JPH05506576A - Ｄｎａ、ｄｎａ構造体、細胞及びこれらから誘導した植物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ＤＮＡ、ＤＮ＾Ｎ遺構、細胞及びこれらから誘導した植物技術分野 この出願は新規なりＮＡ構造体、これらを含有する植物細胞及びこれらから誘導 した植物に関する。特にこの出願は植物における形質発現を調節する組換えＤＮ Ａ技法の使用を伴なう。

背景技術 周知の通り、細胞は、遺伝子（ｇｅｎｅ）のＤＮＡをタンパク質に転写させてメ ツセンジャーＲＮＡ　（ｍＲＮＡ）を製造し、次いでこのｍＲＮＡを例えばイン トロン部分の切り出しにより加工（プロセッシング）し最後にリポソームにより タンパク質中に翻訳することによりタンパク質を製造するものである。この過程 は細胞中に“アンチセンス（ａｎｔｉ−ｓｅｎｓｅ）　ＲＮＡ”の存在によって 阻害されてしまう、このアンチセンスＩ？ＮＡなる用語は当該ｒａＲＮＡ中の塩 基の配列と相補的なＲＮＡ配列を意味し；アンチセンス（逆方向の）配列（３′ 〜５′の方向で読み取る）中の各々の塩基又は塩基の大部分が５′〜３′の方間 に読み取ったｍＲＮＡ配列中の対応の塩基（Ｃに対してはＧ、Ｕに対してはＡ） と対合（ｐａｉｒｉｎｇ）を行ない得る意味で相補的なＲＮＡ配列を意味する。

この阻害は２本の相補的なＲＮａ１ｍ同志間での複合体（ｃｏｍｐｌｅｘ）の生 成によって行われ、タンパク質の形成を妨害すると思われる。しかしながらこの 研究は不確定であり；複合体は更なる転写、プロセッシング、輸送又は翻訳を妨 害してしまい又はｍＲＮＡを分解してしまい又はこれらの作用の１つ以上を有し てしまう。が＼るアンチセンスＲＮ＾は、関連する遺伝子の（又はこれと実質的 な相同性を示すＤＮＡ塩基配列の）コード化ＤＮＡ鎖（ｃｏｄ−ｉｎｇ　５ｔｒ ａｎｄ）　（鋳型ＤＮＡ鎖と相対して）の後方部分を転写するように設けた適当 なりＮＡ構造体で形質転換することにより細胞中に製造できる。

特定の植物遺伝子の発現をダウンレギュレート（ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｅ）す るのにこの技法を使用することは、例えば米国特許出願第１１９６１４号に対応 する欧州特許公開第２７１９８８号に記載されている。形質発現の減少は植物の 表現型の変化を生起し：この変化は全体の眼で見うる表現型の差異のレベルで例 えば色のついた花弁の代りに無色となるペチュニアの花弁におけるアントシアニ ン生産の欠如で（ｖａｎ　ｄｅｒ　ＫｒｏｌらのＮａｔｕｒｅ、３３３　８６６ 〜８６９．１９８８）　；あるいはより微細な生化学的レベルで例えばトマト果 実の成熟中にポリガラクツロカーゼの量の変化及びペクチンの解重合の減少で（ ＳｍｉｔｈらのＮａｔｕｒｅ、■虹７２４〜７２６゜１９８８　；　Ｓｍ１ｔｈ 　らのＰｌａｎｔ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ＋　Ｊ３．３０３〜３ １１、１９９０）行われる。即ちアンチセンスＲＮＡは植物における形質発現の ダウンレギュレーション（ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａ−ｔｉｏｎ）を達成するのに有 用であることが判明された。

本発明を生起する研究においては、本発明者はトマト及びメロンからセルラーゼ 又は同様な酵素をエンコードするＤＮＡ塩基配列を単離した。これらのＤＮＡ塩 基配列はトマト、メロン及び他の果実の成熟特性を改質するのに使用されるもの と本発明者は想定する。

トマト及びメロン果実の細胞壁は多ｗｉより主としてなり、多糖類はセルロース 、セミセルロース及びベクチンフラクシゴンに再分される。果実の熟成中に細胞 壁の組成にかなりの変化がある。トマトの果皮組織においては、細胞壁フラクシ ョン中のセルロースの割合はわずかに増大する（）ｌｕｂｅｒのＨｏｒｔｉｃｕ ｌｔｕｒａｌ　５ｃｒｅｎｃｅ　２０＋　４４２〜４４３、１９８５）。

