CN105340729A

CN105340729A - 用于选择显示减少的损伤诱导的表面变色的方法

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Publication number: CN105340729A
Application number: CN201510638844.3A
Authority: CN
Inventors: C·M·P·范杜恩
Original assignee: Ruixwang Seedling Group Corp
Current assignee: Ruixwang Seedling Group Corp; Rijk Zwaan Zaadteelt en Zaadhandel BV
Priority date: 2006-01-06
Filing date: 2007-01-08
Publication date: 2016-02-24
Also published as: IL192623A; RU2433585C2; US20130237452A1; AU2007204056A1; RU2008132321A; CA2636196A1; KR20080084856A; ES2434037T3; EP1988764A1; IL192623A0; MA30943B1; EP1988764B1; ES2434037T5; ES2725201T3; KR20080093119A; ES2403435T3; BRPI0706430A2; MA30305B1; AU2007204058B2; US20090053757A1

Abstract

本发明涉及用于针对其中存在的个体筛选植物或植物部分的群体的方法，所述个体与对照植物或植物部分相比，显示减少的变色，所述方法包括提供植物群体或来自该群体的植物的部分；任选地在待筛选的植物或植物部分上产生损伤表面；温育植物或植物部分或在其上产生的损伤表面，以允许在其内或其上发生变色；在植物或植物部分内或上观察变色；将观察到的变色与在对照植物或植物部分内观察到的变色进行比较，从而鉴定显示没有变色或显示与对照植物或植物部分相比减少的变色的植物或植物部分。合适地变色是损伤诱导的变色。

Description

用于选择显示减少的损伤诱导的表面变色的方法

本申请是申请号为200780006285.8的专利申请的分案申请。

发明领域

本发明涉及用于针对其中存在的个体筛选植物或植物部分的群体的方法，所述个体与对照植物或植物部分相比，显示减少的损伤诱导的表面变色。

发明背景

由于不断增加的需要，新鲜产品例如莴苣、意大利红生菜(radicchio)、苦苣和其他蔬菜的加工近年来获得长足的发展。叶类蔬菜的收获和加工包括叶子的大量切割，这诱导了强烈的损伤反应。该损伤反应导致加工的产品的快速变质。该变质表现在由于损伤表面上和周围的酶促褐变或变粉红引起的变色、呼吸和由于蒸腾作用引起的变干。特别地，酶促褐变或变粉红据认为是非常重要的，其直接或间接决定了鲜切包装的叶类蔬菜如莴苣和意大利红生菜的总体质量。

此外，作为变质的结果，微生物的数量可显著增加，这可以危害食品安全。加工的莴苣的高度易腐坏的性质导致消费者感觉到强烈的变色(off-colour)、异味(off-odour)和质地改变，这妨碍了比所谓的便利市场的流通增长更快速的增长。

其他蔬菜如马铃薯、蘑菇、块根芹菜、朝鲜蓟和茄子，还有果实和花可经历不希望的变色。例如，果实如香蕉、苹果、梨子、鳄梨、芒果、桃子和杏子等，当切成薄片或剥皮时，很快变成褐色。当以加工的形式例如薄切片、切成的小方块、去皮的形式或在果实沙拉中提供这些果实时，必须采取措施。

切花花茎(Cutflowerstem)(例如来自大丁草或菊花)也可容易地变色，所述变色从商业的观点来看是不希望的，因为消费者认为变色使花丧失了吸引力，从而减少了产品的可销售性。

为了抑制蔬菜例如莴苣中的变质过程，已发展了可用于减缓加工的莴苣的变质的许多化学或物理的收获后处理方法。

在这些方法当中包括在改变的大气下包装鲜切的叶类蔬菜、使用可食用的涂层、热激处理和加入抑制酶促褐变的化学物质。

当在低温下在减少氧气的大气下包装鲜切莴苣时，可显著地减少酶促褐变。然而，这样的改变的、低氧环境导致无氧呼吸，这产生了令人感觉非常讨厌的产品的异味和臭味。

可食用的涂层是用作物理隔离屏障和有效保护产品免受各种变质例如蒸发和褐变侵害的材料的薄层。这些涂层可以例如由树脂、多糖或蛋白质制成。

已进一步证明，可通过在加工后即刻在45℃下使用90秒的短暂热激来防止鲜切莴苣的褐变。热激很可能使蛋白质的生物合成从参与变色的酶转向热激蛋白，从而减少了酶促褐变的能力。可选择地，可用参与变色通路的酶的热敏感性(thermosensitivity)来解释热激处理对褐变的作用。

可使用的化学物质可以是例如还原剂如维生素C、螯合剂如EDTA、络合剂如环糊精和酶抑制剂如L半胱氨酸。化学物质在新鲜食品中的应用明显地牵涉到食品安全性问题和需要法规批准(regulatoryapproval)。可以考虑上述收获后技术的组合，最终，使用的方法是技术功效、成本和食品安全性之间的平衡结果。

不论所使用何种技术，加工的蔬菜、果实和花的收获后质量的提高来之不易，从而在本领域存在提供可选择的技术来消除或减少对使用物理或化学收获后技术的需要的明确需要。

发明概述

本发明的目的是提供筛选方法，所述方法用于选择显示减少的损伤诱导的变色反应的植物，从而提供对收获后的加工障碍例如酶促褐变或变粉红具有抗性的植物和从其产生的后代。也可在植物的部分例如茎、种子、果实、叶、花、块茎、枝等中看到损伤引起的变色。因此本发明的进一步目的是提供选择在它们的植物部分显示减少的损伤诱导的变色反应的植物的筛选方法。

因此本发明提供了用于针对其中存在的个体(所述个体与对照植物相比，显示减少的变色)筛选植物或植物部分的群体的方法，所述方法包括:

a)提供植物群体或来自该群体的植物的部分；

b)任选地在植物或植物部分上产生损伤表面；

c)温育植物或植物部分或在其上产生的损伤表面以允许在其内或其上发生变色；

d)在植物或植物部分内或上观察变色；

e)将观察到的变色与在对照植物或植物部分中观察到的变色进行比较，从而鉴定显示没有变色的或显示与对照植物或植物部分相比减少的变色的植物或植物部分。

本发明的方法具有两个主要的实施方案。在第一实施方案中，变色是内源性底物转化的结果。该变色将在一定的环境下温育植物或植物部分一定量的时间后自发地产生。该情况下的变色是损伤诱导的。本发明特别地涉及天然发生的酶促变粉红色和褐变反应。本发明的筛选方法意欲用于鉴定不显示该反应或与对照相比显示减少的反应的植物。

在第二实施方案中，变色由外源加入的底物的转化引起，当植物中的反应发生时，所述底物可被转化成变成可见的有色底物。这样的颜色反应可以是或可以不是损伤诱导的。其也发生在例如完整的种子的种皮中。本发明的筛选方法意欲用于鉴定不显示该反应或显示与对照相比减少的反应的植物。

