JP2000069978A - エンドグルカナーゼａｃｃ５ - Google Patents
エンドグルカナーゼａｃｃ５Info
- Publication number
- JP2000069978A JP2000069978A JP10256108A JP25610898A JP2000069978A JP 2000069978 A JP2000069978 A JP 2000069978A JP 10256108 A JP10256108 A JP 10256108A JP 25610898 A JP25610898 A JP 25610898A JP 2000069978 A JP2000069978 A JP 2000069978A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- activity
- carboxymethylcellulose
- enzyme
- stable
- saccharification
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 糸状菌アクレモニウム・セルロリティカス由
来のセルラーゼ系を構成する種々の酵素中、植物細胞壁
の分解に有効な成分であるエンドグルカナーゼＡＣＣ５
を提供すること。 【解決手段】 糸状菌アクレモニウム・セルロリティカ
スに由来し、アビセル糖化活性が高く、カルボキシメチ
ルセルロース液化活性とカルボキシメチルセルロース糖
化活性との比率が中エンド型を示し、カルボキシメチル
セルロースを基質とした糖化活性における至適ｐＨは5.
０〜5.５であり、作用最適温度は５０〜５５℃であり、
分子量が６0,０００（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
電機泳動法による）であるエンドグルカナーゼＡＣＣ
５。
来のセルラーゼ系を構成する種々の酵素中、植物細胞壁
の分解に有効な成分であるエンドグルカナーゼＡＣＣ５
を提供すること。 【解決手段】 糸状菌アクレモニウム・セルロリティカ
スに由来し、アビセル糖化活性が高く、カルボキシメチ
ルセルロース液化活性とカルボキシメチルセルロース糖
化活性との比率が中エンド型を示し、カルボキシメチル
セルロースを基質とした糖化活性における至適ｐＨは5.
０〜5.５であり、作用最適温度は５０〜５５℃であり、
分子量が６0,０００（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
電機泳動法による）であるエンドグルカナーゼＡＣＣ
５。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、エンドグルカナー
ゼに関し、詳しくは糸状菌アクレモニウム・セルロリテ
ィカスに由来する新規なエンドグルカナーゼＡＣＣ５に
関する。
ゼに関し、詳しくは糸状菌アクレモニウム・セルロリテ
ィカスに由来する新規なエンドグルカナーゼＡＣＣ５に
関する。
【０００２】
【従来の技術】セルロースは、高等植物細胞壁の主要な
構成成分であり、広く天然に存在する。セルロースは、
グルコースがβ−１，４−グルコシド結合により重合し
た高分子多糖であり、天然にはセルロースが結晶状、あ
るいは非結晶状態で存在しており、更には他の成分、リ
グニン，ヘミセルロース類，ペクチン類などとも複雑に
結合して植物組織を構築している。セルラーゼは、セル
ロースをセロオリゴ糖、セロビオース、最終的にはグル
コースにまで分解する反応を触媒する酵素群の総称であ
り、その作用様式によって、エンドグルカナーゼ，エキ
ソグルカナーゼ，β- グルコシダーゼなどに大別され
る。それらの作用様式を詳細に比較すると、種々の作用
様式を示す複数の酵素が互いに補い合い、相乗効果を発
現することにより、植物細胞壁の主成分であるセルロー
スを分解するものと考えられている。しかし最近、飼料
用酵素の分野では、これらセルラーゼ群の中で特に植物
細胞壁の分解に効果的なセルラーゼ成分の検討が進み、
エンドグルカナーゼがその主要な役割を果たしているこ
とが判明しつつある（例えば、ＷＯ９５／１６３６０公
報）。
構成成分であり、広く天然に存在する。セルロースは、
グルコースがβ−１，４−グルコシド結合により重合し
た高分子多糖であり、天然にはセルロースが結晶状、あ
るいは非結晶状態で存在しており、更には他の成分、リ
グニン，ヘミセルロース類，ペクチン類などとも複雑に
結合して植物組織を構築している。セルラーゼは、セル
ロースをセロオリゴ糖、セロビオース、最終的にはグル
コースにまで分解する反応を触媒する酵素群の総称であ
り、その作用様式によって、エンドグルカナーゼ，エキ
ソグルカナーゼ，β- グルコシダーゼなどに大別され
る。それらの作用様式を詳細に比較すると、種々の作用
様式を示す複数の酵素が互いに補い合い、相乗効果を発
現することにより、植物細胞壁の主成分であるセルロー
スを分解するものと考えられている。しかし最近、飼料
用酵素の分野では、これらセルラーゼ群の中で特に植物
細胞壁の分解に効果的なセルラーゼ成分の検討が進み、
エンドグルカナーゼがその主要な役割を果たしているこ
とが判明しつつある（例えば、ＷＯ９５／１６３６０公
報）。
【０００３】糸状菌アクレモニウム・セルロリティカス