同様に、セルロース含量のわずかな増大は成熟中のメロンでも観察された。しか しながら、他の細胞壁フラクションは迅速に可溶化され且つ分解されるので、セ ルロースの絶対値は熟成中に減少してしまう。トマトの房室ゲルにおいては細胞 壁フラクション中のセルロースの割合は熱化中に減少する。

セルラーゼ活性の増大はアボカド果実の熟成にも関連している（Ａｗａｄ及びＹ ｏｕｎｇのＰｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ　６４　３０６〜３０８．１９７ ９）。トマト及びメロン果実を柔らかにするのにセルラーゼの役割は不明確であ る。

トマト果実におけるセルラーゼ活性については幾つかの報告がなされている（例 えばＨａｌｌのＮａｔｕｒｅＪＱｆｉ　１０１０〜１０１１．１９６３及びＨｏ ｂｓｏｎのＪｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｆｏｏｄ　５ｃｉｅｎｃｅ　Ｊ３＋５８８〜 ５９２．１９６８）。セルラーゼ活性は完熟の開始時に成熟した生のトマト果実 に見出される。果皮組織においては、セルラーゼ活性は完熟が進行するにつれて 大体１０倍増大する（Ｐｏｏｖａｉａｈ及びＮｕｋａｙａのＰｌａｎｔ　Ｐｈｙ ｓｉｏｌｏｇｙＪｊ。

５３４〜５３７．１９７９及びＨｕｂｅｒの前記したＨｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａ ｌＳｃｉｅｎｃｅ　１９８５）。セルラーゼ活性は果皮組織におけるよりも房室 ゲルにおける方が高く、また完熟中に増大する。

セルラーゼ活性は特にゲル形成の重要な特徴的性質であり得ると示唆された。

メロンが成熟する際には、セルラーゼ活性は最も若い組織で景高であり次いでメ ロン果実が成熟し完熟するにつれて下降することが報告されている（　ｌｅｓ　 ｔｅｒ及びＤｕｎ−１ａｐの５ｃｉｅｎｔｉａ　ＨｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｅＪ ｉＬ３２３〜３３１．１９８５）。

発明の開示 本発明によると、セルラーゼ又は同様な酵素をエンコードする遺伝子（ｇｅｎｅ ）の若干又は全てと相同性のＤＮＡ塩基配列を転写するのに定置された、植物中 で作用する転写開始領域を含有してなるＤＮＡ構造体（ｃｏｎｓ　ｔｒｕｃ　ｔ ）であって、前記の遺伝子が構造体ＴＣＥＬＢ６及びＭＣＥＬＥ２の何れかによ ってエンコードしたＤＮＡと実質的な相同性を示している、ＤＮＡ構造体が提供 される。

別の要旨によると、本発明はセルラーゼ又は同様な酵素をエンコードするｍＲＮ Ａと実質的な相同性を示す塩基の実質的な配列（ｒｕｎ）に相補的なＲＮＡをエ ンコードするＤＮＡ塩基配列を転写するのに定置された、植物中で作用する転写 開始領域を含有してなるか−るＤＮＡ構造体を提供する０本発明はまた本発明の ＤＮＡ構造体を含有する植物細胞；改質した成熟特性を示し且つ該植物細胞から 由来する形質転換済み植物；及びか−る植物の果実及び種子も包含する。

本発明のＤＮＡ構造体を植物中に挿入してセルラーゼ又は同様な酵素の生産を調 節できる。ＤＮＡ構造体の性状に応じて、酵素の生産は植物の一生涯に亘って又 は植物の寿命の特定の段階で増大又は減少させ得る。一般に、予期される様に、 酵素の生産は実質的に完全な遺伝子と相同性のＩＩＮＡを含有する構造体によっ てのみ促進される。

更に驚くべきことは、完全な遺伝子に相当するＤＮＡ塩基配列よりも実質的に短 かい不完全なりＮＡ塩基配列を含有する構造体はそれらがセンスＲＮ＾又はアン チセンスＲＮＡを発現するように設けられたかに拘らず酵素の発現を一般に阻害 するというものである。

