JPH04506602A - Ｄｎａ構造体、細胞及びこれから誘導される植物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 １−２．　トマトの細胞である、請求の範囲第１０項に記載の植物細胞。

１３、請求の範囲第１０項〜第１２項のいずれかにに記載の細胞を含有する植物 。

１４、更年性の果実を特徴する請求の範囲第１３項に記載の植物。

１５、トマト、ナシ又はメロンである、請求の範囲第１３項に記載の植物。

１６、切断した場合に、改善された保持品質を有する、観賞用植物である、請求 の範囲第１３項に記載の植物。

１７．バラ、菊、チュウリップ、ラッパズイセン又はカーネーシヨンである、請 求の範囲第１６項に記載の植物。

１８、葉菜野菜類である、請求の範囲第１３項に記載の植物。

１９、請求の範囲第１３項〜第１８項のいずれかにに記載の植物の種子、球茎又 は切穂（ｃｕｔｔｉｎｇ）。

２０、９ＴＯＭ１３に対するｅ＋ＲＮＡを発現させるのに適合する構造体を特徴 する請求の範囲第１９項に記載の種子。

２１、スコツトランド、アバディーン所在のＮａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏ１１ｅｃｔ ｉｏｎ　ｏｆ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　ａｎｄ　Ｍａｒｉｎｅｓａｃｔｅｒｉａ にＮＣＩＢ　４０３０７の寄託番号で寄託サレタトマト種子からの後代である請 求の範囲第２０項に記載の種子−二及びこの種子から生長させた植物及び果実。

特表千４−５０６６０２　（２） 明細書 ＤＮＡ構造体、細胞及びこれから誘導される植物本出願は新規なりＮＡ構造体（ ＤＮＡ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）　、コれを含有する植物細胞及びこれから誘導さ れる植物に関する。本出願は、特に、植物における遺伝子の発現（ｅｘｐｒｅｓ ｓｉｏｎ）を抑制するためのアンチセンスＲＮＡ技術（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　Ｒ ＮＡ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）の使用に関する。

周知のごとく、細胞は蛋白質を製造するが、この蛋白質の製造は、その蛋白質に ついての遺伝子のＤＮＡを転写してメツセンジャーＲＮＡ　（ｉＲＮＡ）を生成 させ、ついで、このメツセンジャーＲＮ＾をく例えば、イントロンの除去により ）加工しくｐｒｏｃｅｓｓ＞そして最後にリポソーム４こより蛋白質に翻訳する ことによって行われる。

翻訳は“アンチセンスＲＮＡ　＋（“ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　ＲＮＡ　−）が細胞 中に存在することによって抑制され得る。“アンチセンスＲＮＡ”という用語は 、問題となる１ＲＮＡの塩基の配列に対して相補的なＲＮＡ塩基配列を意味する ：この”相補的な”という用語は（３′〜５°センス（ｓｅｎｓｅ）において読 まれる）アンチセンスＲＮＡ塩基配列中の各塩基が、５゛〜３゛センスにおいて 読まれるｗ＋ＲＮＡ中の対応する塩基と対になることができること（Ｇと０１＾ とＵ）を意味する。この抑制は、ＲＮＡの二本の相補的な鎖（ストランド）の間 て錯体（ｃｏａ＋ｐｌｅｘ）が形成され、蛋白質の形成が阻止されることによっ て生起するものと考えられる。この錯体がどのような作用を行うかは明らかでは ない、錯体は更に転写、プロセッシング（ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）、輸送（ｔｒ ａｎｓｐｏｒｔ）又は翻訳を阻害するか又はｇｌＲＮＡを分解するか又はこれら の作用の二つ以上を行う。かかるアンチセンスＩ？Ｎ人は、関連する遺伝子［又 はこれと実質的な相同（ｈｏｅ＋ｏｌｏｇｙ）を示すＤＮＡ塩基配列コのコード 鎖（ｃｏｄｉｎｇ　５ｔｒａｎｄ）　［鋳型鎖（ｔｅｍｐｌａｔｅ　５ｔｒａｎ ｄ）に対立する］の後方部分を転写するために配列されている適当なりＮＡ構造 体（ＤＮＡ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）についての形質転換によって細胞内に生成さ れ得る。

特定の植物遺伝子の発現を低下させる（ダウンレギニレート）　（ｄｏｗｎｒｅ ｇｕｌａｔｅ）ためにこの技術を使用するこそは、例えば、ＩＣＩの欧州特許公 開Ｎｏ　２７１９８８号（米国特許田願第０９６１４号に対応）に記載されてい る。

遺伝子の発現の減少により、植物の表現型（ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）に変化か生ず る：この植物の表現型の変化は、全体的な可視の表現型の差（ｇｒｏｓｓｓ　ｖ ｉｓｉｂｌｅ　ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｄｉｆｒｅｒｅｎｃｅ　）の水準で生ずる： 例えば、ペチュニア（ｐｅｔｕｎｆａ）の花弁におけるアントシアニンの産生が 行われなくなり、着色した花弁の代わりに無色の花弁が生ずる（ｖａｎ　ｄｅｒ 　ｋｒｏｌ等、Ｎａｔｕｒｅ、　３３３　、８６６−８６９゜１９８８）　；又 、表現型の変化は、より微妙な（ｓｕｂｔｌｅ）生化学的な水準で生ずる；例え ば、トラトの果実の成熟中にポリガラクツロナーセの量の変化及びペクチンの脱 型台の減少か生ずる（Ｓｇ＋　ｉ　ｔ　ｈ等、Ｎａｔｕｒｅ、　３３４　、７２ ４−７２６．１９８１１；　Ｓｍｔｔｈ等、Ｐｌａｎｔ　Ｍａｔ、Ｂｉｏｌ　、 １９９０゜３６９＝３７９）。従って、アンチセンスＲＮＡは植物の遺伝子の発 現のダウンレギュレーションを行うのに有用であることが証明されている。