后一种施用方案更特别地涉及用于就针对其中存在的个体(所述个体与对照植物或植物部分相比，显示减少的变色)筛选植物或植物部分的群体的方法，所述方法包括:

a)提供植物群体或来自该群体的植物的部分；

b)将植物或植物部分与底物一起温育，所述底物可转化成有色色素从而允许在其内或其上发生变色；

c)在植物或植物部分内或上观察变色；

d)将观察到的变色与在对照植物或植物部分中观察到的变色进行比较，从而鉴定显示没有变色或显示与对照植物或植物部分相比减少的变色的植物或植物部分。

本发明的方法可用于可经历变色的任何植物，但特别适合用于产品，特别是用于蔬菜或果实或用于花。该方法尤其适合于用于叶类蔬菜例如莴苣、意大利红生菜或苦苣，适合用于块茎，如马铃薯或甘薯(sweetpotato)，适合用于根类植物，例如块根芹菜(celeriac)，适合用于枝条类(shoots)，例如witloof或适合用于蘑菇。此外方法可用于果实，例如苹果、香蕉、鳄梨、桃子、梨子、杏子、芒果、茄子和适合用于花类或花茎类(flowerstem)，例如大丁草茎、菊花、朝鲜蓟基部等。

本发明的筛选方法意欲用于鉴定在一个或多个它们的部分或组织中具有减少的损伤诱导的表面变色的植物。因此，为了进行筛选，使用易于变色的部分或组织是非常实用的。在莴苣中，这样的部分或组织可以是叶或其部分例如叶的打孔部分，在香蕉中，可合适地使用去皮果实的切片，在花类植物中，茎的切片是非常实用的受试载体(testvehicle)。

然而，已发现还可在未受损伤的组织上检测变色。在实施例中，显示了完整的种皮和根尖能够在外源加入的底物存在的情况下诱导颜色反应，所述底物在未受伤的情况下可被转化成有色色素。该颜色反应的减少或不存在可用于筛选具有减少的变色的植物。

在特定的实施方案中，该方法特别适合用于选择属于菊科(Asteraceae)的植物，特别是莴苣属(Lactuca)的植物和更特别地属于莴苣(Lactucasativa)种的植物或属于菊苣属(Cichorium)的植物，和特别地属于菊苣(Cichoriumintybus)种和苦苣(Cichoriumendivia)种的植物，所述植物显示不存在或减少的损伤诱导的表面变色

使用本发明的方法筛选的植物群体可以是任何植物群体，但优选是具有许多不同成员的变异植物群体，以增加发现显示减少的损伤诱导的变色的植物的机会。可通过使用例如化学物质和/或辐射的诱变处理产生这样的变异群体，所述变异群体在本文中被称为突变体植物群体。可选择的群体是种质集合体，所述集合体是显示天然变异的植物的集合体。此外，还可使用转基因植物的群体。

适合地使用具有损伤表面的植物部分来进行本发明的方法。非常有用的受试样品是通过对叶子穿孔产生的盘，即所谓的叶盘。可选择地，可使用有叶脉的叶类蔬菜的中脉组织。合适地，从此类叶脉切取叶盘。在果实中，可评估分成二半的果实的切面或可选择地薄切片或小方块的切面。对于花，茎的切片是非常有用的受试样品。

合适地在水性环境中进行温育。可用在湿润的滤纸上或滤纸间温育的叶盘很好地进行本发明的方法。然后在滤纸上可以非常清楚地看到围绕损伤的边缘的颜色反应。

可选择地，水性环境包括水或溶液。在将在下面进一步说明的特定的实施方案中，溶液包含底物，例如L-3,4-二羟基苯丙氨酸。该化合物通过多酚氧化酶转化成黑色的色素黑色素的产物。可用于在该方面筛选莴苣植物的可选择的化合物包括但不限于绿原酸、异绿原酸、L酪氨酸和儿茶酚。

还可使用亲本植物(所述亲本植物显示不存在或减少的损伤诱导的叶变色)的后代进行本发明，从而证明后代仍然具有与在亲本植物中发现的相同的不存在或减少的损伤诱导的叶变色。

本发明还可在植物的部分上进行。植物部分如莴苣或苦苣的叶球或叶通常是具有切面(所述切面可经历变色)的部分。其他部分是果实、枝、根、种子、块茎、花、茎等。

在本发明的其他实施方案中，种子或萌发的种子可用作在外源加入的底物存在的情况下在其上进行筛选方法的载体(vehicle)。在萌发的种子的情况下，幼根尖参与颜色反应。

就鉴定可用于加工的蔬菜的市场的突变体植物而言本发明在商业上具有极大的吸引力。如上面所解释的，产品特别是新鲜果实和蔬菜的变色被认为是不想要的，因为消费者拒绝变色的产品。

发明详述

当通过切割收获和加工莴苣时，产生许多叶损伤表面，所述叶损伤表面导致植物或植物部分的显著反应，表现为损伤表面上或附近的褐色或粉红色变色。还可在远离叶的中脉以及柄上的损伤表面的位置上观察到变粉红色。有时还可在即将收获前的阶段观察到变粉红色，这据认为是由于农作物的非生物胁迫或过度成熟造成的。

其他植物，特别是其他蔬菜、果实和花也易于变色。因此本发明的方法也是鉴定显示减少的损伤诱导的变色反应的其他植物特别是其他蔬菜或果实或花的非常方便的筛选方法。

不同形式的变色受到酶活性的影响，所述酶活性由于损伤而获得强烈的增强且产生了几种形式的多酚和来源于其的反应产物。

参与褐变反应的重要的酶活性是PPO。与酶促褐变相关的PPO活性不限定于莴苣，已描述了该PPO活性在许多其他植物物种中如苹果、香蕉和马铃薯中与收获后变质有关。事实上，PPO被公认为是与许多加工的新鲜果实和蔬菜的收获后变质有关的最重要的酶之一。

因此，PPO一直是目的在于减少或预防其活性以增加食品的收获后质量的许多技术的靶标。PPO催化将存在于植物组织中的多酚氧化，从而形成邻醌的反应。然后，酶促和非酶促反应导致褐色或黑色色素的形成。

在许多植物种中，PPO由小的基因家族编码，所述基因家族的个体成员可具有指示功能趋异的不同的时间和空间表达模式。例如已显示，莴苣在叶的光合和维管组织中包含不同的PPO同种型(isoform)。

PPO的天然底物在不同的物种之间可以不同。表1列出了经历损伤后变色的不同蔬菜和果实的PPO底物。这些和其他底物可用于本发明的基于外源底物的筛选方法。

表1

在许多植物中，PPO酶的水平并非是植物组织损伤后特异性诱导的，而是以无活性形式存在于叶绿体中。在损伤后，由于存在于液泡中的酚类底物因为组织的破裂而与PPO接触的事实的原因，PPO的激活由此而表现出来。

在莴苣中，作为PPO的底物的多酚的产生由损伤诱导。因此，莴苣组织的褐变潜能似乎不受叶组织中PPO的量的限制而是受损伤后多酚生物合成速度的限制。

在该方面，不同的农作物之间情况可以不同。例如，在苹果中，多酚的量足以在损伤后1小时内产生果实的褐变反应，然而在莴苣中，由于莴苣中多酚库大部分需要在损伤后重新合成的事实，褐变反应可花费数天时间。

通过详尽表征的称为苯基丙酸类通路(phenylpropanoidpathway)的生物化学通路进行多酚类的合成。首先，该通路的关键步骤由苯丙氨酸解氨酶催化(PAL,Hahlbrock,K和Scheel,D(1989)Annu.Rev.PlantPhysiol.PlantMol.Biol.40,347-369)。PAL将通过莽草酸酯通路合成的氨基酸苯丙氨酸转化成肉桂酸(cinnamicacid)。

