JP2009522564A - 軽減した傷誘導性表面変色を示す植物を選抜するためのスクリーニング法ならびにそれにより得られる植物および植物部分 - Google Patents
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Abstract
Description
a)植物の集団またはその集団の植物の部分を用意すること、
b)スクリーニング対象の植物または植物部分および対照の植物または植物部分に損傷表面を作り出すこと、
c)損傷表面をインキュベートして、表面内部または表面上に変色を起こさせること、
d)植物または植物部分の内部または表面の損傷表面変色を観察すること、
e)スクリーニング対象の植物または植物部分の内部または表面で観察される損傷表面変色を、対照の植物または植物部分の表面または内部で観察される変色と比較して、変色を示さないか、または対照の植物または植物部分に比べ軽減している変色を示す植物または植物部分を同定すること
を含む。
1.植物の変異体集団、詳細には突然変異体集団の作出。このような突然変異体集団は、種子または植物組織をエチルメタンスルホン酸(ems)などの突然変異原またはX線で処理することにより作出できる。
2.スクリーニングにおける選抜が、植物、詳細には葉菜類、より詳細にはレタス、エンダイブまたはウィットルーフの、PALおよび/またはPPOにより導かれる損傷応答誘導性変色に基づく、効率的な表現型スクリーニングのセットアップ。
3.収穫後の変色能に関して、また、植物、詳細には葉菜類、より詳細にはレタス、エンダイブまたはウィットルーフの栽培および加工に悪影響を及ぼす、改変の多面発現効果がないことに関して、その損傷応答が改変された突然変異体の、一般的な方法に従った特徴づけ。
a)突然変異原で改変する植物種のM0種子を処理してM1種子を得る、
b)このようにして得たM1種子から植物を生長させてM1植物を得る、
c)所望により、工程b)およびc)をn回繰り返して、M1+n種子を得る、
d)このようにして得たM1+n種子を発芽させて、この種子から植物を生長させる。
emsを使用したレタスの遺伝的改変
レタス品種トルバドールTroubadour,Apache,Yorvik and Roderickの種子およそ2000個を、0.05%(w/v)emsまたは0.07%(w/v)emsのいずれかの通気溶液中で、24時間室温でインキュベートした。ems処理の後、M1種子を水ですすぎ、20℃で16時間明期/8時間暗期の管理方式で温室に植え、成熟した植物を栽培し、M2種子を作出するために薹立ちさせ花が咲くように誘導した。成熟後、M2種子を収穫し、まとめて、後日使用するまで保存した。突然変異頻度は、クロロフィル生合成が阻害される白化した表現型を有する個々の植物の相対数に基づいて推定した。
淡紅色色素形成に基づくレタスの傷誘導性変色についての表現型スクリーニング指標の開発
損傷により誘導されたレタスの葉変色を容易に評価できる表現型アッセイを開発した。この手順は、変色についての幼若植物スクリーニングを可能にする。直径5mmの円形葉片を幼若植物または成熟植物から採取し、トレーに入れたぬれたろ紙の間に置いた。この系を5℃で7日間インキュベートした。インキュベーション期間中、円形葉片の損傷箇所で淡紅色色素が発色し、この色素は、ろ紙上で、印刷された円のように明瞭に視認できるようになった(図2)。
軽減した傷誘導性変色を示す突然変異体のスクリーニング
傷誘導性の酵素的褐変能または淡紅変能が低いレタスの突然変異体を同定するために、実施例2に記載の円形葉片アッセイを、レタスの突然変異体集団の植物に適用した。
軽減した傷誘導性変色を示す突然変異体のスクリーニング
傷誘導性の酵素的褐変能が低いレタスの突然変異体を同定するために、実施例2に記載の円形葉片アッセイをレタスの突然変異体集団の植物に適用した。8500個体の植物を3週齢(6〜8葉段階)まで温室内で栽培し、各個体植物から円形葉片を採取し、ぬれたろ紙の間で5℃で7日間インキュベートした。
軽減した傷誘導性変色を示している選抜された突然変異体の表現型分析
実施例3に示したスクリーニングから選抜された12個体の突然変異体のうち6個体が、低下した強い成長表現型および白化を示した。他の突然変異体は、正常に、すなわち、突然変異誘発実験の開始集団の型に従って発育した。
子孫において変色表現型がほとんどないことの確認