本発明は、二つの知見、即ち、従来知られていなかった機能を有する既知の遺伝 子がエチレンの生合成の経路に関係かあるという知見及びこの遺伝子に対するＲ ＮＡアンチセンスはこの生合成経路（ｐａｔｈｗａｙ）を切断し、エチレンの生 成を減少させるのに有効であるという知見に基つくものである。問題の遺伝子は Ｈｏｌｄｓｗｏｒｔｈ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、１５ ．７３１−７３９゜１９８７に開示されているｐＴＯＭ１３中に（殆ど完全に） エンコードされている。

本発明によれば、エチレンの生合成に関係する酵素をエンコードする（ｅｎｃｏ ｄｅ）遺伝子の幾つか又は全てと相同の（ｈｏｒＡｏｌｏｇｏｕｓ）ＤＮＡ塩基 配列を含有するＤＮＡ構造体（ＤＮＡ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）であって、上記Ｄ ＮＡ塩基配列は植物内で作動する（ｏｐｅｒａｔｉｖｅ）転写開始領域によって 先行されており、従って、ＤＮＡ構造体は植物細胞内でＲＮＡを生成することが できるものである、ＤＮＡ構造体が提供される。

本発明の他の要旨によれば、植物内で作動する転写開始領域を含有するＤＮＡ構 造体であって、この転写開始領域はエチレンの生合成に関係する酵素をエンコー ドするｍＲＮＡに対して実質的な相同性（ｈｏｆｆｌｏ　ｌ　ｏｇｙ）を示す塩 基の実質的な系列（ｒｕｎ）と相補的なＲＮＡをエンコードするＤＮＡ塩基配列 の転写のために設けられた転写開始領域である、ＤＮＡ構造体が提供される。エ チレンの生合成に関係する酵素をエンコードするｍＲＮＡは、９７０Ｍ１３から のＤＮＡから誘導されたものであるか、又は、このＤＮＡと完全に又は部分的に 相同性であるＤＮＡから誘導されたものであることが好ましい。本発明には、本 発明によるＤＮＡ構造体を含有する植物細胞；これから誘導された、エチレンの 生成量の低い植物、及びかかる植物の種子も包含される。

植物内でのエチレンの生合成に関係する２つの主要な酵素はＡＣＣシンターゼ及 びＡＣＣオキシダーゼである。

ｐＴＯＭ−１３は後者をエンコードするＤＮＡを含有するものと考えられる。こ のことが正しいか、正しくないかに関わりなく、９７０Ｍ１３は本発明に従って エチレンの生成を抑制するのに使用するためのＤＮＡの有効な供給源であること は確かである。本発明の発明者かその著者である、“Ｎａｔｕｒｅ”、１９９０ の報文を参照せよ。

本発明の構造体はエチレンの生成を調整するために植物中に挿入し得る。構造体 の種類に応じて、植物の生命の特定の段階を通して或いは特定の段階において、 エチレンの生成を増大させるか又は減少させ得る。−特表平４−５０６６０２　 （３） 般的には、予測され得るごとく、エチレンの生成は、エチレンの生成経路（ｅｔ ｈｙｌｅｎｅ　ｐａｔｈｗａｙ）に関係する、実質的に完全に内在性の（ｅｎｄ ｏｇｅｎｅｏｕｓ）　ｍＲＮＡと相同性のＲＮＡを発現する構造体のみによって 促進される。より驚くべきことは、完全遺伝子（ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ｇｅｎｅ） に対応するＤＮＡ塩基配列より実質的に短い不完全ＤＮＡ（ｉｎｃｏｍｐｌｅｔ ｅ　ＤＮＡ）　塩基配列を含有する構造体か、この構造体がセンスＲＮ＾を発現 するために配置されているか又はアンチセンスＲＮ＾を発現するために配置され ているかに関わりなしに、一般的に、遺伝子の発現及び従ってエチレンの生成を 抑制することである。

低いエチレン生成性を示す植物は種々の有用な性質を有する。その他の効果とし て、エチレンの減少は果実の成熟；果実の軟質化；葉及び花の老化（ｓｅｎｓｃ ｅｎｃｅ）：及び果実、葉及び花の脱離（ａｂｓｃｉｓｓｉｏｎ）を遅延させる の４こ利用し得る。

本発明のＤＮＡ構造体はアンチセンスＲＮＡ中への転写を行わせるためには、少 なくとも５０塩基の長さの塩基配列からなることが好ましい。塩基配列に対する 理論的な上限値はない一塩基配列は、細胞によって製造される関連するｍＲＮＡ の長さと同一の長さであり得る−が、一般的には、好都合なものであるためには 、１００〜１０００塩基の長さの塩基配列を使用することが適当てあろう。かか る構造体の調製は以下に詳述する。

本発明で使用するためのアンチセンスＲＮＡの好ましい供給源はクローンｐＴＯ Ｍ［によってエンコードされる遺伝子に対して相同性を示すＤＮＡである。

所望のアンチセンスＤＮＡは、かかるＤＩＡの適当な塩基配列を制限酵素で切断 し：ついで切断されたＤＮＡを上流プロモーター塩基配列と下流ターミネータ− 塩基配列とを含有するベクター中にクローンすることによって得ることかできる ；クローニングは切断ＤＮＡ塩基配列が、この塩基配列を切断するのに使用した ＤＮＡ鎖内てのその方向（ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）について反転する（ｉｎｖ ｅｒｔｅ）ように行われる。

新しいベクターにおいては、以前には鋳型鎖（ｔｅｍｐｌａｔｅ　５ｔｒａｎｄ ）であった鎖がコード鎖（ｃｏｄｊｎｇｓｔｒａｎｄ）になるか又は以前にはコ ード鎖であった鎖が鋳型鎖になる。かくして、新しいベクターはｐＴＯＭＬ３ｍ ＲＮ＾の塩基配列に相補的な塩基配列内てＲＮＡを生成するであろう。従って、 ２本のＲＮＡ鎖は、その塩基配列内においてたけてはなしに、そのオリエンテー ション（ｏｒｉｅｎｔａｔｊｏｎ）　（５°〜３゛）内においても相補的である 。

