JP3349509B2 - Ｄｎａ構造体、細胞及びこれから誘導される植物 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本出願は新規なDNA構造体（DNA construct）、これを
含有する植物細胞及びこれから誘導される植物に関す
る。本出願は、特に、植物における遺伝子の発現（expr
ession）を抑制するためのアンチセンスRNA技術（antis
ense RNA technology）の使用に関する。

周知のごとく、細胞は蛋白質を製造するが、この蛋白
質の製造は、その蛋白質についての遺伝子のDNAを転写
してメッセンジャーRNA（mRNA）を生成させ、ついで、
このメッセンジャーRNAを（例えば、イントロンの除去
により）加工し（process）そして最後にリボソームに
より蛋白質に翻訳することによって行われる。翻訳は
“アンチセンスRNA"（“antisense RNA"）が細胞中に存
在することによって抑制され得る。“アンチセンスRNA"
という用語は、問題となるmRNAの塩基の配列に対して相
補的なRNA塩基配列を意味する：この“相補的な”とい
う用語は（3'〜5'センス（sense）において読まれる）
アンチセンスRNA塩基配列中の各塩基が、5'〜3'センス
において読まれるmRNA中の対応する塩基と対になること
ができること（ＧとＣ、ＡとＵ）を意味する。この抑制
は、RNAの二本の相補的な鎖（ストランド）の間で錯体
（complex）が形成され、蛋白質の形成が阻止されるこ
とによって生起するものと考えられる。この錯体がどの
ような作用を行うかは明らかではない：錯体は更に転
写、プロセッシング（processing）、輸送（transpor
t）又は翻訳を阻害するか又はmRNAを分解するか又はこ
れらの作用の二つ以上を行う。かかるアンチセンスRNA
は、関連する遺伝子［又はこれと実質的な相同（homolo
gy）を示すDNA塩基配列］のコード鎖（coding strand）
［鋳型鎖（template strand）に対立する］の後方部分
を転写するために配列されている適当なDNA構造体（DNA
construct）についての形質転換によって細胞内に生成
され得る。

特定の植物遺伝子の発現を低下させる（ダウンレギュ
レート）（downregulate）ためにこの技術を使用するこ
とは、例えば、ICIの欧州特許公開No 271988号（米国特
許出願第119614号に対応）に記載されている。遺伝子の
発現の減少により、植物の表現型（phenotype）に変化
が生ずる：この植物の表現型の変化は、全体的な可視の
表現型の差（grosss visible phenotype difference）
の水準で生ずる；例えば、ペチュニア（petunia）の花
弁におけるアントシアニンの産生が行われなくなり、着
色した花弁の代わりに無色の花弁が生ずる（van der kr
ol等、Nature,333,866−869,1988）；又、表現型の変化
は、より微妙な（subtle）生化学的な水準で生ずる；例
えば、トマトの果実の成熟中にポリガラクツロナーゼの
量の変化及びペクチンの脱重合の減少が生ずる（Smith
等、Nature,334,724−726,1988;Smith等、Plant Mol.Bi
ol,1990,369−379）。従って、アンチセンスRNAは植物
の遺伝子の発現のダウンレギュレーションを行うのに有
用であることが証明されている。

本発明は、二つの知見、即ち、従来知られていなかっ
た機能を有する既知の遺伝子がエチレンの生合成の経路
に関係があるという知見及びこの遺伝子に対するRNAア
ンチセンスはこの生合成経路（pathway）を切断し、エ
チレンの生成を減少させるのに有効であるという知見に
基づくものである。問題の遺伝子はHoldsworth等、Nucl
eic Acid Research,15,731−739,1987に開示されている
pTOM13中に（殆ど完全に）エンコードされている。