在莴苣，叶子的损伤导致PAL基因表达和PAL活性的强诱导。多酚的形成与该酶活性相关，这表明由莴苣的损伤诱导的PAL活性是造成褐变的重要因素(Campos,R.等人(2004)PhysiologicaPlantarum121,429-438和其中的参考资料)。然而，目前还不清楚哪一个其他因素决定损伤诱导的变色反应的最终结果。例如，据认为过氧化物酶(POD)的活性在建立变色的最终水平中同样重要(Fukumoto,L.R.等人(2002)J.Agric.FoodChem.540,4503-4511；Martin-DianaA.等人(2005)Biosci.Biotechnol.Biochem.69,1677-1685)。

由于酶活性依赖于内部过氧化氢的可获得性，因而POD对变色的贡献可能是有限的。

进一步显然的是，植物以某种不为人知的方式感觉到损伤，随后通过级联反应产生信号，对于莴苣，该信号目前未被充分确定。似乎显然的是，这些活性主要被靶向伤口愈合和抗病原体的防御。因而，许多遗传因子可能参与发动损伤的莴苣组织的变色反应，这些因子中的各因子是减少或消除损伤诱导的变色的遗传修饰的潜在的靶标。

这些遗传因子的大部分目前是未知的，对于已知的涉及到的因子，不清楚这些因子在变色反应中所起的特定作用达到何种程度，或这些因子可能具有与植物的损伤生理学相关的更一般的功能。

例如，尽管认为损伤诱导的PAL活性确定莴苣的褐变水平，但苯基丙酸类通路的产物已知参与尤其细胞壁的生物合成或还参与防御反应。因此为了减少褐变潜能而减少损伤诱导的PAL活性，可削弱除了损伤诱导的褐变以外的与莴苣栽培的其他方面相关的其他功能，这可能是较不希望的。

同样地，PPO的活性据认为参与防御反应，因此通过减少PPO水平来减少褐变潜能可增加对病原体的易感性(Thipyapong,P.等人(2004)Planta220,105-117)。因此，本发明者推论，更加无偏性的方法可在该方面获得更大的成功。这样的方法包括下列步骤：

1.植物的变异体群体，特别是突变体群体的产生。可通过用诱变剂如甲磺酸乙酯(ems)或X射线处理种子或植物组织来产生这样的突变体群体。

2.有效率的表型筛选的建立，在所述筛选中，选择基于通过PAL和/或PPO介导的植物的变色，特别是损伤反应诱导的植物的变色。

3.在它们的关于收获后变色潜能的损伤反应发生改变的且不存在所述改变的多效性的突变体的表征，根据一般实践，所述多效性削弱植物的生长和加工。

本发明因而涉及用于鉴定、选择和获得显示减少的损伤诱导的变色和收获后加工障碍例如酶促褐变或变粉红色的植物的筛选方法。在筛选方法中，可在损伤表面观察到变色，而且还发现完整的组织也显示在加入底物后发生的颜色反应。

例如可如下制备用于本发明的方法的突变体植物群体：

a)使用诱变剂处理待改变植物物种的M0种子以获得M1种子；

b)栽培来自所获得的M1种子的植物以获得M1植物；

c)任选地重复步骤b)和c)n次以获得M1+n种子，

d)萌发所获得的M1+n种子，栽培来自这些种子的植物。

根据本发明，随后针对它们的损伤诱导的变色反应测定这些植物。选择不显示或显示减少的对损伤的变色反应的植物。然后，栽培选择的植物的后代，测量损伤诱导的变色反应。

为了产生遗传变异性，可使用诱变。可用于在植物物种中诱导遗传突变的几种化学或物理处理对于本领域技术人员来说是已知的。例如，可在包含不同浓度的诱变剂如ems的溶液中处理种子。Ems主要烷基化DNA链的G残基，这在DNA复制过程中引起与T配对而非与C配对。从而GC碱基配对以由有效剂量的ems和植物的错配修复系统的活性确定的频率改变成AT碱基配对。

ems的有效剂量取决于所使用的浓度、种子大小和其他物理性质以及种子在ems溶液中的温育时间。已用诱变剂处理的种子通常称为M1种子。作为处理的结果，M1种子的组织在它们的细胞的基因组中包含随机点突变，那些存在于将形成种系组织(生殖细胞)的细胞的亚群中的点突变将被传递至称为M2的下一代。单倍不足(haplo-insufficient)从而引起不育或诱导胚胎致死现象的突变或其组合将不被传递至M2代。

如上述使用ems的相似方法同样可用于其他诱变剂。合适的诱变剂在本领域内是熟知的。特别有用的是烷基化诱变剂，例如硫酸二乙酯(des)、乙烯亚胺(ei)、丙磺酸内酯、N-甲基-N-亚硝基尿烷(nitrosourethane)(mnu)、N-亚硝基-N-甲脲(NMU)、N-乙基-N-亚硝基脲(enu)、叠氮化纳。

可选择地，通过辐射诱导突变，所述辐射选自例如X射线、快中子、紫外线照射。

在本发明的另一个实施方案中，通过基因工程例如通过使用嵌合寡核苷酸、同源重组、基因打靶、与内源产物竞争的经修饰的靶基因的导入、通过RNA干扰进行的下调等来诱导突变。

可将诱变处理的M2群体用于针对通过PAL和PPO介导的损伤反应的筛选方法。对于本领域技术人员来说显然的是携带遗传变异的任何植物群体可用作该表型筛选的起始材料，所述植物群体是例如作为显示天然变异的植物的集合体的种质集合体或转基因植物的群体。

合适地通过自体授粉产生M1和M1+n种子。

为了进行本发明的表型筛选，必须产生损伤表面，因为酶促变色反应是在损伤后诱导的。这样的损伤是通过方法如切割、穿孔、切片、磨损、挤压、破坏、剥皮、压碎、压迫、鞭打、碾磨、液体注射、渗透压休克、分离(detaching)、割和撕裂获得的。

发现，在其中PPO在底物可到达的范围内的情况下，例如当PPO分泌或位于细胞外部时，还可在完整的组织和植物部分例如种子上实施使用外源加入的底物的本发明的方法。从而诱导颜色反应的酶也可在无预先损伤的情况下获得。

在损伤后或当不需要损伤时，用于诊断导致组织变色的通路和可非常有效地用于突变体群体的筛选的表型特征必须逐渐表现出来。

令人吃惊地发现，可通过采集植物的部分，然后在非常特殊的条件(所述条件有利于不同形式的变色，特别地损伤表面变色发生)下温育它们来获得这样的表型特征。然后，这样的测定可用于大量的植物或植物部分例如突变植物，以选择显示减少的损伤诱导的变色反应的植物。

本发明的一个实施方案基于令人吃惊的发现，即当采集来自叶子例如莴苣叶子或苦苣或witloof的叶子的叶盘并且在5℃下在湿润的滤纸之间温育时，在大约4天后，叶盘边缘的粉红色染料的形成逐渐变得明显。合适的滤纸是1450CV型滤纸,Ref.no.10313281，来自Schleier&Schuell,MicroscienceGmbH,Dassel,Germany。在进一步温育后，信号增强，在大约一周后达到最大强度。粉红色染料的形成特异性地在损伤表面发生。

可通过在视觉标度(visualscale)上进行从0(其表示无褐变或变粉红色)至10(其表示与待筛选的植物的标准品种(例如用于筛选莴苣的莴苣(L.sativa)相似的褐变和变粉红)的评分来测量变色。在本实例中，莴苣品种‘Troubadour’用作10的标准。

