The 20 cycles were fixed at 53 ° C.
  • the amplified 800 bp DNA fragment was inserted into the pCR2.1-TOPO plasmid vector according to the attached protocol using the TOPO TA cloning kit (manufactured by Invitrogen) to obtain the plasmid TOPO-pACC8-partial.
  • This DNA fragment was amplified by PCR using the plasmid TOPO-pACC8-partial as a template in the same manner as described above, and the obtained PCR product was labeled using an ECL direct system (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech) as a probe.
  • pACC8-F AAAGACCGCGTGTTAGGATC (SEQ ID NO: 49)
  • pACC8-R CGCGTAGGAAATAAGACACC (SEQ ID NO: 50)
  • the amplified DNA was inserted into the pCR2.1-TOPO plasmid vector using TOPO TA cloning kit (Invitrogen) to obtain plasmid pACC8.
  • Escherichia coli TOP10 strain / pACC8 was obtained by transforming Escherichia coli TOP10 strain (manufactured by Invitrogen) with the obtained plasmid pACC8.
  • ACC8-N ATGAAGCTAACTTTTCTCCTGAAC (SEQ ID NO: 51)
  • ACC8-C CTAATTGACAGATGCAGACCAATG (SEQ ID NO: 52)
  • the base sequence of the ACC8 cDNA gene was analyzed and compared with the pACC8 gene to determine the position of the intron.
  • Example 6 Cloning of ACC9 Gene (6-1) Isolation of genomic DNA and mRNA and preparation of cDNA Genomic DNA of Acremonium cellulolyticus ACCP-5-1 was isolated by the method described in Example 1-1. Moreover, the cDNA of Acremonium cellulolyticus ACCP-5-1 was prepared by the method described in Example 1-4.
  • ACC9-F CCGGCTGCGGCAARTGYTAYMA (SEQ ID NO: 53)
  • ACC9-R AGTACCACTGGTTCTGCACCTTRCANGTNSC (SEQ ID NO: 54)
  • PCR was performed using ACC9-F and ACC9-R as primers and genomic DNA as a template. PCR was performed using LA taq polymerase (manufactured by Takara Bio Inc.). PCR was performed with a program that carried out 40 cycles of 94 ° C for 30 seconds, annealing for 30 seconds, and 72 ° C for 1 minute. The annealing temperature was gradually reduced from 63 ° C to 53 ° C in the first 20 cycles, and then The 20 cycles were fixed at 53 ° C.
  • the amplified 800 bp DNA fragment was inserted into the pCR2.1-TOPO plasmid vector according to the attached protocol using the TOPO ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ TA cloning kit (manufactured by Invitrogen) to obtain the plasmid TOPO-pACC9-partial.
  • pACC9-F TACATTCCGAAGGCACAGTT (SEQ ID NO: 57)
  • pACC9-R CTGAGCTGATTATCCTGACC (SEQ ID NO: 58)
  • the amplified DNA was inserted into the pCR2.1-TOPO plasmid vector using TOPO TA cloning kit (Invitrogen) to obtain plasmid pACC9.
  • Escherichia coli TOP10 strain / pACC9 was obtained by transforming Escherichia coli TOP10 strain (manufactured by Invitrogen) with the obtained plasmid pACC9.
  • Example 7 Cloning of ACC10 Gene (7-1) Isolation of genomic DNA and mRNA and preparation of cDNA Genomic DNA of Acremonium cellulolyticus ACCP-5-1 was isolated by the method described in Example 1-1. Moreover, the cDNA of Acremonium cellulolyticus ACCP-5-1 was prepared by the method described in Example 1-4.
  • ACC10-F GGTGTACGTGGGCACCAAYGGNMGNGG (SEQ ID NO: 61)
  • ACC10-R AATTCGCGGCCGCTAAAAAAAAA (SEQ ID NO: 62)
  • PCR was performed using ACC10-F and ACC10-R as primers and cDNA as a template. PCR was performed using LA taq polymerase (manufactured by Takara Bio Inc.). PCR was performed with a program that carried out 40 cycles of 94 ° C for 30 seconds, annealing for 30 seconds, and 72 ° C for 1 minute. The annealing temperature was gradually reduced from 63 ° C to 53 ° C in the first 20 cycles, and then The 20 cycles were fixed at 53 ° C.
  • the amplified 300 bp DNA fragment was inserted into the pCR2.1-TOPO plasmid vector according to the attached protocol using TOPO TA cloning kit (manufactured by Invitrogen) to obtain plasmid TOPO-pACC10-partial.
  • ACC10 full-length gene by inverse PCR method a circular DNA digested with Hin dIII a template, PCR was carried out by the following sequence contained in ACC10 gene fragment
  • the 5 ′ upstream region and 3 ′ downstream region of the ACC5 gene were obtained.
  • ACC10-inv-F TTCTGCTACTGCGGTTGCTA (SEQ ID NO: 63)
  • ACC10-inv-R GAATAACGTAGGTCGACAAG (SEQ ID NO: 64)
  • the base sequences of the 5 ′ upstream region and 3 ′ downstream region were analyzed, and the full-length base sequence of the ACC10 gene was determined.
  • pACC10-F CGTTGACCGAAAGCCACTT (SEQ ID NO: 65)
  • pACC10-R TGGCCTAAAGCTAAATGATG (SEQ ID NO: 66)
  • the amplified DNA was inserted into the pCR2.1-TOPO plasmid vector using TOPO TA cloning kit (Invitrogen) to obtain plasmid pACC10.
  • Escherichia coli TOP10 strain / pACC10 was obtained by transforming Escherichia coli TOP10 strain (manufactured by Invitrogen) with the obtained plasmid pACC10.
  • Example 8 Cloning of BGLC gene >> (8-1) Preparation of genomic DNA and cDNA Genomic DNA of Acremonium cellulolyticus ACCP-5-1 was isolated by the method described in Example 1-1. Moreover, the cDNA of Acremonium cellulolyticus ACCP-5-1 was prepared by the method described in Example 1-4.
  • BGLC-F CCTGGGTGACCCTGTACCAYTGGGAYYT (SEQ ID NO: 69)
  • BGLC-R TGGGCAGGAGCAGCCRWWYTCNGT (SEQ ID NO: 70)
  • PCR was performed using BGLC-F and BGLC®-R as primers and genomic DNA as a template. PCR was performed using LA taq polymerase (manufactured by Takara Bio Inc.). PCR was performed with a program that carried out 40 cycles of 94 ° C for 30 seconds, annealing for 30 seconds, and 72 ° C for 1 minute. The annealing temperature was gradually reduced from 63 ° C to 53 ° C in the first 20 cycles, and then The 20 cycles were fixed at 53 ° C.
  • the amplified 1.2 kbp DNA fragment was inserted into the pCR2.1-TOPO plasmid vector using the TOPO ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ TA cloning kit (manufactured by Invitrogen) according to the attached protocol to obtain the plasmid TOPO-pBGLC-partial.
  • BGLC-inv-F GGAGTTCTTCTACATTTCCC (SEQ ID NO: 71)
  • BGLC-inv-R AACAAGGACGGCGTGTCAGT (SEQ ID NO: 72)
  • the base sequences of the 5 ′ upstream region and 3 ′ downstream region were analyzed, and the full-length base sequence of the BGLC gene was determined.
  • pBGLC-F CTCCGTCAAGTGCGAAGTAT (SEQ ID NO: 73)
  • pBGLC-R GGCTCGCTAATACTAACTGC (SEQ ID NO: 74)
  • the amplified DNA was inserted into the pCR2.1-TOPO plasmid vector using TOPO TA cloning kit (Invitrogen) to obtain plasmid pBGLC.
  • Escherichia coli TOP10 strain / pBGLC was obtained by transforming Escherichia coli TOP10 strain (manufactured by Invitrogen) with the obtained plasmid pBGLC.
  • BGLC-N ATGGGCTCTACATCTCCTGCCCAA (SEQ ID NO: 75)
  • BGLC-C CTAGTTCCTCGGCTCTATGTATTT (SEQ ID NO: 76)
  • the base sequence of the BGLC cDNA gene was analyzed, and the position of the intron was determined by comparison with the pBGLC gene.
  • this BGLC gene was shown to contain three introns shown in the nucleotide sequence of 784 to 850, 1138 to 1205, and 1703 to 1756 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 15.
  • the amino acid sequence of BGLC predicted from the open reading frame (ORF) was as shown in SEQ ID NO: 16.
  • Signal sequence prediction software SignalP 3.0 presumed that the signal sequence from -28 to -1 amino acid residues of this BGLC was a signal sequence.
  • Example 9 Cloning of BGLD gene >> (9-1) Preparation of genomic DNA and cDNA Genomic DNA of Acremonium cellulolyticus ACCP-5-1 was isolated by the method described in Example 1-1. Moreover, the cDNA of Acremonium cellulolyticus ACCP-5-1 was prepared by the method described in Example 1-4.
  • BGLD-F CACCGCCGCCTACCARRTNGARGG (SEQ ID NO: 77)
  • BGLD-R TGGCGGTGTAGTGGTTCATGSCRWARWARTC (SEQ ID NO: 78)
  • PCR was performed using BGLD-F and BGLD-R as primers and genomic DNA as a template. PCR was performed using LA taq polymerase (manufactured by Takara Bio Inc.). PCR was performed with a program that carried out 40 cycles of 94 ° C for 30 seconds, annealing for 30 seconds, and 72 ° C for 1 minute. The annealing temperature was gradually reduced from 63 ° C to 53 ° C in the first 20 cycles, and then The 20 cycles were fixed at 53 ° C.
  • the amplified 1 kbp DNA fragment was inserted into the pCR2.1-TOPO plasmid vector using the TOPO ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ TA cloning kit (manufactured by Invitrogen) according to the attached protocol to obtain the plasmid TOPO-pBGLD-partial.
  • BGLD-inv-F CGGTTTCAATATCGGTAAGC (SEQ ID NO: 79)
  • BGLD-inv-R GTGTCCAAAGCTCTGGAATG (SEQ ID NO: 80)
  • the base sequences of the 5 ′ upstream region and 3 ′ downstream region were analyzed, and the full-length base sequence of the BGLD gene was determined.
  • pBGLD-F TTCTCTCACTTTCCCTTTCC (SEQ ID NO: 81)
  • pBGLD-R AATTGATGCTCCTGATGCGG (SEQ ID NO: 82)
  • the amplified DNA was inserted into the pCR2.1-TOPO plasmid vector using TOPO TA cloning kit (Invitrogen) to obtain plasmid pBGLD.
  • Escherichia coli TOP10 strain / pBGLD was obtained by transforming Escherichia coli TOP10 strain (manufactured by Invitrogen) with the obtained plasmid pBGLD.
  • BGLD-N ATGGGTAGCGTAACTAGTACCAAC (SEQ ID NO: 83)
  • BGLD-C CTACTCTTTCGAGATGTATTTGTT (SEQ ID NO: 84)
  • the base sequence of the BGLD cDNA gene was analyzed, and the position of the intron was determined by comparison with the pBGLD gene.
  • the protein of the present invention can be used as a cellulase preparation and can be applied to cellulosic substrate degradation.
  • this invention was demonstrated along the specific aspect, the deformation
  • Each base sequence represented by the sequence number 19 to 84 in the sequence listing is an artificially synthesized primer sequence.
  • SEQ ID NO: 27 positions 18 and 27
  • SEQ ID NO: 41 position 18
  • SEQ ID NO: 42 position 14
  • SEQ ID NO: 54 positions 26 and 29
  • SEQ ID NO: 61 positions 22 and 25
  • sequence The symbol “n” in No. 70 (22nd position) and SEQ ID No. 77 (19th position) means an arbitrary base.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Textile Engineering (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

　アクレモニウム・セルロリティカスよりエンドグルカナーゼやβ－グルコシターゼに分類されるセルラーゼ遺伝子を含むゲノムＤＮＡを単離し、その塩基配列を解析することによってエンドグルカナーゼ及びβ－グルコシターゼ遺伝子を特定することを課題とした。　既知のエンドグルカナーゼ及びβ－グルコシターゼのアミノ酸配列を鋭意比較し、アクレモニウム・セルロリティカスにおいても保存されうるアミノ酸配列を見出し、本情報をもとに様々なプライマーを設計した。この様にして設計された様々なプライマーを用いて、ゲノムDNAもしくはcDNAを鋳型にしたPCRを実施した。その結果、エンドグルカナーゼ及びβ－グルコシターゼの遺伝子断片が得られたので、本遺伝子断片を基に、プライマーを設計し、PCRを継続することにより、エンドグルカナーゼ及びβ－グルコシターゼの遺伝子9種を増幅し、塩基配列を解析し本発明を完成するに至った。