（Acremonium cellu1o1yticus）ＦＥＲＭ ＢＰ−６８
５の生産するセルラーゼは、糖化活性の強いことが特徴
であり、飼料用途やサイレージ用途での有用性が報告さ
れている( 例えば、特開平４−１１７２４４号公報，特
開平７−２３６４３１号公報) 。また、含有されている
セルラーゼ成分についても報告されている［例えば、Ag
ric. Biol. Chem.，52，2493〜2501（1988），同誌53，
3359〜3360（1989），同誌54，309 〜317 (1990)］。し
かし、そのセルラーゼ酵素群の中で、いずれの成分が有
効成分であるのかについては、十分に知られていなかっ
た。
（Acremonium cellu1o1yticus）ＦＥＲＭ ＢＰ−６８
５の生産するセルラーゼは、糖化活性の強いことが特徴
であり、飼料用途やサイレージ用途での有用性が報告さ
れている( 例えば、特開平４−１１７２４４号公報，特
開平７−２３６４３１号公報) 。また、含有されている
セルラーゼ成分についても報告されている［例えば、Ag
ric. Biol. Chem.，52，2493〜2501（1988），同誌53，
3359〜3360（1989），同誌54，309 〜317 (1990)］。し
かし、そのセルラーゼ酵素群の中で、いずれの成分が有
効成分であるのかについては、十分に知られていなかっ
た。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】そこで本発明者らは、
糸状菌アクレモニウム・セルロリティカスのセルラーゼ
系を構築する種々の酵素を分画、精製して鋭意検討し
た。その結果、これら酵素群の中で特に植物細胞壁の分
解に有効な成分を見出し、本発明を完成した。本発明
は、新規なエンドグルカナーゼの提供を目的とするもの
である。
糸状菌アクレモニウム・セルロリティカスのセルラーゼ
系を構築する種々の酵素を分画、精製して鋭意検討し
た。その結果、これら酵素群の中で特に植物細胞壁の分
解に有効な成分を見出し、本発明を完成した。本発明
は、新規なエンドグルカナーゼの提供を目的とするもの
である。
【０００５】
【課題を解決するための手段】請求項１に記載の本発明
は、糸状菌アクレモニウム・セルロリティカスに由来
し、下記の性質を有するエンドグルカナーゼである。 (a) 作用：アビセル糖化活性が高く、カルボキシメチル
セルロース液化活性とカルボキシメチルセルロース糖化
活性との比率が中エンド型を示す。 (b) 基質特異性：本酵素はカルボキシメチルセルロース
及びアビセルによく作用する。 (c) 作用至適ｐＨ及び安定ｐＨの範囲：当該酵素のカル
ボキシメチルセルロースを基質とした糖化活性における
作用至適ｐＨは、5.０〜5.５であり、４℃、２４時間処
理においてはｐＨ3.５〜8.０の範囲で安定であり、４５
℃、２時間処理においてはｐＨ3.５〜7.０の範囲で安定
である。 (d) 作用最適温度：カルボキシメチルセルロースを基質
とした糖化活性においては、５０〜５５℃である。 (e) 温度安定性：５５℃以下で安定である（ｐＨ5.５、
１０分間）。 (f) 分子量：６0,０００（ＳＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動法による） (g) 等電点：ｐＩ 4.５５（ポリアクリルアミドゲル等
電点電気泳動法による） (h) 比活性：２4.７単位／ｍｇタンパク質（カルボキシ
メチルセルロース糖化活性） ：0.３９単位／ｍｇタンパク質（アビセル糖化活性） (i) Ｎ末端側アミノ酸配列：配列表の配列番号１記載の
配列を有する。
は、糸状菌アクレモニウム・セルロリティカスに由来
し、下記の性質を有するエンドグルカナーゼである。 (a) 作用：アビセル糖化活性が高く、カルボキシメチル
セルロース液化活性とカルボキシメチルセルロース糖化
活性との比率が中エンド型を示す。 (b) 基質特異性：本酵素はカルボキシメチルセルロース
及びアビセルによく作用する。 (c) 作用至適ｐＨ及び安定ｐＨの範囲：当該酵素のカル
ボキシメチルセルロースを基質とした糖化活性における
作用至適ｐＨは、5.０〜5.５であり、４℃、２４時間処
理においてはｐＨ3.５〜8.０の範囲で安定であり、４５
℃、２時間処理においてはｐＨ3.５〜7.０の範囲で安定
である。 (d) 作用最適温度：カルボキシメチルセルロースを基質
とした糖化活性においては、５０〜５５℃である。 (e) 温度安定性：５５℃以下で安定である（ｐＨ5.５、
１０分間）。 (f) 分子量：６0,０００（ＳＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動法による） (g) 等電点：ｐＩ 4.５５（ポリアクリルアミドゲル等
電点電気泳動法による） (h) 比活性：２4.７単位／ｍｇタンパク質（カルボキシ
メチルセルロース糖化活性） ：0.３９単位／ｍｇタンパク質（アビセル糖化活性） (i) Ｎ末端側アミノ酸配列：配列表の配列番号１記載の
配列を有する。
【０００６】
【発明の実施の形態】本発明のエンドグルカナーゼＡＣ
Ｃ５は、糸状菌アクレモニウム・セルロリティカスが生
産するセルラーゼ系中に含まれる有効成分である。以下
に本発明を詳細に説明する。本発明のエンドグルカナー