如果希望，可使用图进行比较，从而给0和10之间的中间级别评分。此外，可由具有粉红色或褐色染料的滤纸产生数字图像，然后计算每叶盘位置具有强粉红色或褐色的像素的数目。通过使用这些测量中的一种，可进行本领域技术人员熟知的简单统计分析如t检验，从而确定植物或植物群体变粉红色或褐变的程度是否比标准显著更低。单侧检验的所使用的显著性水平是0.001。

对于突变体，可在作为最佳的可获得的标准的原始品种的粉红色评分和个体突变体和/或它们的后代的粉红色评分之间进行统计比较。

为了在代表不同变异样品的现有植物中发现本发明的性状，可使用繁殖系(breedingline)和/或基因库登录号(genebankaccession)。然后可在处于研究中的个体登录号与群体的其余部分的变粉红色的评分之间进行统计比较。当针对显著减少的变粉红色对个体进行统计检测时，可能需要多重比较检验来保持适当的总体显著性水平，例如使用一个标准的Dunnett氏多重比较检验(DunnettCW,J.Amer.Statist.Assoc.50:1096-1121(1955))。

此外，据显示可通过使用不同发育阶段的叶子的许多不同类型的组织获得该反应。例如，还可诱导中脉组织产生该对损伤的反应。当用于不同种类的莴苣，例如叶用莴苣(butterhead)、卷心莴苣(iceberg)、直立莴苣(cos)、荷兰莴苣(batavia)或栋叶莴苣(oakleaf)时，未发现显示比被研究的群体的剩余部分显著更少的变粉红色的个体登录号。因此得出，在栽培的莴苣种类中，不存在或只存在非常有限的损伤诱导的粉红色变色的遗传变异。

根据本发明，进一步证明PPO的特异性抑制剂L半胱氨酸，当在反应过程中使用时，强烈地抑制粉红色染料的形成。此外，发现肉桂醛(其为PAL活性和鲜切莴苣的褐变的抑制剂)抑制粉红色染料的形成(Fujita,N.等人(2006)Biosci.Biotechnol.Biochem.70,672-676)。这些发现显示莴苣的粉红色变色反应是PAL和PPO依赖性的。

已知通过使用短暂的热激可非常有效地防止鲜切莴苣的酶促褐变。可通过假定将蛋白质的生物合成从苯基丙酸类通路改向热激蛋白，从而减少朝向多酚形成的代谢流来解释观察到的效应。

可选择地，可通过假定参与多酚氧化的酶例如PPO和POD通过热激处理而失活来解释效应。当对随后针对变粉红色反应而进行测定的莴苣使用热激时，显示该反应如酶促褐变被有效抑制。这证明了作为本发明的部分的莴苣的变粉红色反应在生理上与熟知的酶促褐变反应非常相似。

通过将L半胱氨酸用作还原剂来进一步验证该发现。L半胱氨酸，除了是PPO的抑制剂外，还已知与有色的邻醌(o-quinone)反应并且在化学还原反应中将它们转化回无色的二酚。当用L半胱氨酸处理由莴苣叶盘形成的粉红色染料时，证明粉红色化合物被转化成无色化合物。因此粉红色染料似乎可能是由PPO形成的邻醌。

这由发现：还原剂如抗坏血酸或谷胱甘肽也可将粉红色染料转化成无色化合物来确证。

此外，当用L半胱氨酸处理采自田间的、显示变粉红色的植物时，也可消除粉红色变色。这证明叶盘变粉红色反应代表了有时可在处于田间条件下生长的植物中看到的天然发生的变粉红色现象。

本发明的其他实施方案基于下列实验。通过切割产生叶球的莴苣叶的部分，将所述部分在16℃下在空气中进行温育。作为反应，在大约4天后，损伤表面变成褐色。特别地在主脉的损伤表面上，可清楚地观察到褐变。此外，还可在通过切割或磨损损坏叶子后在整个植物水平上观察到褐变反应。

L半胱氨酸(PPO的抑制剂)可完全抑制所有这些褐变反应，这证明了这些表型是通过PPO的活性表现的，从而可被当作如在莴苣的加工和包装过程中观察到的收获后褐变的诊断。

这些损伤诱导的褐变反应能够以有效的方式产生，所述方式可在用于鉴定损伤诱导的褐变潜能减少的突变体植物的表型筛选方法中使用。

本发明的其他实施方案基于莴苣组织的损伤表面上的变色，或基于在完整莴苣组织例如莴苣种皮内、上或附近观察到的、通过使用底物诱导的颜色反应，所述底物可被酚氧化酶转化成有色化合物。

例如，当将莴苣叶盘与PPO底物L-3,4-二羟基苯丙氨酸(L-DOPA)一起温育时，在损伤表面上观察到深褐色向黑色的变色，该变色是黑素形成(通过PPO)的表现。当同时使用L半胱氨酸，黑色变色被完全抑制，这确认了该变色是PPO介导的假设。

尽管L-DOPA被认为不是莴苣PPO的天然底物，但其可用于目的在于鉴定显示减少的损伤诱导的变色的突变体的测定。

可以以与对于L-DOPA所描述的方式相似的方式，使用其他底物以产生变色反应。这些底物包括但不限于绿原酸、异绿原酸、L酪氨酸和儿茶酚。

综合起来，植物中产生的损伤表面上不同染料的形成监控始于损伤信号的诱导、通过PAL和PPO介导且导致变色的通路的变化。如所描述的，可容易地通过目检(所述目检允许进行非常有效的突变体筛选方法)来评估这些损伤诱导的变色反应。在图1中图解说明了本发明描述的方法的背后的原理。

因此根据本发明，发现在体外，叶盘的损伤诱导的变色通路与以工业规模进行加工的莴苣的损伤诱导的变色具有很大的重叠，从而可被当作该过程的诊断特征。这由这样的概念支持，即PAL或PPO的抑制剂抑制在实际的工业条件下加工的和包装的莴苣的酶促褐变。重要地，由于该方法包括诱导步骤(即损伤和由PPO介导的一个最终的代谢转换)，因而该方法允许捕获直接或间接参与该生理过程的所有遗传因子。此外，由于可通过使用不同发育阶段的叶子的整个叶组织产生该反应，因此当考虑相关性时，可将突变体筛选靶向这些不同的阶段或组织。

可进一步表征突变体植物，基于一个或多个上述表型测定，已鉴定所述突变植物在从损伤到向PAL和PPO依赖性变色的生理过程方面发生了改变。可在不同的水平例如在分子、生物化学、生理学和表型水平上进行该表征。

对于本领域技术人员很显然的是，可观察到变色的可变水平，所述变色的可变水平可反映影响原始群体中的变色性状的不同的突变基因座或相同基因座的不同等位基因型的存在。

在隐性突变的情况下，可通过进行等位性检验容易地区分这两种可能性，所述检验包括将两种突变植物杂交和确定杂种的表型。在突变的等位性的情况下，减少的变色性状在F1中将是明显的，然而在突变体的表型由不同隐性基因座确定的情况下，情况则不是这样。

当在本发明的一个实施方案中将随机诱变用于产生起始群体时，遗传背景中的突变也可在实验条件下促成表型的变异。为了区分不同强度的单突变和遗传背景中的突变的组合效应，应当针对不同的减少的变色事件进行回交以产生均一的遗传背景。

为了确定参与损伤诱导的变色的特定基因座上的突变是否展示多效性，该方法也是适当的。

因此基于减少的变色反应所选择的M2植物用于生长M3种子。然后，针对它们减少的对损伤的反应重新评估来源于减少的变色事件的近交系。此外，可在不同的遗传背景中和在不同的农作物栽培和加工条件下评估减少的褐变或变粉红色。本发明的筛选方法可用于所有这些评估。