本発明によれば、植物によるエチレンの合成に関与す
る酵素をエンコードする遺伝子のDNA配列に相当するDNA
配列を含有する組換え体DNA構造体であって、上記DNA配
列は植物内で作動する転写開始領域によって先行されか
つ制御されており、その結果、上記構造体は植物細胞内
でRNAを生成することができかつそれによって前記酵素
の発現を減少させ、その結果として、植物内でのエチレ
ンの産生を抑制することができるものであり、また、上
記DNA配列はアンチセンス方向に配向されているもので
あり、かつ、下記の塩基配列を有するものである組換え
体DNA構造体が提供される： 本発明の他の要旨によれば、植物内で作動する転写開
始領域を含有するDNA構造体であって、この転写開始領
域はエチレンの生合成に関係する酵素をエンコードする
mRNAに対して実質的な相同性（homology）を示す塩基の
実質的な系列（run）と相補的なRNAをエンコードするDN
A塩基配列の転写のために設けられた転写開始領域であ
る、DNA構造体が提供される。エチレンの生合成に関係
する酵素をエンコードするmRNAは、pTOM13からのDNAか
ら誘導されたものであるか、又は、このDNAと完全に又
は部分的に相同性であるDNAから誘導されたものである
ことが好ましい。本発明には、本発明によるDNA構造体
を含有する植物細胞；これから誘導された、エチレンの
生成量の低い植物；及びかかる植物の種子も包含され
る。

植物内でのエチレンの生合成に関係する２つの主要な
酵素はACCシンターゼ及びACCオキシダーゼである。pTOM
13は後者をエンコードするDNAを含有するものと考えら
れる。このことが正しいか、正しくないかに関わりな
く、pTOM13は本発明に従ってエチレンの生成を抑制する
のに使用するためのDNAの有効な供給源であることは確
かである。本発明の発明者がその著者である、“Natur
e",1990の報文を参照せよ。

本発明の構造体はエチレンの生成を調整するために植
物中に挿入し得る。構造体の種類に応じて、植物の生命
の特定の段階を通じて或いは特定の段階において、エチ
レンの生成を増大させるか又は減少させ得る。一般的に
は、予測され得るごとく、エチレンの生成は、エチレン
の生成経路（ethylene pathway）に関係する、実質的に
完全に内在性の（endogeneous）mRNAと相同性のRNAを発
現する構造体のみによって促進される。より驚くべきこ
とは、完全遺伝子（complete gene）に対応するDNA塩基
配列より実質的に短い不完全DNA（incomplete DNA）塩
基配列を含有する構造体が、この構造体がセンスRNAを
発現するために配置されているか又はアンチセンスRNA
を発現するために配置されているかに関わりなしに、一
般的に、遺伝子の発現及び従ってエチレンの生成を抑制
することである。

低いエチレン生成性を示す植物は種々の有用な性質を
有する。その他の効果として、エチレンの減少は果実の
成熟；果実の軟質化；葉及び花の老化（senscence）；
及び果実、葉及び花の脱離（abscission）を遅延させる
のに利用し得る。

本発明のDNA構造体はアンチセンスRNA中への転写を行
わせるためには、少なくとも50塩基の長さの塩基配列か
らなることが好ましい。塩基配列に対する理論的な上限
値はない−塩基配列は、細胞によって製造される関連す
るmRNAの長さと同一の長さであり得る−が、一般的に
は、好都合なものであるためには、100〜1000塩基の長
さの塩基配列を使用することが適当であろう。かかる構
造体の調製は以下に詳述する。

本発明で使用するためのアンチセンスRNAの好ましい
供給源はクローンpTOM13によってエンコードされる遺伝
子に対して相同性を示すDNAである。

所望のアンチセンスDNAは、かかるDNAの適当な塩基配
列を制限酵素で切断し；ついで切断されたDNAを上流プ
ロモーター塩基配列と下流ターミネーター塩基配列とを
含有するベクター中にクローンすることによって得るこ
とができる；クローニングは切断DNA塩基配列が、この
塩基配列を切断するのに使用したDNA鎖内でのその方向
（orientation）について反転する（inverte）ように行
われる。

新しいベクターにおいては、以前には鋳型鎖（templa
te strand）であった鎖がコード鎖（coding strand）に
なるか又は以前にはコード鎖であった鎖が鋳型鎖にな
る。かくして、新しいベクターはpTOM13 mRNAの塩基配
列に相補的な塩基配列内でRNAを生成するであろう。従
って、２本のRNA鎖は、その塩基配列内においてだけで
はなしに、そのオリエンテーション（orientation）
（5'〜3'）内においても相補的である。