Description

新規セルラーゼ遺伝子
　本発明は、セルラーゼに関するものであり、詳細には、アクレモニウム・セルロリティカス（Acremonium cellulolyticus）由来のセルラーゼ、該セルラーゼをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを利用したセルラーゼの製造方法及びその用途に関するものである。なお、本明細書において「ポリヌクレオチド」には、例えば、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ、又はそれらの修飾体若しくはキメラ体が含まれ、好ましくはＤＮＡである。
　セルラーゼはセルロースを分解する酵素の総称であり、一般に微生物の生産するセルラーゼには多種類のセルラーゼ成分からなる。セルラーゼ成分は、その基質特異性から、セロビオハイドロラーゼ、エンドグルカナーゼ、β－グルコシターゼの３種類に分類され、セルラーゼを産生する糸状菌であるアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）の場合には、最大４種類セロビオハイドロラーゼ、１５種類のエンドグルカナーゼ、１５種類のβ－グルコシターゼが産生されると考えられている。よって、微生物の産生するセルラーゼを産業上利用する場合は、その微生物が生産する様々なセルラーゼ成分の混合物として利用されることになる。
　糸状菌アクレモニウム・セルロリティカスは糖化力の強いセルラーゼを生産することが特徴であり（非特許文献１）、飼料用途やサイレージ用途で、高い有用性を持つことが報告されている（特許文献１－３）。また、含有されているセルラーゼ成分（特許文献４－１０）に関しても詳細な検討がなされており、その他の糸状菌と同様に多種類のセルラーゼ成分が分泌されていることが明らかにされている。
　ある用途に限った場合は、多種類のセルラーゼ成分の内、特定の酵素の数種の成分がその用途に重要であると考えられている。従って、微生物が生産するセルラーゼを、利用させる用途に応じてセルラーゼ成分組成を最適化できれば、より活性の高いセルラーゼが得られることが期待される。そのための最良の方法は、遺伝子組換えの手法により特定の酵素遺伝子を導入して過剰発現させる、もしくは特定の酵素の遺伝子を欠損させることである。
　しかしながら、アクレモニウム・セルロリティカスの場合には、多種類のセルラーゼ成分の内、２種類のセロビオハイドロラーゼ遺伝子（特許文献４、５）及び１種類のβ－グルコシターゼ遺伝子（特許文献１０）が単離されているのみであり、その他のセルラーゼについては、その遺伝子導入による発現増強や、欠損による発現抑制をすることができない状況にあった。
　この様な背景の中、アクレモニウム・セルロリティカスの産生するセルラーゼの組成を遺伝子組換え技術により最適化するために、エンドグルカナーゼやβ－グルコシターゼなどの多糖分解酵素遺伝子の単離が所望されていた。
「アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Agricultural and Biological Chemistry）」，（日本），1987年，第51巻，p. 65
特開平７－２６４９９４号公報 特許第２５３１５９５号明細書 特開平７－２３６４３１号公報 特開２００１－１７１８０号公報 国際公開ＷＯ９７／３３９８２号パンフレット 国際公開ＷＯ９９／０１１７６７号パンフレット 特開２０００－６９９７８号公報 特開平１０－０６６５６９号公報 特開２００２－１０１８７６号公報 特開２０００－２９８２６２号公報
　本発明は、アクレモニウム・セルロリティカスよりエンドグルカナーゼやβ－グルコシターゼに分類されるセルラーゼ遺伝子を含むゲノムＤＮＡを単離し、その塩基配列を解析することによってエンドグルカナーゼ及びβ－グルコシターゼ遺伝子を特定することを課題とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するため、既知のエンドグルカナーゼ及びβ－グルコシターゼをアミノ酸配列を鋭意比較し、アクレモニウム・セルロリティカスにおいても保存されうるアミノ酸配列を見出し、本情報をもとに様々なプライマーを設計した。この様にして設計された様々なプライマーを用いて、ゲノムＤＮＡもしくはｃＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲを実施した。その結果、エンドグルカナーゼ及びβ－グルコシターゼの遺伝子断片が得られたので、本遺伝子断片を基に、プライマーを設計し、ＰＣＲを継続することにより、エンドグルカナーゼ及びβ－グルコシターゼの遺伝子９種を増幅し、塩基配列を解析し本発明を完成するに至った。
　即ち、本発明は、
［１］以下の（ｉ）、（ii）、及び（iii）から選択されるタンパク質：
（ｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列の１～３０６番の配列を含むタンパク質；
（ii）配列番号２に記載のアミノ酸配列の１～３０６番の配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含むエンドグルカナーゼ；
（iii）配列番号２に記載のアミノ酸配列の１～３０６番の配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むエンドグルカナーゼ、
［２］以下の（ｉ）、（ii）、及び（iii）から選択されるタンパク質：
（ｉ）配列番号４に記載のアミノ酸配列の１～４７５番の配列を含むタンパク質；
（ii）配列番号４に記載のアミノ酸配列の１～４７５番の配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含むエンドグルカナーゼ；
（iii）配列番号４に記載のアミノ酸配列の１～４７５番の配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むエンドグルカナーゼ、
［３］以下の（ｉ）、（ii）、及び（iii）から選択されるタンパク質：
（ｉ）配列番号６に記載のアミノ酸配列の１～３９１番の配列を含むタンパク質；
（ii）配列番号６に記載のアミノ酸配列の１～３９１番の配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含むエンドグルカナーゼ；
（iii）配列番号６に記載のアミノ酸配列の１～３９１番の配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むエンドグルカナーゼ、
［４］以下の（ｉ）、（ii）、及び（iii）から選択されるタンパク質：
（ｉ）配列番号８に記載のアミノ酸配列の１～３７６番の配列を含むタンパク質；
（ii）配列番号８に記載のアミノ酸配列の１～３７６番の配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含むエンドグルカナーゼ；
（iii）配列番号８に記載のアミノ酸配列の１～３７６番の配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むエンドグルカナーゼ、
［５］以下の（ｉ）、（ii）、及び（iii）から選択されるタンパク質：
（ｉ）配列番号１０に記載のアミノ酸配列の１～２２１番の配列を含むタンパク質；
（ii）配列番号１０に記載のアミノ酸配列の１～２２１番の配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含むエンドグルカナーゼ；
（iii）配列番号１０に記載のアミノ酸配列の１～２２１番の配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むエンドグルカナーゼ、
［６］以下の（ｉ）、（ii）、及び（iii）から選択されるタンパク質：
（ｉ）配列番号１２に記載のアミノ酸配列の１～３１９番の配列を含むタンパク質；
（ii）配列番号１２に記載のアミノ酸配列の１～３１９番の配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含むエンドグルカナーゼ；
（iii）配列番号１２に記載のアミノ酸配列の１～３１９番の配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むエンドグルカナーゼ、
［７］以下の（ｉ）、（ii）、及び（iii）から選択されるタンパク質：
（ｉ）配列番号１４に記載のアミノ酸配列の１～３０１番の配列を含むタンパク質；
（ii）配列番号１４に記載のアミノ酸配列の１～３０１番の配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含むエンドグルカナーゼ；
（iii）配列番号１４に記載のアミノ酸配列の１～３０１番の配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むエンドグルカナーゼ、
［８］以下の（ｉ）、（ii）、及び（iii）から選択されるタンパク質：
（ｉ）配列番号１６に記載のアミノ酸配列の１～４５８番の配列を含むタンパク質；
（ii）配列番号１６に記載のアミノ酸配列の１～４５８番の配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含むβ－グルコシダーゼ；
（iii）配列番号１６に記載のアミノ酸配列の１～４５８番の配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むβ－グルコシダーゼ、
［９］以下の（ｉ）、（ii）、及び（iii）から選択されるタンパク質：
（ｉ）配列番号１８に記載のアミノ酸配列の１～４５７番の配列を含むタンパク質；
（ii）配列番号１８に記載のアミノ酸配列の１～４５７番の配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含むβ－グルコシダーゼ；
（iii）配列番号１８に記載のアミノ酸配列の１～４５７番の配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むβ－グルコシダーゼ、
［１０］糸状菌由来である、［１］～［９］に記載のタンパク質、
［１１］糸状菌がアクレモニウム・セルロリティカス（Acremonium cellulolyticus）に属する糸状菌である、［１０］に記載のタンパク質、
［１２］［１］～［９］に記載のタンパク質をコードする塩基配列を含む、ポリヌクレオチド、
［１３］配列番号１に記載の塩基配列、又はその改変配列を含む、ＤＮＡ、
［１４］以下の（ｉ）、（ii）、及び（iii）から選択されるＤＮＡ：
（ｉ）［１］に記載のタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ii）配列番号１に記載の塩基配列の１３６～１４３７番の配列を含むＤＮＡ；
（iii）配列番号１に記載の塩基配列の１３６～１４３７番の配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
［１５］［１４］に記載のＤＮＡから、イントロン配列を除去したＤＮＡ、
［１６］イントロン配列が、配列番号１に記載の塩基配列の２３３～２９１番、３５１～４２５番、５７９～６３１番、６９７～７５４番、又は、８５３～９０７番の配列から選択される１以上の配列を含む配列である、［１５］に記載のＤＮＡ、
［１７］［１３］～［１６］に記載のＤＮＡから、シグナル配列をコードする塩基配列を除去したＤＮＡ、
［１８］シグナル配列をコードする塩基配列が、配列番号１に記載の塩基配列の１３６～２１６番の配列である、［１７］に記載のＤＮＡ、
［１９］配列番号３に記載の塩基配列、又はその改変配列を含む、ＤＮＡ、
［２０］以下の（ｉ）、（ii）、及び（iii）から選択されるＤＮＡ：
（ｉ）［２］に記載のタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ii）配列番号３に記載の塩基配列の１２８～１６１５番の配列を含むＤＮＡ；
（iii）配列番号３に記載の塩基配列の１２８～１６１５番の配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
［２１］［１９］～［２０］に記載のＤＮＡから、シグナル配列をコードする塩基配列を除去したＤＮＡ、
［２２］シグナル配列をコードする塩基配列が、配列番号３に記載の塩基配列の１２８～１８７番の配列である、［２１］に記載のＤＮＡ、
［２３］配列番号５に記載の塩基配列、又はその改変配列を含む、ＤＮＡ、
［２４］以下の（ｉ）、（ii）、及び（iii）から選択されるＤＮＡ：
（ｉ）［３］に記載のタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ii）配列番号５に記載の塩基配列の１６９～１５９８番の配列を含むＤＮＡ；
（iii）配列番号５に記載の塩基配列の１６９～１５９８番の配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
［２５］［２４］に記載のＤＮＡから、イントロン配列を除去したＤＮＡ、
［２６］イントロン配列が、配列番号５に記載の塩基配列の２５４～３０９番、４０６～４６１番、又は、１３７２～１４５０番の配列から選択される１以上の配列を含む配列である、［２５］に記載のＤＮＡ、
［２７］［２３］～［２６］に記載のＤＮＡから、シグナル配列をコードする塩基配列を除去したＤＮＡ、
［２８］シグナル配列をコードする塩基配列が、配列番号５に記載の塩基配列の１６９～２３１番の配列である、［２７］に記載のＤＮＡ、
［２９］配列番号７に記載の塩基配列、又はその改変配列を含む、ＤＮＡ、
［３０］以下の（ｉ）、（ii）、及び（iii）から選択されるＤＮＡ：
（ｉ）［４］に記載のタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ii）配列番号７に記載の塩基配列の７０～１３７６番の配列を含むＤＮＡ；
（iii）配列番号７に記載の塩基配列の７０～１３７６番の配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
［３１］［３０］に記載のＤＮＡから、イントロン配列を除去したＤＮＡ、
［３２］イントロン配列が、配列番号７に記載の塩基配列の４５１～５００番、又は、７６５～８３０番の配列から選択される１以上の配列を含む配列である、［３１］に記載のＤＮＡ、
［３３］［２９］～［３２］に記載のＤＮＡから、シグナル配列をコードする塩基配列を除去したＤＮＡ、
［３４］シグナル配列をコードする塩基配列が、配列番号７に記載の塩基配列の７０～１２９番の配列である、［３３］に記載のＤＮＡ、
［３５］配列番号９に記載の塩基配列、又はその改変配列を含む、ＤＮＡ、
［３６］以下の（ｉ）、（ii）、及び（iii）から選択されるＤＮＡ：
（ｉ）［５］に記載のタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ii）配列番号９に記載の塩基配列の１４１～９７４番の配列を含むＤＮＡ；
（iii）配列番号９に記載の塩基配列の１４１～９７４番の配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
［３７］［３６］に記載のＤＮＡから、イントロン配列を除去したＤＮＡ、
［３８］イントロン配列が、配列番号９に記載の塩基配列の５５１～６０９番、又は、８３１～８９４番の配列から選択される１以上の配列を含む配列である、［３７］に記載のＤＮＡ、
［３９］［３５］～［３８］に記載のＤＮＡから、シグナル配列をコードする塩基配列を除去したＤＮＡ、
［４０］シグナル配列をコードする塩基配列が、配列番号９に記載の塩基配列の１４１～１８５番の配列である［３９］に記載のＤＮＡ、
［４１］配列番号１１に記載の塩基配列、又はその改変配列を含む、ＤＮＡ、
［４２］以下の（ｉ）、（ii）、及び（iii）から選択されるＤＮＡ：
（ｉ）［６］に記載のタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ii）配列番号１１に記載の塩基配列の１１４～１２３０番の配列を含むＤＮＡ；
（iii）配列番号１１に記載の塩基配列の１１４～１２３０番の配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
［４３］［４２］に記載のＤＮＡから、イントロン配列を除去したＤＮＡ、
［４４］イントロン配列が、配列番号１１に記載の塩基配列の１８３～２３２番、又は、２９９～３５７番の配列から選択される１以上の配列を含む配列である、［４３］に記載のＤＮＡ、
［４５］［４１］～［４４］に記載のＤＮＡから、シグナル配列をコードする塩基配列を除去したＤＮＡ、
［４６］シグナル配列をコードする塩基配列が、配列番号１１に記載の塩基配列の１１４～１６１番の配列である、［４５］に記載のＤＮＡ、
［４７］配列番号１３に記載の塩基配列、又はその改変配列を含む、ＤＮＡ、
［４８］以下の（ｉ）、（ii）、及び（iii）から選択されるＤＮＡ：
（ｉ）［７］に記載のタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ii）配列番号１３に記載の塩基配列の１２４～１１４３番の配列を含むＤＮＡ；
（iii）配列番号１３に記載の塩基配列の１２４～１１４３番の配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
［４９］［４８］に記載のＤＮＡから、イントロン配列を除去したＤＮＡ、
［５０］イントロン配列が、配列番号１３に記載の塩基配列の２２５～２７５番の配列である、［４９］に記載のＤＮＡ、
［５１］［４７］～［５０］に記載のＤＮＡから、シグナル配列をコードする塩基配列を除去したＤＮＡ、
［５２］シグナル配列をコードする塩基配列が、配列番号１３に記載の塩基配列の１２４～１８６番の配列である、［５１］に記載のＤＮＡ、
［５３］配列番号１５に記載の塩基配列、又はその改変配列を含む、ＤＮＡ、
［５４］以下の（ｉ）、（ii）、及び（iii）から選択されるＤＮＡ：
（ｉ）［８］に記載のタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ii）配列番号１５に記載の塩基配列の２３８～１８８７番の配列を含むＤＮＡ；