可进行生物化学研究以阐明涉及受遗传修饰影响的通路的问题。可进行分子研究以确定假定的参与酶促褐变或变粉红色反应的候选基因如编码PAL、PPO或过氧化物酶的基因是否被修饰。进一步地进行遗传分析以证明候选基因中发现的修饰是形成改变的表型的原因。

尽管诱导的诱变是提供用于本发明的筛选方法的植物群体的优选方法，但对于本领域技术人员来说已知的是，存在允许以特定的方式修饰存在于植物的基因组中的基因靶的技术。例如，已证明嵌合寡核苷酸是具有特定作用模式的有效诱变剂。

另一个方法是通过同源重组或基因打靶修饰基因靶。通过使用该方法，用导入的包含希望的修饰的DNA片段交换基因的片段。转基因方法也是可行的，在所述方法中导入与内源产物竞争的被修饰的靶基因。这可导致显性负效应。此外，通过RNA干扰特异性下调基因的表达是可行的。

在诱变的寡核苷酸的情况下，基因打靶或转基因方法用于修饰参与损伤诱导的变色反应的遗传因子，很明显，相关基因的一级结构应当是已知的。

当针对变粉红色测定从种子(所述种子是通过自体授精获得的)生长的特定突变体的后代植物时，观察到与对于原始鉴定的突变体所发现的减少相似的减少。这证明减少的粉红色变色反应能够遗传并且可通过基因组的修饰引起。

进一上令人吃惊的发现是如下事实，即当将经鉴定显示减少的损伤诱导的变色的突变体的后代植物生长至成熟并且针对损伤的中脉组织的酶促褐变进行检测时，该反应也被强烈抑制。这显示叶盘变粉红色的测定因果性地涉及莴苣中的酶促褐变，以及显示变粉红色的测定可用于预测成熟莴苣植物的酶促褐变的水平。

因此，可将叶盘变粉红色的测定用作鉴定具有减少的酶促褐变潜能的莴苣植物的选择工具。该工具可用于从任何类型的植物群体(无论遗传变异的原因是什么)鉴定存在于该群体中的具有减少的酶促褐变潜能的莴苣植物。例如，除了ems群体外，可使用天然获得的材料或繁殖种群。

该筛选方法还可用于筛选显示损伤诱导的变色的其他植物。

本发明提供的一种或多种筛选方法可例如用于其收获后加工质量需要提高的任何植物物种。除了栽培的莴苣外，本发明还可用于例如属于菊科的其他植物物种，例如莴苣属的野生型种或属于菊苣属(所述属是种如苦苣(Cichoriumendivia)、菊苣和witloof菊苣(Cichoriumintybus)属于的属)的植物。此外，可用本发明的方法筛选其他农作物植物例如苹果、意大利红生菜(radicchio)、马铃薯、甘薯、块根芹菜、蘑菇、香蕉、鳄梨、桃子、梨、杏子、芒果、茄子和花或花茎(flowerstems)例如大丁草茎、菊花、朝鲜蓟基部等。

本发明涉及用于通过进行本文中公开的一种筛选方法来检测植物中的表型特征的方法。通过3个变色试验(即变粉红色或褐变的发生或将底物如L-DOPA转化成黑色素的能力)中的一个或多个检测确定特征的存在。

本文中所使用的“对照”是已知其显示变粉红色、褐变和L-DOPA至黑色素的转化中的一种或多种变色反应的任何植物，所述反应可被L半胱氨酸或肉桂醛抑制。合适地，使用植物，所述植物的叶盘或其他植物部分，当在5℃下在湿润的滤纸之间温育7天时，显示围绕所述盘或部分的边缘的粉红色变色。

将在下列的且不意欲以任何方式限定本发明的实施例中进一步举例说明本发明。所述实施例涉及莴苣叶盘和种子、菊苣属和茄子，但可使用其他植物或其部分特别是新鲜果实和蔬菜而不使用莴苣。在实施例中参考下列附图。

图1:针对减少的收获后酶促变色而进行的莴苣群体的突变体筛选方法的设计背后的原理的概述。筛选的输入信号是被植物感觉且产生导致许多生理过程(包括衰老、呼吸和组织变色)的不同信号传输反应的叶组织的损伤。该输入信号可与作为PPO底物的酚类化合物应用相结合。

筛选的输出信号是诊断收获后褐变和变粉红色的损伤表面的褐色或粉红色变色(所述变色取决于所使用的条件)。这可从输出信号被肉桂醛和L半胱氨酸(其分别为PAL和PPO的特异性抑制剂)完全抑制的事实推断出来。

图2:基于叶盘的粉红色变色的筛选的输出表型的代表性图像。将莴苣植物的叶盘(每植物1个叶盘)排列在湿润的滤纸之间并且在5℃下温育7天。可在损伤表面清楚地观察到围绕各叶盘的粉红色变色。

图3:在不同浓度的PAL抑制剂肉桂醛存在的情况下进行的叶盘变粉红色测定(每培养皿4个叶盘)。各培养皿上方的数字显示所使用的肉桂醛的百分比。

图4:PPO抑制剂L半胱氨酸对湿润的滤纸之间温育的莴苣叶盘(每培养皿4个叶盘)的粉红色变色的抑制效应。各培养皿上方的数字显示所使用的L半胱氨酸的百分比。

图5:PPO抑制剂L半胱氨酸在1.5mML-DOPA存在的情况下对湿润的滤纸之间温育的莴苣叶盘(每培养皿4个叶盘)的黑色变色的抑制效应。各培养皿上方的数目显示所使用的L半胱氨酸的mM浓度。

图6:热激预处理对莴苣叶盘变粉红色的效应。在各培养皿上指定的温度下对完整的叶子施用热激，进行90秒。

图7:通过L半胱氨酸使通过莴苣的损伤反应形成的粉红色染料至无色化合物的转化。培养皿的上行显示L-DOPA测定，而培养皿的下行显示变粉红色的测定。在完成损伤反应后，用L半胱氨酸处理各培养皿中的两个叶盘中的下方叶盘。所使用的L半胱氨酸的浓度是上面指定的0、0.001、0.01、0.1、1和10mM。

图8:通过L半胱氨酸产生的田间栽培的莴苣中变粉红色的减少。上方的图框(upperpanel)显示采自被水浸(waterlogging)极端胁迫的植物的莴苣叶子的常见的变粉红色症状。主脉显示粉红色染料的存在。下方右图框显示采自在室温下用1mML半胱氨酸处理30分钟后，显示变粉红色症状的叶子的叶盘。下方左图框显示在室温下用水处理30分钟后的相似的叶盘。

图9:图框A:根据本发明描述的方法针对叶盘变色对个体莴苣M2植物(按库分组的)进行的表型分析。12000个样品中总共有138个样品在该图框中展示，其中箭头所指的样品显示急剧减少的变粉红色变色。图框B:确认了与显示清楚的变色反应的对照样品相比，粉红色变色的形成几乎不存在(中间位置中的样品)的图框A中指出的选择的个体的再检测。

图10:M2莴苣植物的表型。通过使用根据本发明的测定法，标记有1、2、4、5、7、10和12的植物显示减少的粉红色叶盘变色。植物3、6、8、9和11是显示与野生型对照相当的粉红色叶盘变色的水平的植物。植物1是显示粉红色变色的急剧减少和正常生长习性的突变体的唯一例子。植物2、4、5、7、10和12显示减少的粉红色变色和矮小、变白的表型。