転写のためのＤＮＡ塩基配列の供給源としては、９７０Ｍ１３のごときｃＤＮＡ クローンを使用することが好都合である。ｐＴＯＭＬ３が生成するＲＮＡを構造 決定する（ｓｅｑｕｅｎｃｅ）ことから演鐸されるごとき、９７０Ｍ１３の塩基 配列は第１図に示されている。９７０Ｍ１３は１９８９年７月６日１こＮａｔｉ ｏｎａｌ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎｓ　ｏｒＩｎｄｕｓｔｒｉａｌ　ａｎｄＭａｒ ｉｎｅ　Ｂａｃｔｅｒｉａ（Ａｂｅｒｄｅｅｎ＞にＮＣＩＢ　４［）１６２の寄 託番号て寄託されている。別法として、９７０Ｍ１３に類似するｃＤＮＡクロー ンは成熟しつつあるトマトのｍＲＮＡから、５ａｌｔｅｒ等、Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ １ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、　５．１３７−１４７１．：記載の方法によ って得ることができる。この方法においては、９７０Ｍ１３によって生成される ｍＲＮＡの全体又は実質的に全体についてコードする塩基配列を得ることができ る。かく得られたｃＤＮＡを制限酵素によって適当な長さのものに切断して使用 し得る。

転写のための塩基配列についての他の供給源はエチレンの生合成に関係する蛋白 質をエンコードする適当な遺伝子である。かかる遺伝子は、イントロンが存在す るという点で例えば９７０Ｍ１３のｃＤＮＡと異なる。イントロンはｍＲＮＡ中 に転写されない（転写されたとしても、後に切り落とされるン。転写のための塩 基配列の供給、源としてかかる遺伝子を使用した場合には、イントロン領誠又は エクソン領域のいずれかを使用し得る。

本発明で使用するための遺伝子又はｃＤＮＡはトマト以外の他の供給源、例えば 、桃又はメロンのごとき成熟している果実から単離し得る。この目的のためには 、プローブとしてｐＴＯＭＬ３から誘導されたＤＮＡを使用することが好都合で ある。

転写を行うのに適当なりＮＡ塩基配列を得るための別の方法は、例えば、第１図 を指針（ｇｕｉｄｅ）として使用して、適当な塩基から、又はＧＴＯＭＡの公表 されている塩基配列（Ｈｏｌｄｓｖｏｒｔｈ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　 Ｒｅ５ｅａｒｃｈ。

１５．１０６００．１９８７＞から、最初から（ａｂ　１ｎｉｔｉｏ）合成する 方法である。

本発明による組換え体ＤＮＡ及びベクターは以下に述べるごとくして調製し得る 。転写を行うのに望ましい塩基配列を含有する適当なベクター（例えばｐＴＯＭ １３）を制限酵素で処理して塩基配列を切り取る。かく得られたＤＮＡ鎖を、所 望のプロモーター塩基配列（例えば、ＣａＭＶ３５ｓ又はポリガラクツロナーゼ 遺伝子プロモーター塩基配列−〇ｉｒｄ等、Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　 Ｂｉｏｌｏｇｙ、　ｉｔ　。

６５１−６６２．１９８８）と所望のターミネータ−塩基配列く例えば、ツバリ ン（ｎｏｐａ［ｊｎｅ）ンンターゼ遺伝子の３°末端、ｎｏｓ　３’末＃）とを 含有する第２のベクター中にく逆のオリエンテーションて）クローンする。　本 発明によれば、環境からの要求に応じて、構成プロモーター（ｃｏｎｓｔｉｔｕ ｔｉｖｅ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ）（例えばＣａＭＶ）及び誘導性プロモーター（ｉ ｎｄｕｃｉｂｌｅ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ）又は発育的に調節されたプロモーター（ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｌｙ　ｒｅｇｕｌａｔｅｄｐｒｏ＋ｎｏｔｅｒ）　 ［例えば、ポリガラクツロナーゼ遺伝子についてのプロモーター又は脱離領域特 異的プロモーター（ａｂｃｊｓｓｉｏｎ−ｚｏｎｅ−ｓｐｅｃｉｆ’ｉｃ　ｐｒ ｏｍｏｔｅｒ）又は花−特異的プロモーター（ｆｌｏｗｅｒ−ｓｐｅｃｉＮｃ　 ｐｒｏｍｏｔｅｒ）コの両者を使用することが提案される。構成プロモーターの 使用により、エチレンによって制御されるすべての機能が影響を受けるであろう ニ一方、誘導性プロモーターの使用により、機能はより選択的に制御されるであ ろ特表平４−５０６６０２　（４） う。かくして、本発明を例えばトマトに適用する場合には、ＰＧ遺伝子（前記の Ｂｉｒｄ等、１９８ｇの文献参ｆＨＡ）ノプロモーターを使用することが好都合 であることか認められ得る。このプロモーターを使用することは、少なくともト マトにおいては、アンチセンスＲＮＡの生成か成熟−特異的（ｒｉｐｅｎｉｎｇ −ｓｐｅｃｉｒｉｃ）プロモーターの制御下にあるという利点を有する。かくし て、エチレンの生成は果実の成熟（ｒｉｐｅｎｉｎｇ）中においてたけ抑制され 、他の発育段階においては抑制されないであろう。

使用しうる他の成熟−特異的プロモーターはＥ８プロモーター（Ｄｉｅｋａ＋ａ ｎ及びＦｆｓｃｈｅｒ、ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ、７　。