転写のためのDNA塩基配列の供給源としては、pTOM13
のごときcDNAクローンを使用することが好都合である。
pTOM13が生成するRNAを構造決定する（sequence）こと
から演繹されるごとき、pTOM13の塩基配列は第１図に示
されている。pTOM13は1989年７月６日にNational Colle
ctions of Industrial and Marine Bacteria（Aberdee
n）にNCIB 40162の寄託番号で寄託されている。別法と
して、pTOM13に類似するcDNAクローンは成熟しつつある
トマトのmRNAから、Salter等、Plant Molecular Biolog
y,５,137−147に記載の方法によって得ることができ
る。この方法においては、pTOM13によって生成されるmR
NAの全体又は実質的に全体についてコードする塩基配列
を得ることができる。かく得られたcDNAを制限酵素によ
って適当な長さのものに切断して使用し得る。

転写のための塩基配列についての他の供給源はエチレ
ンの生合成に関係する蛋白質をエンコードする適当な遺
伝子である。かかる遺伝子は、イントロンが存在すると
いう点で例えばpTOM13のcDNAと異なる。イントロンはmR
NA中に転写されない（転写されたとしても、後に切り落
とされる）。転写のための塩基配列の供給源としてかか
る遺伝子を使用した場合には、イントロン領域又はエク
ソン領域のいずれかを使用し得る。

本発明で使用するための遺伝子又はcDNAはトマト以外
の他の供給源、例えば、桃又はメロンのごとき成熟して
いる果実から単離し得る。この目的のためには、プロー
ブとしてpTOM13から誘導されたDNAを使用することが好
都合である。

転写を行うのに適当なDNA塩基配列を得るための別の
方法は、例えば、第１図を指針（guide）として使用し
て、適当な塩基から、又はGTOMAの公表されている塩基
配列（Holdsworth等、Nucleic Acids Research,15,1060
0,1987）から、最初から（ab initio）合成する方法で
ある。

本発明による組換え体DNA及びベクターは以下に述べ
るごとくして調製し得る。転写を行うのに望ましい塩基
配列を含有する適当なベクター（例えばpTOM13）を制限
酵素で処理して塩基配列を切り取る。かく得られたDNA
鎖を、所望のプロモーター塩基配列（例えば、CaMV35s
又はポリガラクツロナーゼ遺伝子プロモーター塩基配列
−Bird等,Plant Molecular Biology,11,651−662,198
8）と所望のターミネーター塩基配列（例えば、ノパリ
ン（nopaline）シンターゼ遺伝子の3'末端、nos 3'末
端）とを含有する第２のベクター中に（逆のオリエンテ
ーションで）クローンする。本発明によれば、環境から
の要求に応じて、構成プロモーター（constitutive pro
moter）（例えばCaMV）及び誘導性プロモーター（induc
ible promoter）又は発育的に調節されたプロモーター
（developmentally regulated promoter）［例えば、ポ
リガラクツロナーゼ遺伝子についてのプロモーター又は
脱離領域特異的プロモーター（abcission−zone−speci
fic promoter）又は花−特異的プロモーター（flower−
specific promoter）］の両者を使用することが提案さ
れる。構成プロモーターの使用により、エチレンによっ
て制御されるすべての機能が影響を受けるであろう：一
方、誘導性プロモーターの使用により、機能はより選択
的に制御されるであろう。かくして、本発明を例えばト
マトに適用する場合には、PG遺伝子（前記のBird等,198
8の文献参照）のプロモーターを使用することが好都合
であることが認められ得る。このプロモーターを使用す
ることは、少なくともトマトにおいては、アンチセンス
RNAの生成が成熟−特異的（ripening−specific）プロ
モーターの制御下にあるという利点を有する。かくし
て、エチレンの生成は果実の成熟（ripening）中におい
てだけ抑制され、他の発育段階においては抑制されない
であろう。使用しうる他の成熟−特異的プロモーターは
E8プロモーター（Diekman及びFischer,EMBO Journal、
７,3315−3320,1988）である。