ゼＡＣＣ５を含むセルラーゼ系を生産する微生物として
は、糸状菌アクレモウム・セルロリティカスＹ−９４株
（ＦＥＲＭ ＢＰ−５８２６）、アクレモウム・セルロ
リティカスＴＮ株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６８５）などがあ
り、本菌によるセルラーゼの製造については、例えば特
公昭６０−４３９５４号公報，特公昭６３−６３１９７
号公報に記載された方法に従って行えば良い。すなわ
ち、上記の菌株を炭素源と窒素源を含む液体培地に培養
し、培養物から目的とするセルラーゼを採取することに
より得られる。上記微生物の培養終了後、培養物を遠心
分離等により除去して得た上清液を、粗酵素として用い
ることもできるが、通常は、この上清液を限外濾過法な
どにより濃縮し、防腐剤などを加えて濃縮酵素とする
か、濃縮後スプレードライ法によって粉末酵素とする。
Ｃ５は、糸状菌アクレモニウム・セルロリティカスが生
産するセルラーゼ系中に含まれる有効成分である。以下
に本発明を詳細に説明する。本発明のエンドグルカナー
ゼＡＣＣ５を含むセルラーゼ系を生産する微生物として
は、糸状菌アクレモウム・セルロリティカスＹ−９４株
（ＦＥＲＭ ＢＰ−５８２６）、アクレモウム・セルロ
リティカスＴＮ株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６８５）などがあ
り、本菌によるセルラーゼの製造については、例えば特
公昭６０−４３９５４号公報，特公昭６３−６３１９７
号公報に記載された方法に従って行えば良い。すなわ
ち、上記の菌株を炭素源と窒素源を含む液体培地に培養
し、培養物から目的とするセルラーゼを採取することに
より得られる。上記微生物の培養終了後、培養物を遠心
分離等により除去して得た上清液を、粗酵素として用い
ることもできるが、通常は、この上清液を限外濾過法な
どにより濃縮し、防腐剤などを加えて濃縮酵素とする
か、濃縮後スプレードライ法によって粉末酵素とする。
【０００７】本発明のエンドグルカナーゼＡＣＣ５は、
これら濃縮酵素又は粉末酵素を必要に応じて部分精製又
は高度に精製して得ることができる。当該酵素の精製法
としては常法、即ち硫酸アンモニウムなどを用いる塩析
法、アルコールなどの有機溶媒沈澱法、膜分離法、さら
にはイオン交換体，疎水クロマトグラフィー用担体，ゲ
ル濾過用担体などを用いるクロマト分離法等を単独又は
適宜組み合わせて用いることができる。
これら濃縮酵素又は粉末酵素を必要に応じて部分精製又
は高度に精製して得ることができる。当該酵素の精製法
としては常法、即ち硫酸アンモニウムなどを用いる塩析
法、アルコールなどの有機溶媒沈澱法、膜分離法、さら
にはイオン交換体，疎水クロマトグラフィー用担体，ゲ
ル濾過用担体などを用いるクロマト分離法等を単独又は
適宜組み合わせて用いることができる。
【０００８】本発明によって得られる高純度に精製され
たエンドグルカナーゼＡＣＣ５の性質は、下記の通りで
ある。本酵素については従来の文献には報告されていな
いので、新規酵素である。 (a) 作用：アビセル糖化活性が高く、カルボキシメチル
セルロース液化活性とカルボキシメチルセルロース糖化
活性との比率が中エンド型を示す。 (b) 基質特異性：本酵素はカルボキシメチルセルロース
及びアビセルによく作用する。 (c) 作用至適ｐＨ及び安定ｐＨの範囲：当該酵素のカル
ボキシメチルセルロースを基質とした糖化活性における
作用至適ｐＨは、5.０〜5.５であり（図４）、４℃、２
４時間処理においてはｐＨ3.５〜8.０の範囲で安定であ
り（図５−ａ）、４５℃、２時間処理においてはｐＨ3.
５〜7.０の範囲で安定である（図５−ｂ）。 (d) 作用最適温度：カルボキシメチルセルロースを基質
とした糖化活性においては、５０〜５５℃である（図
６）。 (e) 温度安定性：５５℃以下で安定である（ｐＨ5.５、
１０分間）（図７）。 (f) 分子量：６0,０００（ＳＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動法による）（図８） (g) 等電点：ｐＩ 4.５５（ポリアクリルアミドゲル等
電点電気泳動法による）（図９） (h) 比活性：２4.７単位／ｍｇタンパク質（カルボキシ
メチルセルロース糖化活性） ：0.３９単位／ｍｇタンパク質（アビセル糖化活性） (i) Ｎ末端側アミノ酸配列：配列表の配列番号１記載の
配列を有する（パーキンエルマー社製、プロテインシー
ケンサーModel 492 による）。
たエンドグルカナーゼＡＣＣ５の性質は、下記の通りで
ある。本酵素については従来の文献には報告されていな
いので、新規酵素である。 (a) 作用：アビセル糖化活性が高く、カルボキシメチル
セルロース液化活性とカルボキシメチルセルロース糖化
活性との比率が中エンド型を示す。 (b) 基質特異性：本酵素はカルボキシメチルセルロース
及びアビセルによく作用する。 (c) 作用至適ｐＨ及び安定ｐＨの範囲：当該酵素のカル
ボキシメチルセルロースを基質とした糖化活性における
作用至適ｐＨは、5.０〜5.５であり（図４）、４℃、２
４時間処理においてはｐＨ3.５〜8.０の範囲で安定であ
り（図５−ａ）、４５℃、２時間処理においてはｐＨ3.