图11:显示减少的变色的莴苣的突变体的后代检测。在左边，显示25个显示正常的损伤诱导的变色反应的样品。在右边，显示采自一系列来源于单个突变体的35个后代植物的样品组，所述突变体显著地减少了其损伤诱导的变色反应。

图12.基于采自成熟莴苣植物的叶子中脉部分的褐色变色的筛选的输出表型的代表性图像。图像显示在16℃下温育3天后莴苣边叶中脉的组织盘。可在损伤表面清楚地观察到常见的褐色变色。各培养皿包含3个在中脉的不同位置(绿色、淡绿色和白色)采集的叶盘。培养皿上方的数字表示向滤器中加入的L半胱氨酸的mM浓度。

图13:莴苣叶表面的L-DOPA至黑色素的转化。图框A显示1.5mML-DOPA溶液中的测定。上管是阴性对照，其他3个管相同。图框B显示包含1.5mML-DOPA的湿润滤纸之间的叶盘的温育的结果。

图14:在中脉褐变上显示减少的损伤诱导的粉红色变色的莴苣突变体的后代检测。图框A显示减少的变粉红的突变体的编号为1至8的8株后代植物的中脉叶盘(每植物3个叶盘)。图框B显示编号为9至16的显示正常褐变反应的8株对照植物的中脉叶盘(每植物3个叶盘)。

图15:在环境大气下切割和包装后，显示减少的损伤诱导的粉红色变色或褐变反应的莴苣的突变体的评估。对照植物的叶球的叶碎片示于左边，减少的变色的突变体的叶碎片示于右边。将鲜切叶材料在4℃下贮存6天。可在对照样品中清楚地观察到褐色变色，然而突变体样品保持不变。

图16:苦苣(cichoriumendivia)(左图框)和菊苣(Cichoriumintybus)(右图框)中变粉红色测定。

图17:莴苣叶盘上的绿原酸测定。

图18:切开的茄子中的褐变反应。

图19:莴苣(上行)和茄子(下行)的种子上的L-DOPA测定。

图20:莴苣的萌发的种子上的L-DOPA测定。

图21:莴苣的萌发的种子上的儿茶酚测定。

实施例

实施例1

使用ems进行的莴苣的遗传修饰

将莴苣品种Troubadour、Apache、Yorvik和Roderick的大约2000粒种子在室温下在24小时期间于0.05％(w/v)或0.07％(w/v)的ems的充气溶液中进行温育。在ems处理后，用水漂洗M1种子，然后在20℃下在16小时光照、8小时黑暗的方案下种植在温室中，让其长成成熟的植物，诱导抽苔和开花以产生M2种子。在成熟后，收获M2种子，将聚集成堆和贮藏以待进一步使用。基于具有白化的表型的个体植物(所述植物的叶绿素生物合成被扰乱)的相对数目估计突变频率。

实施例2

基于粉红色色素形成诊断莴苣的损伤诱导的变色的表型筛选的发展

发展其中可容易地评估由损伤诱导的莴苣的叶变色的表型测定法。该方法允许针对变色进行幼小植物的筛选。从幼小或成熟的植物采集直径5mm的叶盘并且将其置于培养皿中的湿润的滤纸之间。将系统在5℃下温育7天。在温育过程中，变得如在滤纸上打印的圆一样清楚可见的粉红色染料在叶盘的损伤位置产生(图2)。

为了证明粉红色染料的产生需要活性苯基丙酸类通路，在该测定中检测PAL(肉桂醛，图3)和PPO(L半胱氨酸，图4)的抑制剂的效应。当在测定过程中使用肉桂醛时，粉红色变色在0.01％或更高的浓度被完全抑制。

使用0.001％和更高的浓度的L半胱氨酸获得相似的结果，然而其他氨基酸如L亮氨酸或L丙氨酸不显示任何效果。这证明L半胱氨酸可抑制莴苣叶盘的变粉红色反应并且L半胱氨酸的抑制作用是特异性的。

为了证明L半胱氨酸在该系统中确实用作PPO活性的抑制剂，将莴苣叶盘与PPO底物L-3,4-二羟基苯丙氨酸(L-DOPA)一起温育。尽管认为L-DOPA不是莴苣PPO的天然底物，但在损伤表面观察到暗褐色至黑色的变色，所述变色是通过PPO形成黑色素的表现。当同时使用1mM或更高浓度的L半胱氨酸时，如图5中所示，变色被完全抑制。

通过在诱导损伤反应前使用热激来进一步表征莴苣叶盘变粉红色的反应。在21、40、50和60℃的温度下在90秒的期间温育分离的叶。在该处理后，采集叶盘，针对变粉红色对其进行测定。当在50℃或更高的温度下进行热激时，变粉红色反应被完全抑制。该结果显示于图6中。

由于已知L半胱氨酸通过将它们转化回无色的二酚而与作为PPO产物的邻醌反应，因此确定L半光氨酸对来自莴苣叶盘的粉红色染料的影响。平行地，在与L-DOPA温育后，确定L半胱氨酸对黑色素形成的影响。

根据上述方法采集和温育叶盘。在完成损伤反应后，向叶盘加入一系列浓度的L半胱氨酸，监测颜色的变化。结果示于图7中。该实验清楚地证明L半胱氨酸将粉红色染料转化回无色化合物，然而L-DOPA测定中形成的黑色的黑色素不受L半胱氨酸影响。这证明粉红色染料很可能是由莴苣多酚氧化系统形成的邻醌。

为了证明体外观察到的反应反映生理上相关的反应，将基于L半胱氨酸的变色用于田间生长的植物材料。这可通过从田间栽培的莴苣植物收获沿着叶脉显示强烈的变粉红色症状的叶子来进行。当例如通过严重水浸的条件胁迫植物时，通常观察到该现象。叶子用于制备叶盘，所述叶盘立即用1mML半胱氨酸进行温育。在室温下进行在大约30分钟的温育后，如图8中所示，粉红色变色消失。

综合起来，这些实验数据显示，可通过损伤诱导莴苣叶盘以产生PAL和PPO依赖性的粉红色变色。该表型允许用于莴苣突变体的有效率的和有效的筛选方法，所述莴苣突变体具有改变的、通过PAL、PPO或两者介导的损伤反应诱导的变色。

实施例3

筛选具有减少的损伤诱导的变色的突变体

为了鉴定具有低损伤诱导的酶促褐变或变粉红色潜能的莴苣突变体，将实施例2中描述的叶盘测定法用于莴苣突变体群体的植物。

在温室中栽培12000株植物(位置:DeLier,3月28日播种；4月18日种植；在常规的莴苣的生长条件下进行生长)，从各个体植物采集叶盘(从5月15日开始采样)，将叶盘作为(平均)25个样品的库在5℃下在湿润的滤纸之间温育7天。依赖于粉红色变色的强度给每一个叶盘进行视觉评分。基于该评估，选择其叶盘显示没有或显示具有相对低程度的损伤表面变色的植物。将具有几乎看不到的痕量变色的植物编号为06D.210202。

在12000株植物中，最终选择1株只显示痕量的、几乎看不见的变色的植物和11株显示相对低变色水平的植物。这些测定中的一个测定的结果示于图9。

对最初选择的12个个体重复变色测定，对于大多数个体情况，确认了最初的结果。只选择确认的个体进行进一步的分析和种子生产。

实施例4

筛选具有减少的损伤诱导的变色的突变体

为了鉴定具有低损伤诱导的酶促褐变潜能的莴苣突变体，将实施例2中描述的叶盘测定法用于莴苣突变体群体的植物。将8500株植物栽培在温室中直至3周龄(6-8叶期)，然后从各个体植物采集叶盘，将所述叶盘在5℃下于湿润的滤纸之间温育7天。