実施例3および5の植物06D.210202のようなレタスの突然変異体の軽減した変色が、本明細書中に記載の突然変異誘発処理により引き起こされた遺伝的影響によるものであることを実証するために、自殖により種子を作出した。植物06D.210202の自殖により作出した種子に、06D.819784と番号をつけた。この種子を土中で発芽させ、円形葉片淡紅変アッセイを用いて変色について植物を試験した。
褐色色素形成に基づく、レタスの傷誘導性変色についての表現型スクリーニング指標の開発
レタス植物を栽培して成熟させ、中央脈組織から円形片を切り取ることにより外葉の部分を採取した。この円形片をぬれたろ紙上で16℃でインキュベートした。およそ72時間後、損傷表面は褐色に変化した。10mM L−システイン存在下では褐変応答は抑制され、このことは、観察された変色がPPO媒介性であることを示している。このような実験の代表的な結果を図12に示す。
メラニンと呼ばれる黒色色素へのL−3,4−ジヒドロキシフェニルアラニン(L−DOPA)の転換に基づく、レタスの傷誘導性変色の表現型スクリーニング指標の開発
広い意味での傷誘導性変色を扱うアッセイに加え、本発明に従えば、この方法により、PPO活性が低下した突然変異体について、より特定的な方法でスクリーニングすることも可能になる。1.5mM L−DOPAの存在下でインキュベートした円形葉片を使用することにより、PPO活性の指標となる表現型アッセイを開発した。黒変が明瞭になったので、L−DOPAはレタス葉の損傷表面で、ポリフェノール酸化系によりメラニンと呼ばれる黒色色素に容易に転換される可能性がある、と結論づけることができる。L−DOPAは、ドパクロムおよびインドールキノンを経由して黒色メラニンへと非酵素的に転換される反応性のL−DOPAキノンへ、PPOにより転換される。
中央脈円形片褐変アッセイを用いた、変色がほとんどないことを示している突然変異体の子孫の褐変応答低下についての評価
円形葉片の損傷表面の淡紅変が顕著に軽減している、実施例3、5および6で得た植物番号06D.210202のようなレタスの突然変異体の軽減した変色が、傷誘導性褐変応答においても効果的に軽減していることを実証するために、いくつかの後代植物を栽培し成熟させた。
プラスチック袋に詰めた生鮮カットレタスの結球を使用した、変色がほとんどないことを示している突然変異体の子孫の褐変応答低下についての評価
円形葉片の損傷表面の淡紅変が顕著に軽減している、実施例6で得た番号06D.819784の種子から栽培したレタス植物の成熟結球を、ナイフを使用して細かく刻み、周囲大気の入ったプラスチック袋内に詰めた。通常の円形葉片淡紅変応答を示す対照植物を同一方法で処理した。この袋を4℃で6日間保存した後、葉材料を褐変応答について評価した。
Claims (41)
- 植物または植物部分の集団を、対照となる植物または植物部分と比べて、その中で傷誘導性表面変色の軽減を示す個体の存在についてスクリーニングする方法であって、
a)植物の集団またはその集団の植物の部分を用意すること、
b)スクリーニング対象の植物または植物部分および対照の植物または植物部分に損傷表面を作り出すこと、
c)損傷表面をインキュベートして、表面内部または表面上に変色を起こさせること、
d)植物または植物部分の内部または表面の損傷表面変色を観察すること、
e)スクリーニング対象の植物または植物部分の内部または表面で観察される損傷表面変色を、対照の植物または植物部分の表面または内部で観察される変色と比較して、変色を示さないか、または対照の植物または植物部分に比べ変色の程度が軽減している植物または植物部分を同定すること
を含む方法。 - 植物が、野菜植物、果実植物または顕花植物である、請求項1に記載の方法。
- 植物が、レタス、エンダイブ、ウィットルーフ、ジャガイモ、サツマイモ、根セロリ、マッシュルーム、アーティチョークおよびナスから選択される野菜植物である、請求項2に記載の方法。
- 植物が、リンゴ、バナナ、アボカド、モモ、洋ナシ、アンズおよびマンゴーから選択される果実植物である、請求項2に記載の方法。
- 植物が、ガーベラおよびキクから選択される顕花植物である、請求項2に記載の方法。
- 植物が、キク科、詳細にはラクチュカ属、さらに詳細にはラクチュカ・サティバ種に属する、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
- 植物が、チコリ属、詳細にはチコリウム・インティブス種およびチコリウム・エンディヴィア種に属する、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