本発明によるベクターは、所望の植物を形質転換して
本発明の植物を製造するのに使用し得る。トマトのごと
き双子葉植物を、例えばBevan（1984）Nucleic Acid Re
search,12,8711−8721に記載されるごとき、Tiプラスミ
ド技術によって形質転換し得る。かかる形質転換植物は
有性的に（sexually）又は細胞培養（cell culture）に
よって増殖させ（reproduce）得る。

植物細胞内でのアンチセンスRNAの生成の程度は、プ
ロモーター塩基配列を適当に選択することにより、或い
は、植物ゲノム中に導入される本発明のDNA塩基配列の
コピーの数又は組込み（intergation）の部位を選択す
ることにより制御し得る。この方法において、例えば、
熟成後のより長い期間又はより短い期間、トマトの軟化
を遅延させ得ることが証明され得る。

本発明の構造体は当業者に既知の種々の方法で単子葉
植物及び双子葉植物の両者の細胞を形質転換するのに使
用し得る。多くの場合、かかる植物細胞を培養して（特
に、植物細胞が双子葉植物の細胞である場合）全植物
（whole plant）を再生させ（regenerate）、ついでこ
れを生殖させて遺伝的に変性された（genetically modi
fied）連続世代（successive generation）を得ること
ができる。本発明の好ましい遺伝的変性植物は、トマト
の他に、マンゴー、桃、リンゴ、梨、バナナ及びメロン
のごとき果実を包含する更年性果実（climacteric frui
t）である。

前述したごとく、本発明で使用するためのアンチセン
スRNAの好ましい供給源は、クローンpTOM13によってエ
ンコードされる遺伝子と相同性を示すDNAである。pTOM1
3は赤色トマトDNAから単離されるcDNAから誘導される。
本発明者はこのDNAを生体外ハイブリッド−選択翻訳（i
n vitro hybrid−select translation）（この方法はSl
ater等、Plant Molecular Biology,５,137−147に記載
されている）によって特徴ずけそしてこのDNAは約35,00
0ドルトンの蛋白質をエンコードすることを示した。DNA
塩基配列分析はクローンが1370塩基の長さであることを
示した。このDNA塩基配列から誘導されたアミノ酸配列
のコンピュウター分析を使用した場合に、明確なリーダ
ー塩基配列（leader sequence）が検出されないので、
細胞質蛋白質をエンコードすると考えられる。しかしな
がら、蛋白質を液胞膜（tonoplast）又は液胞（vacuol
e）に当てる（direct）ためにどのような目的情報（tar
geting information）が要求されるかということが明ら
かには知られていないので、上記の蛋白質を細胞質蛋白
質と指定することは危険である（speculative）。

本発明者はpTOM13がコードするmRNAは、トマトの葉に
機械的傷害（mechanical wounding）を与えた後並びに
熟成中のトマトの果実において非常に迅速に誘導される
ことを認めた。傷害を与えた場合、傷害を与えてから１
時間後に、最大の発現が観察され、傷害を与えてから10
分という早い時期にmRNAは検出し得るまで増大した。３
時間後には、pTOM13 mRNAの水準は傷害を与える前の水
準まで減少した。トマトの果実においては、pTOM13 mRN
Aは、完全にオレンジ色になる熟成段階で（full orange
stage of ripening）最も強く発現した。ついで、mRNA
の水準は熟成している果実の生合成能力（biosynthetic
capacity）の一般的な減少に従って減少した。傷害果
実もpTOM13 mRNAを生成することによって応答した。し
かしながら、誘導の水準は変動する：この水準は緑色の
（green）傷害果実（wounded fruit）において最大であ
り、赤色の傷害果実においては実質的に存在しない。