本発明で使用した遺伝子は典型的にはトマト又はメロンのセルラーゼ遺伝子から のＤＮＡから由来するか；又は該遺伝子と完全に又は部分的に相同性のＤＮＡか ら由来する。本発明は、寄託されであるクローンＴＣＥＬＢ６又はＭＣＥＬＥ２ を使用して実施できる。あるいは別法としてかＸるクローンは植物ＤＮＡにおけ る他の相同性セルラーゼ又は同様な遺伝子又はその一部分を同定する試験物とし て使用でき、これによってより長い塩基配列長さのＤＮＡ又は相異なる塩基配列 のＤＮＡが得られる。この様にしてトマト又はメロンから誘導したＤＮＡあるい はセルラーゼ遺伝子が得られるのが知られている他の植物材料から誘導したＤＮ Ａを篩別（スクリーン）できる。

本発明を応用し得る植物には、商業上重要な果実担持植物特にトマト及びメロン がある。この様にして組換えＤＮＡからＲＮＡを発現し且つ次の特性の１つ又は それ以上を有し得る植物を生成できる： 軟らかくなること（柔軟化）が遅延し、堅固さが向上する；軟らかくなることが 遅くなることにより取扱い中に果実が損傷するのが低下するが、植物の成熟中に 色、風味及び芳香の発現は持続している（この事実によって果実の成熟段階のよ り近（で果実を収穫できしかも尚取扱い及び輸送に耐えて良好な状態で市場に到 達できる）：細胞壁の変質が減少したことにより保存期限がより長くなり且つ貯 蔵特性がより良くなる（果実はまた貯蔵中に病害の感染を余り受け易くなくなる ）；ペーストの粘度、固形分含量、ｐＨ、弾性の如き要因に寄与するセルラーゼ 活性が変化することにより加工特性が向上する。

本発明のＤＮＡ構造体はＲＮＡに転写するのに長さが少なくとも２０個の塩基を 有する塩基配列を含有してなるのが好ましい。酵素の発現増大が目的であるなら ば、その時は遺伝子配列の実質的に全部を構造体中に含有させる。

センスＲＮ＾による抑制については、より短かい塩基配列を使用する。アンチセ ンスＲＮＡを抑制に使用する場合には、塩基配列の長さには理論上の上限はなく 、細胞によって生産された関連あるｌｌＲＮＡ程長くあり得るが、便宜上長さが 少なくとも５０個の塩基、好ましくは１００〜１０００個の塩基の配列を使用す るのが適当であると一般に見出される。か！る構造体の調製は以下に詳細に記載 する。

転写のためＤＮＡ塩基配列の供給源としては、トマトセルラーゼについてはＴＣ ＥＬＢ６及びメロンセルラーゼについては？’ＩＣＥＬＥ２の如きクローンを使 用するのが都合良い。

丁ＣＥＬＢ６及びＭＣＥＬＥ２の塩基配列は第１図に記載される。

ＤＮＡ及びタン白質データヘースの研究が示す所によれば、これらのクローンは アボカド果実のセルラーゼ（ＴｕｃｋｅｒらのＰｌａｎｔ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ 　Ｂｉｏｌｏｇｙ　’１．１９７〜２０３＋　１９８７）及びいんげんの切断セ ルラーゼ（ＴｕｃｋｅｒらのＰｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏ−Ｉ　ｏｇｙ憇、　１２ ５７〜１２６２．１９８８）についてのクローンと相同性を示す。ＴＣＥＬＢ６ 及びＭＣＥＬＥ２はそれぞれ受理番号ＮＣｌＢ４Ｏ２６８及び４０２６９として スコツトランドのＡｂｅｒｄｅｅｎに在る寄託機関ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　 Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌａｎｄ　Ｍａｒｉｎｅ　 Ｂａｃｔｅｒｉａに１９９０年３月２９日に寄託されている。

ＴＣＥＬＢ６及びＭＣＥＬＥ２中にクローン化したＤＮＡフラグメントと同様な りＮＡフラグメントは、適当な合成オリゴヌクレオチドプライマーと適当な場合 にはトマト又はメロンのゲノミンクＤＮＡとを用いてポリメラーゼ連鎖の反応で 生成できる。別の場合には、ＴＣＥＬＢ６及びＭＣＥＬＥ２と相同性を示すｃＤ ＮＡクローンは５ｌａｔｅｒらのプラントモレキュラーバイオロジー（Ｐｌａｎ ｔ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）　５＋１３’７〜１４７゜１９８５ によって記載された方法と同様な方法により成熟しているトマト又はメロンのｍ ＲＮＡから得ることができる。