（iii）配列番号１５に記載の塩基配列の２３８～１８８７番の配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつβ－グルコシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
［５５］［５４］に記載のＤＮＡから、イントロン配列を除去したＤＮＡ、
［５６］イントロン配列が、配列番号１５に記載の塩基配列の７８４～８５０番、１１３８～１２０５番、又は、１７０３～１７５６番の配列から選択される１以上の配列を含む配列である、［５５］に記載のＤＮＡ、
［５７］［５３］～［５６］に記載のＤＮＡから、シグナル配列をコードする塩基配列を除去したＤＮＡ、
［５８］シグナル配列をコードする塩基配列が、配列番号１５に記載の塩基配列の２３８～３２１番の配列である、［５７］に記載のＤＮＡ、
［５９］配列番号１７に記載の塩基配列、又はその改変配列を含む、ＤＮＡ、
［６０］以下の（ｉ）、（ii）、及び（iii）から選択されるＤＮＡ：
（ｉ）［９］に記載のタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ii）配列番号１７に記載の塩基配列の６６～１７６５番の配列を含むＤＮＡ；
（iii）配列番号１７に記載の塩基配列の６６～１７６５番の配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつβ－グルコシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
［６１］［６０］に記載のＤＮＡから、イントロン配列を除去したＤＮＡ、
［６２］イントロン配列が、配列番号１７に記載の塩基配列の１４９～２１１番、４０４～４６０番、９３４～９８８番、又は、１５７５～１６２６番の配列から選択される１以上の配列を含む配列である、［６１］に記載のＤＮＡ、
［６３］［５９］～［６２］に記載のＤＮＡから、シグナル配列をコードする塩基配列を除去したＤＮＡ、
［６４］シグナル配列をコードする塩基配列が、配列番号１７に記載の塩基配列の６６～２２７番の配列である、［６３］に記載のＤＮＡ、
［６５］［１２］～［６４］に記載のＤＮＡを含む、発現ベクター、
［６６］［６５］に記載の発現ベクターで形質転換された、宿主細胞、
［６７］宿主細胞が酵母又は糸状菌である、［６６］に記載の宿主細胞、
［６８］酵母が、サッカロミセス（Saccharomyces）属、ハンゼヌラ（Hansenula）属又はピキア（Pichia）属に属するものである、［６７］に記載の宿主細胞、
［６９］酵母が、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）である、［６８］に記載の宿主細胞、
［７０］糸状菌が、フミコーラ（Humicola）属、アスペルギルス（Aspergillus）属、トリコデルマ（Trichoderma）属、フザリウム（Fusarium）又はアクレモニウム（Acremonium）属に属するものである、［６７］に記載の宿主細胞、
［７１］糸状菌が、アクレモニウム・セルロリティカス（Acremonium cellulolyticus）、フミコーラ・インソレンス（Humicola insolens）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）もしくはアスペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）、トリコデルマ・ビリデ（Trichoderma viride）、又はフザリウム・オキシスポーラム（Fusarium oxysporum）である、［７０］に記載の宿主細胞、
［７２］［１２］～［６４］に記載のＤＮＡに対応する遺伝子を、相同組み換えにより欠損させたアクレモニウム（Acremonium）属の糸状菌、
［７３］糸状菌がアクレモニウム・セルロリティカス（Acremonium cellulolyticus）である、［７２］に記載の糸状菌、
［７４］［６６］～［７３］に記載の宿主細胞を培養し、その宿主及び／又はその培養物から［１］～［９］に記載のタンパク質を採取する工程を含む、前記タンパク質の製造法、
［７５］［７４］に記載の方法で生産された、タンパク質、
［７６］［１］～［９］若しくは［７５］に記載のタンパク質を含む、セルラーゼ調製物、
［７７］バイオマスを糖化する処理方法であって、セルロース含有バイオマスを、［１］～［９］若しくは［７５］に記載のタンパク質、又は［７６］に記載のセルラーゼ調製物と接触させる工程を含む、方法、
［７８］セルロース含有繊維の処理方法であって、セルロース含有繊維を、［１］～［９］若しくは［７５］に記載のタンパク質、又は［７６］に記載のセルラーゼ調製物と接触させる工程を含む、方法、
［７９］古紙を脱インキ薬品により処理して脱インキを行う工程において、［１］～［９］若しくは［７５］に記載のタンパク質、又は［７６］に記載のセルラーゼ調製物を用いることを特徴とする古紙の脱インキ方法、
［８０］紙パルプのろ水性の改善方法であって、紙パルプを、［１］～［９］若しくは［７５］に記載のタンパク質、又は［７６］に記載のセルラーゼ調製物で処理する工程を含む、方法、
［８１］動物飼料の消化能を改善する方法であって、動物飼料を、［１］～［９］若しくは［７５］に記載のタンパク質、又は［７６］に記載のセルラーゼ調製物で処理する工程を含む、方法
に関する。
　本発明により、アクレモニウム・セルロリティカスに由来する特定のエンドグルカナーゼ及びβ－グルコシターゼを組換えタンパク質として効率良く生産するために必要なＤＮＡを得ることができ、また、これらセルラーゼ成分を効率良く発現する組換え微生物を得ることができる。更に、得られた組換え微生物を培養することにより、効率よく安価に特定のエンドグルカナーゼ及びβ－グルコシターゼを生産することができる。
　また本発明により、アクレモニウム・セルロリティカスのゲノムより特定のエンドグルカナーゼ及びβ－グルコシターゼ遺伝子を欠損させることができ、その結果、これらのエンドグルカナーゼ及びβ－グルコシターゼが含まれていないセルラーゼを生産する組換えアクレモニウム・セルロリティカスを得て、特定のエンドグルカナーゼ及びβ－グルコシターゼセルラーゼが含まれていないセルラーゼを生産することができる。
　本発明で得られる様々なセルラーゼの中から、最適なセルラーゼ群を選択し、セルロース系基質を処理することにより、これらセルロース系基質を効率的かつ安価に分解することができる。
プラスミドpACC3の制限酵素地図である。 プラスミドpACC5の制限酵素地図である。 プラスミドpACC6の制限酵素地図である。 プラスミドpACC7の制限酵素地図である。 プラスミドpACC8の制限酵素地図である。 プラスミドpACC9の制限酵素地図である。 プラスミドpACC10の制限酵素地図である。 プラスミドpBGLCの制限酵素地図である。 プラスミドpBGLDの制限酵素地図である。
エンドグルカナーゼ及びβ－グルコシターゼ
　本発明のタンパク質であるエンドグルカナーゼ及びβ－グルコシターゼは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８から選択されるアミノ酸配列における成熟タンパク質部分に対応する配列を含むか、あるいは、該アミノ酸配列と実質的に同等なアミノ酸配列を含むことができる。
　本発明において「実質的に同等なアミノ酸配列」とは、例えば、１つ若しくは複数個（好ましくは数個）のアミノ酸の置換、欠失、及び／又は付加による改変を有するが、ポリペプチドの活性に影響を受けないアミノ酸配列や、７０％以上の同一性を有するが、ポリペプチドの活性に影響を受けないアミノ酸配列を意味する。
　改変されるアミノ酸残基の数は、好ましくは１～４０個、より好ましくは１～数個、更に好ましくは１～８個、最も好ましくは１～４個である。本発明でいう「活性に影響を与えない改変」の例としては、保存的置換が挙げられる。「保存的置換」とは、ポリペプチドの活性を実質的に変化しないように１若しくは複数個のアミノ酸残基を、別の化学的に類似したアミノ酸残基で置き換えることを意味する。例えば、ある疎水性アミノ酸残基を別の疎水性アミノ酸残基によって置換する場合、ある極性アミノ酸残基を同じ電荷を有する別の極性アミノ酸残基によって置換する場合などが挙げられる。このような置換を行うことができる機能的に類似したアミノ酸は、アミノ酸毎に当該技術分野において公知である。具体例を挙げると、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニン等が挙げられる。極性（中性）アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システイン等が挙げられる。陽電荷をもつ（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジン等が挙げられる。また、負電荷をもつ（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸等が挙げられる。
　本明細書における「同一性（identity）」とは、当業者に公知の相同性検索プログラムであるＦＡＳＴＡ３［Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１４３５－１４４１（１９８５）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５，２４４４－２４４８（１９８８）；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／Ｅ－ｍａｉｌ／ｈｏｍｏｌｏｇｙ－ｊ．ｈｔｍｌ］においてデフォルト（初期設定）のパラメータを用いて算出される数値である。前記同一性としては、好ましくは８０％以上の同一性、より好ましくは９０％以上の同一性、更に好ましくは９５％以上の同一性、更に好ましくは９８％以上の同一性、特に好ましくは９９％以上の同一性であることができる。
　本発明のタンパク質は、成熟タンパク質部分に対応する各アミノ酸配列、又はそれらと実質的に同等なアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端に、酵素活性に影響を与えない範囲で、任意のポリペプチド配列を付与することができる。このようなポリペプチド配列としては、例えば、シグナル配列、検出用マーカー（例えば、ＦＬＡＧタグ）、精製用ポリペプチド［例えば、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）］を挙げることができる。
エンドグルカナーゼ及びβ－グルコシターゼ遺伝子
　本発明のポリヌクレオチドであるエンドグルカナーゼ及びβ－グルコシターゼ遺伝子は、前記の本発明のタンパク質をコードする塩基配列を含むことができ、また、配列番号１に記載の塩基配列の１３６～１４３７番の配列、配列番号３に記載の塩基配列の１２８～１６１５番の配列、配列番号５に記載の塩基配列の１６９～１５９８番の配列、配列番号７に記載の塩基配列の７０～１３７６番の配列、配列番号９に記載の塩基配列の１４１～９７４番の配列、配列番号１１に記載の塩基配列の１１４～１２３０番の配列、配列番号１３に記載の塩基配列の１２４～１１４３番の配列、配列番号１５に記載の塩基配列の２３８～１８８７番の配列、配列番号１７に記載の塩基配列の６６～１７６５番の配列から選択される塩基配列、あるいは、該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能な塩基配列を含むことができる。
　本発明において「ストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーション後のメンブレンの洗浄操作を、高温度低塩濃度溶液中で行うことを意味し、例えば、２×ＳＳＣ濃度（１×ＳＳＣ：１５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸３ナトリウム、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム）、０．５％ＳＤＳ溶液中で、６０℃、２０分間の洗浄条件を意味する。
エンドグルカナーゼ及びβ－グルコシターゼ遺伝子の取得
　本発明のエンドグルカナーゼ及びβ－グルコシターゼ遺伝子は、例えば、以下の方法によりアクレモニウム・セルロリティカス又はその変異株から単離することができる。また、本発明に開示するように塩基配列が明らかとなっているため、人工的に化学合成することも可能である。
　アクレモニウム・セルロリティカスの菌体から、慣行法によりゲノムＤＮＡを抽出する。このゲノムＤＮＡを適当な制限酵素にて消化後、適当なベクターと連結することにより、アクレモニウム・セルロリティカスのゲノムＤＮＡライブラリーを作製する。ベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、コスミドベクター、ＢＡＣベクター等、多様なものが使用できる。
　次に、本明細書において開示したエンドグルカナーゼ及びβ－グルコシターゼ遺伝子の塩基配列に基づいて適当なプローブを作成し、ゲノムＤＮＡライブラリーからハイブリダイゼーションによって所望のエンドグルカナーゼ及びβ－グルコシターゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を単離することができる。また、本明細書において開示したエンドグルカナーゼ及びβ－グルコシターゼ遺伝子の塩基配列に基づいて所望の遺伝子を増幅させるためのプライマーを作成し、アクレモニウム・セルロリティカスのゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを実施し、増幅したＤＮＡ断片を適当なベクターと連結することにより所望の遺伝子を単離することができる。更に、本発明によるエンドグルカナーゼ及びβ－グルコシターゼ遺伝子は、プラスミドpACC3、pACC5、pACC6、pACC7、pACC8、pACC9、pACC10、pBGLC、及びプラスミドpBGLDに含まれていることから、これらをＰＣＲの鋳型ＤＮＡとして利用することが可能である。また、これらプラスミドから適当な制限酵素にて所望のＤＮＡ断片を調製することができる。
微生物の寄託
　pACC3で形質転換された大腸菌（Escherichia coli TOP10/pACC3）は、平成２０（２００８）年１０月９日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５－８５６６日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に国際寄託された。受託番号は、ＦＥＲＭ ＢＰ－１１０２９である。
　pACC5で形質転換された大腸菌（Escherichia coli TOP10/pACC5）は、平成２０（２００８）年１０月９日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５－８５６６日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に国際寄託された。受託番号は、ＦＥＲＭ ＢＰ－１１０３０である。
　pACC6で形質転換された大腸菌（Escherichia coli TOP10/pACC6）は、平成２０（２００８）年１０月９日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５－８５６６日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に国際寄託された。受託番号は、ＦＥＲＭ ＢＰ－１１０３１である。
　pACC7で形質転換された大腸菌（Escherichia coli TOP10/pACC7）は、平成２０（２００８）年１０月９日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５－８５６６日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に国際寄託された。受託番号は、ＦＥＲＭ ＢＰ－１１０３２である。
　pACC8で形質転換された大腸菌（Escherichia coli TOP10/pACC8）は、平成２０（２００８）年１０月９日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５－８５６６日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に国際寄託された。受託番号は、ＦＥＲＭ ＢＰ－１１０３３である。
　pACC9で形質転換された大腸菌（Escherichia coli TOP10/pACC9）は、平成２０（２００８）年１０月９日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５－８５６６日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に国際寄託された。受託番号は、ＦＥＲＭ ＢＰ－１１０３４である。
　pACC10で形質転換された大腸菌（Escherichia coli TOP10/pACC10）は、平成２０（２００８）年１０月９日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５－８５６６日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に国際寄託された。受託番号は、ＦＥＲＭ ＢＰ－１１０３５である。
　pBGLCで形質転換された大腸菌（Escherichia coli TOP10/pBGLC）は、平成２０（２００８）年１０月９日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５－８５６６日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に国際寄託された。受託番号は、ＦＥＲＭ ＢＰ－１１０３６である。
　pBGLDで形質転換された大腸菌（Escherichia coli TOP10/pBGLD）は、平成２０（２００８）年１０月９日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５－８５６６日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に国際寄託された。受託番号は、ＦＥＲＭ ＢＰ－１１０３７である。