３３１５−３３２０．１９８８）である。

本発明によるベクターは、所望の植物を形質転換して本発明の植物を製造するの に使用し得る。トマトのごとき双子葉植物を、例えばＢｅｖａｎ（１９８４）　 Ｎｕｃｌｅｉｃ＾ｃＬｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　１２．１１７１１−８７２１に 記載されるごとき、Ｔｉプラスミド技術によって形質転換し得る。かかる形質転 換植物は有性的に（ｓｅｘｕａｌ　ｌｙ）又は細胞培養（ｃｅｌｌｃｕｌｔｕｒ ｅ）によって増殖させ（ｒｅｐｒｏｄｕｃｅ）得る。

植物細胞内でのアンチセンスＲＮＡの生成の程度は、プロモーター塩基配列を適 当に選択することにより、或いは、植物ゲノム中に導入される本発明のＤＮＡ塩 基配列のコピーの数又は組込み（ｆｎｔｅｒｇａｔｌｏｎ）の部位を選択するこ とにより制御し得る。この方法において、例えば、熟成後のより長い期間又はよ り短い期間、トマトの軟化を遅延させ得ることが証明され得る。

本発明の構造体は当業者に既知の種々の方法で単子葉植物及び双子葉植物の両者 の細胞を形質転換するのに使用し得る。多くの場合、かかる植物細胞を培養して （特に、植物細胞が双子葉植物の細胞である場合ン全植物（ｗｈｏｌｅ　ｐｌａ ｎｔ）を再生させ（ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅ＞　、ついでこれを生殖させて遺伝的 に変性された（ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ　ｍｏｄｉｆ’１ｅｄ）連続世代（ｓｕ ｃｃｅｓｓ　ｉｖｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）を得ることができる。本発明の好ま しい遺伝的変性植物は、トマトの他に、マンゴ−１桃、リンゴ、梨、バナナ及び メロンのごとき果実を包含する支竿性果実（ｃｌｉｍａｃｔｅｒｉｃ　ｆｒｕｉ ｔ）である。

前述したごとく、本発明で使用するためのアンチセンスＲＮＡの好ましい供給源 は、クローンｐＴＯＭ１３によってエンコードされる遺伝子と相同性を示すＤＮ Ａである。

ｐＴＯＭ−Ｌ３は赤色トマトＤＮＡから単離されるｃＤＮＡから誘導される。本 発明者はこのＤＮＡを生体外ハイブリッド−１３７−１４７に記載されている） によって特徴すけそしてこのＤＮＡは約３５，０００ドルトンの蛋白質をエンコ ードすることを示した。ＤＮＡ塩基配列分析はクローンが１３７０塩基の長さで あることを示した。このＤＮＡ塩基配列から誘導されたアミノ酸配列のコンビュ ウター分析を使用した場合に、明確なリーダー塩基配列（ｌｅａｄｅｒｓｅｑｕ ｅｎｃｅ）か検出されないので、細胞質蛋白質をエンコードすると考えられる。

しかしながら、蛋白質を液胞膜（ｔｏｎｏｐｌａｓｔ）又は液胞（ｖａｃｕｏｌ ｅ）に当てる（ｄｉｒｏｃｔ）ためにどのような目的情報（ｔａｒｇｅｔ　ｉｎ ｇｉｎｆｏｒｍａｔ　１ｏｎ）が要求されるかということか明らかには知られて いないので、上記の蛋白質を細胞質蛋白質と指定することは危険である（ｓ　ｐ ｅｃｕ　ｌ　ａｔ　１ｖｅ）。

本発明者はｐＴＯＭ１３がコードする１ＩＩＲＮＡは、トマトの葉に機械的傷害 （ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ　ｗｏｕｎｄｉｎｇ）を与えた後並びに熟成中のトマト の果実において非常に迅速に誘導されることを認めた。傷害を与えた場合、傷害 を与えてから１時間後に、最大の発現が観察され、傷害を与えてから１０分とい う早い時期にｌｌｌＲＮＡは検出し得るまで増大した。３時間後には、ｐＴＯＭ １３　ｍＲＮＡの水準は傷害を与える前の水準まで減少した。　トマトの果実に おいては、ｐＴＯＭ１３　ｍＲＮＡは、完全にオレンジ色になる熟成段階で（ｆ ’ｕｌｌ　ｏｒａｎｇｅ　ｓｔａｇｅ　ｏｆ　ｒｉｐｅｎｉｎｇ）最も強く発現 した。ついて、ｌｌｌＲＮＡの水準は熟成している果実の生合成能力（ｂｉｏｓ ｙｎｔｈｅｔｉｃ　ｃａｐａｃｉｔｙ）の一般的な減少に従って減少した。傷害 果実もｐＴＯＭ１３１ＩＩＲＮＡを生成することによって応答した。しかしなが ら、誘導の水準は変動する。この水準は緑色の（ｇｒｅｅｎ）傷害果実（ｗｏｕ ｎｄｅｄ　ｆｒｕｊｔ）において最大であり、赤色の傷害果実においては実質的 に存在しない。

ｐＴＯＭ１３の遺伝子コピー数は種々の方法で分析されてイル。ｐＴＯＭ１３の ケノム位置（ｇｅｎｏｍｉｃ　１ｏｃａｔｉｏｎ）はＲＦＬＰマツピングを使用 して同定されている（Ｍｕｔｓｃｈｌｅｒ等。

Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、　７６ ．２８５−２９２゜１９８ｇ）　トマトのゲノム中の２つの位置はｐＴＯＭ１３ と相同の配列を担持１７ている。遺伝子は３−４員からなる小さな多重遺伝子族 （ｍｕｌｔｉｇｅｎｅ　ｒａａｌｉｌｙ）として存在することもサザン法（Ｓｏ ｕｔｈｅｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇ）によって示されている。この遺伝子族の幾つ かのメンバーはクローンされており、これらのメンバーの３つの配列は決定され ている（Ｈｏｌｄｓｗｏｒｔｈ等、Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌ ｏｇｙ。