pTOM13の遺伝子コピー数は種々の方法で分析されてい
る。pTOM13のゲノム位置（genomic location）はRFLPマ
ッピングを使用して同定されている（Mutschler等,Theo
retical and Applied Genetics,76,285−292,1988）：
トマトのゲノム中の２つの位置はpTOM13と相同の配列を
担持している。遺伝子は３−４員からなる小さな多重遺
伝子族（multigene family）として存在することもサザ
ン法（Southern blotting）によって示されている。こ
の遺伝子族の幾つかのメンバーはクローンされており、
これらのメンバーの３つの配列は決定されている（Hold
sworth等,Plant Molecular Biology,11,81−88,198
8）。GTOM17はpTOM13と相同であり、傷害葉（wounded l
eaf），傷害果実中及び果実熟成時に発現される。GTOMA
はpTOM13と密接に関連しているが同一ではなく、傷害葉
内で発現される。第３の遺伝子、GTOMBは恐らくは偽遺
伝子（pseudogene）である。これらのクローンの塩基配
列分析、DNA内での探索及び蛋白質データー分析は任意
の既知の蛋白質との相同を示さなかった。

pTOM13遺伝子族の構造と発現についてのこれらの多数
の情報は既知であるが、従来、このクローンの生化学的
な作用は明らかにされていない。このクローンがエチレ
ンの生合成又は代謝に関係し得ることは示唆されている
（Holdsworth等,Nucleic Acids Rsearch,15,731−739,1
987;Smith等,Planta,168,94−100,1986）。このことは
エチレンの生合成と、pTOM13の発現の際の発生との間の
明らかな関係から示唆されたものである。しかしなが
ら、従来、この遺伝子族によってエンコードされる蛋白
質の生化学的な作用についての根拠は示されていない。
かかる根拠はpTOM13に密接に関連するクローン、即ち、
E8を単離した他の研究者によっても得られていない（De
ikman等,EMBO Journal,７,3315−3320,1988）。

本発明を導く研究において、本発明者は減少したpTOM
13の発現を示すトランスジェニック（transgenic）トマ
ト植物の表現型を決定するためにアンチセンスRNAを使
用した。以下に述べる実験の結果（これは予期し得なか
った結果である）は、pTOM13に対してのアンチセンスRN
Aの使用によりエチレンの生成が減少することを示して
いる。このことは傷害葉組織、傷害未熟成果実及び熟成
中のトマトの果実の組織において示され得る。

一次形質転換細胞（primary transformant）において
観察されるエチレンの減少は50〜95％の間で変動した。
かかる形質転換細胞は、典型的には、一方だけの対立遺
伝子内に構造体（construct）を含有しているので、植
物を自植させ（selfing）、両者の対立遺伝子内に構造
体を含有する後代を選別することにより、エチレンの生
成が更に減少した、或いは、エチレンの生成が完全に抑
制された植物を得ることができる。従って、本発明によ
れば、所望に応じて、ある範囲のエチレンの生成性を有
する植物を製造し得る。

本発明はトマト果実の熟成及び軟化並びに多数の開花
植物の生長、開花及び結実を抑制するのに使用し得る。
植物内のエチレンの水準の減少により、かかる現象、特
に、色素の形成速度並びに細胞壁の変化の誘発を含め
て、結実及び果実の軟化が遅延するであろう。これらの
変化の効果として、果実の熟成時間と貯蔵期間が長くな
るであろう。多数の果実（例えば、トマト、マンゴー、
モモ、リンゴ、ナシ、バナナ及びメロン）において見ら
れる過熱（overripening）を回避し得る。葉の老化を遅
延させ、より長い時間、緑色のままの葉菜類（leaf veg
etable）（例えば、レタス、キャベツ、ホウレンソウ）
を創製することが期待される。花弁の老化及び脱離を遅
延させることも期待される。このことは、園芸産業にお
いて利用することができ、より長い保存寿命を有する切
り花（cut flower）（バラ、菊、カーネーション、チュ
ウリップ、ラッパズイセン等）及び鉢植植物（pot plan
t）が得られる。