発現ベクター及び形質転換された微生物
　本発明においては、前記の配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８に記載されるアミノ酸配列、又はその改変アミノ酸配列をコードする塩基配列を含むＤＮＡ（以下、単に「本発明によるＤＮＡ配列」という）を、宿主微生物内で複製可能で、かつ、そのＤＮＡ配列がコードするタンパク質を発現可能な状態で含む発現ベクターが提供される。本発現ベクターは、自己複製ベクター、すなわち、染色体外の独立体として存在し、その複製が染色体の複製に依存しない、例えば、プラスミドを基本に構築することができる。また、本発現ベクターは、宿主微生物に導入されたとき、その宿主微生物のゲノム中に組み込まれ、それが組み込まれた染色体と一緒に複製されるものであってもよい。本発明によるベクター構築の手順及び方法は、遺伝子工学の分野で慣用されているものを用いることができる。
　本発明による発現ベクターは、これを実際に宿主微生物に導入して所望の活性を有するタンパク質を発現させるために、前記の本発明によるＤＮＡ配列の他に、その発現を制御するＤＮＡ配列や微生物を選択するための遺伝子マーカー等を含んでいるのが望ましい。発現を制御するＤＮＡ配列としては、プロモーター及びターミネーター及びシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列等がこれに含まれる。プロモーターは宿主微生物において転写活性を示すものであれば特に限定されず、宿主微生物と同種若しくは異種のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子の発現を制御するＤＮＡ配列として得ることができる。また、シグナルペプチドは、宿主微生物において、タンパク質の分泌に寄与するものであれば特に限定されず、宿主微生物と同種若しくは異種のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子から誘導されるＤＮＡ配列より得ることができる。また、本発明における遺伝子マーカーは、形質転換体の選択の方法に応じて適宜選択されてよいが、例えば薬剤耐性をコードする遺伝子、栄養要求性を相補する遺伝子を利用することができる。
　更に、本発明によれば、この発現ベクターによって形質転換された微生物が提供される。この宿主－ベクター系は特に限定されず、例えば、大腸菌、放線菌、酵母、糸状菌などを用いた系、及び、それらを用いた他のタンパク質との融合タンパク質発現系などを用いることができる。
　また、この発現ベクターによる微生物の形質転換も、この分野で慣用されている方法に従い実施することができる。
　更に、この形質転換体を適当な培地で培養し、その培養物から上記の本発明によるタンパク質を単離して得ることができる。従って、本発明の別の態様によれば、前記の本発明による新規タンパク質の製造方法が提供される。形質転換体の培養及びその条件は、使用する微生物についてのそれと本質的に同等であってよい。また、形質転換体を培養した後、目的のタンパク質を回収する方法は、この分野で慣用されているものを用いることができる。
　また、本発明における好ましい態様によれば、本発明によるＤＮＡ配列によってコードされるエンドグルカナーゼ及びβ－グルコシターゼ酵素を発現させ得る酵母細胞が提供される。本発明における酵母細胞としては、例えばサッカロミセス（Saccharomyces）属、ハンゼヌラ（Hansenula）属、又はピキア（Pichia）属に属する微生物、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）が挙げられる。
　本発明における宿主糸状菌は、フミコーラ（Humicola）属、アスペルギルス（Aspergillus）属又はトリコデルマ（Trichoderma）属、フザリウム（Fusarium）属、又はアクレモニウム（Acremonium）属に属するものであることができる。更にそれらの好ましい例としては、フミコーラ・インソレンス（Humicola insolens）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）若しくはアスペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）、又はトリコデルマ・ビリデ（Trichoderma viride）、フザリウム・オキシスポーラム（Fusarium oxysporum）、又はアクレモニウム・セルロリティカス（Acremonium cellulolyticus）が挙げられる。
　本発明によるエンドグルカナーゼ及びβ－グルコシターゼ遺伝子を適当なベクターに連結してアクレモニウム・セルロリティカスに導入し、その発現を抑制すること、又はこれら遺伝子について相同組換えを利用して遺伝子破壊を行いその機能を欠損させることにより、特定のエンドグルカナーゼ及びβ－グルコシターゼの発現を抑制することができる。相同組換えを利用した遺伝子破壊は慣用の方法に従って実施することができ、遺伝子破壊に用いられるベクターの作成やベクターの宿主への導入は当業者に自明であろう。
セルラーゼの調製
　こうして得られた形質転換体を適当な培地で培養し、その培養物から上記した本発明のタンパク質を単離して得ることができる。形質転換体の培養及びその条件は、使用する微生物に応じて適宜に設定すればよい。また、培養液からの目的とするタンパク質の回収、精製も常法に従って行うことができる。
セルラーゼ調製物 
　本発明の別の態様によれば、上記の本発明によるタンパク質（セルラーゼ）を含むセルラーゼ調製物が提供される。本発明によるセルラーゼ調製物は、本発明によるセルラーゼに、一般的に含まれる成分、例えば賦形剤（例えば、乳糖、塩化ナトリウム、ソルビトール等）、界面活性剤、防腐剤等とともに混合され製造されてもよい。また、本発明におけるセルラーゼ調製物はいずれか適当な形状、例えば粉末又は液体状に調製することができる。
セルラーゼの用途
　本発明によれば、バイオマス糖化について本発明のセルラーゼ酵素（群）又はセルラーゼ調製物による処理で有意に糖化を改善できるものと考えられる。従って、本発明によれば、バイオマス糖化の改善方法であって、本発明のセルラーゼ酵素（群）又はセルラーゼ調製物でバイオマスを処理する工程を含む方法が提供される。本発明で処理できるバイオマスの例としては、稲わら、バガス、コーンストーバー、椰子の実などの果実の絞りかす、廃木材、並びにこれらに適切な前処理を施した材料が挙げられる。
　更に本発明によれば、着色セルロース含有繊維の澄明化をもたらす方法であって、セルラーゼ酵素（群）又はセルラーゼ調製物で着色セルロース含有繊維を処理する工程を含む方法、並びに、着色セルロース含有繊維の色の局所的な変化をもたらす方法、すなわち、着色セルロース含有繊維にストーンウオッシュの外観を与える方法が提供される。そして、この方法は、本発明のエンドグルカナーゼ酵素又はセルラーゼ調製物により着色セルロース含有繊維を処理する工程を含む。
　また、本発明によれば、紙パルプのろ水性が、強度の著しい低下を伴うことなく、本発明によるエンドグルカナーゼ酵素による処理で有意に改善できるものと考えられる。従って、本発明によれば、パルプのろ水性の改善方法であって、本発明のエンドグルカナーゼ酵素又はセルラーゼ調製物で紙パルプを処理する工程を含む方法が提供される。本発明で処理できるパルプの例としては、古紙パルプ、再循環板紙パルプ、クラフトパルプ、亜硫酸パルプ又は加工熱処理及び他の高収率パルプが挙げられる。
　更に、本発明によるエンドグルカナーゼを動物飼料中で用いることにより、飼料中のグルカンの消化能を改善することができる。従って、本発明によれば、動物飼料の消化能を改善する方法であって、本発明のエンドグルカナーゼ酵素又はセルラーゼ調製物で動物飼料を処理する工程を含む方法が提供される。
　本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明はその要旨を越えない限り以下の実施例に限定されるものではない。
《実施例１：ACC3遺伝子のクローニング》
（1-1）ゲノムDNAの単離
　アクレモニウム・セルロリティカス（Acremonium cellulolyticus）ACCP-5-1株を（s）培地（2%ブイヨン、0.5%イーストエキス及び2%グルコース）で32℃にて2日間培養し、遠心分離により菌体を回収した。得られた菌体より、堀内らの方法（H.Horiuchi et. al., J.Bacteriol., 170, 272-278, (1988)）に従いゲノムDNAを単離した。
（1-2）ACC3遺伝子断片の取得
　Glycoside Hydrolase family 5に分類される既知のエンドグルカナーゼの配列を基に以下のプライマーを作製した。
ACC3-F：GGGCGTCTGTRTTYGARTGT（配列番号：19）
ACC3-R：AAAATGTAGTCTCCCCACCA（配列番号：20）
　ACC3-F及びACC3-Rをプライマーとして使用し、ゲノムDNAを鋳型としてPCRを行った。PCRはLA taqポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いて実施した。PCRは94℃で30秒、アニールを30秒、72℃で1分間を40サイクル実施するプログラムで実施したが、アニール温度は最初の20サイクルで63℃から53℃へ段階的に低下させ、その後の20サイクルにおいては53℃に固定した。増幅された1kbpのDNA断片を、TOPO TAクローニングキット（インビトロジェン社製）により、添付のプロトコールに従ってpCR2.1-TOPOプラスミドベクターに挿入し、プラスミドTOPO-pACC3-partialを得た。
　プラスミドTOPO-pACC3-partialにクローニングされた挿入DNA断片のシークエンスはBigDye Terminator v3.1 Cycle Sequebcing Kit（アプライドバイオシステムズ社製）とABI PRISMジェネティックアナライザー（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて、添付のプロトコールに従って行った。その結果得られた塩基配列をアミノ酸配列に翻訳し、そのアミノ酸配列をホモロジー検索した結果、タラロマイセス・エメルソニ（Talaromyces emersonii）由来のエンドグルカナーゼEG1（Q8WZD7）と74％の同一性を示したため、本DNA断片をエンドグルカナーゼ（Glycoside Hydrolase family 5）遺伝子の一部であると判断した。
（1-3）インバースPCR法によるACC3遺伝子全長の取得
　インバースPCR法はTrigliaらの方法（T Triglia et. al., Nucleic Acids Research, 16, 8186, (1988)）に従い実施した。アクレモニウム・セルロリティカスのゲノムDNAをSalＩで一晩消化し、Mighty Mix（タカラバイオ社製）を用いて環状DNAを作製した。本環状DNAをテンプレートに、ACC3遺伝子断片に含まれる下記の配列によりPCRを実施し、ACC3遺伝子の5’上流領域並びに3’下流領域を取得した。
ACC3-inv-F：ACTTCCAGACTTTCTGGTCC（配列番号：21）
ACC3-inv-R：AGGCCGAGAGTAAGTATCTC（配列番号：22）
　上記5’上流領域並びに3’下流領域を実施例1-2に記載の方法により解析し、ACC3遺伝子の全長塩基配列を決定した。
　インバースPCR法により得た塩基配列を基に以下のプライマーを作製し、ゲノムDNAをテンプレートにPCRを実施し、ACC3遺伝子を増幅した。
pACC3-F：GAAGGATGGTAGATTGTCCG（配列番号：23）
pACC3-R：ACCGAGAAGGATTTCTCGCA（配列番号：24）
　増幅されたDNAをTOPO TAクローニングキット（インビトロジェン社製）によりpCR2.1-TOPOプラスミドベクターに挿入し、プラスミドpACC3を得た。得られたプラスミドpACC3により大腸菌（Escherichia coli）TOP10株（インビトロジェン社製）を形質転換することによりEscherichia coli TOP10株/pACC3を得た。
（1-4）cDNAの作製並びにACC3遺伝子のイントロン解析
　アクレモニウム・セルロリティカスACCP-5-1株をセルラーゼ誘導培地で32℃にて2日間培養し、遠心分離により菌体を回収した。得られた菌体を液体窒素で凍結後、乳鉢と乳棒を用いて磨砕した。この磨砕した菌体からISOGEN（ニッポンジーン社）により、添付のプロトコールに従い全RNAを単離した。更に全RNAから、mRNA Purification Kit（ファルマシア社）により、添付のプロトコールに従い、mRNAを精製した。
　こうして得られたmRNAから、TimeSaver cDNA Synthesis Kit（ファルマシア社）により、添付のプロトコールに従い、cDNAを合成した。ACC3遺伝子配列から開始コドン並びに終始コドンを含む下記のプライマーを作製し、cDNAをテンプレートにPCRを実施し、ACC3 cDNA遺伝子を増幅した。
ACC3-N：ATGAAGACCAGCATCATTTCTATC（配列番号：25）
ACC3-C：TCATGGGAAATAACTCTCCAGAAT（配列番号：26）
　上記ACC3 cDNA遺伝子を実施例1-2に記載の方法により解析し、pACC3遺伝子と比較することでイントロンの位置を決定した。
（1-5）ACC3のアミノ酸配列の推定
　上記の方法によりアクレモニウム・セルロリティカスより単離されたエンドグルカナーゼACC3遺伝子は配列番号１に記載の塩基配列の136～1437番に示された1302bpの塩基からなっていた。また、本ACC3遺伝子は配列番号１に記載の塩基配列の233～291番、351～425番、579～631番、697～754番、及び853～907番に示される5つのイントロンが含まれていることが示された。オープンリーディングフレーム（ORF）から予測されるACC3のアミノ酸配列は配列番号２に示される通りであった。なお、シグナル配列予測ソフトSignalP 3.0により本ACC3の-27～-1アミノ酸残基までがシグナル配列と推定した。
《実施例２：ACC5遺伝子のクローニング》
（2-1）ゲノムDNA並びにmRNAの単離とcDNAの作製
　実施例1-1に記載の方法で、アクレモニウム・セルロリティカスACCP-5-1株のゲノムDNAを単離した。また、実施例1-4に記載の方法で、アクレモニウム・セルロリティカスACCP-5-1株のcDNAを作製した。
（2-2）ACC5遺伝子断片の取得
　Glycoside Hydrolase family 7に分類される既知のエンドグルカナーゼのN末端アミノ酸配列並びにポリA塩基配列を基に以下のプライマーを作製した。
ACC5-F：CAGCAGGCCCCCACCCCNGAYAAYYTNGC（配列番号：27）
ACC5-R：AATTCGCGGCCGCTAAAAAAAAA（配列番号：28）
　ACC5-F及びACC5-Rをプライマーとして使用し、cDNAを鋳型としてPCRを行った。PCRはLA taqポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いて実施した。PCRは94℃で30秒、アニールを30秒、72℃で1分間を40サイクル実施するプログラムで実施したが、アニール温度は最初の20サイクルで63℃から53℃へ段階的に低下させ、その後の20サイクルにおいては53℃に固定した。増幅された1.5kbpのDNA断片を、TOPO TAクローニングキット（インビトロジェン社製）により、添付のプロトコールに従ってpCR2.1-TOPOプラスミドベクターに挿入し、プラスミドTOPO-pACC5-partialを得た。
　プラスミドTOPO-pACC5-partialにクローニングされた挿入DNA断片の塩基配列を解析し、得られた塩基配列をアミノ酸配列に翻訳し、そのアミノ酸配列をホモロジー検索した結果、アスペルギルス・フミガタス（Aspergillus fumigatus）由来のエンドグルカナーゼ（Q4WCM9）と60％の同一性を示したため、本DNA断片をエンドグルカナーゼ（Glycoside Hydrolase family 7）遺伝子の一部であると判断した。
（2-3）インバースPCR法によるACC5遺伝子全長の取得
　実施例1-3に記載の方法で、HindIIIで消化した環状DNAをテンプレートに、ACC5遺伝子断片に含まれる下記の配列によりPCRを実施し、ACC5遺伝子の5’上流領域並びに3’下流領域を取得した。
ACC5-inv-F：ATCTCACCTGCAACCTACGA（配列番号：29）
ACC5-inv-R：CCTCTTCCGTTCCACATAAA（配列番号：30）
　上記5’上流領域並びに3’下流領域の塩基配列を解析し、ACC5遺伝子の全長塩基配列を決定した。
　インバースPCR法により得た塩基配列を基に以下のプライマーを作製し、ゲノムDNAをテンプレートにPCRを実施し、ACC5遺伝子を増幅した。
pACC5-F：ATTGCTCCGCATAGGTTCAA（配列番号：31）
pACC5-R：TTCAGAGTTAGTGCCTCCAG（配列番号：32）
増幅されたDNAをTOPO TAクローニングキット（インビトロジェン社製）によりpCR2.1-TOPO　プラスミドベクターに挿入し、プラスミドpACC5を得た。得られたプラスミドpACC5により大腸菌（Escherichia coli）TOP10株（インビトロジェン社製）を形質転換することによりEscherichia coli TOP10株/pACC5を得た。
（2-4）ACC5遺伝子のイントロン解析
　ACC5遺伝子配列から開始コドン並びに終始コドンを含む下記のプライマーを作製し、cDNAをテンプレートにPCRを実施し、ACC5 cDNA遺伝子を増幅した。
ACC5-N：ATGGCGACTAGACCATTGGCTTTTG（配列番号：33）
ACC5-C：CTAAAGGCACTGTGAATAGTACGGA（配列番号：34）
　上記ACC5 cDNA遺伝子の塩基配列を解析し、pACC5遺伝子と比較することでイントロンの位置を決定した。
（2-5）ACC5のアミノ酸配列の推定