この様にして、トマト又はメロンのセルラーゼ遺伝子によって生産されたｍＲＮ Ａの全体又は実質的に全体をコードする塩基配列を得ることができる。こうして 得られたｃＤＮＡの適当な長さは制限酵素により使用するのに切断できる。

転写用の塩基配列についてＤＮＡフラグメントの供給源はｍＲＮＡから又はセル ラーゼ又は同様な酵素をエンコードする遺伝子から誘導できる。ＤＮＡが遺伝子 から由来するならば、このＤＮＡはイントロンが存在し得る点でｍＲＮＡから由 来するＤＮＡとは異なっている。イントロンはｍＲＮＡ中に転写されない（又は こうして転写されたとしても、イントロンは次後に切り落される）。か−る遺伝 子を転写用の塩基配列の供給源として使用する時には、イントロン領域又はエキ ソン領域の何れかを使用できる。

転写用の適当なりＮＡ塩基配列を得る別の仕方は、例えば手引きとして第１図を 用いて適当な塩基からＤＮＡ塩基配列を最初から合成するものである。アプライ ドバイオシステム社のオグリヌクレオチドシンセサイザーの如き装置が利用され これは最大で約１００個までの塩基の何れか所望の塩基配列で成る長さの単一鎖 ＤＮＡを合成するものである。ＤＮＡの相補鎖をアニールし続いて連結反応させ て所望の長さ及び配列の二本ｇ　ＤＮＡフラグメントを生成する。

アンチセンスＲＮ＾を発現する新規なベクターにおいては、以前は鋳型ＤＮＡ鎖 であったＤＮＡ鎖（ストランド）は暗号用（コード用）ストランドとなり、又は その逆であり得る。か（して新規なベクターはセルラーゼ遺伝子の配列に相補的 である塩基配列中にＲＮＡをエンコードするものである。かくして２本のＲＮＡ 鎖はそれらの塩基配列においてのみならずそれらの配向（５′〜３′）において も相補性である。

本発明の組換えＤＮＡ及びベクターは次の如く形成できる。転写用の所望の塩基 配列を含有する適当なりＮＡ供給源（例えばＴＣＥＬＢ６又はＭＣＥＬＥ２　） を制限酵素で処理して配列を切断する。別の場合には適当なりＮＡフラグメント は、合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いて適当なりＩＪＡ供給ｉｆ］！（ 例えばＴＣＥＬＢ６又はＭＣＥＬＥ２　）からポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ） により生成できる。

こうして得られたＤＮＡ鎖（ストランド）は、所望のプロモーター配列例えばカ リフラワーのモザイクウィルス３５Ｓプロモーター又はトマトのポリガラクツロ カーゼ遺伝子プロモーター配列（ＢｉｒｄらのＰｌａｎｔ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ 　Ｂｉｏ−１ｏｇｙ、ユし６５１〜６６２．１９８８）と所望のターミネータ− 配列（例えば細菌の−ｉ工倶狙以臘りし！コ旦鱈工虹ユ甜咀のツバリンシンター ゼ遺伝子の３′配列、ｎｏｓ　３　’末端）とを含有する第２のベクター中にク ローン化される（所望ならば逆の配向で）。

本発明によると、事情が要求するように構成プロモーター（例えばカリフラワー のモザイクウィルス３５Ｓ）と誘導性又は発生的に調節したプロモーター（例え ば成熟果実の特異的ポリガラクツロカーゼ遺伝子）との両方を使用することを提 案する。構成プロモーターを使用すると植物の全ての部分での機能に作用する傾 向があり：然るに組織特異性のプロモーターを使用することにより、機能はより 選択的に調節できる。即ち本発明を例えばトマト及びメロンに応用する際には、 ＰＧ遺伝子のプロモーター（Ｂｉｒｄらの前記文献、１９８８参照）を用いるの が都合良いと見出される。少なくともトマトにこのプロモーターを使用するとア ンチセンスＲＮＡの製造は熟成−特異性プロモーターの制御下にあるという利点 がある。即ちアンチセンスＲＮＡはその作用が必要とされる器官でのみ生産され る。使用し得る他のトマト成熟用−特異的プロモーターにはＥ８プロモーター（ Ｄｉｅｋｍａｎ　＆　ＦｉｓｃｈｅｒのＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ、７３３１５〜 ３３２０．１９８８）がある。