５〜7.０の範囲で安定である（図５−ｂ）。 (d) 作用最適温度：カルボキシメチルセルロースを基質
とした糖化活性においては、５０〜５５℃である（図
６）。 (e) 温度安定性：５５℃以下で安定である（ｐＨ5.５、
１０分間）（図７）。 (f) 分子量：６0,０００（ＳＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動法による）（図８） (g) 等電点：ｐＩ 4.５５（ポリアクリルアミドゲル等
電点電気泳動法による）（図９） (h) 比活性：２4.７単位／ｍｇタンパク質（カルボキシ
メチルセルロース糖化活性） ：0.３９単位／ｍｇタンパク質（アビセル糖化活性） (i) Ｎ末端側アミノ酸配列：配列表の配列番号１記載の
配列を有する（パーキンエルマー社製、プロテインシー
ケンサーModel 492 による）。
【０００９】ここで、当該酵素の活性測定法と１単位の
酵素量の定義については以下の通りとした。 ・アビセル糖化活性 ｐＨ5.０、４０℃で２％アビセル懸濁液に酵素を作用さ
せ、１分間に１μｍｏｌのグルコースに相当する還元糖
を生成する酵素量を１単位と定義した。 ・カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）糖化活性 ｐＨ5.０、３０℃で0.２５％カルボキシメチルセルロー
ス溶液に酵素を作用させ、１分間に１μｍｏｌのグルコ
ースに相当する還元糖を生成する酵素量を１単位と定義
した。 ・カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）液化活性 キャノン・フェンスケ粘度計を用いて、ｐＨ5.０、３０
℃で0.２５％カルボキシメチルセルロース溶液に酵素を
作用させ、経時的に反応混液の流動度（η）を測定し、
比流動度（φsp.=１／η）をカルボキシメチルセルロー
ス液化活性とした。
酵素量の定義については以下の通りとした。 ・アビセル糖化活性 ｐＨ5.０、４０℃で２％アビセル懸濁液に酵素を作用さ
せ、１分間に１μｍｏｌのグルコースに相当する還元糖
を生成する酵素量を１単位と定義した。 ・カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）糖化活性 ｐＨ5.０、３０℃で0.２５％カルボキシメチルセルロー
ス溶液に酵素を作用させ、１分間に１μｍｏｌのグルコ
ースに相当する還元糖を生成する酵素量を１単位と定義
した。 ・カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）液化活性 キャノン・フェンスケ粘度計を用いて、ｐＨ5.０、３０
℃で0.２５％カルボキシメチルセルロース溶液に酵素を
作用させ、経時的に反応混液の流動度（η）を測定し、
比流動度（φsp.=１／η）をカルボキシメチルセルロー
ス液化活性とした。
【００１０】
【実施例】以下に、本発明を実施例により詳しく説明す
る。 実施例１（酵素原末の調製） アクレモニウム属微生物由来のセルラーゼ製剤を得るた
め、下記の手法により微生物の培養を行った。培養液体
培地は、すべて以下の組成から構成され、常法により加
熱滅菌したものを用いた。セルロース４％、リン酸水素
二カリウム1.２％、バクトペプトン１％、硝酸カリウム
0.６％、尿素0.２％、塩化カリウム0.１６％：硫酸マグ
ネシウム・七水塩0.１２％、硫酸亜鉛・七水塩0.００１
％、硫酸マンガン・七水塩0.００１％、硫酸銅・五水塩
0.００１％。液体培地５００ｍｌにアクレモニウム・セ
ルロリティカスＴＮ株（ＦＥＲＭＢＰ−６８５）を接種
し、３０℃で４８時間撹絆しながら培養した。次に、そ
の培養液をシードとして１５Ｌにスケールアップし、更
にスケールアップを続けて最終的に６００Ｌタンク中の
培養液量を３００Ｌとし、通気撹絆培養を７日間行っ
た。得られた培養液をフィルタープレスで濾過した後、
限外濾過により１５Ｌまで濃縮し、乳糖２ｋｇを添加し
てスプレードライにより粉末化した。この方法で得られ
たセルラーゼ製剤は5.０ｋｇであった。
る。 実施例１（酵素原末の調製） アクレモニウム属微生物由来のセルラーゼ製剤を得るた
め、下記の手法により微生物の培養を行った。培養液体
培地は、すべて以下の組成から構成され、常法により加
熱滅菌したものを用いた。セルロース４％、リン酸水素
二カリウム1.２％、バクトペプトン１％、硝酸カリウム
0.６％、尿素0.２％、塩化カリウム0.１６％：硫酸マグ
ネシウム・七水塩0.１２％、硫酸亜鉛・七水塩0.００１
％、硫酸マンガン・七水塩0.００１％、硫酸銅・五水塩
0.００１％。液体培地５００ｍｌにアクレモニウム・セ
ルロリティカスＴＮ株（ＦＥＲＭＢＰ−６８５）を接種
し、３０℃で４８時間撹絆しながら培養した。次に、そ
の培養液をシードとして１５Ｌにスケールアップし、更
にスケールアップを続けて最終的に６００Ｌタンク中の
培養液量を３００Ｌとし、通気撹絆培養を７日間行っ
た。得られた培養液をフィルタープレスで濾過した後、
限外濾過により１５Ｌまで濃縮し、乳糖２ｋｇを添加し
てスプレードライにより粉末化した。この方法で得られ
たセルラーゼ製剤は5.０ｋｇであった。
【００１１】実施例２（エンドグルカナーゼＡＣＣ５の
精製） 実施例１で得られた酵素原末を、２０ｍＭ 酢酸緩衝液
（ｐＨ5.５）に溶解し、不純物を高速冷却遠心分離によ
り除去した。得られた上清を酵素精製の出発材料として
以下に示した方法で精製した。 強塩基性陰イオン交換クロマトグラフィー： QAE−ト
ヨパール550C（東ソー（株））に前記の上清を吸着さ
せ、酢酸緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ5.５）中にＮａＣｌを
それぞれ０、0.０４、0.１５、0.５Ｍ含有せしめ、順次
ステップワイズ溶出を行い、0.１５Ｍ ＮａＣｌで溶出
されるセルラーゼ活性画分を分取した。 疎水クロマトグラフィー：ブチルトヨパール（東ソー