　上記の方法によりアクレモニウム・セルロリティカスより単離されたエンドグルカナーゼACC5遺伝子は配列番号３に記載の塩基配列の128～1615番に示された1488bpの塩基からなっていた。オープンリーディングフレーム（ORF）から予測されるACC5のアミノ酸配列は配列番号４に示される通りであった。なお、シグナル配列予測ソフトSignalP 3.0により本ACC5の-20～-1アミノ酸残基までがシグナル配列と推定した。
《実施例３：ACC6遺伝子のクローニング》
（3-1）ゲノムDNAの単離とゲノムライブラリーの作製
　実施例1-1に記載の方法で、アクレモニウム・セルロリティカスACCP-5-1株のゲノムDNAを単離した。単離したゲノムDNAをSau3AＩにより部分消化した。これをファージベクター・dMBL3クローニングキット（ストラタジーン社製）のBamHＩアームに、ライゲーションキットVer.2（宝酒造社製）を用いて連結させた。これをエタノール沈殿後、TE緩衝液に溶解した。連結混合物をMaxPlaxλpackerging kit（エピセンターテクノロジー社製）を用い、ファージ粒子を形成させ、大腸菌XL1-blue MRA（P2）株に感染させた。この方法により1.1 X 104個のファージから成るゲノムDNAライブラリーが得られた。
（3-2）ACC6遺伝子断片の取得
　Glycoside Hydrolase family 5に分類される既知のエンドグルカナーゼの配列を基に以下のプライマーを作製した。
ACC6-F：GTGAACATCGCCGGCTTYGAYTTYGG（配列番号：35）
ACC6-R：CCGTTCCACCGGGCRTARTTRTG（配列番号：36）
　ACC6-F及びACC6-Rをプライマーとして使用し、ゲノムDNAを鋳型としてPCRを行った。PCRはLA taqポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いて実施した。PCRは94℃で30秒、アニールを30秒、72℃で1分間を40サイクル実施するプログラムで実施したが、アニール温度は最初の20サイクルで63℃から53℃へ段階的に低下させ、その後の20サイクルにおいては53℃に固定した。増幅された300bpのDNA断片を、TOPO TAクローニングキット（インビトロジェン社製）により、添付のプロトコールに従ってpCR2.1-TOPOプラスミドベクターに挿入し、プラスミドTOPO-pACC6-partialを得た。
　プラスミドTOPO-pACC6-partialにクローニングされた挿入DNA断片の塩基配列を解析し、得られた塩基配列をアミノ酸配列に翻訳し、そのアミノ酸配列をホモロジー検索した結果、トリコデルマ・ビリデ（Trichoderma viride）由来のエンドグルカナーゼEG3（Q7Z7X2）と61％の同一性を示したため、本DNA断片をエンドグルカナーゼ（Glycoside Hydrolase family 5）遺伝子の一部であると判断した。本DNA断片をプラスミドTOPO-pACC6-partialを鋳型として上記と同様の方法でPCRに増幅し、得られたPCR産物はECLダイレクトシステム（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用いて標識しプローブとした。
（3-3）プラークハイブリダイゼーションによるスクリーニング
　実施例3-1において作成したファージプラークを、ハイボンドＮ＋ナイロントランスファーメンブラン（アマシャム社製）に転写し、アルカリ変性後、5倍濃度SSC（SSC：15mmol/Lクエン酸3ナトリウム、150mmol/L塩化ナトリウム）で洗浄し、乾燥させてDNAを固定した。ハイブリダイゼーションは、1時間のプレハイブリダイゼーション（42℃）の後、HRP標識プローブを添加し、4時間（42℃）ハイブリダイゼーションを行った。プローブの洗浄は6M尿素、0.4％SDS添加0.5倍濃度SSCで2回、2倍濃度SSCで2回行った。
　プローブの洗浄を行ったナイロン膜は、検出溶液に１分間浸したあと、同社製ハイパーフィルムECLに感光させ、1個の陽性クローンを得た。陽性クローンからのDNA調製は、Maniatisらの方法（J．Sambrook，E．F．Fritsch and T．Maniat1s，"Molecular Cloning"，Cold Spring Harbor Laboratory Press.1989）に従い、宿主大腸菌としてLE392を用いて行った。まず、LE392をLB-MM培地（1％ペプトン、0.5％イーストエキス、0.5％塩化ナトリウム、10mmol/L硫酸マグネシウム、0.2％マルトース）で一晩培養した。これにシングルプラーク由来のファージ溶液を感染させ、LB-MM培地で一晩培養した。これに、塩化ナトリウムを1Mに、そしてクロロホルムを0.8％になるよう加え、大腸菌の溶菌を促進させた。遠心分離により、菌体残渣をのぞき、10％PEG6000による沈澱からファージ粒子を回収した。ファージ粒子はSDS存在下、プロティナーゼKで消化し、これをフェノール処理、エタノール沈澱化によりファージDNAを回収した。
　以上のように調製したDNAはECLダイレクトシステムを用い、サザンブロット解析を行った。実施例3-2のPCR増幅断片をプローブにハイブリダイゼーションを行った結果、2.9kbpのXbaI断片が染色体DNAと共通のハイブリダイゼーションパターンを示した。このXbaI断片をpUC118にクローン化し、プラスミドpUC-ACC6を得た後、プラスミドの塩基配列を解析した。
（3-4）ACC6遺伝子全長の取得
　pUC-ACC6より得た塩基配列を基に以下のプライマーを作製し、ゲノムDNAをテンプレートにPCRを実施し、ACC6遺伝子を増幅した。
pACC6-F：CTCTGCATTGAATCCCGAGA（配列番号：37）
pACC6-R：GCAACGCTAAAGTGCTCATC（配列番号：38）
　増幅されたDNAをTOPO TAクローニングキット（インビトロジェン社製）によりpCR2.1-TOPOプラスミドベクターに挿入し、プラスミドpACC6を得た。得られたプラスミドpACC6により大腸菌（Escherichia coli）TOP10株（インビトロジェン社製）を形質転換することによりEscherichia coli TOP10株/pACC6を得た。
（3-5）cDNAの作製並びにACC6遺伝子のイントロン解析
　実施例1-4に記載の方法で、アクレモニウム・セルロリティカスACCP-5-1株のcDNAを作製した。ACC6遺伝子配列から開始コドン並びに終始コドンを含む下記のプライマーを作製し、cDNAをテンプレートにPCRを実施し、ACC6 cDNA遺伝子を増幅した。
ACC6-N：ATGACAATCATCTCAAAATTCGGT（配列番号：39）
ACC6-C：TCAGGATTTCCACTTTGGAACGAA（配列番号：40）
　上記ACC6 cDNA遺伝子の塩基配列を解析し、pACC6遺伝子と比較することでイントロンの位置を決定した。
（3-6）ACC6のアミノ酸配列の推定
　上記の方法によりアクレモニウム・セルロリティカスより単離されたエンドグルカナーゼACC6遺伝子は配列番号５に記載の塩基配列の169～1598番に示された1430bpの塩基からなっていた。また、本ACC6遺伝子は配列番号５に記載の塩基配列の254～309番、406～461番、及び1372～1450番に示される3つのイントロンが含まれていることが示された。オープンリーディングフレーム（ORF）から予測されるACC6のアミノ酸配列は配列番号６に示される通りであった。なお、シグナル配列予測ソフトSignalP 3.0により本ACC6の-21～-1アミノ酸残基までがシグナル配列と推定した。
《実施例４：ACC7遺伝子のクローニング》
（4-1）ゲノムDNAの単離とゲノムライブラリーの作製
　実施例3-1に記載の方法で、アクレモニウム・セルロリティカスACCP-5-1株のゲノムDNAライブラリーを調製した。
（4-2）ACC7遺伝子断片の取得
　Glycoside Hydrolase family 5に分類される既知のエンドグルカナーゼの配列を基に以下のプライマーを作製した。
ACC7-F：CACGCCATGATCGACCCNCAYAAYTAYG（配列番号：41）
ACC7-R：ACCAGGGGCCGGCNGYCCACCA（配列番号：42）
　ACC7-F及びACC7-Rをプライマーとして使用し、ゲノムDNAを鋳型としてPCRを行った。PCRはLA taqポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いて実施した。PCRは94℃で30秒、アニールを30秒、72℃で1分間を40サイクル実施するプログラムで実施したが、アニール温度は最初の20サイクルで63℃から53℃へ段階的に低下させ、その後の20サイクルにおいては53℃に固定した。増幅された670bpのDNA断片を、TOPO TAクローニングキット（インビトロジェン社製）により、添付のプロトコールに従ってpCR2.1-TOPOプラスミドベクターに挿入し、プラスミドTOPO-pACC7-partialを得た。
　プラスミドTOPO-pACC7-partialにクローニングされた挿入DNA断片の塩基配列を解析し、得られた塩基配列をアミノ酸配列に翻訳し、そのアミノ酸配列をホモロジー検索した結果、アスペルギルス・フミガタス（Aspergillus fumigatus）由来のエンドグルカナーゼ（Q4WM09）と63％の同一性を示したため、本DNA断片をエンドグルカナーゼ（Glycoside Hydrolase family 5）遺伝子の一部であると判断した。本DNA断片をプラスミドTOPO-pACC7-partialを鋳型として上記と同様の方法でPCRに増幅し、得られたPCR産物はECLダイレクトシステム（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用いて標識しプローブとした。
（4-3）プラークハイブリダイゼーションによるスクリーニング
　実施例3-3の記載の方法で、ゲノムDNAライブラリーをスクリーニングした結果、1個の陽性クローンを得た。得られた陽性クローンについてサザンブロット解析を行った結果、3.7kbpのXbaI断片が染色体DNAと共通のハイブリダイゼーションパターンを示した。このXbaI断片をpUC118にクローン化し、プラスミドpUC-ACC7を得た後、プラスミドの塩基配列を解析した。
（4-4）ACC7遺伝子全長の取得
　pUC-ACC7より得た塩基配列を基に以下のプライマーを作製し、ゲノムDNAをテンプレートにPCRを実施し、ACC7遺伝子を増幅した。
pACC7-F：CAGTCAGTTGTGTAGACACG（配列番号：43）
pACC7-R：ACTCAGCTGGGTCTTCATAG（配列番号：44）
増幅されたDNAをTOPO TAクローニングキット（インビトロジェン社製）によりpCR2.1-TOPO　プラスミドベクターに挿入し、プラスミドpACC7を得た。得られたプラスミドpACC7により大腸菌（Escherichia coli）TOP10株（インビトロジェン社製）を形質転換することによりEscherichia coli TOP10株/pACC7を得た。
（4-5）cDNAの作製並びにACC7遺伝子のイントロン解析
　実施例1-4に記載の方法で、アクレモニウム・セルロリティカスACCP-5-1株のcDNAを作製した。ACC7遺伝子配列から開始コドン並びに終始コドンを含む下記のプライマーを作製し、cDNAをテンプレートにPCRを実施し、ACC7 cDNA遺伝子を増幅した。
ACC7-N：ATGAGGTCTACATCAACATTTGTA（配列番号：45）
ACC7-C：CTAAGGGGTGTAGGCCTGCAGGAT（配列番号：46）
　上記ACC7 cDNA遺伝子の塩基配列を解析し、pACC7遺伝子と比較することでイントロンの位置を決定した。
（4-6）ACC7のアミノ酸配列の推定
　上記の方法によりアクレモニウム・セルロリティカスより単離されたエンドグルカナーゼACC7遺伝子は配列番号７に記載の塩基配列の70～1376番に示された1307bpの塩基からなっていた。また、本ACC7遺伝子は配列番号７に記載の塩基配列の451～500番、及び765～830番に示される2つのイントロンが含まれていることが示された。オープンリーディングフレーム（ORF）から予測されるACC7のアミノ酸配列は配列番号８に示される通りであった。なお、シグナル配列予測ソフトSignalP 3.0により本ACC7の-20～-1アミノ酸残基までがシグナル配列であると推定した。
《実施例５：ACC8遺伝子のクローニング》
（5-1）ゲノムDNAの単離とゲノムライブラリーの作製
　実施例3-1に記載の方法で、アクレモニウム・セルロリティカスACCP-5-1株のゲノムDNAライブラリーを調製した。
（5-2）ACC8遺伝子断片の取得
　ペニシリウム・ベルクロッサム（Penicillium verruculosum）由来のエンドグルカナーゼIIIのN末端、C末端のアミノ酸配列に対応するDNA配列に基づき、以下のプライマーを作製した。
MSW-N：CAACAGAGTCTATGCGCTCAATACTCGAGCTACACCAGT（配列番号：47）
MSW-C：CTAATTGACAGCTGCAGACCAA（配列番号：48）
　MSW-N及びMSW-Cをプライマーとして使用し、ゲノムDNAを鋳型としてPCRを行った。PCRはLA taqポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いて実施した。PCRは94℃で30秒、アニールを30秒、72℃で1分間を40サイクル実施するプログラムで実施したが、アニール温度は最初の20サイクルで63℃から53℃へ段階的に低下させ、その後の20サイクルにおいては53℃に固定した。増幅された800bpのDNA断片を、TOPO TAクローニングキット（インビトロジェン社製）により、添付のプロトコールに従ってpCR2.1-TOPOプラスミドベクターに挿入し、プラスミドTOPO-pACC8-partialを得た。
　プラスミドTOPO-pACC8-partialにクローニングされた挿入DNA断片の塩基配列を解析し、得られた塩基配列をアミノ酸配列に翻訳し、そのアミノ酸配列をホモロジー検索した結果、トリコデルマ・ビリデ（Trichoderma viride）由来のエンドグルカナーゼCel12A（Q8NJY4）と60％の同一性を示したため、本DNA断片をエンドグルカナーゼ（Glycoside Hydrolase family 12）遺伝子の一部であると判断した。本DNA断片をプラスミドTOPO-pACC8-partialを鋳型として上記と同様の方法でPCRに増幅し、得られたPCR産物はECLダイレクトシステム（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用いて標識しプローブとした。
（5-3）プラークハイブリダイゼーションによるスクリーニング
　実施例3-3の記載の方法で、ゲノムDNAライブラリーをスクリーニングした結果、1個の陽性クローンを得た。得られた陽性クローンについてサザンブロット解析を行った結果、約5kbpのSalI断片が染色体DNAと共通のハイブリダイゼーションパターンを示した。このSalI断片をpUC118にクローン化し、プラスミドpUC-ACC8を得た後、プラスミドの塩基配列を解析した。
（5-4）ACC8遺伝子全長の取得
　pUC-ACC8より得た塩基配列を基に以下のプライマーを作製し、ゲノムDNAをテンプレートにPCRを実施し、ACC8遺伝子を増幅した。
pACC8-F：AAAGACCGCGTGTTAGGATC（配列番号：49）
pACC8-R：CGCGTAGGAAATAAGACACC（配列番号：50）
　増幅されたDNAをTOPO TAクローニングキット（インビトロジェン社製）によりpCR2.1-TOPOプラスミドベクターに挿入し、プラスミドpACC8を得た。得られたプラスミドpACC8により大腸菌（Escherichia coli）TOP10株（インビトロジェン社製）を形質転換することによりEscherichia coli TOP10株/pACC8を得た。
（5-5）cDNAの作製並びにACC8遺伝子のイントロン解析
　実施例1-4に記載の方法で、アクレモニウム・セルロリティカスACCP-5-1株のcDNAを作製した。ACC8遺伝子配列から開始コドン並びに終始コドンを含む下記のプライマーを作製し、cDNAをテンプレートにPCRを実施し、ACC8 cDNA遺伝子を増幅した。
ACC8-N：ATGAAGCTAACTTTTCTCCTGAAC（配列番号：51）
ACC8-C：CTAATTGACAGATGCAGACCAATG（配列番号：52）
　上記ACC8 cDNA遺伝子の塩基配列を解析し、pACC8遺伝子と比較することでイントロンの位置を決定した。
（5-6）ACC8のアミノ酸配列の推定
　上記の方法によりアクレモニウム・セルロリティカスより単離されたエンドグルカナーゼACC8遺伝子は配列番号９に記載の塩基配列の141～974番に示された834bpの塩基からなっていた。また、本ACC8遺伝子は配列番号９に記載の塩基配列の551～609番、及び831～894番に示される2つのイントロンが含まれていることが示された。オープンリーディングフレーム（ORF）から予測されるACC8のアミノ酸配列は配列番号１０に示される通りであった。なお、シグナル配列予測ソフトSignalP 3.0により本ACC8の-15～-1アミノ酸残基までがシグナル配列であると推定した。
《実施例６：ACC9遺伝子のクローニング》
（6-1）ゲノムDNA並びにmRNAの単離とcDNAの作製
　実施例1-1に記載の方法で、アクレモニウム・セルロリティカスACCP-5-1株のゲノムDNAを単離した。また、実施例1-4に記載の方法で、アクレモニウム・セルロリティカスACCP-5-1株のcDNAを作製した。
（6-2）ACC9遺伝子断片の取得
　Glycoside Hydrolase family 45に分類される既知のエンドグルカナーゼの配列を基に以下のプライマーを作製した。
ACC9-F：CCGGCTGCGGCAARTGYTAYMA（配列番号：53）
ACC9-R：AGTACCACTGGTTCTGCACCTTRCANGTNSC（配列番号：54）