本発明の構造体はエチレンの生成を減少させることに
より形質転換植物において作用するので、植物にエチレ
ンを供給することにより、その効果を、随意に、完全に
又は部分的に反転させ得る。現在においては、果実（例
えば、トマト、バナナ）は熟成を防止するために冷凍下
に販売地まで輸送し、そこでエチレンを供給することに
より、熟成させている。本発明による果実は冷凍を必要
としないであろう（その結果、エネルギーと費用が節約
され、オゾン層が保護される）。エチレンは遊離のガス
として、或いはエテフォン（ethephon）のごときエチレ
ン生成性化合物の形で供給し得る。

エチレンは植物の傷害応答（plant wounding respoms
e）に関連するので、本発明の構造体を含有する植物は
傷害に対する新規な応答性（response）を有することが
予測される。上記の植物は、例えば、傷害をより受けや
すいことが考えられ得る（しかしながら、本発明者によ
っては未だ形質転換トマトにおいてはかかる差異は観察
されていない）。傷害に応答して生ずるエチレンの生成
が少ないことにより、微生物学的な攻撃の活性がより小
さいものとなり、その結果、貯蔵時の品質が改善され
る。

本発明を添付図面を参照して更に説明する。

第１図はクローンpTOM13の塩基配列を示す。

第2a図は本発明によるpTOM13アンチセンスベクターpB
ASの構造を図解的に例示する。

第2b図は本発明による、切頭（truncated）pTOM13ア
ンチセンス植物形質変換ベクターpBASCの構造を図解的
に例示する。

第３図は対照トマト植物及びトランスジェニックトマ
ト植物（傷害葉及び非傷害葉）の組織における、pTOM13
センス及びアンチセンスRNAの発現を検出するノザン法
ハイブリダイゼーションのオートラジオグラフを示す。

第4a〜4c図は対照トマト植物及びトランスジェニック
トマト植物においてエチレンの生成が時間と共にどのよ
うに変化するかを示す（第4a図：傷害葉；第4b図：傷害
未塾果実；第4c図：非傷害熟成果実）。

第５図は実施例３からのトランスジェニックトマト植
物の自植（selfing）により得られた５本のF1トマト植
物のサザンブロット（Southern blot）のオートラジオ
グラフである。

以下の実施例は本発明を例示するものである。

実施例 １ pTOM13の塩基配列の正確な同定 pTOM13の塩基配列は既に発表されている（Holdsworth
等,Nucleic Acids Research,15,731−739,1987）。アン
チセンスRNAベクターの構成の際に、本発明者はpTOM13
の5'末端と3'末端の間でのかなりの塩基配列の相同を同
定した。従って、本発明者は熟成果実において見出ださ
れるpTOM13 mRNAの塩基配列の決定を行った。RNA塩基配
列の決定法（RNA sequencing）によって決定された、pT
OM13 RNAをエンコードするcDANクローンの正確な塩基配
列は第１図に示されている。

以前に発表された塩基配列はmRNAの5'末端で異なるこ
とを見出だしたことは重要である。これはアンチセンス
RNAベクターの構成において特に有用な領域であり得る
ので、正確なRNA/cDNA塩基配列を同定したことは特に重
要である。

実施例 ２ pTOM13アンチセンスRNAベクターの構成。

２組のベクターを構成した。

1.完全なpTOM13 cDNA（pBAS）を使用。

2.最後の200塩基を除去したpTOM13 cDNA（pBASC）を使
用。

これらの断片（fragment）を、CaMV 35Sプロモーター
の制御下でアンチセンスRNAを発現させるpDH51,pUCをベ
ースするベクター中に別々にクローンした。このベクタ
ーはCaMV 3'末端塩基配列を使用する。pTOM13塩基配列
の方向（orientation）は、cDNAの塩基配列とベクター
の塩基配列の境界（border）の制限酵素地図とDNA塩基
配列の決定法を使用して決定した。これらのベクターの
構造を確認した後、発現モジュール（expression modul
e）を標準的なクローニングプロトコールを使用してBin
19（Bevan,Nucleic Acids Research,12,8711−8721,198
4）中に移転（transfer）させた。