１１．８１−８８．１９８８）。０７０Ｍ１７はｐＴＯＭ　１３と相同であり、 傷害葉（ｗｏｕｎｄｅｄ　１ｅａｆ）、傷害果実中及び果実熟成時に発現される 。ＧＴＯＭＡはｐＴＯＭ１３と密接に関連しているか同一ではなく、傷害葉内で 発現される。第３の遺伝子、ＧＴＯＭＢは恐らくは偽遺伝子（ｐｓｅｕｄｏｇｅ ｎｅ）である。これら功クローンの塩基配列分析、ＤＮＡ内での探索及び蛋白質 データー分析は任意の既知の蛋白質との相同を示さなかった。

ｐＴＯＭ　１３遺伝子族の構造と発現についてのこれらの多数の情報は既知であ るが、従来、このクローンの生化学的な作用は明らかにされていない。このクロ ーンがエチレンの生合成又は代謝に関係し得ることは示唆されている（Ｈｏｌｄ ｓｗｏｒｔｈ等、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｓｅａｒｃｈ。

１５．７３１−７３９．１９８７；Ｓｍ１ｔｈ等、ＰＩａｎｔａ、　１６８．９ ４−１００．１９８６）。このことはエチレンの生合成と、ｐＴＯＭ１３の発現 の際特表平４−５０６６０２　（５） の発生との間の明らかな関係から示唆されたものである。しかしなから、従来、 この遺伝子族によってエンコードされる蛋白質の生化学的な作用についての根拠 は示されていない。かかる根拠はｐＴＯＭ１３に密接に関連するクローン、即ち 、Ｅ８を単離した他の研究者によっても得られティない（Ｄｅｉｋｍａｎ等、Ｅ ＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ、　７　。

３３１５−３３２０．１９８８）。

本発明を導く研究において、本発明者は減少したｐＴＯＭ１３の発現を示すトラ ンスジェニック（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ）トマト植物の表現型を決定するために アンチセンスＲＮＡを使用した。以下に述べる実験の結果（これは予期し得なか った結果である）は、ｐＴＯＭ１３に対してのアンチセンスＲＮＡの使用により エチレンの生成が減少することを示している。このことは傷害葉組織、傷害未熟 成果実及び熟成中のトマトの果実の組織において示され、得る。

一次形質転換細胞（ｐｒｉ＠ａｒｙ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔ）において観察 されるエチレンの減少は５０〜９５％の間で変動した。

かかる形質転換細胞は、典型的には、一方だけの対立遺伝子内に構造体（ｃｏｎ ｓｔｒｕｃｔ）を含有しているので、植物を０植させ（ｓｅｌｆｉｎｇ）　、両 者の対立遺伝子内に構造体を含有する後代を選別することにより、エチレンの生 成が更に減少した、或いは、エチレンの生成が完全に抑制された植物を得ること ができる。従って、本発明によれば、所望に応じて、ある範囲のエチレンの生成 性を有する植物を製造し得る。

本発明はトマト果実の熟成及び軟化並びに多数の開花植物の生長、開花及び結実 を抑制するのに使用し得る。植物内のエチレンの水準の減少により、かかる現象 、特に、色素の形成速度並びに細胞壁の変化の誘発を含めて、結実及び果実の軟 化が遅延するであろう。

これらの変化の効果として、果実の熟成時間と貯蔵期間が長くなるであろう。多 数の果実（例えば、トマト、マンゴ−、モモ、リンゴ、ナシ、バナナ及びメロン ）において見られる過熟（ｏｖｅｒｒｉｐｅｎｉｎｇ）を回避し得る。

葉の老化を遅延させ、より長い時間、緑色のままの葉菜類（ｌｅａｆｖｅｇｅｔ ａｂｌｅ）（例えば、レタス、キャベツ、ホウレンソウ）を創製することが期待 される。花弁の老化及び脱離を遅延させることも期待される。このことは、園芸 産業において利用することができ、より長い保存寿命を有する切り花（ｃｕｔ　 ｒｌｏｖｅｒ）（バラ、菊、カーネーション、チュウリップ、ラッパズイセン等 ）及び鉢植植物（ｐｏｔ　ｐｌａｎｔ）が得られる。

本発明の構造体はエチレンの生成を減少させることにより形質転換植物において 作用するので、植物にエチレンを供給することにより、その効果を、随意に、完 全に又は部分的に反転させ得る。現在においては、果実（例えば、トマト、バナ ナ）は熟成を防止するために冷凍下に販売地まで輸送し、そこでエチレンを供給 することにより、熟成させている。本発明による果実は冷凍を必要としないであ ろう（その結果、エネルギーと費用が節約され、オゾン層か保護される）。エチ レンは遊離のガスとして、或いはエテフオン（ｅｔｈｅｐｈｏｎ）のこときエチ レン生成性化合物の形で供給し得る。

エチレンは植物の傷害応答（ｐｌａｎｔ　ｗｏｕｎｄｉｎｇｒｅｓｐｏＩｌｌｓ ｅ）に関連するので、本発明の構造体を含有する植物は傷害に対する新規な応答 性（ｒｅｓｐｏｎｓｅ）を有することが予測される。上記の植物は、例えば、傷 害をより受けやすいことが考えられ得る（しかしながら、本発明者によっては未 た形質転換トマトにおいてはかかる差異は観察されていない）。傷害に応答して 生ずるエチレンの生成か少ないことにより、微生物学的な攻撃の活性かより小さ いものとなり、その結果、貯蔵時の品質が改善される。

本発明を添付図面を参照して更に説明する。

第１図はクローンｐＴＯＭ１３のの塩基配列を示す。

第２ａ図は本発明によるｐＴＯＭ１３アンチセンスベクター　ｐＢＡＳの構造を 図解的に例示する。

第２ｂ図は本発明による、切頭（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）ｐＴＯＭ１３アンチセン ス植物形質変換ベクターｐＢＡＳＣの構造を図解的に例示する。