　ACC9-F及びACC9-Rをプライマーとして使用し、ゲノムDNAを鋳型としてPCRを行った。PCRはLA taqポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いて実施した。PCRは94℃で30秒、アニールを30秒、72℃で1分間を40サイクル実施するプログラムで実施したが、アニール温度は最初の20サイクルで63℃から53℃へ段階的に低下させ、その後の20サイクルにおいては53℃に固定した。増幅された800bpのDNA断片を、TOPO TAクローニングキット（インビトロジェン社製）により、添付のプロトコールに従ってpCR2.1-TOPOプラスミドベクターに挿入し、プラスミドTOPO-pACC9-partialを得た。
　プラスミドTOPO-pACC9-partialにクローニングされた挿入DNA断片の塩基配列を解析し、得られた塩基配列をアミノ酸配列に翻訳し、そのアミノ酸配列をホモロジー検索した結果、トリコデルマ・ビリデ（Trichoderma viride）由来のエンドグルカナーゼEGＶ（Q7Z7X0）と79％の同一性を示したため、本DNA断片をエンドグルカナーゼ（Glycoside Hydrolase family 45）遺伝子の一部であると判断した。
（6-3）インバースPCR法によるACC9遺伝子全長の取得
　実施例1-3に記載の方法で、SalＩ又はXbaＩで消化した環状DNAをテンプレートに、ACC9遺伝子断片に含まれる下記の配列によりPCRを実施し、ACC9遺伝子の5’上流領域並びに3’下流領域を取得した。
ACC9-inv-F：CGAAGTGTTTGGTGACAACG（配列番号：55）
ACC9-inv-R：GTGGTAGCTGTATCCGTAGT（配列番号：56）
　上記5’上流領域並びに3’下流領域の塩基配列を解析し、ACC9遺伝子の全長塩基配列を決定した。
　インバースPCR法により得た塩基配列を基に以下のプライマーを作製し、ゲノムDNAをテンプレートにPCRを実施し、ACC9遺伝子を増幅した。
pACC9-F：TACATTCCGAAGGCACAGTT（配列番号：57）
pACC9-R：CTGAGCTGATTATCCTGACC（配列番号：58）
　増幅されたDNAをTOPO TAクローニングキット（インビトロジェン社製）によりpCR2.1-TOPOプラスミドベクターに挿入し、プラスミドpACC9を得た。得られたプラスミドpACC9により大腸菌（Escherichia coli）TOP10株（インビトロジェン社製）を形質転換することによりEscherichia coli TOP10株/pACC9を得た。
（6-4）ACC9遺伝子のイントロン解析
　ACC9遺伝子配列から開始コドン並びに終始コドンを含む下記のプライマーを作製し、cDNAをテンプレートにPCRを実施し、ACC9 cDNA遺伝子を増幅した。
ACC9-N：ATGAAGGCTTTCTATCTTTCTCTC（配列番号：59）
ACC9-C：TTAGGACGAGCTGACGCACTGGTA（配列番号：60）
　上記ACC9 cDNA遺伝子の塩基配列を解析し、pACC9遺伝子と比較することでイントロンの位置を決定した。
（6-5）ACC9のアミノ酸配列の推定
　上記の方法によりアクレモニウム・セルロリティカスより単離されたエンドグルカナーゼACC9遺伝子は配列番号１１に記載の塩基配列の114～1230番に示された1117bpの塩基からなっていた。また、本ACC9遺伝子は配列番号１１に記載の塩基配列の183～232番、及び299～357番に示される2つのイントロンが含まれていることが示された。オープンリーディングフレーム（ORF）から予測されるACC9のアミノ酸配列は配列番号１２に示される通りであった。なお、シグナル配列予測ソフトSignalP 3.0により本ACC9の-16～-1アミノ酸残基までがシグナル配列であると推定した。
《実施例７：ACC10遺伝子のクローニング》
（7-1）ゲノムDNA並びにmRNAの単離とcDNAの作製
　実施例1-1に記載の方法で、アクレモニウム・セルロリティカスACCP-5-1株のゲノムDNAを単離した。また、実施例1-4に記載の方法で、アクレモニウム・セルロリティカスACCP-5-1株のcDNAを作製した。
（7-2）ACC10遺伝子断片の取得
　Glycoside Hydrolase family 61に分類される既知のエンドグルカナーゼの配列並びにポリA塩基配列を基に以下のプライマーを作製した。
ACC10-F：GGTGTACGTGGGCACCAAYGGNMGNGG（配列番号：61）
ACC10-R：AATTCGCGGCCGCTAAAAAAAAA（配列番号：62）
　ACC10-F及びACC10-Rをプライマーとして使用し、cDNAを鋳型としてPCRを行った。PCRはLA taqポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いて実施した。PCRは94℃で30秒、アニールを30秒、72℃で1分間を40サイクル実施するプログラムで実施したが、アニール温度は最初の20サイクルで63℃から53℃へ段階的に低下させ、その後の20サイクルにおいては53℃に固定した。増幅された300bpのDNA断片を、TOPO TAクローニングキット（インビトロジェン社製）により、添付のプロトコールに従ってpCR2.1-TOPOプラスミドベクターに挿入し、プラスミドTOPO-pACC10-partialを得た。
　プラスミドTOPO-pACC10-partialにクローニングされた挿入DNA断片の塩基配列を解析し、得られた塩基配列をアミノ酸配列に翻訳し、そのアミノ酸配列をホモロジー検索した結果、アスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）由来のエンドグルカナーゼEGIV（Q0D0T6）と65％の同一性を示したため、本DNA断片をエンドグルカナーゼ（Glycoside Hydrolase family 61）遺伝子の一部であると判断した。
（7-3）インバースPCR法によるＡＣＣ１０遺伝子全長の取得
　実施例1-3に記載の方法で、HindIIIで消化した環状DNAをテンプレートに、ACC10遺伝子断片に含まれる下記の配列によりPCRを実施し、ACC5遺伝子の5’上流領域並びに3’下流領域を取得した。
ACC10-inv-F：TTCTGCTACTGCGGTTGCTA（配列番号：63）
ACC10-inv-R：GAATAACGTAGGTCGACAAG（配列番号：64）
　上記5’上流領域並びに3’下流領域の塩基配列を解析し、ACC10遺伝子の全長塩基配列を決定した。
　インバースPCR法により得た塩基配列を基に以下のプライマーを作製し、ゲノムDNAをテンプレートにPCRを実施し、ACC10遺伝子を増幅した。
pACC10-F：CGTTGACCGAAAGCCACTT（配列番号：65）
pACC10-R：TGGCCTAAAGCTAAATGATG（配列番号：66）
増幅されたDNAをTOPO TAクローニングキット（インビトロジェン社製）によりpCR2.1-TOPO　プラスミドベクターに挿入し、プラスミドpACC10を得た。得られたプラスミドpACC10により大腸菌（Escherichia coli）TOP10株（インビトロジェン社製）を形質転換することによりEscherichia coli TOP10株/pACC10を得た。
（7-4）ACC10遺伝子のイントロン解析
　ACC10遺伝子配列から開始コドン並びに終始コドンを含む下記のプライマーを作製し、cDNAをテンプレートにPCRを実施し、ACC10 cDNA遺伝子を増幅した。
ACC10-N：ATGCCTTCTACTAAAGTCGCTGCCC（配列番号：67）
ACC10-C：TTAAAGGACAGTAGTGGTGATGACG（配列番号：68）
　上記ACC10 cDNA遺伝子の塩基配列を解析し、pACC10遺伝子と比較することでイントロンの位置を決定した。
（7-5）ACC10のアミノ酸配列の推定
　上記の方法によりアクレモニウム・セルロリティカスより単離されたエンドグルカナーゼACC10遺伝子は配列番号１３に記載の塩基配列の124～1143番に示された1020bpの塩基からなっていた。また、本ACC10遺伝子は配列番号１３に記載の塩基配列の225～275番に示される1つのイントロンが含まれていることが示された。オープンリーディングフレーム（ORF）から予測されるACC10のアミノ酸配列は配列番号１４に示される通りであった。なお、シグナル配列予測ソフトSignalP 3.0により本ACC10の-21～-1アミノ酸残基までがシグナル配列であると推定した。
《実施例８：BGLC遺伝子のクローニング》
（8-1）ゲノムDNA並びにcDNAの作製
　実施例1-1に記載の方法で、アクレモニウム・セルロリティカスACCP-5-1株のゲノムDNAを単離した。また、実施例1-4に記載の方法で、アクレモニウム・セルロリティカスACCP-5-1株のcDNAを作製した。
（8-2）BGLC遺伝子断片の取得
　Glycoside Hydrolase family 1に分類される既知のβ－グルコシダーゼの配列を基に以下のプライマーを作製した。
BGLC-F：CCTGGGTGACCCTGTACCAYTGGGAYYT（配列番号：69）
BGLC-R：TGGGCAGGAGCAGCCRWWYTCNGT（配列番号：70）
　BGLC-F及びBGLC -Rをプライマーとして使用し、ゲノムDNAを鋳型としてPCRを行った。PCRはLA taqポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いて実施した。PCRは94℃で30秒、アニールを30秒、72℃で1分間を40サイクル実施するプログラムで実施したが、アニール温度は最初の20サイクルで63℃から53℃へ段階的に低下させ、その後の20サイクルにおいては53℃に固定した。増幅された1.2kbpのDNA断片を、TOPO TAクローニングキット（インビトロジェン社製）により、添付のプロトコールに従ってpCR2.1-TOPOプラスミドベクターに挿入し、プラスミドTOPO-pBGLC-partialを得た。
　プラスミドTOPO-pBGLC-partialにクローニングされた挿入DNA断片の塩基配列を解析し、得られた塩基配列をアミノ酸配列に翻訳し、そのアミノ酸配列をホモロジー検索した結果、アスペルギルス・フミガタス（Aspergillus fumigatus）由来のβ－グルコシダーゼ1（Q4WRG4）と69％の同一性を示したため、本DNA断片をβ－グルコシダーゼ（Glycoside Hydrolase family 1）遺伝子の一部であると判断した。
（8-3）インバースPCR法によるBGLC遺伝子全長の取得
　実施例1-3に記載の方法で、XbaＩで消化した環状DNAをテンプレートに、BGLC遺伝子断片に含まれる下記の配列によりPCRを実施し、BGLC遺伝子の5’上流領域並びに3’下流領域を取得した。
BGLC-inv-F：GGAGTTCTTCTACATTTCCC（配列番号：71）
BGLC-inv-R：AACAAGGACGGCGTGTCAGT（配列番号：72）
　上記5’上流領域並びに3’下流領域の塩基配列を解析し、BGLC遺伝子の全長塩基配列を決定した。
　インバースPCR法により得た塩基配列を基に以下のプライマーを作製し、ゲノムDNAをテンプレートにPCRを実施し、BGLC遺伝子を増幅した。
pBGLC-F：CTCCGTCAAGTGCGAAGTAT（配列番号：73）
pBGLC-R：GGCTCGCTAATACTAACTGC（配列番号：74）
　増幅されたDNAをTOPO TAクローニングキット（インビトロジェン社製）によりpCR2.1-TOPOプラスミドベクターに挿入し、プラスミドpBGLCを得た。得られたプラスミドpBGLCにより大腸菌（Escherichia coli）TOP10株（インビトロジェン社製）を形質転換することによりEscherichia coli TOP10株/pBGLCを得た。
（8-4）BGLC遺伝子のイントロン解析
　BGLC遺伝子配列から開始コドン並びに終始コドンを含む下記のプライマーを作製し、cDNAをテンプレートにPCRを実施し、BGLC cDNA遺伝子を増幅した。
BGLC-N：ATGGGCTCTACATCTCCTGCCCAA（配列番号：75）
BGLC-C：CTAGTTCCTCGGCTCTATGTATTT（配列番号：76）
　上記BGLC cDNA遺伝子の塩基配列を解析し、pBGLC遺伝子と比較することでイントロンの位置を決定した。
（8-5）BGLCのアミノ酸配列の推定
　上記の方法によりアクレモニウム・セルロリティカスより単離されたβ－グルコシダーゼBGLC遺伝子は配列番号１５に記載の塩基配列の238～1887番に示された1650bpの塩基からなっていた。また、本BGLC遺伝子は配列番号１５に記載の塩基配列の784～850番、1138～1205番、及び1703～1756番に示される3つのイントロンが含まれていることが示された。オープンリーディングフレーム（ORF）から予測されるBGLCのアミノ酸配列は配列番号１６に示される通りであった。なお、シグナル配列予測ソフトSignalP 3.0により本BGLCの-28～-1アミノ酸残基までがシグナル配列であると推定した。
《実施例９：BGLD遺伝子のクローニング》
（9-1）ゲノムDNA並びにcDNAの作製
　実施例1-1に記載の方法で、アクレモニウム・セルロリティカスACCP-5-1株のゲノムDNAを単離した。また、実施例1-4に記載の方法で、アクレモニウム・セルロリティカスACCP-5-1株のcDNAを作製した。
（9-2）BGLD遺伝子断片の取得
　Glycoside Hydrolase family 1に分類される既知のβ－グルコシダーゼの配列を基に以下のプライマーを作製した。
BGLD-F：CACCGCCGCCTACCARRTNGARGG（配列番号：77）
BGLD-R：TGGCGGTGTAGTGGTTCATGSCRWARWARTC（配列番号：78）
　BGLD-F及びBGLD-Rをプライマーとして使用し、ゲノムDNAを鋳型としてPCRを行った。PCRはLA taqポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いて実施した。PCRは94℃で30秒、アニールを30秒、72℃で1分間を40サイクル実施するプログラムで実施したが、アニール温度は最初の20サイクルで63℃から53℃へ段階的に低下させ、その後の20サイクルにおいては53℃に固定した。増幅された1kbpのDNA断片を、TOPO TAクローニングキット（インビトロジェン社製）により、添付のプロトコールに従ってpCR2.1-TOPOプラスミドベクターに挿入し、プラスミドTOPO-pBGLD-partialを得た。
　プラスミドTOPO-pBGLD-partialにクローニングされた挿入DNA断片の塩基配列を解析し、得られた塩基配列をアミノ酸配列に翻訳し、そのアミノ酸配列をホモロジー検索した結果、タラロマイセス・エメルソニ（Talaromyces emersonii）由来のβ－グルコシダーゼ1（Q8X214）と76％の同一性を示したため、本DNA断片をβ－グルコシダーゼ（Glycoside Hydrolase family 1）遺伝子の一部であると判断した。
（9-3）インバースPCR法によるBGLD遺伝子全長の取得
　実施例1-3に記載の方法で、XhoＩで消化した環状DNAをテンプレートに、BGLD遺伝子断片に含まれる下記の配列によりPCRを実施し、BGLD遺伝子の5’上流領域並びに3’下流領域を取得した。
BGLD-inv-F：CGGTTTCAATATCGGTAAGC（配列番号：79）
BGLD-inv-R：GTGTCCAAAGCTCTGGAATG（配列番号：80）
　上記5’上流領域並びに3’下流領域の塩基配列を解析し、BGLD遺伝子の全長塩基配列を決定した。
　インバースPCR法により得た塩基配列を基に以下のプライマーを作製し、ゲノムDNAをテンプレートにPCRを実施し、BGLD遺伝子を増幅した。
pBGLD-F：TTCTCTCACTTTCCCTTTCC（配列番号：81）
pBGLD-R：AATTGATGCTCCTGATGCGG（配列番号：82）
　増幅されたDNAをTOPO TAクローニングキット（インビトロジェン社製）によりpCR2.1-TOPOプラスミドベクターに挿入し、プラスミドpBGLDを得た。得られたプラスミドpBGLDにより大腸菌（Escherichia coli）TOP10株（インビトロジェン社製）を形質転換することによりEscherichia coli TOP10株/pBGLDを得た。
（9-4）BGLD遺伝子のイントロン解析
　BGLD遺伝子配列から開始コドン並びに終始コドンを含む下記のプライマーを作製し、cDNAをテンプレートにPCRを実施し、BGLD cDNA遺伝子を増幅した。
BGLD-N：ATGGGTAGCGTAACTAGTACCAAC（配列番号：83）
BGLD-C：CTACTCTTTCGAGATGTATTTGTT（配列番号：84）
　上記BGLD cDNA遺伝子の塩基配列を解析し、pBGLD遺伝子と比較することでイントロンの位置を決定した。
（9-5）BGLDのアミノ酸配列の推定
　上記の方法によりアクレモニウム・セルロリティカスより単離されたβ－グルコシダーゼBGLD遺伝子は配列番号１７に記載の塩基配列の66～1765番に示された1700bpの塩基からなっていた。また、本BGLD遺伝子は配列番号１７に記載の塩基配列の149～211番、404～460番、934～988番、及び1575～1626番に示される4つのイントロンが含まれていることが示された。オープンリーディングフレーム（ORF）から予測されるBGLDのアミノ酸配列は配列番号１８に示される通りであった。なお、シグナル配列予測ソフトSignalP 3.0により本BGLDの-33～-1アミノ酸残基までがシグナル配列であると推定した。
　本発明のタンパク質は、セルラーゼ調製物として使用することができ、セルロース系基質分解の用途に適用することができる。
　以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
　配列表の配列番号１９～８４の配列で表される各塩基配列は、人工的に合成したプライマー配列である。配列番号２７（18位及び27位）、配列番号４１（18位）、配列番号４２（14位）、配列番号５４（26位及び29位）、配列番号６１（22位及び25位）、配列番号７０（22位）、配列番号７７（19位）における記号”n”は任意塩基を意味する。