（株））に前記で得た分取画分を吸着させ、酢酸緩衝
液（２０ｍＭ、ｐＨ4.０）中に（ＮＨ4)2 ＳＯ4 の濃度
が0.７、0.５、0.４、０Ｍとなるように溶解せしめた各
緩衝液及び脱イオン水を用いて、順次ステップワイズ溶
出を行い、脱イオン水により溶出されたセルラーゼ活性
画分を分取した。
精製） 実施例１で得られた酵素原末を、２０ｍＭ 酢酸緩衝液
（ｐＨ5.５）に溶解し、不純物を高速冷却遠心分離によ
り除去した。得られた上清を酵素精製の出発材料として
以下に示した方法で精製した。 強塩基性陰イオン交換クロマトグラフィー： QAE−ト
ヨパール550C（東ソー（株））に前記の上清を吸着さ
せ、酢酸緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ5.５）中にＮａＣｌを
それぞれ０、0.０４、0.１５、0.５Ｍ含有せしめ、順次
ステップワイズ溶出を行い、0.１５Ｍ ＮａＣｌで溶出
されるセルラーゼ活性画分を分取した。 疎水クロマトグラフィー：ブチルトヨパール（東ソー
（株））に前記で得た分取画分を吸着させ、酢酸緩衝
液（２０ｍＭ、ｐＨ4.０）中に（ＮＨ4)2 ＳＯ4 の濃度
が0.７、0.５、0.４、０Ｍとなるように溶解せしめた各
緩衝液及び脱イオン水を用いて、順次ステップワイズ溶
出を行い、脱イオン水により溶出されたセルラーゼ活性
画分を分取した。
【００１２】Mono Qを用いた陰イオン交換クロマトグ
ラフィー：Mono Qカラムに、前記で得たセルラーゼ活
性画分を吸着させ、ＦＰＬＣを用いて溶出を行った。酢
酸緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ4.５）中のＮａＣｌ濃度が０
Ｍから0.１Ｍに上昇するように直線濃度勾配をかけ室温
で溶出した。その結果、セルラーゼ活性を有するＩ及び
IIの２個のセルラーゼ活性画分が溶出された。これらの
画分中のタンパク質量とカルボキシメチルセルロース
（ＣＭＣ）糖化活性の測定値を図１に示した。 疎水クロマトグラフィー：Alkyl-superoseカラムに、
前記で得た分取画分のうちセルラーゼＩ画分を吸着せ
しめ、ＦＰＬＣを用いて溶出を行った。酢酸緩衝液（２
０ｍＭ、ｐＨ4.５）中の（ＮＨ4)2 ＳＯ4 濃度が1.５Ｍ
から０Ｍに下降するよう、直線濃度勾配をかけ室温で溶
出した。その結果、セルラーゼ活性を有する１個のタン
パク質画分が溶出された。これらの画分中のタンパク質
量とカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）糖化活性の
測定値を図２に示した。得られたセルラーゼ活性画分は
Native- 及びＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
で単一のタンパク質染色バンドを示す、高純度セルラー
ゼ標品であった。本精製セルラーゼ標品をエンドグルカ
ナーゼＡＣＣ５と命名した。
ラフィー：Mono Qカラムに、前記で得たセルラーゼ活
性画分を吸着させ、ＦＰＬＣを用いて溶出を行った。酢
酸緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ4.５）中のＮａＣｌ濃度が０
Ｍから0.１Ｍに上昇するように直線濃度勾配をかけ室温
で溶出した。その結果、セルラーゼ活性を有するＩ及び
IIの２個のセルラーゼ活性画分が溶出された。これらの
画分中のタンパク質量とカルボキシメチルセルロース
（ＣＭＣ）糖化活性の測定値を図１に示した。 疎水クロマトグラフィー：Alkyl-superoseカラムに、
前記で得た分取画分のうちセルラーゼＩ画分を吸着せ
しめ、ＦＰＬＣを用いて溶出を行った。酢酸緩衝液（２
０ｍＭ、ｐＨ4.５）中の（ＮＨ4)2 ＳＯ4 濃度が1.５Ｍ
から０Ｍに下降するよう、直線濃度勾配をかけ室温で溶
出した。その結果、セルラーゼ活性を有する１個のタン
パク質画分が溶出された。これらの画分中のタンパク質
量とカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）糖化活性の
測定値を図２に示した。得られたセルラーゼ活性画分は
Native- 及びＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
で単一のタンパク質染色バンドを示す、高純度セルラー
ゼ標品であった。本精製セルラーゼ標品をエンドグルカ
ナーゼＡＣＣ５と命名した。
【００１３】実施例３ 実施例２で得た精製エンドグルカナーゼＡＣＣ５を0.２
５％ ＣＭＣ溶液に作用させ、経時的に得られる反応混
液の粘度低下力（φsp. ）と還元力の増加とを相関させ
た結果を図３に示した。得られた直線の勾配から判断し
て、当該エンドグルカナーゼは中エンド型の水解様式を
示した。
５％ ＣＭＣ溶液に作用させ、経時的に得られる反応混
液の粘度低下力（φsp. ）と還元力の増加とを相関させ
た結果を図３に示した。得られた直線の勾配から判断し
て、当該エンドグルカナーゼは中エンド型の水解様式を
示した。
【００１４】実施例４ 実施例２で得た精製エンドグルカナーゼＡＣＣ５の３０
℃における作用至適ｐＨを図４に示す。本酵素は、McIl
vaine 緩衝液でｐＨ5.０〜5.５において最大活性を示し
た。また、本酵素の４℃、２４時間処理におけるｐＨ安
定性を図５−ａに、４５℃、２時間処理におけるｐＨ安
定性を図５−ｂにそれぞれ示す。図中の■と●はMcIlva
ine 緩衝液を示し，□と○はBritton & Robinson緩衝液
を示す。
℃における作用至適ｐＨを図４に示す。本酵素は、McIl
vaine 緩衝液でｐＨ5.０〜5.５において最大活性を示し
た。また、本酵素の４℃、２４時間処理におけるｐＨ安
定性を図５−ａに、４５℃、２時間処理におけるｐＨ安
定性を図５−ｂにそれぞれ示す。図中の■と●はMcIlva
ine 緩衝液を示し，□と○はBritton & Robinson緩衝液
を示す。