第３図は対照トマト植物及びトランスジェニックトマト植物（Ｉ害葉及び非傷害 葉）の組織における、ｐＴＯＭ１３センス及びアンチセンスＲＮ＾の発現を検出 するノザン法ハイブリダイゼーションのオートラジオグラフを示す。

第４ａ〜４０図は対照トマト植物及びトランスジェニックトマト植物においてエ チレンの生成が時間と共にどのように変化するかを示す（第４ａ図：傷害葉；第 ４ｂ図　傷害末塾果実；第４Ｃ図：非傷害熟成果実）第５図は実施例３からのト ランスジェニックトマト植物の０植（ｓｅｌｆｉｎｇ）により得られた５本のＦ １トマト植物のササンプロット（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　ｂｌｏｔ）のオートラジオ グラフである。

以下の実施例は本発明を例示するものである。

実施例　１ ｐＴＯＭ　１３の塩基配列の正確な同定ｐＴＯＭ１３の塩基配列は既に発表され ている（Ｈｏ１．ｄｓｗｏｒｔｈ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａ ｒｃｈ、１５，７３１−７３９゜１９８７）。アンチセンスＲＮＡベクターの構 成の際に、本発明者は９７０Ｍ１３の５′末端と３゛末端の間でのかなりの塩基 配列の相同を同定した。従って、本発明者は熟成果実において見出たされる９７ ０Ｍ１３　ｍＲＮＡの塩基配列の決定を行った。ＲＮＡ塩基配列の決定法（ＲＮ Ａ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）によって決定された、９７０Ｍ１３　ＲＮＡをエン コードするｃＤＮＡクローンの正確な塩基配列は第１図に示されている。

以前に発表された塩基配列はｍＲＮへの５゛末端で異なる特表平４−５ｏｓ６ｏ ２（６） ことを見出たしたことは重要である。これはアンチセンスＲＮＡベクターの構成 において特に有用な領域であり得るので、正確なＲＮＡ／ｃＤＮＡ塩基配列を同 定したことは特に重要である。

実施例　２ ｐＴＯＭ１３アンチセンスＲＮＡベクターの構成。

２組のベクターを構成した。

１、完全なｐＴＯＭｌｇ　ｃＤＮＡ（ｐＢＡＳ）を使用。

２、最後の２００塩基を除去した９７０Ｍ１３　ｃＤＮＡ（ｐＢＡＳＣ）を使用 。

これらの断片（ｆｒａｇｍｅｎｔ）を、ＣａＭＶ　３５Ｓプロモーターの制御下 てアンチセンスＲＮＡを発現させるｐＤＨ５１。

ｐｕｃをベースするベクター中に別々にクローンした。

このベクターはＣａＭＶ　３°末端塩基配列を使用する。

ｐＴＯＭ１３塩基配列の方向（ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）は、ｃＤＮＡの塩基配 列乏ベクターの塩基配列の境界（ｂｏｒｄｅｒ）の制限酵素地図とＤＮＡ塩基配 列の決定法を使用して決定した。これらのベクターの構造を確認した後、発現モ ジュール（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｇ＋ｏｄｕｌｅ）を標準的なりローニングブ ロトコールを使用してＢ１ｎ１９　（Ｂｅｖａｎ、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１２．８７１１−８７２１．１９８４）中に移転（ｔｒａｎ ｓｆｅｒ）させた。

第２ａ図は９７０Ｍ１３−アンチセンス植物形質転換ベクター、ｐＢＡＳの構成 をより詳細に示すものである。１．３ｋｂ　ｃＤＮＡインサート（Ｉｎ５ｅｒｔ ）をｐＴＯＭ　１３からのＰｓｔ　１によって切断しついてｐＤＨ５１のＰｓｔ 　Ｌ部位中に連結（ｌ　ｉｇａｔｅ）　した（工程１）。プロモーター（ρ「） についてアンチセンス方向（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）に あるインサートを有する発現単位（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｕｎｉｔ）を、植物 形質転換バイナリ−ベクター、Ｂｉｎ　１９の左側及び右側のＴ−ＤＮＡ境界の 間の多重クローニング部位に転移させて（工程２＞　、ｔ）ＲＡＳを形成させた 。

第２ｂ図は切頭（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）９７０Ｍ１３−アンチセンス植物形質転 換ベクター、ｐＢＡＳＣの構成をより詳細に示すものである。１．３　ｋｂ　ｃ ＤＮＡインサートを９７０Ｍ１３からのＰｓｔ　ｌによって切断しついてｐＧＥ Ｍ３　（ＰｒｏｍｅｇａＢｉｏｔｅｃｈ　Ｍｅｄｉｓｏｎ、ＵＳＡ）のＰｓｔ　 １部位中に連結（Ｉ　ｉｇａｔｅ）したく工程１〉。２００ｂｐ　Ａｃｅ　１断 片をｃＤＮＡの３゛末端から削除したく工程２）。切頭（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ） 　ｃＤＮＡを含有するＰｓｔ　１−Ｘｂａｌ断片を、　ｐＤＦ１５１の３５３プ ロモーターとターミネータ−の間にアンチセンス方向に連結した（工程３）。こ の“発現単位”を植物形質転換ノλイナリーヘクター、Ｂｔｎ　１９の左側及び 右側のＴ−ＤＮＡ境界の間の多重クローニング部位に転移させてく工程４）、＋ ］ＢＡＳＣを形成させた。