本発明のベクターを使用して所望に応じて植物を形質転換させることができ、か くして本発明の植物を形成できる。トマト及びメロンの如き双子葉植物は例えば ＢｅｖａｎのＮｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　且８７１１〜８ ７２１　（１９８４）により記載される如くアグロバクテリウム（Ａ　ｒｏｂａ ｃｔｅｒｉｕリーＴｉプラスミド技法によって形質転換させることができる。

か−る形質転換した植物は有性的に又は細胞培養により又は組織培養により生殖 させ得る。

植物細胞中のアンチセンスＲＮＡの作製程度は、プロモーター配列の適当な選択 により又は植物ゲノム中に誘導される本発明のＤＮＡ配列の複製（コピー）の個 数又は組込みの座位を選択することにより１ｉ［することができるにの様にして 完熱又は老化をより大きな又はより小さな程に改質することができる。

本発明の構造体を使用して、技術的に知られた種々の仕方で単子葉植物と双子葉 植物との両方の細胞を形質転換させ得る。多くの場合に、か−る植物細胞（特に 該細胞が双子葉植物の細胞である時）を培養して全植物を再生でき、続いて生殖 して遺伝子的に改質した植物の連続世代を与える。本発明の遺伝子的に改質した 植物の例は、トマトと同様に例えばマンゴ−１桃、リンゴ、ナシ、イナゴ、バナ ナ及びメロンの果実を包含する。か−る遺伝子的に改質した植物は、植物プロモ ーターの調節下で発現し得る他の外因性ＤＮＡ例えば本出願人の欧州特許出願第 ２７１，９８８号（米国特許出願第１１９，６１４号）に記載される如く他の果 実熟成酵素例えばポリガラクツロカーゼ又はペクチンメチルエステラーゼに対し てアンチセンスのＲＮＡを発現するＤＮＡを更に含有できる。

本発明を添附図面を参照しながら更に以下に記載する；第１図はそれぞれクロー ンＴＣＥＬＢ６（Ｓｅｑ　ＩＤ　Ｎｏ：１）及びＭＣＥＬＥ２（Ｓｅｑ　ＩＤ　 Ｎｏ：２）のトマト及びメロンセルラーゼ遺伝子の塩基配列を示す。

第２図はポリメラーゼ連鎖反応によりトマト及びメロンセルラーゼ遺伝子のフラ グメントの生成に使用したオリゴヌクレオチドを示す。

第３図はポリメラーゼ連鎖反応によりトマトセルラーゼ遺伝子のフラグメントの 生成用標注を示す。

第４図はトマトセルラーゼｃＤＮＡクローンランブダ（ｌａｍｂｄａ）ｅｅｌ− １（Ｓｅｑ　ＩＤ　Ｎｏ：３）の塩基配列を示す。

第５図は本発明のセルラーゼアンチセンスＲＮＡベクターの構成用湿性を示す。

次の実施例は本発明の詳細な説明する。

夫胤桝土 トマトセルラーゼ遺伝子のフラグメントの合成、クローン化及び特性決定 トマトセルラーゼ遺伝子のフラグメントをポリメラーゼ連鎖反応で生成した。反 応用の合成オリゴヌクレオチドプライマー（ＴＣＥＬＩＯ及びＴＣＥＬＩＩ　） はアボカドセルラーゼ（Ｔｕｃｋｅｒらの前記文献、１９８７）　といんげん切 断セルラーゼ（Ｔｕｃｋｅｒらの前記文献、１９８８　）との間の相同性領域か ら意図した（第２図）、、アボカドＤＮＡを用いてのＰＣＲ反応においては、こ れらのプライマーはＴｕｃｋｅｒら（１９８７）。