Claims (81)

  1. 　以下の（ｉ）、（ii）、及び（iii）から選択されるタンパク質：
    （ｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列の１～３０６番の配列を含むタンパク質；
    （ii）配列番号２に記載のアミノ酸配列の１～３０６番の配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含むエンドグルカナーゼ；
    （iii）配列番号２に記載のアミノ酸配列の１～３０６番の配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むエンドグルカナーゼ。
  2. 　以下の（ｉ）、（ii）、及び（iii）から選択されるタンパク質：
    （ｉ）配列番号４に記載のアミノ酸配列の１～４７５番の配列を含むタンパク質；
    （ii）配列番号４に記載のアミノ酸配列の１～４７５番の配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含むエンドグルカナーゼ；
    （iii）配列番号４に記載のアミノ酸配列の１～４７５番の配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むエンドグルカナーゼ。
  3. 　以下の（ｉ）、（ii）、及び（iii）から選択されるタンパク質：
    （ｉ）配列番号６に記載のアミノ酸配列の１～３９１番の配列を含むタンパク質；
    （ii）配列番号６に記載のアミノ酸配列の１～３９１番の配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含むエンドグルカナーゼ；
    （iii）配列番号６に記載のアミノ酸配列の１～３９１番の配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むエンドグルカナーゼ。
  4. 　以下の（ｉ）、（ii）、及び（iii）から選択されるタンパク質：
    （ｉ）配列番号８に記載のアミノ酸配列の１～３７６番の配列を含むタンパク質；
    （ii）配列番号８に記載のアミノ酸配列の１～３７６番の配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含むエンドグルカナーゼ；
    （iii）配列番号８に記載のアミノ酸配列の１～３７６番の配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むエンドグルカナーゼ。
  5. 　以下の（ｉ）、（ii）、及び（iii）から選択されるタンパク質：
    （ｉ）配列番号１０に記載のアミノ酸配列の１～２２１番の配列を含むタンパク質；
    （ii）配列番号１０に記載のアミノ酸配列の１～２２１番の配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含むエンドグルカナーゼ；
    （iii）配列番号１０に記載のアミノ酸配列の１～２２１番の配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むエンドグルカナーゼ。
  6. 　以下の（ｉ）、（ii）、及び（iii）から選択されるタンパク質：
    （ｉ）配列番号１２に記載のアミノ酸配列の１～３１９番の配列を含むタンパク質；
    （ii）配列番号１２に記載のアミノ酸配列の１～３１９番の配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含むエンドグルカナーゼ；
    （iii）配列番号１２に記載のアミノ酸配列の１～３１９番の配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むエンドグルカナーゼ。
  7. 　以下の（ｉ）、（ii）、及び（iii）から選択されるタンパク質：
    （ｉ）配列番号１４に記載のアミノ酸配列の１～３０１番の配列を含むタンパク質；
    （ii）配列番号１４に記載のアミノ酸配列の１～３０１番の配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含むエンドグルカナーゼ；
    （iii）配列番号１４に記載のアミノ酸配列の１～３０１番の配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むエンドグルカナーゼ。
  8. 　以下の（ｉ）、（ii）、及び（iii）から選択されるタンパク質：
    （ｉ）配列番号１６に記載のアミノ酸配列の１～４５８番の配列を含むタンパク質；
    （ii）配列番号１６に記載のアミノ酸配列の１～４５８番の配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含むβ－グルコシダーゼ；
    （iii）配列番号１６に記載のアミノ酸配列の１～４５８番の配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むβ－グルコシダーゼ。
  9. 　以下の（ｉ）、（ii）、及び（iii）から選択されるタンパク質：
    （ｉ）配列番号１８に記載のアミノ酸配列の１～４５７番の配列を含むタンパク質；
    （ii）配列番号１８に記載のアミノ酸配列の１～４５７番の配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含むβ－グルコシダーゼ；
    （iii）配列番号１８に記載のアミノ酸配列の１～４５７番の配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むβ－グルコシダーゼ。
  10. 　糸状菌由来である、請求項１～９のいずれか一項に記載のタンパク質。
  11. 　糸状菌がアクレモニウム・セルロリティカス（Acremonium cellulolyticus）に属する糸状菌である、請求項１０に記載のタンパク質。
  12. 　請求項１～９のいずれか一項に記載のタンパク質をコードする塩基配列を含む、ポリヌクレオチド。
  13. 　配列番号１に記載の塩基配列、又はその改変配列を含む、ＤＮＡ。
  14. 　以下の（ｉ）、（ii）、及び（iii）から選択されるＤＮＡ：
    （ｉ）請求項１に記載のタンパク質をコードするＤＮＡ；
    （ii）配列番号１に記載の塩基配列の１３６～１４３７番の配列を含むＤＮＡ；
    （iii）配列番号１に記載の塩基配列の１３６～１４３７番の配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
  15. 　請求項１４に記載のＤＮＡから、イントロン配列を除去したＤＮＡ。
  16. 　イントロン配列が、配列番号１に記載の塩基配列の２３３～２９１番、３５１～４２５番、５７９～６３１番、６９７～７５４番、又は、８５３～９０７番の配列から選択される１以上の配列を含む配列である、請求項１５に記載のＤＮＡ。
  17. 　請求項１３～１６のいずれか一項に記載のＤＮＡから、シグナル配列をコードする塩基配列を除去したＤＮＡ。
  18. 　シグナル配列をコードする塩基配列が、配列番号１に記載の塩基配列の１３６～２１６番の配列である、請求項１７に記載のＤＮＡ。
  19. 　配列番号３に記載の塩基配列、又はその改変配列を含む、ＤＮＡ。
  20. 　以下の（ｉ）、（ii）、及び（iii）から選択されるＤＮＡ：
    （ｉ）請求項２に記載のタンパク質をコードするＤＮＡ；
    （ii）配列番号３に記載の塩基配列の１２８～１６１５番の配列を含むＤＮＡ；
    （iii）配列番号３に記載の塩基配列の１２８～１６１５番の配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
  21. 　請求項１９～２０のいずれか一項に記載のＤＮＡから、シグナル配列をコードする塩基配列を除去したＤＮＡ。
  22. 　シグナル配列をコードする塩基配列が、配列番号３に記載の塩基配列の１２８～１８７番の配列である、請求項２１に記載のＤＮＡ。
  23. 　配列番号５に記載の塩基配列、又はその改変配列を含む、ＤＮＡ。
  24. 　以下の（ｉ）、（ii）、及び（iii）から選択されるＤＮＡ：
    （ｉ）請求項３に記載のタンパク質をコードするＤＮＡ；
    （ii）配列番号５に記載の塩基配列の１６９～１５９８番の配列を含むＤＮＡ；
    （iii）配列番号５に記載の塩基配列の１６９～１５９８番の配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
  25. 　請求項２４に記載のＤＮＡから、イントロン配列を除去したＤＮＡ。
  26. 　イントロン配列が、配列番号５に記載の塩基配列の２５４～３０９番、４０６～４６１番、又は、１３７２～１４５０番の配列から選択される１以上の配列を含む配列である、請求項２５に記載のＤＮＡ。
  27. 　請求項２３～２６のいずれか一項に記載のＤＮＡから、シグナル配列をコードする塩基配列を除去したＤＮＡ。
  28. 　シグナル配列をコードする塩基配列が、配列番号５に記載の塩基配列の１６９～２３１番の配列である、請求項２７に記載のＤＮＡ。
  29. 　配列番号７に記載の塩基配列、又はその改変配列を含む、ＤＮＡ。
  30. 　以下の（ｉ）、（ii）、及び（iii）から選択されるＤＮＡ：
    （ｉ）請求項４に記載のタンパク質をコードするＤＮＡ；
    （ii）配列番号７に記載の塩基配列の７０～１３７６番の配列を含むＤＮＡ；
    （iii）配列番号７に記載の塩基配列の７０～１３７６番の配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
  31. 　請求項３０に記載のＤＮＡから、イントロン配列を除去したＤＮＡ。
  32. 　イントロン配列が、配列番号７に記載の塩基配列の４５１～５００番、又は、７６５～８３０番の配列から選択される１以上の配列を含む配列である、請求項３１に記載のＤＮＡ。
  33. 　請求項２９～３２のいずれか一項に記載のＤＮＡから、シグナル配列をコードする塩基配列を除去したＤＮＡ。
  34. 　シグナル配列をコードする塩基配列が、配列番号７に記載の塩基配列の７０～１２９番の配列である、請求項３３に記載のＤＮＡ。
  35. 　配列番号９に記載の塩基配列、又はその改変配列を含む、ＤＮＡ。
  36. 　以下の（ｉ）、（ii）、及び（iii）から選択されるＤＮＡ：
    （ｉ）請求項５に記載のタンパク質をコードするＤＮＡ；
    （ii）配列番号９に記載の塩基配列の１４１～９７４番の配列を含むＤＮＡ；
    （iii）配列番号９に記載の塩基配列の１４１～９７４番の配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
  37. 　請求項３６に記載のＤＮＡから、イントロン配列を除去したＤＮＡ。
  38. 　イントロン配列が、配列番号９に記載の塩基配列の５５１～６０９番、又は、８３１～８９４番の配列から選択される１以上の配列を含む配列である、請求項３７に記載のＤＮＡ。
  39. 　請求項３５～３８のいずれか一項に記載のＤＮＡから、シグナル配列をコードする塩基配列を除去したＤＮＡ。
  40. 　シグナル配列をコードする塩基配列が、配列番号９に記載の塩基配列の１４１～１８５番の配列である請求項３９に記載のＤＮＡ。
  41. 　配列番号１１に記載の塩基配列、又はその改変配列を含む、ＤＮＡ。
  42. 　以下の（ｉ）、（ii）、及び（iii）から選択されるＤＮＡ：
    （ｉ）請求項６に記載のタンパク質をコードするＤＮＡ；
    （ii）配列番号１１に記載の塩基配列の１１４～１２３０番の配列を含むＤＮＡ；
    （iii）配列番号１１に記載の塩基配列の１１４～１２３０番の配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
  43. 　請求項４２に記載のＤＮＡから、イントロン配列を除去したＤＮＡ。
  44. 　イントロン配列が、配列番号１１に記載の塩基配列の１８３～２３２番、又は、２９９～３５７番の配列から選択される１以上の配列を含む配列である、請求項４３に記載のＤＮＡ。
  45. 　請求項４１～４４のいずれか一項に記載のＤＮＡから、シグナル配列をコードする塩基配列を除去したＤＮＡ。
  46. 　シグナル配列をコードする塩基配列が、配列番号１１に記載の塩基配列の１１４～１６１番の配列である、請求項４５に記載のＤＮＡ。
  47. 　配列番号１３に記載の塩基配列、又はその改変配列を含む、ＤＮＡ。
  48. 　以下の（ｉ）、（ii）、及び（iii）から選択されるＤＮＡ：
    （ｉ）請求項７に記載のタンパク質をコードするＤＮＡ；
    （ii）配列番号１３に記載の塩基配列の１２４～１１４３番の配列を含むＤＮＡ；
    （iii）配列番号１３に記載の塩基配列の１２４～１１４３番の配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
  49. 　請求項４８に記載のＤＮＡから、イントロン配列を除去したＤＮＡ。
  50. 　イントロン配列が、配列番号１３に記載の塩基配列の２２５～２７５番の配列である、請求項４９に記載のＤＮＡ。
  51. 　請求項４７～５０のいずれか一項に記載のＤＮＡから、シグナル配列をコードする塩基配列を除去したＤＮＡ。
  52. 　シグナル配列をコードする塩基配列が、配列番号１３に記載の塩基配列の１２４～１８６番の配列である、請求項５１に記載のＤＮＡ。
  53. 　配列番号１５に記載の塩基配列、又はその改変配列を含む、ＤＮＡ。
  54. 　以下の（ｉ）、（ii）、及び（iii）から選択されるＤＮＡ：
    （ｉ）請求項８に記載のタンパク質をコードするＤＮＡ；
    （ii）配列番号１５に記載の塩基配列の２３８～１８８７番の配列を含むＤＮＡ；
    （iii）配列番号１５に記載の塩基配列の２３８～１８８７番の配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつβ－グルコシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
  55. 　請求項５４に記載のＤＮＡから、イントロン配列を除去したＤＮＡ。
  56. 　イントロン配列が、配列番号１５に記載の塩基配列の７８４～８５０番、１１３８～１２０５番、又は、１７０３～１７５６番の配列から選択される１以上の配列を含む配列である、請求項５５に記載のＤＮＡ。
  57. 　請求項５３～５６のいずれか一項に記載のＤＮＡから、シグナル配列をコードする塩基配列を除去したＤＮＡ。
  58. 　シグナル配列をコードする塩基配列が、配列番号１５に記載の塩基配列の２３８～３２１番の配列である、請求項５７に記載のＤＮＡ。
  59. 　配列番号１７に記載の塩基配列、又はその改変配列を含む、ＤＮＡ。
  60. 　以下の（ｉ）、（ii）、及び（iii）から選択されるＤＮＡ：
    （ｉ）請求項９に記載のタンパク質をコードするＤＮＡ；
    （ii）配列番号１７に記載の塩基配列の６６～１７６５番の配列を含むＤＮＡ；
    （iii）配列番号１７に記載の塩基配列の６６～１７６５番の配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつβ－グルコシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
  61. 　請求項６０に記載のＤＮＡから、イントロン配列を除去したＤＮＡ。
  62. 　イントロン配列が、配列番号１７に記載の塩基配列の１４９～２１１番、４０４～４６０番、９３４～９８８番、又は、１５７５～１６２６番の配列から選択される１以上の配列を含む配列である、請求項６１に記載のＤＮＡ。
  63. 　請求項５９～６２のいずれか一項に記載のＤＮＡから、シグナル配列をコードする塩基配列を除去したＤＮＡ。
  64. 　シグナル配列をコードする塩基配列が、配列番号１７に記載の塩基配列の６６～２２７番の配列である、請求項６３に記載のＤＮＡ。
  65. 　請求項１２～６４のいずれか一項に記載のＤＮＡを含む、発現ベクター。
  66. 　請求項６５に記載の発現ベクターで形質転換された、宿主細胞。
  67. 　宿主細胞が酵母又は糸状菌である、請求項６６に記載の宿主細胞。
  68. 　酵母が、サッカロミセス（Saccharomyces）属、ハンゼヌラ（Hansenula）属又はピキア（Pichia）属に属するものである、請求項６７に記載の宿主細胞。
  69. 　酵母が、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）である、請求項６８に記載の宿主細胞。
  70. 　糸状菌が、フミコーラ（Humicola）属、アスペルギルス（Aspergillus）属、トリコデルマ（Trichoderma）属、フザリウム（Fusarium）又はアクレモニウム（Acremonium）属に属するものである、請求項６７に記載の宿主細胞。
  71. 　糸状菌が、アクレモニウム・セルロリティカス（Acremonium cellulolyticus）、フミコーラ・インソレンス（Humicola insolens）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）もしくはアスペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）、トリコデルマ・ビリデ（Trichoderma viride）、又はフザリウム・オキシスポーラム（Fusarium oxysporum）である、請求項７０に記載の宿主細胞。
  72. 　請求項１２～６４のいずれか一項に記載のＤＮＡに対応する遺伝子を、相同組み換えにより欠損させたアクレモニウム（Acremonium）属の糸状菌。
  73. 　糸状菌がアクレモニウム・セルロリティカス（Acremonium cellulolyticus）である、請求項７２に記載の糸状菌。
  74. 　請求項６６～７３のいずれか一項に記載の宿主細胞を培養し、その宿主及び／又はその培養物から請求項１～９のいずれか一項に記載のタンパク質を採取する工程を含む、前記タンパク質の製造法。
  75. 　請求項７４に記載の方法で生産された、タンパク質。
  76. 　請求項１～９及び７５のいずれか一項に記載のタンパク質を含む、セルラーゼ調製物。
  77. 　バイオマスを糖化する処理方法であって、セルロース含有バイオマスを、請求項１～９及び７５のいずれか一項に記載のタンパク質、又は請求項７６に記載のセルラーゼ調製物と接触させる工程を含む、方法。
  78. 　セルロース含有繊維の処理方法であって、セルロース含有繊維を、請求項１～９及び７５のいずれか一項に記載のタンパク質、又は請求項７６に記載のセルラーゼ調製物と接触させる工程を含む、方法。
  79. 　古紙を脱インキ薬品により処理して脱インキを行う工程において、請求項１～９及び７５のいずれか一項に記載のタンパク質、又は請求項７６に記載のセルラーゼ調製物を用いることを特徴とする古紙の脱インキ方法。
  80. 　紙パルプのろ水性の改善方法であって、紙パルプを、請求項１～９及び７５のいずれか一項に記載のタンパク質、又は請求項７６に記載のセルラーゼ調製物で処理する工程を含む、方法。
  81. 　動物飼料の消化能を改善する方法であって、動物飼料を、請求項１～９及び７５のいずれか一項に記載のタンパク質、又は請求項７６に記載のセルラーゼ調製物で処理する工程を含む、方法。
PCT/JP2010/055897 2010-03-31 2010-03-31 新規セルラーゼ遺伝子 WO2011121768A1 (ja)