第2a図はpTOM13−アンチセンス植物形質転換ベクタ
ー、pBASの構成をより詳細に示すものである。1.3kb cD
NAインサート（insert）をpTOM13からのPst 1によって
切断しついでpDH51のPst 1部位中に連結（ligate）した
（工程１）。プロモーター（pr）についてアンチセンス
方向（antisense orientation）にあるインサートを有
する発現単位（expression unit）を、植物形質転換バ
イナリーベクター、Bin 19の左側及び右側のＴ−DNA境
界の間の多重クローニング部位に転移させて（工程
２）、pBASを形成させた。

第2b図は切頭（truncated）pTOM13−アンチセンス植
物形質転換ベクター、pBASCの構成をより詳細に示すも
のである。1.3 kb cDNAインサートをpTOM13からのPst 1
によって切断しついでpGEM3（Promega Biotech Mediso
n,USA）のPst 1部位中に連結（ligate）した（工程
１）。200bp Acc 1断片をcDNAの3'末端から削除した
（工程２）。切頭（truncated）cDNAを含有するPst 1−
Xbal断片を,pDH51の35Sプロモーターとターミネーター
の間にアンチセンス方向に連結した（工程３）。この
“発現単位”を植物形質転換バイナリーベクター、Bin
19の左側及び右側のＴ−DNA境界の間の多重クローニン
グ部位に転移させて（工程４）、pBASCを形成させた。

第2a図及び第2b図においては下記の略号を使用した:
P,Pst 1;A,ACC 1;L,T4 DNAリガーゼ;H.Hind III;E,ECO
R1;k.E.coli DNAポリメラーゼのクレノウ（klenow）断
片;X,Xval;Pv,Pvul1;pr,35Sプロモーター;tr,35Sターミ
ネーター;lb,rb,左及び右Ｔ−DNA境界反復体（border r
epeat）;S,Sma 1;mcs,多重クローニング部位。

実施例 ３ 形質転換植物の形成 ベクターをアグロバクテリウム（Agrobacterium）LBA
4044（植物バイオテクノロジー研究者に広く利用されて
いる微生物菌株）に転移させ、形質転換実験に使用し
た。トマトとタバコの、それぞれ、茎断片及び葉部分の
形質転換を標準的なプロトコールに従って行った。形質
転換植物をそのカナマイシン−含有媒体上での生長能力
によって同定した。

実施例 ４ 形質転換トマト植物の分析 I.形質転換植物のDNA分析 形質転換植物の葉からDNAを抽出した。このDNAのサザン
法による分析により、多数の植物中にアンチセンス遺伝
子が存在することが確認された。

II.形質転換植物の葉の試料の分析 II.1.RNA分析 形質転換植物の葉からRNAを抽出し、pTOM13に対する
鎖特異的（strand−specific）プローブを用いてプロー
ブした。その結果、アンチセンスRNAがトランスジェニ
ック植物内で合成されたことが示された。

傷害を与えた後、かなりの量のpTOM13 mRNAが蓄積さ
れた。形質転換植物においてはこの蓄積は抑制された。
約50〜80％のpTOM13 mRNAの減少が観察された。このこ
とはノザンハイブリダイゼーション分析により測定し
た。通常の植物とトランスジェニック植物の傷害葉にお
けるpTOM13 mRNAの量とアンチセンスRNAの量とを示す、
第３図に例示されている。非傷害葉及び傷害葉（第３図
においては、それぞれ、ｌ及びwlで示されている）から
RNAを抽出し；アガロースゲル電気泳動により分別し；
ハイブリダイゼーション膜上にブロットし；ついでセン
ス特異的プローブ（sense−specific probe）（第３図
におけるＡ）又はアンチセンス特異的プローブ（antise
nse−specific probe）（第３図におけるＢ）でチャレ
ンジ（challenge）した。