- 植物部分が、葉、結球、芽、根、塊茎、茎、花、果実、種子またはその断片および細胞から選択される、請求項1または2に記載の方法。
- 植物部分が円形葉片である、請求項6または7に記載の方法。
- 植物部分が、中央脈組織から得た円形片である、請求項6または7に記載の方法。
- 植物集団が、突然変異体植物の集団、生殖質収集物、トランスジェニック植物の集団または突然変異した細胞の懸濁物である、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
- 突然変異体植物の集団が、化学薬品および/または照射法を用いた突然変異誘発処理によって得られる、請求項11に記載の方法。
- インキュベーションが水性環境中で行われる、請求項1から12のいずれか一項に記載の方法。
- 水性環境が、ぬれたろ紙を含む、請求項13に記載の方法。
- 水性環境が、水または溶液を含む、請求項13に記載の方法。
- 水性環境が、L−3,4−ジヒドロキシフェニルアラニン、クロロゲン酸、イソクロロゲン酸、L−チロシンおよびカテコールから選択される化合物を含有する、請求項14または15に記載の方法。
- 対照植物が、その円形葉片を2枚のぬれたろ紙の間で7日間5℃でインキュベートすると、縁周囲に淡紅変を示す植物である、請求項1から16のいずれか一項に記載の方法。
- 植物の集団を請求項1から17のいずれか一項に記載のスクリーニング法に供すること、およびスクリーニングにおいて表面変色を示さないか、またはスクリーニングにおいて対照植物に比べ表面変色の軽減した集団から植物を選抜することにより得られる、軽減した傷誘導性表面変色を示している植物。
- 野菜植物、果実植物または顕花植物である、請求項18に記載の植物。
- レタス、エンダイブ、ウィットルーフ、ジャガイモ、サツマイモ、根セロリ、マッシュルーム、アーティチョークおよびナスから選択される野菜植物である、請求項19に記載の植物。
- リンゴ、バナナ、アボカド、モモ、洋ナシ、アンズおよびマンゴーから選択される果実植物である、請求項19に記載の植物。
- ガーベラおよびキクから選択される顕花植物である、請求項19に記載の植物。
- キク科、詳細にはラクチュカ属、より詳細にはラクチュカ・サティバ種に属する、請求項18に記載の植物。
- チコリ属、詳細にはチコリウム・インティブス種およびチコリウム・エンディヴィア種に属する、請求項18に記載の植物。
- 軽減した傷誘導性葉変色を示し負の多面発現効果を示さない、請求項18から24のいずれか一項に記載の植物。
- 種子が表1に掲載のとおりの日付およびアクセション番号でNCIMBに寄託されたレタス植物である、請求項18から20および23のいずれか一項に記載の植物。
- 請求項26に記載の植物を同じ種の別の植物と交雑することにより得られる、請求項18から25のいずれか一項に記載の植物。
- 親植物において見られるのと同様に、傷誘導性葉変色を示さないか、または該変色の軽減を示す、請求項18から27のいずれか一項に記載の親植物の後代。
- 請求項18から28のいずれか一項に記載の植物の部分。
- 葉、結球、茎、芽、根、塊茎、果実、花、種子またはその断片、および細胞から選択される、請求項29に記載の部分。
- 請求項1から17のいずれか一項に記載の方法により得られる、請求項29または30に記載の部分。
- 親において見られるのと同様に、傷誘導性葉変色を示さないか、または該変色の軽減を示す、請求項29、30または31に記載の植物部分から再生される植物。
- 請求項18から28および32のいずれか一項に記載の植物の種子。
- 親において見られるのと同様に、傷誘導性葉変色を示さないか、または該変色の軽減を示す、請求項33に記載の種子の後代。
- 請求項18から20、23から34のいずれか一項に記載の野菜植物またはその部分を含む、野菜製品。
- 野菜が葉菜類である、請求項35に記載の野菜製品。
- 野菜が、レタス、エンダイブおよびチコリから選択されている、請求項36に記載の野菜製品。
- 加工レタス、加工チコリ、加工エンダイブまたはその組合せである、請求項37に記載の野菜製品。
- 請求項18から19、21、28から34のいずれか一項に記載の植物由来の果実。
- 請求項18から19、22、28から34のいずれか一項に記載の植物由来の花。
- 請求項1から17のいずれか一項に記載の方法でスクリーニングすると、傷誘導性葉変色を示さないか、または限られた該変色を示す、請求項38から41のいずれか一項に記載の製品。
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