の塩基配列に基づいた２６６個の塩基対フラグメントを生成すると予期されるも のである。アニール化及び伸長に適当な条件を用いてトマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓ ｉｃｏｎ　ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍＭｉｌｌ　ｃｖ、　Ａ１１ｓａ　Ｃｒａｉｇ） から抽出したＤＮＡとのＰＣＲ反応（第３図）は大体３００個の塩基対のフラグ メントを生成した。このフラグメントをアガロースゲルから精製し、）１ｉｎｃ 　ＩＩで切断しておいたベクターＭ１３＋ｎｐｌＢ中にクローン化した。２１個 のクローンを微量滴定板に移送し、ナイロン膜（Ｈｙｂｏｎｄ　Ｎ−アメルシャ ム社）上で自己複製した。

この膜を４５℃で５ＸＳＳＰＥ、　０．２５％マーヘル（Ｍａｒｖｅ＋）、　０ ．０５％ＳＤＳ中で［３２Ｐ）標識したオリゴヌクレオチド丁ＣＥＬＩＯでハイ ブリド化し、５０°Ｃで２ＸＳＳＣ，Ｏ，，１％ｓｏｓテ洗浄した。

７個のクローンをＴＣＥＬＩＯにハイブリッド化した。ハイブリッド他用クロー ン（ＴＣＥＬＢ６）の１つのヌクレオチド配列を決定した（第１図）、このヌク レオチド配列はアボカドセルラーゼ遺伝子（Ｔｕｃｋｅｒらの前記文献１９８７ ）のヌクレオチド配列と有意な程の類似性を有した。

裏胤桝Ｉ メロンセルラーゼ遺伝子のフラグメントの合成、クローン化及び特性決定 トマトセルラーゼ遺伝子のフラグメントについて実施例１に記載したのと同様な 要領でメロンセルラーゼ遺伝子のフラグメントを生成し、クローン化し且つ配列 した。

同じＰＣＢプライマー（ＴＣＥＬＩＯ及びＴＣＥＬＩＩ）を使用してメロン（Ｃ ｕｃｕｍｆｓ　ｍｅｌｏ　Ｌ　ｃｖ、　Ｗｅｓｔｅｒｎ　５ｈｉｐｐｅｒ）から 抽出したＤＮＡから大体３００個の塩基対のフラグメントを生成した。このフラ グメントを、旧ｎｃＩＩで切断したＭ１３ｍｐ１８中にクローン化し且つ（３２ Ｐ）で標識化したＴＣＥＬＩＯでＡイブリント化した。１つのハイブリッド他用 クローン（ＭＣＥＬＥ２）のヌクレオチド配列を決定しく第１図）、これはトマ ト及びアボカドセルラーゼ遺伝子とを意な程の相同性を示した。

裏施拠１ トマトセルラーゼｃＤＮＡクローンの単離及び特性決定ハイブリッド化試験物（ ｐｒｏｂｅ）としてクローンＴＣＥＬＢ６の挿入体を使用して、市販されて入手 し得る成熟トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ　ｅｓｃｕｌｅｎｔｕＩＩＭｉｌ ｌ　ｃｖ　Ａｉ［ｓａ　Ｃｒａｉｇ）ｃＤＮＡライブラリーをスクリーンした。

１つのハイブリッド他用クローンを同定し且つ均質化するまで精製した。該クロ ーンのヌクレオチド配列を完全に決定した（第４図）。

該クローンは１４１５個の塩基対の挿入体を有し、アボカド配列（Ｔｕｃｋｅｒ らの前記文献）と有意な程の類似性を示した。

実１ｌｉ１ Ｐｃｔ？及びＣａＭＶ　３５Ｓプロモーターにより増幅した遺伝子フラグメント を有するトマト及びメロンセルラーゼアンチセンスＲＮＡベクターの構成 第５図に示した如くトマト又はメロンのセルラーゼ遺・伝子又はｃＤＮＡフラグ メントからクローン化した配列を使用してベクターを構成し得た。