【００１５】実施例５ 実施例２で得た精製エンドグルカナーゼＡＣＣ５の作用
最適温度を調べるために、カルボキシメチルセルロース
を基質とした糖化活性を測定したところ、図６に示した
ように、至適温度は５０〜５５℃（ｐＨ5.５）であっ
た。次に、本酵素の温度安定性をｐＨ5.５、１０分間の
条件下で測定したところ、図７に示したように、５５℃
以下で安定であった。
最適温度を調べるために、カルボキシメチルセルロース
を基質とした糖化活性を測定したところ、図６に示した
ように、至適温度は５０〜５５℃（ｐＨ5.５）であっ
た。次に、本酵素の温度安定性をｐＨ5.５、１０分間の
条件下で測定したところ、図７に示したように、５５℃
以下で安定であった。
【００１６】実施例６ 実施例２で得た精製エンドグルカナーゼＡＣＣ５の分子
量を決定するため、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動を行った。すなわち、１2.５％ゲルを用いて２０
ｍＡの定電流で室温にて５０分間通電した。その結果、
本酵素の分子量は約６0,０００と算出された（図８）。
なお、この測定に用いた標準タンパク質及びその分子量
はそれぞれ以下の通りである。 標準タンパク質 分子量 Phosphorylase b ９7,０００ Serum albumin ６６０００ Ovalbumin ４5,０００ Carbonic anhydrase ３1,０００ Trypsin inhibitor ２1,５００ Lysozyme １4,４００
量を決定するため、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動を行った。すなわち、１2.５％ゲルを用いて２０
ｍＡの定電流で室温にて５０分間通電した。その結果、
本酵素の分子量は約６0,０００と算出された（図８）。
なお、この測定に用いた標準タンパク質及びその分子量
はそれぞれ以下の通りである。 標準タンパク質 分子量 Phosphorylase b ９7,０００ Serum albumin ６６０００ Ovalbumin ４5,０００ Carbonic anhydrase ３1,０００ Trypsin inhibitor ２1,５００ Lysozyme １4,４００
【００１７】実施例７ 実施例２で得た精製エンドグルカナーゼＡＣＣ５の等電
点（ｐＩ）を決定するため、マルチフォーII電気泳動装
置（ファルマシアバイオテク社製）を用いてポリアクリ
ルアミドゲル等電点電気泳動を行った。泳動用ゲルに
は、Ampholine PAG P1ate （ｐＨ3.５〜5.９）for IEF
（ファルマシアバイオテク社製）を用いて１０℃、１５
００Ｖ、５０ｍＡ、３０Ｗの泳動条件下で９０分間通電
した。その結果、本酵素の等電点は4.５５と算出された
（図９）。なお、この測定に用いた標準タンパク質のｐ
Ｉはそれぞれ以下の通りである。 標準タンパク質 ｐＩ Amyloglucosidase 3.５０ Soybean trypsin inhibitor 4.５５ β-Lactoglobulin A 5.２０ Bovin carbonic anhydrase B 5.８０ Human carbonic anhydrase B 6.５５ Horse myoglobin-acidic band 6.８５ Horse myoglobin-basicband 7.３５ Lentil lectin-acidic band 8.１５ Lentil lectin-middle band 8.４５ Lentil lectin-basic band 8.６５ Trypsinogen 9.３０
点（ｐＩ）を決定するため、マルチフォーII電気泳動装
置（ファルマシアバイオテク社製）を用いてポリアクリ
ルアミドゲル等電点電気泳動を行った。泳動用ゲルに
は、Ampholine PAG P1ate （ｐＨ3.５〜5.９）for IEF
（ファルマシアバイオテク社製）を用いて１０℃、１５
００Ｖ、５０ｍＡ、３０Ｗの泳動条件下で９０分間通電
した。その結果、本酵素の等電点は4.５５と算出された
（図９）。なお、この測定に用いた標準タンパク質のｐ
Ｉはそれぞれ以下の通りである。 標準タンパク質 ｐＩ Amyloglucosidase 3.５０ Soybean trypsin inhibitor 4.５５ β-Lactoglobulin A 5.２０ Bovin carbonic anhydrase B 5.８０ Human carbonic anhydrase B 6.５５ Horse myoglobin-acidic band 6.８５ Horse myoglobin-basicband 7.３５ Lentil lectin-acidic band 8.１５ Lentil lectin-middle band 8.４５ Lentil lectin-basic band 8.６５ Trypsinogen 9.３０
【００１８】実施例８ 実施例２で得た精製エンドグルカナーゼＡＣＣ５のＮ末
端側アミノ酸配列を決定した。まず、８％ Gel SDS-PAG
E mini（テフコ社製）を用いて電気泳動分離を行った
後、マルチフォーII（ファルマシアバイオテク社製）に
て、ＰＶＤＦ膜（ミリポア社製）に、タンパク質を電気
的にうつしとり、クマジー・ブリリアント・ブルーＲ−
２５０（ナカライテスク社製）で染色した後、水で洗浄
し、風乾した。ここから分子量６0,０００のタンパク質
がプロットされている部分を切り出し、プロテインシー
ケンサー Model 492（パーキンエルマー社製）に供し、
Ｎ末端側アミノ酸配列の決定を試みたが、エドマン分解
により切り出されるアミノ酸が得られず、Ｎ末端側アミ
ノ酸が修飾保護されていることが判明した。そこで、先
の染色し、洗浄したメンブレンから分子量６0,０００の
タンパク質を切り出し、ポリビニルピロリドン−４０
（シグマ社製）にて、膜上のタンパク質未結合部分をブ
ロックし、Podell, D. N. ら［Biochem. Biophys. Res.