II.2.エチレンの測定 トマトの （ａ）傷害葉 （ｂ）傷害未熟成果実 （ｃ）非傷害熟成果実 について、アルミナカラムを使用する標準的ガスクロマ
トグラフィーによりエチレンの生成を測定した。傷害ト
ランスジェニック植物においては、野生型対照と比較し
た場合、80％又はそれ以上のエチレンの発生の減少が生
じた。第４図は通常トマト植物及びトランスジェニック
トマト植物においてエチレンの発生が時間の経過と共に
どのように変化するかを示す（第4a図：傷害葉；第4b
図：未熟成果実の果皮から切断した傷害部分；第4c図：
非傷害熟成果実）。

III.形質転換トマト果実の分析 1.RNA分析 通常のトマト果実と形質転換トマト果実（実施例３か
ら得られたもの）から異なる熟成段階でRNAを抽出し
た。pTOM13 mRNAの水準をノザンハイブリダイゼーショ
ン分析によって測定した。この（単一の）実験において
は、アンチセンス植物の熟成果実においてはpTOM13 mRN
Aは検出されなかった。

2.エチレンの分析 本発明のアンチセンス構造体を含有する形質転換トマ
ト植物（実施例３からのもの）からの果実は、果実の熟
成中に存在するエチレンの水準における80％又はそれ以
上の減少を示した。第4c図は熟成果実（通常及びアンチ
センス）において、エチレンの生成が時間と共に変化す
ることを示している。エチレンの生成はアンチセンス果
実において減少する。

実施例 ５ ホモ接合体型（homozygous）アンチセンス遺伝子トマト
植物の同定 実施例３からの最初の形質転換細胞の自植後代（self
ed progeny）を発生させ、pTOM13から得られたDNAをプ
ローブとして使用して、サザン法（Southernblot analy
sis）によりホモ接合体型植物を同定した。第５図はア
ンチセンス−pTOM13植物形質転換ベクターpBASC（実施
例２からのもの）を用いて形質転換した親植物からのFl
世代（Fl generation）からのDNAの、サザン法ゲノムハ
イブリダイゼーション（genomic Southern hybridisati
on）のオートラジオグラフである。DNAを葉から抽出
し、ECO R1で切断し、アガロースゲル電気泳動で分別
し、ハイブリダイゼーション膜上にブロットしついでラ
ンダムプライム（random prime）32p−標識pROM13 cDNA
インサートプローブを用いてチャレンジした。得られた
結果は１（トラックa,e）、２（トラックb,d）及び０
（トラックｃ）pTOM13−アンチセンス遺伝子を有する植
物を示した。分子量マーカー（molecular weight marke
r）は第３図の左側にキロベース（kirobase）で示され
ている。従って、トラックｂ及びｄの植物は、通常のメ
ンデルの法則に従って分離している（segregate）と思
われる、アンチセンス構造体についてホモ接合体的であ
ると考えられる。

ホモ接合体的トマト植物は1990年７月10日に、スコッ
トランド、アバデイーン、AB2,1RY、マーシャルドライ
ブ通り,National Collection of Industrial and Marin
e BacteriaにNCIB 40307の寄託番号で寄託された。

フロントページの続き (72)発明者 ライセツト，グラントレー，ウオルター イギリス国．エルイー12・９エスエル. ラフバロ．シエプスヘツド．ノースウツ ド・ドライブ．49 (56)参考文献 特開 昭62−296880（ＪＰ，Ａ) Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ ｓ．，Ｖｏｌ．15，Ｎｏ．24（1987) ｐ．10600 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ ｅｑ ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (2)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】植物によるエチレンの合成に関与する酵素
   をエンコードする遺伝子のDNA配列に相当するDNA配列を
   含有する組換え体DNA構造体であって、上記DNA配列は植
   物内で作動する転写開始領域によって先行されかつ制御
   されており、その結果、上記構造体は植物細胞内でRNA
   を生成することができかつそれによって前記酵素の発現
   を減少させ、その結果として、植物内でのエチレンの産
   生を抑制することができるものであり、また、上記DNA
   配列はアンチセンス方向に配向されているものでありか
   つ下記の塩基配列を有するものである組換え体DNA構造
   体：
2. 【請求項２】請求項１に記載の組換え体DNA構造体が形
   質転換によりそのゲノム中に安定に組込まれているトマ
   ト植物。