第２ａ図及び第２ｂ図においては下記の略号を使用した：　Ｐ、Ｐｓｔ　１；　 Ａ、＾ＣＣ１；Ｌ、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ；　Ｈ，Ｈｉｎｄｌｌｌ；Ｅ、ＥＣＯ Ｒ１；に、Ｅ、Ｃｏ１ｔ　ＤＮＡポリメラーゼのフレノウ（ｋｌｅｎｏｗ）断片 ；　Ｘ、Ｘｖａｌ：Ｐｖ、Ｐｖｕｌｌ；ｐｒ、３５Ｓプロモーター　；　ｔｒ、 ３５Ｓターミネータ−；　ｌｂ、ｒｂ、左及び右Ｔ−ＤＮＡ境界反復体（ｂｏｒ ｄｅｒ　ｒｅｐｅａｔ）：Ｓ、Ｓｍａ　ｌ；ｌｌｌ’ｃｓ、多重クローニング部 位。

実施例　３ 形質転換植物の形成 ベクターをアゲＯバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＬＩ３Ａ４０４ ４（植物バイオテクノロジー研究者に広く利用されている微生物菌株）に転移さ せ、形質転換実験に使用した。トマトとタバコの、それぞれ、茎断片及び葉部分 の形質転換を標準的なプロ！・コールに従って行った。形質転換植物をそのカナ マイシンー含有媒体上での生長能力によって同定した。

実施例　４ 形質転換トマト植物の分析 １、形質転換植物のＤＮＡ分析 形質転換植物の葉からＤＮＡを抽出した。このＤＮＡのサザク法による分析によ り、多数の植物中にアンチセンス遺伝子が存在することか確認された。

＋＋　形質転換植物の葉の試料の分析 ＋１．１．　ＲＮＡ分析 形質転換植物の葉からＲＮＡを抽出し、９７０Ｍ１３に対する鎖特異的（ｓｔｒ ａｎｄ−ｓｐｅｃｉ　ｆｉｃ）プローブを用いてプローブした。その結果、アン チセンスＲＮＡかトランスジェニック植物内で合成されたことが示された。

傷害を与えた後、かなりの量の９７０Ｍ１３　ｍＲＮＡが蓄積された。形質転換 植物においてはこの蓄積は抑制された。約５０〜８０％のｐＴＯＭ１３　ｍＲＮ Ａの減少が観察された。

このことはノサンハイブリダイゼーション分析により測定した、通常の植物とト ランスジェニック植物の傷害葉におけるｐＴＯＭ１３　ＩＩＩＲＮ＾の量とアン チセンスＲＮＡの量とを示す、第３図に例示されている。非傷害葉及び傷害葉（ 第３図においては、それぞれ、■及びｗｌて示されている）からＲＮＡを抽出し ；アガロースゲル電気泳動により分別し；ハイブリダイゼーション膜上にプロッ トし二ついでセンス特異的プローブ（ｓｅｎｓｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｐｒｏｂ ｅ）（第３図におけるＡ）又はアンチセンス特異的プローブ（ａｎｔｉｓｅｎｓ ｅ−ｓｐｅｃｉｒｉｃ　ｐｒｏｂｅ）　（第３図におけるＢ）てチャレンジ（ｃ ｈａｌｌｅｎｇｅ）　した。

＋１．２．エチレンの測定 トマトの （ａ）傷害葉 （Ｉｌ））傷害未熟成果実 （ｃ）非傷害熟成果実 について、アルミナカラムを使用する標準的ガスクロマトグラフィーによりエチ レンの生成を測定した。傷害トランスジェニック植物においては、野生型対照と 比較した場合、８０％又はそれ以上のエチレンの発生の減少が生じた。第４図は 通常トマト植物及びトランスジェニックトマト植物においてエチレンの発生が時 間の経過と共にどのように変化するかを示す（第４ａ図傷害葉：第４ｂ図：未熟 成果実の果皮から切断した傷特表平４−５０６６０２　（７） 害部分：第４Ｃ図、非傷害熟成果実）。

ＩＩ＋、形質転換トマト果実の分析 １、ｌ？ＮＡ分析 通常のトマト果実と形質転換トマト果実（実施例３から得られたちの）から異な る熟成段階てＲＮＡを抽出した。ｐＴＯＭ１３　ｍＲＮＡの水準をノザンハイブ リダイゼーション分析によって測定した。この（単一の）実験においては、アン チセンス植物の熟成果実においてはｐＴＯＭＬ３　ｒＡＲＮＡは検出されなかっ た。

２、エチレンの分析 本発明のアンチセンス構造体を含有する形質転換トマト植物（実施例３からのも の）からの果実は、果実の熟成中に存在するエチレンの水準における８０％又は それ以上の減少を示した。第４Ｃ図は熟成果実（通常及びアンチセンス）におい て、エチレンの生成が時間と共４こ変化することを示している。エチレンの生成 はアンチセンス果実において減少する。

実施例　５ ホモ接合体型（ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ）アンチセンス遺伝子トマト植物の同定 実施例３からの最初の形質転換細胞の０植後代（ｓｅｌｆｅｄ　ｐｒｏｇｅｎｙ ）を発生させ、ｐＴＯＭ　１３から得られたＤＮＡをプローブとして使用して、 サザン法（Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ　ａｎａｌｙｓｉｓ）によりホモ接合体型 植物を同定した。

第５図はアンチセンス−ｐＴＯＭＬ３植物形質転換ベクターｐＢＡＳＣ（実施例 ２からのもの）を用いて形質転換した親植物からのＰｉ世代（ＦＬ　ｇｅｎｅｒ ａｔｉｏｎ）からのＤＮＡの、サザン法ケノムハイブリダイゼーション軸ｅｎｏ ｍｉｃＳｏｕｔｈｅｒｎ　ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ）のオートラジオグラフ である。ＤＮＡを葉から抽出し、ＥＣＯＲ１で切断し、アガロースゲル電気泳動 て分別し、ハイブリダイゼーション膜上にプロットしついでランダムプライム（ ｒａｎｄｏｍｐｒｉｍｅ）３２ｐ−標識ｐＲＯＭ１３　ｃＤＮＡインサートプロ ーブを用いてチャレンジした。得られた結果は１（トラックａ。