Commun.，81，176 (1978)］の方法に従って、Ｐｆｕピ
ログルタメートアミノペプチダーゼ（宝酒造社製）を用
いて処理することにより、修飾Ｎ末端残基を除去した。
しかる後、再度前記したプロテインシーケンサーによ
り、Ｎ末端側アミノ酸配列を１３残基決定した。得られ
た配列は配列表の配列番号１に示される通りであった。
端側アミノ酸配列を決定した。まず、８％ Gel SDS-PAG
E mini（テフコ社製）を用いて電気泳動分離を行った
後、マルチフォーII（ファルマシアバイオテク社製）に
て、ＰＶＤＦ膜（ミリポア社製）に、タンパク質を電気
的にうつしとり、クマジー・ブリリアント・ブルーＲ−
２５０（ナカライテスク社製）で染色した後、水で洗浄
し、風乾した。ここから分子量６0,０００のタンパク質
がプロットされている部分を切り出し、プロテインシー
ケンサー Model 492（パーキンエルマー社製）に供し、
Ｎ末端側アミノ酸配列の決定を試みたが、エドマン分解
により切り出されるアミノ酸が得られず、Ｎ末端側アミ
ノ酸が修飾保護されていることが判明した。そこで、先
の染色し、洗浄したメンブレンから分子量６0,０００の
タンパク質を切り出し、ポリビニルピロリドン−４０
（シグマ社製）にて、膜上のタンパク質未結合部分をブ
ロックし、Podell, D. N. ら［Biochem. Biophys. Res.
Commun.，81，176 (1978)］の方法に従って、Ｐｆｕピ
ログルタメートアミノペプチダーゼ（宝酒造社製）を用
いて処理することにより、修飾Ｎ末端残基を除去した。
しかる後、再度前記したプロテインシーケンサーによ
り、Ｎ末端側アミノ酸配列を１３残基決定した。得られ
た配列は配列表の配列番号１に示される通りであった。
【００１９】
【発明の効果】本発明による酵素エンドグルカナーゼＡ
ＣＣ５は、糖化力が強いとされるアクレモニウム属微生
物由来のセルラーゼの主成分の一つであり、その性質が
初めて明らかになった。本酵素は、飼料、サイレージな
どの用途に有用である。
ＣＣ５は、糖化力が強いとされるアクレモニウム属微生
物由来のセルラーゼの主成分の一つであり、その性質が
初めて明らかになった。本酵素は、飼料、サイレージな
どの用途に有用である。
【図１】 Mono Qによる陰イオン交換クロマトグラフィ
ーの分画図である。
ーの分画図である。
【図２】 Alkyl-superoseによる疎水クロマトグラフィ
ーの分画図である。
ーの分画図である。
【図３】 本酵素のＣＭＣに対するエンド水解度を示す
図である。
図である。
【図４】 本酵素の作用至適ｐＨを示す図である。
【図５】 ａは４℃、２４時間処理における本酵素の安
定ｐＨ範囲を、ｂは４５℃、２時間処理における本酵素
の安定ｐＨの範囲を示す図である。
定ｐＨ範囲を、ｂは４５℃、２時間処理における本酵素
の安定ｐＨの範囲を示す図である。
【図６】 本酵素の作用最適温度を示す図である。
【図７】 本酵素の温度安定性を示す図である。
【図８】 本酵素の分子量を測定した際のＳＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動分析を示す図である。
アクリルアミドゲル電気泳動分析を示す図である。
【図９】 本酵素の等電点を測定した際のポリアクリル
アミドゲル等電点電気泳動分析を示す図である。
アミドゲル等電点電気泳動分析を示す図である。
【配列表】 <110> 明治製菓株式会社 MEIJI SEIKA KAISHA LTD. <110> 工業技術院長 DIRECTOR GENERAL OF AGENCY OF INDUSTIAL SCIENCE AND TECHNOLOGY <120> エンドグルカナーゼACC5 <130> P100988K <141> 1998-08-27 <160> 1 <210> 1 <211> 13 <212> PRT <213> Acremonium cellulolyticus <220> <221> PEPTIDE <222> Ｎ末端 <400> 1 Gln Gln Ala Pro Thr Pro Asp Asn Leu Ala Ser Leu Pro 1 5 10
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:645） (72)発明者 河野 敏明 埼玉県坂戸市千代田５−３−１ 明治製菓 株式会社生物科学研究所内 (72)発明者 隅田 奈緒美 神奈川県小田原市栢山788番地 明治製菓 株式会社薬品技術研究所内 (72)発明者 山辺 倫 茨城県つくば市東１−１−３ 工業技術院 生命工学工業技術研究所内 Ｆターム(参考） 4B024 AA10 BA12 4B050 CC01 DD03 FF09E FF11E
Claims (1)
- 【請求項１】 糸状菌アクレモニウム・セルロリティカ
スに由来し、下記の性質を有するエンドグルカナーゼＡ
ＣＣ５。 (a) 作用：アビセル糖化活性が高く、カルボキシメチル
セルロース液化活性とカルボキシメチルセルロース糖化
活性との比率が中エンド型を示す。 (b) 基質特異性：本酵素はカルボキシメチルセルロース
及びアビセルによく作用する。 (c) 作用至適ｐＨ及び安定ｐＨの範囲：当該酵素のカル
ボキシメチルセルロースを基質とした糖化活性における
作用至適ｐＨは5.０〜5.５であり、４℃、２４時間処理
においてはｐＨ3.５〜8.０の範囲で安定であり、４５
℃、２時間処理においてはｐＨ3.５〜7.０の範囲で安定
である。 (d) 作用最適温度：カルボキシメチルセルロースを基質
とした糖化活性においては、５０〜５５℃である。 (e) 温度安定性：５５℃以下で安定である（ｐＨ5.５、
１０分間）。 (f) 分子量：６0,０００（ＳＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動法による） (g) 等電点：ｐＩ 4.５５（ポリアクリルアミドゲル等
電点電気泳動法による） (h) 比活性：２4.７単位／ｍｇタンパク質（カルボキシ
メチルセルロース糖化活性） ：0.３９単位／ｍｇタンパク質（アビセル糖化活性） (i) Ｎ末端側アミノ酸配列：配列表の配列番号１記載の
配列を有する。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10256108A JP2000069978A (ja) | 1998-08-27 | 1998-08-27 | エンドグルカナーゼａｃｃ５ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10256108A JP2000069978A (ja) | 1998-08-27 | 1998-08-27 | エンドグルカナーゼａｃｃ５ |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000069978A true JP2000069978A (ja) | 2000-03-07 |
Family
ID=17288013