依赖于粉红色变色的强度给予各叶盘视觉评分。基于该评估，选择其叶盘显示没有或显示相对低程度的损伤表面变色的植物。在8500株植物中，选择8株不显示任何可见变色的植物和10株显示相对低的变色的植物。对18个最初选择的个体重复变色测定，对于大多数个体情况，确认了最初的结果。12个个体示于图10中。只选择确认的个体用于进行进一步的分析和种子生产。给1株不具有多效副作用(例如，变白、变矮)的突变植物赋予编号05D.202539。通过该植物的自交产生的种子被编号为05D.810596。通过3株从05D.810596的种子生长而来的植物的自交产生的种子编号为07G.9979并且保藏在NCIMB。NCIMB号是41441(于2006年10月10日保藏)。

实施例5

选择的显示减少的损伤诱导的变色的突变体的表型分析

在选自实施例3中提供的筛选的12个突变体中，6个显示急剧减少的生长表型和变白。其他突变体发育正常，即与诱变实验的起始群体的类型一致。

变矮和变白的突变体的叶绿体功能可能被扰乱。由于PPO存在于这些细胞器中，这可以解释叶盘测定中相对低的反应。由于该多效突变是不希望的，因此这些突变体被认为是不太适切的。

显示最强的叶盘变色的减少的突变植物06D.210202显示了正常表型，因此突变被认为是对于变色是特异性的，不具有强多效性效应。

实施例6

后代中几乎不存在变色表型的确认

为了证明莴苣突变体如来自实施例3和5的植物06D.210202的减少的变色是由通过本文中描述的诱变处理产生的遗传效应引起的，通过自交产生种子。通过植物06D.210202的自交产生的种子编号为06D.819784。将种子在土壤中萌发，使用叶盘变粉红色测定法针对变色检测植物。

该实验清楚地显示改变的表型具有遗传基础，因为所有后代植物都显示相似的表型，即粉红色变色的急剧减少，与用于产生种子的突变体相似。在图11中举例说明了该结果。

通过3株从06D.819784的种子生长的植物的自交产生的种子编号为06D.863B2，然后在NCIMB保藏。NCIMB号为41454(于2007年1月3日保藏)。

实施例7

基于褐色色素形成诊断莴苣的损伤诱导的变色的表型筛选的发展

将莴苣栽培至成熟，通过从叶脉组织切取叶盘来采集边叶的部分。将叶盘在16℃下于湿润的滤纸上进行温育。在大约72小时后，损伤表面转变成褐色。在10mML半胱氨酸存在的情况下，褐变反应被抑制，这表明观察到的变色是PPO介导的。这样的实验的代表性结果显示于图12中。

由于如图12中展示的反应是PPO介导的褐变反应，因此为了筛选显示减少的在莴苣的加工过程中发生的褐色变色的突变体，如本实施例中描述的筛选方法可以认为是有效的和无偏性的。

实施例8

基于L-3,4-二羟基苯丙氨酸(L-DOPA)转化回称为黑色素的黑色色素诊断莴苣的损伤诱导的变色的表型筛选的发展

除了在广义上阐明损伤诱导的变色的测定外，根据本发明的方法也允许以更特异性的方式筛选具有减少的PPO活性的突变体。通过使用在1.5mML-DOPA存在的情况下温育的叶盘来发展显示PPO活性的表型测定法。由于黑色变色变得明显，从而可推断出，可通过多酚氧化系统在莴苣叶的损伤表面容易地将L-DOPA转化成称为黑色素的黑色色素。通过PPO将L-DOPA转化成反应性L-DOPA-醌，该L-DOPA-醌通过多巴色素和吲哚醌非酶促地转化成黑色的黑色素。

此外，显示可通过在反应期间加入1mML半胱氨酸来抑制反应(图5)。因此，该分析使得能够鉴定突变体，所述突变体在叶的损伤表面产生PPO活性的能力被改变。如图13中所显示的，可在溶液和湿润的滤纸之间观察到莴苣叶盘对L-DOPA的存在的反应。

实施例9

使用叶脉叶盘褐变测定法(ribdiscbrowningassay)针对减少的褐变反应评估显示几乎不存在变色的突变体的后代

为了证明莴苣突变体(如来自实施例3、5和6的、叶盘的损伤表面的粉红色变色显著减少的植物编号06D.210202)的减少的变色也在损伤诱导的褐变反应中有效地减少，将许多后代植物栽培至成熟。

在该发育阶段，从许多后代植物的边叶采集3个中脉叶盘。根据实施例7中描述的方法温育这些脉叶盘。结果显示，较早显示为急剧减少的损伤诱导的粉红色变色的突变体的后代植物也强烈地减少损伤诱导的中脉褐变。该实验的结果示于图14中。

实施例10

使用包装在塑料袋中的鲜切莴苣叶球针对减少的褐变反应评估显示几乎不存在变色的突变体的后代

使用刀将莴苣植物的成熟叶球切成碎片，然后包装在包含环境大气的塑料袋中，所述莴苣植物是从来自实施例6的种子编号06D.819784生长而来的、叶盘的损伤表面的粉红色变色显著减少的莴苣植物。以相同的方式处理显示正常叶盘粉红色变色反应的对照植物。将袋子在4℃下保存6天后，针对其褐变反应评估叶材料。

该实验显示，更早显示为损伤诱导的粉红色变色的急剧减少的突变体的后代植物，当使用环境大气进行加工和贮藏在塑料袋中时，损伤诱导的中脉褐变也急剧减少。该实验的结果示于图15。

实施例11

菊苣中的变粉红色

为了鉴定有低的损伤诱导的酶促变粉红色潜能的突变体，将实施例2中描述的叶盘测定法用于突变的菊苣群体的植物。结果显示于图16中。结果得出，菊苣中也存在变粉红色反应。因此本发明的筛选方法是选择显示减少的损伤诱导的变色的菊苣植物的强有力工具。迄今，只能通过观察成熟的植物来评估苦苣和witloof中的褐变反应。可在幼小植物材料上进行实践的本发明的方法是非常有效率的和快速的。

实施例12

茄子中的变色

将茄子切成两半，在室温下温育过夜。从图18得出，变色反应主要是由种子引起的。因此，种子是用于基于底物(例如使用L-DOPA)的变色测定的合适的候选物。

实施例13

基于绿原酸的转化诊断莴苣的损伤诱导的变色的表型筛选

在滤纸上将莴苣的叶盘与10mM绿原酸一起温育。图17显示叶盘的褐变。在加入L半胱氨酸后，颜色消失再次显示变色是依赖于PPO的。

该实施例证明绿原酸是用于基于底物的筛选测定的合适的底物。

实施例14

诊断种子的损伤诱导的变色的基于底物的表型筛选

用0、2.5和5mML-DOPA温育莴苣和茄子的种子。图19显示在种子中观察到的颜色反应是浓度依赖性的。该反应是PPO依赖性的，因为其可用L半胱氨酸抑制。

将莴苣的萌发的种子与L-DOPA一起温育。图20显示种皮和正好在根尖后的根区(rootzone)显示颜色反应。该颜色反应可用于筛选显示减少的变色的种子。

将莴苣种子与0、100、250、500、750和1000mg/L儿茶酚一起温育。图21显示种子显示浓度依赖性颜色反应。该反应是PPO依赖性的，因为发现其被L半胱氨酸抑制。