ｅ）、２（トラックｂ、ｄ）及びＯ（トランクＣ）　ｐＴＯＭＬ３−アンチセン ス遺伝子を有する植物を示した。分子量マーカー（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｗｅｉ ｇｈｔ　ｍａｒｋｅｒ）は第３図の左側にキロベース（ｋｉｒｏｂａｓｅ）で示 されている。従って、トラックｂ及びｄの植物は、通常のメンデルの法則に従っ て分離している（ｓｅｇｒｅｇａｔｅ）と思われる、アンチセンス構造林につい てホモ接合体的であると考えられる。

ホモ接合体的トマト植物は１９９０年７月１０日に、スコツトランド、アバディ ーン、ＡＢ２．ＩＲＹ　、マーシャルドライブ通り、　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏ １１ｅｃｔｉｏｎ　ｏｒＩｎｄｕｓｔｒｉａｌａｎｄ　Ｍａｒｉｎｅ　Ｂａｃｔ ｅｒｉａにＮＣＩＢ　４０３０７の寄託番号で寄託された。

ＦＩＧ　、Ｉ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｐＴＯＭ１３−一一〒−−−−−−〒 −−− Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｆ　ｊＧ　、　３１、　ｗ、１．　１． 　ｗ、１ Ｔ１ｍｅ　ａｆｔｅｒ　ｃｕｔｔｌｎｇ　ｄｌｓｋｓ　（ｈｏｕｒｓ）階工五： 会’；ｅｐｏ槽？３’：ｌよ、ｒ…°１°ｇ　ｆｒｕｉｔ　ｏｒ°０１止１８° ０Ｄａｙｓ　ｆｒｏｍ　５ｔａｒｔ　ｏｆ　ｃｏｌｏｕｒ　ｃｈａｎｇｅｂｃｄ ｅ 国際調査報告 一１ＩＩ呻１１１−＋ｌ拳１＾＠１ｍ１ｌｌ＊’１ＮｏＰＣＴ／ＧＢ９０１０１ ０７２国際調査報告

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. １．エチレンの生合成に関係する酵素をエンコードする遺伝子の幾つか又は全て と相同のＤＮＡ塩基配列を含有するＤＮＡ構造体であって、上記ＤＮＡ塩基配列 は植物内で作動する転写開始領域によって先行されており、従って、ＤＮＡ構造 体は植物細胞内でＲＮＡを生成することができるものである、ＤＮＡ構造体。
2. ２．植物内で作動する転写開始領域を含有するＤＮＡ構造体であって、この転写 開始領域はエチレンの生合成に関係する酵素をエンコードするｍＲＮＡに対して 実質的な相同性を示す塩基の実質的な系列と相補的なＲＮＡをエンコードするＤ ＮＡ塩基配列の転写のために設けられた転写開始領域である、請求の範囲第１項 に記載のＤＮＡ構造体。
3. ３．エチレンの生合成に関係する酵素はＡＣＣシンターゼ及びＡＣＣオキシダー ゼである、請求の範囲第１項又は第２項に記載のＤＮＡ構造体。
4. ４．エチレンの生合成に関係する酵素をエンコードするｍＲＮＡは、ｐＴＯＭ１ ３からのＤＮＡから誘導されたものであるか、又は、このＤＮＡと完全に又は部 分的に相同であるＤＮＡから誘導されたものである、請求の範囲第１項又は第２ 項に記載のＤＮＡ構造体。
5. ５．第１図に示される塩基配列と相同のＤＮＡを含有する、請求の範囲第１項〜 第４項のいずれかにに記載のＤＮＡ構造体。
6. ６．植物内で作動する転写開始領域は構成プロモーターである、請求の範囲第２ 項に記載のＤＮＡ構造体。
7. ７．構成プロモーターはＣａＭＶ３５Ｓである、請求の範囲第６項に記載のＤＮ Ａ構造体。
8. ８．植物内で作動する転写開始領域は誘導性の又は発育的に調節されたプロモー ターである、請求の範囲第２項に記載のＤＮＡ構造体。
9. ９．プロモーターはポリガラクツロナーゼ遺伝子についてのプロモーターである 、請求の範囲第８項に記載のＤＮＡ構造体。
10. １０．請求の範囲第１項〜第９項のいずれかにに記載の構造体で形質転換された 植物細胞。
11. １１．マンゴー、モモ、リンゴ、ナシ、バナナ又はメロンの細胞である、請求の 範囲第１０項に記載の植物細胞。
12. １２．トマトの細胞である、請求の範囲第１０項に記載の植物細胞。
13. １３．請求の範囲第１０項〜第１２項のいずれかにに記載の細胞を含有する植物 。
14. １４．更年性の果実を結実する、請求の範囲第１３項に記載の植物。
15. １５．トマト、ナシ又はメロンである、請求の範囲第１３項に記載の植物。
16. １６．切断した場合に、改善された保持品質を有する、観賞用植物である、請求 の範囲第１３項に記載の植物。
17. １７．バラ、菊、チュウリップ、ラッパズイセン又はカーネーションである、請 求の範囲第１６項に記載の植物。
18. １８．葉菜野菜類である、請求の範囲第１３項に記載の植物。
19. １９．請求の範囲第１３項〜第１８項のいずれかにに記載の植物の種子、球茎又 は切穂（Ｃｕｔｔｉｎｇ）。
20. ２０．ｐＴＯＭ１３に対するｍＲＮＡを発現させるのに適合する構造体を含有す る、請求の範囲第１９項に記載の種子。
21. ２１．スコットランド、アバディーン所在のＮａｔｉｏｎａｌＣｏｌｌｅｃｔｉ ｏｎｏｆＩｎｄｕｓｔｒｉａｌａｎｄＭａｒｉｎｅＢａｃｔｅｒｉａにＮＣＩＢ ４０３０７の寄託番号で寄託されたトマト種子からの後代である請求の範囲第２ ０項に記載の種子；及びこの種子から生長させた植物及び果実。