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10256108A Pending JP2000069978A (ja) | 1998-08-27 | 1998-08-27 | エンドグルカナーゼａｃｃ５ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2000069978A (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2011021616A1 (ja) | 2009-08-20 | 2011-02-24 | 明治製菓株式会社 | β-グルコシダーゼ活性を有する新規タンパク質およびその用途 |
| WO2011121768A1 (ja) | 2010-03-31 | 2011-10-06 | 明治製菓株式会社 | 新規セルラーゼ遺伝子 |
| JP2012187098A (ja) * | 2011-02-22 | 2012-10-04 | Shinshu Univ | 酸無添加ジュースの製造方法及び流動化剤 |
| JP2014239698A (ja) * | 2014-09-16 | 2014-12-25 | Ｍｅｉｊｉ Ｓｅｉｋａファルマ株式会社 | 新規セルラーゼ遺伝子 |
| JP2016039821A (ja) * | 2015-11-20 | 2016-03-24 | Ｍｅｉｊｉ Ｓｅｉｋａファルマ株式会社 | 新規セルラーゼ遺伝子 |
-
1998
- 1998-08-27 JP JP10256108A patent/JP2000069978A/ja active Pending
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2011021616A1 (ja) | 2009-08-20 | 2011-02-24 | 明治製菓株式会社 | β-グルコシダーゼ活性を有する新規タンパク質およびその用途 |
| US8975057B2 (en) | 2009-08-20 | 2015-03-10 | Meiji Seika Pharma Co., Ltd. | Protein having β-glucosidase activity and uses thereof |
| US10125355B2 (en) | 2009-08-20 | 2018-11-13 | Meiji Seika Pharma Co., Ltd. | Protein having B-glucosidase activity and uses thereof |
| WO2011121768A1 (ja) | 2010-03-31 | 2011-10-06 | 明治製菓株式会社 | 新規セルラーゼ遺伝子 |
| US10053679B2 (en) | 2010-03-31 | 2018-08-21 | Meiji Seika Pharma Co., Ltd. | Cellulase gene |
| US10774318B2 (en) | 2010-03-31 | 2020-09-15 | Meiji Seika Pharma Co., Ltd. | Cellulase gene |
| JP2012187098A (ja) * | 2011-02-22 | 2012-10-04 | Shinshu Univ | 酸無添加ジュースの製造方法及び流動化剤 |
| JP2014239698A (ja) * | 2014-09-16 | 2014-12-25 | Ｍｅｉｊｉ Ｓｅｉｋａファルマ株式会社 | 新規セルラーゼ遺伝子 |
| JP2016039821A (ja) * | 2015-11-20 | 2016-03-24 | Ｍｅｉｊｉ Ｓｅｉｋａファルマ株式会社 | 新規セルラーゼ遺伝子 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JPH11503902A (ja) | アルカリセルラーゼおよびその製造方法 | |
| EP0577823A1 (en) | Thermostable purified endoglucanases from thermophilic bacterium acidothermus cellulolyticus | |
| Sindhu et al. | Purification and characterization of α-amylase from Penicillium janthinellum (NCIM 4960) and its application in detergent industry | |
| Matano et al. | Cellulose promotes extracellular assembly of Clostridium cellulovorans cellulosomes | |
| JP2507339B2 (ja) | 粗ｔＰＡの精製方法 | |
| JP2000069978A (ja) | エンドグルカナーゼａｃｃ５ | |
| EP0888455A1 (en) | Alkaline cellulase and method of producing same | |
| JPH11513885A (ja) | 結晶セルラーゼおよびその製造方法 | |
| WO1999011767A1 (fr) | Endoglucanase acc4 | |
| JPH068322B2 (ja) | ペクチンの製造法 | |
| JP4039494B2 (ja) | 中温性キシラナーゼ | |
| JPH1066569A (ja) | エンドグルカナーゼ | |
| JP4863227B2 (ja) | シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ．）新種菌株、および該新種菌株を使用してキチナーゼ（ｃｈｉｔｉｎａｓｅ）、キトサナーゼ（ｃｈｉｔｏｓａｎａｓｅ）とナットウキナーゼ（Ｎａｔｔｏｋｉｎａｓｅ）を生産する製造方法 | |
| JP3761236B2 (ja) | 新規なβ−グルコシダーゼ、その製造法および用途 | |
| JP2002255988A5 (ja) | ||
| JP2001061473A (ja) | 新規ポリガラクツロナーゼ | |
| Abdel-Naby et al. | Purification and some properties of chitinase from Aspergillus carneus | |
| JPH07322886A (ja) | オリゴ糖及び単糖の製造方法 | |
| Zhuravleva et al. | N-Acetyl-β-D-hexosaminidase Secreted by the Marine Fungus Phoma glomerata | |
| JP3489789B2 (ja) | 新規ラミナリナーゼ及びその製造方法 | |
| Harata et al. | X‐ray structure of glu 53 human lysozyme | |
| WO1988008031A1 (en) | Process for preparing cyclodextrins | |
| JPS6156997B2 (ja) | ||
| JP2959777B2 (ja) | 新規エンドデキストラナーゼ、その製造方法及び本酵素を用いたイソマルトオリゴ糖の製造方法 | |
| JPH0353883A (ja) | 耐熱性β‐１，３‐グルカナーゼ遺伝子ＤＮＡ、該ＤＮＡを含む組換え体プラスミド及び形質転換体と耐熱性β‐１，３‐グルカナーゼ及びその製法 |