Claims

1.一种方法，所述方法用于针对其中存在的与对照植物或植物部分相比显示减少的变色的个体而筛选植物或植物部分的群体，所述方法包括

a)提供植物的群体或来自该群体的植物的部分；

b)在水性环境中温育具有在其上通过切割产生的损伤表面的植物或植物部分以允许在其内或其上发生变色；

c)在植物或植物部分内或上观察变色；

d)将观察到的变色与在对照植物或植物部分中观察到的变色进行比较，从而鉴定显示没有变色的或显示与对照植物或植物部分相比减少的变色的植物或植物部分，

其中用于筛选的所述植物或植物部分是幼小植物材料。

2.权利要求1中所述的方法，其中变色是损伤诱导的变色。

3.权利要求1或2中所述的方法，其中植物是蔬菜植物、结果的植物或开花植物。

4.权利要求3中所述的方法，其中植物是选自莴苣、苦苣、witloof、马铃薯、甘薯、块根芹菜、蘑菇、朝鲜蓟和茄子的蔬菜植物。

5.权利要求3中所述的方法，其中植物是选自苹果、香蕉、鳄梨、桃子、梨子、杏子和芒果的结果的植物。

6.权利要求3中所述的方法，其中植物是选自大丁草和菊花的开花植物。

7.权利要求1中所述的方法，其中植物属于菊科。

8.权利要求7中所述的方法，其中所述植物属于莴苣属。

9.权利要求8中所述的方法，其中所述植物属于莴苣种。

10.权利要求1中所述的方法，其中所述植物属于菊苣属。

11.权利要求10中所述的方法，其中所述植物属于菊苣(Cichoriumintybus)和苦苣种。

12.权利要求1中所述的方法，其中植物部分选自叶、叶球、枝、根、块茎、茎、花、果实、种子、萌发的种子或其碎片。

13.权利要求7-12中任一项所述的方法，其中植物部分是叶盘。

14.权利要求7-12中任一项所述的方法，其中植物部分是来自中脉组织的叶盘。

15.权利要求1中所述的方法，其中植物群体是突变体植物的群体、种质集合体或转基因植物的群体。

16.权利要求15中所述的方法，其中通过使用化学物质和/或辐射进行诱变处理获得突变体植物的群体。

17.权利要求1中所述的方法，其中水性环境包括湿润的滤纸。

18.权利要求1中所述的方法，其中水性环境包括水或溶液。

19.权利要求17或18中所述的方法，其中水性环境包含选自L-3,4-二羟基苯丙氨酸、绿原酸、异绿原酸、L酪氨酸和儿茶酚的化合物。

20.权利要求17或18中所述的方法，其中水性环境包含选自下列化合物的化合物：苹果中的绿原酸、儿茶酚、儿茶素、咖啡酸、黄酮醇糖苷、3,4-二羟基苯丙氨酸(DOPA)、3,4-二羟基苯甲酸、对甲酚、4-甲基儿茶酚、白矢车菊甙元、对香豆酸、杏子中的异绿原酸、咖啡酸、4-甲基儿茶酚、绿原酸、儿茶素、表儿茶酸、焦棓酚、儿茶酚、黄酮醇、对香豆酸衍生物、鳄梨中的4-甲基儿茶酚、多巴胺、焦棓酚、儿茶酚、绿原酸、咖啡酸、DOPA、香蕉中的3,4-二羟苯乙胺(多巴胺)、白飞燕草甙元、白矢车菊甙元、茄子中的绿原酸、咖啡酸、香豆酸、肉桂酸衍生物、莴苣中的酪氨酸、咖啡酸、绿原酸衍生物、芒果中的多巴胺-HCl、4-甲基儿茶酚、咖啡酸、儿茶酚、儿茶素、绿原酸、酪氨酸、DOPA、对甲酚、蘑菇中的酪氨酸、儿茶酚、DOPA、多巴胺、肾上腺素、去甲肾上腺素、桃子中的绿原酸、焦棓酚、4-甲基儿茶酚、儿茶酚、咖啡酸、没食子酸、儿茶素、多巴胺、梨中的绿原酸、儿茶酚、儿茶素、咖啡酸、DOPA、3,4-二羟苯甲酸、对甲酚、马铃薯中的绿原酸、咖啡酸、儿茶酚、DOPA、对甲酚、对羟基苯基、丙酸、对羟基苯基丙酮酸、间甲酚、甘薯中的绿原酸、咖啡酸、咖啡酰胺。

21.权利要求1中所述的方法，其中对照植物是当其叶盘在5℃下在两片湿润的滤纸之间温育7天时，显示围绕边缘的粉红色变色的植物。

22.一种方法，所述方法用于针对其中存在的与对照植物或植物部分相比显示减少的变色的个体而筛选植物或植物部分的群体，所述方法包括

a)提供植物的群体或来自该群体的植物的部分；

c)在植物或植物部分内或上观察变色；

d)将观察到的变色与在对照植物或植物部分中观察到的变色进行比较，从而鉴定显示没有变色或显示与对照植物或植物部分相比减少的变色的植物或植物部分，

其中用于筛选的所述植物或植物部分是幼小植物材料、种子或萌发的种子。

23.权利要求22中所述的方法，其中底物选自如下化合物：苹果中的绿原酸、儿茶酚、儿茶素、咖啡酸、黄酮醇糖苷、3,4-二羟基苯丙氨酸(DOPA)、3,4-二羟基苯甲酸、对甲酚、4-甲基儿茶酚、白矢车菊甙元、对香豆酸、杏子中的异绿原酸、咖啡酸、4-甲基儿茶酚、绿原酸、儿茶素、表儿茶酸、焦棓酚、儿茶酚、黄酮醇、对香豆酸衍生物、鳄梨中的4-甲基儿茶酚、多巴胺、焦棓酚、儿茶酚、绿原酸、咖啡酸、DOPA、香蕉中的3,4-二羟苯乙胺(多巴胺)、白飞燕草甙元、白矢车菊甙元、茄子中的绿原酸、咖啡酸、香豆酸、肉桂酸衍生物、莴苣中的酪氨酸、咖啡酸、绿原酸衍生物、芒果中的多巴胺-HCl、4-甲基儿茶酚、咖啡酸、儿茶酚、儿茶素、绿原酸、酪氨酸、DOPA、对甲酚、蘑菇中的酪氨酸、儿茶酚、DOPA、多巴胺、肾上腺素、去甲肾上腺素、桃子中的绿原酸、焦棓酚、4-甲基儿茶酚、儿茶酚、咖啡酸、没食子酸、儿茶素、多巴胺、梨中的绿原酸、儿茶酚、儿茶素、咖啡酸、DOPA、3,4-二羟苯甲酸、对甲酚、马铃薯中的绿原酸、咖啡酸、儿茶酚、DOPA、对甲酚、对羟基苯基、丙酸、对羟基苯基丙酮酸、间甲酚、甘薯中的绿原酸、咖啡酸、咖啡酰胺。

24.权利要求23中所述的方法，其中化合物是L-DOPA。

25.权利要求22、23或24中所述的方法，其中在用底物温育之前损伤植物或植物部分，然后观察损伤或损伤附近的变色。

26.权利要求22中所述的方法，其中所述植物或植物部分是种子、萌发的种子或叶盘。

27.权利要求1中所述的方法，其中变色可被L半胱氨酸抑制或逆转。