１、ＴＣＥＬＢ６　（２２３ｂｐ　トマトセルラーゼ遺伝子）　−ｐＪＲＩＴｃ ｌ２、　ＭＣＥＬＥ２　（２２３ｂｐメロンセルラーゼ遺伝子）　−ｐＪＲ１阿 Ｃ１ｐ、ＴＲｌＴｃ１はＴＣＥＬＢ６　ＲＦ　ＤＮＡをＰｓｔＩで切断すること により試験管内で合成でき、次いで切断末端はＴ４　ＤＮＡポリメラーゼでフラ ッシュさせた。この反応からの２８３ｂｐフラグメントを次いで単離し、５ｒａ ａ　Ｉ及びＢａｍ旧で切断したｐＪＲｌ中にクローン化した。ｐＪＲｌ　（Ｓｗ ｆｔｈ　らのＮａｔｕｒｅ３３４．７２４〜７２６．１９８８）はＢ１ｎ１９　 （ＢｅｖａｎのＮｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ、　１２．８７１ １〜８７２１．１９８４）基質のベクターであり、これはＣａＭＶ　３５Ｓプロ モーターの制御下にアンチセンスＲＮＡの発現を可能とさせる。このベクターは ツバリンシンターゼ（ｎｏｓ）　３　’末端終結配列を包含する。

合成後に、ｐＪＲＩＴｃｌの正確な構造を有するベクターをＤＮＡ配列分析によ り同定する。

ベクターｐＪＲＩＭｃ１は、第５図に示した構成図式に従って、同様に形成した 。

１１拠工 Ｐｃｔ？及びトマトのポリガラクツロカーゼ遺伝子プロモーターにより単離した 遺伝子フラクションを有するトマト及びメロンのセルラーゼアンチセンスＲＮＡ ベクターの構成 実施例３に記載したトマト及びメロンの遺伝子フラグメントを同じ方法によって ベクターｐＪＲ２中にクローン化して次のクローンを得る： １　、　ＴＣＥＬＢ６　（２２３ｂｐ　トマトセルラーゼ遺伝子）　−ｐＪＲ２ Ｔｃ１２、門ＣＥＬＥ２　（２２３ｂｐメロンセルラーゼ遺伝子）　−ｐＪＲ２ ？Ｉｃ１ρＪＲ２はＢ１ｎ１９基質のベクターであり、トマトのポリガラクッロ カーゼプロモーターの制御下にアンチセンス配向八を発現し得る。このベクター はツバリンシンターゼ（ｎｏｓ）　３’末端終結配列を包含する（第４図参照） 。

裏施■旦 ＰＣＲ及びＣａＭＶ　３５５プロモーターにより単離した遺伝子フラグメントを 有するトマト及びメロンのセルラーゼセンスＲＮ＾ベクターの構成 実施例３に記載したトマト及びメロンの遺伝子フラグメントをセンス配向でｐＪ Ｒｌ中にクローン化して次のクローンを得る： １、ＴＣＥＬＢ６　（２２３ｂｐ　）マドセルラーゼ遺伝子）　−ｐＪＲＩＴｃ １ｓ２、ＭＣＥＬＥ２　（２２３ｂｐメロンセルラーゼ遺伝子）　−ｐＪＲ１門 Ｃｌ５ｐＪＲＩＴｃ１ｓはＴＣＥＬＢ６１？Ｆ　［ｌＮＡをＰｓｔＩ及びχｂａ ｒで切断することにより試験管内で合成でき、次いで切断した末端を７４　ＤＮ Ａポリメラーゼでフラッシュさせる。次いでこの反応からの２８３ｂｐフラグメ ントを単離させ、ｐＪＲｌのＨｉｎｃ　ＩＩ部位中にクローン化した。合成後に 、ＴＣＥＬＢ６配列をセンス配向で有するベクターをＤＮＡ配列分析により同定 する。

ベクターｐＪＲＩＭｃ１ｓも同様に形成する。

支旅医エ トマドセルラーゼｃＤＮへ挿入体を有するトマトのアンチセンス及びセンスＲＮ Ａベクターの構成トマトのセルラーゼｃＤＮＡクローン（ｌａｍｂｄａ　ｃｅｌ −１）をＥｃｏＲＩで切断してｃＤＮＡ挿入体を切出した。１４１５個の塩基対 フラグメントを単離し、切断末端を７４　ＤＮＡポリメラーゼでフラッシュさせ た。次いでこのフラグメントをｐＪＲｌの、Ｓｍａ１部位中にクローン化した。

合成後に、アンチセンス配向のｌａａｇｂｄａ　ｃｅｌ−１配列を有するベクタ ーをｐＣＲとＤＮＡとの両方の配列分析によ゛′肩定した。アンチセンス配向で セルラーゼｃＤＮＡ配列を含有する１種のクローンはｐＪＲＴ　ｃｅｌＡと呼ぶ 。