Priority Applications (9)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201080067181.XA CN102939376B (zh) 2010-03-31 2010-03-31 新纤维素酶基因
DK10848946.9T DK2554667T3 (en) 2010-03-31 2010-03-31 Hitherto unknown cellular properties
PCT/JP2010/055897 WO2011121768A1 (ja) 2010-03-31 2010-03-31 新規セルラーゼ遺伝子
ES10848946.9T ES2608402T3 (es) 2010-03-31 2010-03-31 Nuevo gen de celulasa
EP10848946.9A EP2554667B1 (en) 2010-03-31 2010-03-31 Novel cellulase gene
CA2794471A CA2794471A1 (en) 2010-03-31 2010-03-31 Novel cellulase gene
BR112012024959A BR112012024959A2 (pt) 2010-03-31 2010-03-31 novo gene de celulose
US13/638,538 US10053679B2 (en) 2010-03-31 2010-03-31 Cellulase gene
US16/038,459 US10774318B2 (en) 2010-03-31 2018-07-18 Cellulase gene

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/JP2010/055897 WO2011121768A1 (ja) 2010-03-31 2010-03-31 新規セルラーゼ遺伝子

Related Child Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US13/638,538 A-371-Of-International US10053679B2 (en) 2010-03-31 2010-03-31 Cellulase gene
US16/038,459 Division US10774318B2 (en) 2010-03-31 2018-07-18 Cellulase gene

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2011121768A1 true WO2011121768A1 (ja) 2011-10-06

Family

ID=44711554

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2010/055897 WO2011121768A1 (ja) 2010-03-31 2010-03-31 新規セルラーゼ遺伝子

Country Status (8)

Country Link
US (2) US10053679B2 (ja)
EP (1) EP2554667B1 (ja)
CN (1) CN102939376B (ja)
BR (1) BR112012024959A2 (ja)
CA (1) CA2794471A1 (ja)
DK (1) DK2554667T3 (ja)
ES (1) ES2608402T3 (ja)
WO (1) WO2011121768A1 (ja)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102363772A (zh) * 2011-08-23 2012-02-29 北京挑战生物技术有限公司 一种酸性纤维素酶egi及其基因和应用
JP2015033378A (ja) * 2013-07-09 2015-02-19 本田技研工業株式会社 β−グルコシダーゼ
JP2015033379A (ja) * 2013-07-09 2015-02-19 本田技研工業株式会社 β−グルコシダーゼ
JP2015033377A (ja) * 2013-07-09 2015-02-19 本田技研工業株式会社 β−グルコシダーゼ
JP2015033380A (ja) * 2013-07-09 2015-02-19 本田技研工業株式会社 β−グルコシダーゼ
WO2023225459A2 (en) 2022-05-14 2023-11-23 Novozymes A/S Compositions and methods for preventing, treating, supressing and/or eliminating phytopathogenic infestations and infections

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8778639B1 (en) * 2013-02-12 2014-07-15 Novozymes Inc. Polypeptides having endoglucanase activity and polynucleotides encoding same
US8771993B1 (en) * 2013-02-12 2014-07-08 Novozymes A/S Polypeptides having endoglucanse activity and polynucleotides encoding same
WO2014202623A2 (en) * 2013-06-19 2014-12-24 Dsm Ip Assets B.V. Rasamsonia gene and use thereof
CN105420218B (zh) * 2015-12-23 2019-02-05 天津科技大学 一种低温的木糖苷/阿拉伯呋喃糖苷双功能酶ax543及其基因和应用
WO2019059404A1 (ja) * 2017-09-25 2019-03-28 味の素株式会社 タンパク質の製造法および二糖の製造法

Citations (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH07236431A (ja) 1994-03-03 1995-09-12 Meiji Seika Kaisha Ltd サイレージの調製方法
JPH07264994A (ja) 1994-03-31 1995-10-17 Meiji Seika Kaisha Ltd セルラーゼを添加した家畜の飼料
JP2531595B2 (ja) 1990-09-05 1996-09-04 工業技術院長 サイレ―ジ用酵素剤
WO1997033982A1 (fr) 1996-03-14 1997-09-18 JAPAN, represented by DIRECTOR GENERAL OF AGENCY OF INDUSTRIAL SCIENCE AND TECHNOLOGY Proteine ayant une activite de cellulase et son procede de production
JPH1066569A (ja) 1996-08-28 1998-03-10 Agency Of Ind Science & Technol エンドグルカナーゼ
WO1999011767A1 (fr) 1997-08-28 1999-03-11 Meiji Seika Kaisha Ltd. Endoglucanase acc4
JP2000069978A (ja) 1998-08-27 2000-03-07 Agency Of Ind Science & Technol エンドグルカナーゼａｃｃ５
WO2000024879A1 (fr) * 1998-10-23 2000-05-04 Meiji Seika Kaisha, Ltd. Preparations a base d'endoglucanases et de cellulase
JP2000298262A (ja) 1999-04-13 2000-10-24 Hitachi Ltd 液晶表示素子
JP2001017180A (ja) 1999-07-06 2001-01-23 Meiji Seika Kaisha Ltd 新規なプロモーター、及びそれを用いたタンパク質の発現方法
WO2001090375A1 (en) * 2000-05-22 2001-11-29 Meiji Seika Kaisha, Ltd. Endoglucanase nce5 and cellulase preparations containing the same
JP2002101876A (ja) 2000-09-29 2002-04-09 National Institute Of Advanced Industrial & Technology 新規なβ−グルコシダーゼ
WO2007044043A2 (en) * 2004-12-21 2007-04-19 Monsanto Technology, Llc Transgenic plants with enhanced agronomic traits
WO2008111613A1 (ja) * 2007-03-12 2008-09-18 Meiji Seika Kaisha, Ltd. エンドグルカナーゼｐｐｃｅおよびそれを含んでなるセルラーゼ調製物
WO2008140749A2 (en) * 2007-05-10 2008-11-20 Novozymes, Inc. Compositions and methods for enhancing the degradation or conversion of cellulose-containing material

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002026979A1 (fr) 2000-09-29 2002-04-04 Meiji Seika Kaisha, Ltd. NOUVELLE ENZYME PRESENTANT UNE ACTIVITE β-GLUCOSIDASE ET SON UTILISATION
JP4025848B2 (ja) 2001-11-02 2007-12-26 独立行政法人産業技術総合研究所 セルロース原料の分解方法
JP3874409B2 (ja) 2001-11-30 2007-01-31 財団法人野田産業科学研究所 新規エンドグルカナーゼおよびエンドグルカナーゼ遺伝子
JP2004313022A (ja) 2003-04-11 2004-11-11 Meiji Seika Kaisha Ltd エンドグルカナーゼｍｔｅ１およびそれを含んでなるセルラーゼ調製物
EP1733033B1 (en) * 2004-02-06 2012-06-20 Novozymes Inc. Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
CN101442902B (zh) 2004-12-21 2013-09-18 孟山都技术有限公司 具有增强的农艺性状的转基因植物的制备方法
US9969993B2 (en) 2007-05-31 2018-05-15 Novozymes, Inc. Filamentous fungal host cells and methods of recombinantly producing proteins
EP2373788A1 (en) 2008-12-04 2011-10-12 Novozymes Inc. Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
CN102597243B (zh) * 2009-07-07 2015-05-20 诺维信股份有限公司 具有纤维素分解增强活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸
CN102666847B (zh) 2009-10-29 2015-12-09 诺维信股份有限公司 具有纤维二糖水解酶活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸
EP3222716B1 (en) 2009-11-06 2020-08-19 Novozymes, Inc. Composition for saccharification of cellulosic material
ES2585284T3 (es) * 2010-03-30 2016-10-04 Novozymes A/S Métodos para el aumento de productos derivados de procesos de fermentación

Patent Citations (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2531595B2 (ja) 1990-09-05 1996-09-04 工業技術院長 サイレ―ジ用酵素剤
JPH07236431A (ja) 1994-03-03 1995-09-12 Meiji Seika Kaisha Ltd サイレージの調製方法
JPH07264994A (ja) 1994-03-31 1995-10-17 Meiji Seika Kaisha Ltd セルラーゼを添加した家畜の飼料
WO1997033982A1 (fr) 1996-03-14 1997-09-18 JAPAN, represented by DIRECTOR GENERAL OF AGENCY OF INDUSTRIAL SCIENCE AND TECHNOLOGY Proteine ayant une activite de cellulase et son procede de production
JPH1066569A (ja) 1996-08-28 1998-03-10 Agency Of Ind Science & Technol エンドグルカナーゼ
WO1999011767A1 (fr) 1997-08-28 1999-03-11 Meiji Seika Kaisha Ltd. Endoglucanase acc4
JP2000069978A (ja) 1998-08-27 2000-03-07 Agency Of Ind Science & Technol エンドグルカナーゼａｃｃ５
WO2000024879A1 (fr) * 1998-10-23 2000-05-04 Meiji Seika Kaisha, Ltd. Preparations a base d'endoglucanases et de cellulase
JP2000298262A (ja) 1999-04-13 2000-10-24 Hitachi Ltd 液晶表示素子
JP2001017180A (ja) 1999-07-06 2001-01-23 Meiji Seika Kaisha Ltd 新規なプロモーター、及びそれを用いたタンパク質の発現方法
WO2001090375A1 (en) * 2000-05-22 2001-11-29 Meiji Seika Kaisha, Ltd. Endoglucanase nce5 and cellulase preparations containing the same
JP2002101876A (ja) 2000-09-29 2002-04-09 National Institute Of Advanced Industrial & Technology 新規なβ−グルコシダーゼ
WO2007044043A2 (en) * 2004-12-21 2007-04-19 Monsanto Technology, Llc Transgenic plants with enhanced agronomic traits
WO2008111613A1 (ja) * 2007-03-12 2008-09-18 Meiji Seika Kaisha, Ltd. エンドグルカナーゼｐｐｃｅおよびそれを含んでなるセルラーゼ調製物
WO2008140749A2 (en) * 2007-05-10 2008-11-20 Novozymes, Inc. Compositions and methods for enhancing the degradation or conversion of cellulose-containing material

Non-Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AGRICULTURAL AND BIOLOGICAL CHEMISTRY, JAPAN, vol. 51, 1987, pages 65
DATABASE NCBI [online] 30 May 2002 (2002-05-30), "Talaromyces emersonii endo beta 1,4 glucanase (eg1) gene, partial cds.", XP008158969, Database accession no. AF440013 *
J. SAMBROOK; E. F. FRITSCH; T. MANIATLS: "Molecular Cloning", 1989, COLD SPRING HARBOR LABORATORY PRESS
PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 85, 1988, pages 2444 - 2448, Retrieved from the Internet <URL:http://www.ddbj.nig.ac.jp/E-mail/homology-j.html>
SCIENCE, vol. 227, 1985, pages 1435 - 1441
See also references of EP2554667A4 *
SHEPPARD P.O. ET AL.: "The use of conserved cellulase family-specific sequences to clone cellulase homologue cDNAs from Fusarium oxysporum.", GENE, vol. 150, no. 1, 1994, pages 163 - 167, XP023966311 *
SHI P. ET AL.: "Cloning, characterization, and antifungal activity of an endo-1,3-beta-D: -glucanase from Streptomyces sp. S27.", APPL. MICROBIOL. BIOTECHNOL., vol. 85, no. 5, 21 August 2009 (2009-08-21), pages 1483 - 1490, XP019778534 *
VLASENKO E. ET AL.: "Substrate specificity of family 5, 6, 7, 9, 12, and 45 endoglucanases.", BIORESOUR. TECHNOL., vol. 101, no. 7, 14 December 2009 (2009-12-14), pages 2405 - 2411, XP026822534 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102363772A (zh) * 2011-08-23 2012-02-29 北京挑战生物技术有限公司 一种酸性纤维素酶egi及其基因和应用
JP2015033378A (ja) * 2013-07-09 2015-02-19 本田技研工業株式会社 β−グルコシダーゼ
JP2015033379A (ja) * 2013-07-09 2015-02-19 本田技研工業株式会社 β−グルコシダーゼ
JP2015033377A (ja) * 2013-07-09 2015-02-19 本田技研工業株式会社 β−グルコシダーゼ
JP2015033380A (ja) * 2013-07-09 2015-02-19 本田技研工業株式会社 β−グルコシダーゼ
WO2023225459A2 (en) 2022-05-14 2023-11-23 Novozymes A/S Compositions and methods for preventing, treating, supressing and/or eliminating phytopathogenic infestations and infections

Also Published As

Publication number Publication date
US20130023014A1 (en) 2013-01-24
EP2554667A4 (en) 2013-09-04
DK2554667T3 (en) 2017-01-30
ES2608402T3 (es) 2017-04-10
US10774318B2 (en) 2020-09-15
CN102939376B (zh) 2016-07-06
BR112012024959A2 (pt) 2015-09-22
US10053679B2 (en) 2018-08-21
CN102939376A (zh) 2013-02-20
US20180327729A1 (en) 2018-11-15
CA2794471A1 (en) 2011-10-06
EP2554667A9 (en) 2014-04-02
EP2554667A1 (en) 2013-02-06
EP2554667B1 (en) 2016-10-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5618478B2 (ja) 新規セルラーゼ遺伝子
US10774318B2 (en) Cellulase gene
JP5745411B2 (ja) β−グルコシダーゼ活性を有する新規タンパク質およびその用途
JP4547335B2 (ja) エンドグルカナーゼｓｔｃｅおよびそれを含むセルラーゼ調製物
JP4644603B2 (ja) 界面活性剤に耐性なセルラーゼ及びその変換方法
JP5193997B2 (ja) エンドグルカナーゼｐｐｃｅおよびそれを含んでなるセルラーゼ調製物
EP3224356B1 (en) Methods for recombinant expression of beta-glucosidase gene
CN115975994A (zh) 酶组合物及其用途
JP4257759B2 (ja) 新規なプロモーター、及びそれを用いたタンパク質の発現方法
WO2001096382A2 (en) Thermostable cellulase
JP3962805B2 (ja) セルラーゼ活性を有するタンパク質およびその製造法
WO2011157231A1 (zh) 新型内切木聚糖酶，其编码基因和应用
JP6106738B2 (ja) 新規セルラーゼ遺伝子
JPWO2002042474A1 (ja) セルロース結合領域を欠失した接合菌由来エンドグルカナーゼ酵素
JP2014239698A (ja) 新規セルラーゼ遺伝子
Hamada et al. Isolation and transcriptional analysis of a cellulase gene (cell) from the basidiomycete Irpex lacteus
CN104293812B (zh) 耐热中性纤维素酶Cel6C及其编码基因和应用
JP2004313022A (ja) エンドグルカナーゼｍｔｅ１およびそれを含んでなるセルラーゼ調製物
JP7250282B2 (ja) 新規β－グルコシダーゼ、これを含む酵素組成物およびこれらを用いた糖液の製造方法
US6428996B1 (en) Cellulase enzymes

Legal Events

Date Code Title Description
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 201080067181.X

Country of ref document: CN

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 10848946

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2794471

Country of ref document: CA

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2828/KOLNP/2012

Country of ref document: IN

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 13638538

Country of ref document: US

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

REEP Request for entry into the european phase

Ref document number: 2010848946

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2010848946

Country of ref document: EP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: JP

REG Reference to national code

Ref country code: BR

Ref legal event code: B01A

Ref document number: 112012024959

Country of ref document: BR

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 112012024959

Country of ref document: BR

Kind code of ref document: A2

Effective date: 20120928