ベクターｐＪＲＴｃｅｌｓは同様な標注を使用することにより且つセンス配向で セルラーゼのｃＤＮＡ配列を有するクローンを同定することにより得られる。

１差■且 形質転換したトマト及びメロン植物の生成実施例４〜７に記載の如く形成したベ クターをアグロバクテリウムツメファシェンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　 ｔｕａ＋ｅｆａ−ｃｉｅｎｓ）　ＬＢＡ４４０４　（植物のバイオテクノロジス トには広く入手し得る微生物）に転移させしかもこれを用いてトマト及びメロン 植物を形質転換させる。トマトの草分節片の形質転換は標準の生化学記録書に従 かう（例えばＢｉｒｄらのＰｌａｎｔ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　 ＩＬ６５１〜６６２．１９８８）。

メロン植物も同様な方法により形質転換する。形質転換した植物は、抗生物質の カナマイシンを含をする培地上でそれらが生長する能力により同定された。植物 を再分化させ成熟するまで生長させた。成熟している果実はそれらの熱化特性に 対する改良について分析した。

０口ＯＣつ りへ■へ ００　Ｍ １へωヘ 一− マ Ｔｏｍａｔｏ／ｍｅｌｏｎ　ｇＤＮＡ　−ｃｅｌｌｕｌａｓｅ　ｇｅｎｅマ 要約書 果実の熱化挙動を改良するのに有用なりＮＡ構造体は、セルラーゼ又は同様な酵 素をエンコードする遺伝子の若干又は全てと相同性のＤＮＡ塩基配列を転写する のに定置された、植物中で作用する転写開始領域を含有してなり、前記の遺伝子 は構造体ＴＣＥＬＢ６及びＭＣＥＬＥ２の何れかによってエンコードしたＤＮＡ と実質的な相同性を示しているものである。また植物細胞及びか＼る構造体で形 質転換した植物。

国ｌａ！ＩＩ査報告 １ｍｗ、ｍｍ＋ａｌＡａ＠４（＠１−−ｓ−ＰＣＴ／ＧＢ　９１１００６１４国 際調査報告 ＧＢ　９１００６１４

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. １．セルラーゼをエンコードする遺伝子の若干又は全てと相同性のＤＮＡ塩基配 列を転写するのに定置された、植物中で作用する転写開始領域を含有してなるＤ ＮＡ構造体であって、前記の遺伝子は構造体ＴＣＥＬＢ６及びＭＣＥＬＥ２の何 れかによってエンコードしたＤＮＡと実質的な相同性を示している、ＤＮＡ構造 体。
2. ２．セルラーゼをエンコードするｍＲＮＡと実質的な相同性を示す塩基の実質的 な配列に相補的なＲＮＡをエンコードするＤＮＡ塩基配列を転写するのに定置さ れた、植物中で作用する転写開始領域を含有してなる特許請求の範囲１記載のＤ ＮＡ構造体。
3. ３．ＤＮＡ塩基配列はクローンＴＣＥＬＢ６及びＭＣＥＬＥ２の何れかから誘導 される特許請求の範囲１又は２に記載のＤＮＡ構造体。
4. ４．ＤＮＡ塩基配列はｃＤＮＡから誘導される特許請求の範囲１〜３の何れかに 記載のＤＮＡ構造体。
5. ５．特許請求の範囲１〜４の何れかに記載のＤＮＡ構造体で形質転換した植物細 胞。
6. ６．特許請求の範囲５に記載の細胞から再分化される遺伝子的に改質した植物又 はか、る植物の後代植物。
7. ７．他の点では同様な未改質の植物と比較すると、セルラーゼの発現が低下され ている特許請求の範囲６記載の植物。
8. ８．トマト又はメロン植物である特許請求の範囲６又は７記載の植物。
9. ９．特許請求の範囲６〜８の何れかに記載の植物の果実及び種子。
10. １０．セルラーゼ関連塩基配列でハイブリッド化してあるＤＮＡを含有するクロ ーンＴＣＥＬＢ６及びＭＣＥＬＥ２及びこれらから誘導したＤＮＡ構造体。